ES2642313T3 - Enriquecimiento e identificación de células fetales en sangre materna y ligandos para tal uso - Google Patents

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Description

Enriquecimiento e identificación de células fetales en sangre materna y ligandos para tal uso
5 Antecedentes
El examen de células fetales para la detección temprana de enfermedades fetales y anomalías genéticas se lleva a cabo durante muchos embarazos, en particular, cuando la edad materna es elevada (35 años o más) o cuando se conocen enfermedades genéticas en la familia. Las células fetales se pueden obtener mediante amniocentesis,
10 extracción del líquido amniótico de la cavidad amniótica que se encuentra en el interior del saco amniótico o mediante biopsia coriónica, en la que se toman biopsias de la placenta, denominada toma de muestras invasiva.
El estudio prenatal de aneuploidías emplea o bien el análisis cromosómico tradicional o bien sondas de ADN específicas de cromosoma para el esclarecimiento de aberraciones numéricas de los cromosomas que presentan
15 más frecuentemente anomalías, en particular, de los cromosomas 13, 18, 21, X e Y del feto.
Debido a la invasividad de los métodos de toma de muestras descritos anteriormente y al riesgo de aborto, resultaría ventajoso llevar a cabo el diagnóstico fetal mediante un procedimiento no invasivo tal como, por ejemplo, mediante el uso de una muestra de sangre materna.
20 Durante el embarazo, una variedad de tipos de células de origen fetal atraviesan la placenta y circulan por la sangre periférica materna. La viabilidad de uso de las células fetales en la circulación materna con fines diagnósticos se ha visto dificultada por el hecho de que las células fetales están presentes en la sangre materna únicamente en números muy limitados, se ha informado de números de una célula fetal por 105-108 células maternas nucleadas o
25 de 1-10 células fetales por ml de sangre materna. Además, la mayoría de las células fetales no se pueden distinguir de las células maternas únicamente en base a su morfología, por lo que se han investigado métodos de identificación de células fetales alternativos.
El documento US2007/0015171 describe un método no invasivo de aislamiento y detección de ADN fetal. El método
30 enriquece una muestra de sangre materna usando anticuerpos que se unen específicamente a las células maternas y/o anticuerpos que se unen específicamente a las células fetales. Los autores de la invención sugieren el uso de unos pocos anticuerpos específicamente mencionados: el HLe-1 es un anticuerpo que reconoce un antígeno presente sobre los leucocitos humanos maduros y sobre precursores de eritrocitos muy inmaduros, pero no en eritrocitos nucleados maduros. Por tanto, se sugiere que se puede usar este anticuerpo para reconocer leucocitos
35 maternos, pero no eritrocitos nucleados fetales. También se sugieren un anticuerpo anti-monocitos (M3) y un anticuerpo anti-linfocitos (L4) para extraer células maternas de una muestra. Por último, los autores recomiendan el uso de un anticuerpo monoclonal, que reconoce al receptor de transferrina (TfR) sobre las células fetales. Posteriormente, se puede disponer del ADN de las células fetales aisladas para su detección y diagnóstico.
40 El documento WO2008/132753 describe un método de identificación de un trofoblasto mediante detección en las células de una expresión en la muestra biológica de un marcador del trofoblasto seleccionado de entre el grupo que consiste en una anexina IV, una citoqueratina-7, una citoqueratina 8 y una citoqueratina-19. Por un trofoblasto nos referimos a una célula epitelial procedente de la placenta de un embrión o feto de mamífero; un trofoblasto habitualmente está en contacto con la pared uterina. Se mencionan tres tipos de trofoblastos, el citotrofoblasto
45 velloso, el sincitiotrofoblasto y el trofoblasto extravelloso. Significativamente, los autores de la invención usaron anticuerpos monoclonales contra vimentina para estimar la magnitud de contaminación con fibroblastos de los trofoblastos aislados de placentas del primer trimestre. Por tanto, los trofoblastos que aislaron los autores de esta invención no comprenden vimentina.
50 Gussin et al., 2004 formularon la hipótesis de que las células fetales presentes en la sangre materna que no responden a las condiciones de un cultivo hematopoyético representan a las células endoteliales. Investigaron si las células progenitoras endoteliales de origen fetal se pueden seleccionar a partir de sangre materna en base a su expresión de CD133 o CD105 y expandir en cultivo. Los autores concluyeron que las células CD133+ y CD105+ aisladas de la sangre materna se pueden expandir in vitro en condiciones endoteliales. Estas células parecen ser de
55 origen materno, más que fetal.
El documento WO 2010/078872 describe el enriquecimiento de células fetales procedentes de sangre materna mediante puesta en contacto de una suspensión celular con microperlas de CD105.
60 Kye-Hwan Na et al., "Isolation and Characterisation of Trophoblast Stem Cells-like Cells Derived from Human Term
Placenta", Dev. Reprod. vol.14(3), p.155-162, (2010) describen que las células similares a células madre trofoblásticas analizadas mediante RT-PCR y FACS expresan tanto la CD105 como la CK7. Por tanto, sigue habiendo una necesidad de métodos mejorados de aislamiento de células fetales a partir de muestras de sangre materna para facilitar la detección y el diagnóstico prenatales.
Resumen de la invención
La presente invención se basa en la identificación de antígenos que se puedan usar para la identificación y/o enriquecimiento de células fetales de una muestra de sangre materna. En particular, la invención se basa en el
10 sorprendente descubrimiento de que las células fetales presentes en una muestra de sangre materna presentan características tanto endoteliales como epiteliales. Usando esta transición, los autores de la invención aportan un nuevo método de enriquecimiento e identificación de células fetales en una muestra de sangre materna y también describen nuevos antígenos para este fin.
15 En un primer modo de realización preferido de la invención, tal y como se define en las reivindicaciones, la muestra de sangre materna se pone en contacto con un marcador de células endoteliales y, de ese modo, las células con fenotipo endotelial se enriquecen mediante selección de las células específicas para dicho marcador de células endoteliales. Tal método de identificación de una célula fetal en una muestra de sangre materna comprende las etapas de:
a.
suministro de una muestra de sangre materna o una fracción de la misma
b.
puesta en contacto de la muestra con una sonda de hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos complementaria a un gen que codifica un marcador de células endoteliales o un ligando que se une a un marcador de células endoteliales y
25 c. enriquecimiento de las células específicas para dicho marcador de células endoteliales
d. puesta en contacto de las células seleccionadas en b) que expresan un fenotipo endotelial con una sonda de hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos complementaria a un gen que codifica un marcador de células epiteliales o a un ligando dirigido a un marcador de células epiteliales
e. detección de las células con fenotipo endotelial que también se unen al marcador de células epiteliales de la etapa 30 c).
f. opcionalmente, diagnóstico y/o predicción del contenido genético de las células detectadas en d)
donde las etapas b-e se pueden llevar a cabo en cualquier orden.
35 Breve descripción de las figuras
Figura 1. Célula fetal masculina identificada mediante sondas específicas de X e Y. La flecha indica la célula fetal. Figura 2. Frecuencia de células fetales por ml de sangre materna. Figura 3. Célula fetal que muestra tinción para pancitoqueratina. La flecha indica la célula fetal.
40 Figura 4. Célula fetal que muestra tinción para citoqueratina 7. La flecha indica la célula fetal. Figura 5. Célula fetal que muestra tinción para vimentina. La flecha indica la célula fetal. Figura 6. Célula fetal teñida con citoqueratina (verde) y con sondas FISH para el cromosoma 21 (rojo) y el cromosoma X (azul). Las flechas señalan a las tres copias del cromosoma 21 en la célula fetal. El fondo de células maternas contiene dos copias del cromosoma 21.
Descripción de la invención
La presente invención se basa en la identificación de antígenos que se puedan usar para la identificación y/o el enriquecimiento de células fetales de una muestra de sangre materna. En particular, la invención se basa en el
50 sorprendente descubrimiento de que las células fetales presentes en una muestra de sangre materna presentan características tanto endoteliales como epiteliales. Por primera vez, la presente invención describe que las células fetales presentes en una muestra de sangre materna experimentan una transición única, que no sufre ninguna de las células maternas normales en la sangre. Ya desde el temprano estadio de blastocisto, las células del embrión se diferencian en tres capas germinales, denominadas endodermo, mesodermo y ectodermo. El mesodermo representa
55 células de tejidos blandos tales como los músculos, la grasa y los vasos sanguíneos. El ectodemo y el endodermo representa células epiteliales que cubren las superficies externa e interna. Las células mesodérmicas y ectodérmicas tienen marcadas diferencias en cuanto al patrón de expresión del marcador. La transición epitelio-mesénquima (TEM) es un proceso mediante el cual las células epiteliales pierden sus características epiteliales y adquieren un fenotipo similar al mesenquimal. La TEM se ha descrito en la embriogénesis temprana, en la que la migración y la
60 desdiferenciación transitoria de las células epiteliales embrionarias son necesarias para la formación de, por
ejemplo, el tubo neural. La TEM también se ha descrito en relación con el cáncer, en el que diversas rutas oncogénicas inducen la TEM. En los últimos años, la TEM ha sido especialmente estudiada en relación con el proceso metastásico.
5 La presente invención se refiere al descubrimiento hecho por los autores de la invención de que las células fetales presentes en la sangre materna experimentan TEM y, usando esta característica, la presente invención aporta un nuevo método de aislamiento e identificación de células fetales presentes en una muestra de sangre materna. Usando un marcador mesodérmico (es decir, un marcador endotelial) como marcador de selección positiva, las células fetales presentes en un número muy bajo en una muestra de sangre materna se enriquecen junto con
10 algunas células maternas. Posteriormente, se realiza la identificación positiva de las células fetales mediante la puesta en contacto de las células restantes con un marcador epitelial y, por consiguiente, mediante el uso del fenómeno TEM. Ninguna de las células maternas normales presentes en una muestra de sangre expresa marcador epitelial alguno. Usando esta transición, los autores de la invención aportan un nuevo método de enriquecimiento e identificación de
15 células fetales en una muestra de sangre materna y también describen nuevos antígenos para este fin.
Por tanto, los métodos de la invención comprenden el aislamiento de células que expresan marcadores de células endoteliales y la posterior detección de las células, que además expresan marcadores de células epiteliales.
20 Los antígenos identificados se pueden usar para la identificación de células fetales en una muestra de sangre materna mediante detección o cuantificación del ARNm o de la proteína (antígeno) codificada por el ARNm. Cuando se usa el término detección en el presente documento, este cubre tanto la detección como la cuantificación. Sin embargo, en dos modos de realización independientes, el término detección cubre o bien la detección o bien la cuantificación. Generalmente, el experto en la materia reconocerá cuando la detección también cubre la
25 cuantificación, es decir, cuándo es pertinente cuantificar los niveles de ARNm o los niveles de la proteína codificada por los ARNm. Esto puede ser necesario, por ejemplo, para la detección de un determinado ARNm que se exprese a un nivel bajo en las células maternas (pero que no esté ausente) y este mismo ARNm se exprese a, por ejemplo, a un nivel 3 veces superior en las células fetales.
30 Cuando se usa el término enriquecimiento en el presente documento, este cubre el aislamiento de una o más células de cualquiera de las otras células presentes en la muestra. En un modo de realización, la(s) célula(s) enriquecida(s) no se aísla(n) de la muestra, sino que se lleva a cabo cualquier tipo de diagnóstico de la(s) célula(s) mientras todavía está(n) presente(s) en la muestra. Entonces, la muestra puede estar presente en un portaobjetos esmerilado y el diagnóstico se puede llevar a cabo mediante microscopía; en este modo de realización, las células se detectan más
35 que se aíslan.
Otro descubrimiento que han realizado los presentes autores de la invención es el de que la etapa de fijación de las células de la muestra materna ayuda enormemente a la identificación y el enriquecimiento de las células fetales de la muestra. Esta etapa de fijación se puede llevar a cabo junto con los métodos de enriquecimiento y/o identificación de
40 células fetales descritos en el presente documento o junto con métodos de enriquecimiento y/o identificación de células fetales descritos en la técnica anterior (por ejemplo, en el documento US2007/0015171 descrito en la sección de antecedentes).
Fijación de las células de una muestra de sangre materna
45 En un modo de realización de la invención, el descubrimiento de que la fijación de las células de una muestra de sangre materna aumenta enormemente la estabilidad de las células fetales en una muestra de sangre materna, a la vez que permite el enriquecimiento e identificación de células fetales, por ejemplo, tal y como se ha descrito anteriormente en el presente documento. En un modo de realización, el procedimiento de fijación se puede llevar a
50 cabo en una muestra de sangre no enriquecida inmediatamente después de la toma de muestras (es decir, la etapa a del método descrito en el primer modo de realización), lo que conlleva a la fijación de componentes celulares en la muestra de sangre materna. Al mismo tiempo, la fijación es tan leve que los eritrocitos maternos se pueden lisar selectivamente en una etapa posterior de lisis. En un modo de realización, la fijación se puede llevar a cabo en cualquier momento que resulte adecuado entre las etapas a-d del método descrito en el primer modo de realización.
55 En un modo de realización, la fijación se lleva a cabo tras la etapa a del método descrito en el primer modo de realización. En otro modo de realización, la fijación se lleva a cabo tras la etapa b del método descrito en el primer modo de realización. En otro modo de realización, la fijación se lleva a cabo tras la etapa c del método descrito en el primer modo de realización. En otro modo más de realización, la fijación se lleva a cabo tras la etapa d del método descrito en el primer modo de realización.
