ES2708558T3

ES2708558T3 - Enriquecimiento e identificación de células fetales en sangre materna y ligandos para dicho uso

Info

Publication number: ES2708558T3
Application number: ES14199993T
Authority: ES
Inventors: Britta Christensen; Steen Kølvraa; Andreas Eckelt; Marie Brinch; Ripudaman Singh; Lotte Hatt
Original assignee: ARCEDI BIOTECH APS
Current assignee: ARCEDI BIOTECH APS
Priority date: 2009-01-07
Filing date: 2010-01-07
Publication date: 2019-04-10
Anticipated expiration: 2030-01-07
Also published as: DK2857527T3; HK1208883A1; PL2857527T3; US20120003643A1; EP2857527A3; EP2634268A2; EP3470534B1; EP2634268A3; EP3470534C0; EP2857527A2; PT2857527T; PT2385992E; DK2385992T3; WO2010078872A3; ES2533861T3; HRP20150274T1; HRP20190076T1; EP2385992B1; EP2857527B1; EP3470534A1

Abstract

Un procedimiento de detección de una célula fetal que comprende las etapas de a. Proporcionar una muestra de sangre materna o una fracción de la misma b. Fijar las células c. Lisar selectivamente los eritrocitos d. Poner en contacto las células fijadas resultantes de la etapa c con i. una sonda de hibridación dirigida a un ácido nucleico que comprende al menos 10 pb de un gen CD146 expresado diferencialmente en células fetales de una muestra de sangre materna, o ii. un ligando dirigido a un antígeno codificado por un gen CD146 expresado diferencialmente en células fetales de una muestra de sangre materna.

Description

DESCRIPCION

Enriquecimiento e identificacion de celulas fetales en sangre materna y ligandos para dicho uso

Antecedentes

El examen de celulas fetales para la deteccion temprana de enfermedades fetales y anomalfas geneticas se lleva a cabo en relacion con muchos embarazos, en particular cuando la edad materna es alta (35 anos o mas) o cuando se conocen enfermedades geneticas en la familia. Las celulas fetales se pueden obtener por amniocentesis, la extraccion de lfquido amniotico de la cavidad amniotica dentro del saco amniotico o por biopsia de corion, donde se toman biopsias de la placenta, lo que se denomina muestreo invasivo.

La exploracion de aneuploidfa prenatal emplea analisis de cromosomas tradicionales o sondas de ADN espedficas de cromosomas para la elucidacion de las aberraciones numericas de los cromosomas mas anormales, en particular los cromosomas 13, 18, 21, X e Y en el feto.

Debido a la invasion de los procedimientos de muestreo descritos anteriormente y al riesgo de aborto, sena ventajoso realizar un diagnostico fetal mediante un procedimiento no invasivo, tal como por ejemplo mediante el uso de una muestra de sangre materna.

Durante el embarazo, una diversidad de tipos de celulas de origen fetal atraviesan la placenta y circulan dentro de la sangre periferica materna. La viabilidad del uso de celulas fetales en la circulacion materna para fines de diagnostico se ha visto obstaculizada por el hecho de que las celulas fetales estan presentes en la sangre materna en numeros muy limitados, los numeros reportados han sido de una celula fetal por 105-108 celulas maternas nucleadas o 1-10 celulas fetales por ml de sangre materna. Ademas, la mayona de las celulas fetales no se pueden distinguir de las celulas maternas basandose unicamente en la morfologfa, por lo que se han investigado procedimientos alternativos de identificacion de celulas fetales.

El documento US2007/0015171describe un procedimiento no invasivo para el aislamiento y la deteccion del ADN fetal. El procedimiento enriquece una muestra de sangre materna usando anticuerpos que se unen espedficamente a las celulas maternas y/o anticuerpos que se unen espedficamente a las celulas fetales. Los inventores sugieren el uso de algunos de los anticuerpos mencionados espedficamente: HLe-1 es un anticuerpo que reconoce un antfgeno presente en leucocitos humanos maduros y en precursores de eritrocitos muy inmaduros, pero no eritrocitos nucleados maduros. Por lo tanto, se sugiere que este anticuerpo puede usarse para reconocer leucocitos maternos, pero no eritrocitos nucleados fetales. Tambien se sugieren anticuerpos anti-monocitos (M3) y anticuerpos anti-linfocitos (L4) para eliminar las celulas maternas de una muestra. Finalmente, los autores sugieren usar un anticuerpo monoclonal, que reconozca el receptor de la transferrina (TfR) en las celulas fetales. El ADN de celulas fetales aisladas se pone posteriormente a disposicion para deteccion. El documentoUS2008/0261822ensena el diagnostico genetico prenatal no invasivo usando una muestra que contiene trofoblastos, por ejemplo, sangre materna o una muestra transcervical, y CD146 como marcador fetal

Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de procedimientos mejorados para aislar celulas fetales de muestras de sangre materna para facilitar la deteccion y el diagnostico prenatales.

