KR20130102612A - 모체 혈액에서 태아 세포의 농화 및 확인 및 이러한 용도의 리간드 - Google Patents

모체 혈액에서 태아 세포의 농화 및 확인 및 이러한 용도의 리간드 Download PDF

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브리타 크리스텐센
스틴 콜브라
마리에 브린치
리푸다멘 싱
로테 하트
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Abstract

본 발명은 태아 세포 특이적 리간드 및/또는 태아 세포 특이적 잡종화 프로브를 사용하는 모체 혈액 샘플 중 태아 세포의 농화 및/또는 확인과 관련되며 리간드 또는 프로브는, 농화의 첫 번째 라운드에서, 내피 세포/중간엽 마커, 예를 들어, CD105, CD146 또는 CD141에 관련되고 리간드 또는 프로브는, 농화의 두 번째 라운드에서, 시토케라틴, 예를 들어, CK7, CK8, CK18 또는 CK19와 같은 상피 세포 마커에 관련된다. 농화된 또는 확인된 태아 세포는 검출 또는 진단의 단계를 받을 수도 있으며, 그러므로 본 발명은 비-침습적 태아 진단을 가능하게 한다.

Description

모체 혈액에서 태아 세포의 농화 및 확인 및 이러한 용도의 리간드{ENRICHMENT AND IDENTIFICATION OF FETAL CELL IN MATERNAL BLOOD AND LIGANDS FOR SUCH USE}
태아 질환 및 유전적 이상의 조기 검출을 위한 태아 세포의 검사는 특히 모체의 나이가 많을 때 (35살 이상) 또는 가족에 유전적 질환이 알려져 있는 경우, 많은 임신과 관련하여 수행된다. 태아 세포는 생체 조직 검사가 태반으로부터 취해지는 경우, 소위 침습적 샘플링의 경우, 양수 진단 (amniocentesis), 양막 주머니 내의 양막강으로부터 양수의 제거에 의해 또는 융모막 생체 조직 검사에 의해 얻어질 수도 있다.
태아 이수성 (aneuploidy) 스크리닝은 태아의 가장 흔한 비정상 염색체, 특히 염색체 13, 18, 21, X 및 Y의 수적인 이상의 설명을 위해 전통적인 염색체 분석 또는 염색체 특이적 DNA 프로브를 이용한다.
상기 설명된 샘플링 방법의 침습적 및 낙태의 위험으로 인해, 비-침습적 과정, 예를 들어, 모체 혈액 샘플의 사용에 의해 태아 진단을 수행하는 것이 유리할 것이다.
임신 중에 태아 기원의 다양한 세포 타입은 태반을 통과하고 모체의 말초 혈액 내에 순환한다. 진단의 목적으로 모체 순환에서 태아 세포를 사용할 가능성은 태아 세포가 매우 제한된 숫자로만 모체 혈액에 존재한다는 사실에 의해 저해되며, 보고된 숫자는 105-108개의 유핵 모체 세포 당 하나의 태아 세포 또는 모체 혈액 ml 당 1-10개의 태아 세포이다. 추가로 대부분의 태아 세포는 형태학에만 기초하여서는 모체 세포와 구별될 수 없고, 따라서 태아 세포의 확인의 대체 방법이 조사되었다.
US2007/0015171는 태아 DNA의 분리 및 검출을 위한 비-침습적 방법을 설명한다. 방법은 모체 세포에 특이적으로 결합하는 항체 및/또는 태아 세포에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 모체 혈액 샘플을 농화한다. 발명자는 특이적으로 언급된 소수의 항체의 사용을 제안한다: HLe-1은 성숙한 사람 백혈구 및 매우 미숙한 적혈구 전구체 상에 존재하지만, 성숙한 유핵 적혈구 상에는 존재하지 않는 항원을 인식하는 항체이다. 따라서, 이 항체가 모체 백혈구를 인식하지만 태아 유핵 적혈구는 인식하지 않도록 사용될 수 있다는 것으로 제안된다. 항-단핵 백혈구 항체 (M3) 및 항-림프구 항체 (L4)는 또한 샘플로부터 모체 세포의 제거를 위해 제안된다. 결국, 저자는 단클론성 항체의 사용을 제안하고, 이것은 태아 세포 상의 트랜스페린 수용체 (TfR)을 인식한다. 이후에 분리된 태아 세포의 DNA는 검출 및 진단에 이용 가능해진다.
WO2008/132753은 아넥신 IV, 시토케라틴-7, 시토케라틴 8 및 시토케라틴-19로 구성된 그룹으로부터 선별되는 영양 세포 마커를 생물학적으로 샘플 발현하는 세포에서 검출로 영양 세포를 확인하는 방법을 설명한다. 영양 세포는 포유동물 배아 또는 태아의 태반으로부터 유도되는 상피 세포로서 나타난다; 영양 세포는 전형적으로 자궁 벽과 접촉한다. 영양 세포의 세 개의 타입; 융모성 세포 영양 모세포 (cytotrophoblast), 합포체 영양 세포 (synsytiotrophoblast) 및 융모 외 영양 세포 (extravillous trophoblast)가 언급된다. 중요하게는, 발명자가 임신 제 1 삼분기 (first trimester) 태반으로부터 분리된 영양 세포의 섬유아세포 오염의 정도를 평가하는 비멘틴에 대한 단클론성 항체를 사용하였다. 따라서, 이들 발명자에 의해 분리된 영양 세포는 비멘틴을 포함하지 않는다.
Gussin et al., 2004는 조혈모세포 배양 조건에 반응하지 않는 모체의 혈액에서 태아 세포는 내피 세포를 나타낸다고 가정하였다. 그들은 태아 기원의 내피 간세포가 CD133 또는 CD105의 발현에 기초하여 모체 혈액으로부터 선별되고 배양에서 확장될 수도 있는지 조사하였다. 저자는 모체 혈액으로부터 분리된 CD133+ 및 CD105+ 세포가 내피 세포 조건 하에 시험관 내에서 확장될 수 있다고 결론지었다. 이 세포들은 태아 기원 대신에 모체 기원인 것으로 나타난다.
따라서, 예를 들어, 태아 검출 및 진단이 가능하도록 모체 혈액 샘플로부터 태아 세포를 분리하는 개선된 방법에 대한 필요가 남아있다.
본 발명은 모체 혈액 샘플의 태아 세포의 확인 및/또는 농화에 사용될 수 있는 항원의 확인에 기초한다. 특히 본 발명은 모체 혈액 샘플에서 태아 세포가 내피 세포 및 상피 세포의 특징 둘 다를 나타낸다는 놀라운 발견에 기초한다. 이 변화를 이용함으로써 발명자는 모체 혈액 샘플에서 태아 세포를 농화하고 확인하는 새로운 방법을 제공하고 또한 이 목적을 위한 새로운 항원을 개시한다.
본 발명의 바람직한 첫 번째 구체예에서, 모체 혈액 샘플은 내피 세포 마커와 접촉되고 내피 세포의 표현형을 갖는 세포는 이로 인해 상기 내피 세포 마커에 특이적인 세포를 선별함으로써 농화된다. 모체 혈액 샘플에서 태아 세포를 확인하는 이러한 방법은
a.모체 혈액 샘플 또는 이들의 분획을 제공하는 단계
b. 샘플을 내피 세포 마커를 암호화하는 유전자 또는 내피 세포 마커에 결합하는 리간드에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브와 접촉시키는 단계 및
c. 상기 내피 세포 마커에 특이적인 세포를 농화하는 단계
d. 내피 세포의 표현형을 나타내는, b)에서 선별된 세포를 상피 세포 마커를 암호화하는 유전자 또는 상피 세포 마커에 관련된 리간드에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브와 접촉시키는 단계
e. 단계 c)의 상피 세포 마커에도 결합하는, 내피 세포의 표현형을 갖는 세포를 검출하는 단계
f. 임의로, d)에서 검출된 세포의 유전적 내용물을 진단 및/또는 예측하는 단계
를 포함하며, 단계 b-e는 어떤 순서로도 수행될 수 있다.
도 1. X 및 Y 특이적 프로브에 의해 확인된 남성 태아 세포. 화살표는 태아 세포를 나타낸다.
도 2. 모체 혈액의 ml 당 태아 세포의 빈도.
도 3. 판시토케라틴 염색을 나타내는 태아 세포. 화살표는 태아 세포를 나타낸다.
도 4. 시토케라틴 7 염색을 나타내는 태아 세포. 화살표는 태아 세포를 나타낸다.
도 5. 비멘틴 염색을 나타내는 태아 세포. 화살표는 태아 세포를 나타낸다.
도 6. 시토케라틴 (녹색)으로 및 염색체 21 (적색) 및 X 염색체 (청색)에 대한 FISH 프로브로 염색된 태아 세포. 화살표는 태아 세포에서 염색체 21의 세 개의 카피를 가리킨다. 모체 세포의 배경은 각각 두 개의 카피의 염색체 21을 함유한다.
본 발명은 모체 혈액 샘플의 태아 세포의 확인 및/또는 농화에 사용될 수 있는 항원의 확인에 기초한다. 특히 본 발명은 모체 혈액 샘플에서 태아 세포가 내피 세포 및 상피 세포의 특징 둘 다를 나타낸다는 놀라운 발견에 기초한다. 본 발명은 먼저 모체 혈액 샘플에 존재하는 태아 세포가 혈액에서 정상 모체 세포 중 아무것도 겪지 않는 독특한 변화를 겪는다는 것을 개시한다. 이미 초기 배반포 (blastocyst) 단계로부터 배아의 세포는 세 개의 배엽 (germ layer), 즉 내배엽 (endoderm), 중배엽 (mesoderm) 및 외배엽 (ectoderm)으로 분화한다. 중배엽은 근육, 지방 및 혈관과 같은 연조직 세포를 나타낸다. 외배엽 및 내배엽은 외표면 및 내표면을 커버하는 상피 세포를 나타낸다. 중배엽 및 외배엽 세포는 마커 발현 패턴에서 명백한 차이를 갖는다. 상피세포-중간엽 변화 (Epithelial-mesenchymal transition; EMT)은 상피 세포가 그것들의 상피 세포의 특징을 상실하고 중간엽-유사 표현형을 얻는 과정이다. EMT는 배아 상피 세포의 이동 및 일시적 탈분화가, 예를 들어, 신경관의 형성에 필요한 경우 초기 배발생 (embryogenesis)에서 설명되었다. EMT는 또한 여러 종양 형성 경로가 EMT를 유발하는 경우 암에 관하여 설명되었다. EMT는 특히 최근 수년 동안 변화 과정에 관하여 연구되었다.
본 발명은 발명자에 의해 만들어진, 모체 혈액에 존재하는 태아 세포가 EMT를 겪는다는 인식과 관련되고 이 특징을 이용함으로써 본 발명은 모체 혈액 샘플에 존재하는 태아 세포를 분리하고 확인하는 새로운 방법을 제공한다. 양성 선별 마커로서 중배엽 마커 (즉, 내피 세포 마커)를 이용함으로써 모체 혈액 샘플에 매우 적은 숫자로 존재하는 태아 세포는 일부 모체 세포와 함께 농화된다. 태아 세포의 양성 확인은 이후에 남은 세포들을 상피 세포 마커와 접촉시킴으로써 수행되고 이로 인해 EMT 현상을 이용한다. 혈액 샘플에 존재하는 정상 모체 세포 중 아무것도 상피 세포 마커를 발현하지 않는다.
이 변화를 이용함으로써 발명자는 모체 혈액 샘플에서 태아 세포를 농화하고 확인하는 새로운 방법을 제공하고 또한 이러한 목적을 위한 새로운 항원을 개시한다.
따라서 본 발명의 방법은 내피 세포 마커를 발현하는 세포의 분리 후 세포의 검출을 포함하며, 이것은 추가로 상피 세포 마커를 발현한다.
확인된 항원은 mRNA 또는 mRNA에 의해 암호화되는 단백질 (항원)을 검출하거나 정량함으로써 모체 혈액 샘플에서 태아 세포의 확인에 사용될 수도 있다. 용어 검출이 여기에 사용될 때, 그것은 검출 및 정량 둘 다를 커버한다. 하지만, 두 개의 별도의 구체예에서, 용어 검출은 검출 또는 정량을 커버한다. 일반적으로, 당업자는 검출이 또한 정량을 커버할 때, 즉, 그것이 mRNA 수준 또는 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 수준을 정량하는 것이 적절할 때를 인식할 것이다. 이것은, 예를 들어, 모체 세포에서 낮은 수준 (하지만 없지는 않음)으로 발현되는 특정 mRNA의 검출에, 및 같은 mRNA가 태아 세포에서, 예를 들어, 3배 더 높은 수준으로 발현되는 경우에 필요할 수도 있다.
여기에서 용어 농화가 사용될 때, 그것은 샘플에 존재하는 다른 세포 중 어떤 것으로부터 하나 이상의 세포의 분리를 커버한다. 한 구체예에서, 농화된 세포(들)는 샘플로부터 분리되지 않지만 샘플에 존재하는 동안 세포(들)에서 어떤 진단도 수행된다. 샘플은 유리 슬라이드 상에 존재할 수도 있고 진단은 현미경을 사용하여 수행될 수도 있고 이 구체예에서 세포는 분리되기보다 검출된다.
본 발명자가 만든 또 다른 발견은 모체 샘플의 세포를 고정하는 단계가 샘플의 태아세포의 확인 및 농화를 크게 돕는다는 것이다. 이 고정 단계는 여기에 설명된 태아 세포를 농화 및/또는 확인하는 방법으로 또는 선행 업계 (예를 들어, 배경 섹션에 설명된 US2007/0015171)에 설명되었던 태아 세포를 농화 및/또는 확인하는 방법으로 수행될 수도 있다.
모체 혈액 샘플의 세포의 고정
본 발명의 한 구체예에서, 모체 혈액 샘플의 세포의 고정이 모체 혈액 샘플에서 태아 세포의 안정성을 크게 증가시키는 한편, 예를 들어, 여기에서 상기 추가로 설명된 바와 같이 태아 세포의 농화 및 확인을 허용하는 발견. 한 구체예에서, 고정 과정은 샘플링 후 즉시 비-농화 혈액 샘플에서 수행될 수 있으며 (즉, 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 a), 모체 혈액 샘플에서 세포 성분의 고정을 발생시킨다. 동시에 모체 적혈구가 이후의 용해 단계에서 선별적으로 용해될 수 있도록 고정이 매우 부드러워야 한다. 고정은 한 구체예에서 첫 번째 구체예에서 설명된 방법의 단계 a-d 사이의 어떤 적합한 시점에서도 수행될 수 있다. 한 구체예에서, 고정은 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 a 후에 수행된다. 또 다른 구체예에서 고정은 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 b 후에 수행된다. 또 다른 구체예에서, 고정은 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 c 후에 수행된다. 또 다른 구체예에서, 고정은 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 d 후에 수행된다.