Por tanto, un modo de realización de la invención es un método que comprende las etapas de
a.
suministro de una muestra de sangre materna o una fracción de la misma
b.
puesta en contacto de la muestra con una solución de fijación
5 Preferentemente, la muestra de sangre materna se pone en contacto con la solución de fijación inmediatamente después de que se ha obtenido la muestra. Tal y como se usa en el presente contexto, el término inmediatamente significa que la muestra no se somete a ninguna otra manipulación antes de ser puesta en contacto con la solución de fijación. Preferentemente, la muestra se pone en contacto con la solución de fijación como máximo 24 horas
10 después de que se ha obtenido la muestra. Más preferentemente, la muestra se pone en contacto con la solución de fijación como máximo 12 horas, tal como 8 horas, 4 horas, 2 horas, 1 hora, 30 minutos, 15 minutos, después de que se ha obtenido la muestra. Preferentemente, la muestra se pone en contacto con la solución de fijación como máximo 1 hora después de que la se ha obtenido la muestra. En otro modo de realización preferido, la solución de fijación se añade a sangre total, preferentemente, antes de
15 proceder a una etapa opcional de sedimentación tal como, por ejemplo, sedimentación por gravedad o sedimentación por centrifugación. La fijación se realiza preferentemente durante entre 1 y 60 minutos. Más preferentemente, la fijación se realiza durante entre 5 y 30 minutos y, más preferentemente, la fijación se realiza entre 5 y 15 minutos, tal como 10 minutos.
20 La solución de fijación comprende preferentemente entre el 2,5 % y el 7,5 % de paraformaldehído, más preferentemente entre el 3 % y el 6 %, y más preferentemente entre el 4 % y el 5 %. Además de paraformaldehído, la solución de fijación comprende preferentemente una sal en una concentración de entre 0,05 M y 0,3 M. Más preferentemente, la concentración es de entre 0,1 y 0,2 M y la concentración más preferida es de entre 0,125 y 0,175 M. Preferentemente, la sal es LiCl, KCl, NaCl o PBS, siendo PBS la más
25 preferida.
Cuando se usan las concentraciones de solución de fijación anteriormente mencionadas, es preferible añadir entre 0,2 y 10 volúmenes de la solución de fijación a la muestra de sangre materna para su fijación, más preferentemente se añaden entre 0,5 y 5 volúmenes y más preferentemente se añaden entre 1 y 3 volúmenes. Habitualmente, se
30 añaden 2/3 de volumen. En otro modo de realización más, es preferible añadir entre 1/3 y 3/3 de volumen de solución de fijación, por ejemplo 2/3 de volumen.
Resultará evidente para un experto en la materia que las diversas concentraciones de solución de fijación y los múltiplos de dilución se pueden ajustar de modo que aporten las concentraciones finales deseadas después de que
35 se ha añadido la solución de fijación a la muestra de sangre materna. Preferentemente, la concentración final de paraformaldehído es de entre el 2 y el 6 %, más preferentemente de entre el 3 y el 5 % y más preferentemente de entre el 3,5 y el 4,5 %. Una concentración final habitual es el 4 %.
Preferentemente, la etapa de fijación va seguida de una etapa de lisis que comprende: 40
c. Puesta en contacto de la muestra fijada de la etapa a con un tampón de lisis.
Habitualmente, el tampón de lisis comprende un detergente no iónico, preferentemente Triton X-100. Las concentraciones preferidas del detergente son de entre el 0,01 % (p/p) y el 0,5 %, más preferentemente entre el 0,05 45 %-0,3 % y la más preferentemente el 0,1 %.
En un modo de realización preferido, la etapa de lisis se lleva a cabo inmediatamente después de la etapa de fijación. O sea, tanto la etapa de fijación como la de lisis se llevan a cabo después de la etapa a y antes de la etapa b del método descrito en el primer modo de realización. Es decir, la solución de lisis se añade directamente a la
50 muestra, por ejemplo, después de la fijación durante 10 minutos. Habitualmente, la lisis se realiza durante un periodo de 15 minutos a 120 minutos, más preferentemente de 30 a 60 minutos y lo más preferentemente durante de 40 a 45 minutos.
Tal y como se ha mencionado anteriormente, sorprendentemente, la etapa de lisis permite la lisis selectiva de 55 eritrocitos maternos.
Otro modo de realización de la invención consiste en el uso del tampón de lisis para la lisis selectiva de eritrocitos maternos en una muestra de sangre materna o una fracción de la misma, tal y como se ha descrito anteriormente en el presente documento. En un modo de realización preferido, el tampón de lisis es para su uso en el método de la 60 presente invención y el tampón de lisis se puede añadir a la muestra de sangre materna o a una fracción de la
misma después de la etapa a del método descrito en el primer modo de realización.
Puesta en contacto de la muestra de sangre materna con un ligando o una sonda
5 Se describe un método de selección de una célula fetal en una muestra de sangre materna, método que comprende las etapas de:
a.
suministro de una muestra de sangre materna o una fracción de la misma
b.
puesta en contacto de la muestra con
10 i. una sonda de hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos complementaria a un gen que codifica un marcador de células endoteliales o ii un ligando dirigido a un marcador de células endoteliales
c. selección de las células que se unen a la sonda de hibridación o al ligando de la etapa anterior y, de ese modo,
enriquecimiento de la muestra en células que se unen a la sonda de hibridación o al ligando de la etapa anterior 15 d. puesta en contacto de la muestra (enriquecida) de la etapa con
i. una sonda de hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos complementaria a un gen que codifica un marcador de células epiteliales o ii un ligando dirigido a un marcador de células epiteliales.
20 Preferentemente, el método además comprende una etapa de identificación de células fetales de la muestra. Como resultará evidente, la identificación comprende preferentemente la detección de la presencia del ligando dirigido a un marcador de células epiteliales sobre o en la célula fetal o la detección de la presencia de una sonda de hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos complementaria a un gen que codifica un marcador de células epiteliales sobre o en la célula fetal. Preferentemente, la muestra de sangre materna se pone en contacto con el
25 ligando o la sonda de hibridación uniendo un marcador de células endoteliales o un gen que codifica dicho marcador y, de ese modo, las células con fenotipo endotelial se enriquecen mediante selección de las células específicas para dicho marcador de células endoteliales. Tal método comprende las etapas de:
a. suministro de una muestra de sangre materna o una fracción de la misma
30 b. puesta en contacto la muestra con una sonda de hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos complementaria a un gen que codifica un marcador de células endoteliales o un ligando dirigido a un marcador de células endoteliales y
c. selección de las células específicas para dicho marcador de células endoteliales y, de ese modo, enriquecimiento de la muestra en células con fenotipo endotelial
35 d. puesta en contacto de las células seleccionadas en c) que exhiben un fenotipo endotelial con una sonda de hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos complementaria a un gen que codifica un marcador de células epiteliales o un ligando dirigido a un marcador de células epiteliales
e. detección de las células con fenotipo endotelial que también se unen al marcador de células epiteliales de la etapa
d) 40 f. opcionalmente, diagnóstico y/o predicción del contenido genético de las células detectadas en e)
donde las etapas b-e se pueden llevar a cabo en cualquier orden.
El experto en la materia sabrá que, en un modo de realización, las etapas b, c, d, e y f anteriormente descritas se
45 pueden llevar a cabo en cualquier orden, preferentemente en el orden anteriormente descrito o en el orden b, d, c, e y f, más preferentemente en el orden anteriormente descrito. Por tanto, en un modo de realización, la muestra se pone en contacto con una sonda de hibridación o un ligando dirigido a un marcador de células endoteliales y, a continuación, la misma muestra se pone en contacto con una sonda de hibridación o un ligando dirigido a un marcador de células epiteliales antes de llevar a cabo la etapa de selección. El marcador de células endoteliales se
50 selecciona de entre el grupo que consiste en CD105, CD146 o CD141, vimentina, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR2, VEGFR-3, ITGA5, ITGB5, CDH11 o CDH3. Un marcador endotelial de la presente invención es un marcador que se expresa principalmente sobre o en las células endoteliales. Dicho marcador endotelial no se expresa particularmente sobre o en cualquier otro tipo de células. El más preferido es la CD105 (SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2). El marcador de células epiteliales se selecciona de entre el grupo que consiste en CK1, CK2, CK3, CK4, CK5,
55 CK6, CK7, CK8, CK9, CK10, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 o CK19. Un marcador epitelial de la presente invención es un marcador que se expresa principalmente en o sobre las células epiteliales. Dicho marcador epitelial no se expresa particularmente en o sobre cualquier otro tipo de células.
En un modo de realización preferido, el método además comprende la puesta en contacto de la muestra con 60 anticuerpo M30 (u otro ligando dirigido a la CK18 apoptótica). En un modo de realización preferido, el marcador
epitelial se selecciona de entre el grupo que consiste en: CK4, CK5, CK6A, CK6B, CK7, CK8, CK10, CK13 y CK18. El más preferido es la CK18 (SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO 13). Los antígenos para uso en la presente invención y los genes codificadores se identifican en la tabla 1. Tabla 1:
Acceso NCBI:
Abreviado N.º de acceso
Endoglina humana
CD 105 AF035753
Vimentina humana
Vim NM_003380
Citoqueratina 1 humana
KRT1 X69725
Citoqueratina 2 humana
KRT2 NM_000423
Citoqueratina 3 humana
KRT3 NM_057088
Citoqueratina 4 humana
KRT4 NM_002272
Citoqueratina 5 humana
KRT5 NM_000424
Citoqueratina 6 humana
KRT6 NM_080747
Citoqueratina 7 humana
KRT7 NM_005556
Citoqueratina 8 humana
KRT8 NM_002273
Citoqueratina 10 humana
KRT10 NM_000421
Citoqueratina 13 humana
KRT13 NM_153490
Citoqueratina 14 humana
KRT14 NM_000526
Citoqueratina 15 humana
KRT15 NM_002275
Citoqueratina 16 humana
KRT16 NM_005557
Citoqueratina 17 humana
KRT17 NM_000422
Citoqueratina 18 humana
KRT18 NM_199187
Citoqueratina 19 humana
KRT19 NM_002276
Molécula de adhesión celular vascular
VCAM P19320
Molécula de adhesión intracelular 1
ICAM NP_000192
Molécula CD9
CD9 NP_001760
Receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 1 (Flt-1)
VEGFR-1 P17948
Receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2
VEGFR-2 P35968
Receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 3
VEGFR-3 P35916
Integrina, alfa V
ITGA5 AAI36443
Integrina, beta V
ITGB5 ABY87537
Cadherina 11
CDH11 EAW83002
Cadherina 3
CDH3 P22223
Los antígenos para uso en la etapa b del método descrito en el primer modo de realización y los genes codificadores se seleccionan preferentemente de la tabla 2. Por tanto, el marcador de células endoteliales de la etapa b) del 10 método del primer modo de realización de la invención descrito en el resumen de la invención se selecciona preferentemente de entre los marcadores codificados por los genes de la tabla 2.
Tabla 2:
Acceso NCBI:
Abreviado N.º de acceso
Endoglina humana
CD 105 AF035753
Vimentina humana
Vim NM_003380
Molécula de adhesión celular vascular
VCAM P19320
Molécula de adhesión intracelular 1
ICAM NP_000192
Receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 1 (Flt-1)
VEGFR-1 P17948
Receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2
VEGFR-2 P35968
Receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 3
VEGFR-3 P35916
15 Los antígenos para uso en la etapa d del método descrito en el primer modo de realización y los genes codificadores se seleccionan preferentemente de la tabla 3. Por tanto, el marcador de células epiteliales de la etapa d) del método del primer modo de realización de la invención descrito en el resumen de la invención se selecciona preferentemente de entre los marcadores codificados por los genes de la tabla 3.
Tabla 3:
Acceso NCBI:
Abreviado N.º de acceso
Citoqueratina 1 humana
KRT1 X69725
Citoqueratina 2 humana
KRT2 NM_000423
Citoqueratina 3 humana
KRT3 NM_057088
Citoqueratina 4 humana
KRT4 NM_002272
Citoqueratina 5 humana
KRT5 NM_000424
Citoqueratina 6 humana
KRT6 NM_080747
Citoqueratina 7 humana
KRT7 NM_005556
Citoqueratina 8 humana
KRT8 NM_002273
Citoqueratina 10 humana
KRT10 NM_000421
Citoqueratina 13 humana
KRT13 NM_153490
Citoqueratina 14 humana
KRT14 NM_000526
Citoqueratina 15 humana
KRT15 NM_002275
Citoqueratina 16 humana
KRT16 NM_005557
Citoqueratina 17 humana
KRT17 NM_000422
Citoqueratina 18 humana
KRT18 NM_199187
Citoqueratina 19 humana
KRT19 NM_002276
Cabe señalar que la sonda de hibridación de las etapas b y d del método descrito en el primer modo de realización (véase el resumen de la invención) puede ser complementaria o bien a la hebra codificante o bien a la hebra no
5 codificante del gen. Preferentemente, la sonda es complementaria a la hebra codificante (hebra que no se usa como molde). En un modo de realización relacionado, la sonda se dirige al ARNm. Si la sonda se va a dirigir al ARNm, se puede dirigir a las uniones de corte y empalme, lo que quiere decir que las secuencias se interrumpen en el ADN.
