KR20230041000A - 설폰화된 dna의 정제 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 화학적으로 변형된, 상세하게는, 설폰화된 DNA의 정제를 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 또한, 본 개시내용은 실리카 지지체, 예컨대, 실리카 비드 및 실리카 표면에 설폰화된 DNA를 결합시키기 위한 산성 조건을 사용하여 설폰화된 DNA의 정제를 개선시키는, 바이설파이트 전환을 위한 방법 및 시스템을 제공한다.
Description
본 출원은 2020년 7월 29일자로 출원된 미국 가출원 제63/058,179호를 우선권으로 주장하고, 이러한 문헌은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
발명의 분야
본 개시내용은 설폰화된 DNA의 정제에 관한 것이다. 또한, 본 개시내용은 DNA의 바이설파이트 전환 및 지지체, 예를 들어, 실리카 지지체를 사용한 설폰화된 DNA의 개선된 정제, 및 설폰화된 DNA를 지지체에 결합시키기 위한 산성 조건의 사용을 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다.
DNA 메틸화는 DNA, 특히 DNA의 사이토신 고리에 메틸기를 첨가하여 유전자의 기능을 변형시킴으로써 발생하는 후성적 메커니즘이다. DNA 메틸화 부위를 검출하고 맵핑하는 것은 후성적 유전자 조절을 이해하고 암 및 다른 질환 상태의 발달 및 진행과 관련된 비정상적인 DNA 메틸화를 검출하는 데 필수적이다.
메틸화 부위의 맵핑은 현재, DNA 또는 이의 변이체에서 5-메틸사이토신의 검출을 위한 문헌[Frommer, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1827-31 (1992), 이러한 문헌은 모든 목적을 위해 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨]에 기술된 바이설파이트 방법에 의해 달성된다. 5-메틸사이토신을 맵핑하는 바이설파이트 방법은 5-메틸사이토신이 아닌 사이토신이 바이설파이트와 반응한다는 관찰에 기반한다. 대개, 반응은 다음을 포함하는 일련의 단계를 포함한다: 사이토신을 아황산수소와 반응시켜 설폰화된 사이토신을 형성시키는 단계; 설폰화된 우라실을 생성시키는 설폰화된 반응 중간체를 자발적 탈아민화시키는 단계; 및 알칼리 조건 하에 우라실을 탈설폰화하여 우라실을 형성시키는 단계. 우라실과 5-메틸사이토신 사이의 염기쌍 차이, 즉, 아데닌과의 우라실 염기쌍 및 구아닌과의 5-메틸사이토신 염기쌍 사이의 염기쌍 차이는 검출을 용이하게 한다. 따라서, 다양한 방법, 예를 들어, 바이설파이트 게놈 시퀀싱(Grigg G, & Clark S, Bioessays (1994) 16: 431-36; Grigg G, DNA Seq. (1996) 6: 189-98) 또는 예를 들어, 미국 특허 제5,786,146호에 개시된 바와 같은 메틸화-특이적 PCR(MSP)은 비-메틸화된 사이토신으로부터 메틸화된 사이토신을 분화시킬 수 있다. 바이설파이트 전환을 위한 반응 조건, 시약의 농도 등의 많은 변화가 당업계에 공지되어 있으며, 각각의 변화는 DNA 회복율 및 탈아미노화 수준의 차이를 초래할 수 있다.
일반적으로, 바이설파이트 처리 방법은 염기쌍 분석을 위해 정제된 전환된 DNA 샘플을 제조하기 위한 세척 단계 및 완충제 변화를 포함한다. 다양한 방법, 예를 들어, 스핀 칼럼, 에탄올 정제, 및 고체 지지체가 이러한 단계를 용이하게 한다. 그러나, 실리카 스핀 칼럼 또는 에탄올 정제를 사용하는 방법은 종종 사이토신 메틸화의 척도로서 바이설파이트 방법의 유용성을 손상시키는 샘플 손실을 초래한다. 고체 지지체를 사용하여 일부 개선이 개발되었지만, 이러한 방법은 투입물로서 다량의 DNA를 필요로 하고 또한 샘플 손실 및 재현성의 문제를 겪는다. 또한, 통상적인 방법은 종종 완료하는데 수일의 긴 시간을 필요로 하고, 전환된 DNA의 효율적인 전환 및 회복을 제공하지 않는다. 결과적으로, 통상적인 방법은 DNA 메틸화의 정성적 측정만을 제공한다.
DNA의 바이설파이트 전환을 최적화하기 위해, 일반적으로 바이설파이트 변형 반응 자체, 즉, DNA에서 메틸화되지 않은 사이토신을 설폰화하는 단계에 초점을 맞추었다. 생성된 설폰화된 DNA의 회복을 개선시키는 일부 방법은 카오트로픽 염(chaotropic salt) 농도를 증가시켜 물과 DNA의 수소 결합을 파괴하여 실리카-DNA 상호작용을 촉진시키는 데 초점을 맞추었다. 다른 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제9,315,853호에서, 결합 완충제를 단순화함으로써 사이토신-풍부 DNA의 감소된 회복을 해결하였으며, 여기서, 첨가제, 예컨대, 알코올 및 TRIS가 제거되고, 이러한 문헌은 모든 목적을 위해 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 명세서에 개시된 시스템 및 방법은 특히 사이토신-풍부 표적에 대해 바이설파이트 전환된 DNA 회복을 증가시키고, 바이설파이트 처리 공정의 변화에 대한 강건성(robustness)을 개선하고, 광범위한 샘플 유형에 대한 DNA 회복을 증가시킨다. 상기 방법은 수소 결합 파괴에 추가하여 실리카-DNA 상호작용을 촉진하기 위해 DNA 전하를 중화시키는 것을 포함한다.
산성 용액 중에서 설폰화된 DNA를 실리카 지지체에 결합시키는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 개시되고, 여기서 산성 용액은 설폰화된 DNA의 등전점(isoelectric point) pH(I) 이하의 pH를 갖는다. 일부 실시형태에서, pH는 5 미만이다. 일부 실시형태에서, pH는 2.5 내지 4이다. 산성 용액은 카오트로픽 염 또는 작용제를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 카오트로픽 염은 구아니딘 하이드로클로라이드(GuHCl)이다.
상기 방법은 변성된 비-설폰화된 DNA를 설폰화 시약과 함께 인큐베이션하여 설폰화된 DNA를 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "설폰화 시약"은 바람직하게는 비메틸화된 사이토신 뉴클레오타이드를 우라실 설포네이트 뉴클레오타이드로 선택적으로 전환시키는 시약을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 설폰화 시약은 암모늄 바이설파이트이다.
상기 방법은 설폰화된 DNA에 결합된 실리카 지지체를 세척하는 단계; 설폰화된 DNA를 탈설폰화시켜 탈설폰화된 DNA를 형성시키는 단계; 및 실리카 지지체로부터 탈설폰화된 DNA를 용리시키는 단계 중 적어도 하나 또는 모두를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세척은 알코올, 예를 들어, 에탄올로 수행된다. 일부 실시형태에서, 탈설폰화는 알칼리 조건에서 설폰화된 DNA의 인큐베이션을 포함하고, 일부 실시형태에서, 설폰화된 DNA는 검출 검정, 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응에 직접 첨가되어, 설폰화된 DNA가 검출 검정을 수행하는 조건 하에서 탈설폰화된다. 일부 실시형태에서, 용리는 고열로의 처리를 포함한다.
본 기술은 하기 실시형태를 더 포함하고, 이들에 의해 예시된다:
1. 방법으로서, 산성 결합 용액에서 설폰화된 DNA와 실리카 지지체를 배합하는 단계를 포함하되, 상기 산성 결합 용액은 상기 설폰화된 DNA의 등전점(pH(I)) 이하의 pH를 가지며, 설폰화된 DNA는 상기 실리카 지지체에 결합되는, 방법.
2. 실시형태 1에 있어서, 상기 실리카 지지체가 입자, 비드 및 섬유 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
3. 실시형태 1에 있어서, 상기 실리카 지지체가 자성인, 방법.
4. 실시형태 1에 있어서, 상기 산성 결합 용액의 pH가 5 미만인, 방법.
5. 실시형태 4에 있어서, 상기 산성 결합 용액의 pH가 2.0 내지 4인, 방법.
6. 실시형태 1에 있어서, 상기 산성 결합 용액이 카오트로픽 염을 포함하는, 방법.
7. 실시형태 6에 있어서, 상기 카오트로픽 염이 구아니딘 하이드로클로라이드(GuHCl) 및 구아니딘 아이소티오사이아네이트(GITC) 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
8. 실시형태 1에 있어서, 상기 방법이 단일-가닥 비-설폰화된 DNA 또는 부분-설폰화된 DNA를 설폰화 시약과 함께 인큐베이션하여 설폰화된 DNA를 제조하는 단계를 더 포함하는, 방법.
9. 실시형태 8에 있어서, 상기 설폰화 시약이 암모늄 바이설파이트 및 소듐 바이설파이트 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
10. 실시형태 1에 있어서,
i) 설폰화된 DNA에 결합된 실리카 지지체를 세척하는 단계;
ii) 상기 설폰화된 DNA를 탈설폰화시켜 탈설폰화된 DNA를 형성시키는 단계; 및
iii) 상기 실리카 지지체로부터 상기 탈설폰화된 DNA를 용리시키는 단계
중 적어도 하나를 더 포함하는, 방법.
11. 실시형태 8에 있어서, 비-설폰화된 DNA를 설폰화 시약과 함께 인큐베이션하는 것은 상기 설폰화된 DNA의 pH(I) 이상의 pH를 갖는 설폰화 반응 용액에서 수행되는, 방법.
12. 실시형태 11에 있어서, 상기 설폰화 반응 용액의 적어도 일부가 상기 산성 결합 용액에서 상기 설폰화된 DNA와 상기 실리카 지지체의 조합 전에 상기 설폰화된 DNA로부터 제거되는, 방법.
13. 실시형태 12에 있어서, 본질적으로 모든 상기 설폰화 반응 용액이 상기 산성 결합 용액에서 상기 설폰화된 DNA와 상기 실리카 지지체를 배합하기 전에 상기 설폰화된 DNA로부터 제거되는, 방법.
14. 실시형태 12에 있어서, 상기 설폰화 반응 용액의 적어도 일부가 크기 배제 여과에 의해 설폰화된 DNA로부터 제거되는, 방법.
15. 실시형태 11에 있어서, 상기 산성 결합 용액이 상기 설폰화 반응 용액에서 상기 설폰화된 DNA에 산성 성분을 첨가함으로써 형성되는, 방법.
16. 실시형태 15에 있어서, 상기 산성 성분이 산성 용액인, 방법.
17. 실시형태 16에 있어서, 상기 산성 성분이 산성 아세테이트, 글리신, 말레이트, 폼에이트 또는 시트레이트 용액 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
18. 실시형태 15에 있어서, 상기 산성 성분이 카오트로픽 염을 포함하는, 방법.
19. 실시형태 18에 있어서, 상기 카오트로픽 염이 GuHCl 및 GITC 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
20. 탈설폰화된 DNA를 제조하는 방법으로서,
i) 단일-가닥 비-설폰화된 DNA 또는 부분-설폰화된 DNA를 설폰화 시약과 함께 인큐베이션하여 설폰화 반응 혼합물에서 설폰화된 DNA를 제조하는 단계;
ii) 상기 설폰화 반응 혼합물을
a) 산성 성분; 및
b) 카오트로픽 염; 및
c) 실리카 지지체
와 배합하여, 산성 결합 용액을 형성하는 단계로서, 상기 산성 결합 용액은 상기 설폰화된 DNA의 등전점(pH(I)) 이하의 pH를 가지며, 설폰화된 DNA는 상기 실리카 지지체에 결합되는, 상기 산성 결합 용액을 형성하는 단계;
iii) 상기 산성 결합 용액으로부터 상기 실리카 지지체에 결합된 설폰화된 DNA를 분리하는 단계;
iv) 상기 설폰화된 DNA가 탈설폰화되는 조건 하에서 분리된 설폰화된 DNA를 처리하는 단계를 포함하는, 방법.
21. 실시형태 20에 있어서, 상기 비-설폰화된 DNA가 하나 이상의 비메틸화된 사이토신 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 탈설폰화된 DNA가 하나 이상의 데옥시우라실 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
22. 실시형태 20에 있어서, 상기 설폰화된 DNA가 탈설폰화되는 조건 하에서 분리된 설폰화된 DNA를 처리하는 단계가 설폰화된 DNA를 탈설폰화 용액과 배합하는 것을 포함하는, 방법.
23. 실시형태 22에 있어서, 상기 탈설폰화 용액이 상기 실리카 지지체에 결합된 설폰화된 DNA와 조합되는, 방법.
24. 카오트로픽 염을 포함하는 산성 결합 용액 중에 설폰화된 DNA 및 실리카 지지체를 포함하는 조성물로서, 상기 산성 결합 용액은 상기 설폰화된 DNA의 pH(I) 이하의 pH를 가지며, 상기 설폰화된 DNA는 상기 실리카 지지체에 결합되는, 조성물.
25. 실시형태 24에 있어서, 상기 카오트로픽 염이 GuHCl 및 GITC 중 적어도 하나를 포함하는, 조성물.
26. 실시형태 24에 있어서, 상기 산성 결합 용액이 아세테이트, 글리신, 말레이트, 폼에이트 또는 시트레이트 완충제 중 적어도 하나를 포함하는, 조성물.
27. 실시형태 26에 있어서, 상기 산성 결합 용액이 시트레이트 완충제를 포함하는, 조성물.
28. 실시형태 24에 있어서, 상기 산성 결합 용액이 바이설파이트 염을 포함하는, 조성물.
29. 실시형태 28에 있어서, 상기 바이설파이트 염이 암모늄 바이설파이트인, 조성물.
30. 실시형태 24에 있어서, 상기 산성 결합 용액의 pH가 5 미만인, 조성물.
31. 실시형태 30에 있어서, 상기 산성 결합 용액의 pH가 2.0 내지 4인, 조성물.
32. 키트로서,
i) 바이설파이트 시약 용액 또는 바이설파이트 시약 용액을 제조하기 위한 성분들;
ii) 실리카 지지체; 및
iii) 설폰화된 DNA의 pH(I) 이하의 pH를 갖는 산성 성분
을 포함하는, 키트.
33. 실시형태 32에 있어서, 상기 바이설파이트 시약 용액이 설폰화된 DNA의 pH(I)보다 큰 pH를 갖는, 키트.
34. 실시형태 32에 있어서, 상기 산성 성분이 산성 용액인, 키트.
35. 실시형태 33에 있어서, 상기 산성 성분이 아세테이트, 글리신, 말레이트, 폼에이트 또는 시트레이트 완충제 중 적어도 하나를 포함하는, 키트.
36. 실시형태 32에 있어서, 카오트로픽 염을 더 포함하는, 키트.
37. 실시형태 36에 있어서, 상기 산성 성분이 카오트로픽 염을 포함하는, 키트.
38. 실시형태 36에 있어서, 상기 카오트로픽 염이 GuHCl 및 GITC 중 적어도 하나를 포함하는, 키트.
39. 실시형태 32에 있어서, 상기 실리카 지지체가 입자, 비드 및 섬유 중 적어도 하나를 포함하는, 키트.
40. 실시형태 32에 있어서, 상기 실리카 지지체가 자성인, 키트.
41. 실시형태 32에 있어서, 상기 산성 성분의 pH가 5 미만인, 키트.
42. 실시형태 41에 있어서, 상기 산성 성분의 pH가 2.0 내지 4인, 키트.