Resumen de la invencion

El alcance de la invencion esta definido por las reivindicaciones adjuntas. La presente divulgacion proporciona varios aspectos: En un primer aspecto, la presente divulgacion proporciona un procedimiento para fijar celulas de una muestra de sangre materna de manera que las celulas fetales de la muestra se identifican y/o enriquecen de manera mas eficiente. En particular, el procedimiento de fijacion permite la lisis selectiva de los eritrocitos maternos. El procedimiento comprende las etapas de

a. Proporcionar una muestra de sangre materna o una fraccion de la misma

b. Poner en contacto la muestra con una solucion de fijacion

Tambien se describen soluciones de fijacion y usos de las mismas en los siguientes aspectos.

Otro aspecto de la divulgacion se refiere a procedimientos de identificacion y/o enriquecimiento de celulas fetales a partir de una muestra de sangre materna usando ARNm expresados preferentemente en celulas fetales y/o protemas codificadas por los ARNm. Dichos procedimientos comprenden las etapas de

a. Proporcionar una muestra de sangre materna o una fraccion de la misma

b. Poner en contacto la muestra con

i. una sonda de hibridacion dirigida a un acido nucleico que comprende al menos 10 pb de un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en TMEFF2, ABHD2, ACVR2B, ADAM11, AHNAK, AK000420, ALS2CL, BC089454, BC111482,CB123670, CCNA2, CD7, CPS1, CRYL1, D4ST1, DKFZp434F142, EDN1, EEF1A1, ENST00000356196, FLJ35740, FYN, GCC2, GSK3A, HIST1H2AJ, HLA-C, HMGA1, HMGN2, ITGA7, KCNK4, KMO, KY, LOC389286, MAD2L1, MAPK3, MYL6, NBR2, NTRK1, PF4, PGK1, PPIA, QPRT, RGPD2, RP11-78J21.1, RPL23, RPL23A, RPL26, RPL39, RPS27, SLAMF1, SYT9, T (BRACHYURY), THC2265980, THC2274391, TP73, TPM3, UBL4A, WRN, ZFYVE9, ZNF283, ZNF539, ZNF614, CD141, CD135, CD142/F3, CD146, CD33, CD68, CD144, CD62E, GAP/GJA5, ITGA5, KCNK3/TASK-1, CNTFR, JAM-1, SDC4/Syndecan 4, ACVR2B, ACVR2A, CD44v6+CD44v4/5, STX1A, TEK/Tie2, CD171, NCAM/CD56, ALPP, ALPPL2 y MMP23A/MMP23B o

ii. un ligando dirigido a un antfgeno codificado por un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en TMEFF2, ABHD2, ACVR2B, ADAM11, AHNAK, AK000420, ALS2CL, BC089454, BC111482,CB123670, CCNA2, CD7, CPS1, CRYL1, D4ST1, DKFZp434F142, EDN1, EEF1A1, ENST00000356196, FLJ35740, FYN, GCC2, GSK3A, HIST1H2AJ, HLA-C,HMGA1, HMGN2, ITGA7, KCNK4, KMO, KY, LOC389286, MAD2L1, MAPK3, MYL6, NBR2, NTRK1, PF4, PGK1, PPIA, QPRT, RGPD2, RP11-78J21.1, RPL23, RPL23A, RPL26, RPL39, RPS27, SLAMF1, SYT9, T (BRACHYURY), THC2265980, THC2274391, TP73, TPM3, UBL4A, WRN, ZFYVE9, ZNF283, ZNF539, ZNF614, CD141, CD135, CD142/F3, CD146, CD33, CD68, CD144, CD62E, GAP/GJA5, ITGA5, KCNK3/TASK-1, CNTFR, JAM-1, SDC4/Syndecan 4, ACVR2B, ACVR2A, CD44v6+CD44v4/5, STX1A, TEK/Tie2, CD171, NCAM/CD56, ALPP, ALPPL2 y MMP23A/MMP23B.

Despues del enriquecimiento y/o identificacion, la celula o celulas fetales se someten tfpicamente a una etapa de deteccion, de modo que se puede realizar una etapa de prediccion y/o diagnostico del feto.