El término “una fracción de la misma” se usa para indicar que la muestra de sangre materna se puede poner en
10 contacto directamente con un ligando o con una sonda de hibridación o que la muestra de sangre materna se puede procesar previamente de tal modo que solo comprenda una fracción de la muestra de sangre materna original cuando se pone en contacto con el ligando o la sonda de hibridación. La muestra de sangre materna se puede, por ejemplo, someter a concentración de sus células, una etapa de coagulación o una etapa de enriquecimiento antes de ser puesta en contacto con el ligando o la sonda de hibridación.
15 En un modo de realización, el método comprende:
a.
suministro de una muestra de sangre materna o una fracción de la misma
b.
puesta en contacto de la muestra con
20 i. una sonda de hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos complementaria a un gen que codifica vimentina humana y/o
ii. un ligando dirigido a la vimentina humana.
En otro modo de realización preferido, el método comprende: 25
a.
suministro de una muestra de sangre materna o una fracción de la misma
b.
puesta en contacto de la muestra con
i. una sonda de hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos complementaria a un gen que
codifica citoqueratina 7 humana y/o 30 ii. un ligando dirigido a la citoqueratina 7 humana.
En un modo de realización más preferido, el método comprende:
a. suministro de una muestra de sangre materna o una fracción de la misma 35 b. puesta en contacto de la muestra con
i. una sonda de hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos complementaria a un gen que codifica CD105 y/o
ii. un ligando dirigido a la CD105 (SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2) y
c. puesta en contacto de la muestra con
40 i. una sonda de hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos complementaria a un gen que codifica citoqueratina 7 (SEQ ID NO: 7) y/o
ii. un ligando dirigido a la citoqueratina 7 humana hecho después de que la muestra de sangre materna se haya
puesto en contacto con un marcador endotelial, en un modo de realización preferido el CD 105.
En otro modo de realización preferido más, el método comprende:
5 a. suministro de una muestra de sangre materna o una fracción de la misma
b. puesta en contacto de la muestra con
i. una sonda de hibridación cruzada que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos complementaria a los genes del grupo que consiste en un gen que codifica las citoqueratinas 1-6, 8, 10 y 13-19 humanas y/o
ii. un ligando de reactividad cruzada dirigido a las citoqueratinas 1-6, 8, 10 y 13-19 humanas.
10 En este modo de realización, el ligando se puede unir a múltiples citoqueratinas, es decir, a las citoqueratinas 1-6, 8, 10 y 13-19. Esta reactividad cruzada se puede conseguir mediante direccionamiento del ligando hacia regiones conservadas (idénticas) de la citoqueratina. Asimismo, las sondas de hibridación cruzada se pueden diseñar mediante direccionamiento de la sonda hacia regiones conservadas (idénticas) de los genes que codifican las
15 citoqueratinas mencionadas.
En un modo de realización, el método comprende:
a. suministro de una muestra de sangre materna o una fracción de la misma 20 b. puesta en contacto de la muestra con
i. una sonda de hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos complementaria a un gen que codifica CD105 y/o
ii. un ligando dirigido a la CD105 y
c. puesta en contacto de la muestra con
25 i. una sonda de hibridación cruzada que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos complementaria a los genes del grupo que consiste en un gen que codifica las citoqueratinas 1-6, 8, 10 y 13-19 humanas y/o
ii. un ligando de reactividad cruzada dirigido a las citoqueratinas 1-6, 8, 10 y 13-19 humanas.
En otro modo de realización más, se usa una mezcla de sondas de hibridación o ligandos (uno para cada antígeno o 30 gen) como una alternativa a una sonda de hibridación cruzada o un ligando de reactividad cruzada.
En tal modo de realización, el método comprende las etapas de
a. suministro de una muestra de sangre materna o una fracción de la misma 35 b. puesta en contacto de la muestra con
i. una sonda de hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos complementaria a un gen que codifica CD105 y/o
ii. un ligando dirigido a la CD105 y
c. puesta en contacto de la muestra con
40 i. una mezcla de sondas de hibridación, que comprende sondas de hibridación que comprenden al menos 10 nucleótidos contiguos complementarias a los genes del grupo que consiste en un gen que codifica las citoqueratinas 1-6, 8, 10 y 13-19 humanas, una sonda de hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos complementaria a un gen que codifica la citoqueratina 7 humana y una sonda de hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos complementaria a un gen que codifica la vimentina humana y/o
45 ii. una mezcla de ligandos que comprende un ligando de reactividad cruzada dirigido a las citoqueratinas 1-6, 8, 10 y 13-19 humanas, un ligando dirigido a la citoqueratina 7 humana y un ligando dirigido a la vimentina humana.
En un modo de realización preferido, las células reactivas tanto a un marcador endotelial (es decir, CD105) como a un marcador epitelial (es decir, citoqueratina 7) se identifican y seleccionan posteriormente para análisis adicionales.
50 En un modo de realización preferido, la etapa b utiliza preferentemente una sonda de hibridación tal y como se describe a continuación en el presente documento y la etapa d utiliza un ligando tal y como se describe a continuación en el presente documento.
55 Selección de sangre total
En un modo de realización, la muestra de sangre materna de la etapa a del método descrito en el primer modo de realización es sangre total, es decir, la sangre no se ha sometido a ningún fraccionamiento antes de ser puesta en contacto con un ligando dirigido a un marcador de células endoteliales o una sonda de hibridación dirigida a un gen
60 que codifica un marcador de células endoteliales.
Fijación y lisis selectiva
En un modo de realización preferido de la invención, las células de la muestra de sangre materna se fijan tal y como
5 se describe en un modo de realización de la invención. El número de células maternas supera en gran medida al número de células fetales presentes en una muestra de sangre materna, por tanto, puede ser útil la inclusión de una etapa de enriquecimiento mediante la cual se eliminen las células maternas de la muestra que se va a analizar. La etapa de enriquecimiento se puede llevar a cabo en cualquier momento que resulte adecuado durante el procedimiento y resulta más adecuada como etapa posterior a la etapa a del método descrito en el primer modo de
10 realización. Para no eliminar ninguna célula fetal, es preferible que la etapa de enriquecimiento no discrimine entre diferentes tipos de células fetales nucleadas. Una gran fracción de células maternas en la muestra de sangre está comprendida por eritrocitos. Se conocen diversos métodos de eliminación de los eritrocitos y el más conveniente es la lisis de eritrocitos, que se puede lograr mediante lisis mediada por NH4Cl. Por tanto, en un modo de realización preferido, los eritrocitos maternos se lisan selectivamente inmediatamente después de la fijación. Por consiguiente,
15 el método de identificación de una célula fetal en una muestra de sangre materna comprende las etapas de:
a.
suministro de una muestra de sangre materna o una fracción de la misma
b.
enriquecimiento de las células fetales mediante sometimiento de dicha muestra de sangre materna a lisis de
eritrocitos 20 c. fijación de las células restantes
d.
puesta en contacto de la muestra con una sonda de hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos complementaria a un gen que codifica un marcador de células endoteliales o un ligando que se une a un marcador de células endoteliales y
e.
enriquecimiento de las células específicas para dicho marcador de células endoteliales
25 f. puesta en contacto de las células seleccionadas en b) que exhiben un fenotipo endotelial con una sonda de hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos complementaria a un gen que codifica un marcador de células epiteliales o un ligando dirigido a un marcador de células epiteliales
g. detección de las células con fenotipo endotelial que también se unen al marcador de células epiteliales de la etapa
c) 30 h. opcionalmente, diagnóstico y/o predicción del contenido genético de las células detectadas en d)
donde las etapas b-e se pueden llevar a cabo en cualquier orden, preferentemente en el orden anteriormente indicado.
35 Permabilización
En otro modo de realización más, las células de la muestra de sangre materna se someten a una etapa de permeabilización antes de ser puestas en contacto con ligandos o sondas de hibridación tal y como se ha descrito anteriormente. Es decir, la etapa de permeabilización se lleva a cabo antes de la etapa b del método descrito en el
40 primer modo de realización. Esta etapa comprende preferentemente la puesta en contacto de la muestra con metanol, acetona o saponina. Preferentemente, el agente permeabilizante es metanol. Por consiguiente, el método de identificación de una célula fetal en una muestra de sangre materna comprende las etapas de:
a. suministro de una muestra de sangre materna o una fracción de la misma 45 b. permeabilización de las células de dicha muestra de sangre materna
c.
puesta en contacto de la muestra con una sonda de hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos complementaria a un gen que codifica un marcador de células endoteliales o un ligando que se une a un marcador de células endoteliales y
d.
enriquecimiento de las células específicas para dicho marcador de células endoteliales
50 e. puesta en contacto las células seleccionadas en b) que exhiben un fenotipo endotelial con una sonda de hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos complementaria a un gen que codifica un marcador de células epiteliales o un ligando dirigido a un marcador de células epiteliales
f. detección de las células con fenotipo endotelial que también se unen al marcador de células epiteliales de la etapa
c) 55 g. opcionalmente, diagnóstico y/o predicción del contenido genético de las células detectadas en d)
donde las etapas b-e se pueden llevar a cabo en cualquier orden.
Selección positiva
Preferentemente, el enriquecimiento dependiente del antígeno comprende la puesta en contacto de la muestra de sangre materna con anticuerpos dirigidos a la CD105, tal y como se describe en la sección de ejemplos y en un modo de realización de la invención. Es decir, en un modo de realización, la etapa b del método descrito en el primer modo de realización es una etapa dependiente del antígeno.
5 En un modo de realización preferido, la muestra de sangre materna se fija, lisa y enriquece usando anticuerpos dirigidos a la CD105 antes de ser puesta en contacto con ligandos o sondas de hibridación dirigidas a células epiteliales (es decir, la etapa d del método descrito en el primer modo de realización).
10 Eficiencia
Un modo de realización preferido de la presente invención hace comercialmente factible la identificación de células fetales, porque disminuye drásticamente el número de células individuales que se tienen que analizar para la identificación de células fetales. La presente invención reduce el número de células en la muestra de 10 a 20 veces 15 de tal modo que se pueden analizar mediante barrido automático de aproximadamente 20 a 30 portaobjetos. Es decir, la invención no solo aporta antígenos específicos a células fetales para su uso en la identificación de células fetales. También aporta métodos de enriquecimiento que reducen drásticamente el número de células que se deben analizar para identificación de células fetales. Los métodos permiten la identificación consistente de 0,1 a 1,1 células fetales/ml de muestra de sangre materna y con el análisis de únicamente 20 a 30 portaobjetos/106 -107 células
20 totales.
Habitualmente, el área de los portaobjetos cubierta por células es de 15 mm x 15 mm, lo que destaca aún más la eficiencia del método.
25 Sondas de hibridación
Las sondas de hibridación de las etapas b y d del método descrito en el primer modo de realización de la invención, en la sección “Resumen de la invención”, se usan como generalmente se hace en la técnica y habitualmente son ADN o ARN, preferentemente ADN. En modos de realización preferidos, las sondas se modifican con nucleótidos no
30 naturales que mejoran la afinidad de unión y/o la especificidad de unión. Ejemplos preferidos de tales nucleótidos no naturales son los LNA (ácidos nucleicos bloqueados), los TINA (ácidos nucleicos intercalantes torsionados), el PNA (ácido péptidonucleico), los INA (ácidos nucleicos intercalantes), monómeros de ARN morfolino-y 2'O-sustituidos tales como los monómeros de 2'O-metil-ARN y 2'O-(2-metoxietil)-ARN.
35 La longitud de las sondas puede ser cualquier longitud que resulte adecuada, tal como en el rango de 10 a 200 nucleótidos, preferentemente entre 10 y 30 nucleótidos, más preferentemente de 15-25 nucleótidos y, preferentemente, la sonda es totalmente complementaria al gen que codifica las citoqueratinas 1, 2, 3, 4 (SEQ ID NO: 3), 5 (SEQ ID NO: 4), 6A (SEQ ID NO: 5), 6B (SEQ ID NO: 6), 7 (SEQ ID NO: 7), 8 (SEQ ID NO: 8), 10 (SEQ ID NO: 9), 13 (SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11), 14, 15, 16, 17, 18 (SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13) y 19 humanas, a
40 la CD105 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) y/o a la vimentina humana a lo largo de toda la longitud de la sonda.
En un modo de realización, la sonda es al menos un 85 % complementaria a un gen que codifica cualquiera de las proteínas descritas en la tabla 1-3, preferentemente de la tabla 2, tal como al menos un 90 % complementaria, por ejemplo, al menos el 95 % complementaria a lo largo de toda la longitud de la sonda. La sonda puede ser 45 complementaria al ADN o al ARNm que codifican dicha proteína. En un modo de realización, la sonda es al menos un 85 % complementaria al gen que codifica las citoqueratinas 1, 2, 3, 4 (SEQ ID NO: 3), 5 (SEQ ID NO: 4), 6A (SEQ ID NO 5), 6B (SEQ ID NO: 6), 7 (SEQ ID NO: 7), 8 (SEQ ID NO: 8), 10 (SEQ ID NO: 9), 13 (SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11), 14, 15, 16, 17, 18 (SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13) y 19 humanas, la CD105 (SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO: 2) y/o la vimentina humana, tal como al menos un 90 % 50 complementaria, por ejemplo, al menos un 95 % complementaria a lo largo de toda la longitud de la sonda. La sonda puede ser complementaria al ADN o al ARNm que codifican dicha proteína. En un modo de realización preferido, la sonda es totalmente complementaria al gen que codifica la CD105 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) a lo largo de toda la longitud de la sonda. En otro modo de realización preferido, la sonda es totalmente complementaria al gen que codifica la CK18 (SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO 13) a lo largo de toda la
55 longitud de la sonda. En un modo de realización, las sondas de hibridación para uso en la etapa b del método descrito en el primer modo de realización de la invención, en la sección “Resumen de la invención”, se pueden seleccionar de entre sondas de hibridación que hibridan un nucleótido que codifica una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en: CD 105, vimentina, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, y VEGF-3. La más preferida es la CD105 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2).