43. 방법으로서, 산성 결합 용액에서 설폰화된 DNA와 실리카 지지체를 배합하는 단계를 포함하되, 상기 산성 결합 용액은 상기 설폰화된 DNA의 등전점(pH(I)) 이하의 pH를 가지며, 설폰화된 DNA는 실리카 지지체에 결합되고, 상기 실리카 지지체는 바람직하게는 입자, 비드 및 섬유 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 실리카 지지체는 바람직하게는 자성인, 방법.
44. 실시형태 43에 있어서, 상기 산성 결합 용액의 pH가 5 미만, 바람직하게는 4 미만, 바람직하게는 약 2.0 내지 4인, 방법.
45. 실시형태 43 또는 실시형태 44에 있어서, 상기 산성 결합 용액이 카오트로픽 염을 포함하고, 상기 카오트로픽 염은 바람직하게는 구아니딘 하이드로클로라이드(GuHCl) 및 구아니딘 아이소티오사이아네이트(GITC) 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
46. 실시형태 43 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 단일-가닥 비-설폰화된 DNA 또는 부분-설폰화된 DNA를 설폰화 시약과 함께 인큐베이션하여 상기 설폰화된 DNA를 제조하는 단계를 더 포함하는, 방법.
47. 실시형태 46에 있어서, 상기 설폰화 시약이 암모늄 바이설파이트 및 소듐 바이설파이트 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
48. 실시형태 43 내지 47 중 어느 하나에 있어서,
i) 설폰화된 DNA에 결합된 실리카 지지체를 세척하는 단계;
ii) 상기 설폰화된 DNA를 탈설폰화시켜 탈설폰화된 DNA를 형성시키는 단계; 및
iii) 상기 실리카 지지체로부터 상기 탈설폰화된 DNA를 용리시키는 단계
중 적어도 하나를 더 포함하는, 방법.
49. 실시형태 48에 있어서, 비-설폰화된 DNA를 설폰화 시약과 함께 인큐베이션하는 것은 상기 설폰화된 DNA의 pH(I) 이상인 pH를 갖는 설폰화 반응 용액에서 수행되는, 방법.
50. 실시형태 49에 있어서, 상기 설폰화 반응 용액의 적어도 일부가 상기 산성 결합 용액 중에서 상기 설폰화된 DNA와 상기 실리카 지지체를 배합하기 전에 상기 설폰화된 DNA로부터 제거되는, 방법.
51. 실시형태 50에 있어서, 본질적으로 모든 상기 설폰화 반응 용액이 상기 산성 결합 용액 중에서 상기 설폰화된 DNA와 상기 실리카 지지체를 배합하기 전에 상기 설폰화된 DNA로부터 제거되는, 방법.
52. 실시형태 50 또는 51에 있어서, 상기 설폰화 반응 용액의 적어도 일부가 크기 배제 여과에 의해 상기 설폰화된 DNA로부터 제거되는, 방법.
53. 실시형태 49 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 산성 결합 용액이 상기 설폰화 반응 용액 중에서 상기 설폰화된 DNA에 산성 성분을 첨가함으로써 형성되는, 방법.
54. 실시형태 53에 있어서, 상기 산성 성분이 산성 용액인, 방법.
55. 실시형태 53 또는 54에 있어서, 상기 산성 성분이 산성 아세테이트, 글리신, 말레이트, 폼에이트 또는 시트레이트 용액 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
56. 실시형태 53 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 산성 성분이 카오트로픽 염을 포함하고, 상기 카오트로픽 염은 바람직하게는 GuHCl 및 GITC 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
57. 탈설폰화된 DNA를 제조하는 방법으로서,
i) 단일-가닥 비-설폰화된 DNA 또는 부분-설폰화된 DNA를 설폰화 시약과 함께 인큐베이션하여 설폰화 반응 혼합물 중에서 설폰화된 DNA를 제조하는 단계;
ii) 상기 설폰화 반응 혼합물을
a) 산성 성분;
b) 카오트로픽 염; 및
c) 실리카 지지체
와 배합하여, 산성 결합 용액을 형성하는 단계로서, 상기 산성 결합 용액은 상기 설폰화된 DNA의 등전점(pH(I)) 이하의 pH를 가지며, 설폰화된 DNA는 상기 실리카 지지체에 결합되는, 상기 산성 결합 용액을 형성하는 단계;
iii) 상기 산성 결합 용액으로부터 상기 실리카 지지체에 결합된 설폰화된 DNA를 분리하는 단계;
iv) 상기 설폰화된 DNA가 탈설폰화되는 조건 하에서 분리된 설폰화된 DNA를 처리하는 단계
를 포함하되, 바람직하게는 상기 비-설폰화된 DNA는 하나 이상의 비메틸화된 사이토신 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 탈설폰화된 DNA는 하나 이상의 데옥시우라실 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
58. 실시형태 57에 있어서, 상기 설폰화된 DNA가 탈설폰화되는 조건 하에서 분리된 설폰화된 DNA를 처리하는 단계가 설폰화된 DNA를 탈설폰화 용액과 배합하는 것을 포함하는, 방법.
59. 실시형태 58에 있어서, 상기 탈설폰화 용액이 상기 실리카 지지체에 결합된 설폰화된 DNA와 조합되는, 방법.
60. 카오트로픽 염을 포함하는 산성 결합 용액 중에 설폰화된 DNA 및 실리카 지지체를 포함하는 조성물로서, 상기 산성 결합 용액은 상기 설폰화된 DNA의 pH(I) 이하의 pH를 가지며, 상기 설폰화된 DNA는 상기 실리카 지지체에 결합되고,
상기 카오트로픽 염은 바람직하게는 GuHCl 및 GITC 중 적어도 하나를 포함하고; 상기 산성 결합 용액은 바람직하게는 아세테이트, 글리신, 말레이트, 폼에이트 또는 시트레이트 완충제 중 적어도 하나, 바람직하게는 시트레이트 완충제를 포함하는, 조성물.
61. 실시형태 60에 있어서, 상기 산성 결합 용액이 바이설파이트 염, 바람직하게는 암모늄 바이설파이트를 포함하는, 조성물.
62. 실시형태 60 또는 61에 있어서, 상기 산성 결합 용액의 pH가 5 미만, 바람직하게는 2.0 내지 4인, 조성물.
63. 키트로서,
i) 바이설파이트 시약 용액 또는 바이설파이트 시약 용액을 제조하기 위한 성분들로서, 상기 바이설파이트 시약 용액은 바람직하게는 설폰화된 DNA의 pH(I)보다 큰 pH를 갖는, 상기 바이설파이트 시약 용액 또는 바이설파이트 시약 용액을 제조하기 위한 성분들;
ii) 실리카 지지체; 및
iii) 산성 성분, 바람직하게는 산성 용액으로서, 상기 산성 성분은 설폰화된 DNA의 pH(I) 이하의 pH를 가지며, 상기 산성 성분은 바람직하게는 아세테이트, 글리신, 말레이트, 폼에이트 또는 시트레이트 중 적어도 하나, 바람직하게는 시트레이트 완충제
를 포함하는, 산성 성분을 포함하는, 키트.
64. 실시형태 63에 있어서, 카오트로픽 염을 더 포함하고, 바람직하게는 상기 산성 성분은 카오트로픽 염을 포함하고, 상기 카오트로픽 염은 바람직하게는 GuHCl 및 GITC 중 적어도 하나를 포함하는, 키트.
65. 실시형태 63 또는 64에 있어서, 상기 실리카 지지체가 입자, 비드 및 섬유 중 적어도 하나를 포함하는, 키트.
66. 실시형태 63 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 상기 실리카 지지체가 자성인, 키트.
67. 실시형태 63 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 상기 산성 성분의 pH가 5 미만이고, 바람직하게는 상기 산성 성분의 pH가 2.0 내지 4인, 키트.
본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 특정 바람직한 실시형태에서, 단일-가닥 DNA는 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플로부터 단리된다. 예컨대, 일부 바람직한 실시형태에서, 단일-가닥 DNA는 인간 대상체, 예를 들어, 암을 갖거나 가질 것으로 의심되는 대상체로부터의 샘플, 예를 들어, 대상체로부터의 혈장 샘플, 대변 샘플, 또는 다른 샘플로부터 단리된다. 다른 실시형태에서, 단일-가닥 DNA는 합성이다. 바람직한 실시형태에서, 단일-가닥 DNA는 염기-쌍 DNA 가닥이 분리되어 단일 가닥을 형성하는 변성 조건(예를 들어, 알칼리성 조건, 고온 등)에 이중-가닥 DNA를 노출시킴으로써 형성된다. 일부 실시형태에서, 탈설폰화된 DNA는, 예를 들어, DNA에서 하나 이상의 메틸화된 DNA 마커(MDM)를 측정하기 위해 측정된다. 예를 들어, 본 명세서에서(예를 들어, 표 1 내지 7, 도 3, 7 내지 13, 15a 및 15b, 16 및 18에 개시된 MDM을 비롯하여, 실험 섹션 또는 도면에서) 명명된 임의의 DNA가 임의의 유형의 샘플(예를 들어, 혈장, 대변, 조직, 등)로부터, 단독으로 또는 조합하여, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개 등의 임의의 하위조합으로 검출 또는 측정될 수 있다.
본 개시내용의 다른 양태 및 실시형태는 하기 상세한 설명 및 첨부 도면에 비추어 명백할 것이다.
도 1은 본 명세서에 개시된 방법을 포함하는 바이설파이트 처리 방법의 일 실시형태의 개요이다.
도 2는 제안된 결합 메커니즘의 개략도이다.
도 3은 6개의 상이한 마커 DNA에 대해 회복된 결합 pH 대 log 가닥의 그래프를 제공한다.
도 4는 전환된 사이토신 퍼센트 대 최대 결합 pH의 그래프이다. 각 DNA 가닥의 전환된 사이토신 백분율(우라실 설포네이트 뉴클레오타이드/총 뉴클레오타이드)을 최대 가닥 회복에 필요한 가장 높은 추정 결합 pH에 대해 플롯팅하였다. 이러한 점의 선형 피트(linear fit)가 도시된다.
도 5는 동일한 프라이머/프로브 조합을 사용하는 DNA 가닥의 전환된 사이토신 퍼센트 대 최대 결합 pH의 그래프이다. 3개의 DNA(BMP3, β-액틴("BTACT"), 및 NDRG4 가닥)는 특정 DNA의 각 변이체에 대해 동일한 프라이머 및 프로브 결합 서열을 보유하지만 그러한 DNA 가닥의 다른 영역에 상이한 수의 비메틸화된 C를 함유하는 DNA 세트를 제조하도록 변형되었다. 이러한 상관 관계의 강도를 추가로 예시하기 위해, 라인은 각 서열 세트에 피팅되었다.
도 6A 및 6b는 비-조정된 결합 pH(도 6A) 또는 낮은 결합 pH(도 6B)를 사용한 전환 및 정화 후 총 DNA의 그래프를 도시한다.
도 7은 4개의 상이한 DNA 서열(LASS4, PPP2R5C, LRRC4, 및 ZDHHC1)에 대한 비-조정된 결합 pH(상단 행) 또는 낮은 결합 pH(하단 행)에 대해 회복된 가닥에 대한 대변 샘플 부피(mL)의 그래프이다. ZDHHC1 DNA는 2회 시험되었다.
도 8A는 낮은 pH 및 비-조정된 pH에서 수행된 결합 반응으로부터 상이한 로트의 암모늄 바이설파이트로부터의 가닥 회복을 나타내는 표를 제공한다.
도 8B는 낮은 pH 및 비-조정된 pH에서 수행된 결합 반응으로부터 상이한 농도의 암모늄 바이설파이트로부터의 가닥 회복을 나타내는 표를 제공한다.
도 9는 낮은 pH 및 비-조정된 pH에서 수행된 결합 반응에 존재하는 오염물의 효과를 나타내는 표를 제공한다.
도 10은 비-조정된 pH 결합 반응을 사용하여 다양한 실리카 비드를 사용하여 회복된 가닥의 로그를 나타내는 표를 제공한다.
도 11은 실시예 1에 기재된 낮은 pH 결합 반응을 사용하여 다양한 실리카 비드를 사용하여 회복된 가닥의 로그를 나타내는 표를 제공한다.
도 12는 4.85 내지 2.13 범위의 산성 pH("BND pH")로 조정된 결합 반응을 사용하여 회복된 가닥을 나타내는 표를 제공한다.
도 13은 비-조정된 또는 낮은 pH 결합 반응을 사용하여 상이한 크기의 DNA 분자 및 상이한 농도의 DNA 분자에 대해 회복된 가닥을 나타내는 표를 제공한다.
도 14는 프로토콜 1, 프로토콜 2, 및 프로토콜 3에 의해 제공된 반응 조건을 비교하는 표를 나타낸다.
도 15A 및 15b는 프로토콜 1, 프로토콜 2, 및 프로토콜 3을 사용하여 가닥 회복을 비교하는 표를 나타낸다.
도 16은 프로토콜 1, 프로토콜 2, 및 프로토콜 3을 사용하여 상이한 메틸화 마커 DNA에 대한 도 15A 및 도 15B에 도시된 가닥 회복의 쌍별 비교(pairwise comparison)를 갖는 표를 나타낸다.
도 17은 프로토콜 2 회복 대 프로토콜 1 또는 프로토콜 3을 사용한 회복의 비율로 나타낸, 상이한 메틸화 마커 DNA에 대한 도 16에 도시된 가닥 회복을 비교하는 그래프를 도시한다. 각 데이터포인트에 대한 "프로토콜 X"는 그러한 데이터포인트에 대한 프로토콜 1 또는 3을 나타낸다.
도 18은 결합 단계 동안 비-조정된 pH를 사용하거나, 표시된 설폰화된 DNA를 실리카 비드에 결합시키는 동안 pH를 감소시키기 위해 글리신, 시트레이트, 말레이트 또는 폼에이트 완충제를 사용하여 상이한 DNA의 회복을 비교하는 표를 나타낸다.
도 2는 제안된 결합 메커니즘의 개략도이다.
도 3은 6개의 상이한 마커 DNA에 대해 회복된 결합 pH 대 log 가닥의 그래프를 제공한다.
도 4는 전환된 사이토신 퍼센트 대 최대 결합 pH의 그래프이다. 각 DNA 가닥의 전환된 사이토신 백분율(우라실 설포네이트 뉴클레오타이드/총 뉴클레오타이드)을 최대 가닥 회복에 필요한 가장 높은 추정 결합 pH에 대해 플롯팅하였다. 이러한 점의 선형 피트(linear fit)가 도시된다.
도 5는 동일한 프라이머/프로브 조합을 사용하는 DNA 가닥의 전환된 사이토신 퍼센트 대 최대 결합 pH의 그래프이다. 3개의 DNA(BMP3, β-액틴("BTACT"), 및 NDRG4 가닥)는 특정 DNA의 각 변이체에 대해 동일한 프라이머 및 프로브 결합 서열을 보유하지만 그러한 DNA 가닥의 다른 영역에 상이한 수의 비메틸화된 C를 함유하는 DNA 세트를 제조하도록 변형되었다. 이러한 상관 관계의 강도를 추가로 예시하기 위해, 라인은 각 서열 세트에 피팅되었다.
도 6A 및 6b는 비-조정된 결합 pH(도 6A) 또는 낮은 결합 pH(도 6B)를 사용한 전환 및 정화 후 총 DNA의 그래프를 도시한다.
도 7은 4개의 상이한 DNA 서열(LASS4, PPP2R5C, LRRC4, 및 ZDHHC1)에 대한 비-조정된 결합 pH(상단 행) 또는 낮은 결합 pH(하단 행)에 대해 회복된 가닥에 대한 대변 샘플 부피(mL)의 그래프이다. ZDHHC1 DNA는 2회 시험되었다.