La presente divulgacion se basa en la identificacion de los ARNm que codifican protemas que se expresan preferentemente en celulas fetales de una muestra de sangre materna. Es decir, los ARNm estan presentes en niveles aumentados en las celulas fetales en comparacion con los niveles de ARNm en celulas sangumeas maternas. Por lo tanto, los ARNm identificados pueden usarse para la identificacion de celulas fetales en una muestra de sangre materna mediante la deteccion o cuantificacion del ARNm o la protema codificada por el ARNm. Cuando el termino deteccion se usa en este documento, abarca tanto la deteccion como la cuantificacion. Sin embargo, en dos realizaciones separadas, el termino deteccion abarca la deteccion o la cuantificacion. En general, el experto en la materia reconocera cuando la deteccion tambien abarca la cuantificacion, es decir, cuando es relevante cuantificar los niveles de ARNm o los niveles de la protema codificada por los ARNm. Esto puede por ejemplo, necesitarse para la deteccion de un ARNm determinado que se expresa a un nivel bajo en celulas maternas (pero no ausente) y donde el mismo ARNm se expresa, por ejemplo, a niveles 3 veces mayores que en celula fetales.

Un subconjunto de los ARNm codifica protemas expuestas en la superficie, y estas protemas se pueden usar como antfgenos para ligandos tales como aptameros o anticuerpos y el uso de estos ligandos permite el enriquecimiento y/o la identificacion de celulas fetales de una muestra de sangre materna. Dicho enriquecimiento es deseable porque las celulas fetales obtenidas de sangre materna pueden usarse para la deteccion y el diagnostico prenatales.

Otro descubrimiento que los presentes inventores han hecho es que una etapa de fijacion de las celulas de la muestra materna ayuda en gran medida a la identificacion y el enriquecimiento de las celulas fetales de la muestra. Esta etapa de fijacion se puede realizar junto con los procedimientos de enriquecimiento y/o identificacion de celulas fetales descritos en este documento o junto con procedimientos de enriquecimiento y/o identificacion de celulas fetales que se han descrito en la tecnica anterior (por ejemplo el documento US2007/0015171descrito en la seccion de antecedentes).

Fijacion de las celulas de una muestra de sangre materna

Un primer aspecto de la invencion se basa en el descubrimiento de que la fijacion de las celulas de una muestra de sangre materna aumenta considerablemente la estabilidad de las celulas fetales en una muestra de sangre materna, mientras que permite el enriquecimiento y la identificacion de las celulas fetales, por ejemplo, como se describe mas detalladamente en el segundo aspecto de la invencion. El procedimiento de fijacion se puede realizar en una muestra de sangre no enriquecida inmediatamente despues del muestreo, lo que da como resultado la fijacion de todos los componentes celulares en la muestra de sangre materna. Al mismo tiempo, la fijacion es tan leve que los eritrocitos maternos pueden lisarse selectivamente en una etapa de lisis posterior.

Por lo tanto, un primer aspecto de la divulgacion es un procedimiento que comprende las etapas

a. Proporcionar una muestra de sangre materna o una fraccion de la misma

b. Poner en contacto la muestra con una solucion de fijacion

Preferentemente, la muestra de sangre materna se pone en contacto con la solucion de fijacion inmediatamente despues de que se haya obtenido la muestra. El termino inmediatamente como se usa en el presente contexto significa que la muestra no esta sujeta a ninguna otra manipulacion antes de ser contactada con la solucion de fijacion. Preferentemente, la muestra se pone en contacto con la solucion de fijacion no mas de 24 horas despues de que se haya proporcionado la muestra. Mas preferentemente, la muestra se pone en contacto con la solucion de fijacion no mas de 12 horas, tal como 8 horas, 4 horas, 2 horas, 1 hora, 30 minutos, 15 minutos despues de que se haya proporcionado la muestra. Mas preferentemente, la muestra se pone en contacto con la solucion de fijacion no mas de 1 hora despues de que se haya proporcionado la muestra.

En otra realizacion preferida, la solucion de fijacion se anade a la sangre completa y preferentemente antes de una etapa de sedimentacion opcional tal como, por ejemplo, sedimentacion por gravedad o sedimentacion por centrifugacion.

La fijacion se realiza preferentemente entre 1 y 60 minutos. Mas preferentemente, la fijacion se realiza entre 5 y 30 minutos y, lo mas preferentemente, la fijacion se realiza entre 5 y 15 minutos, tal como 10 minutos.

La solucion de fijacion comprende preferentemente entre el 2,5 % y el 7,5 % de paraformaldel'ndo, mas preferentemente entre el 3 % y el 6 %, y lo mas preferentemente entre el 4 % y el 5 %.

Ademas del paraformaldel'ndo, la solucion de fijacion comprende preferentemente sal en una concentracion entre 0,05 M y 0,3 M. Mas preferentemente, la concentracion esta entre 0,1 y 0,2 M y la mas preferida es una concentracion entre 0,125 y 0,175 M. La sal es preferentemente LiCl, KCl, NaCl o PBS, siendo PBS el mas preferido.