En un modo de realización, las sondas de hibridación para uso en la etapa d del método descrito en el primer modo de realización de la invención se pueden seleccionar de entre sondas de hibridación que hibridan un nucleótido que codifica una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en: CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 y CK19.
5 La más preferida es la CK18 (SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13).
Colorantes indicadores
Las sondas de hibridación y ligandos para su uso de acuerdo con la invención en las etapas b y d del método
10 descrito en el primer modo de realización de la invención descrito en “Resumen de la invención”, pueden comprender, o preferentemente estar unidos a, un colorante indicador (también denominado en el presente documento marcador). Dichas sondas de hibridación o ligando están preferentemente unidos covalentemente a un colorante indicador. El colorante indicador es preferentemente un colorante indicador fluorescente. Preferentemente, el colorante indicador se selecciona de entre el grupo que consiste en FAM™, TET™, JOE™, VIC™, SYBR® Green,
15 6 FAM, HEX, TET, TAMRA, JOE, ROX, fluoresceína, Cy3, Cy5, Cy5.5, Texas Red, rodamina, verde de rodamina, rojo de rodamina, 6-carboxirodamina-6G, Alexa Fluor, verde Oregón 488, verde Oregón 500 y verde Oregón 514.
En un modo de realización, las sondas de hibridación también comprenden un colorante inhibidor de la fluorescencia. En un modo de realización preferido, el colorante inhibidor de la fluorescencia se selecciona de entre
20 el grupo que consiste en TAMRA™, Black Hole Quencher™, DABCYL, BHQ-1, BHQ-2, DDQ I, DDQ II y Eclipse Dark Quencher.
El uso de colorantes indicadores e inhibidores de la fluorescencia es deseable porque permite diversas clases de cuantificaciones además de la identificación.
25 Habitualmente, el colorante indicador y el colorante inhibidor de la fluorescencia están localizados uno cerca del otro en la sonda de hibridación, permitiendo que la fluorescencia inducida por láser o por luz emitida por el indicador se inhiba mediante el colorante inhibidor de la fluorescencia. Cuando el oligonucleótido se une a una hebra molde complementaria, el colorante indicador y el colorante inhibidor de la fluorescencia están separados entre sí de tal
30 modo que el inhibidor ya no inhibe la señal del indicador, es decir, se puede detectar la hibridación.
Por tanto, en un modo de realización, la sonda de hibridación es capaz de formar una estructura tallo-bucle, donde el colorante indicador y el colorante inhibidor de la fluorescencia se aproximan en el tallo. En un modo de realización, el oligonucleótido es una denominada baliza molecular. Cuando la base de la baliza molecular se empareja con una
35 hebra molde, el inhibidor de la fluorescencia y el indicador ya no están próximos. Por lo tanto, la señal inducida por láser desde el colorante indicador ya no se ve inhibida.
En lugar de usar un colorante indicador y un colorante inhibidor de la fluorescencia, se puede usar un denominado par de FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia), que comprende un fluoróforo donante y un
40 fluoróforo aceptor. Cuando el fluoróforo donante es excitado por una fuente de luz externa, emite luz a una longitud de onda que excita al fluoróforo aceptor, que a su vez emite luz a una longitud de onda diferente que puede ser detectada y medida.
La energía solo se transfiere del donante al aceptor si el fluoróforo donante y el fluoróforo aceptor están muy 45 próximos.
Entre los pares de FRET preferidos se incluyen BFP-YFP, CFP-YFP, GFP-DsRed, GFP-Cy3, GFP-mOrange, YFP-RFP, FAM-ROX, FAM-Cy5, FAM-Hex, FAM-TAMRA y Cy3-Cy5.
50 En un modo de realización de la presente invención, las sondas de hibridación y los ligandos que se van a usar en la etapa b del método descrito en el primer modo de realización están preferentemente unidos a un colorante indicador, colorante indicador diferente del colorante indicador unido a las sondas de hibridación y ligandos que se van a usar en la etapa d del mismo método.
55 Ligandos
El ligando tal y como se usa en el método de la invención, en las etapas b y d del método descrito en el primer modo de realización es preferentemente un anticuerpo, un péptido o un aptámero. Un ligando, tal y como se usa en el método de la invención, se une principalmente a la(s) célula(s) de interés, preferentemente con una afinidad más alta 60 que con la que se une a otras células. Por tanto, preferentemente, el ligando se une principalmente a dicho marcador
de células endoteliales o a dicho marcador de células epiteliales.
El ligando puede ser un aptámero. Los aptámeros son ligandos de alta afinidad a base de ácidos nucleicos que se unen a antígenos tales como las proteínas. Habitualmente, se identifican usando técnicas de evolución in vitro tales 5 como la SELEX (evolución sistemática de ligandos mediante enriquecimiento exponencial). En la SELEX, se usan rondas iterativas de selección y amplificación de ácidos nucleicos a partir de una biblioteca inicial para la identificación de aptámeros de alta afinidad. Como la biblioteca inicial es muy grande (por ejemplo, 1014 secuencias diferentes) y las secuencias pueden mutar durante las rondas iterativas, la identificación de aptámeros de alta afinidad se puede hacer ahora sobre una base rutinaria y los expertos en la materia conocen bien tales métodos. Los
10 aptámeros preferidos tienen una longitud de menos de 50 nucleótidos.
Los péptidos de alta afinidad se pueden generar usando la técnica de expresión en fago. En la técnica de expresión en fago, se selecciona una biblioteca de fagos que expresan péptidos contra la diana y, posteriormente, se amplifica en un proceso evolutivo similar a la SELEX. Existen diversos sistemas de presentación en fagos y el tamaño del
15 péptido se puede seleccionar de tal forma que se adapte a determinadas necesidades particulares. En un modo de realización, los péptidos que se usan con el método de la invención tiene un tamaño de menos de 50 aminoácidos.
Con frecuencia, la librería se presenta en una matriz, por ejemplo, una matriz de anticuerpos. Por tanto, la presentación en fagos puede usarse para identificar anticuerpos de alta afinidad. Otras técnicas de evolución in vitro
20 para la generación de anticuerpos implican la presentación ARNm, la presentación en ribosomas y la presentación en ADN covalente.
El ligando también puede ser un anticuerpo. Un anticuerpo usado en la invención es un polipéptido o una proteína capaz de reconocer y unirse a un antígeno que comprende al menos un sitio de unión al antígeno. Dicho sitio de 25 unión al antígeno puede comprender preferentemente al menos una CDR. El anticuerpo puede ser un anticuerpo presente de forma natural, un fragmento de un anticuerpo presente de forma natural o un anticuerpo sintético. El término “anticuerpo presente de forma natural” se refiere a glicoproteínas heterotetraméricas capaces de reconocer y unirse a un antígeno que contienen dos cadenas pesadas (H) idénticas y dos cadenas ligeras (L) idénticas interconectadas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de 30 cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH) y una región constante de cadena pesada (abreviada en el presente documento como CH). Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y una región constante de cadena ligera (abreviada en el presente documento como CL). Las regiones VH y VL se pueden además subdividir en regiones hipervariables, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones más conservadas,
35 denominadas regiones marco (FR). Los anticuerpos pueden comprender diversos heterotetrámeros diferentes. También se pueden generar los anticuerpos mediante inmunización de animales adecuados tales como ratones, ratas, cabras, conejos, caballos, etc.
Los anticuerpos usados para la presente invención pueden ser tanto monoclonales como policlonales. Los expertos
40 en la materia conocen bien los métodos de generación de ambos tipos de anticuerpos. Además de los métodos de evolución in vitro antes indicados, los anticuerpos monoclonales se preparan habitualmente usando la tecnología de hibridomas.
En un modo de realización preferido, el ligando es un anticuerpo o un aptámero que reconoce y se une a un 45 antígeno seleccionado de entre el grupo que consiste en:
CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18, CK19, CD105, vimentina, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, ITGA5, ITGB5, CDH11 y CDH3.
50 En un modo de realización preferido, el ligando para uso en la etapa b del método descrito en el primer modo de realización de la invención, en la sección “Resumen de la invención”, se selecciona de entre el grupo que consiste en: CD 105, vimentina, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, y VEGF-3. La más preferida es la CD105 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2). El ligando para uso en la etapa d del método descrito en el primer modo de realización de la invención, en la sección “Resumen de la invención”, se selecciona de entre el grupo que consiste en: CK1, CK2,
55 CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 y CK19. El más preferido es la CK18 (SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13).
Especificidad de ligandos
60 Preferentemente, los ligandos para uso en las etapas b y d del método descrito en el primer modo de realización se
unen específicamente a células fetales. Cuando se hace referencia a la especificidad, lo que se quiere decir es que los ligandos tienen una mayor afinidad de unión por las células fetales que por las células maternas. La afinidad de unión se puede expresar en términos de una constante de disociación (kd) y la especificidad como una relación entre la kd de un ligando dado para células maternas y la kd del mismo ligando para células fetales. Es decir, un ligando 5 puede tener una kd de 10-5 M para las células maternas y de 10-9 M para las células fetales. En este caso, la especificidad sería de 10 000. Sin embargo, como tanto las células fetales como las células maternas no son necesariamente una población homogénea, la especificidad también se puede expresar en términos del múltiplo de enriquecimiento que se puede alcanzar con un ligando dado (tal y como se describe adicionalmente a continuación). En un modo de realización preferido, los ligandos se generan mediante el método de la presente invención que se
10 describe a continuación en el presente documento. Es decir, la especificidad de los ligandos se ha optimizado.
Preferentemente, el método además comprende una etapa de identificación de las células fetales de la muestra y/o una etapa de enriquecimiento de las células fetales de la muestra. En un modo de realización preferido, la etapa de enriquecimiento se lleva a cabo antes de la etapa de identificación. Con frecuencia, después del enriquecimiento y/o
15 identificación, se lleva a cabo una etapa de detección y una etapa de predicción y/o diagnóstico.
Identificación
Cuando el método comprende una etapa de identificación, un modo de realización comprende la detección de la
20 presencia del ligando o la sonda de hibridación sobre o en las células fetales (etapa e del método descrito en el primer modo de realización).
La detección se puede hacer posible mediante marcado del ligando o la sonda de hibridación con colorantes fluorescentes u otros colorantes adecuados para la detección. Por tanto, el método puede ser, por ejemplo,
25 hibridación in situ fluorescente (FISH). La sonda puede también comprender un inhibidor de la fluorescencia como un fluoróforo o un par de FRET, tal y como se ha descrito anteriormente, que permita la detección de sondas de hibridación unidas a sus secuencias diana. Alternativamente o adicionalmente, las sondas que se unen a sus dianas se separan de las sondas que no se unen mediante una o más etapas de lavado.
30 La identificación también se puede realizar mediante inmunotinción usando un ligando tal como un anticuerpo.
La identificación se puede realizar usando FISH multicolor o inmunotinción multicolor. Es decir, se pueden usar simultáneamente sondas de hibridación diferentes con marcadores fluorescentes diferentes o se pueden usar simultáneamente dos (o más) anticuerpos diferentes con marcadores fluorescentes diferentes. Ambos pueden ser
35 específicos de las células fetales o uno puede ser específico de las células fetales y el otro puede ser específico de las células maternas.
En un modo de realización, la célula fetal identificada se puede someter a microdisección por captura láser (LCM, por sus siglas en inglés).
40 Enriquecimiento
En un modo de realización preferido, se lleva a cabo una etapa de enriquecimiento, dependiente de ligando o dependiente de sonda de hibridación, después de poner la muestra materna en contacto con el ligando o la sonda
45 de hibridación, es decir, la etapa c del método descrito en el primer modo de realización de la invención en “Resumen de la invención”. En un modo de realización, el enriquecimiento también se puede llevar a cabo tras la etapa d del método descrito en el primer modo de realización. Para el enriquecimiento, se prefiere un ligando por encima de una sonda de hibridación.
50 El ligando usado en la etapa c del método descrito en el primer modo de realización de la invención está preferentemente unido a una molécula metálica, tal como perlas magnéticas.
Cuando se hace referencia al enriquecimiento, lo que se quiere decir es que la proporción de células fetales a células maternas de la muestra ha aumentado. El múltiplo de enriquecimiento es preferentemente más de 1000
55 veces, incluso más preferentemente más de 10 000 veces y más preferentemente más de 100 000 veces.
En otro modo de realización, el múltiplo de enriquecimiento se selecciona de entre el grupo que consiste en más de 10 veces, más de 100 veces, más de 1000 veces, más de 10 000 veces, más de 100 000 veces y más de 1 000 000 de veces.