도 8A는 낮은 pH 및 비-조정된 pH에서 수행된 결합 반응으로부터 상이한 로트의 암모늄 바이설파이트로부터의 가닥 회복을 나타내는 표를 제공한다.
도 8B는 낮은 pH 및 비-조정된 pH에서 수행된 결합 반응으로부터 상이한 농도의 암모늄 바이설파이트로부터의 가닥 회복을 나타내는 표를 제공한다.
도 9는 낮은 pH 및 비-조정된 pH에서 수행된 결합 반응에 존재하는 오염물의 효과를 나타내는 표를 제공한다.
도 10은 비-조정된 pH 결합 반응을 사용하여 다양한 실리카 비드를 사용하여 회복된 가닥의 로그를 나타내는 표를 제공한다.
도 11은 실시예 1에 기재된 낮은 pH 결합 반응을 사용하여 다양한 실리카 비드를 사용하여 회복된 가닥의 로그를 나타내는 표를 제공한다.
도 12는 4.85 내지 2.13 범위의 산성 pH("BND pH")로 조정된 결합 반응을 사용하여 회복된 가닥을 나타내는 표를 제공한다.
도 13은 비-조정된 또는 낮은 pH 결합 반응을 사용하여 상이한 크기의 DNA 분자 및 상이한 농도의 DNA 분자에 대해 회복된 가닥을 나타내는 표를 제공한다.
도 14는 프로토콜 1, 프로토콜 2, 및 프로토콜 3에 의해 제공된 반응 조건을 비교하는 표를 나타낸다.
도 15A 및 15b는 프로토콜 1, 프로토콜 2, 및 프로토콜 3을 사용하여 가닥 회복을 비교하는 표를 나타낸다.
도 16은 프로토콜 1, 프로토콜 2, 및 프로토콜 3을 사용하여 상이한 메틸화 마커 DNA에 대한 도 15A 및 도 15B에 도시된 가닥 회복의 쌍별 비교(pairwise comparison)를 갖는 표를 나타낸다.
도 17은 프로토콜 2 회복 대 프로토콜 1 또는 프로토콜 3을 사용한 회복의 비율로 나타낸, 상이한 메틸화 마커 DNA에 대한 도 16에 도시된 가닥 회복을 비교하는 그래프를 도시한다. 각 데이터포인트에 대한 "프로토콜 X"는 그러한 데이터포인트에 대한 프로토콜 1 또는 3을 나타낸다.
도 18은 결합 단계 동안 비-조정된 pH를 사용하거나, 표시된 설폰화된 DNA를 실리카 비드에 결합시키는 동안 pH를 감소시키기 위해 글리신, 시트레이트, 말레이트 또는 폼에이트 완충제를 사용하여 상이한 DNA의 회복을 비교하는 표를 나타낸다.
정의
이 섹션에서 사용되는 섹션 표제 및 본 명세서의 전체 개시내용은 단지 조직화 목적을 위한 것이고, 제한하려는 것은 아니다.
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 어구가 하기에 정의된다. 추가 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다.
명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐, 문맥상 명백히 달리 지시하지 않는 한, 하기 용어는 본 명세서에서 명시적으로 관련된 의미를 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 어구 "일 실시형태에서"는 반드시 동일한 실시형태를 지칭하는 것은 아니지만, 그럴 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 "다른 실시형태에서"라는 어구는 반드시 상이한 실시형태를 지칭하는 것은 아니지만, 그럴 수 있다. 따라서, 후술되는 바와 같이, 기술의 다양한 실시형태는 기술의 범위 또는 사상을 벗어나지 않고 용이하게 조합될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하다(comprise(s))", "포함하다(include(s))", "갖는", "갖다", "할 수 있다", "함유하다" 및 이들의 변형은 추가적인 행위 또는 구조의 가능성을 배제하지 않는 개방형 접속 어구, 용어, 또는 단어인 것으로 의도된다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "또는"은 포괄적인 "또는" 연산자이고, 문맥상 명백히 달리 지시하지 않는 한 용어 "및/또는"과 동등하다. "~에 기반한"이라는 용어는 배타적이지 않고, 문맥상 명백히 달리 지시하지 않는 한 기술되지 않은 추가적인 요인에 기반하는 것을 허용한다.
단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 본 개시내용은 또한 명시적으로 제시되든 그렇지 않든지 간에, 본 명세서에 제시된 실시형태 또는 요소를 "포함하는", 이로 "이루어진" 및 이로 "본질적으로 이루어진" 다른 실시형태를 고려한다.
본 출원의 청구범위에서 사용되는 접속 어구 "본질적으로 이루어진"은 문헌[In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461, 463 (CCPA 1976)]에서 논의된 바와 같이, 청구범위의 범위를 청구된 발명의 특정 물질 또는 단계 "및 기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들"로 제한한다. 예를 들어, 인용된 요소를 "본질적으로 이루어진" 조성물은, 오염물이 존재하더라도, 순수한 조성물, 즉, 인용된 성분들"로 구성되는" 조성물과 비교하여 인용된 조성물의 기능을 변경하지 않는 수준으로 인용된 오염물을 함유할 수 있다.
본 명세서에서 수치 범위의 언급을 위해, 동일한 정도의 정밀도로 그 사이의 각각의 개재 수가 명시적으로 고려된다. 예를 들어, 6 내지 9의 범위에 대해, 6 및 9에 추가하여 숫자 7 및 8이 고려되고, 6.0 내지 7.0 범위에 대해, 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0이 명시적으로 고려된다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시와 관련하여 사용되는 과학 용어 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 분자 생물학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 임의의 명명법은 당업계에 널리 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 용어의 의미와 범위는 명확해야 한다. 그러나, 잠재적인 모호성이 있는 경우, 본 명세서에 제공된 정의는 임의의 사전 또는 외부 정의보다 우선한다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "DNA 단편" 또는 "작은 DNA" 또는 "짧은 DNA"는 약 200개 이하의 염기쌍 또는 뉴클레오타이드 길이로 구성된 DNA를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "메틸화" 또는 "메틸화된"은, 예를 들어, CpG 유전자좌에서 사이토신의 메틸화 상태와 관련하여 사용되는 바와 같이, 일반적으로 사이토신 염기의 위치 5에 메틸 기의 존재 또는 부재를 지칭한다(즉, 특정 사이토신이 5-메틸 사이토신인 지의 여부). 메틸화는, 예를 들어, 바이설파이트로의 처리에 의한 우라실로의 전환에 대한 특정 C-잔기의 민감도(또는 이의 부족)를 결정함으로써, 예를 들어, 사이토신의 메틸화 상태의 분석을 위한 일상적인 방법에 의해 입증되는 바와 같이 직접적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 샘플이 (샘플에서 대부분 또는 모든 비-메틸화된 사이토카인이 우라실로 전환되는 조건 하에서) 비-메틸화되는 경우 그러한 잔기를 전환시킬 것으로 예상되는 방식으로 바이설파이트로 샘플이 처리될 때 우라실로 전환되지 않는 샘플에서 사이토카인 잔기는 일반적으로 "메틸화된" 것으로 간주될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "메틸 사이토신", "메틸 C", "메틸화된 사이토신", "메틸화된 C" 및 "meC"는 상호교환적으로 사용되고, 5-메틸사이토신(5mC) 및 5-하이드록시메틸 사이토신(5hmC) 둘 다를 포함한다.
용어 "바이설파이트 시약"은 메틸화된 및 비메틸화된 CpG 다이뉴클레오타이드 서열을 구별하기 위해 본 명세서에 개시된 바와 같이 유용한 바이설파이트, 다이설파이트, 하이드로겐 설파이트, 또는 이들의 조합을 포함하는 시약을 지칭한다. 상기 처리 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, PCT/EP2004/011715호 및 WO 2013/116375호, 이들 각각은 그 전체가 참조에 의해 원용됨). 일부 실시형태에서, 바이설파이트 처리는 변성 용매, 예컨대 비제한적으로 n-알킬렌글리콜 또는 다이에틸렌 글리콜 다이메틸 에터(DME)의 존재 하에, 또는 다이옥산 또는 다이옥산 유도체의 존재 하에 수행된다. 일부 실시형태에서, 변성 용매는 1% 내지 35%(v/v)의 농도로 사용된다. 일부 실시형태에서, 바이설파이트 반응은 스캐빈저, 예컨대, 비제한적으로 크로만 유도체, 예를 들어, 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만 2-카복실산 또는 트리하이드록시벤존산 및 이들의 유도체, 예를 들어, 갈산(PCT/EP2004/011715호 참조, 이의 전문이 참조에 의해 원용됨)의 존재 하에 수행된다. 특정 바람직한 실시형태에서, 바이설파이트 반응은, 예를 들어, WO 2013/116375호에 기재된 바와 같이, 암모늄 바이설파이트로도 지칭되는, 암모늄 하이드로겐 설파이트로의 처리를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "설폰화된 DNA"는 설폰화 시약, 예를 들어, 바이설파이트 시약으로 처리한 결과 설폰화된 사이토신 또는 우라실을 포함하는 DNA를 지칭한다. 설폰화된 DNA는 DNA가 설폰화되어 우라실 설포네이트를 형성하지 않은 비메틸화된 사이토신(들)을 포함하도록 부분적으로 설폰화될 수 있거나, DNA가 완전히 설폰화되어, 모든 비메틸화된(또는 달리 보호되지 않은) 사이토신이 설폰화되어 우라실 설포네이트를 형성할 수 있다. 설폰화된 DNA는 또한, 바이설파이트 시약으로 처리된 DNA를 모방하기 위해 예를 들어, 표준 핵산 합성 화학을 사용하여 합성된 DNA일 수 있다. 예를 들어, DNA의 가닥은 뉴클레오타이드 모노머로부터 합성되어 하나 이상의 우라실 설포네이트 뉴클레오타이드를 포함하는 가닥을 형성할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "비-설폰화된 DNA"는 사이토신이 우라실 설포네이트 뉴클레오타이드로 전환되는 조건 하에, 설폰화 시약, 예를 들어, 바이설파이트 시약으로 처리되지 않은 DNA를 지칭한다. 비-설폰화된 DNA는 하나 이상의 비메틸화된 사이토신 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 비-설폰화된 DNA에는 우라실 설포네이트 뉴클레오타이드가 존재하지 않는다.
DNA를 고체 지지체에 결합시키기 위한 용액 또는 조건과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "낮은 pH"는 DNA, 예를 들어, 설폰화된 DNA가 결합하는 고체 지지체의 pH(I) 이하의 pH를 갖는 결합 용액 또는 조건을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 낮은 pH 결합 조건은 산성 성분, 예를 들어, 산성 pH를 갖는 완충제와 함께 결합제, 예를 들어, 카오트로픽 염, 예컨대, 구아니딘 하이드로클로라이드를 포함하는 결합 용액의 사용에 의해 제공된다. 일부 실시형태에서, 산성 성분은 결합 혼합물이 설폰화된 DNA와 조합되기 전에 결합제와 예비혼합되는 반면, 일부 실시형태에서, 산성 성분은 결합제가 설폰화된 DNA와 조합되기 전 또는 후에 설폰화된 DNA와 조합된다.
설폰화된 DNA를 고체 지지체에 결합시키기 위한 용액 또는 조건과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "비-조정된 pH", "표준 pH", 및 "높은 pH"는 상호교환적으로 사용되고, 설폰화된 DNA 및 결합제, 예를 들어, GuHCl만을 포함하는 결합 용액의 pH에 비해 결합 용액 또는 조건의 pH를 감소시키기 위한 산성 성분을 포함하지 않는다. 일반적으로, 비-조정된 pH 결합 용액은 고체 지지체, 특히 실리카 지지체의 pH(I) 이상의 pH를 갖는다. 일부 실시형태에서, 비-조정된 pH 결합 용액은 DNA의 샘플, 설폰화된 DNA, 및 결합제, 예를 들어, GuHCl을 설폰화하는 데 사용되는 설폰화 시약의 일부 또는 전부를 포함하는 혼합물이다. 일부 실시형태에서, 비-조정된 결합 용액의 pH는 설폰화 시약 단독의 pH 또는 그 부근이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "샘플"은 가장 넓은 의미로 사용된다. 예를 들어, 인간 유전자 또는 염색체 또는 인간 염색체와 관련된 서열을 함유하는 것으로 의심되는 샘플은 세포, 세포로부터 단리된 염색체(예를 들어, 중기 염색체의 확산), 게놈 DNA(서던 블롯 분석을 위한 것과 같은 고체 지지체에 결합 또는 용액 내), RNA(노던 블롯 분석과 같은 고체 지지체에 결합 또는 용액 내), cDNA(용액 또는 고체 지지체에 결합), 무세포 DNA(예를 들어, 혈장으로부터의 순환 무세포 DNA; 체액, 예컨대, 혈장, 소변, 대변, 등으로부터의 단편화된 DNA); 엑소좀 또는 다른 소낭으로부터, 예를 들어, 체액 등으로부터 단리된 DNA를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이는 시편 또는 배양물(예를 들어, 미생물 배양물)을 포함하는 것을 의미하는 반면, 다른 실시형태에서, 이는 생물학적 및 환경 샘플(예를 들어, 표적 서열, 유전자 또는 주형을 포함하는 것으로 의심되는) 둘 다를 포함하는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 합성 기원의 시편을 포함할 수 있다. 샘플은 정제되지 않거나 부분적으로 또는 완전히 정제되거나 달리 가공될 수 있다. 핵산을 "함유하는 것으로 의심되는" 샘플은 표적 핵산 분자를 함유하거나 함유하지 않을 수 있다.
본 기술은 사용되거나 분석되는 생물학적 샘플의 유형에 의해 제한되지 않는다. 본 기술은 인간(예를 들어, 성인, 유아, 또는 배아) 또는 동물(예를 들어, 소, 가금류, 마우스, 래트, 개, 돼지, 고양이, 말, 등)로부터 얻어진, 조직(예를 들어, 장기(예를 들어, 심장, 간, 뇌, 폐, 위, 장, 비장, 신장, 췌장, 및 생식 기관), 선, 피부, 및 근육), 세포(예를 들어, 혈액 세포(예를 들어, 림프구 또는 적혈구), 근육 세포, 종양 세포, 및 피부 세포), 가스, 체액(예를 들어, 혈액 또는 이의 일부, 혈청, 혈장, 소변, 정액, 타액 등), 또는 고체(예를 들어, 대변) 샘플을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 다양한 생물학적 샘플에 유용하다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 고형 식품 및/또는 사료 제품 및/또는 성분, 예컨대, 유제품, 야채, 육류 및 육류 부산물, 및 폐기물일 수 있다. 생물학적 샘플은 모든 다양한 과의 가축뿐만 아니라 유제류, 곰, 어류, 토끼류, 설치류, 기족류 등과 같은 동물을 포함하지만 이로 제한되지 않는, 위험한(feral) 또는 야생 동물로부터 얻어질 수 있다.
생물학적 샘플은 또한 생검 및 조직 절편(예를 들어, 생검 또는 종양의 절편, 성장, 발진, 감염, 또는 파라핀-포매된 절편), 의료 또는 병원 샘플(예를 들어, 혈액 샘플, 타액, 구강 면봉, 뇌척수액, 흉막액, 우유, 초유, 림프, 가래, 구토물, 담즙, 정액, 난모세포, 자궁경부 세포, 양수, 소변, 대변, 모발, 및 땀을 포함하지만, 이로 제한되지 않음), 실험실 샘플(예를 들어, 세포하 분획), 및 법의학 샘플(예를 들어, 혈액 또는 조직(예를 들어, 스패터(spatter) 또는 잔류물), 핵산을 함유하는 모발 및 피부 세포), 및 고고학 샘플(예를 들어, 화석화된 유기체, 조직, 또는 세포)을 포함한다.