Cuando se usan las concentraciones mencionadas anteriormente de la solucion de fijacion, se prefiere anadir entre 0,2 y 10 volumenes de la solucion de fijacion a la muestra de sangre materna para la fijacion, mas preferentemente entre 0,5 y 5 volumenes y lo mas preferentemente se anade entre 1 y 3 volumenes. Tfpicamente se anaden 2 volumenes. En otra realizacion mas, se prefiere anadir entre 1/3 y 3/3 volumenes de solucion de fijacion, por ejemplo, 2/3 volumenes.

El experto en la materia tendra claro que las diversas concentraciones de la solucion de fijacion y los numeros de veces de la dilucion se pueden ajustar para obtener las concentraciones finales deseadas una vez que la solucion de fijacion se haya anadido a la muestra de sangre materna. Preferentemente, la concentracion final de paraformaldel'ndo esta entre 2 y 6 %, mas preferentemente entre 3 y 5 % y lo mas preferentemente entre 3,5 % y 4,5 %. Una concentracion final tfpica es del 4 %.

Preferentemente, a la etapa de fijacion le sigue una etapa de lisis que comprende:

c. Poner en contacto la muestra fijada de la etapa con un tampon de lisis

- donde el tampon de lisis comprende un detergente no ionico, preferentemente Triton X-100. Las concentraciones preferidas del detergente estan entre el 0,01 % y el 0,5 %, mas preferentemente entre el 0,05 % y el 0,3 %, y lo mas preferentemente el 0,1 %.

En una realizacion preferida, la etapa de lisis se realiza inmediatamente despues de la etapa de fijacion.

Como se menciono anteriormente, la etapa de lisis permite sorprendentemente la lisis selectiva de los eritrocitos maternos.

Un segundo aspecto de la divulgacion es el uso de la solucion de fijacion para fijar celulas fetales en una muestra de sangre materna o una fraccion de la misma, como se describe en el primer aspecto. En una realizacion preferida, la solucion de fijacion es para uso en el procedimiento del cuarto aspecto.

Un tercer aspecto de la divulgacion es el uso del tampon de lisis para la lisis selectiva de eritrocitos maternos en una muestra de sangre materna o una fraccion de la misma, como se describe en el primer aspecto. En una realizacion preferida, el tampon de lisis es para uso en el procedimiento del cuarto aspecto.

Poner en contacto la muestra de sangre materna con un ligando o una sonda

Un cuarto aspecto de la presente divulgacion proporciona un procedimiento que comprende las etapas de a. Proporcionar una muestra de sangre materna o una fraccion de la misma

b. Poner en contacto la muestra con

Los productos genicos de los genes se identifican en la tabla 1, asf como tambien los niveles de expresion en las celulas fetales y maternas. En los ejemplos se muestran los experimentos que verifican que los ARNm de estos genes se expresan preferentemente en celulas fetales de una muestra de sangre materna.

La expresion "una fraccion de la misma" se usa para indicar que la muestra de sangre materna se puede poner en contacto directamente con un ligando o una sonda de hibridacion o que la muestra de sangre materna se puede preprocesar para que solo comprenda una fraccion de la muestra de sangre materna original al ser contactada con el ligando o sonda de hibridacion. La muestra de sangre materna puede, por ejemplo, estar sujeta a la concentracion de sus celulas, una etapa de coagulacion o una etapa de enriquecimiento antes de ponerse en contacto con el ligando o la sonda de hibridacion.

Sondas de hibridacion

Las sondas de hibridacion se usan generalmente en la tecnica y son tipicamente ADN o ARN, preferentemente ADN. En realizaciones preferidas, las sondas se modifican con nucleotidos no naturales que mejoran la afinidad de union y/o la especificidad de union. Ejemplos preferidos de dichos nucleotidos no naturales son LNA (acidos nucleicos bloqueados), TINA (acidos nucleicos de intercalacion retorcidos), PNA (acido nucleico peptfdico), INA (acidos nucleicos de intercalacion), morfolino y monomeros de ARN sustituidos en 2'O tales como monomeros ARN 2'O-metil y ARN 2'O-(2-metoxietil).

La longitud de las sondas esta preferentemente entre 10 y 30 nucleotidos, mas preferentemente 15-25 nucleotidos. Colorantes reporteros

Las sondas de hibridacion y los ligandos a usar de acuerdo con la invencion pueden comprender un colorante reportero (tambien denominado en este documento marcador). Preferentemente, el colorante reportero se selecciona de entre el grupo que consiste en FAM™, TET™, JOE™, VIC™, SYBR® Green, 6 FAM, HEX, TET, TAMRA, JOE, ROX, Fluorescema, Cy3, Cy5, Cy5.5, Texas Red, Rhodamine, Rhodamine Green, Rhodamine Red, 6-CarboxyRhodamine 6G, Alexa Fluor, Oregon Green 488, Oregon Green 500 y Oregon Green 514.