60 La base del enriquecimiento son los ARNm identificados y preferentemente expresados en células fetales y las
proteínas codificadas por los ARNm.
Como resultará evidente para el experto en la materia, se pueden llevar a cabo etapas dependientes de antígeno adicionales basadas en ligandos (o antígenos) conocidos en la técnica anterior. Ejemplos de tales antígenos 5 conocidos en la técnica anterior son: CD34, Tra, Oct1, Crypto1, SSEA1, CD29, CD33, CD146 y CD166.
Tal y como se ha descrito anteriormente en lo que se refiere a, por ejemplo, la CD105, también se puede llevar a cabo una etapa de enriquecimiento antes de que la muestra materna se haya puesto en contacto con el ligando o la sonda de hibridación, es decir, antes de la etapa b del método descrito en el primer modo de realización.
Separación basada en flujo
En un modo de realización preferido, el enriquecimiento se realiza mediante citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS). De este modo, el ligando se marca fluorescentemente, lo que permite la FACS. Los expertos
15 en la materia conocen bien la FACS y los marcadores adecuados y anteriormente se han dado ejemplos de ellos.
Como alternativa a la FACS, se puede usar separación celular en dispositivo microfluídico.
Inmovilización
20 En otro modo de realización preferido, el enriquecimiento se realiza mediante inmovilización de los ligandos. Los ligandos para uso en las etapas b y/o d del método descrito en el primer modo de realización de la invención, en el “Resumen de la invención”, se pueden, por ejemplo, inmovilizar sobre perlas tales como perlas magnéticas, perlas de sefarosa, perlas de agarosa, etc. Cuando los ligandos y las células unidos a las mismas se inmovilizan, se
25 pueden separar por lavado las células no unidas de las perlas. Tal procedimiento de lavado se puede llevar a cabo de manera discontinua o en una columna. Tras el enriquecimiento (fraccionamiento), las células unidas se pueden eluir usando alta o baja concentración de sal, conectores escindibles, pH alto o bajo, agentes desnaturalizantes, etc. Más preferentemente, las células unidas se eluyen mediante elución competitiva con antígenos solubles o ligandos secundarios que se unen a ligandos específicos de células fetales, por ejemplo, anticuerpos dirigidos a la parte fijada
30 del ligando usado para la inmovilización.
Un método preferido de enriquecimiento es MACS (selección celular inmunomagnética), donde los ligandos se inmovilizan sobre perlas magnéticas. Es decir, las células unidas a los ligandos se pueden separar de las no unidas mediante selección de partículas por magnetismo.
35 En un modo de realización preferido, el enriquecimiento de la etapa b del método descrito en el primer modo de realización se lleva a cabo usando CD105 inmovilizada sobre perlas magnéticas.
Selección negativa usando antígenos
40 En un modo de realización, también se pueden usar ligandos que se unen específicamente a células maternas para el enriquecimiento. Por tanto, en un modo de realización preferido, el método además comprende una etapa de puesta en contacto de la muestra con un ligando específico de células maternas dirigido a un antígeno materno. Esta etapa se puede llevar a cabo en cualquier momento que resulte adecuado, tal como antes de la etapa b del método
45 descrito en el primer modo de realización. Después de poner en contacto la muestra con un ligando específico de células maternas, el enriquecimiento se puede realizar, por ejemplo, mediante FACS, MACS, dispositivos microfluídicos o inmovilización, tal y como se ha descrito anteriormente.
Preferentemente, el ligando se selecciona de entre el grupo que consiste en ligandos que se unen a antígenos
50 codificados por ARNm que se expresan preferentemente en células de la sangre materna pero no en células fetales, tal y como han identificado los autores de la presente invención.
Como resultará evidente para el experto en la materia, se pueden usar etapas de enriquecimiento dependientes de antígeno adicionales (selecciones negativas) basadas en ligandos (o antígenos) conocidos en la técnica anterior. Por
55 tanto, en un modo de realización, se lleva a cabo una etapa de enriquecimiento dependiente de antígeno adicional, en la que el ligando se selecciona de entre el grupo que consiste en ligandos que se unen a antígenos maternos específicos conocidos en la técnica anterior tales como CD45, HLA-A, HLA-B o anticuerpos seleccionados de entre el grupo que consiste en HLe-1, M3 y L4.
60 Un marcador de tipo celular preferido para la selección negativa es el CD45, también conocido como antígeno
común leucocitario. La CD45 es una proteína transmembrana expresada por todas las células hematopoyéticas diferenciadas excepto los eritrocitos y las células del plasma. La proteína CD45 existe en diferentes formas, todas ellas producidas a partir de un único gen complejo que da lugar a ocho ARNm maduros diferentes y da como resultado ocho productos proteicos diferentes. Se expresa en todos los leucocitos pero no en otras células y, por
5 tanto, funciona como un marcador panleucocitario que incluye los diversos y distintos tipos de leucocitos (o glóbulos blancos) tales como los neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos (células B y T), monocitos y macrófagos.
Debido a la expresión de la CD45 en la gran mayoría de las células nucleadas presentes en la sangre materna, es preferible una selección negativa usando el marcador CD45. Después de la reducción de las células positivas para
10 CD45, se recogen las células negativas para CD45 de la muestra. Tal reducción y recogida se pueden llevar a cabo mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica.
En un modo de realización, las células presentes en la muestra de sangre materna o en un fragmento de la misma se contratiñen usando un marcador CD45 en cualquier momento que resulte adecuado y, de ese modo, se
15 identifican las células maternas presentes en la muestra. A continuación, se pueden recoger las células negativas para CD45 de la muestra. Tal contratinción y recogida se pueden llevar a cabo mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica.
HLA
20 Los antígenos leucocitarios humanos, parte del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano, son los responsables de las proteínas presentadoras de antígeno de la superficie celular y de muchos otros genes.
Están presentes dos clases de antígenos leucocitarios humanos, los antígenos clase I (A, B y C) y los antígenos
25 clase II (DR, DP y DQ), que tienen funciones diferentes. Ambas clases incluyen un número elevado de alelos variables. Los genes HLA no expresados por células fetales se pueden usar para la reducción de células maternas en la muestra. Es decir, la muestra de sangre materna o una fracción de la misma presente en la etapa a del método descrito en el primer modo de realización se puede someter a antígenos dirigidos a genes HLA.
Otros métodos de enriquecimiento
También se pueden usar métodos de enriquecimiento que no usen ligandos específicos al antígeno.
35 Un método de enriquecimiento adicional preferido es la lisis de eritrocitos tal como la lisis mediada por NH4Cl, que permite la lisis selectiva de eritrocitos dejando las células nucleadas intactas. Un experto en la materia conoce bien este método. En un modo de realización preferido, la lisis de eritrocitos se lleva a cabo antes de la etapa b del método descrito en el primer modo de realización. Para la lisis mediada por NH4Cl se usa preferentemente una concentración de 0,1-0,2 mM de NH4Cl, tal como de 0,14-0,18 mM de NH4Cl, más preferentemente 0,15-0,17 mM
40 de NH4Cl.
También se pueden usar para el enriquecimiento los métodos de fijación y lisis selectiva anteriormente descritos en el presente documento.
45 La muestra también se puede someter a una separación inicial basada en el tamaño o la densidad, tal como mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque. Esto conlleva a la producción de una capa de sobrenadante, que contiene plaquetas; una capa de células mononucleares y un sedimento aglutinado que contiene granulocitos y eritrocitos no nucleados. La capa mononuclear se separa de las otras capas para producir una muestra materna enriquecida en células fetales.
50 También se pueden utilizar para el enriquecimiento propiedades físicas de las células, tales como, aunque no exclusivamente, la carga.
Sedimentación
55 Las células presentes en la muestra de sangre se pueden enriquecer mediante sedimentación, donde se permite sedimentar a la mayoría de las células presentes en la muestra. Antes de la sedimentación, la muestra de sangre se puede diluir en una solución adecuada, tal como NaCl 0,15 M. La sedimentación puede continuar hasta que se ha producido la sedimentación total, tal como durante al menos 5 horas, o preferentemente durante toda la noche.
Preferentemente, la muestra se deja sedimentar a una temperatura inferior a la temperatura ambiente, tal como a una temperatura inferior a 15 °C, tal como inferior a 10 °C u 8 °C o 6 °C, preferentemente a una temperatura de 2-8 °C o de en torno a4 °C.
5 Puede que una proporción menor de células con baja densidad no sedimente y se puedan aislar mediante prefijación suave tal y como se ha descrito, tal como en paraformaldehído al 0,5 % y posterior centrifugación.
Combinación de ligandos y métodos de enriquecimiento
10 Tal como se entenderá, se pueden combinar los diversos ligandos y métodos de enriquecimiento. Por tanto, se pueden usar al mismo tiempo o de forma sucesiva 1, 2, 3 o más ligandos específicos de células fetales dirigidos a células con fenotipo endotelial (es decir, marcadores de células endoteliales). Asimismo, se pueden usar enriquecimientos iterados usando, respectivamente, ligandos específicos de células fetales y ligandos específicos de células maternas.
La muestra
Es deseable obtener una muestra de sangre materna tan grande como sea posible con el fin de incrementar el número total de células fetales. Por consiguiente, el tamaño de la muestra de sangre materna de la etapa a del
20 método descrito en el primer modo de realización se encuentra preferentemente en el intervalo de 0,5 a 50 ml, tal como en elintervalo de 1a 40ml, talcomo de 5a 35ml o de 10 a 30ml.
La muestra de sangre materna suministrada se obtiene preferentemente de una mujer embarazada de entre 5-24 o 6-20 semanas de gestación, más preferentemente de entre 7-16 u 8-12 semanas de gestación.
25 Dilución -concentración
De acuerdo con la invención, la muestra también se puede diluir o concentrar en cualquier momento durante el método. La muestra se puede diluir al menos 1,5 veces, tal como dos veces, más preferentemente al menos tres
30 veces, tal como cinco veces mediante adición de tampones isotónicos, tales como soluciones salinas, soluciones salinas tamponadas con fosfato, PBD y/o medios de crecimiento adecuados, tales como medios basales, y medios de crecimiento de tejidos. Una etapa del método puede incluir la dilución de una muestra mediante adición de diversos componentes asignados para la etapa específica del método.
35 Para llevar a cabo el método puede resultar ventajoso, por razones de viabilidad de las diferentes etapas del método, concentrar la muestra, por ejemplo, para reducir el volumen sin eliminar ninguna célula. El volumen de la muestra se puede reducir hasta menos del 80 %, tal como el 70 %, o el 60 % o el 50 % del volumen original de la muestra, o incluso preferentemente hasta menos del 40 %, tal como el 25 % del volumen original de la muestra. Una etapa de concentración puede ser la centrifugación. De acuerdo con la invención, el método puede comprender una
40 o más etapas de concentración. La centrifugación es uno de los métodos preferidos de concentración celular. Para evitar el daño celular, es preferible una centrifugación suave, tal como 300 g durante 10 minutos.
Detección y diagnóstico
45 Preferentemente, el método de la invención se puede usar para la detección, predicción y/o diagnóstico prenatales (es decir, las etapas e y f del método descrito en el primer modo de realización). Por tanto, una célula identificada se puede someter a detección, predicción y/o diagnóstico o una muestra de sangre materna enriquecida en células fetales se puede someter a detección, predicción y/o diagnóstico.
50 En un modo de realización, se dispone de proteínas fetales para la detección, por ejemplo mediante inmunoelectrotransferencia, secuenciación de proteínas o espectrometría de masas. En otro modo de realización preferido, la detección y/o diagnóstico comprenden una etapa de puesta a disposición de ADN o ARN fetales para la detección. Los métodos de detección preferidos de la etapa e del método descrito en el primer modo de realización son el FISH
55 (hibridación fluorescente in situ), la transferencia de tipo Northern, la transferencia de tipo Southern, las secuenciación de ADN/ARN y el análisis y amplificación de micromatrices. Tales métodos se pueden usar para detectar la presencia de secuencias específicas que indican un determinado estado, por ejemplo, una enfermedad prenatal o predisposición a una determinada enfermedad. Los métodos también se pueden usar para detectar una aneuploidía cromosómica, tal como la trisomía 13, la trisomía 18 o la trisomía 21. Los métodos de detección también
60 se pueden usar para determinar el género del feto mediante detección de secuencias específicas a Y.
En un modo de realización alternativo, el número de células fetales de la muestra se compara con un número estándar. El aumento del número de células fetales en la muestra puede indicar que el embarazo corre riesgo. El número de células fetales en la muestra (así como en una muestra de control) se puede estimar usando, por
5 ejemplo, FACS.
Identificación de ligandos específicos
Se describe un método de identificación de un ligando específico de células fetales que comprende las etapas de:
10 a) suministro de una biblioteca de candidatos de ligando específico de células fetales b) suministro de un conjunto de células maternas c) puesta en contacto de la biblioteca de la etapa a con las células maternas de la etapa b d) selección de los ligandos que no se unen a las células maternas para generar una biblioteca reducida de ligandos
15 que se unen a las células maternas. Preferentemente, el método además comprende las etapas de e) puesta en contacto de la biblioteca de la etapa a o de la biblioteca de la etapa d con una célula fetal f) selección de los ligandos que se unen a la célula fetal para generar una biblioteca enriquecida en ligandos que se unen a células fetales, pero no a células maternas.