환경 샘플은 표면 물질, 토양, 물(예를 들어, 담수 또는 해수), 조류, 지의류, 지질학적 샘플, 핵산을 함유하는 공기 함유 물질, 결정, 및 산업용 샘플과 같은 환경 물질뿐만 아니라 식품 및 유제품 가공 기기, 기구, 장비, 도구, 일회용 및 비일회용 품목으로부터 수득된 샘플을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
샘플은 임의의 요망되거나 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 미국 특허 제9,000,146호; 및 제10,047,390호에 기술된 방법 및 시스템을 사용하여 체액, 대변, 또는 다른 샘플로부터 직접적으로 분석되고, 이러한 문헌들 각각은 모든 목적을 위해 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
그러나, 상기 기재된 예는 본 기술에 적용 가능한 샘플(예를 들어, 표적 서열, 유전자 또는 주형을 포함하는 것으로 의심되는(예를 들어, 이들의 존재 또는 부재가 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 결정될 수 있음)) 유형을 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
핵산 검출 또는 분석 방법과 관련하여 사용될 때, 용어 "표적"은, 예를 들어, 표적 핵산을 함유하는 것으로 의심되는 샘플에서 검출 또는 분석될 뉴클레오타이드의 특정 서열을 갖는 핵산을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 표적은 메틸화 상태를 결정하는 것이 바람직한 특정 서열을 갖는 핵산이다. 폴리머라제 연쇄 반응과 관련하여 사용될 때, "표적"은 일반적으로 폴리머라제 연쇄 반응에 사용되는 프라이머에 의해 결합되는 핵산의 영역을 지칭한다. 따라서, "표적"은 샘플에 존재할 수 있는 다른 핵산 서열로부터 분류되는 것으로 추구된다. "세그먼트"는 표적 서열 내의 핵산 영역으로 정의된다. 용어 "샘플 주형"은 표적의 존재에 대해 분석되는 샘플로부터 유래하는 핵산을 지칭한다.
플랩 구조, 예를 들어, 침습성 절단 구조의 핵산 가닥과 관련하여 사용되는 용어 "주형"은 업스트림 및 다운스트림의 핵산 또는 핵산 영역이 혼성화하여 침습성 절단 구조를 형성하는 가닥을 지칭한다. 주형 가닥은, 예를 들어, PCR 플랩 엔도뉴클레아제 검정에서, 폴리머라제에 의한 프라이머의 연장을 위한 주형으로서 역할을 할 수 있지만, 상기 용어의 사용은 중합 검정 또는 반응으로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산 분자"는 DNA 또는 RNA를 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 핵산 함유 분자를 지칭한다. 상기 용어는 4 아세틸사이토신, 8-하이드록시-N6-메틸아데노신, 아지리디닐사이토신, 슈도아아이소사이토신, 5-(카복시하이드록실-메틸) 우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카복시메틸-아미노메틸우라실, 다이하이드로우라실, 이노신, N6-아이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도-우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-다이메틸-구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸-사이토신, 5-메틸사이토신, 5-하이드록시메틸사이토신, 5-카복실사이토신, 5-포르밀사이토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시-아미노-메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N-아이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스터, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오사이토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸에스터, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오사이토신, 및 2,6-다이아미노퓨린을 포함하지만 이로 제한되지 않는 DNA 및 RNA의 임의의 공지된 염기 유사체를 포함하는 서열을 포함한다.
핵산 서열 또는 분자는 단일 또는 이중 가닥일 수 있고, 센스 또는 안티센스 가닥을 나타내는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA일 수 있다. 따라서, 핵산 서열은 dsDNA, ssDNA, 혼합 ssDNA, 혼합 dsDNA, ssDNA로 제조된 dsDNA(예를 들어, 용융, 변성, 헬리카제 등을 통해), A-, B-, 또는 Z-DNA, 삼중-가닥 DNA, RNA, ssRNA, dsRNA, 혼합된 ss 및 dsRNA, ssRNA로 제조된 dsRNA(예를 들어, 용융, 변성, 헬리카제 등을 통해), 메신저 RNA(mRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 전이 RNA(tRNA), 촉매 RNA, snRNA, 마이크로RNA 또는 단백질 핵산(PNA)일 수 있다.
본 기술은 사용되는 핵산(예를 들어, 서열 또는 분자(예를 들어, 표적 서열 및/또는 올리고뉴클레오타이드))의 유형 또는 공급원에 의해 제한되지 않는다. 예를 들어, 핵산 서열은 증폭되거나 생성된 서열(예를 들어, 합성을 통한 핵산 서열의 증폭 또는 생성(예를 들어, 중합(예를 들어, 프라이머 연장(예를 들어, RNA-DNA 하이브리드 프라이머 기술))) 및 역전사(예를 들어, RNA의 DNA로의)) 및/또는 증폭(예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 롤링 서클 증폭(RCA), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 전사 매개 증폭(TMA), 리가제 연쇄 반응(LCR), 사이클링 프로브 기술, Q-베타 레플리카제, 가닥 치환 증폭(SDA), 분지형-DNA 신호 증폭(bDNA), 하이브리드 포획, 및 헬리카제 의존성 증폭)일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "공정 대조군"은 외인성 분자, 예를 들어, 표적 DNA의 추출 전에 샘플에 첨가된 외인성 핵산을 지칭하고, 이는 공정의 효율을 평가하고 성공 또는 실패 모드를 결정한다. 사용되는 공정 제어 핵산의 성질은 일반적으로 검정 유형 및 측정되는 물질에 의존적이다. 예를 들어, 사용되는 검정이 이중 가닥 DNA 또는 이의 돌연변이의 검출 및/또는 정량을 위한 것이라면, 이중 가닥 DNA 공정 대조군은 통상적으로 추출 전에 샘플에 스파이킹된다. 유사하게, mRNA 또는 마이크로RNA를 모니터링하는 검정의 경우, 사용되는 공정 대조군은 통상적으로 RNA 전사체 또는 합성 RNA이다. 공정 제어는 통상적으로 공정의 효율성을 평가하고 공정 및 공정 단계의 성공 또는 실패를 결정하는 데 도움을 준다.
비-표적 DNA와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "외인성"은 표적 DNA를 함유하는 공급원 또는 샘플 이외의 공급원으로부터 분리 및 정제된 비-표적 DNA를 지칭한다. 예를 들어, 정제된 어류 DNA는, 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 미국 특허 제9,212,392호에 기재된 바와 같은 인간 표적 DNA를 포함하는 샘플에 대한 외인성 DNA이다. 외인성 DNA는 표적 DNA와 상이한 유기체로부터 유래될 필요는 없다. 예를 들어, 상업적으로 수득된 정제된 어류 DNA는 특정 어류로부터의 샘플에서 표적 핵산을 검출하도록 구성된 반응에 첨가되는 경우 외인성일 것이다. 바람직한 실시형태에서, 외인성 DNA는 외인성 DNA가 첨가되는 반응에서 표적 핵산을 검출 및/또는 정량화하도록 구성된 검정에 의해 검출되지 않도록 선택된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "어류 DNA"는, 예를 들어, 미국 특허 제9,212,392호에 기재된 바와 같은 어류로부터 단리된 벌크(예를 들어, 게놈) DNA를 지칭한다. 벌크 정제된 어류 DNA는 상업적으로 입수 가능하고, 예를 들어, 대구 및/또는 청어 정자 DNA(Roche Applied Science, 독일 만하임 소재) 또는 연어 DNA(USB/Affymetrix)의 형태로 제공된다. "어류 DNA"는 단리된 형태, 예를 들어, 별도로 합성되거나 어류 게놈의 다른 DNA로부터 분리된 어류로부터의 임의의 특정 유전자와 구별된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "제브라피쉬 DNA"는 다니오 레리오(Danio rerio)로부터 단리되거나, 다니오 레리오로부터의 DNA에서 발견되는 뉴클레오타이드의 서열을 갖도록 시험관내(예를 들어, 효소적으로, 합성에 의해) 생성된 DNA를 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 제브라피쉬 DNA는 검출 가능한 대조군 DNA, 예를 들어, 샘플 처리 단계를 통해 DNA 회복을 확인하기 위한 공정 대조군으로서 첨가된 메틸화된 DNA이다. 특히, RASSF1 유전자의 적어도 일부를 포함하는 제브라피쉬 DNA는, WO 2018/017710A1호에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 인간 샘플에 대한 공정 대조군으로서 사용되고, 이는 본 명세서에 참고로 포함되고, 인간 샘플에 대한 공정 대조군으로서 제브라피쉬 DNA의 사용을 기술하고 있다. 본 명세서에서 사용되는 "ZFRASSF1"은 제브라피쉬 RASSF1 유전자의 적어도 일부를 포함하는 공정 대조군을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 핵산의 가닥과 관련하여 사용되는 용어 "회복" 및 "회복된"은 공정(예를 들어, 완전 바이설파이트 전환 공정) 후 또는 하나 이상의 공정 단계(예를 들어, 핵산의 기질 결합 이후 결합된 가닥의 용리) 후 샘플에서 측정된 DNA의 가닥의 양 또는 수를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 회복된 가닥은 참조 값, 예를 들어, 가공 전에 샘플에 첨가되거나 존재할 것으로 예상되는 가닥의 양 또는 수, 또는 참조 샘플에서 측정되거나 참조 샘플에 존재할 것으로 예상되는 양과 비교된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "키트"는 물질을 전달하기 위한 임의의 전달 시스템을 지칭한다. 핵산 정제 시스템 및 반응 검정의 맥락에서, 이러한 전달 시스템은 시약 및 디바이스(예를 들어, 카오트로픽 염, 입자, 완충제, 변성제, 올리고뉴클레오타이드, 필터 등의 저장, 수송 또는 전달을 가능하게 하는 시스템을 포함한다. 적절한 용기) 및/또는 지지 물질(예를 들어, 샘플 처리 또는 샘플 저장 용기, 절차를 수행하기 위한 서면 지침 등)을 한 위치에서 다른 위치로 저장, 수송 또는 전달할 수 있는 시스템을 포함한다. 예를 들어, 키트는 관련 반응 시약 및/또는 지지 물질을 함유하는 하나 이상의 엔클로저(예를 들어, 박스)를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "단편화된 키트"는 각각이 전체 키트 성분의 일부를 함유하는 2개 이상의 개별 용기를 포함하는 전달 시스템을 지칭한다. 용기는 의도된 수용자에게 함께 또는 별도로 전달될 수 있다. 예를 들어, 제1 용기는 샘플 수집을 위한 물질 및 완충제를 함유할 수 있는 반면, 제2 용기는 포획 올리고뉴클레오타이드 및 변성제를 함유할 수 있다. 용어 "단편화된 키트"는 연방 식품, 의약품, 및 화장품법의 섹션 520(e)에 따라 규제되는 분석물 특이적 시약(ASR's)을 함유하는 키트를 포함하는 것으로 의도되지만, 이에 제한되지 않는다. 실제로, 각각이 총 키트 성분의 일부를 함유하는 2개 이상의 개별 용기를 포함하는 임의의 전달 시스템은 용어 "단편화된 키트"에 포함된다. 대조적으로, "조합된 키트"는 단일 용기에(예를 들어, 각각의 요망되는 성분을 수용하는 단일 박스에) 반응 검정의 모든 성분을 함유하는 전달 시스템을 지칭한다. 용어 "키트"는 단편화된 및 조합된 키트 둘 다를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "시스템"은 특정 목적을 위해 사용하기 위한 물품의 집합을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 물품은, 예를 들어, 물품, 종이, 온라인으로(예를 들어, 웹사이트 또는 웹 주소에서) 기록 가능한 매체(예를 들어, 디스켓, CD, DVD, 플래시 드라이브 등)에 제공된 정보로서 사용 설명서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 명령은 사용자를 온라인 위치, 예를 들어, 명령을 보고, 듣고, 및/또는 다운로드하기 위한 웹사이트로 안내한다. 일부 실시형태에서, 지침 또는 다른 정보는, 예를 들어, 컴퓨터 또는 모바일 장치, 예를 들어, 스마트 폰을 위한 애플리케이션("앱")으로서 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "정보"는 사실 또는 데이터의 임의의 수집물을 지칭한다. 인터넷을 포함하지만 이로 제한되지 않는 컴퓨터 시스템(들)을 사용하여 저장되거나 처리되는 정보와 관련하여, 상기 용어는 임의의 포맷(예를 들어, 아날로그, 디지털, 광학 등)으로 저장된 임의의 데이터를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체와 관련된 정보"는 대상체(예를 들어, 인간, 식물 또는 동물)에 관한 사실 또는 데이터를 지칭한다. 용어 "게놈 정보"는 핵산 서열, 유전자, 대립유전자 빈도, RNA 발현 수준, 단백질 발현, 유전자형과 관련된 표현형 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 게놈에 관한 정보를 지칭한다. "대립유전자 빈도 정보"는 대립유전자 동일성, 대립유전자의 존재와 대상체(예를 들어, 인간 대상체)의 특성 사이의 통계적 상관관계, 개인에서 대립유전자의 존재 또는 부재를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 대립유전자 빈도에 관한 사실 또는 데이터 또는 집단, 하나 이상의 특정 특징을 갖는 개체에 대립유전자가 존재할 가능성의 백분율 등을 포함한다.
발명의 상세한 설명
본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그 전체가 참조에 의해 원용된다. 본 명세서에 개시된 물질, 방법, 및 예는 단지 예시적인 것이고 제한하려는 것이 아니다.
본 명세서에 제공된 기술은 설폰화 시약으로 처리된 DNA의 변형-후 회복을 개선하기 위한 방법에 관한 것이다. 특히, 기술은 설폰화된 DNA를 하전된 표면, 예를 들어, 실리카 표면 또는 지지체, 예를 들어, 검정 웰 또는 슬라이드의 표면, 섬유, 입자, 비드 등에 결합시키는 방법을 제공한다. 이 기술은 특정 물질 및 형태의 지지체, 예를 들어, 비드 형태의 실리카와 관련하여 논의되지만, 이 기술은 다른 지지체 물질, 및 섬유, 입자, 튜브 등을 포함하는 임의의 형태 또는 구성의 지지체에 적용 가능한 것으로 이해될 것이다.
상기 방법은 비드에 대한 설폰화된 DNA의 고도로 안정한 결합을 촉진하는 조건을 제공한다. 이는 당업자가 DNA와 비드의 상호작용을 방해할 것으로 예상되는 매우 염기성인 탈설폰화 반응 조건에도 불구하고 바이설파이트-처리된 DNA의 효율적인 회복을 용이하게 한다. 본 명세서에 제공된 혁신적인 단계의 조합에 의해, 기술은 입력 DNA의 개선된 회복을 갖는 바이설파이트-전환된 DNA를 제조하기 위한 방법을 제공한다.
본 기술은 하기에 기술되고 실험예에서 개발된 실험 발견과 관련이 있다. 이러한 실시예는 핵산의 메틸화 상태의 분석에 사용되는 시약의 개발 및 시험을 기술한다. 특히, 기술은 결합 완충제의 pH가 실리카 및 우라실 설포네이트-풍부 DNA 둘 다의 등전점 pH(I) 미만이 되도록 산성 pH를 갖는 결합 용액에 관한 것이고, 이에 의해 실리카에 설폰화된 DNA의 결합을 촉진한다.
일반적인 설폰화 시약은 소듐 바이설파이트 및 암모늄 바이설파이트를 포함한다. 하기 실시예에서, 암모늄 바이설파이트가 사용되지만, 기술의 원리는 분자에 걸쳐 전하, 예를 들어, 매우 음전하를 생성하는 방식으로 처리된 임의의 DNA에 용이하게 적용될 수 있다. 예를 들어, 다른 설폰화 시약, 예를 들어, 소듐 바이설파이트로 처리된 DNA는 본 기술과 함께 사용된다.