En una realizacion, las sondas de hibridacion tambien comprenden un colorante de extincion. En una realizacion preferida, el colorante de extincion se selecciona de entre el grupo que consiste en TAMRA™, Black Hole Quencher™, DABCYL, BHQ-1, BHQ-2, DDQ I, DDQ II y Eclipse Dark Quencher.

El uso de reportero y colorante de extincion es deseable porque permite diversos tipos de cuantificaciones ademas de la identificacion.

Tfpicamente el colorante reportero y el colorante interruptor estan ubicados cerca uno del otro en la sonda de hibridacion, lo que permite que la fluorescencia inducida por la luz o el laser sea emitida por el inhibidor reportero a extinguir con el colorante interruptor. Cuando el oligonucleotido se une a una hebra de molde complementaria, el colorante reportero y el colorante interruptor se separan entre sf de manera que el interruptor ya no apaga la senal del reportero, es decir, se puede detectar la hibridacion.

Por lo tanto, en una realizacion, la sonda de hibridacion es capaz de formar una estructura de vastago-bucle, donde el interruptor y el colorante reportero se ponen en proximidad en el vastago. En una realizacion, el oligonucleotido es una denominada baliza molecular. El interruptor y el reportero ya no estan cerca, cuando la base de baliza molecular se empareja con una hebra de molde. Por lo tanto, la senal inducida por laser del colorante reportador ya no se extingue.

En lugar de usar un colorante reportero y un colorante interruptor, se puede usar un par denominado FRET (transferencia de energfa de resonancia de fluorescencia) que comprende un fluoroforo donante y un fluoroforo aceptor. Cuando el fluoroforo donante es excitado por una fuente de luz externa, emite luz a una longitud de onda, que excita al fluoroforo aceptor, que a su vez emite luz a una longitud de onda diferente, que puede ser detectada y medida. La energfa solo se transfiere del donante al aceptor si el fluoroforo donante y el fluoroforo aceptor estan muy cerca.

Los pares de FRET preferidos incluyen BFP-YFP, CFP-YFP, GFP-DsRed, GFP-Cy3, GFP-mOrange, YFP-RFP, FAM-ROX, FAM-Cy5, FAM-Hex, FAM-TAMRA y Cy3-Cy5.

Ligandos

El ligando como se usa en el procedimiento de la invencion es preferentemente un anticuerpo, un peptido o un aptamero.

Los aptameros son ligandos de alta afinidad basados en acidos nucleicos que se unen a antfgenos tales como las protemas. Tfpicamente se identifican usando tecnicas de evolucion in vitro tales como SELEX (evolucion sistematica de ligandos mediante enriquecimiento exponencial). En SELEX, se usan rondas iteradas de seleccion y amplificacion de acidos nucleicos de una biblioteca inicial para la identificacion de aptameros de alta afinidad. Dado que la biblioteca inicial es muy grande (por ejemplo, 1014 secuencias diferentes) y las secuencias pueden mutarse durante rondas iteradas, la identificacion de aptameros de alta afinidad ahora se puede realizar de forma habitual y dichos procedimientos son conocidos por el experto. Los aptameros preferidos tienen menos de 50 nucleotidos de longitud. Se pueden generar peptidos de alta afinidad usando la presentacion en fagos. En la presentacion en fagos, se selecciona una biblioteca de peptidos que presentan fagos contra el objetivo y se amplifican posteriormente en un procedimiento de evolucion similar al SELEX. Existen diversos sistemas para la presentacion en fagos y el tamano del peptido puede elegirse para satisfacer necesidades particulares. En una realizacion, los peptidos a usar con el procedimiento de la invencion tienen un tamano de menos de 50 aminoacidos.

A menudo, la biblioteca se presenta en un armazon, por ejemplo, un armazon de anticuerpos. Por lo tanto, la presentacion en fagos puede usarse para identificar anticuerpos de alta afinidad. Otras tecnicas de evolucion in vitro para la generacion de anticuerpos incluyen la presentacion de ARNm, la presentacion de ribosomas y la presentacion de ADN covalente.

Los anticuerpos tambien se pueden generar usando la inmunizacion de animales adecuados, como ratones, ratas, cabras, conejos, caballos, etc.

Los anticuerpos usados para la presente invencion pueden ser monoclonales o policlonales. Los procedimientos para generar ambos tipos de anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la materia. Ademas de los procedimientos de evolucion in vitro descritos anteriormente, los anticuerpos monoclonales se preparan tfpicamente usando tecnolog^a de hibridoma.