20 Debería resultar evidente que una célula basta para la selección de los ligandos de la etapa f, pero obviamente también se pueden usar más células fetales. Se describe que los ligandos específicos identificados se seleccionan de tal modo que quede garantizado que los ligandos se dirigen a células epiteliales de origen placentario. Las etapas b-f se pueden llevar a cabo mediante las etapas de
25 g) suministro de una muestra de sangre materna h) puesta en contacto de la biblioteca con una muestra de sangre materna i) selección de los ligandos que se unen a las células fetales mediante extracción de células fetales individuales, que se han identificado mediante una prueba FISH de un cromosoma Y y/o se han identificado mediante el método del quinto aspecto de invención, y recogida únicamente de los ligandos de estas células.
30 La muestra de sangre materna puede haber sido enriquecida en células fetales. Preferentemente, el método además comprende:
j) multiplicación/amplificación de los ligandos seleccionados de tal modo que se prepare una biblioteca amplificada 35 para selecciones adicionales contra células fetales y/o contra células maternas.
Como resultará evidente, se pueden llevar a cabo múltiples rondas de selección y amplificación para identificar los mejores ligandos. Se describe que el método de identificación de un ligando específico de células fetales se lleva a cabo tal y como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO2010/078872. La biblioteca de candidatos de ligando
40 específico de células fetales puede ser una biblioteca de anticuerpos o péptidos presentados en fagos (presentación en fago), ARNm (presentación en ribosomas o presentación en ARNm) o ADN (presentación covalente o selección de plásmidos). La biblioteca también puede ser una biblioteca de oligonucleótidos de ADN o ARN para la identificación de aptámeros.
45 El término "candidatos" se usa para dar a entender que los compuestos de la biblioteca no se unen necesariamente a las células fetales. Tienen que someterse a pruebas de unión para la identificación de ligandos específicos de células fetales.
En un aspecto, la biblioteca de candidatos de ligando específico de células fetales es una biblioteca totalmente 50 aleatoria. En tal caso, la biblioteca se puede seleccionar iterativamente en primer lugar contra células fetales y amplificar, antes de que se lleve a cabo la contraselección (selección negativa) contra células maternas.
En otro aspecto, la biblioteca de candidatos de ligando específico de células fetales se basa en ligandos de células fetales conocidos. Tal biblioteca se puede crear, por ejemplo, mediante presentación en un fago de un anticuerpo
55 que se une a las células fetales y mutagénesis del gen que codifica el anticuerpo para crear una biblioteca. En tal caso, la mutagénesis puede mejorar la especificidad a la vez que retiene o incluso mejora la afinidad por las células fetales.
En un aspecto, el ligando se une a un antígeno codificado por un gen seleccionado de entre el grupo que consiste 60 en citoqueratina1, 4-6, 8, 10, 13, 18 y 19 humanas, citoqueratina 7 humana y vimentina humana. Por tanto, la
afinidad y/o especificidad de los ligandos se optimizan usando el método anteriormente descrito.
Ligandos y sondas de hibridación específicos de células fetales
5 En un modo de realización de la invención el ligando y las sondas de hibridación específicos de las células endoteliales de la etapa b del método descrito en el primer modo de realización de la presente invención se pueden seleccionar de entre el grupo que consiste en:
i. un ligando dirigido a un antígeno seleccionado de entre el grupo que consiste en CD105, vimentina, VCAM, ICAM, 10 VEGFR-1, VEGFR-2, VEGF-3 y
ii. una sonda de hibridación dirigida a un ácido nucleico que comprende al menos 10 nucleótidos de un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en un gen que codifica CD105, vimentina, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2 y VEGFR-3.
15 En la invención, el ligando y las sondas de hibridación específicos de células endoteliales de la etapa d del método descrito en el primer modo de realización de la presente invención se pueden seleccionar de entre el grupo que consiste en:
i. un ligando dirigido a un antígeno seleccionado de entre el grupo que consiste en CK1, CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, 20 CK6, CK7, CK8, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 y CK19 humanas.
ii. una sonda de hibridación dirigida a un ácido nucleico que comprende al menos 10 nucleótidos de un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en un gen que codifica CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 y CK19.
25 En un modo de realización, el ligando y la sonda de hibridación específicos de células fetales se seleccionan de entre el grupo que consiste en: CD105 y CK18.
En un modo de realización, el ligando o la sonda de hibridación se caracterizan porque permiten la selección correcta en el 90 % de células en una muestra de ensayo que comprende el 99,9 % de células maternas y el 0,1 % 30 de células fetales. Es decir, cuando se hace referencia a una identificación correcta en el 90 % en el presente documento, quiere decir que cuando se lleva a cabo la selección con la muestra de ensayo y con el ligando, se recogerán 90 células fetales por cada 10 células maternas y lo mismo sucederá para una exactitud mejor/peor. Un método de selección preferido es el MACS. Se prefiere un ligando que permita la selección correcta en el 95 %, la selección correcta en el 98 % o incluso se prefiere aún más la selección celular correcta en el 99 %. Como una
35 muestra de sangre materna tiene una riqueza muy baja en células fetales, se prefiere incluso más que el ligando permita la selección celular correcta en el 99,9 %, el 99,99 % o el 99,999 % a partir de una muestra de ensayo tal y como se ha descrito anteriormente. Preferentemente, los ligandos son aptámeros, péptidos o anticuerpos. Los más preferidos son los anticuerpos.
40 Los ligandos se identifican preferentemente usando el método descrito anteriormente el presente documento o en el documento WO2010/078872 ya que tienen una mayor especificidad. Se describe que los ligandos o las sondas de hibridación de la identificada usando el método descrito anteriormente en el presente documento o en el documento WO2010/078872 se usan para el enriquecimiento de una muestra de sangre materna en células fetales o para la identificación de células fetales en una muestra de sangre materna. Preferentemente, el uso de los ligandos o las
45 sondas de hibridación es tal y como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Se describe que los ligandos o las sondas de hibridación se usan para la identificación de ligandos específicos de células fetales adicionales. Los ligandos y/o las sondas de hibridación se usan en el método descrito anteriormente en el presente documento o en el documento WO2010/078872. Se describe una célula fetal identificada mediante el método anteriormente descrito en el presente documento. Dicha célula se caracteriza por su expresión de un marcador
50 seleccionado de entre el grupo de citoqueratinas 1, 2, 3, 4 (SEQ ID NO: 3), 5 (SEQ ID NO: 4), 6A (SEQ ID NO: 5), 6B (SEQ ID NO: 6), 7 (SEQ ID NO: 7), 8 (SEQ ID NO: 8), 10 (SEQ ID NO: 9), 13 (SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11), 14, 15, 16, 17, 18 (SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13), y 19 humanas, vimentina y CD105 humanas (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) y se pueden distinguir de otras células mediante la expresión de CD105 o vimentina y/o la coexpresión de CD105 o vimentina y citoqueratinas. Preferentemente, la célula fetal se ha aislado o identificado, por
55 ejemplo, tal y como se ha descrito en otros aspectos de esta invención y no está presente en el cuerpo humano. Se describe el uso de la célula fetal identificada mediante el método descrito anteriormente en el presente documento para la identificación y el diagnóstico, tal y como se ha descrito anteriormente, o para la generación de ligandos específicos de células fetales adicionales, por ejemplo, tal y como se ha descrito en la sección “Identificación de ligandos específicos”.
Determinación prenatal del género
La célula fetal aislada se puede además usar para la determinación del género del feto, bien mediante el uso de sondas específicas para varones, bien mediante el empleo de miembros de unión al antígeno identificados mediante 5 el método de detección de células fetales descrito en el presente documento y, a continuación, cualquier método adecuado para la determinación del género conocido por un experto en la materia.
Diagnóstico prenatal de anomalías cromosómicas
10 En paralelo a la determinación del género, se describen métodos de determinación de anomalías cromosómicas mediante la detección de células fetales basada en antígenos o miembros de unión que reconozcan dichos antígenos de células fetales aislados o identificados en base a la presente invención. Tales métodos de determinación de anomalías cromosómicas se refieren a la detección de anomalías tales como aneuploidías, traslocación, traslocación desequilibrada, reordenamiento, reordenamiento subtelomérico, reordenamiento
15 cromosómico desequilibrado, reordenamiento subtelomérico desequilibrado, deleción, inversiones, inversiones desequilibradas, duplicación e inestabilidad telomérica y/o acortamiento. La anomalía cromosómica además puede ser tal como sustitución de un único nucleótido, microdeleción, microinserción, deleciones de secuencias cortas, inserciones de secuencias cortas, cambios multinucleótido, metilación del ADN y/o pérdida de impronta genética. (Acuerdo de intenciones) En un modo de realización preferido la aneuploidía cromosómica es una trisomía completa
20 y/o parcial. Tal como la trisomía 21, la trisomía 18, la trisomía 13, la trisomía 16 y/o el síndrome de triple X X X, así como otras anomalías cromosómicas sexuales. Alternativamente, la aneuploidía es una monosomía completa y/o parcial, tal como la monosomía X, la monosomía 21, la monosomía 22, la monosomía 16 y/o la monosomía 15.
Las técnicas de hibridación del ADN se pueden usar para la determinación del género o la determinación de
25 anomalías cromosómicas. Entre las técnicas conocidas en la técnica se incluyen métodos tales como la hibridación fluorescente in situ (FISH), el marcaje in situ mediante cebadores (PRINS), la FISH cuantitativa (Q-FISH) y el bandeo multicolor (MCB). La hibridación fluorescente in situ (FISH) hace uso de sondas moleculares marcadas tal y como se ha descrito anteriormente con, por ejemplo, una fluorescencia. Se usa una sonda correspondiente a un gen o una secuencia de ADN y esta muestra una señal al microscopio en un locus específico de un núcleo. La técnica FISH se
30 puede aplicar a células interfásicas y puede confirmar la presencia de una euploidía o una aneuploidía de los cromosomas X, Y, 13, 15, 18 y 21. La FISH es útil para la identificación de anomalías en el número de cromosomas tales como las trisomías y monosomías y, cuando se dispone de sondas para regiones específicas de los cromosomas, se puede usar para determinar si hay presencia de deleciones, traslocaciones o duplicaciones.
35 Como una alternativa a las técnicas de hibridación anteriormente mencionadas, se pueden usar métodos PCR para la determinación de anomalías cromosómicas. Esto requerirá el aislamiento inicial de las pocas células fetales. Entre los métodos PCR de acuerdo con la invención, se incluye un adecuado método conocido en la técnica capaz de detectar anomalías como trisomías, etc., tal y como se ha descrito anteriormente. Los métodos PCR se pueden emplear además para la determinación de anomalías menores, tales como pequeñas deleciones mutacionales en
40 genes específicos. La PCR cuantitativa fluorescente (QF-PCR) es un ejemplo de tales métodos disponibles para la detección de, por ejemplo, las trisomías 13, 18, 21, triploidías, trisomías dobles y aneuploidías X e Y (V. Cirigliano, 2004). Mediante el diseño de cebadores adecuados para anomalías cromosómicas menores, pero no obstante graves, se pueden usar métodos PCR para la determinación de enfermedades tales como, por ejemplo, la fibrosis quística, que es frecuentemente provocada por una deleción de 3 bp en el gen de la fibrosis quística que lleva a una
45 proteína a la que le falta un aminoácido fenilalanina crítico.
Tal y como se ha descrito anteriormente, las células fetales pueden ser una célula madre. Las células madre se presentan en diferentes variedades, dependiendo de cuándo y dónde se producen durante el desarrollo y de cómo de versátiles son. Las células madre fetales detectadas pueden ser de cualquier tipo, tal como embriónicas o
50 somáticas, y son pluripotentes o multipotentes.
Uso de células madre
Mediante la aplicación de la tecnología descrita en el presente documento, se pueden aislar células madre fetales de
55 muestras de sangre materna mediante el uso de un miembro de unión, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que reconozca dicho antígeno de célula fetal de acuerdo con la invención. Las células madre pueden producir más células madre y se pueden usar para generar tipos de células especializadas tales como las nerviosas, las sanguíneas o las hepáticas. Dependiendo de los tipos de células madre aisladas, las células pueden tener diferentes aplicaciones en el desarrollo de células de tipos celulares o tejidos específicos. Las células madre pluripotentes
60 pueden dar lugar a cualquier tipo de células, mientras que las células madre multipotentes pueden dar lugar a un
número más limitado de tipos de células. Por ejemplo, las células madre formadoras de sangre (hematopoyéticas) pueden ser capaces de formar todos los tipos de células sanguíneas, mientras que las células madre mesenquimales son capaces de formar células mesenquimales.
5 Las células madre, especialmente las células madre pluripotentes, se pueden usar para el tratamiento de una variedad de enfermedades. Las células madre pluripotentes son tradicionalmente células madre embriónicas, las cuales, debido a consideraciones éticas, tienen una disponibilidad limitada. La posibilidad de usar células madre aisladas de una muestra de sangre materna es una alternativa atractiva. Las células madre pluripotentes se pueden usar para el tratamiento de una pluralidad de enfermedades para las que los métodos convencionales no
10 proporcionan un tratamiento adecuado.