바람직한 구체예에서, "본 발명의 개요"에 설명된 바와 같은 본 발명의 첫 번째 구체예의 방법은
a. 모체 혈액 샘플 또는 이들의 분획을 제공하는 단계
b. 상기 모체 혈액 샘플의 세포를 고정하는 단계
c. 샘플을 내피 세포 마커를 암호화하는 유전자 또는 내피 세포 마커에 결합하는 리간드에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브를 접촉시키는 단계 및
d. 상기 내피 세포 마커에 특이적인 세포를 농화하는 단계
e. 내피 세포의 표현형을 나타내는, b)에서 선별된 세포를 상피 세포 마커를 암호화하는 유전자 또는 상피 세포 마커에 관련된 리간드에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브와 접촉시키는 단계
f. 단계 c)의 상피 세포 마커에도 결합하는, 내피 세포의 표현형을 갖는 세포를 검출하는 단계
g. 임의로, d)에서 검출된 세포의 유전적 내용물을 진단 및/또는 예측하는 단계
를 포함하며, 단계 c-e는 어떤 순서로도 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 구체예는
a. 모체 혈액 샘플 또는 이들의 분획을 제공하는 단계
b. 샘플을 고정 용액과 접촉시키는 단계
를 포함하는 방법이다.
바람직하게, 모체 혈액 샘플은 얻어진 후 즉시 고정 용액과 접촉된다. 본 맥락에서 사용된 바와 같이 용어 즉시는 샘플이 고정 용액과 접촉되기 전에 어떤 다른 조작도 받지 않는다는 것을 의미한다. 바람직하게, 샘플은 제공된 후 24시간 이하 동안 고정 용액과 접촉된다. 더 바람직하게는, 샘플은 제공된 후 12시간 이하, 예를 들어, 8시간, 4시간, 2시간, 1시간, 30분, 15분 동안 고정 용액과 접촉된다. 가장 바람직하게, 샘플은 제공된 후 1시간 이하 동안 고정 용액과 접촉된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 고정 용액은 바람직하게 임의의 침전 단계, 예를 들어, 중력에 의한 침전 또는 원심분리에 의한 침전 전에 전혈 (whole blood)에 추가된다.
고정은 바람직하게 1 내지 60분 동안 수행된다. 더 바람직하게, 고정은 5 내지 30분 동안 수행되고 가장 바람직하게, 고정은 5분 내지 15분, 예를 들어, 10분 동안 수행된다.
고정 용액은 바람직하게 2.5% 내지 7.5%, 더 바람직하게, 3% 내지 6%, 및 가장 바람직하게 4% 내지 5% 파라포름알데히드를 포함한다.
파라포름알데히드 외에, 고정 용액은 바람직하게 0.05M 내지 0.3M의 농도로 염을 포함한다. 더 바람직하게 농도는 0.1 내지 0.2M이고 가장 바람직한 것은 0.125 내지 0.175M의 농도이다. 염은 바람직하게 LiCl, KCl, NaCl 또는 PBS이며, PBS가 가장 바람직하다.
상기 언급된 농도의 고정 용액이 사용될 때, 고정을 위해 0.2 내지 10배의 고정 용액을 모체 혈액 샘플에 추가하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게 0.5 내지 5배가 추가되고 가장 바람직하게 1 내지 3배가 추가된다. 전형적으로 2/3배가 추가된다. 또 다른 구체예에서, 1/3 내지 3/3배, 예를 들어, 2/3배의 고정 용액을 추가하는 것이 바람직하다.
다양한 농도의 고정 용액 및 희석의 배수는, 예를 들어, 고정 용액이 모체 혈액 샘플에 추가된 후 원하는 최종 농도를 제공하도록 조정될 수 있다. 바람직하게, 파라포름알데히드의 최종 농도는 2 내지 6%, 더 바람직하게 3 내지 5% 및 가장 바람직하게 3.5% 내지 4.5%이다. 전형적인 최종 농도는 4%이다.
바람직하게, 고정 단계는
c. 단계 a의 고정된 샘플을 용해 완충액과 접촉시키는 단계
를 포함하는 용해의 단계 후 이어진다.
용해 완충액은 전형적으로 비-이온성 세제, 바람직하게 Triton X-100을 포함한다. 세제의 바람직한 농도는 0.01 중량% 내지 0.5 중량%, 더 바람직하게 0.05%-0.3%, 및 가장 바람직하게 0.5 중량%이다.
바람직한 구체예에서, 용해 단계는 고정 단계 후 즉시 수행된다. 그것은 고정 및 용해 둘 다가 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 a 후에 및 단계 b 전에 수행된다는 것이다. 즉, 용해 용액은, 예를 들어, 10분 동안 고정 후에 샘플에 직접적으로 추가된다. 용해는 전형적으로 15분 내지 120분, 더 바람직하게 30 내지 60분 및 가장 바람직하게 40 내지 45분의 기간 동안 수행된다.
상기 언급된 바와 같이, 용해 단계는 바람직하게 모체 적혈구의 선별적 용해를 허용한다.
여기에서 상기 설명된 바와 같이, 본 발명의 또 다른 구체예는 모체 혈액 샘플 또는 이들의 분획에서 모체 적혈구의 선별적 용해를 위한 용해 완충액의 사용이다. 바람직한 구체예에서, 용해 완충액은 본 발명의 방법에 사용되는 것이고 용해 완충액은 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 a 후에 모체 혈액 샘플 또는 이들의 분획에 추가될 수도 있다.
모체 혈액 샘플과 리간드 또는 프로브의 접촉
본 발명의 한 구체예는 모체 혈액 샘플에서 태아 세포를 선별하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
a. 모체 혈액 샘플 또는 이들의 분획을 제공하는 단계
b. 샘플을
i. 내피 세포 마커를 암호화하는 유전자에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브 또는
ii. 내피 세포 마커에 관련된 리간드
와 접촉시키는 단계
c. 이전 단계의 잡종화 프로브 또는 리간드에 결합하는 세포를 선별하고 이로 인해 이전 단계의 잡종화 프로브 또는 리간드에 결합하는 세포에 대해 샘플을 농화하는 단계
d. 단계의 (농화된) 샘플을
i. 상피 세포 마커를 암호화하는 유전자에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브 또는
ii. 상피 세포 마커에 관련된 리간드
와 접촉시키는 단계를 포함한다.
바람직하게, 방법은 샘플의 태아 세포를 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 명백해지는 바와 같이, 확인은 바람직하게 태아 세포 상에 또는 안에 상피 세포 마커에 관련된 리간드의 존재를 검출하는 단계 또는 태아 세포 상에 또는 안에 상피 세포 마커를 암호화하는 유전자에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 모체 혈액 샘플은 내피 세포 마커에 결합하는 리간드 또는 잡종화 프로브 또는 상기 마커를 암호화하는 유전자와 접촉되고 이로 인해 내피 세포의 표현형을 갖는 세포는 상기 내피 세포 마커에 특이적인 세포를 선별함으로써 농화된다. 이러한 방법은
a. 모체 혈액 샘플 또는 이들의 분획을 제공하는 단계
b. 샘플을 내피 세포 마커를 암호화하는 유전자 또는 내피 세포 마커에 관련된 리간드에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브를 포함하는 잡종화 프로브와 접촉시키는 단계, 및
c. 상기 내피 세포 마커에 특이적인 세포를 선별하고 이로 인해 내피 세포의 표현형을 갖는 세포에 대해 샘플을 농화하는 단계
d. 내피 세포의 표현형을 나타내는, c)에서 선별된 세포를 상피 세포 마커를 암호화하는 유전자에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드 또는 상피 세포 마커에 관련된 리간드를 포함하는 잡종화 프로브와 접촉시키는 단계
e. 단계 d)의 상피 세포 마커에도 결합하는, 내피 세포의 표현형을 갖는 세포를 검출하는 단계
f. 임의로, e)에서 검출된 세포의 유전적 내용물을 진단 및/또는 예측하는 단계
를 포함하며, 단계 b-e는 어떤 순서로도 수행될 수 있다.
당업자들은 한 구체예에서 상기 설명된 단계 b, c, d, e 및 f는 어떤 순서로, 바람직하게 상기 설명된 순서로 또는 b, d, c, e, 및 f의 순서로, 더 바람직하게 상기 설명된 순서로 수행될 수 있다는 것을 알 것이다. 따라서, 한 구체예에서, 샘플은 잡종화 프로브 또는 내피 세포 마커에 관련된 리간드와 접촉된 후 선별 단계가 수행되기 전에 같은 샘플을 잡종화 프로브 또는 상피 세포 마커에 관련된 리간드와 접촉시킨다.
바람직한 구체예에서, 내피 세포 마커는 CD105, CD146 또는 CD141, 비멘틴, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, ITGA5, ITGB5, CDH11 또는 CDH3으로 구성된 그룹으로부터 선별된다. 본 발명의 내피 세포 마커는 주로 내피 세포 내에 또는 상에 발현되는 마커이다. 상기 내피 세포 마커는 특히 어떤 다른 세포 타입 내에 또는 상에 발현되지 않는다. 가장 바람직한 것은 CD105 (SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2)이다.
바람직한 구체예에서, 상피 세포 마커는 CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK9, CK10, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 또는 CK19로 구성된 그룹으로부터 선별된다. 본 발명의 상피 세포 마커는 주로 상피 세포 내에 또는 상에 발현되는 마커이다. 상기 상피 세포 마커는 특히 어떤 다른 세포 타입 내에 또는 상에 발현되지 않는다.
바람직한 구체예에서, 방법은 샘플을 M30 항체 (또는 사멸성 CK18에 관련된 또 다른 리간드)와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상피 세포 마커는 CK4, CK5, CK6A, CK6B, CK7, CK8, CKIO, CK13 및 CK18로 구성된 그룹으로부터 선별된다. 가장 바람직한 것은 CK18 (SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 13)이다.
본 발명에 사용되는 항원 및 암호화 유전자는 표 1에서 확인된다.
표 1:
Figure pct00001
Figure pct00002
첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 b에 사용되는 항원 및 암호화 유전자는 바람직하게 표 2에서 선별된다. 따라서, 본 발명의 개요에 설명된, 본 발명의 첫 번째 구체예의 방법의 단계 b)의 내피 세포 마커는 바람직하게 표 2의 유전자에 의해 암호화된 마커로부터 선별된다.
표 2:
Figure pct00003
첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 d에 사용되는 항원 및 암호화 유전자는 바람직하게 표 3에서 선별된다. 따라서, 본 발명의 개요에 설명된, 본 발명의 첫 번째 구체예의 방법의 단계 d)의 상피 세포 마커는 바람직하게 표 3의 유전자에 의해 암호화된 마커로부터 선별된다.
표 3:
Figure pct00004
첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 b 및 d의 잡종화 프로브 (본 발명의 개요 참조)는 유전자의 암호화 가닥 또는 비-암호화 가닥에 상보성일 수도 있다는 것을 주목해야 한다. 바람직하게, 프로브는 암호화 가닥 (비-주형 가닥)에 상보성이다. 관련된 구체예에서, 프로브는 mRNA에 관련된다. 프로브가 mRNA에 관련된 것이면, 그것은 스플라이스 접합 (splice junction)에 관련될 수도 있으며, 이것은 DNA에서 분할된다는 것을 의미한다.
용어 "이들의 분획"은 모체 혈액 샘플이 리간드 또는 잡종화 프로브와 직접적으로 접촉될 수도 있거나 리간드 또는 잡종화 프로브와 접촉될 때 원래의 모체 혈액 샘플의 분획을 포함하기 위해서만 모체 혈액 샘플이 사전 가공될 수도 있다는 것을 나타내기 위해 사용된다. 모체 혈액 샘플은 리간드 또는 잡종화 프로브와 접촉되기 전에, 예를 들어, 그것의 세포의 농축, 응고 단계 또는 농화 단계를 받게 될 수도 있다.
바람직한 구체예에서, 방법은
a. 모체 혈액 샘플 또는 이들의 분획을 제공하는 단계
b. 샘플을
i. 사람 비멘틴을 암호화하는 유전자에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브 및/또는
ii. 사람 비멘틴에 관련된 리간드
와 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 방법은
a. 모체 혈액 샘플 또는 이들의 분획을 제공하는 단계
b. 샘플을
i. 사람 시토케라틴 7을 암호화하는 유전자에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브 및/또는
ii. 사람 시토케라틴 7에 관련된 리간드
와 접촉시키는 단계를 포함한다.
더 바람직한 구체예에서, 방법은
a. 모체 혈액 샘플 또는 이들의 분획을 제공하는 단계
b. 샘플을
i. CD105를 암호화하는 유전자에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브 및/또는
ii. CD105 (SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2)에 관련된 리간드
와 접촉시키는 단계
c. 샘플을
i. 시토케라틴 7 (SEQ ID NO: 7)을 암호화하는 유전자에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브 및/또는
ii. 모체 혈액 샘플이 내피 세포 마커, 바람직한 구체예에서, CD105와 접촉된 후 수행에서 사람 시토케라틴 7에 관련된 리간드
와 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 방법은
a. 모체 혈액 샘플 또는 이들의 분획을 제공하는 단계
b. 샘플을
i. 사람 시토케라틴 1-6, 8, 10 및 13-19를 암호화하는 유전자로 구성된 그룹의 유전자에 상보성인, 교차 반응하는 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브
ii. 사람 시토케라틴 1-6, 8, 10 및 13-19에 관련된, 교차 반응하는 리간드
와 접촉시키는 단계를 포함한다.
이 구체예에서, 리간드는 다수의 시토케라틴, 즉, 시토케라틴 1-6, 8, 10 및 13-19와 결합할 수 있다. 이 교차 반응성은 리간드가 시토케라틴의 보존된 (동일한) 영역으로 유도함으로써 이루어질 수 있다. 유사하게, 교차 반응하는 잡종화 프로브는 프로브가 언급된 시토케라틴을 암호화하는 유전자의 보존된 (동일한) 영역으로 유도함으로써 설계될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 방법은
a. 모체 혈액 샘플 또는 이들의 분획을 제공하는 단계
b. 샘플을
i. CD105를 암호화하는 유전자에 상보성인, 적어도 10개의 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브 및/또는
ii. CD105에 관련된 리간드
와 접촉시키는 단계
c. 샘플을
i. 사람 시토케라틴 1-6, 8, 10 및 13-19를 암호화하는 유전자로 구성된 그룹의 유전자에 상보성인, 교차 반응하는 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브 및/또는
ii. 사람 시토케라틴 1-6, 8, 10 및 13-19에 관련된 교차 반응하는 리간드
와 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 잡종화 프로브 또는 리간드 (각각의 항원 또는 유전자에 대하여 하나)의 혼합물은 교차 반응하는 잡종화 프로브 또는 교차 반응하는 리간드에 대한 대안으로서 사용된다.