Especificidad de los ligandos

Preferentemente, los ligandos se unen espedficamente a las celulas fetales. Cuando se hace referencia a la especificidad, lo que se quiere decir es que los ligandos tienen una mayor afinidad de union para las celulas fetales que para las celulas maternas. La afinidad de union puede expresarse en terminos de una constante de disociacion (kd) y especificidad como una relacion entre la kd de un ligando dado para celulas maternas y la kd del mismo ligando para celulas fetales. Es decir, un ligando puede tener una kd de 10-5 M para las celulas maternas y de 10-9 M para las celulas fetales. En este caso, la especificidad sena de 10.000. Sin embargo, dado que tanto las celulas fetales como las maternas no son necesariamente una poblacion homogenea, la especificidad tambien puede expresarse en terminos del numero de veces de enriquecimiento que se puede lograr con un ligando dado (como se describe mas adelante).

En una realizacion preferida, los ligandos se generan por el procedimiento del quinto aspecto de la invencion. Es decir, la especificidad de los ligandos ha sido optimizada.

Preferentemente, el procedimiento comprende ademas una etapa de identificacion de celulas fetales de la muestra y/o una etapa de enriquecimiento de celulas fetales de la muestra. En una realizacion preferida, la etapa de enriquecimiento se realiza antes de la etapa de identificacion.

Despues del enriquecimiento y/o identificacion, a menudo se realiza una etapa de deteccion y una etapa de prediccion y/o diagnostico.

Identificacion

Cuando el procedimiento comprende una etapa de identificacion, una realizacion comprende detectar la presencia del ligando o la sonda de hibridacion sobre o en las celulas fetales.

La deteccion se puede habilitar marcando el ligando o la sonda de hibridacion con colorantes fluorescentes u otros colorantes adecuados para la deteccion. Por lo tanto, el procedimiento puede ser, por ejemplo, la hibridacion in situ fluorescente (FISH). La sonda puede comprender un interruptor, asf como un fluoroforo o un par FRET como se describe anteriormente, que permite la deteccion de sondas de hibridacion unidas a sus secuencias diana. Como alternativa o ademas, las sondas que se unen a sus dianas se separan de las sondas no vinculantes mediante una o mas etapas de lavado.

La identificacion tambien se puede hacer usando la inmunotincion usando un ligando tal como un anticuerpo.

La identificacion se puede hacer usando FISH multicolor o inmunotincion multicolor. Es decir, diferentes sondas de hibridacion con diferentes marcadores fluorescentes pueden usarse simultaneamente o dos (o mas) anticuerpos diferentes con diferentes marcadores fluorescentes pueden usarse simultaneamente. Ambos pueden ser espedficos para las celulas fetales o uno puede ser espedfico para las celulas fetales y el otro puede ser espedfico para las celulas maternas.

Enriquecimiento

En una realizacion preferida, una etapa de enriquecimiento dependiente del ligando o dependiente de la sonda de hibridacion se realiza despues de que la muestra materna se haya puesto en contacto con el ligando o la sonda de hibridacion. Para el enriquecimiento, se prefiere un ligando a una sonda de hibridacion.

Cuando se hace referencia al enriquecimiento, lo que se quiere decir es que la relacion de celulas fetales a celulas maternas de la muestra aumenta. El numero de veces de enriquecimiento es preferentemente mas de 1000 veces, incluso mas preferentemente mas de 10.000 veces y lo mas preferentemente mas de 100.000 veces.

En otra realizacion, el numero de veces de enriquecimiento se selecciona de entre el grupo que consiste en mas de 10 veces, mas de 100 veces, mas de 1000 veces, mas de 10.000 veces, mas de 100.000 veces y mas de 1.000.000 veces. La base del enriquecimiento son los ARNm identificados expresados preferentemente en celulas fetales y protemas codificadas por los ARNm.

Una parte de los ARNm espedficos de celulas fetales identificadas codifican antigenos expuestos en la superficie y en una realizacion preferida, el ligando se dirige a un antigeno expuesto en la superficie celular codificado por un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en tomoregulina, e Dn 1, AHNAK, CD 105, SYT 9 , KMO, HMGA1, T de raton, ACVR2B, CD141, CD135, CD142/F3, CD146, CD33, CD68, CD144, CD62E, GAP/GJA5, ITGA5, KCNK3 / TASK-1, CNTFR, JAM-1, SDC4/Syndecan 4 , ACVR2B, ACVR2A, CD44v6 CD44v4/5, STX1A, TEK/Tie2, CD171, NCAM/CD56, ALPP, ALPPL2 y MMP23A/MMP23B.

El uso de ligandos dirigidos a antigenos expuestos en la superficie espedfica de celulas fetales permite el enriquecimiento de celulas fetales a partir de una muestra materna sin permeabilizar las celulas (segun sea necesario para antfgenos intracelulares o acidos nucleicos capturados por sondas de hibridacion).