Bibliografía
Gussin HA, Sharma AK, Elias S. «Culture of endothelial cells isolated from maternal blood using anti-CD105 and 15 CD133.» Prenat Diagn, 2004: Mar;24(3):189-93.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 Preparación de muestras de sangre.
Se obtuvieron muestras de sangre periférica de 24 ml de mujeres embarazadas de 11 a 14 semanas de gestación. Las muestras de sangre se extrajeron antes de un procedimiento invasivo y después del consentimiento informado.
25 Todas las muestras de sangre se recogieron en tubos heparinizados y se procesaron inmediatamente después de su recogida.
Además de la sangre heparinizada, se extrajeron 5 ml de sangre a tubos con EDTA. Esta sangre se usó para el análisis del género del feto. Se determinó el género del feto mediante PCR en tiempo real del ADN fetal libre usando
30 genes específicos del cromosoma Y. Posteriormente, solo se procesaron muestras de sangre procedentes de embarazos de varones.
Fijación
35 Para cada muestra, se añade una alícuota de 3 ml de sangre total en tubos de centrifugación de 50 ml con recubrimiento previo (8 tubos por muestra) usando pipetas con recubrimiento previo (el tampón de recubrimiento previo fue BSA al 2 % en PBS sin Ca2+ y Mag2+). Se añadieron dos ml de formaldehído al 10 % en PBS a cada tubo usando pipetas con recubrimiento previo. Tras mezclar cuidadosamente, se fijó la sangre durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Lisis selectiva
Después de la fijación se añadieron 30 ml de Triton X-100 al 0,12 % en PBS (sin Ca2+ y Mg2+) a cada tubo. Se invirtieron los tubos 3 veces y se lisaron los glóbulos rojos durante 45 minutos a temperatura ambiente. Después de
45 la lisis, se añadieron 15 ml de BSA frío (4 ºC) al 2 % en PBS (sin Ca2+ y Mg2+) a cada tubo. Después del mezclado mediante inversión de los tubos dos veces, las células sin lisar se sometieron a sedimentación por centrifugación a 500 g durante 15 minutos a 4 ºC. Después de retirar el sobrenadante, se resuspendieron las células en 10 ml de PBS frío a 4 ºC (sin Ca2+ y Mg2+) y se almacenaron toda la noche a 4 ºC.
50 Permeabilización
Las muestras se permeabilizaron mediante adición de 10 ml de metanol frío (-20 °C) seguida de una incubación a 4 °C durante 10 minutos. Después de la centrifugación a 500 g durante 10 minutos, se agruparon los sedimentos de células en 2 tubos usando pipetas con recubrimiento previo. Los tubos vacíos se enjuagaron con 1 ml de tampón
55 MASC frío (PBS, BSA al 0,5 % y EDTA 2 mM). Las células agrupadas se transfirieron a dos tubos de 15 ml con recubrimiento previo y se centrifugaron a 500 g durante 10 minutos. Después de retirar el sobrenadante, las células de cada tubo se resuspendieron en 500 µl de tampón MACS.
Selección positiva usando microperlas de CD105 y MACS.
Se añadieron 130 µl de microperlas de CD105 (Miltenyi) a 500 µl de suspensión celular y se incubó la suspensión celular durante 60 minutos a 4 ºC. A continuación, se lavaron las células mediante adición de 6 ml de tampón MACS frío seguida de una centrifugación durante 10 minutos a 500 g. Se retiró el sobrenadante y las células se resuspendieron en 2 ml de tampón MACS frío.
5 La suspensión de células marcadas con CD105 se cargó en una columna LD lavada previamente (Miltenyi) ya colocada sobre el imán y apilada en la parte superior de una columna MS lavada previamente (Miltenyi). Cuando las células habían pasado a través de la columna LD, esta se lavó dos veces con 2 ml de tampón MACS frío. La columna MS se lavó con 1 ml de tampón MACS frío. A continuación, se retiró la columna LD del imán y se colocó
10 sobre un tubo de 15 ml con recubrimiento previo y se eluyeron las células mediante aplicación de 5 ml de tampón MACS frío 2 veces. Los primeros 5 ml de tampón pasaron a través de la columna sin usar un émbolo. Se forzó el paso de los segundos 5 ml de tampón a través de la columna mediante el uso de un émbolo. A continuación, se retiró la columna MS del imán y se colocó sobre el tubo de recogida. Se eluyeron las células de la misma forma que para la columna LD, usando 1 ml de tampón MACS frío 2 veces en lugar de 5 ml de tampón 2 veces. El tubo de
15 recogida se centrifugó a 500 g durante 10 minutos. Se descartó el sobrenadante y el sedimento celular se resuspendió en tampón MACS frío. A continuación, se colocó la suspensión celular sobre portaobjetos recubiertos de polilisina y los portaobjetos se secaron al aire (durante toda la noche) antes de su análisis posterior.
Identificación de células fetales masculinas mediante FISH específica de los cromosomas X e Y y barrido 20 automático.
Antes de la hibridación, se enjuagaron los portaobjetos en PBS durante 5 minutos y se deshidrataron durante 3 minutos cada uno en etanol al 60 %, 80 % y 99,9 %. Para este análisis se usaron sondas de repetición específicas de cromosoma DXZ1, CEP X, de ADN satélite alfa marcada con SpectrumGreen y DYZ1, CEP Y, de ADN satélite III 25 marcada con SpectrumOrange (Abbott Molecular). Las mezclas de hibridación que contenían ambas sondas se prepararon mediante mezcla de 1 parte de la sonda X, 1 parte de la sonda Y, 1 parte de agua destilada y 7 partes de tampón de hibridación. Se añadieron quince µl de mezcla de hibridación y se cubrieron con un cubreobjetos de 24 x 24 mm. Se sellaron los cubreobjetos con cemento de caucho y se desnaturalizaron los ADN sobre una placa caliente a 83,5 ºC durante 7 minutos y se hibridaron durante toda la noche en una atmósfera humidificada a 42 ºC. Los
30 portaobjetos hibridados se lavaron durante 2 minutos a 73 ºC en 0,4 x SCC con Tween 20 al 0,3 % y durante 1 minuto a temperatura ambiente en 2xSSC con Tween 20 al 0,1 %. A continuación, se montaron los portaobjetos en Vectashield con DAPI.
Se identificaron las células que contenían una señal FISH roja ubicada en un núcleo teñido con DAPI mediante
35 barrido automático usando dos tipos diferentes de dispositivos de barrido. El sistema de barrido de portaobjetos MDS (versión 5.8.0) desarrollado originalmente por Applied Imaging y el sistema de barrido MetaCyte desarrollado por Metasystems. Con el sistema de barrido MDS se sometieron a barrido los portaobjetos con una amplificación de 20x usando la función de barrido 5. Con MetaCyte, se sometieron a barrido los portaobjetos con una amplificación de 10x usando un clasificador desarrollado y optimizado de manera interna para detectar señales FISH verdaderas de
40 SpectrumOrange. Después del barrido, se inspeccionaron visualmente las células identificadas por el dispositivo de barrido mediante reubicación automática. Las células que tenían una señal verde en y una señal naranja en Y significativamente mayor que la señal en X se clasificaron como células fetales masculinas.
Tinción con anticuerpos de células fetales masculinas.
45 Las células fetales se sometieron a tinción con los siguientes anticuerpos usados por separado. Pancitoqueratina (n.º de producto C2562, Sigma-Aldrich). Citoqueratina 7 (n.º de producto M7018, DAKO Cytomation) y vimentina (n.º de producto V2258, Sigma-Aldrich). El anticuerpo anti-pancitoqueratina reconoce las citoqueratinas 1, 4-6, 8, 10, 13, 18 y 19 humanas. El anticuerpo anti-citoqueratina 7 reconoce la citoqueratina 7 humana y el anticuerpo anti
50 vimentina reconoce un epítopo de la vimentina humana que no se detecta en las células linfoides humanas. Los tres son anticuerpos monoclonales de ratón de isotipo IgG1, IgG2 (citoqueratinas) o IgM (vimentina).
Después de dejar secar al aire los portaobjetos, estos se rehidrataron en 4xSSC durante 10 minutos y, a continuación, se incubaron previamente durante 30 minutos a temperatura ambiente con 100 µl de tampón de 55 bloqueo que consistía en 4xSSC que contenía un 10 % de suero normal de cabra, BSA al 1 % y un reactivo de bloqueo (Roche) al 0,5 % o 100 µl de Imaging Enhancer (Molecular Probes). A continuación, se incubaron los portaobjetos durante 60 minutos a temperatura ambiente con 100 µl de anticuerpo primario diluido 1:50 en tampón de bloqueo. Tras la incubación del anticuerpo, se lavaron los portaobjetos 3 veces durante 5 minutos en 4xSCC. Para la detección, se incubaron los portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente con 100 µl de 60 anticuerpo de conejo anti-IgG de ratón (citoqueratinas) o anti-IgM de ratón (vimentina) conjugado con AlexaFluor-488
(Molecular Probes) diluido 1:200 en tampón de bloqueo, se lavaron 3 veces durante 5 minutos en 4xSSC y, a continuación, se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con 100 µl de conjugado AlexaFluor-488 de cabra anti-Ig de ratón (Molecular Probes) diluido 1:200 en tampón de bloqueo. Después de lavar los portaobjetos dos veces durante 5 minutos en 4xSCC y una vez durante 5 minutos en 2xSCC, se montaron en Vectashield con DAPI
5 (Vector Laboratories).
Tinción con anticuerpo de vimentina seguida de tinción para pancitoqueratina.
Se retiraron los cubreobjetos mediante lavado en 4xSCC durante 10 minutos. A continuación, se enjuagaron los
10 portaobjetos en 4xSCC durante 5 minutos y se incubaron durante 30 minutos con 100 µl de tampón de bloqueo o Imaging Enhancer tal y como se ha descrito anteriormente. A continuación, se incubaron los portaobjetos durante 60 minutos a temperatura ambiente con 100 µl de anticuerpo anti-vimentina diluido 1:50 en tampón de bloqueo. Tras la incubación del anticuerpo, se lavaron los portaobjetos 3 veces durante 5 minutos en 4xSCC. Para la detección, se incubaron los portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente con 100 µl de anticuerpo de conejo anti-IgM
15 de ratón conjugado con AlexaFluor-555 diluido 1:200 en tampón de bloqueo. Después de lavar los portaobjetos 2 veces durante 5 minutos en 4xSCC y una vez durante 5 minutos en 2xSCC, se montaron en Vectashield con DAPI.
Los portaobjetos teñidos con anticuerpo se colocaron en el microscopio de barrido y se inspeccionaron visualmente las células fetales en busca de tinción positiva o negativa mediante reubicación automática.
20 Resultados experimentales del Ejemplo 1.
Se ensayó el origen fetal de las células enriquecidas mediante selección celular inmunomagnética (MACS) con el protocolo CD105 en 32 muestras de sangre procedentes de mujeres embarazadas que portaban fetos masculinos.
25 Se llevó a cabo la técnica FISH con sondas específicas de los cromosomas X e Y, y las células que exhibieron una señal X y una señal Y significativamente mayor que la señal X se consideraron células fetales (Figura 1). Se detectaron entre 0,1 y 1,1 células fetales por ml de sangre en las muestras de sangre materna (Figura 2). El 97 % de las muestras dieron positivo en células fetales. En una muestra de sangre no se detectaron células fetales.
30 Se caracterizaron veintiuna células fetales masculinas mediante tinción con anticuerpos anti-citoqueratina 7, antipancitoqueratina y anti-vimentina usando el protocolo descrito anteriormente. Tres de las 21 células fetales dieron positivo en la tinción con el anticuerpo anti-citoqueratina 7; 10 de las14 células que dieron negativo en la tinción con citoqueratina 7, dieron positivo en la tinción con el anticuerpo anti-pancitoqueratina; mientras que 3 de cada 4 células fetales que dieron negativo en la tinción para citoqueratina, dieron positivo en la tinción con el anticuerpo anti
35 vimentina. Además, 4 de cada 4 células que dieron positivo en la tinción para pancitoqueratina también mostraron tinción positiva con el anticuerpo anti-vimentina. Estos resultados demuestran que la selección celular inmunomagnética (MACS) basada en CD105 de muestras de sangre materna revela un nuevo tipo de célula fetal presente en la sangre materna que expresa citoqueratinas y/o vimentina, diferenciándose de ese modo este tipo de célula de los trofoblastos fetales.
Ejemplo 2
SELECCIÓN DE SANGRE TOTAL Y TINCIÓN EN COLUMNA
45 Toma de muestras de sangre
Se obtuvieron muestras de sangre periférica de 30 ml de mujeres embarazadas de 11 a 14 semanas de gestación. Las muestras de sangre se extrajeron antes de un procedimiento invasivo y después del consentimiento informado. Todas las muestras de sangre se recogieron en tubos heparinizados o en tubos con EDTA y se procesaron en un
50 máximo de 4 horas después de su recogida.
Además de la sangre heparinizada, se extrajeron 5 ml de sangre a tubos con EDTA. Esta sangre se usó para el análisis del género del feto. Se determinó el género del feto mediante PCR en tiempo real del ADN fetal libre usando genes específicos del cromosoma Y.