산의 첨가 없이, 설폰화 반응의 pH는 주로 암모늄 바이설파이트에 의해 결정되고, 이는 통상적으로 실리카의 pH(I) 초과(도 2에 개략적으로 도시됨) 및 설폰화된 DNA의 pH(I) 이상의 pH를 갖는다. 그러나, 결합 반응의 pH가 실리카(또는 다른 지지체 물질) 및/또는 DNA의 pH(I) 초과인 경우, 정전기적 반발은 실리카에 대한 DNA의 완전한 결합을 방해할 수 있다. 기술을 임의의 특정 작용 기전으로 제한하는 것은 아니지만, 예를 들어, 설폰화된 DNA-실리카 비드 혼합물에 산의 첨가에 의해 산성 pH에서 결합 반응을 수행하는 것은 실리카를 중화시키고 우라실 설포네이트 기를 양성자화할 수 있는 것으로 관찰된다. DNA의 정전기적 반발을 감소시키고 실리카-설폰화된 DNA 상호작용을 촉진한다.
본 기술과 함께 사용하기에 적합한 DNA는 임의의 특정 방법에 의해 단리된 DNA로 제한되지 않으며, 적합한 DNA는 상업적 키트, 칼럼 등의 사용을 포함하는 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 샘플, 예를 들어, 대상체로부터 DNA를 단리하는 예시적인 방법은 하기에 기재되어 있다.
대변 DNA 분리
일부 실시형태에서, DNA는 대변 샘플로부터 단리될 수 있다. 본 기술과 함께 사용하기에 적합한 대변으로부터 DNA를 단리하는 예시적인 실시형태는 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 미국 특허 제9,000,146호에서 확인된다. 간략하게는, 대변 샘플을 완충제로 균질화하고, 고체를 예를 들어, 원심분리에 의해 제거하고, 표적 DNA(들)에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 입자 또는 비드를 사용하여 생성된 정화된 상청액으로부터 특정 표적 DNA를 포획한다. 포획 올리고뉴클레오타이드에 결합된 표적 DNA는, 예를 들어, 자성 비드를 수집하기 위한 자기장의 사용에 의해 용액으로부터 분리되고, 포획된 DNA는, 예를 들어, 변성 조건을 사용하여 포획 올리고뉴클레오타이드로부터의 용리 전에 임의로 완충제로 세척된다.
세포주 및 세포 배지 DNA
세포주의 경우, 무세포 게놈 DNA는, 예를 들어, "Maxwell® RSC ccfDNA Plasma Kit"(Promega Corp., 위스콘신 매디슨 소재)를 사용하여 세포-컨디셔닝된 배지로부터 분리될 수 있다. 키트 프로토콜에 따라, 1㎖의 세포 컨디셔닝된 배지(CCM)를 혈장 대신 사용하고, 키트 절차에 따라 처리한다. 용리 부피는 100㎕이고, 이 중 70㎕은 일반적으로 바이설파이트 전환에 사용된다.
혈액 또는 혈장 DNA
4㎖의 혈장 샘플, 예를 들어, 인간 혈액 샘플로부터 DNA를 단리하기 위한 예시적인 절차는 다음과 같다:
혈장 용해 완충제는 다음과 같다:
- 4.3M 구아니딘 티오사이아네이트
- 10% IGEPAL CA-630(옥틸페녹시 폴리(에틸렌옥시)에탄올, 분지형)
(4.8M 구아니딘 티오사이아네이트 45㎖와 조합된 5.3g의 IGEPAL CA-630)
ο 3㎖의 혈장 용해 완충제
ο 200㎕ 자성 실리카 결합 비드(16㎍의 비드/㎕)
ο 2㎖의 100% 아이소프로판올을 첨가한다
(선택적으로 각각의 첨가 후 혼합하고/하거나 임의로 용해 완충제 및 아이소프로판올을 혼합물에 첨가하기 전에 예비-혼합함)
GuHCl-EtOH 세척 완충제는,
- 3M GuHCl(구아니딘 하이드로클로라이드)
- 57% EtOH(에틸 알코올)
DNA 설폰화 및 정제
통상적인 바이설파이트 처리 방법에서, 바이설파이트 처리 단계에서, 비-메틸화된 사이토신 염기는 탈아민화 및 설폰화를 거쳐 음으로 하전된 우라실 설포네이트가 된다(도 1). 전환 시약을 제거하기 위해, 설폰화된 DNA 샘플은 알코올 침전되거나, 예를 들어, 겔 여과에 의해 단리될 수 있다. 설폰화된 DNA는 또한 예를 들어, 약 6 내지 7M 농도로 카오트로픽 염, 예를 들어, 구아니딘 염, 예컨대, 구아니딘 하이드로클로라이드(GuHCl) 또는 구아니딘 아이소티오사이아네이트(GITC)의 첨가에 의해 지지체, 예컨대, 실리카, 예를 들어, 반응 용기의 실리카-코팅된 표면, 실리카 입자 또는 섬유, 상자성 실리카 비드 등에 결합될 수 있다. 변성된 DNA의 고체 매트릭스에 대한 결합을 촉진하기 위한 다른 카오트로픽 결합제는 아이오다이드, 퍼클로레이트, 및 트리클로로아세테이트를 포함한다.
DNA의 바이설파이트 처리의 통상적인 방법(본 기술의 낮은 pH 결합 단계 없이)은 다음과 같다:
I. 암모늄 하이드로겐 설파이트를 사용한 DNA의 설폰화
1. 각 튜브에서, 64㎕ DNA, 7㎕ 1N NaOH, 및 0.2 ㎎/㎖ BSA 및 0.25 ㎎/㎖의 어류 DNA를 함유하는 9㎕의 담체 용액을 결합한다.
2. 42℃에서 20분 동안 인큐베이션한다.
3. 120㎕의 45% 암모늄 수소 설파이트를 첨가하고 66℃에서 75분 동안 인큐베이션한다.
4. 4℃에서 10분 동안 인큐베이션한다.
II. 자성 비드를 이용한 탈설폰화
재료
샘플은 임의의 적절한 장치 또는 기술을 사용하여 혼합되어 본질적으로 하기에 기재된 바와 같은 온도 및 혼합 속도로 샘플을 혼합하거나 인큐베이션한다. 예를 들어, Thermomixer(Eppendorf)는 샘플의 혼합 또는 인큐베이션에 사용될 수 있다. 예시적인 탈설폰화는 다음과 같다:
1. 1분 동안 병을 와동시켜 비드 스톡을 철저히 혼합한다.
2. 비드 50㎕를 2.0㎖ 튜브(예를 들어, USA Scientific으로부터)에 분취한다.
3. 비드에 750㎕의 결합 완충액을 추가한다.
4. 단계 I에서 150㎕의 설폰화된 DNA를 추가한다.
5. 혼합한다(예를 들어, 30℃에서 30분 동안 1000 RPM).
6. 자석 스탠드에 튜브를 놓고 5분 동안 그대로 둔다. 튜브를 스탠드에 놓고 상층액을 제거하고 버린다.
7. 1,000㎕의 세척 완충제를 추가한다. 혼합한다(예를 들어, 30℃에서 3분 동안 1000 RPM).
8. 자석 스탠드에 튜브를 놓고 5분 동안 그대로 둔다. 튜브를 스탠드에 놓고 상층액을 제거하고 버린다.
9. 250㎕의 세척 완충제를 추가한다. 혼합한다(예를 들어, 30℃에서 3분 동안 1000 RPM).
10. 자기 랙(magnetic rack)에 튜브를 놓고; 1분 후에 상청액을 제거하고 버린다.
11. 200㎕의 탈설폰화 완충제를 추가한다. 혼합한다(예를 들어, 30℃에서 5분 동안 1000 RPM).
12. 자기 랙에 튜브를 놓고; 1분 후에 상청액을 제거하고 버린다.
13. 250㎕의 세척 완충제를 추가한다. 혼합한다(예를 들어, 30℃에서 3분 동안 1000 RPM).
14. 자기 랙에 튜브를 놓고; 1분 후에 상청액을 제거하고 버린다.
15. 튜브에 250㎕의 세척 완충액을 추가한다. 혼합한다(예를 들어, 30℃에서 3분 동안 1000 RPM).
16. 자기 랙에 튜브를 놓고; 1분 후에 상청액을 제거하고 버린다.
17. 모든 튜브를 30℃에서 뚜껑을 연 상태로 15분 동안 인큐베이션한다.
18. 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고 70㎕의 용리 완충액을 비드에 직접 추가한다.
19. 비드를 용리-완충제(예를 들어, 40℃에서 45분 동안 1000 RPM)와 함께 인큐베이션한다.
20. 약 1분 동안 자기 랙에 튜브를 놓고; 상층액을 제거하고 저장한다.
전환된 DNA는 이후 하기에 기재된 바와 같이 검출 검정, 예를 들어, 전-증폭 및/또는 플랩 엔도뉴클레아제 검정에 사용된다.
자성 실리카 비드
본 명세서에 제공된 기술은 DNA 메틸화의 정량적 측정을 위한 바이설파이트 처리 및 DNA의 단리에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 자성 비드는 DNA, 예를 들어, 자성 코어 및 실리카 코팅을 포함하는 비드의 처리 및 단리에 사용된다. 실리카 코팅은 DNA에 결합하고 자기 코어는 자석을 사용하여 비드(및 결합된 DNA)를 농축 및 단리하는 효율적인 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 실리카-코팅된 자성 비드는 MagneSil 상자성 입자(Promega, 위스콘신 주 매디슨 소재; 카탈로그 번호 AS1220 또는 AS640A, promega.com)이다.
이 기술은 임의의 특정 유형의 자기 비드로 제한되지 않는다. 본 명세서에 기재된 기술의 실시형태는 핵산에 대한 친화성을 갖는 임의의 자성 비드(예를 들어, 상자성 비드)를 이용한다. 일부 실시형태에서, 자성 비드는 마그네타이트(예를 들어, Fe3O4) 코어 및 이산화규소(SiO2)를 포함하는 코팅을 갖는다. 핵산이 비드에 결합되는 용액의 비드 구조(예를 들어, 크기, 다공도, 모양) 및 조성은 선택적으로 핵산의 상이한 유형(예를 들어, 단일 가닥, 이중 가닥, 또는 다른 형태의 입체형태의 DNA 또는 RNA; 천연 공급원으로부터 유래되거나, 화학적으로 합성되거나, 효소적으로(예를 들어, PCR에 의해) 합성된 핵산) 및 크기(예를 들어, 작은 올리고머, 프라이머, 게놈, 플라스미드, 단편, 예를 들어, 200개 이하의 염기로 구성됨)로 결합하도록 변경될 수 있다. 비드의 이러한 특성은 비드에 대한 핵산의 결합 및 용리에 영향을 미친다. 관련 기술은, 예를 들어, 미국 특허 제6,194,562호; 제6,270,970호; 제6,284,470호; 제6,368,800호; 제6,376,194호에 기재되어 있으며, 각각은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 또한, 예를 들어, 오르가노실란(미국 특허 제4,554,088호에 기술된 바와 같음); 카복실화된 폴리아크릴레이트(미국 특허 제5,648,124호에 기술된 바와 같음); 셀룰로스(미국 특허 출원 제10/955,974호에 기술된 바와 같음); 하이드록시실란(미국 특허 출원 제11/459,541호에 기술된 바와 같음); 및 소수성 지방족 리간드(미국 특허 출원 제12/221,750호에 기술된 바와 같음)로 코팅된 자성 비드가 고려되고, 각각은 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
이 기술은 특정 크기의 자기 비드로 제한되지 않는다. 따라서, 기술의 실시형태는 다수의 상이한 크기의 자성 비드를 사용한다. 더 작은 비드는 흡착을 위해 더 많은 표면적(중량 단위 기준)을 제공하지만, 더 작은 비드는 더 큰 비드에 비해 비드 코어에 혼입될 수 있는 자성 물질의 양으로 제한된다. 일부 실시형태에서, 입자는 비드가 사용되는 기술에 적합한 정의된 평균 또는 중간 크기로 크기 범위에 걸쳐 분포된다. 일부 실시형태에서, 입자는 비교적 좁은 모노모달 입자 크기 분포를 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 기술에서 사용되는 비드는 입자의 외부로부터 접근 가능한 공극을 갖는다. 이러한 공극은 핵산, 예를 들어, DNA 단편이 입자의 내부로 들어가고 공극의 내부 표면에 결합하기에 충분히 큰 제어된 크기 범위를 갖는다. 공극은 핵산에 결합할 수 있는 큰 표면적을 제공하도록 설계된다. 또한, 일 양태에서, 기술은 핵산(예를 들어, DNA) 결합 및/또는 분리의 임의의 특정 방법으로 제한되지 않는다. 따라서, 일부 실시형태에서, 바이설파이트 반응과 관련된 기술의 양태는 DNA 단리의 다른 적합한 방법(예를 들어, 침전, 칼럼 크로마토그래피(예를 들어, 스핀 칼럼) 등)과 조합된다.
비드(및 결합된 물질)는 자기장을 사용하여 혼합물로부터 제거된다. 일부 실시형태에서, 자기장 이외에 다른 형태의 외력이 본 기술에 따라 생물학적 표적 물질을 단리하는 데 사용된다. 예를 들어, 적합한 추가 형태의 외력은 중력 여과, 진공 여과, 및 원심분리를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 기술의 실시형태는 외부 자기장을 적용하여 매질로부터 복합체를 제거한다. 이러한 자기장은 다수의 상이한 공지된 수단 중 임의의 하나를 사용하여 매질에서 적합하게 생성될 수 있다. 예를 들어, 비드를 함유하는 용액의 용기의 외부 표면에 자석을 위치시켜, 입자가 용액을 통해 이동하고 자석에 인접한 용기의 내부 표면에 수집되게 할 수 있다. 이후, 자석은 입자가 자석에 의해 생성된 자기장에 의해 용기에 유지되는 동안, 용액이 용기 밖으로 디켄팅되어 폐기되도록 용기의 외부 표면 상의 제 위치에 유지될 수 있다. 이후, 제2 용액이 용기에 첨가될 수 있고, 입자가 제2 용액으로 이동하도록 자석이 제거될 수 있다. 대안적으로, 자화 가능한 프로브를 용액에 삽입하고 프로브를 자화시켜, 입자가 용액에 침지된 프로브의 말단에 침착되도록 할 수 있다. 그 다음, 프로브는 자화된 채로 남아 있는 동안 용액으로부터 제거될 수 있고, 제2 용액에 침지될 수 있고, 자기장이 중단되어 입자가 제2 용액으로 들어갈 수 있다. 상기 일반적인 용어에 기재된 두 가지 유형의 자기 제거 및 전달 기술에 사용되도록 설계된 자석에 대한 상업적 공급원이 존재한다(예를 들어, 문헌[MagneSphere Technology Magnetic Separation Stand] 또는 PolyATract Series 9600TM Multi-Magnet(둘 다 Promega Corporation으로부터 입수 가능); Magnetight Separation Stand(위스콘신, 매디슨, 노바겐 소재); 또는 Dynal 자기 입자 농축기(노르웨이 오슬로 디날 소재) 참조). 일부 실시형태는 미국 특허 출원 제13/089116호에 기술되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 또한, 일부 실시형태는 "제트 채널" 또는 피펫 팁 자석 분리의 사용을 고려한다(예를 들어, 미국 특허 제5,647,994호 및 제5,702,950호). 일부 실시형태는 예를 들어, Thermo Scientific으로부터 상업적으로 이용 가능한 KingFisher 시스템으로 예시된 바와 같이, 함침된 프로브 방법(예를 들어, 미국 특허 제6,447,729 및 제6,448,092호에 기술된 바와 같음)의 사용을 고려한다.