Como quedara claro para el experto en la materia, pueden realizarse etapas adicionales de enriquecimiento dependientes de antigeno basadas en ligandos (o antigenos) conocidos de la tecnica anterior. Ejemplos de dichos antigenos conocidos de la tecnica anterior son: CD34, Tra, Oct1, Crypto1 y SSEA1.

Clasificacion basada en flujo

En una realizacion preferida, el enriquecimiento se realiza usando la clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS). Por lo tanto, el ligando esta marcado con fluorescencia lo que permite FACS. El FACS y los marcadores adecuados son bien conocidos por los expertos en la materia y los ejemplos se han dado anteriormente. Como alternativa al FACS, se puede usar la clasificacion de celulas de dispositivos microflddicos.

Inmobilizacion

En otra realizacion preferida, el enriquecimiento se realiza usando la inmovilizacion de los ligandos. Los ligandos pueden, por ejemplo, inmovilizarse en perlas tales como perlas magneticas, perlas de sefarosa, perlas de agarosa, etc. Cuando los ligandos y las celulas unidas a las mismas se inmovilizan, las celulas no unidas pueden lavarse de las perlas. Dicho procedimiento de lavado se puede realizar por lotes o en una columna. Despues del enriquecimiento (fraccionamiento), las celulas unidas se pueden eluir usando sal alta o baja, enlazadores escindibles, pH alto o bajo, agentes desnaturalizantes, etc. Mas preferentemente, las celulas unidas se eluyen usando una elucion competitiva con antfgenos solubles o ligandos secundarios que se unen a ligandos espedficos de celulas fetales, por ejemplo, anticuerpos dirigidos a la parte fija del ligando usado para la inmovilizacion.

Un procedimiento preferido de enriquecimiento es MACS (clasificacion de celulas inmunomagneticas), donde los ligandos se inmovilizan en perlas magneticas. Es decir, las celulas unidas a los ligandos se pueden separar de los no ligantes seleccionando las partfculas mediante magnetismo.

Seleccion negativa usando antfgenos

Los ligandos que se unen espedficamente a las celulas maternas tambien pueden usarse para el enriquecimiento. Por lo tanto, en una realizacion preferida, el procedimiento comprende ademas una etapa de poner en contacto la muestra con un ligando espedfico de celulas maternas dirigido a un antfgeno materno. Despues de poner en contacto la muestra con un ligando espedfico de celulas maternas, el enriquecimiento se puede realizar, por ejemplo, usando FACS, MACS, microfluidos o inmovilizacion como se describe anteriormente.

Preferentemente, el ligando se selecciona de entre el grupo que consiste en ligandos que se unen a antfgenos codificados por ARNm expresados preferentemente en celulas de sangre materna como se identifica por los presentes inventores.

Como sera claro para el experto en la materia, se pueden usar etapas adicionales de enriquecimiento dependientes del antfgeno (selecciones negativas) basadas en ligandos (o antfgenos) conocidos de la tecnica anterior. Por lo tanto, en una realizacion, se realiza una etapa adicional de enriquecimiento dependiente del antfgeno, donde el ligando se selecciona de entre el grupo que consiste en ligandos que se unen a antfgenos espedficos maternos conocidos de la tecnica anterior, tales como CD45, HLA-A, HLA-B o anticuerpos seleccionados de entre el grupo que consiste en HLe-1, M3 y L4.

Un marcador de tipo celular preferido para la seleccion negativa es CD45, tambien conocido como antfgeno comun de leucocitos. CD45 es una protema transmembrana expresada por todas las celulas hematopoyeticas diferenciadas excepto eritrocitos y celulas plasmaticas. La protema CD45 existe en diferentes formas, todas producidas a partir de un unico gen complejo que da origen a ocho ARNm maduros diferentes y da como resultado ocho productos proteicos diferentes. Se expresa en todos los leucocitos pero no en otras celulas, y por lo tanto funciona como un marcador panleucocutivo que incluye los diferentes y diversos tipos de leucocitos (o globulos blancos) como los neutrofilos, eosinofilos, basofilos, linfocitos (celulas B y T), monocitos y macrofagos.

Debido a la expresion de CD45 en una gran mayona de las celulas nucleadas presentes en la sangre materna, se prefiere una seleccion negativa usando el marcador CD45. Tras el agotamiento de las celulas positivas para CD45, se recogen las celulas negativas para CD45 de la muestra. Dicho agotamiento y recogida pueden realizarse por cualquier procedimiento adecuado conocido en la tecnica.

HLA

Los antfgenos de leucocitos humanos, parte del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) humano, son responsables de las protemas presentadoras de antfgenos de la superficie celular y muchos otros genes.

Hay dos clases de antfgenos de leucocitos humanos, antfgenos de clase I (A, B y C) y antfgenos de clase II (DR, DP y DQ) que tienen funciones diferentes. Ambas clases incluyen un alto numero de alelos variables.