한 이러한 구체예에서, 방법은
a. 모체 혈액 샘플 또는 이들의 분획을 제공하는 단계
b. 샘플을
i. CD105를 암호화하는 유전자에 상보성인, 적어도 10개의 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브 및/또는
ii. CD105에 관련된 리간드
와 접촉시키는 단계 및
c. 샘플을
i. 사람 시토케라틴 1-6, 8, 10 및 13-19를 암호화하는 유전자로 구성된 그룹의 유전자에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브, 사람 시토케라틴 7을 암호화하는 유전자에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브 및 사람 비멘틴을 암호화하는 유전자에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브를 포함하는, 잡종화 프로브의 혼합물
ii. 사람 시토케라틴 1-6, 8, 10 및 13-19에 관련된 교차 반응하는 리간드, 사람 시토케라틴 7에 관련된 리간드 및 사람 비멘틴에 관련된 리간드를 포함하는 리간드의 혼합물
과 접촉시키는 단계를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 내피 세포 마커 (즉, CD105) 및 상피 세포 마커 (즉, 시토케리틴 7) 둘 다에 반응성인 세포는 이후 추가의 분석을 위해 확인되고 선별된다.
바람직한 구체예에서, 단계 b는 바람직하게 여기에서 하기 설명된 바와 같이 잡종화 프로브를 이용하고 단계 d는 여기에서 하기 설명된 바와 같이 리간드를 이용한다.
전혈 선별
한 구체예에서, 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 a의 모체 혈액 샘플은 전혈이다, 즉, 혈액은 내피 세포 마커에 관련된 리간드 또는 내피 세포 마커를 암호화하는 유전자에 관련된 잡종화 프로브와 접촉되기 전에 어떤 분별법도 받지 않았다.
고정 및 선별적 용해
본 발명의 바람직한 구체예에서, 모체 혈액 샘플의 세포는 본 발명의 한 구체예에 설명된 바와 같이 고정된다. 모체 세포의 수는 모체 혈액 샘플에 존재하는 태아 세포의 수를 크게 초과하며, 따라서, 모체 세포가 분석되는 샘플로부터 제거되는 농화의 단계를 포함하는 것이 유용할 수도 있다. 농화 단계는 과정 중에 어떤 적합한 시점, 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 a 후의 단계로서 가장 적합한시점에서 수행될 수도 있다. 어떤 태아 세포도 제거하지 않기 위해, 농화 단계가 다른 태아 유핵 세포 타입 사이를 구별하지 않는 것이 바람직하다. 혈액 샘플에서 모체 세포의 큰 분획은 적혈구에 의해 포함된다. 적혈구를 제거하는 다수의 방법이 알려져 있고, 가장 편리한 것은 적혈구 용해이며, 이것은 NH4Cl 매개 용해에 의해 성취될 수도 있다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 모체 적혈구는 고정 후 즉시 선별적으로 용해된다. 따라서 모체 혈액 샘플에서 태아 세포를 확인하는 방법은
a. 모체 혈액 샘플 또는 이들의 분획을 제공하는 단계
b. 상기 모체 혈액 샘플이 적혈구 용해를 받게 함으로써 태아 세포를 농화하는 단계
c. 남은 세포를 고정하는 단계,
d. 샘플을 내피 세포 마커를 암호화하는 유전자 또는 내피 세포 마커에 결합하는 리간드에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브를 접촉시키는 단계 및
e. 상기 내피 세포 마커에 특이적인 세포를 농화하는 단계
f. 내피 세포의 표현형을 나타내는, b)에서 선별된 세포를 상피 세포 마커를 암호화하는 유전자에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드 또는 상피 세포 마커에 관련된 리간드를 포함하는 잡종화 프로브와 접촉시키는 단계
g. 단계 c)의 상피 세포 마커에도 결합하는 내피 세포의 표현형을 갖는 세포를 검출하는 단계
h. 임의로, d)에서 검출된 세포의 유전적 내용물을 진단 및/또는 예측하는 단계
를 포함하며, 단계 b-e는 어떤 순서로도, 바람직하게는 상기 지시된 순서로 수행될 수 있다.
침투화 ( permeabilization )
또 다른 구체예에서, 상기 설명된 바와 같이 리간드 또는 잡종화 프로브와 접촉되기 전에 모체 혈액 샘플의 세포는 침투화 단계를 받는다. 즉, 침투화 단계는 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 b 전에 수행된다. 이 단계는 바람직하게 샘플을 메탄올, 아세톤 또는 사포닌과 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직하게, 침투화제는 메탄올이다. 따라서 모체 혈액 샘플에서 태아 세포를 확인하는 방법은
a. 모체 혈액 샘플 또는 이들의 분획을 제공하는 단계
b. 상기 모체 혈액 샘플의 세포를 침투화하는 단계,
c. 샘플을 내피 세포 마커를 암호화하는 유전자 또는 내피 세포 마커에 결합하는 리간드에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브와 접촉시키는 단계 및
d. 상기 내피 세포 마커에 특이적인 세포를 농화하는 단계
e. 내피 세포의 특징으로 나타내는, b)에서 선별된 세포를 상피 세포 마커를 암호화하는 유전자에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드 또는 상피 세포 마커에 관련된 리간드를 포함하는 잡종화 프로브와 접촉시키는 단계
f. 단계 c)의 상피 세포 마커에도 결합하는 내피 세포의 표현형을 갖는 세포를 검출하는 단계
g. 임의로, d)에서 검출된 세포의 유전적 내용물을 진단 및/또는 예측하는 단계
를 포함하며, 단계 b-e는 어떤 순서로도 수행될 수 있다.
양성 선별
바람직하게, 항원 의존적 농화는 실시예 섹션에서 및 본 발명의 한 구체예에서 설명된 바와 같이 모체 혈액 샘플을 CD105와 관련된 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 즉, 한 구체예에서, 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 b는 항원 의존적 단계이다.
바람직한 구체예에서, 모체 혈액 샘플은 상피 세포에 관련된 리간드 또는 잡종화 프로브와 접촉되기 전에 CD105에 관련된 항체를 사용하여 고정되고, 용해되고 농화된다 (즉, 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 d).
효능
본 발명의 바람직한 구체예는 태아 세포 확인을 상업적으로 가능하게 만드는데, 그것은 태아 세포의 확인을 위해 분석되어야 하는 개개의 세포의 수를 극적으로 낮추기 때문이다. 본 발명은 약 20 내지 30개의 슬라이드의 자동화된 스캐닝을 사용하여 분석될 수 있는 샘플에서 세포의 수를 10 내지 20배 감소시킨다. 즉, 본 발명은 태아 세포 확인에 사용되는 태아 세포 특이적 항원을 제공할 뿐만이 아니다. 그것은 또한 태아 세포 확인을 위해 분석되어야 하는 세포의 수를 극적으로 감소시키는 농화 방법을 제공한다. 방법은 모체 혈액 샘플의 및 단지 20 내지 30개의 슬라이드/106-107개의 총 세포의 분석과 일치하는 0.1 내지 1.1개의 태아 세포/ml의 일정한 확인을 가능하게 한다. 세포에 의해 커버되는 슬라이드의 영역은 전형적으로 15 mm x 15 mm이며 방법의 효능을 추가로 강조한다.
잡종화 프로브
섹션 "본 발명의 개요"에서 본 발명의 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 b 및 d의 잡종화 프로브는 일반적으로 업계에서와 같이 사용되고 전형적으로 DNA 또는 RNA이며, 바람직하게 DNA이다. 바람직한 구체예에서, 프로브는 결합 친화도 및/또는 결합 특이성를 개선하는 비-자연 뉴클레오티드로 변형된다. 이러한 비-자연 뉴클레오티드의 바람직한 예는 LNA (잠긴 핵산; locked nucleic acid), TINA (비틀린 인터칼레이팅 핵산; twisted nucleic acid), PNA (펩티드 핵산; peptide nucleic acid), INA (인터칼레이팅 핵산; interclating nucleic acid), 모폴리노 및 2'O-치환된 RNA 모노머, 예를 들어, 2'O-메틸 RNA 모노머 및 2'0-(2-메톡시에틸) RNA이다.
프로브의 길이는 어떤 적합한 길이, 예를 들어, 10 내지 200개의 뉴클레오티드, 바람직하게 10 내지 30개의 뉴클레오티드, 더 바람직하게 15-25개의 뉴클레오티드일 수도 있고 바람직하게, 프로브는 사람 시토케라틴 1, 2, 3, 4 (SEQ ID NO: 3), 5 (SEQ ID NO: 4), 6A (SEQ ID NO: 5), 6B (SEQ ID NO: 6), 7 (SEQ ID NO: 7), 8 (SEQ ID NO: 8), 10 (SEQ ID NO: 9), 13 (SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 11), 14, 15, 16, 17, 18 (SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 13) 및 19, CD105 (SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2) 및/또는 사람 비멘틴을 암호화하는 유전자에 프로브의 길이를 너머 완벽히 상보성이다. 한 구체예에서, 프로브는 표 1-3에 설명된, 바람직하게 표 2의 단백질 중 어떤 것을 암호화하는 유전자에 프로브의 길이를 너머 적어도 85% 상보성, 예를 들어, 적어도 90% 상보성, 예를 들어, 적어도 95% 상보성이다. 프로브는 상기 단백질을 암호화하는 DNA 또는 mRNA에 상보성일 수도 있다.
한 구체예에서, 프로브는 사람 시토케라틴 1, 2, 3, 4 (SEQ ID NO: 3), 5 (SEQ ID NO: 4), 6A (SEQ ID NO: 5), 6B (SEQ ID NO: 6), 7 (SEQ ID NO: 7), 8 (SEQ ID NO: 8), 10 (SEQ ID NO: 9), 13 (SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 11), 14, 15, 16, 17, 18 (SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 13) 및 19, CD105 (SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2) 및/또는 사람 비멘틴을 암호화하는 유전자에 프로브의 길이를 너머 적어도 85% 상보성, 예를 들어, 적어도 90% 상보성, 예를 들어, 적어도 95% 상보성이다. 프로브는 상기 단백질을 암호화하는 DNA 또는 mRNA에 상보성일 수도 있다. 한 바람직한 구체예에서, 프로브는 CD105 (SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2)를 암호화하는 유전자에 프로브의 길이를 너머 완벽히 상보성이다. 또 다른 바람직한 구체예는 프로브가 CK18 (SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 13)을 암호화하는 유전자에 프로브의 길이를 너머 완벽히 상보성이다.
한 구체예에서, 섹션 "본 발명의 개요"에서 본 발명의 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 b에 사용되는 잡종화 프로브는 CD105, 비멘틴, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PAI-1 및 EPCR로 구성된 그룹으로부터 선별되는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드에 잡종화하는 잡종화 프로브로부터 선별될 수도 있다. 가장 바람직한 것은 CD105 (SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2)이다.
한 구체예에서, 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 d에 사용되는 잡종화 프로브는 CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 및 CK19로 구성된 그룹으로부터 선별되는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드에 잡종화하는 잡종화 프로브로부터 선별될 수도 있다.
가장 바람직한 것은 CK18 (SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 13)이다.
리포터 염료 ( reporter dye )
"본 발명의 개요"에 설명된 본 발명의 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 b 및 d에서 본 발명에 따라 사용되는 잡종화 프로브 및 리간드는 리포터 염료 (여기에서 표지로도 불림)를 포함하거나 바람직하게 이에 결합될 수도 있다. 상기 잡종화 프로브 또는 리간드는 바람직하게 리포터 염료에 공유 결합된다. 리포터 염료는 바람직하게 형광 발광 리포터 염료이다. 바람직하게, 리포터 염료는 FAM™, TET™, JOE™, VIC™, SYBR® 그린, 6 FAM, HEX, TET, TAMRA, JOE, ROX, 플루오레세인, Cy3, Cy5, Cy5.5, 텍사스 레드, 로다민, 로다민 그린, 로다민 레드, 6-카르복시로다민 6G, 알렉사 플루오르, 오레곤 그린 488, 오레곤 그린 500 및 오레곤 그린 514로 구성된 그룹으로부터 선별된다.
한 구체예에서, 잡종화 프로브는 또한 퀸쳐 염료 (quenching dye)를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 소멸 염료는 TAMRA™, Black Hole Quencher™, DABCYL, BHQ-1, BHQ-2, DDQ I, DDQ II 및 이클립스 다크 퀸쳐 (Eclipse Dark Quencher)로 구성된 그룹으로부터 선별된다.
리포터 및 퀸쳐 염료의 사용은 그것이 확인 외에 다양한 종류의 정량을 허용하기 때문에 바람직하다.
전형적으로, 리포터 염료 및 퀸쳐 염료는 잡종화 프로브에서 서로 가까이 위치하며, 퀸쳐 염료에 의해 퀸치되는 리포터에 의해 방출되는 빛- 또는 레이져-유발 형광발광을 허용한다. 올리고뉴클레오티드가 상보성 주형 가닥에 결합할 때, 퀸쳐가 더 이상 리포터의 신호를 퀸치하지 않는, 리포터 염료 및 퀸쳐 염료는 서로 분리된다, 즉, 잡종화가 검출된다.
따라서, 한 구체예에서, 잡종화 프로브는 스템-루프 구조 (stem-loop structure)를 형성할 수 있으며, 퀸쳐 및 리포터 염료는 스템 (stem)에서 근위로 이동된다. 한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 소위 분자 표지이다. 주형 가닥에 대한 분자 표지 염기쌍일 때, 퀸쳐 및 리포터는 더 이상 근위에 있지 않다. 그러므로, 리포터 염료의 레이져-유발 신호는 더 이상 퀸치되지 않는다.
리포터 염료 및 퀸쳐 염료를 사용하는 대신에, 기증자 형광체 및 수령자 형광체를 포함하는, 소위 FRET (형광성 공명 에너지 전이 (fluorescence resonance energy transfer)) 쌍이 사용될 수도 있다. 기증자 형광체가 외부 광원에 의해 들뜰 때, 그것은 파장으로 빛을 방출하며, 이것은 수령자 형광체를 들뜨게 만들고, 이것은 차례로 다른 파장으로 빛을 방출하고, 이것은 검출되고 측정될 수 있다. 기증자 형광체 및 수령자 형광체가 가까운 근위에 있으면 에너지는 기증자에서 수령자에게로만 전이된다.
바람직한 FRET 쌍은 BFP-YFP, CFP-YFP, GFP-DsRed, GFP-Cy3, GFP-mOrange, YFP-RFP, FAM-ROX, FAM-Cy5, FAM-Hex, FAM-TAMRA 및 Cy3-Cy5를 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 b에 사용되는 잡종화 프로브 및 리간드는 바람직하게 리포터 염료에 결합되며, 상기 리포터 염료는 같은 방법의 단계 d에 사용되는 잡종화 프로브 및 리간드에 결합된 리포터 염료와 다르다.