DNA 가닥의 정량
본 명세서에 기재된 실시예에서, 가닥 회복은 플랩 엔도뉴클레아제 검정을 사용하여 측정되었다. 예를 들어, 혈액으로부터 샘플 핵산을 추출하고 바이설파이트-전환된 DNA 및 전환되지 않은 DNA의 가닥을 정량하기 위한 예시적인 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제10,648,025호에 기술되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
QuARTS 검정
본 기술에 따라 제조된 DNA 가닥을 정량하는 예시적인 방법은 QuARTS 플랩 검정 기술이다. QuARTS 기술은 폴리머라제 기반 표적 DNA 증폭 공정과 침습적 절단 기반 신호 증폭 공정을 결합한다. 이 기술은, 예를 들어, 미국 특허 제8,361,720호; 제8,715,937호; 제8,916,344호; 및 제9,212,392호, 및 미국 특허 출원 제15/841,006호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. QuARTS 반응에 의해 생성된 형광 신호는 실시간 PCR과 유사한 방식으로 모니터링되고 샘플에서 표적 핵산의 양의 정량을 가능하게 한다.
예시적인 QuARTS 반응은 통상적으로 약 400 내지 600 n㏖/ℓ(예를 들어, 500 n㏖/ℓ)의 각 프라이머 및 검출 프로브, 약 100 n㏖/ℓ의 침습성 올리고뉴클레오타이드, 약 600 내지 700 n㏖/ℓ의 각 FRET 카세트(예를 들어, Hologic, Inc.에 의해 상업적으로 공급되는 바와 같은 FAM, 예를 들어, Hologic, Inc.에 의해 상업적으로 공급되는 바와 같은 HEX; 및 예를 들어, BioSearch Technologies에 의해 상업적으로 공급되는 바와 같은 Quasar 670), 6.675 ng/㎕ FEN-1 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cleavase® 2.0, Hologic, Inc.), 30㎕ 반응 부피의 1 유닛 Taq DNA 폴리머라제(예를 들어, GoTaq® DNA 폴리머라제, Promega Corp., 위스콘신 매디슨 소재), 10 m㏖/ℓ 3-(n-모르폴리노)프로판설폰산(MOPS), 7.5 m㏖/ℓ MgCl2, 및 250 μ㏖/ℓ의 각 dNTP를 포함한다. 예시적인 QuARTS 사이클링 조건은 하기 표에 제시된 바와 같다. 일부 적용에서, 정량화 사이클(Cq)의 분석은 샘플에서 표적 DNA 가닥의 초기 수(예를 들어, 복사체 수)의 측정치를 제공한다.
대용량 바이설파이트-전환된 DNA의 다중 표적화된 사전-증폭
투입 샘플로부터 바이설파이트-처리된 DNA의 대부분 또는 모두를 사전-증폭시키기 위해, 처리된 DNA의 큰 부피가 단일의, 큰 부피의 다중 증폭 반응에 사용될 수 있다. 예를 들어, DNA는 상기 기재된 바와 같이, 예를 들어, Maxwell Promega 혈액 키트 # AS1400을 사용하여 세포주(예를 들어, DFCI032 세포주(선암종); H1755 세포주(신경내분비))로부터 추출된다. DNA는, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같이 바이설파이트 전환된다.
전-증폭은, 예를 들어, 7.5mM MgCl2, 10mM MOPS, 0.3mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.8mM KCl, 0.1 ㎍/㎕ BSA, 0.0001% Tween-20, 0.0001% IGEPAL CA-630, 250μM의 각각의 dNTP, 올리고뉴클레오타이드 프라이머(예를 들어, 12개의 표적의 경우, 12개의 프라이머 쌍/24개의 프라이머, 등몰량(예를 들어, 200 내지 500nM의 각 프라이머의 범위를 포함하지만 이로 제한되지 않음) 또는 상이한 표적 영역의 증폭 효율의 균형을 맞추기 위해 조정된 개별 프라이머 농도), 0.025 유닛/㎕ HotStart GoTaq 농도, 및 20 내지 50 부피%의 바이설파이트-처리된 표적 DNA(예를 들어, 10㎕의 표적 DNA를 50㎕ 반응 혼합물, 또는 50㎕의 표적 DNA를 125㎕ 반응 혼합물에)를 함유한 반응 혼합물에서 수행된다. 열 순환 시간 및 온도는 반응 및 증폭 용기의 부피에 적합하도록 선택된다. 예를 들어, 반응은 하기와 같이 순환될 수 있다.
열 순환 후, 전-증폭 반응의 분취량(예를 들어, 10㎕)을 어류 DNA의 존재 또는 부재하에 10mM Tris, 0.1mM EDTA에서 500㎕로 희석한다. 희석된 사전-증폭된 DNA의 분취량(예를 들어, 10㎕)은, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같이 QuARTS PCR-플랩 검정에 사용된다. 또한 2015년 10월 30일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/249,097호; 2016년 10월 26일자로 출원된 미국 특허 출원 제15/335,096호, 및 2016년 10월 26일자로 출원된 PCT/US16/58875호, 및 미국 특허 제10,648,025호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 모든 목적을 위해 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 기술은 플랩 엔도뉴클레아제 검정의 사용으로 제한되지 않으며, 상이한 실시형태에서, 바이설파이트-전환된 DNA를 분석하는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 분석은 직접 시퀀싱, 파이로시퀀싱, 메틸화-민감성 단일-가닥 입체형태 분석(MS-SSCA), 고분해능 용융 분석, 메틸화-민감성 단일-뉴클레오타이드 프라이머 신장(MS-SnuPE), 염기- 특이적 절단/질량 분광분석법(예를 들어, MALDI-TOF에 의함), 메틸화-특이적 PCR(MSP), 마이크로어레이 분석, 제한 분해 분석), INVADER 검정, 조합된 바이설파이트 제한 분석, 또는 메틸화된 DNA 면역침전(MeDIP)을 포함한다. 이들 및 다른 방법은, 예를 들어, 문헌[Fraga MF & Esteller M (2002), "DNA methylation: a profile of methods and applications" BioTechniques 33(3): 632, 634, 636-49; El-Maarri O (2003), "Methods: DNA methylation" Advances in Experimental Medicine and Biology 544: 197-204; Laird PW (2003), "The power and the promise of DNA methylation markers" Nat. Rev. Cancer 3(4): 253-66; Callinan PA & Feinberg AP (2006), "The emerging science of epigenomics" Hum Mol Genet 15(90001): R95-101]을 참조한다.
실험
실시예 1
바이설파이트-전환된 DNA의 회복에 대한 결합 pH의 효과
하기 기재된 실시예에서, 단일 가닥 DNA 주형을 상기 예시적인 설폰화 단계에 기재된 바와 같이 암모늄 바이설파이트(ABS)로 설폰화시켰다. DNA의 설폰화 후, 설폰화 반응 용액을 크기 배제 여과에 의해 제거하고 설폰화된 DNA를 저(19mM K+), 중간(228mM K+) 및 고(474mM K+) 농도에서 포타슘 아세테이트(KOAc)와 배합하였다. 대조군으로서, 설폰화된 DNA 주형의 일부를 포타슘 아세테이트 대신 바이설파이트 용액으로 되돌렸다.
각각의 샘플을 이어서 카오트로프 및 실리카 비드와 함께 인큐베이션하여 결합을 촉진시켰다. 하기 표 1은 바이설파이트 용액이 각 주형에 대한 높은 염 농도로 인해 결합 반응을 억제하였음을 입증한다. 결합 pH는 4.8 내지 4.9였다.
다양한 사이토신 함량(하기 표 2 참조)의 6개의 DNA 주형(마커)을 바이설파이트-처리한 다음, 5.0 내지 3.4 범위의 pH를 갖는 결합 용액을 사용하여 실리카에 결합시켰다.
결과는 도 3에 도시되어 있다. 최대 log 가닥 회복에 필요한 pH는 각각의 마커에 대해 다양하고 서열의 전환된 사이토신 백분율(즉, 처리 전 메틸화되지 않은 사이토신 뉴클레오타이드이고 결합 단계에서 우라실 설포네이트 뉴클레오타이드인 가닥에서 총 뉴클레오타이드의 백분율)과 상관관계가 있는 것으로 보인다. 높은 함량의 비메틸화 사이토신을 갖고, 따라서 결합 단계에서 우라실 설포네이트로 전환된 높은 함량의 염기를 갖는 DNA는 최대 가닥 회복을 위해 더 낮은 pH를 필요로 하였다.
총 17개의 상이한 DNA 서열을 상기와 동일한 방식으로 시험하였다. 각 DNA의 전환된 사이토신 백분율을 최대 가닥 회복에 필요한 가장 높은 추정 결합 pH에 대해 플롯팅하였다. 이러한 점의 선형 피트(도 4)는 0.76의 R2를 가지고, 이는 전환된 사이토신 퍼센트와 결합 pH 사이의 관계가 강함을 시사한다.
전환된 사이토신 비율과 결합 pH 사이의 상관 관계의 강도를 추가로 설명하기 위해, 도 3의 DNA 가닥 중 3개(BMP3, β-액틴(바이설파이트 처리된 액틴, 또는 "BTACT"), 및 NDRG4)를 변형시켜 각 시험 서열에 대해 동일한 프라이머 및 프로브 결합 서열을 보유하지만 그러한 서열의 다른 영역에서 상이한 수의 비메틸화된 C를 갖는 DNA의 세트를 제조하였다. 라인은 각각의 서열 세트에 대한 포획된 가닥 측정에 적합하였다(도 5). 네 가지 적합치 모두에 대한 기울기 및 절편(도 4 및 5)는 유사하였다.
DNA 샘플 유형의 비교
낮은 pH(시트레이트 완충제) 및 비-조정된 pH(표준 조건)에서 수행된 결합 반응으로부터의 가닥 회복을 다중 샘플 유형에 대해 비교하였다: 합성 DNA("126")의 단일-가닥 126-량체 가닥, 대변으로부터 분리된 DNA 정제된 세포주 DNA("ECLD")로 스파이킹된 샘플, 및 메틸화된 DNA("HMS")에 대해 높은 신호를 제공하는 것으로 이전에 특성화된 대변 샘플로부터 단리된 DNA(샘플 유형 및 결합 조건의 각 조합에 대해 6회 반복), 하기 표 3은 가닥 회복 결과를 보여준다. 대변 샘플로부터의 모든 DNA를 상기 기재된 포획 공정으로 단리하고, 합성 126-량체 DNA 가닥을 담체로서 외인성 어류 DNA와 배합하였다.
표 3의 결과는 낮은 pH 결합 반응의 사용이 이러한 샘플 유형 각각에 대해 유사하거나 향상된 가닥 회복을 생성하였음을 보여준다.
낮은(1x) 또는 높은(10x) 뉴클레오솜 매트릭스를 포함하는 대리 혈액 샘플을 제조하였다. 뉴클레오솜 DNA를 Active Motif Nucleosome Kit(Active Motif, 카탈로그 번호 53504)를 사용하여 HCT116 세포로부터 제조하였다. 메틸화된 DNA 마커(MDM)-양성 혈장 샘플을 모방하기 위해, 뉴클레오솜 DNA를 LBgard® 혈액 튜브(Exact Sciences, Inc.)을 사용하여 건강한 공여자로부터 수집된 풀링된 혈장에 스파이킹하거나 SERACON 음성 희석제에 스파이킹되었다. 뉴클레오솜 매트릭스 제조물의 사용은 MDM-양성 DNA가 암-양성 환자로부터의 샘플에서 예상되는 것과 유사한 크기 분포를 갖는 것을 보장한다.
샘플을 처리하여 상기 기재된 혈장 추출 절차를 사용하거나 QIASYMPHONY DSP Circulating DNA 키트(Qiagen, Inc.)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 이어서, 추출된 DNA 샘플을 상기 기재된 바와 같은 표준(비-조정된 pH) 결합 반응(ABS 반응에 첨가된 7M GuHCl 결합 완충제) 및 낮은 pH 결합 반응(133mM의 7M GuHCl 시트레이트 완충제, pH 2.2 결합 완충제)에서 바이설파이트-처리하고 결합하였다.
14개 DNA의 비교는 t-검정과 비교할 때 15/34 조건에 대해 증가된 가닥 회복을 나타내었다(하기 표 4, 5, 6 및 7). 전반적으로, 낮은 결합 pH는 다양한 샘플 유형에 대한 가닥 회복을 증가시켰다.
대변 샘플로부터 정화된 상청액으로부터 분리된 DNA
4 내지 14 mL(표준) 범위의 샘플 입력 부피를 갖는 세포주 DNA-스파이크된 대변 샘플을 처리하여 세포주 DNA를 포획한 다음, 이를 이후에 표준 pH(도 6A) 및 낮은 결합 pH 결합(도 6B) 용액을 사용하여 바이설파이트-처리하고 단리하였다. 도 6A 및 6b의 비교는 낮은 결합 pH로 총 DNA 및 가닥 회수의 개선된 선형성을 보여준다. 비-조정된(표준) 및 낮은 결합 pH에 사용된 샘플은 상이한 양의 DNA 주형이 스파이킹되었으므로, 제시된 총 가닥 회수는 결합 조건에 걸쳐 직접 비교되어서는 안 된다.
비-조정된 또는 낮은 pH 결합 조건을 사용하여 대변 샘플의 각 부피(mL)로부터 회복된 DNA의 양은 도 7의 8개 패널에 도시되어 있다.
상이한 로트의 암모늄 바이설파이트의 효과
4개의 암모늄 바이설파이트(56%) 로트를 비-조정된 낮은 결합 pH 조건으로 나란히 시험하였다. ABS 로트는 연령이 다양하였다; 가장 오래된 것은 9년이었고 가장 낮은 pH를 가졌다. 암모늄 바이설파이트는 연간 2% 포인트만큼 분해될 수 있다. pH 조정 없이 가닥 회복은 가장 오래된 물질이 가장 높은 회복을 갖는 로트에 걸쳐 다양하였다(도 8A). 낮은 결합 pH로, 회복 정렬이 개선되었다.
암모늄 바이설파이트 농도의 효과
암모늄 바이설파이트를 57%에서 43% 농도로 적정한 다음, 낮은 결합 pH(시트르산 완충제)로 결합되거나 pH 조정 없이 결합된 합성 DNA 주형으로 시험하였다. 56.6%를 기준값으로 사용하여, 표시된 마커 DNA 각각에 대해 더 낮은 ABS 농도에 대한 결합의 차이%를 계산하였다. 결과는 도 8B의 표에 제시되어 있다. ABS 농도에 걸친 가닥 회복 정렬은 낮은 결합 pH로 개선되었다.
제조 동안 도입된 미지의 결합 용액(7M 구아니딘-HCl) 오염물은 선택 마커의 회복을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 낮은 결합 pH 및 비-조정된 가닥 회복을 오염물의 유무와 비교하였을 때, 낮은 결합 pH 조건은 비-조정된 결합 조건과 비교하여 회수율의 하락을 감소시켰다(도 9).