Preparación de muestras de sangre -selección para CD105
Se añadieron de 20-50 µl de microperlas de CD105 (Miltenyi) por ml de sangre y, tras mezclar la muestra, se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, se añadieron alícuotas de la muestra en 6 60 tubos de 50 ml con recubrimiento previo (el tampón de recubrimiento previo fue BSA al 2 % en PBS sin Ca2+ y
Mg2+) y se añadieron 20 ml de tampón MACS a cada tubo antes de proceder a la centrifugación a 445g durante 12 minutos a 4 °C. Se retiraron los sobrenadantes y se añadió tampón MACS hasta un volumen final de 7,5 ml. Tras mezclar cuidadosamente usando una pipeta con recubrimiento previo, la sangre total marcada con CD105 se cargó en alícuotas de 3 ml de sangre en 2 columnas de sangre total lavadas previamente. Cuando la sangre había pasado
5 a través de las columnas, las columnas se lavaron dos veces con 4 ml de tampón MACS, se retiraron del imán y se colocaron sobre un tubo de 15 ml con recubrimiento previo y se eluyeron las células de las columnas empujando con un émbolo 5 ml de tampón de elución para columnas de sangre total (Miltenyi). Después de centrifugar a 445g durante 12 minutos a 4 ºC, se descartó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento celular en 500 µl de PBS usando una punta de pipeta con recubrimiento previo.
Fijación y permeabilización
Después de la adición de 500 µl de Inside Fix (Miltenyi), las células se fijaron durante 20 minutos. Después de la fijación, se añadieron 10 ml de tampón MACS y se centrifugaron los tubos a 500g durante 10 minutos a 4 ºC. A
15 continuación, se descartó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento celular en 500 µl de tampón MACS. Se permeabilizaron las células con 500 µl de MeOH helado y se incubaron durante 10 minutos a 4 ºC. A continuación, se cargaron las células en una columna MS (Miltenyi) lavada previamente ya colocada en el imán. Una vez que la suspensión celular había entrado totalmente en la columna, se lavaron las células mediante aplicación de 500 µl de tampón MACS a la columna.
Tinción celular en el interior de columnas MS.
Las células fetales se tiñeron con un cóctel de los anticuerpos siguientes. Pancitoqueratina (n.º de producto C2562, Sigma-Aldrich). Citoqueratina 7 (n.º de producto M7018, DAKO Cytomation) y citoqueratina 8/18 (producto 18.0213,
25 Invitrogen). El anticuerpo anti-pancitoqueratina reconoce las citoqueratinas 1, 4-6, 8, 10, 13, 18 y 19 humanas. El anticuerpo anti-citoqueratina 7 reconoce la citoqueratina 7 humana y el anti-citoqueratina 8/18 reconoce la citoqueratina 8/18. Los tres son anticuerpos monoclonales de ratón de isotipo IgG1, IgG2.
Antes de la tinción con anticuerpos, las columnas se incubaron previamente durante 10 minutos a temperatura
30 ambiente después de haber aplicado 500 µl de Imaging Enhancer (Molecular Probes) y, a continuación, se lavaron una vez mediante aplicación de 500 µl de tampón MACS. A continuación, se incubaron las columnas durante 30 minutos a temperatura ambiente después de haber aplicado 200 µl del cóctel de citoqueratina diluido 1:50 en tampón de bloqueo que consistía en 4xSSC que contenía un 10 % de suero normal de cabra, BSA al 1 % y reactivo de bloqueo (Roche) al 0,5 %. Tras la incubación del anticuerpo, se lavaron las columnas 3 veces con 500 µl de
35 tampón MACS. Para la detección, se incubaron las columnas durante 30 minutos a temperatura ambiente con 200 µl de fragmentos F(ab)2 de anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugados con AlexaFluor-488 (Invitrogen) diluidos
1:50 en tampón de bloqueo, se lavaron 3 veces con 500 µl de tampón MACS y, a continuación, se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con 200 µl de fragmentos F(ab)2 de anticuerpo de conejo anti-IgG de cabra conjugados con AlexaFluor-488 (Invitrogen) diluidos 1:50 en tampón de bloqueo. Después de la incubación, se 40 lavaron las columnas una vez con 500 µl de tampón MACS y dos veces con 500 µl de PBS sin Ca2+ y Mg2+. A continuación, se transfirieron las columnas desde el imán a un tubo de 15 ml y se recuperaron las células mediante aplicación de 500 µl de tampón MACS dos veces, usando el émbolo durante la aplicación del tampón MACS por segunda vez. Una vez que las células habían sedimentado por centrifugación a 500g durante 10 minutos a 4 ºC, se resuspendió el sedimento celular en PBS sin Ca2+ y Mg2+, se realizaron frotis de las células sobre portaobjetos y
45 los portaobjetos se secaron al aire durante toda la noche en la oscuridad y, a continuación, se montaron en Vectashield con DAPI (Vecta Laboratories).
Análisis de portaobjetos teñidos para citoqueratina
50 Identificación de células teñidas para citoqueratina
Las células fetales teñidas con el cóctel de anticuerpos anti-citoqueratina se identificaron mediante barrido automático usando el sistema de barrido MetaCyte desarrollado por Metasystems. Se sometieron a barrido los portaobjetos con una amplificación de 10x usando un clasificador desarrollado y optimizado de manera interna para
55 la detección de células teñidas para citoqueratina. Después del barrido, las células identificadas por los dispositivos de barrido se inspeccionaron visualmente mediante reubicación automática.
Identificación/verificación FISH de células fetales (masculinas)
60 En los casos de embarazos de varones, se confirmó la especificidad de la tinción con anticuerpos mediante FISH de
XY. Antes de la hibridación, se retiraron los cubreobjetos, se enjuagaron los portaobjetos en PBS durante 5 minutos y, a continuación, se deshidrataron durante 3 minutos cada uno en etanol al 60 %, 80 % y 99,9 %. Para este análisis se usaron sondas de repetición específicas de cromosoma DXZ1, CEP X, de ADN satélite alfa marcada con SpectrumAqua y DYZ1, CEP Y, de ADN satélite III marcada con SpectrumOrange (Abbott Molecular). Las mezclas 5 de hibridación que contenían ambas sondas se prepararon mediante mezcla de 1 parte de la sonda X, 1 parte de la sonda Y, 1 parte de agua destilada y 7 partes de tampón de hibridación. Se añadieron quince µl de mezcla de hibridación y se cubrieron con un cubreobjetos de 24 x 24 mm. Se sellaron los cubreobjetos con cemento de caucho y se desnaturalizaron los ADN sobre una placa caliente a 83,5 ºC durante 7 minutos y se hibridaron durante toda la noche en una atmósfera humidificada a 42 ºC. Los portaobjetos hibridados se lavaron durante 2 minutos a 73 ºC en
10 0,4 x SCC con Tween 20 al 0,3 % y durante 1 minuto a temperatura ambiente en 2xSSC con Tween 20 al 0,1 %. A continuación, se montaron los portaobjetos en Vectashield con DAPI.
Análisis de la trisomía 21
15 En los casos de embarazo de alto riesgo (1:50 o superior), se analizaron células fetales teñidas para citoqueratina en busca de presencia o ausencia de la trisomía 21 (síndrome de Down) usando la sonda LSI 21 específica de locus para el cromosoma 21 marcada con SpectrumOrange (Abbott Molecular). La sonda CEP X marcada con SpectrumAqua se usó junto con la sonda LSI 21 como control interno. Las mezclas de hibridación que contenían ambas sondas se prepararon mediante mezcla de 1 parte de la sonda X, 1 parte de la sonda LSI 21, 1 parte de agua
20 destilada y 7 partes de tampón de hibridación.
Antes de la FISH, se retiraron los cubreobjetos mediante lavado del portaobjetos durante 10 minutos con paraformaldehído (PFA) al 2 % en PBS. A continuación, se posfijaron los portaobjetos mediante incubación durante 10 minutos en PFA al 4 %, se lavaron en PBS durante 2 minutos y se deshidrataron durante 3 minutos cada uno en 25 EtOH al 60 %, 80 % y 99,9 %. Después de secar al aire los portaobjetos, se desnaturalizaron previamente con una mezcla de hibridación que no contenía sondas de la forma que se indica a continuación. Se añadieron 18 µl de mezcla de hibridación y se cubrieron con un cubreobjetos de 24 x 24 mm. A continuación, los portaobjetos se colocaron en una placa caliente a 90 ºC durante 10 minutos. Se retiraron los cubreobjetos y se lavaron los portaobjetos en PBS durante 5 minutos y en EtOH helado al 99,9 % durante 10 minutos. Después de secar al aire, 30 se añadieron 18 µl de la mezcla de hibridación que contenía la sonda LSI 21 y la sonda CEP X y se cubrieron con un cubreobjetos de 24 x 24 mm. Se selló el cubreobjetos con cemento de caucho y se desnaturalizaron los ADN sobre una placa caliente a 90 ºC durante 10 minutos y se hibridaron durante toda la noche en una atmósfera humidificada a 42 ºC. Los portaobjetos hibridados se lavaron durante 2 minutos a 73 ºC en 0,4 x SCC con Tween 20 al 0,3 % y durante 1 minuto a temperatura ambiente en 2xSSC con Tween 20 al 0,1 %. A continuación, se montaron los
35 portaobjetos en Vectashield con DAPI. Se cuentan las señales FISH del cromosoma 21 presentes en las células fetales teñidas mediante reubicación usando el archivo de barrido original. La Figura 6 muestra un caso de diagnóstico prenatal no invasivo de la trisomía 21 (síndrome de Down).
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> FCMB ApS
<120> Aislamiento de células fetales en sangre materna y ligandos para tal uso
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<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 3196 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 2147 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4
<211> 2320
<212> ADN
<213> Homo sapiens 5 <400> 4
<210> 5
<211> 2450 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 5
<210> 6
<211> 2331 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 6
<210> 7
<211> 1753 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 7
<210> 8
<211> 1802 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 8
<210> 9
<211> 2162 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 9
<210> 10
<211> 1719 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 10
<210> 11
<211> 1693 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 11
<210> 12
<211> 1485 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 12
<210> 13
<211> 1439 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 13

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Método de aislamiento de una célula fetal en una muestra de sangre materna, método que comprende
    las etapas de: 5
    a.
    suministro de una muestra de sangre materna o una fracción de la misma
    b.
    puesta en contacto de la muestra con una sonda de hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos complementaria a un gen que codifica un marcador de células endoteliales o un ligando dirigido a un marcador de células endoteliales, donde el marcador de células endoteliales se selecciona de entre el grupo que
    10 consiste en CD105, CD146, CD141, vimentina, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, ITGA5, ITGB5, CDH11 o CDH3 y
    c.
    selección de las células específicas para dicho marcador de células endoteliales y, de ese modo, enriquecimiento de la muestra en células con fenotipo endotelial
    d.
    puesta en contacto de las células seleccionadas en c) que exhiben un fenotipo endotelial con una sonda de
    15 hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos complementaria a un gen que codifica un marcador de células epiteliales o un ligando dirigido a un marcador de células epiteliales, donde el marcador de células epiteliales se selecciona de entre el grupo que consiste en CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK9, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 o CK19
    e. detección de las células con fenotipo endotelial que también se unen al marcador de células epiteliales de la etapa 20 d)
    f. opcionalmente, diagnóstico y/o predicción del contenido genético de las células detectadas en e)
    donde las etapas b-e se pueden llevar a cabo en cualquier orden.
    25 2. Método de la reivindicación 1, donde la diana del marcador de células endoteliales está situada en la superficie de la célula que se va a identificar.
  2. 3. Método de la reivindicación 1, donde la diana del marcador de células epiteliales está situada en el
    interior de la célula que se va a identificar. 30
  3. 4. Método de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende además las etapas de
    a.
    suministro de una muestra de sangre materna o una fracción de la misma
    b.
    puesta en contacto de la muestra con
    35 i. una sonda de hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos complementaria a un gen que codifica un marcador de células endoteliales o ii un ligando dirigido a un marcador de células endoteliales
    c. selección de las células que se unen a la sonda de hibridación o al ligando de la etapa anterior y, de ese modo,
    enriquecimiento de la muestra en células que se unen a la sonda de hibridación o al ligando de la etapa anterior 40 d. puesta en contacto de la muestra enriquecida con
    i. una sonda de hibridación que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos complementaria a un gen que codifica un marcador de células epiteliales o ii un ligando dirigido a un marcador de células epiteliales.
    45 5. Método de cualquier reivindicación 4 que comprende además una etapa de identificación de células fetales de la muestra.
  4. 6. Método de cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5, donde la identificación comprende la detección de
    la presencia del ligando dirigido al marcador de células epiteliales o de la sonda de hibridación dirigida al marcador 50 de células epiteliales sobre o en la célula fetal.
  5. 7. Método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la muestra de sangre materna es sangre total.
    55 8. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las células de la muestra se someten a una etapa de fijación después de la etapa de selección/enriquecimiento.
  6. 9. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las células de la muestra
    se permeabilizan después de la etapa de fijación y antes de ser puestas en contacto con el ligando o la sonda de 60 hibridación dirigidos al marcador de células epiteliales.
  7. 10. Método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el marcador de células endoteliales se selecciona de entre el grupo que consiste en: CD105, CD146 o CD141.
    5 11. Método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el marcador de células endoteliales es CD105.
  8. 12. Método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el marcador de células epiteliales se
    selecciona de entre el grupo que consiste en: CK8, CK18, CK19 o CK7. 10
  9. 13. Método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo M30.
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