리간드
첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 b 및 d에서 본 발명의 방법에 사용되는 바와 같이 리간드는 바람직하게 항체, 펩티드 또는 압타머이다. 본 발명의 방법에 사용된 바와 같이 리간드는 바람직하게 다른 세포에 결합하는 것보다 더 높은 친화도로 주로 원하는 세포(들)에 결합한다. 따라서 바람직하게 리간드는 주로 상기 내피 세포 마커 또는 상기 상피 세포 마커에 결합한다.
리간드는 압타머일 수도 있고, 압타머는 단백질과 같은 항원에 결합하는, 핵산 기반 높은-친화도 리간드이다. 그것들은 전형적으로 SELEX (시험관 증폭 선별법; systematic evolution of ligands by exponential enrichment)와 같은 시험관 내 진화 기술을 사용하여 확인된다. SELEX에서, 초기 라이브러리로부터 반복된 라운드의 핵산의 선별 및 증폭은 높은-친화도 압타머의 확인에 사용된다. 초기 라이브러리가 매우 크기 때문에 (예를 들어, 1014개의 다른 서열) 및 서열이 반복된 라운드 중에 돌연변이가 될 수도 있기 때문에, 높은 친화도 압타머의 확인은 현재 일상적으로 수행될 수 있고 이러한 방법은 당업자에게 알려져 있다. 바람직한 압타머는 길이가 50개 이하의 뉴클레오티드이다.
높은 친화도 펩티드는 파지 디스플레이 (phage display)를 사용하여 발생될 수도 있다. 파지 디스플레이에서, 펩티드를 표시하는 파지의 라이브러리는 표적에 대하여 선별되고 이후 SELEX와 유사한 진화 과정에서 증폭된다. 파지 디스플레이를 위한 다양한 시스템이 존재하고 펩티드의 크기는 특정 필요에 맞게 선별될 수도 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 방법으로 사용되는 펩티드는 50개 미만의 아미노산의 크기를 갖는다.
종종 라이브러리는 스카폴드 (scaffold), 예를 들어, 항체 스카폴드에서 표시된다. 따라서, 파지 디스플레이는 높은 친화도 항체를 확인하기 위해 사용될 수도 있다. 항체 발생을 위한 다른 시험관 내 진화 기술은 mRNA 디스플레이, 리보솜 디스플레이 및 공유결합 DNA 디스플레이를 수반한다.
리간드는 또한 항체일 수도 있다. 본 발명에 따르는 항체는 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함하는, 항원을 인식하고 이에 결합할 수 있는 폴리펩티드 또는 단백질이다. 상기 항원 결합 부위는 바람직하게 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 항체는 자연 발생한 항체, 자연 발생한 항체의 단편 또는 합성 항체일 수도 있다. 용어 "자연 발생한 항체"는 항원을 인식하고 이에 결합할 수 있고 이황화 결합에 의해 서로 결합된 두 개의 동일한 중쇄 (H) 및 두 개의 동일한 경쇄 (L)를 포함하는 헤테로테트라머 당단백질을 나타낸다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 부위 (여기에서 VH로 축약됨) 및 중쇄 불변 부위 (여기에서 CH로 축약됨)을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 부위 (여기에서 VL로 축약됨) 및 경쇄 불변 부위 (여기에서 CL로 축약됨)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 추가로 프레임워크 (framework; FR) 영역으로 불리는, 더 많이 보존되는 영역과 함께 배치된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는, 초가변성의 영역으로 세분될 수 있다. 항체는 다수의 동일한 헤테로테트라머를 포함할 수도 있다. 항체는 또한 마우스, 래트, 염소, 토끼, 말 등과 같이 적합한 동물의 면역화를 사용하여 발생될 수도 있다.
본 발명에 사용된 항체는 단클론성 또는 다클론성일 수도 있다. 두 타입의 항체를 발생시키는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상기 약술된 시험관 내 진화 방법 외에, 단클론성 항체는 전형적으로 히브리도마 (hybridoma) 기술을 사용하여 제조된다.
바람직한 구체예에서, 리간드는 CK1, CK2, CK3; CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK10, CK13, CK14, CK15. CK16, CK17; CK18; CK19, CD105, 비멘틴, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PAI-1, EPCR, CD9, ITGA5, ITGB5, CDH11, CDH3, CPM, CD39, CD200, EPHB4 및 PAR-1로 구성된 그룹으로부터 선별되는 항원을 인식하고 이에 결합하는 항체 또는 압타머이다.
바람직한 구체예에서, 섹션 "본 발명의 개요"에서 본 발명의 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 b에 사용되는 리간드는 CD105, 비멘틴, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PAI-1 및 EPCR로 구성된 그룹으로부터 선별된다. 더 바람직한 것은 CD105 (SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2)이다.
바람직한 구체예에서, 섹션 "본 발명의 개요"에서 본 발명의 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 d에 사용되는 리간드는 CK1; CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8; CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17; CK18 및 CK19로 구성된 그룹으로부터 선별된다. 가장 바람직한 것은 CK18 (SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 13)이다.
리간드의 특이성
바람직하게 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 b 및 d에 사용되는 리간드는 특이적으로 태아 세포에 결합한다. 특이성을 나타낼 때, 의미하는 것은 리간드가 모체 세포보다 태아 세포에 대하여 더 높은 결합 친화도를 갖는다는 것이다. 결합 친화도는 모체 세포에 대한 특정 리간드의 kd 및 태아 세포에 대한 같은 리간드의 kd 사이의 비율로서 해리 상수 (kd) 및 친화도에 관하여 표현될 수도 있다. 즉, 리간드는 모체 세포에 대하여 10-5M 및 태아 세포에 대하여 10-9M의 kd를 가질 수도 있다. 이 경우에, 특이성은 10.000일 것이다. 하지만, 태아 세포 및 모체 세포 둘 다가 반드시 균질한 집단이 아니기 때문에, 특이성은 또한 특정 리간드로 성취될 수 있는 농화의 배에 관하여 표현될 수도 있다 (하기 추가로 설명된 바와 같음).
바람직한 구체예에서, 리간드는 여기에서 하기 설명된 본 발명의 방법에 의해 발생된다. 즉, 리간드의 특이성이 최적화되었다.
바람직하게, 방법은 샘플의 태아 세포를 확인하는 단계 및/또는 샘플의 태아 세포를 농화하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 구체예에서, 농화 단계는 확인의 단계 전에 수행된다.
농화 및/또는 확인 후에, 검출의 단계 및 예측 및/또는 진단의 단계가 종종 수행된다.
확인
방법이 확인의 단계를 포함할 때, 한 구체예는 태아 세포 상에 또는 내에 리간드 또는 잡종화 프로브의 존재를 검출하는 단계를 포함한다 (첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 e).
검출은 리간드 또는 잡종화 프로브를 형광 발광 염료 또는 검출에 적합한 다른 염료로 표지함으로써 가능하게 될 수도 있다. 따라서, 방법은, 예를 들어, 형광 발광 제자리 잡종화 (fluorescent in-situ hybridization; FISH)일 수도 있다. 프로브는 상기 설명된 바와 같이 퀸쳐 뿐만 아니라 형광체 또는 FRET 쌍을 포함할 수도 있으며, 이것은 그것들의 표적 서열에 결합된 잡종화 프로브의 검출을 가능하게 한다. 대안으로 또는 추가로, 그것들의 표적에 결합하는 프로브는 하나 이상의 세척 단계에 의해 비-결합 프로브로부터 분리된다.
확인은 또한 항체와 같은 리간드를 사용하는 면역염색법을 사용하여 수행될 수도 있다.
확인은 다색 FISH 또는 다색 면역염색법을 사용하여 수행될 수도 있다. 즉, 다른 형광 발광 표지를 갖는 다른 잡종화 프로브가 동시에 사용될 수도 있거나 다른 형광 발광 표지를 갖는 두 개의 (또는 이상) 다른 항체가 동시에 사용될 수도 있다. 그것들은 둘 다 태아 세포에 특이적일 수도 있거나 하나가 태아 세포에 특이적이고 다른 것은 모체 세포에 특이적일 수도 있다.
한 구체예에서, 확인된 태아 세포는 레이져 캡쳐 현미 해부 (Laser Capture Microdissection; LCM)를 받을 수도 있다.
농화
바람직한 구체예에서, 리간드 의존적 또는 잡종화 프로브 의존적 농화 단계는 모체 샘플이 리간드 또는 잡종화 프로브와 접촉된 후, 즉, "본 발명의 개요"에서 본 발명의 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 c 후 수행된다. 한 구체예에서, 농화는 또한 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 d 후 수행될 수도 있다. 농화를 위하여, 리간드가 잡종화 프로브보다 바람직하다. 본 발명의 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 c에 사용된 리간드는 바람직하게 마그네틱 비드와 같은, 금속 분자에 결합된다.
농화를 나타낼 때, 의미하는 것은 샘플의 태아 세포의 모체 세포에 대한 비율이 증가된다는 것이다. 농화의 배는 바람직하게 1000배 이상, 더 바람직하게 10.000배 이상 및 가장 바람직하게 100.000배 이상이다.
또 다른 구체예에서, 농화의 배는 10배 이상, 100배 이상, 1000배 이상, 10.000배 이상, 100.000배 이상 및 1.000.000배 이상으로 구성된 그룹으로부터 선별된다.
농화의 기초는 태아 세포에서 우선적으로 발현되는 확인된 mRNA 및 mRNA에 의해 암호화되는 단백질이다.
당업자에게 명백해지는 바와 같이, 선행 기술로부터 알려진 리간드 (또는 항원)에 기초한, 추가의 항원 의존적 농화 단계가 수행될 수도 있다. 선행 기술로부터 알려진 이러한 항원의 예는 CD34, Tra, Octl, Cryptol, SSEA1, CD29, CD33, CD146 및 CD166이다.
예를 들어, CD105에 관하여 상기 설명된 바와 같이, 농화 단계는 또한 모체 샘플이 리간드 또는 잡종화 프로브와 접촉되기 전, 즉, 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 b 전에 수행될 수도 있다.
플로우 -기반 분류 ( Flow - based sorting )
바람직한 구체예에서, 농화는 형광 발광 활성화 세포 분류 (fluorescent activated cell sorting; FACS)를 사용하여 수행된다. 따라서, 리간드는 FACS를 허용하는 형광 발광으로 표지된다. FACS 및 적합한 표지는 당업자에게 잘 알려져 있고 예는 상기 제공되었다.
FACS에 대한 대안으로서, 미세유체 장치 세포 분류 (microfluidic device cell sorting)가 사용될 수도 있다.
면역화
또 다른 바람직한 구체예에서, 농화는 리간드의 면역화를 사용하여 수행된다. "본 발명의 개요"에서 본 발명의 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 b 및/또는 d에 사용된 리간드는 마그네틱 비드, 세파로스 비드, 아가로스 비드 등과 같은 비드 상에서 면역화될 수도 있다. 리간드 및 그것에 결합된 세포가 면역화되고, 결합된 세포는 비드로 세척될 수 있다. 이러한 세척 과정은 배치 (batch)로 또는 컬럼에서 수행될 수도 있다. 농화 (분별; fractionation) 후, 결합된 세포는 높은 또는 낮은 염, 분할 가능한 결합자, 낮은 또는 높은 pH, 변성제, 등을 사용하여 용출될 수 있다. 더 바람직하게, 결합된 세포는 태아 세포 특이적 리간드에 결합하는 가용성 항원 또는 2차 리간드, 예를 들어, 면역화에 사용되는 리간드의 고정된 부분에 관련된 항체를 가지고 경쟁적 용출을 사용하여 용출된다.
리간드가 마그네틱 비드에서 면역화되는 경우, 농화의 바람직한 방법은 MACS (면역자기성 세포 분류 (immunomagnetic cell sorting))이다. 즉, 리간드에 결합된 세포는 자력을 사용하여 입자를 선별함으로써 비-바인더로부터 분리될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 b에서 농화는 마그네틱 비드에서 면역화되는 CD105를 사용하여 수행된다.
항원을 사용하는 음성 선별
모체 세포에 특이적으로 결합하는 리간드는 또한 한 구체예에서 농화에 사용될 수도 있다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 방법은 샘플을 모체 항원에 관련된 모체 세포 특이적 리간드와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 이 단계는 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 b 전과 같이 적합한 어떤 시간에도 수행될 수 있다. 샘플을 모체 세포 특이적 리간드와 접촉시킨 후, 농화는 상기 설명된 바와 같이, 예를 들어, FACS, MACS, 미세유체 또는 면역화를 사용하여 수행될 수도 있다.
바람직하게, 리간드는 모체 혈액 세포에서 우선적으로 발현되지만 태아 세포에서는 아닌 mRNA에 의해 암호화되는 항원에 결합하는 리간드로 구성된 그룹으로부터 선별된다.
당업자에게 명백해지는 바와 같이, 선행 업계로부터 알려진 리간드 (또는 항원)에 기초한, 추가의 항원 의존적 농화 단계 (음성 선별)이 사용될 수도 있다. 따라서 한 구체예에서, 리간드가 선행 업계로부터 알려진 모체 특이적 항원에 결합하는 리간드, 예를 들어, CD45, HLA-A, HLA-B 또는 HLe-1, M3 및 L4로 구성된 그룹으로부터 선별되는 항체로 구성된 그룹으로부터 선별되는 경우, 추가의 항원 의존적 농화 단계가 수행된다.
음성 선별을 위해 바람직한 세포 타입 마커는 백혈구 공통 항원으로도 알려진 CD45이다. CD45는 적혈구 및 혈장 세포를 제외한 모든 분화된 조혈모세포에 의해 발현되는 막침투 단백질이다. CD45 단백질은 모두 8개의 다른 성숙한 mRNA를 발생시키고 8개의 다른 단백질 생산을 일으키는 단일 복합체 유전자로부터 생산되는 다른 형태로 존재한다. 그것은 모든 백혈구 상에서 발현되지만 다른 세포에서는 아니며, 따라서 다른 및 다양한 타입의 백혈구 (또는 백혈구 (white blood cell)), 예를 들어, 호중구 (neutrophil), 호산구 (eosinophil), 호염기구 (basophil), 림프구 (B 및 T 세포), 단핵백혈구 및 마크로파지를 포함하는 판-백혈구 마커의 역할을 한다.
모체 혈액에 존재하는 유핵 세포의 대다수에서 CD45의 발현으로 인해 CD45 마커를 사용하는 음성 선별이 바람직하다. CD45 양성 세포의 고갈에 따라, 샘플의 CD45 음성 세포가 수거된다. 이러한 고갈 및 수거는 업계에 알려진 어떤 적합한 방법으로도 수행될 수 있다.