상이한 제조사의 비드를 사용한 회복
결합 시 비-조정된 pH 또는 낮은 결합 pH로 바이설파이트 전환에 사용하기 위해 다수의 벤더로부터의 실리카 비드를 시험하였고, 결과는 각각 도 10 및 11에 도시되어 있다. 일부 비드는 비-조정된 결합 pH에서 가닥 회복을 나타내지 않았다(도 10), 감소된 결합 pH로 개선된 회복을 나타내었다(도 11). 비드 농도는 도 10의 초기 스크리닝에 대해 동일하게 조정되지 않았지만, 도 11에 도시된 시험에 대해 정렬되었다.
pH 범위에 걸친 DNA 회복
산성 조건은 DNA 주형의 산 가수분해로 인해 가닥 회복의 손실을 유발할 수 있다. 결합 pH가 4.9 내지 2.1의 범위에 걸쳐 조사될 때, 가닥 회수는 약 pH 3.9 내지 약 2.5에서 가장 일관되었다(도 12 참조).
DNA 크기 및 농도의 영향
DNA 크기 및 농도는 조직, 혈액 및 대변과 같은 샘플 유형에 따라 및 내에서 다양할 수 있다. 이 실험에서, 송아지 흉선 DNA를 200 bp, 3.6 반응, 및 20 kbp의 크기에서 300, 2700, 및 5400 ng/ran으로 적정하였다. DNA 샘플을 126 bp 합성 표적 분자로 스파이킹하고, 설폰화된 DNA의 포획을 위해 비-조정된 결합 pH 및 낮은 결합 pH를 사용하여 바이설파이트로 처리하였다. 결과는 도 13에 제시되어 있다.
DNA 크기가 감소하고 농도가 증가함에 따라, 비-조정된 결합 pH 화학에 의해 가닥 회수가 유의하게 감소하였다. 낮은 결합 pH 화학을 갖는 가닥 회수는 비-조정된 결합 pH(374%만큼)에 비해 크게 개선되었다. 또한, 변동 계수(CV)는 낮은 결합 pH 화학으로 개선되었다.
실시예 2
3개의 결합 프로토콜의 비교
하기 실시예에서, 설폰화된 DNA를 실리카에 결합시키기 위한 3개의 상이한 절차가 비교된다.
프로토콜 1은 설폰화 반응이 7M 구아니딘 하이드로클로라이드(GuHCl)의 결합 용액과 조합되지만, pH를 감소시키기 위해 산이 첨가되지 않는 표준 프로토콜이다.
프로토콜 2에서, 설폰화 반응 혼합물은 7M GuHCl, 133mM 시트레이트, pH 2.2의 결합 용액과 조합된다.
프로토콜 3에서, 설폰화 반응 혼합물은 7M GuHCl의 결합 용액과 조합되지만, pH를 감소시키기 위해 산은 첨가되지 않는다.
기재된 각각의 절차에서, 비드-결합된 설폰화된 DNA는, 예를 들어, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 미국 특허 제9,315,853호에 기재된 바와 같이, 고체 지지체 상에서 탈설폰화된다.
전환 프로토콜은 Hamilton STARlet 자동 피펫팅 시스템에서의 성능에 대해 하기에 기술되어 있지만, 동등한 장비로 수동으로 수행될 수 있다.
프로토콜 1
이 절차는 표적 DNA에 상보적인 포획 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 서열-특이적 포획 비드를 사용하여, 샘플, 예를 들어, 대변 샘플로부터 포획된 DNA의 처리를 설명한다.
변성:
1. 캡처 비드 펠릿을 세척하려면 20㎕의 90 ng/㎕ BSA, 10mM Tris pH 8.0, 1mM EDTA 및 160㎕의 100mM NaOH를 추가한다.
2. 45초 동안 1500 RPM으로 혼합하면서 43℃에서 인큐베이션하였다.
3. 혼합 없이 43℃에서 추가로 19분 15초 동안 인큐베이션하였다(총 20분).
4. 5분 동안 자석에 결합한다.
5. 80㎕의 변성 샘플을 새로운 딥 웰 플레이트로 옮긴다.
설폰화:
1. 변성된 샘플에 120㎕의 57% wt/wt 암모늄 바이설파이트(ABS)를 추가한다.
2. 3분 동안 1200 RPM으로 혼합하면서 65.5℃에서 히터 진탕기에 놓는다.
3. 혼합하지 않고 추가로 72분 동안 인큐베이션한다(총 75분).
설폰화된 DNA 결합:
1. 샘플에 750㎕의 7M GuHCl 결합 용액을 추가한다.
2. 피펫을 통해 5 주기 동안 비드 스톡을 혼합하고 각 샘플에 50㎕ 16 ㎎/㎖ 상자성 실리카 비드를 추가한다.
3. 1200 RPM으로 혼합하면서 30.5℃에서 30분 인큐베이션한다.
4. 자석에 5분 동안 놓아 비드를 결합시키고, 상청액을 폐기물로 흡인한다.
알코올 세척 1 및 2:
1. 1㎖ 80% 에탄올(EtOH), 10mM Tris pH 8.0 전환 세척을 비드 펠릿에 첨가한다.
2. 1200 RPM에서 3분 동안 혼합한다.
3. 자석에 5분 동안 놓아 비드를 결합시키고, 상청액을 폐기물로 흡인한다.
4. 250㎕ 80% EtOH, 10mM Tris pH 8.0 전환 세척을 비드 펠릿에 추가한다.
5. 1200 RPM에서 3분 동안 혼합한다.
6. 자석에 2분 동안 놓아 비드를 결합시키고, 상청액을 폐기물로 흡인한다.
탈설폰화:
1. 200㎕의 70% 아이소프로필 알코올(IPA), 105mM NaOH를 비드 펠릿에 추가한다.
2. 7분 동안 혼합하면서 1200 RPM으로 30.5℃에서 인큐베이션한다.
3. 자석에 2분 동안 놓아 비드를 결합시키고, 상청액을 폐기물로 흡인한다.
알코올 세척 3 및 4:
1. 250㎕ 80% EtOH, 10mM Tris pH 8.0 전환 세척을 비드 펠릿에 추가한다.
2. 1200 RPM에서 3분 동안 혼합한다.
3. 자석에 2분 동안 놓아 비드를 결합시키고, 상청액을 폐기물로 흡인한다.
4. 250㎕ 80% EtOH, 10mM Tris pH 8.0 전환 세척을 비드 펠릿에 추가한다.
5. 1200 RPM에서 3분 동안 혼합한다.
6. 자석에 2분 동안 놓아 비드를 결합시키고, 상청액을 폐기물로 흡인한다.
건조 비드 및 용리 DNA:
1. 비드 펠릿을 71.5℃에서 15분 동안 혼합하여 1200 RPM으로 인큐베이션하여 건조시킨다.
2. 70㎕의 10mM Tris pH 8.0, 0.1mM EDTA를 건조 비드에 추가한다.
3. 66.5℃에서 1200 RPM으로 혼합하면서 25분 동안 인큐베이션한다.
4. 8분 동안 자석에 놓아 비드를 냉각시키고 결합시킨다.
5. 변환된 DNA는 검정을 위해 준비된다.
프로토콜 2
이 절차는 표적 DNA에 상보적인 포획 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 서열-특이적 포획 비드를 사용하여, 샘플, 예를 들어, 대변 샘플로부터 포획된 DNA의 처리를 설명한다.
변성:
1. 캡처 비드 펠릿을 세척하려면 50㎕의 36 ng/㎕ BSA, 10mM Tris pH 8.0, 1mM EDTA 및 50㎕ 160mM NaOH를 추가한다.
2. 32.5℃에서 1500 RPM으로 3분 동안 혼합하면서 인큐베이션한다.
3. 5분 동안 자석에 결합한다.
4. 80㎕의 변성 샘플을 새로운 딥 웰 플레이트로 옮긴다.
설폰화:
1. 변성된 샘플에 120㎕의 52% wt/wt ABS를 추가한다.
2. 3분 동안 1200 RPM으로 혼합하면서 62.5℃에서 히터 진탕기에 놓는다.
3. 진탕 없이 추가로 85분 동안 인큐베이션한다(총 88분).
설폰화된 DNA 결합:
1. 750㎕의 7M GuHCl, 133mM 시트레이트, pH 2.2 결합 용액을 샘플에 첨가한다.
2. 피펫을 통해 5 주기 동안 비드 스톡을 혼합하고 각 샘플에 50㎕ 16 ㎎/㎖ 상자성 실리카 비드를 추가한다.
3. 1200 RPM으로 혼합하면서 32.5℃에서 15분 인큐베이션한다.
4. 자석에 5분 동안 놓아 비드를 결합시키고, 상청액을 폐기물로 흡인한다.
알코올 세척 1 및 2:
1. 1㎖ 75% IPA, 20mM Tris pH 7.8 전환 세척을 비드 펠릿에 첨가한다.
2. 1200 RPM에서 3분 동안 혼합한다.
3. 자석에 5분 동안 놓아 비드를 결합시키고, 상청액을 폐기물로 흡인한다.
4. 250㎕ 75% IPA, 20mM Tris pH 7.8 전환 세척을 비드 펠릿에 추가한다.
5. 1200 RPM에서 3분 동안 혼합한다.
6. 자석에 2분 동안 놓아 비드를 결합시키고, 상청액을 폐기물로 흡인한다.
탈설폰화:
1. 200㎕의 70% IPA, 30mM NaOH를 비드 펠릿에 추가한다.
2. 3분 동안 1200 RPM으로 혼합하면서 32.5℃에서 인큐베이션한다.
3. 자석에 2분 동안 놓아 비드를 결합시키고, 상청액을 폐기물로 흡인한다.
알코올 세척 3 및 4:
1. 250㎕ 75% IPA, 20mM Tris pH 7.8 전환 세척을 비드 펠릿에 추가한다.
2. 1200 RPM에서 3분 동안 혼합한다.
3. 자석에 2분 동안 놓아 비드를 결합시키고, 상청액을 폐기물로 흡인한다.
4. 250㎕ 75% IPA, 20mM Tris pH 7.8 전환 세척을 비드 펠릿에 추가한다.
5. 1200 RPM에서 3분 동안 혼합한다.
6. 자석에 2분 동안 놓아 비드를 결합시키고, 상청액을 폐기물로 흡인한다.
건조 비드 및 용리 DNA:
1. 비드 펠릿을 71.5℃에서 15분 동안 혼합하여 1200 RPM으로 인큐베이션하여 건조시킨다.
2. 70㎕의 3mM Tris pH 7.8, 0.1mM EDTA를 건조 비드에 추가한다.
3. 66.5℃에서 1200 RPM으로 혼합하면서 25분 동안 인큐베이션한다.
4. 25분 동안 자석에 놓아 비드를 냉각시키고 결합시킨다.
5. 변환된 DNA는 검정을 위해 준비된다.
프로토콜 3
이 절차는 실리카 지지체에 대한 카오트로프-매개 결합을 사용하여 샘플, 예를 들어, 혈장으로부터 추출된 DNA의 가공을 기술한다. DNA는 하기 변성 단계 전에 지지체로부터 용리된다.
변성:
1. 75㎕의 추출된 DNA 샘플에 11㎕의 90 ng/㎕ BSA, 10mM Tris pH 8.0, 1mM EDTA 및 11㎕의 1.0M NaOH를 첨가한다.
2. 1분 동안 1200 RPM으로 혼합하면서 실온에서 인큐베이션한다.
설폰화:
1. 변성된 샘플에 120㎕의 52% wt/wt ABS를 추가한다.
2. 3분 동안 1200 RPM으로 혼합하면서 65.5℃에서 히터 진탕기에 놓는다.
3. 혼합하지 않고 추가로 72분 동안 인큐베이션하였다(총 75분).
설폰화된 DNA 결합:
1. 샘플에 750㎕의 7M GuHCl 결합 용액을 추가한다.
2. 피펫을 통해 5 주기 동안 비드 스톡을 혼합하고 각 샘플에 50㎕ 16 ㎎/㎖ 상자성 실리카 비드를 추가한다.
3. 1200 RPM으로 혼합하면서 30.5℃에서 30분 인큐베이션한다.
4. 자석에 5분 동안 놓아 비드를 결합시키고, 상청액을 폐기물로 흡인한다.
알코올 세척 1 및 2:
1. 1㎖ 80% EtOH, 10mM Tris pH 8.0 전환 세척을 비드 펠릿에 첨가한다.
2. 1200 RPM에서 3분 동안 혼합한다.
3. 자석에 5분 동안 놓아 비드를 결합시키고, 상청액을 폐기물로 흡인한다.
4. 250㎕ 80% EtOH, 10mM Tris pH 8.0 전환 세척을 비드 펠릿에 추가한다.
5. 1200 RPM에서 3분 동안 혼합한다.
6. 자석에 2분 동안 놓아 비드를 결합시키고, 상청액을 폐기물로 흡인한다.
탈설폰화:
1. 200㎕의 75% IPA, 87.5mM NaOH를 비드 펠릿에 추가한다.
2. 7분 동안 혼합하면서 1200 RPM으로 30.5℃에서 인큐베이션한다.
3. 자석에 2분 동안 놓아 비드를 결합시키고, 상청액을 폐기물로 흡인한다.
알코올 세척 3 및 4:
1. 250㎕ 80% EtOH, 10mM Tris pH 8.0 전환 세척을 비드 펠릿에 추가한다.
2. 1200 RPM에서 3분 동안 혼합한다.
3. 자석에 2분 동안 놓아 비드를 결합시키고, 상청액을 폐기물로 흡인한다.
4. 250㎕ 80% EtOH, 10mM Tris pH 8.0 전환 세척을 비드 펠릿에 추가한다.
5. 1200 RPM에서 3분 동안 혼합한다.
6. 자석에 2분 동안 놓아 비드를 결합시키고, 상청액을 폐기물로 흡인한다.
건조 비드 및 용리 DNA:
1. 비드 펠릿을 71.5℃에서 15분 동안 혼합하여 1200 RPM으로 인큐베이션하여 건조시킨다.
2. 건조 비드에 80㎕의 4mM Tris pH 8.0, 0.1mM EDTA를 추가한다.
3. 66.5℃에서 1200 RPM으로 혼합하면서 25분 동안 인큐베이션한다.
4. 비드를 냉각시키고 결합시키기 위해 20분 동안 자석에 놓는다.
5. 변환된 DNA는 검정을 위해 준비된다.
상기 기재된 조건은 도 14의 표에 요약되고 비교된다.
상기 기재된 치료 프로토콜을 비교하기 위해, 제조업체의 설명서에 따라 MAXWELL 시스템(Promega Corp., 위스콘신주 피치버그 소재), 및 RSC Blood DNA Kit(Promega Corp., Cat # ASB1400)를 사용하여 세포주 OE33 세포(식도 암종)로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 제조된 DNA를 3개의 프로토콜 모두에 사용하고, 개재 DNA 포획 단계 없이 각 프로토콜의 변성 단계에 직접 첨가하였다. 프로토콜 1, 2, 및 3 각각에 대한 가닥 회복을 26.7, 17.8, 11.87, 7.91, 5.27, 3.52 ng/㎕의 농도에서 DNA에 대해 시험하였다. 각 조건의 4회 반복물을 시험하였다. 제조된 DNA에서 시험된 서열은 메틸화 마커 유전자 ZNF568, BMP3, B3GALT6, NDRG4, VAV3 및 ZNF682였다. 상세한 데이터는 도 15A 및 도 15B에 도시되어 있다.
도 16은 도 15A 및 도 15B에 제시된 데이터에 기초하여 프로토콜 1 및 프로토콜 3(둘 다 결합에 대한 pH 조정 없음)과 비교한 프로토콜 2(낮은 pH 결합 사용)로부터의 가닥 회수의 쌍대 비교를 갖는 표를 보여준다. 상이한 메틸화 마커 DNA에 대해.