한 구체예에서, 모체 혈액 샘플에 존재하는 세포 또는 이들의 단편은 어떤 적합한 시점에서도 CD45 마커를 사용하여 대비염색되고 이로 인해 샘플에 존재하는 모체 세포를 확인한다. 이후 샘플의 CD45 음성 세포가 수거될 수도 있다. 이러한 대비 염색 또는 수거는 업계에 알려진 어떤 적합한 방법을 사용하여 수행될 수도 있다.
HLA
사람 백혈구 항원, 사람 주요 조직적합성 복합체 (major histocompatibility complex; MHC)의 일부는 세포-표면 항원-제공 단백질 및 많은 다른 유전자의 원인이 된다.
사람 백혈구 항원의 두 개의 클래스, 다른 기능을 갖는 클래스 I 항원 (A, B & C) 및 클래스 II 항원 (DR, DP, & DQ)이 존재한다. 두 클래스는 많은 수의 가변적 대립유전자를 포함한다.
태아 세포에 의해 발현되지 않는 HLA 유전자는 샘플에서 모체 세포의 고갈에 사용될 수도 있다. 즉, 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 a에 존재하는 모체 혈액 샘플 또는 이들의 분획이 HLA 유전자에 관련된 항원을 받을 수도 있다.
다른 농화 방법
항원 특이적 리간드를 사용하지 않는 추가의 농화 방법이 또한 사용될 수도 있다.
농화의 바람직한 추가의 방법은 NH4Cl 매개 용해와 같은 적혈구의 용해이며, 이것은 유핵 세포를 온전하게 남겨두는 적혈구의 선별적 용해를 허용한다. 이 방법은 당업자에 의해 알려져 있다. 바람직한 구체예에서, 적혈구의 용해는 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 b 전에 수행된다. NH4Cl 매개 용해를 위해 바람직하게 0.1-0.2 mM NH4Cl, 예를 들어, 0.14-0.18 mM NH4Cl, 더 바람직하게 0.15-0.17 mM NH4Cl의 농도가 사용된다.
또한 여기에서 상기 설명된 고정 및 선별적 용해의 방법이 농화에 사용될 수도 있다.
샘플은 또한, 예를 들어, 피콜-히파크 밀도 구배 원심분리에 의해, 크기 또는 밀도에 기초한 초기 분류를 받을 수도 있다. 이것은 혈소판을 함유하는, 상층액 층; 단핵 세포 층; 및 비-유핵 적혈구 및 과립구를 함유하는 점착된 펠렛의 생산을 일으킨다. 단핵 층은 태아 세포가 농화된 모체 샘플을 생산하기 위해 다른 층으로부터 분리된다.
또한 세포의 물리적 성질, 예를 들어, 독점적이지는 않지만 전하는 농화에 이용될 수도 있다.
침전
혈액 샘플에 존재하는 세포는 샘플에 존재하는 세포의 대부분이 침전이 허용되는 경우, 침전에 의해 농화될 수도 있다. 혈액 샘플은 침전 전에 적합한 용액, 예를 들어, 0.15M NaCl에 희석될 수도 있다. 침전은 총 침전이 발생할 때까지, 예를 들어, 적어도 5시간 동안, 또는 바람직하게 하룻밤 동안 계속될 수도 있다.
바람직하게 샘플은 상온 이하의 온도, 예를 들어, 15 ℃ 미만, 예를 들어, 10 ℃ 또는 8 ℃ 또는 6 ℃ 미만, 바람직하게 2-8 ℃ 또는 약 4 ℃의 온도에서 침전이 허용된다.
낮은 밀도를 갖는 세포의 작은 집단은 침전하지 않을 수도 있고 설명된 바와 같이, 예를 들어, 0.5% 파라포름알데히드로 가벼운 사전 고정 후 원심분리에 의해 분리될 수도 있다.
리간드의 결합 및 농화 방법
이해되는 바와 같이, 다양한 리간드 및 농화 방법이 결합될 수도 있다. 따라서, 내피 세포의 표현형을 갖는 세포에 관련된 1, 2, 3개 이상의 태아 세포 특이적 리간드 (즉, 내피 세포 마커)는 동시에 또는 연속으로 사용될 수도 있다. 유사하게, 각각 태아 세포 특이적 리간드 및 모체 특이적 리간드를 사용하는 반복된 농화가 사용될 수도 있다.
샘플
태아 세포의 총 수를 증가시키기 위해 가능한 큰 모체 혈액 샘플을 얻는 것이 바람직하다. 따라서, 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 a의 모체 혈액 샘플의 크기는 바람직하게 0.5 내지 50 ml의 범위, 예를 들어, 1 내지 40 ml, 예를 들어, 5 내지 35 ml 또는 10 내지 30 ml의 범위이다.
제공된 모체 혈액 샘플은 바람직하게 임신 5-24 또는 6-20주, 더 바람직하게 임신 7-16, 또는 8-12주의 임신부로부터 얻어진다.
희석-농축
또한, 본 발명에 따라 샘플은 방법 중의 어떤 시간에도 희석되거나 농축될 수 있다. 샘플은 등장성 완충액, 예를 들어, 염류 용액, 인산 완충된 염류 용액, PBS, 및/또는 적합한 성장 배지, 예를 들어, 기본 배지, 및 조직 성장 배지를 추가함으로써 적어도 1.5배, 예를 들어, 두 배, 더 바람직하게 적어도 세 배, 예를 들어, 5배 희석될 수도 있다. 방법 단계는 특이적 방법 단계를 위해 할당된 다양한 성분의 추가에 의한 샘플의 희석을 포함할 수도 있다.
방법을 수행하기 위해서, 어떤 세포도 제거하지 않고 부피를 감소시키기 위해 샘플을 농축하는 것은 다른 방법 단계의 가능성에 대하여 유리할 수도 있다. 샘플 부피는 원래의 샘플 부피의 80% 미만, 예를 들어, 70, 또는 60 또는 50%, 또는 바람직하게 원래의 샘플 부피의 40% 미만, 예를 들어, 25%로 감소될 수도 있다. 농축 단계는 원심분리일 수도 있다. 방법은 본 발명에 따라 하나 이상의 농축 단계를 포함할 수도 있다. 원심분리는 세포를 농축하는 바람직한 방법이다. 세포에 손상을 방지하기 위해 10분 동안 300 g와 같이, 가벼운 원심분리가 바람직하다.
검출 및 진단
바람직하게, 본 발명의 방법은 태아 검출 및 예측 및/또는 진단 (즉, 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 e 및 f)에 사용될 수도 있다. 따라서, 확인된 세포가 검출 및 예측 및/또는 진단을 받을 수도 있거나 태아 세포에 대하여 농화된 모체 혈액 샘플이 검출 및 예측 및/또는 진단을 받을 수도 있다.
한 구체예에서, 태아 단백질은, 예를 들어, 면역블로팅, 단백질 시퀀싱 (sequencing) 또는 질량 분석법을 통한 검출에 이용 가능하게 된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 검출 및/또는 진단은 태아 DNA 또는 RNA를 검출에 이용 가능하게 하는 단계를 포함한다.
첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 e의 바람직한 검출 방법은 FISH (형광 발광 제자리 잡종화), 노던 블로팅, 서던 블로팅, DNA/RNA 시퀀싱, 미크로어레이 분석 및 증폭이다. 이러한 방법은 특정 조건, 예를 들어, 태아 질환 또는 특정 질환에 대한 소인 (predisposition)을 나타내는 특이적 서열의 존재를 검출하기 위해 사용될 수도 있다. 방법은 또한 삼염색체 (trisomy) 13, 삼염색체 18 또는 삼염색체 21과 같은 염색체 이수성을 검출하기 위해 사용될 수도 있다. 검출 방법은 또한 Y 특이적 서열을 검출함으로써 태아의 성별을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
대체 구체예에서, 샘플에서 태아 세포의 증가된 수는 표준 수와 비교된다. 샘플에서 태아 세포의 증가된 수는 임신이 위험에 있다는 것을 나타낼 수도 있다. 샘플에서 (뿐만 아니라 대조군 샘플에서) 태아 세포의 증가된 수는, 예를 들어, FACS를 사용하여 평가될 수 있다.
특이적 리간드의 확인
본 발명의 한 구체예는 다음 단계를 포함하는, 태아 세포 특이적 리간드를 확인하는 방법이다:
a) 태아 세포 특이적 리간드 후보물질의 라이브러리를 제공하는 단계
b) 모체 세포의 풀 (pool)을 제공하는 단계
c) 단계 a의 라이브러리를 단계 b의 모체 세포와 접촉시키는 단계
d) 모체 세포에 결합하지 않는 리간드를 선별하여 모체 세포에 결합하는 리간드가 고갈된 라이브러리를 생성하는 단계.
바람직한 구체예에서, 방법은 다음 단계를 추가로 포함한다:
e) 단계 a의 라이브러리 또는 단계 d의 라이브러리를 태아 세포와 접촉시키는 단계
f) 태아 세포에 결합하는 리간드를 선별하여 태아 세포에 결합하지만, 모체 세포에 결합하지 않는 리간드가 농화된 라이브러리를 생성하는 단계.
하나의 세포가 단계 f의 리간드의 선별에 충분하지만, 분명히 더 많은 태아 세포가 사용될 수도 있다는 것은 명백하다. 한 구체예에서, 확인된 특이적 리간드는 리간드가 태반 기원의 상피 세포에 관련된다는 것이 보장되도록 선별된다.
단계 b-f는 다음 단계로 수행될 수도 있다:
g) 모체 혈액 샘플을 제공하는 단계
h) 라이브러리를 모체 혈액 샘플과 접촉시키는 단계
i) Y 염색체의 FISH-입증에 의해 확인되고 및/또는 이것은 본 발명의 다섯 번째 양태의 방법에 의해 확인할 개개의 태아 세포를 제거함으로써 태아 세포에 결합하는 리간드를 선별하는 단계, 및 이 세포들로부터만 리간드를 수거하는 단계.
모체 혈액 샘플은 태아 세포를 위해 농화될 수도 있다.
바람직한 구체예에서, 방법은 다음 단계를 추가로 포함한다:
j) 예를 들어, 태아 세포에 대하여 및/또는 모체 세포에 대하여 추가 선별을 위해 증폭된 라이브러리를 제조하기 위해 선별된 리간드를 증가/증폭시키는 단계.
명백해지는 바와 같이, 다수의 라운드의 선별 및 증폭이 가장 좋은 리간드를 확인하기 위해 수행될 수도 있다.
또 다른 구체예에서, 태아 세포 특이적 리간드를 확인하는 방법은 PCT/DK2010/050002의 실시예 1에 설명된 바와 같이 수행된다.
태아 세포 특이적 리간드 후보물질의 라이브러리는 파지 (파지 디스플레이), mRNA (리보솜 디스플레이 또는 mRNA 디스플레이) 또는 DNA (공유 결합 디스플레이 또는 플라스미드 패닝 (panning)) 상에 나타난 항체 또는 펩티드의 라이브러리일 수도 있다. 라이브러리는 또한 압타머의 확인을 위한 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드의 라이브러리일 수도 있다.
용어 "후보물질"은 라이브러리의 화합물이 반드시 태아 세포에 결합하지 않는다는 것을 나타내기 위해 사용된다. 그것들은 태아 세포 특이적 리간드의 확인을 위한 결합에 대하여 테스트되어야 한다.
한 구체예에서, 태아 세포 특이적 리간드 후보물질의 라이브러리는 완벽히 무작위 라이브러리이다. 이러한 경우에서, 라이브러리는 모체 세포에 대한 대비 선별 (음성 선별)이 수행되기 전에, 먼저 태아 세포에 대하여 반복적으로 선별될 수도 있고 증폭될 수도 있다.
또 다른 구체예에서, 태아 세포 특이적 리간드 후보물질의 라이브러리는 태아 세포의 알려진 리간드에 기초한다. 이러한 라이브러리는, 예를 들어, 라이브러리를 생성하기 위해 파지에서 태아 세포에 결합하는 항체 및 항체를 암호화하는 유전자의 돌연변이 생성을 나타냄으로써 생성될 수도 있다. 이러한 경우에, 돌연변이 생성은 특이성을 개선하는 한편 태아 세포에 대한 친화도를 유지하거나 개선할 수도 있다.
한 구체예에서, 리간드는 사람 시토케라틴 1, 4-6, 8, 10, 13, 18 및 19, 사람 시토케라틴 7 및 사람 비멘틴으로 구성된 그룹으로부터 선별되는 유전자에 의해 암호화된 항원에 결합한다. 따라서 리간드의 친화도 및/또는 특이성은 상기 약술된 방법을 사용하여 최적화된다.
태아 세포 특이적 리간드 및 잡종화 프로브
본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 b의 내피 세포 특이적 리간드 및 잡종화 프로브는 다음으로 구성된 그룹으로부터 선별될 수도 있다:
i. CD105, 비멘틴, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PAI-1, EPCR로 구성된 그룹으로부터 선별되는 항원에 관련된 리간드 및
ii. CD105, 비멘틴, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PAI-1, EPCR을 암호화하는 유전자로 구성된 그룹으로부터 선별되는 유전자 중 적어도 10개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산에 관련된 잡종화 프로브.
본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 첫 번째 구체예에 설명된 방법의 단계 d의 상피 세포 특이적 리간드 및 잡종화 프로브는 다음으로 구성된 그룹으로부터 선별될 수도 있다:
i. 사람 CK1 CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 및 CK19로 구성된 그룹으로부터 선별되는 항원에 관련된 리간드 및
ii. CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 및 CK19를 암호화하는 유전자로 구성된 그룹으로부터 선별되는 유전자 중 적어도 10개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산에 관련된 잡종화 프로브.
한 구체예에서, 태아 세포 특이적 리간드 및 잡종화 프로브는 CD105 및 CK18로 구성된 그룹으로부터 선별된다.
한 구체예에서, 리간드 또는 잡종화 프로브는 99.9% 모체 세포 및 0.1% 태아 세포를 포함하는 테스트 샘플에서 세포 중 90% 정확한 선별을 가능하게 한다는 점이 특징이다. 즉, 90% 정확한 확인을 나타낼 때, 여기에서 의미하는 것은 테스트 샘플 및 리간드로 선별을 수행할 때, 각각 10개의 모체 세포에 대하여 90개의 태아 세포가 수거되고 유사하게 더 나은/나쁜 정확성으로 90개의 태아 세포가 수거된다는 것이다. 바람직한 선별 방법은 MACS이다. 더 바람직한 것은 95% 정확한 선별, 98% 정확한 선별 또는 더 바람직하게 99% 정확한 세포 선별을 가능하게 하는 리간드이다. 모체 혈액 샘플이 매우 낮은 양의 태아 세포를 갖기 때문에, 리간드가 상기 설명된 바와 같이 테스트 샘플로부터 99,9%, 99,99% 또는 99,999% 정확한 세포 선별을 가능하게 하는 것이 더 바람직하다.