도 17은 지시된 DNA 농도에서 프로토콜 2 대 프로토콜 1 또는 프로토콜 3(집합적으로 "프로토콜 X"로 그룹화됨)을 사용한 백분율 변화를 보여주는 그래프를 보여준다. 점선은 100%, 즉, 프로토콜 2 및 프로토콜 X를 사용한 동등한 회복을 나타낸다. 증가된 가닥 회수 수준은 시험된 더 낮은 DNA 농도에서 VAV3 마커 DNA를 제외하고 다른 두 프로토콜(둘 다 표준, 비-조정된 pH 결합 조건을 사용함)과 비교하여 프로토콜 2 방법(낮은 pH 결합 조건을 사용함)으로 나타났으며, 프로토콜 1이 더 높은 가닥 회복을 제공하였다.
완충제 비교
프로토콜 2는 GuHCl 결합 용액에서 글리신, 시트레이트, 말레이트, 또는 폼에이트 완충제를 사용하도록 변형된 설폰화된 DNA 결합 단계와 함께 상기 기재된 바와 같이 사용되었다. 완충되지 않은 대조군 반응은 결합 단계에서 완충제가 첨가되지 않은 GuHCl을 사용하였다. 결과는 도 18에 제시되어 있다.
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기재된 조성물, 방법, 및 기술의 용도의 다양한 변형 및 변형은 기재된 바와 같은 기술의 범위 및 사상을 벗어나지 않으면서 당업자에게 명백할 것이다. 기술이 특정 예시적인 실시형태와 관련하여 설명되었지만, 청구된 바와 같은 본 발명은 이러한 특정 실시형태에 지나치게 제한되지 않아야 한다는 것이 이해되어야 한다. 실제로, 분자 생물학, 진단, 약리학, 생화학, 의학, 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형은 하기 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
Claims (67)
- 방법으로서, 산성 결합 용액에서 설폰화된 DNA와 실리카 지지체를 배합하는 단계를 포함하되, 상기 산성 결합 용액은 상기 설폰화된 DNA의 등전점(isoelectric point)(pH(I)) 이하의 pH를 가지며, 설폰화된 DNA는 상기 실리카 지지체에 결합되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 실리카 지지체가 입자, 비드 및 섬유 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 실리카 지지체가 자성인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 산성 결합 용액의 pH가 5 미만인, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 산성 결합 용액의 pH가 2.0 내지 4인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 산성 결합 용액이 카오트로픽 염(chaotropic salt)을 포함하는, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 카오트로픽 염이 구아니딘 하이드로클로라이드(GuHCl) 및 구아니딘 아이소티오사이아네이트(GITC) 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법이 단일-가닥 비-설폰화된 DNA 또는 부분-설폰화된 DNA를 설폰화 시약과 함께 인큐베이션하여 설폰화된 DNA를 제조하는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 설폰화 시약이 암모늄 바이설파이트 및 소듐 바이설파이트 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
i) 설폰화된 DNA에 결합된 실리카 지지체를 세척하는 단계;
ii) 상기 설폰화된 DNA를 탈설폰화시켜 탈설폰화된 DNA를 형성시키는 단계; 및
iii) 상기 실리카 지지체로부터 상기 탈설폰화된 DNA를 용리시키는 단계
중 적어도 하나를 더 포함하는, 방법. - 제8항에 있어서, 비-설폰화된 DNA를 설폰화 시약과 함께 인큐베이션하는 것은 상기 설폰화된 DNA의 pH(I) 이상의 pH를 갖는 설폰화 반응 용액에서 수행되는, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 설폰화 반응 용액의 적어도 일부가 상기 산성 결합 용액에서 상기 설폰화된 DNA와 상기 실리카 지지체의 조합 전에 상기 설폰화된 DNA로부터 제거되는, 방법.
- 제12항에 있어서, 본질적으로 모든 상기 설폰화 반응 용액이 상기 산성 결합 용액에서 상기 설폰화된 DNA와 상기 실리카 지지체를 배합하기 전에 상기 설폰화된 DNA로부터 제거되는, 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 설폰화 반응 용액의 적어도 일부가 크기 배제 여과에 의해 설폰화된 DNA로부터 제거되는, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 산성 결합 용액이 상기 설폰화 반응 용액에서 상기 설폰화된 DNA에 산성 성분을 첨가함으로써 형성되는, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 산성 성분이 산성 용액인, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 산성 성분이 산성 아세테이트, 글리신, 말레이트, 폼에이트 또는 시트레이트 용액 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 산성 성분이 카오트로픽 염을 포함하는, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 카오트로픽 염이 GuHCl 및 GITC 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
- 탈설폰화된 DNA를 제조하는 방법으로서,
i) 단일-가닥 비-설폰화된 DNA 또는 부분-설폰화된 DNA를 설폰화 시약과 함께 인큐베이션하여 설폰화 반응 혼합물에서 설폰화된 DNA를 제조하는 단계;
ii) 상기 설폰화 반응 혼합물을
a) 산성 성분; 및
b) 카오트로픽 염; 및
c) 실리카 지지체
와 배합하여, 산성 결합 용액을 형성하는 단계로서, 상기 산성 결합 용액은 상기 설폰화된 DNA의 등전점(pH(I)) 이하의 pH를 가지며, 설폰화된 DNA는 상기 실리카 지지체에 결합되는, 상기 산성 결합 용액을 형성하는 단계;
iii) 상기 산성 결합 용액으로부터 상기 실리카 지지체에 결합된 설폰화된 DNA를 분리하는 단계;
iv) 상기 설폰화된 DNA가 탈설폰화되는 조건 하에서 분리된 설폰화된 DNA를 처리하는 단계를 포함하는, 방법. - 제20항에 있어서, 상기 비-설폰화된 DNA가 하나 이상의 비메틸화된 사이토신 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 탈설폰화된 DNA가 하나 이상의 데옥시우라실 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 설폰화된 DNA가 탈설폰화되는 조건 하에서 분리된 설폰화된 DNA를 처리하는 단계가 설폰화된 DNA를 탈설폰화 용액과 배합하는 것을 포함하는, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 탈설폰화 용액이 상기 실리카 지지체에 결합된 설폰화된 DNA와 조합되는, 방법.
- 카오트로픽 염을 포함하는 산성 결합 용액 중에 설폰화된 DNA 및 실리카 지지체를 포함하는 조성물로서, 상기 산성 결합 용액은 상기 설폰화된 DNA의 pH(I) 이하의 pH를 가지며, 상기 설폰화된 DNA는 상기 실리카 지지체에 결합되는, 조성물.
- 제24항에 있어서, 상기 카오트로픽 염이 GuHCl 및 GITC 중 적어도 하나를 포함하는, 조성물.
- 제24항에 있어서, 상기 산성 결합 용액이 아세테이트, 글리신, 말레이트, 폼에이트 또는 시트레이트 완충제 중 적어도 하나를 포함하는, 조성물.
- 제26항에 있어서, 상기 산성 결합 용액이 시트레이트 완충제를 포함하는, 조성물.
- 제24항에 있어서, 상기 산성 결합 용액이 바이설파이트 염을 포함하는, 조성물.
- 제28항에 있어서, 상기 바이설파이트 염이 암모늄 바이설파이트인, 조성물.
- 제24항에 있어서, 상기 산성 결합 용액의 pH가 5 미만인, 조성물.
- 제30항에 있어서, 상기 산성 결합 용액의 pH가 2.0 내지 4인, 조성물.
- 키트로서,
i) 바이설파이트 시약 용액 또는 바이설파이트 시약 용액을 제조하기 위한 성분들;
ii) 실리카 지지체; 및
iii) 설폰화된 DNA의 pH(I) 이하의 pH를 갖는 산성 성분
을 포함하는, 키트. - 제32항에 있어서, 상기 바이설파이트 시약 용액이 설폰화된 DNA의 pH(I)보다 큰 pH를 갖는, 키트.
- 제32항에 있어서, 상기 산성 성분이 산성 용액인, 키트.
- 제33항에 있어서, 상기 산성 성분이 아세테이트, 글리신, 말레이트, 폼에이트 또는 시트레이트 완충제 중 적어도 하나를 포함하는, 키트.
- 제32항에 있어서, 카오트로픽 염을 더 포함하는, 키트.
- 제36항에 있어서, 상기 산성 성분이 카오트로픽 염을 포함하는, 키트.
- 제36항에 있어서, 상기 카오트로픽 염이 GuHCl 및 GITC 중 적어도 하나를 포함하는, 키트.
- 제32항에 있어서, 상기 실리카 지지체가 입자, 비드 및 섬유 중 적어도 하나를 포함하는, 키트.
- 제32항에 있어서, 상기 실리카 지지체가 자성인, 키트.
- 제32항에 있어서, 상기 산성 성분의 pH가 5 미만인, 키트.
- 제41항에 있어서, 상기 산성 성분의 pH가 2.0 내지 4인, 키트.
- 방법으로서, 산성 결합 용액에서 설폰화된 DNA와 실리카 지지체를 배합하는 단계를 포함하되, 상기 산성 결합 용액은 상기 설폰화된 DNA의 등전점(pH(I)) 이하의 pH를 가지며, 설폰화된 DNA는 실리카 지지체에 결합되고, 상기 실리카 지지체는 바람직하게는 입자, 비드 및 섬유 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 실리카 지지체는 바람직하게는 자성인, 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 산성 결합 용액의 pH가 5 미만, 바람직하게는 4 미만, 바람직하게는 약 2.0 내지 4인, 방법.
- 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 산성 결합 용액이 카오트로픽 염을 포함하고, 상기 카오트로픽 염은 바람직하게는 구아니딘 하이드로클로라이드(GuHCl) 및 구아니딘 아이소티오사이아네이트(GITC) 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
- 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 단일-가닥 비-설폰화된 DNA 또는 부분-설폰화된 DNA를 설폰화 시약과 함께 인큐베이션하여 상기 설폰화된 DNA를 제조하는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 설폰화 시약이 암모늄 바이설파이트 및 소듐 바이설파이트 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
- 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
i) 설폰화된 DNA에 결합된 실리카 지지체를 세척하는 단계;
ii) 상기 설폰화된 DNA를 탈설폰화시켜 탈설폰화된 DNA를 형성시키는 단계; 및
iii) 상기 실리카 지지체로부터 상기 탈설폰화된 DNA를 용리시키는 단계
중 적어도 하나를 더 포함하는, 방법. - 제48항에 있어서, 비-설폰화된 DNA를 설폰화 시약과 함께 인큐베이션하는 것은 상기 설폰화된 DNA의 pH(I) 이상인 pH를 갖는 설폰화 반응 용액에서 수행되는, 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 설폰화 반응 용액의 적어도 일부가 상기 산성 결합 용액 중에서 상기 설폰화된 DNA와 상기 실리카 지지체를 배합하기 전에 상기 설폰화된 DNA로부터 제거되는, 방법.
- 제50항에 있어서, 본질적으로 모든 상기 설폰화 반응 용액이 상기 산성 결합 용액 중에서 상기 설폰화된 DNA와 상기 실리카 지지체를 배합하기 전에 상기 설폰화된 DNA로부터 제거되는, 방법.
- 제50항 또는 제51항에 있어서, 상기 설폰화 반응 용액의 적어도 일부가 크기 배제 여과에 의해 상기 설폰화된 DNA로부터 제거되는, 방법.
- 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 결합 용액이 상기 설폰화 반응 용액 중에서 상기 설폰화된 DNA에 산성 성분을 첨가함으로써 형성되는, 방법.
- 제53항에 있어서, 상기 산성 성분이 산성 용액인, 방법.
- 제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 산성 성분이 산성 아세테이트, 글리신, 말레이트, 폼에이트 또는 시트레이트 용액 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
- 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 성분이 카오트로픽 염을 포함하고, 상기 카오트로픽 염은 바람직하게는 GuHCl 및 GITC 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
- 탈설폰화된 DNA를 제조하는 방법으로서,
i) 단일-가닥 비-설폰화된 DNA 또는 부분-설폰화된 DNA를 설폰화 시약과 함께 인큐베이션하여 설폰화 반응 혼합물 중에서 설폰화된 DNA를 제조하는 단계;
ii) 상기 설폰화 반응 혼합물을
a) 산성 성분;
b) 카오트로픽 염; 및
c) 실리카 지지체
와 배합하여, 산성 결합 용액을 형성하는 단계로서, 상기 산성 결합 용액은 상기 설폰화된 DNA의 등전점(pH(I)) 이하의 pH를 가지며, 설폰화된 DNA는 상기 실리카 지지체에 결합되는, 상기 산성 결합 용액을 형성하는 단계;
iii) 상기 산성 결합 용액으로부터 상기 실리카 지지체에 결합된 설폰화된 DNA를 분리하는 단계;
iv) 상기 설폰화된 DNA가 탈설폰화되는 조건 하에서 분리된 설폰화된 DNA를 처리하는 단계
를 포함하되, 바람직하게는 상기 비-설폰화된 DNA는 하나 이상의 비메틸화된 사이토신 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 탈설폰화된 DNA는 하나 이상의 데옥시우라실 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법. - 제57항에 있어서, 상기 설폰화된 DNA가 탈설폰화되는 조건 하에서 분리된 설폰화된 DNA를 처리하는 단계가 설폰화된 DNA를 탈설폰화 용액과 배합하는 것을 포함하는, 방법.
- 제58항에 있어서, 상기 탈설폰화 용액이 상기 실리카 지지체에 결합된 설폰화된 DNA와 조합되는, 방법.
- 카오트로픽 염을 포함하는 산성 결합 용액 중에 설폰화된 DNA 및 실리카 지지체를 포함하는 조성물로서, 상기 산성 결합 용액은 상기 설폰화된 DNA의 pH(I) 이하의 pH를 가지며, 상기 설폰화된 DNA는 상기 실리카 지지체에 결합되고,
상기 카오트로픽 염은 바람직하게는 GuHCl 및 GITC 중 적어도 하나를 포함하고; 상기 산성 결합 용액은 바람직하게는 아세테이트, 글리신, 말레이트, 폼에이트 또는 시트레이트 완충제 중 적어도 하나, 바람직하게는 시트레이트 완충제를 포함하는, 조성물. - 제60항에 있어서, 상기 산성 결합 용액이 바이설파이트 염, 바람직하게는 암모늄 바이설파이트를 포함하는, 조성물.
- 제60항 또는 제61항에 있어서, 상기 산성 결합 용액의 pH가 5 미만, 바람직하게는 2.0 내지 4인, 조성물.
- 키트로서,
i) 바이설파이트 시약 용액 또는 바이설파이트 시약 용액을 제조하기 위한 성분들로서, 상기 바이설파이트 시약 용액은 바람직하게는 설폰화된 DNA의 pH(I)보다 큰 pH를 갖는, 상기 바이설파이트 시약 용액 또는 바이설파이트 시약 용액을 제조하기 위한 성분들;
ii) 실리카 지지체; 및
iii) 산성 성분, 바람직하게는 산성 용액으로서, 상기 산성 성분은 설폰화된 DNA의 pH(I) 이하의 pH를 가지며, 상기 산성 성분은 바람직하게는 아세테이트, 글리신, 말레이트, 폼에이트 또는 시트레이트 중 적어도 하나, 바람직하게는 시트레이트 완충제
를 포함하는, 산성 성분을 포함하는, 키트. - 제63항에 있어서, 카오트로픽 염을 더 포함하고, 바람직하게는 상기 산성 성분은 카오트로픽 염을 포함하고, 상기 카오트로픽 염은 바람직하게는 GuHCl 및 GITC 중 적어도 하나를 포함하는, 키트.
- 제63항 또는 제64항에 있어서, 상기 실리카 지지체가 입자, 비드 및 섬유 중 적어도 하나를 포함하는, 키트.
- 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 실리카 지지체가 자성인, 키트.
- 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 성분의 pH가 5 미만이고, 바람직하게는 상기 산성 성분의 pH가 2.0 내지 4인, 키트.
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