바람직하게, 리간드는 압타머, 펩티드 또는 항체이다. 가장 바람직한 것은 항체이다.
리간드는, 예를 들어, 개선된 특이성을 갖기 위해 바람직하게 여기에서 상기 설명된 또는 PCT/DK2010/050002에 설명된 방법을 사용하여 확인된다.
본 발명의 한 구체예에서, 여기에서 상기 설명된 또는 PCT/DK2010/050002에 설명된 방법을 사용하여 확인할 리간드 또는 잡종화 프로브는 태아 세포를 위하여 모체 혈액 샘플을 농화하기 위해 또는 모체 혈액 샘플에서 태아 세포를 확인하기 위해 사용된다. 바람직하게 리간드 또는 잡종화 프로브의 사용은 여기에서 상기 설명된 바와 같다.
또한 제공된 것은 여기에서 상기 설명된 바와 같은 리간드 또는 잡종화 프로브 및 사용 설명서를 포함하는 키트이다.
바람직하게, 키트는 농화를 위한 첫 번째 리간드 및/또는 확인을 위한 잡종화 프로브를 포함한다. 더 바람직하게, 키트는 내피 세포 마커인 첫 번째 리간드 및 두 번째 리간드 및/또는 상피 세포 마커인 잡종화 프로브를 포함한다. 내피 세포 마커는 태아 세포의 농화에 사용되고 상피 세포 마커는 내피 세포 및 상피 세포의 표현형 둘 다를 함유하는 샘플에 존재하는 태아 세포의 확인에 사용된다.
바람직한 구체예에서, 키트는 또한 여기에서 상기 섹션 "고정 및 선별적 용해"에서 설명된 바와 같이 고정 완충액 및 용해 완충액을 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 리간드 또는 잡종화 프로브는 추가의 태아 세포 특이적 리간드의 확인에 사용된다. 이 사용의 바람직한 구체예에서, 리간드 및/또는 잡종화 프로브는 여기에서 상기 설명된 또는 PCT/DK2010/050002에 설명된 방법으로 사용된다.
본 발명의 한 양태는 여기에서 상기 설명된 방법에 의해 확인된 태아 세포이다. 상기 세포는 사람 시토케라틴 1, 2, 3, 4 (SEQ ID NO: 3), 5 (SEQ ID NO: 4), 6A (SEQ ID NO: 5), 6B (SEQ ID NO: 6), 7 (SEQ ID NO: 7), 8 (SEQ ID NO: 8), 10 (SEQ ID NO: 9), 13 (SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 11), 14, 15, 16, 17, 18 (SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 13), 및 19사람 비멘틴 및 CD105 (SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2)의 그룹으로부터 선별되는 마커의 발현을 특징으로 하고 CD105 또는 비멘틴의 발현 및/또는 CD105 또는 비멘틴 및 시토케라틴의 동시-발현에 의해 다른 세포로부터 구분될 수 있다. 바람직하게, 태아 세포는, 예를 들어, 본 발명의 다른 양태에 설명된 바와 같이 분리되거나 확인되고, 사람 신체에 존재하지 않는다.
본 발명의 한 양태는, 예를 들어, 섹션 "특이적 리간드의 확인"에 설명된 바와 같이 상기 설명된 바와 같이 검출 및 진단을 위해 또는 추가의 태아 세포 특이적 리간드의 발생을 위해 여기에서 상기 설명된 방법에 의해 확인할 태아 세포의 사용이다.
또 다른 양태는 다음을 포함하는 키트이다:
a. i. 상피 세포 마커를 암호화하는 유전자에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브 또는
ii. 상피 세포 마커에 관련된 리간드
b. i. 내피 세포 마커를 암호화하는 유전자에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브 또는
ii. 내피 세포 마커에 관련된 리간드 및 사용 설명서.
태아 성별 결정
본 발명에 따르는 분리된 태아 세포는 남성 특이적 프로브의 사용에 의해 또는 태아 세포의 검출을 위해 여기에 설명된 방법으로 확인된 항원 결합 멤버를 이용한 후 이어서, 당업자에게 알려진 성별의 결정의 적합한 방법으로, 태아의 성별의 결정에 추가로 사용될 수도 있다.
염색체 이상의 태아 진단
성별의 결정과 동시에, 본 발명은 항원 또는 본 발명에 기초하여 분리되거나 확인된 상기 태아 세포 항원을 인식하는 결합 멤버에 기초하는 태아 세포의 검출에 의한 염색체 이상의 결정 방법과 추가로 관련된다. 이러한 염색체 이상의 결정 방법은 예를 들어, 이수성, 전위 (translocation), 불균형 전위, 재배열, 서브텔로미어 재배열, 불균형 염색체 재배열, 불균형 서브텔로미어 재배열, 삭제, 역위 (inversion), 불균형 역위, 중복 (duplication) 및 텔로미어 불안정성 및/또는 단축 (shortening)의 검출과 관련된다. 염색체 이상은 추가로 단일 뉴클레오티드 치환, 미세 삭제, 짧은 삭제, 짧은 삽입, 다수의 뉴클레오티드 변화, DNA 메틸화 및/또는 각인의 손실 (loss of imprining; LOI)일 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 염색체 이수성은 완벽한 및/또는 부분적인 삼염색체, 예를 들어, 삼염색체 21, 삼염색체 18, 삼염색체 13, 삼염색체 16 및/또는 XXX 및 다른 성 염색체 이상이다. 대안으로 이수성은 완벽한 및/또는 부분적 일염색체성, 예를 들어, 일염색체성 X, 일염색체성 21, 일염색체성 22, 일염색체성 16 및/또는 일염색체성 15이다.
DNA 잡종화 기술은 성별의 결정 또는 염색체 이상의 결정에 사용될 수도 있다. 업계에 알려진 기술은 형광 발광 제자리 잡종화 (FISH), 초회감작 제자리 표지법 (primed in situ labeling; PRINS), 정량 FISH (Q-FISH) 및 다색-밴딩 (MCB)과 같은 방법들을 포함한다. 형광 발광 제자리 잡종화 (FISH)는 상기 설명된 바와 같이, 예를 들어, 형광 발광으로 표지된 분자 프로브를 이용한다. 유전자 또는 DNA 서열에 해당하는 프로브가 사용되고 핵의 특이적 위치에서 현미경 하에서 신호를 나타낸다. FISH 기술은 간기 세포에 적용될 수도 있고 염색체 X, Y, 13, 15, 18, 21의 정배수성 또는 이수성의 존재를 확인할 수도 있다. FISH는 삼염색체 및 일염색체성과 같은 염색체의 비정상 멤버를 확인하는데 유용하고 프로브가 염색체의 특이적 영역에 이용 가능할 때, 삭제, 전위, 또는 중복이 존재하는지 결정하기 위해 사용될 수도 있다.
상기 언급된 잡종화 기술에 대한 대안으로서 PCR 방법이 염색체 이상을 결정하는데 사용될 수도 있다. 이것은 소수의 태아 세포의 초기 분리가 필요할 것이다. 본 발명에 따르는 PCR 방법은 업계에 알려진 적합한 방법을 포함하며, 상기 설명된 바와 같이, 삼염색체 등과 같은 이상을 검출할 수 있다. PCR 방법은 특이적 유전자에서 돌연변이의 작은 삭제와 같이, 작은 이상의 결정에 이용될 수도 있다. 정량 형광 발광 PCR (QF-PCR)은, 예를 들어, 삼염색체 13, 18, 21, 삼배체성 (triploidy), 이중 삼염색체 뿐만 아니라 X 및 Y 이수성의 검출에 적합한 이러한 방법의 예이다 (V. Cirigliano, 2004). 작지만 심각한 염색체 이상에 적합한 프라미어의 설계에 의해 PCR 방법은 질환, 예를 들어, 중요한 페닐알라닌 아미노산이 고갈된 단백질로 이어지는 낭포성 섬유종 (Cystic Fibrosis) 유전자의 3bp 결실에 의해 종종 유발되는 낭포성 섬유종의 결정에 사용될 수도 있다.
태아 세포는 상기 설명된 바와 같이 줄기세포일 수도 있다. 줄기세포는 여러 종류가 있으며, 발생 중에 그것들이 생산되는 시간 및 장소, 및 그것들이 목적과 관련된다. 검출된 태아 줄기세포는 배아세포, 또는 체세포와 같이, 어떤 타입도 될 수 있고, 만능성 (pluripotent) 또는 다분화성 (multipotent)이다.
줄기 세포의 사용
여기에 설명된 기술을 적용함으로써, 태아 줄기 세포는 본 발명의 상기 태아 세포 항원을 인식하는 결합 멤버, 항체 또는 항체 단편의 사용에 의해 모체 혈액 샘플로부터 분리될 수도 있다. 줄기세포는 더 많은 줄기세포를 생산할 수 있고 그것들은 신경, 혈액 또는 간세포와 같이 분화된 세포 타입을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 분리된 줄기 세포의 타입에 의존적으로 세포는 특이적 세포 타입 또는 조직의 세포의 발생에서 다양한 적용을 가질 수도 있다. 만능 줄기 세포는 어떤 세포 타입도 일으킬 수 있는 반면 다분화성 줄기 세포는 더 많이 제한된 수의 세포 타입을 일으킬 수 있다. 예를 들어, 혈액 형성 (조혈) 줄기 세포는 모든 타입의 혈액 세포를 형성할 수 있는 반면, 중간엽 줄기 세포는 중간엽 세포를 형성할 수 있다.
줄기 세포, 특히 만능 줄기 세포는 다양한 질환의 치료에 사용될 수도 있다. 만능 줄기 세포는 전통적으로 배아 줄기 세포이며, 이것은 윤리적 사항으로 인해 제한적으로 이용 가능하다. 모체 혈액 샘플로부터 분리된 줄기세포의 사용 가능성은 매력적인 대안이다. 만능 줄기세포는 통상적인 방법이 적합한 치료를 제공하지 않는 복수의 질환의 치료에 사용될 수도 있다.
참고문헌
Gussin HA, Sharma AK, Elias S. ≫Culture of endothelial cells isolated from maternal blood using 항-CD105 and CD133.≪ Prenat Diagn, 2004: Mar;24(3): 189-93.
실시예
실시예 1
혈액 샘플의 제조
24 ml의 말초 혈액 샘플을 임신 11 내지 14주의 임신부로부터 얻었다. 전 및 고지에 입각한 동의 후 혈액 샘플을 뽑았다. 모든 혈액 샘플을 헤파린 처리된 튜브에 수거하였고 그것들이 수거된 후 즉시 가공하였다.
헤파린 혈액 외에, 5 ml의 혈액을 EDTA 튜브로 뽑았다. 이 혈액을 태아 성별 분석에 사용하였다. 태아의 성별은 y-염색체 특이적 유전자를 사용하여 자유 태아 DNA의 실시간 PCR로 결정하였다. 남성 임신의 혈액 샘플만 추가로 가공하였다.
고정
각각의 샘플에 대하여 3 ml의 전혈을 사전 코팅된 피펫을 사용하여 사전 코팅된 50 ml 원심분리 튜브 (샘플 당 8개의 튜브)로 앨리쿼트하였다 (사전 코팅 완충액은 Ca2 + 및 Mg2 +이 있거나 없는 PBS 중의 2% BSA였다). PBS 중의 10% 포름알데히드 2 ml을 사전 코팅된 피펫을 사용하여 각각의 튜브에 추가하였다. 조심스럽게 섞은 후, 혈액을 상온에서 10분 동안 고정하였다.
선별적 용해
고정 후, PBS (Ca2 + 및 Mg2 +이 있거나 없음) 중의 0.12% Triton X-100 30 ml을 각각의 튜브에 추가하였다. 튜브를 3번 뒤집었고 적혈구를 상온에서 45분 동안 용해시켰다. 용해 후, 15 ml의 차가운 (4 ℃) PBS (Ca2 + 및 Mg2 +이 있거나 없음) 중의 2% BSA를 각각의 튜브에 추가하였다. 튜브를 두 번 뒤집어서 섞은 후, 용해되지 않은 세포를 500 g로 4 ℃에서 15분 동안 원심분리하여 펠렛화하였다. 상층액을 제거한 후, 세포를 10 ml의 4 ℃ 차가운 PBS (Ca2 + 및 Mg2 +이 있거나 없음)에 재현탁하였고, 4 ℃에서 하룻밤 동안 저장하였다.
침투화
샘플을 10 ml의 차가운 (-20 ℃) 메탄올을 추가한 후 이어서 4 ℃에서 10분 동안 배양함으로써 침투화하였다. 500 g로 10분 동안 원심분리 후, 세포 펠렛을 사전 코팅된 피펫을 사용하여 2개의 튜브로 모았다. 빈 튜브는 1 ml의 차가운 MASC 완충액 (PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)으로 헹궜다. 모아진 세포들을 두 개의 사전 코팅된 15 ml 튜브로 옮겼고 500 g로 10분 동안 원심분리하였다. 상층액의 제거 후, 각각의 튜브의 세포를 500 μl MACS 완충액에 재현탁하였다.
CD105 미세비드 및 MACS 를 사용하여 양성 선별
500 μl 세포 현탁액에 130 μl의 CD105 미세비드 (Miltenyi)를 추가하였고 세포 현탁액을 4 ℃에서 60분 동안 배양하였다. 이후 세포를 6 ml의 차가운 MACS 완충액을 추가함으로써 세척한 후 이어서 500 g로 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하였고 세포를 2 ml의 차가운 MACS 완충액에 재현탁하였다.
CD105 표지된 세포 현탁액을 이미 자석 위에 배치된 사전 세척된 LD 컬럼 (Miltenyi)에 적용하였고 사전 세척된 MS 컬럼 (Miltenyi)의 위에 쌓았다. 세포가 LD 컬럼을 통과할 때 때, 그것은 2 ml의 차가운 MACS 완충액으로 두 번 세척하였다. MS 컬럼을 1 ml의 차가운 MACS 완충액으로 세척하였다. LD 컬럼을 자석으로부터 제거하였고, 사전 코팅된 15 ml 튜브 위에 배치하였고, 세포를 5 ml의 차가운 MACS 완충액을 두 번 적용함으로써 용출하였다. 처음 5 ml의 완충액은 플런져 (plunger)의 적용 없이 컬럼을 통과하였다. 두 번째 5 ml의 완충액은 플런져를 적용함으로써 강제로 컬럼을 통과하였다. MS 컬럼을 이후 자석으로부터 제거하였고 수거 튜브 위에 배치하였다. 세포를 5 ml의 완충액 두 번 대신에 1 ml의 차가운 MACS 완충액 두 번을 사용하여 LD 컬럼에 대한 것과 같은 방법으로 용출하였다. 수거 튜브를 500 g로 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하였고 세포 펠렛을 차가운 MACS 완충액에 재현탁하였다. 세포 현탁액을 폴리-리신 코팅된 슬라이드 위에 배치하였고, 슬라이드를 추가 분석 전에 공기-건조하였다 (하룻밤 동안).
X- 및 Y-염색체 특이적 FISH 및 자동화된 스캐닝에 의한 남성 태아 세포의 확인
잡종화 전에, 슬라이드를 PBS로 5분 동안 헹궜고 60%, 80% 및 99.9% 에탄올에서 각각 3분 동안 탈수시켰다. 스펙트럼 초록색으로 표지된, 염색체 특이적 반복 DXZ1 프로브 CEP X 알파 위성 DNA 및 스펙트럼 오렌지로 표지된 DYZ1 probe CEP Y 위성 III (Abbott Molecular)를 이 분석에 사용하였다. 프로브 둘 다를 함유하는 잡종화 혼합물을 1 비율의 X-프로브, 1 비율의 Y-프로브, 1 비율의 증류수 및 7 비율의 잡종화 완충액을 섞어서 제조하였다. 15 μl의 잡종화 혼합물을 추가하였고 24 x 24 mm 커버 슬립으로 덮었다. 커버 슬립을 고무 접착제로 밀봉하였고, DNA를 83.5 ℃의 핫 플레이트에서 7분 동안 변성시켰고 42 ℃의 습한 대기에서 하룻밤 동안 잡종화시켰다. 잡종화된 슬라이드를 73 ℃에서 2분 동안 0.3% Tween 20이 들어있는 0.4xSSC 및 상온에서 1분 동안 0.1% Tween 20이 들어있는 2xSSC로 세척하였다. 슬라이드를 DAPI와 함께 Vectashield에 장착하였다.
DAPI 염색된 핵에 위치한 적색 FISH 신호를 함유하는 세포는 두 개의 다른 타입의 스캐너를 사용하는 자동화 스캐닝에 의해 확인하였다. MDS (버전 5.8.0) 슬라이드 스캐닝 시스템은 원래 Applied Imaging에 의해 개발되었고, MetaCyte 스캐닝 시스템은 Metasystems에 의해 개발되었다. MDS 스캐닝 시스템을 가지고, 슬라이드를 스캔 기능 5를 사용하여 20X 확대로 스캔하였다. MetaCyte를 가지고, 슬라이드를 진짜 스펙트럼 오렌지 FISH 신호의 검출을 위해 자체적으로 개발되고 최적화된 분류기를 사용하여 10X 확대로 스캔하였다. 스캐닝 후, 스캐너로 확인된 세포들을 자동 재배치에 의해 눈으로 검사하였다. 하나의 녹색 X-신호 및 X-신호보다 훨씬 더 큰 하나의 오렌지 Y-신호를 갖는 세포를 남성 태아 세포로 분류하였다.
남성 태아 세포의 항체 염색
태아 세포를 개별적으로 사용된 다음 항체로 염색하였다. 판시토케라틴 (제품 번호 C2562, Sigma-Aldrich). 시토케라틴 7 (제품 번호 M7018, DAKO Cytomation) 및 비멘틴 (제품 번호 V2258, Sigma-Aldrich). 항-판시토케라틴 항체는 사람 시토케라틴 1, 4-6, 8, 10, 13, 18 및 19를 인식한다. 항-시토케라틴 7 항체는 사람 시토케라틴 7을 인식하고, 항-비멘틴 항체는 사람 림프모양 세포에서 검출되지 않는 사람 비멘틴의 에피토프를 인식한다. 세 개의 항체 모두는 마우스 단클론성 이소타입 IgG1, IgG2 (시토케라틴) 또는 IgM (비멘틴)이다.
공기 건조 후, 슬라이드를 10분 동안 4xSSC로 재수화하였고, 이후 상온에서 30분 동안 10% 정상 염소 혈청, 1% BSA 및 0.5% 차단제 (Roche)를 함유하는 4xSSC로 구성된 100 μl 차단 완충액 또는 100 μl Imaging Enhancer (Molecular Probes)로 사전 배양하였다. 슬라이드를 차단 완충액에서 1:50으로 희석된 100 μl 1차 항체로 상온에서 60분 동안 배양하였다. 항체 배양 후, 슬라이드를 4xSSC로 5분 동안 3번 세척하였다. 검출을 위하여, 슬라이드를 상온에서 30분 동안 배양하였다. 차단 완충액에서 1:200으로 희석된 100 μl AlexaFluor-488 콘쥬게이티드 토끼 항-마우스 IgG (시토케라틴) 또는 IgM (비멘틴) (Molecular Probes)으로 상온에서 30분 동안 배양하였고, 4xSSC로 5분 동안 3번 세척하였고 차단 완충액에서 1:200으로 희석된 100 μl AlexaFluor-488 콘쥬게이티드 염소 항-토끼 Ig (Molecular Probes)로 상온에서 30분 동안 배양하였다. 4xSSC로 5분 동안 및 2xSSC로 5분 동안 두 번 세척 후, 슬라이드를 DAPI (Vector Laboratories)와 함께 Vectashield에 장착하였다.
판시토케라틴 염색에 이은 비멘틴 항체 염색
커버슬립을 4xSSC로 10분 동안 세척함으로써 제거하였다. 슬라이드를 4xSSC로 5분 동안 헹궜고 상기 설명된 바와 같이 100 μl 차단 완충액 또는 Imaging Enhancer로 30분 동안 배양하였다. 슬라이드를 차단 완충액에서 1:50으로 희석된 100 μl 항-비멘틴 항체로 상온에서 60분 동안 배양하였다. 검출을 위하여, 슬라이드를 차단 완충액에서 1:200으로 희석된 100 μl AlexaFluor-555 콘쥬게이티드 토끼 항-마우스 IgM으로 상온에서 30분 동안 배양하였다. 4xSSC로 5분 동안 2번 세척 및 2xSSC로 5분 동안 1번 세척 후, 슬라이드를 DAPI와 함께 Vectashield에 장착하였다.
항체 염색된 슬라이드를 스캐닝 현미경에 배치하였고 태아 세포를 자동 재배치에 의해 양성 또는 음성 염색에 대하여 눈으로 검사하였다.
실시예 1의 실험 결과
CD105 프로토콜로 자기성 세포 분류 (MACS)에 의해 농화된 세포의 태아 기원을 남성 태아를 가진 임신부의 32개의 혈액 샘플에서 테스트하였다. FISH를 X- 및 Y-염색체 특이적 프로브로 수행하였고, 하나의 X 및 X 신호보다 훨씬 더 큰 하나의 Y 신호를 나타내는 세포를 태아 세포로 생각되었다 (도 1). 혈액의 ml 당 0.1 내지 1.1개의 태아 세포를 모체 혈액 샘플에서 검출하였다 (도 2). 샘플의 97%는 태아 세포에 대하여 양성이었다. 한 혈액 샘플에서는 태아 세포가 검출되지 않았다.
21개의 남성 태아 세포는 상기 설명된 프로토콜을 사용하여 항-시토케라틴 7, 항-판시토케라틴 및 항-비멘틴 항체로 염색을 특징으로 한다. 21개의 태아 세포 중 3개는 항-시토케라틴 7 항체로 양성 염색되었고, 14개의 시토케라틴 7 음성 세포 중 10개는 항-판시토케라틴 항체로 양성 염색되는 한편, 시토케라틴 염색에 대하여 음성인 4개의 태아 세포 중 3개는 항-비멘틴 항체로 양성 염색되었다. 추가로, 4개의 판시토케라틴 양성 세포 중 4개는 또한 항-비멘틴 항체로 양성 염색을 나타냈다. 이 결과들은, 모체 혈액 샘플의 CD105 기반 자기성 세포 분류 (MACS)는 시토케라틴 및/또는 비멘틴을 발현하는 모체 혈액에서 새로운 태아 세포 타입을 나타내고, 따라서 태아 영양 세포의 이 세포 타입을 구별한다.
실시예 2
전혈 선별 및 내부 컬럼 염색
혈액 샘플링
30 ml의 말초 혈액 샘플을 임신 11 내지 14주의 임신부로부터 얻었다. 전 및 고지에 입각한 동의 후 혈액 샘플을 뽑았다. 모든 혈액 샘플을 헤파린 처리된 튜브 또는 EDTA 튜브에 수거하였고 그것들이 수거된 후 4시간 내에 가공하였다.
헤파린 혈액 외에, 5 ml의 혈액을 EDTA 튜브로 뽑았다. 이 혈액을 태아 성별 분석에 사용하였다. 태아의 성별은 y-염색체 특이적 유전자를 사용하여 자유 태아 DNA의 실시간 PCR로 결정하였다.
혈액 샘플의 제조- CD105 선별
혈액의 ml 당 20-50 μl의 CD105 미세비드 (Miltenyi)를 추가하였고, 섞은 후 샘플을 상온에서 30분 동안 배양하였다. 배양 후, 혈액을 6개의 사전 코팅된 50 ml 튜브로 앨리쿼트하였고 (사전 코팅 완충액은 Ca2 + 및 Mg2 +이 있거나 없는 PBS 중의 2% BSA였음) 20 ml의 MACS-완충액을 445 g로 4 ℃에서 12분 동안 원심분리 전에 각각의 튜브에 추가하였다. 상층액을 제거하였고 MACS-완충액을 7.5 ml의 최종 부피로 추가하였다. 조심스럽게 섞은 후 사전 코팅된 피펫을 사용하여 3 ml의 혈액의 앨리쿼트에서 CD105 표지된 전혈을 2개의 사전 세척된 전혈 컬럼에 적용하였다. 혈액이 컬럼을 통과할 때, 컬럼을 4 ml MACS 완충액으로 두 번 세척하였고, 자석으로부터 제거하였고 사전 코팅된 15 ml 튜브 위에 배치하였고, 세포를 5 ml의 전혈 컬럼 용출 완충액 (Miltenyi)를 사용하여 플런징에 의해 컬럼으로부터 용출하였다. 445 g로 4 ℃에서 12분 동안 원심분리 후 상층액을 제거하였고 세포 펠렛을 사전 코팅된 피펫을 사용하여 500 μl의 PBS에 재현탁하였다.
고정 및 침투화
세포를 500 μl의 내부 고정 (Miltenyi)의 추가 후 20분 동안 고정하였다. 고정 후, 10 ml의 MACS 완충액을 추가하였고 튜브를 500 g로 4 ℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하였고 세포 펠렛을 500 μl의 MACS 완충액에 재현탁하였다. 세포를 500 μl의 아이스-콜드 MeOH로 침투화하였고 4 ℃에서 10분 동안 배양하였다. 세포를 이미 자석에 배치된, 사전 세척된 MS 컬럼에 적용하였다. 세포 현탁 이 컬럼으로 완벽히 들어간 후, 세포를 500 μl의 MACS 완충액을 컬럼에 적용함으로써 세척하였다.
MS 컬럼 내부의 세포의 염색
태아 세포를 다음 항체의 칵테일로 염색하였다. 판시토케라틴 (제품 번호 C2562, Sigma-Aldrich). 시토케라틴 7 (제품 번호 M7018, DAKO Cytomation) 및 시토케라틴 8/18 (제품 18.0213, Invitrogen). 항-판시토케라틴 항체는 사람 시토케라틴 1, 4-6, 8, 10, 13, 18 및 19를 인식한다. 항-시토케라틴 7 항체는 사람 시토케라틴 7을 인식하고, 항-시토케라틴 8/18은 시토케라틴 8/18을 인식한다. 세 개의 항체 모두는 마우스 단클론성 이소타입 IgG1, IgG2이다.
항체 염색 전, 컬럼을 500 μl Imaging Enhancer (Molecular Probes)를 적용한 후 상온에서 10분 동안 사전 배양하였고 500 μl의 MACS 완충액을 적용함으로써 한번 세척하였다. 컬럼을 10% 정상 염소 혈청, 1% BSA 및 0.5% 차단제 (Roche)을 함유하는 4xSSC로 구성된 차단 완충액에서 1:50으로 희석된 200 μl의 시토케라틴 칵테일을 적용한 후 상온에서 30분 동안 배양하였다. 항체 배양 후, 컬럼을 500 μl의 MACS 완충액으로 3번 세척하였다. 검출을 위하여, 컬럼을 차단 완충액에서 1:50으로 희석된 염소 항-마우스 IgG (Invitrogen)의 AlexaFluor-488 콘쥬게이티드 F(ab)2 단편 200 μl로 상온에서 30분 동안 배양하였고, 500 μl MACS 완충액으로 3번 세척하였고 차단 완충액에서 1:50으로 희석된 AlexaFluor-488 콘쥬게이티드 F(ab)2 단편 토끼 항-염소 IgG (Invitrogen) 200 μl로 상온에서 30분 동안 배양하였다. 배양 후, 컬럼을 500 μl MACS 완충액으로 한 번 및 Ca2 + 및 Mg2 +이 있거나 없는 PBS 500 μl로 두 번 세척하였다. 컬럼을 자석으로부터 15 ml 튜브로 옮겼고 두 번째 MACS 완충액을 적용할 때 플런져를 사용하여 500 μl MACS 완충액을 두 번 적용함으로써 세포를 회수하였다. 세포를 500 g로 4 ℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 펠렛화한 후, 세포 펠렛을 Ca2 + 및 Mg2 +이 있거나 없는 PBS에 재현탁하였고 세포를 슬라이드에 발랐고 슬라이드를 하룻밤 동안 어두운 곳에서 공기-건조하였고 DAPI (Vector Laboratories)와 함께 Vectashield에 장착하였다.
시토케라틴 염색된 슬라이드의 분석
시토케라틴 염색된 세포의 확인
항-시토케라틴 항체 칵테일로 염색된 태아 세포를 Metasystems에서 개발된 MetaCyte 스캐닝 시스템을 사용하여 자동 스캐닝으로 확인하였다. 슬라이드를 시토케라틴 염색된 세포의 검출을 위해 자체적으로 개발되고 최적화된 분류기를 사용하여 10x 확대로 스캔하였다. 스캐닝 후, 스캐너로 확인된 세포들을 자동 재배치에 의해 눈으로 검사하였다.
(남성) 태아 세포의 FISH 확인/검증 ( verification )
남성 임신의 경우에, 항체 염색의 특이성을 XY FISH로 확인하였다. 잡종화 전, 커버 슬립을 제거하였고 슬라이드를 PBS로 5분 동안 헹궜고 60%, 80% 및 99.9% 에탄올에서 각각 3분 동안 탈수시켰다. 스펙트럼 아쿠아로 표지된 염색체-특이적 반복 DXZ1 프로브 CEP X 알파 위성 DNA 및 스펙트럼 오렌지로 표지된 DYZ1 프로브 CEP Y 위성 III (Abbott Molecular)을 이 분석에 사용하였다.
프로브 둘 다를 함유하는 잡종화 혼합물을 1 비율의 X-프로브, 1 비율의 Y-프로브, 1 비율의 증류수 및 7 비율의 잡종화 완충액을 섞어서 제조하였다. 15 μl의 잡종화 혼합물을 추가하였고 24 x 24 mm 커버 슬립으로 덮었다. 커버 슬립을 고무 접착제로 밀봉하였고, DNA를 83.5 ℃의 핫 플레이트에서 7분 동안 변성시켰고 42 ℃의 습한 대기에서 하룻밤 동안 잡종화시켰다. 잡종화된 슬라이드를 73 ℃에서 2분 동안 0.3% Tween 20이 들어있는 0.4xSSC 및 상온에서 1분 동안 0.1% Tween 20이 들어있는 2xSSC로 세척하였다. 슬라이드를 DAPI와 함께 Vectashield에 장착하였다.
삼염색체 21 분석
높은 위험의 임신 (1:50 이상)의 경우에, 시토케라틴 염색된 태아 세포를 스펙트럼 오렌지로 표지된 염색체 21 특이적 LSI 21 프로브 (Abbott Molecular)를 사용하여 삼염색체 21의 존재 또는 부재 (다운 증후군)에 대하여 분석하였다. 스펙트럼 아쿠아로 표지된 CEP X 프로브를 내부 대조군으로서 LSI 21 프로브와 함께 사용하였다. 프로브 둘 다를 함유하는 잡종화 혼합물을 1 비율의 X-프로브, 1 비율의 LSI 21 프로브, 1 비율의 증류수 및 7 비율의 잡종화 완충액을 섞어서 제조하였다.
FISH 전, 커버 슬립을 PBS 중의 2% 파라포름알데히드 (PFA)에서 10분 동안 슬라이드를 세척함으로써 제거하였다. 슬라이드를 4% PFA에서 10분 동안 배양에 의해 후-고정하였고, PBS에서 2분 동안 세척하였고 60%, 80% 및 99.9% 에탄올에서 각각 3분 동안 탈수시켰다. 공기 건조 후 슬라이드를 다음 방법으로 프로브를 함유하지 않는 잡종화 혼합물로 사전 변성시켰다. 18 μl 잡종화 혼합물을 추가하였고 24 x 24 mm 커버 슬립으로 덮었다. 슬라이드를 90 ℃의 핫 플레이트에 10분 동안 두었다. 커버 슬립을 제거하였고, 슬라이드를 PBS에서 5분 동안 및 아이스-콜드 99.9% 에탄올에서 10분 동안 세척하였다. 공기 건조 후 LSI 21 프로브 및 CEP X 프로브를 함유하는 잡종화 혼합물 18 μl을 추가하였고 24 x 24 mm 커버 슬립으로 덮었다. 커버 슬립을 고무 접착제로 밀봉하였고, DNA를 90 ℃의 핫 플레이트에서 10분 동안 변성시켰고 42 ℃의 습한 대기에서 하룻밤 동안 잡종화시켰다. 잡종화된 슬라이드를 73 ℃에서 2분 동안 0.3% Tween 20이 들어있는 0.4xSSC 및 상온에서 1분 동안 0.1% Tween 20이 들어있는 2xSSC로 세척하였다. 슬라이드를 DAPI와 함께 Vectashield에 장착하였다. 염색된 태아 세포에서 염색체 21 FISH 신호의 계산을 원래의 스캔 파일을 사용하여 재배치에 의해 수행하였다. 도 6은 삼염색체 21 (다운 증후군)의 비-침습적 태아 진단의 경우를 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> FCMB Aps <120> Isolation of fetal cells in maternal blood and ligands for use <130> P2746PC00 <150> PA 2010 01018 <151> 2010-11-09 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3072 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctctacccgg ttggcaggcg gcctggccca gccccttctc taaggaagcg catttcctgc 60 ctccctgggc cggccgggct ggatgagccg ggagctccct gctgccggtc ataccacagc 120 cttcatctgc gccctggggc caggactgct gctgtcactg ccatccattg gagcccagca 180 ccccctcccc gcccatcctt cggacagcaa ctccagccca gccccgcgtc cctgtgtcca 240 cttctcctga cccctcggcc gccaccccag aaggctggag cagggacgcc gtcgctccgg 300 ccgcctgctc ccctcgggtc cccgtgcgag cccacgccgg ccccggtgcc cgcccgcagc 360 cctgccactg gacacaggat aaggcccagc gcacaggccc ccacgtggac agcatggacc 420 gcggcacgct ccctctggct gttgccctgc tgctggccag ctgcagcctc agccccacaa 480 gtcttgcaga aacagtccat tgtgaccttc agcctgtggg ccccgagagg ggcgaggtga 540 catataccac tagccaggtc tcgaagggct gcgtggctca ggcccccaat gccatccttg 600 aagtccatgt cctcttcctg gagttcccaa cgggcccgtc acagctggag 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1500 gtgccgacga cgccatgacc ctggtactaa agaaagagct tgttgcgcat ttgaagtgca 1560 ccatcacggg cctgaccttc tgggacccca gctgtgaggc agaggacagg ggtgacaagt 1620 ttgtcttgcg cagtgcttac tccagctgtg gcatgcaggt gtcagcaagt atgatcagca 1680 atgaggcggt ggtcaatatc ctgtcgagct catcaccaca gcggaaaaag gtgcactgcc 1740 tcaacatgga cagcctctct ttccagctgg gcctctacct cagcccacac ttcctccagg 1800 cctccaacac catcgagccg gggcagcaga gctttgtgca ggtcagagtg tccccatccg 1860 tctccgagtt cctgctccag ttagacagct gccacctgga cttggggcct gagggaggca 1920 ccgtggaact catccagggc cgggcggcca agggcaactg tgtgagcctg ctgtccccaa 1980 gccccgaggg tgacccgcgc ttcagcttcc tcctccactt ctacacagta cccataccca 2040 aaaccggcac cctcagctgc acggtagccc tgcgtcccaa gaccgggtct caagaccagg 2100 aagtccatag gactgtcttc atgcgcttga acatcatcag ccctgacctg tctggttgca 2160 caagcaaagg cctcgtcctg cccgccgtgc tgggcatcac ctttggtgcc ttcctcatcg 2220 gggccctgct cactgctgca ctctggtaca tctactcgca cacgcgttcc cccagcaagc 2280 gggagcccgt ggtggcggtg gctgccccgg cctcctcgga gagcagcagc accaaccaca 2340 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tgggaggagg ccgtggtgtc tctacctgtt caactcggtt tgtgtctggg 180 ggatcagctg ggggctatgg aggcggcgtg agctgtggtt ttggtggagg ggctggtagt 240 ggctttggag gtggctatgg aggtggcctt ggaggtggct atggaggtgg ccttggaggt 300 ggctttggtg ggggttttgc tggtggcttt gttgactttg gtgcttgtga tggcggcctc 360 ctcactggca atgagaagat caccatgcag aacctcaacg accgcctggc ttcctacctg 420 gagaaggtgc gcgccctgga ggaggccaac gctgacctgg aggtgaagat ccgtgactgg 480 cacctgaagc agagcccagc tagccctgag cgggactaca gcccctacta caagaccatt 540 gaagagctcc gggacaagat cctgaccgcc accattgaaa acaaccgggt catcctggag 600 attgacaatg ccaggctggc tgcggacgac ttcaggctca agtatgagaa tgagctggcc 660 ctgcgccaga gcgtggaggc cgacatcaac ggcctgcgcc gggtgctgga tgagctcact 720 ctgtctaaga ctgacctgga gatgcagatc gagagcctga atgaagagct agcctacatg 780 aagaagaacc atgaagagga gatgaaggaa tttagcaacc aggtggtcgg ccaggtcaac 840 gtggagatgg atgccacccc aggcattgac ctgacccgcg tgctggcaga gatgagggag 900 cagtacgagg ccatggcaga gaggaaccgc cgggatgctg aggaatggtt ccacgccaag 960 agtgcagagc tgaacaagga 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tggcagacat ccgggcccaa tatgacgagc tggctcggaa 900 gaaccgagag gagctagaca agtactggtc tcagcagatt gaggagagca ccacagtggt 960 caccacacag tctgctgagg ttggagctgc tgagacgacg ctcacagagc tgagacgtac 1020 agtccagtcc ttggagatcg acctggactc catgagaaat ctgaaggcca gcttggagaa 1080 cagcctgagg gaggtggagg cccgctacgc cctacagatg gagcagctca acgggatcct 1140 gctgcacctt gagtcagagc tggcacagac ccgggcagag ggacagcgcc aggcccagga 1200 gtatgaggcc ctgctgaaca tcaaggtcaa gctggaggct gagatcgcca cctaccgccg 1260 cctgctggaa gatggcgagg actttaatct tggtgatgcc ttggacagca gcaactccat 1320 gcaaaccatc caaaagacca ccacccgccg gatagtggat ggcaaagtgg tgtctgagac 1380 caatgacacc aaagttctga ggcattaagc cagcagaagc agggtaccct ttggggagca 1440 ggaggccaat aaaaagttca gagttcaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1485 <210> 13 <211> 1439 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gcagcctcga gggccaacaa cacctgctgt ccgtgtccat gcccggttgg ccaccccgtt 60 tctgggggca tgagcttcac cactcgctcc accttctcca ccaactaccg gtccctgggc 120 tctgtccagg cgcccagcta cggcgcccgg ccggtcagca gcgcggccag 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gccagcttgg agaacagcct gagggaggtg gaggcccgct acgccctaca gatggagcag 1080 ctcaacggga tcctgctgca ccttgagtca gagctggcac agacccgggc agagggacag 1140 cgccaggccc aggagtatga ggccctgctg aacatcaagg tcaagctgga ggctgagatc 1200 gccacctacc gccgcctgct ggaagatggc gaggacttta atcttggtga tgccttggac 1260 agcagcaact ccatgcaaac catccaaaag accaccaccc gccggatagt ggatggcaaa 1320 gtggtgtctg agaccaatga caccaaagtt ctgaggcatt aagccagcag aagcagggta 1380 ccctttgggg agcaggaggc caataaaaag ttcagagttc aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1439

Claims (16)

  1. 모체 혈액 샘플에서 태아 세포를 분리하는 방법으로서, 상기 방법은
    a. 모체 혈액 샘플 또는 이들의 분획을 제공하는 단계
    b. 샘플을 내피 세포 마커를 암호화하는 유전자 또는 내피 세포 마커에 관련된 리간드에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브와 접촉시키는 단계, 및
    c. 상기 내피 세포 마커에 특이적인 세포를 선별하고 이로 인해 내피 세포의 표현형을 갖는 세포에 대해 샘플을 농화하는 단계
    d. 내피 세포 표현형을 나타내는, c)에서 선별된 세포를 상피 세포 마커를 암호화하는 유전자에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드 또는 상피 세포 마커에 관련된 리간드를 포함하는 잡종화 프로브와 접촉시키는 단계
    e. 단계 d)의 상피 세포 마커에도 결합하는 내피 세포의 표현형을 갖는 세포를 검출하는 단계
    f. 임의로, e)에서 검출된 세포의 유전적 내용물을 진단 및/또는 예측하는 단계
    를 포함하며, 단계 b-e는 어떤 순서로도 수행될 수 있는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 내피 세포 마커의 표적은 확인할 세포의 표면에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상피 세포 마커의 표적은 확인할 세포의 세포 내에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. a. 모체 혈액 샘플 또는 이들의 분획을 제공하는 단계
    b. 샘플을
    i. 내피 세포 마커를 암호화하는 유전자에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브 또는
    ii. 내피 세포 마커에 관련된 리간드
    와 접촉시키는 단계
    c. 이전 단계의 잡종화 프로브 또는 리간드에 결합하는 세포를 선별하고 이로 인해 이전 단계의 잡종화 프로브 또는 리간드에 결합하는 세포에 대해 샘플을 농화하는 단계
    d. (농화된) 샘플을
    i. 상피 세포 마커를 암호화하는 유전자에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브 또는
    ii. 상피 세포 마커에 관련된 리간드
    와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 샘플의 태아 세포를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 확인은 태아 세포 상에 또는 안에 (상피 세포 마커 관련) 리간드 또는 (상피 세포 마커 관련) 잡종화 프로브의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 모체 혈액 샘플은 전혈인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플의 세포는 선별/농화 단계 후 고정 단계를 받게 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플의 세포는 고정 단계 후 (및 상피 세포 마커 관련 리간드 또는 잡종화 프로브와 접촉되기 전) 침투되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 내피 세포 마커는 CD105, CD146 또는 CD141로 구성된 그룹으로부터 선별되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 내피 세포 마커는 CD105인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상피 세포 마커는 CK8, CK18, CK19 또는 CK7로 구성된 그룹으로부터 선별되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 M30 항체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. a. 태아 세포 특이적 리간드 후보물질의 라이브러리를 제공하는 단계
    b. 모체 세포 샘플을 제공하는 단계
    c. 단계 a의 라이브러리를 단계 b의 모체 세포 샘플과 접촉시키는 단계
    d. 혈액 샘플에 존재하는 모체 세포에 결합하지 않는 리간드를 선별하여 모체 세포에 결합하는 리간드가 고갈된 라이브러리를 생성하는 단계
    e. 단계 a의 라이브러리 또는 단계 d의 라이브러리를 태아 세포와 접촉시키는 단계
    f. 태아 세포에 결합하는 리간드를 선별하여 태아 세포에 결합하지만, 모체 세포에 결합하지 않는 리간드가 농화된 라이브러리를 생성하는 단계
    를 포함하는 태아 세포 특이적 리간드를 확인하는 방법.
  15. 제 14항의 단계 a-f를 포함하는 태아 세포에 특이적인 상피 세포 마커를 확인하는 방법으로서,
    a. 제 14항의 단계 f의 선별된 리간드에 결합하는 태아 세포를 상피 세포 마커와 접촉시키는 단계
    b. 상피 세포 마커에도 결합하는 태아 세포에 결합하는 리간드를 선별하고 이로 인해 상피 세포 표현형을 갖는 태아 세포에 결합하는 리간드가 농화된 라이브러리를 생성하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  16. a. i. 상피 세포 마커를 암호화하는 유전자에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브 또는
    ii. 상피 세포 마커에 관련된 리간드
    b. i. 내피 세포 마커를 암호화하는 유전자에 상보성인, 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 잡종화 프로브 또는
    ii. 내피 세포 마커에 관련된 리간드
    c. 사용 설명서
    를 포함하는 키트.
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