Los genes HLA no expresados por celulas fetales pueden usarse para el agotamiento de las celulas maternas en la muestra.

Otros procedimientos de enriquecimiento

Tambien se pueden usar procedimientos de enriquecimiento adicionales que no usan ligandos espedficos de antfgeno.

Un procedimiento adicional preferido de enriquecimiento es la lisis de los eritrocitos, tales como la lisis mediada por NH4Cl, que permite la lisis selectiva de eritrocitos dejando intactas las celulas nucleadas. Este procedimiento es conocido por un experto en la materia. Para la lisis mediada por NH4Cl preferentemente se usa una concentracion de NH4Cl 0,1-0,2 mM, tal como NH4Cl 0,14-0,18 mM, mas preferentemente NH4Cl 0,15-0,17 mM.

Tambien los procedimientos de fijacion y lisis selectiva descritos en el primer aspecto pueden usarse para el enriquecimiento.

La muestra tambien puede someterse a una separacion inicial basada en el tamano o la densidad, tal como mediante centrifugacion con gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque. Esto da como resultado la produccion de una capa sobrenadante, que contiene plaquetas; una capa de celulas mononucleares; y un microgranulo aglutinado que contiene eritrocitos y granulocitos no nucleados. La capa mononuclear se separa de las otras capas para producir una muestra materna enriquecida en celulas fetales.

Tambien las propiedades ffsicas de las celulas, tales como, pero no exclusivamente, la carga, pueden utilizarse para el enriquecimiento.

Combinacion de ligandos y procedimientos de enriquecimiento

Como se entendera, los diversos ligandos y procedimientos de enriquecimiento pueden combinarse. Por lo tanto, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o mas ligandos espedficos de celulas fetales se pueden usar al mismo tiempo o en sucesion. Analogamente, se pueden usar los enriquecimientos iterados usando ligandos espedficos de celulas fetales y ligandos espedficos maternos.

La muestra

Es deseable obtener una muestra de sangre materna lo mas grande posible con el fin de aumentar el numero total de celulas fetales. Sin embargo, debido a problemas practicos, la muestra debe estar dentro de determinados lfmites. En consecuencia, el tamano de la muestra de sangre materna esta preferentemente en el intervalo de 0,5 a 50 ml, tal como en el intervalo de 1 a 40 ml, tal como de 5 a 35 ml o de 10 a 30 ml.

La muestra de sangre materna proporcionada se obtiene preferentemente de una mujer embarazada de entre 5 -24 o 6-20 semanas de gestacion, mas preferentemente entre 7-16, u 8-12 semanas de gestacion.

Dilucion-concentracion

Ademas, de acuerdo con la invencion, la muestra puede diluirse o concentrarse en cualquier momento durante el enriquecimiento del procedimiento o la identificacion de una celula fetal (para facilitar la identificacion de las celulas fetales y en relacion con la viabilidad de las diferentes etapas del procedimiento). La muestra puede diluirse al menos 1,5 veces, como dos veces, mas preferida, al menos tres veces, como cinco veces anadiendo tampones isotonicos, tales como soluciones salinas, soluciones salinas tamponadas con fosfato, PBS y/o medios de crecimiento adecuados, tales como medio basal, y medio de crecimiento de tejidos. Una etapa del procedimiento puede incluir la dilucion de una muestra mediante la adicion de diversos componentes asignados para la etapa del procedimiento espedfico. Para llevar a cabo el procedimiento puede ser ventajoso para la viabilidad de las diferentes etapas del procedimiento concentrar la muestra, por ejemplo, para reducir el volumen sin eliminar ninguna celula. El volumen de la muestra puede reducirse a menos del 80 %, tal como 70, o 60 o 50 % del volumen de la muestra original, o incluso preferible a menos del 40 %, tal como el 25 % del volumen de la muestra original. Una etapa de concentracion puede ser la centrifugacion. El procedimiento puede comprender de acuerdo con la invencion una o mas etapas de concentracion. La centrifugacion es un procedimiento preferido para concentrar las celulas. Para evitar danos en las celulas, se prefiere una centrifugacion suave, tal como 300 g durante 10 minutos.

Sedimentacion

Las celulas presentes en la muestra de sangre pueden concentrarse por sedimentacion en lugar de centrifugacion, donde la mayona de las celulas presentes en la muestra pueden sedimentar. La muestra de sangre puede diluirse antes de la sedimentacion en una solucion adecuada, como NaCl 0,15 M. La sedimentacion puede continuar hasta que se haya producido la sedimentacion total, tal como, durante al menos 5 horas, o preferentemente durante la noche. Preferentemente, la muestra se deja sedimentar a una temperatura inferior a la temperatura ambiente, tal como a una temperatura inferior a 15 °C, tal como inferior a 10 °C u 8 °C o 6 °C, preferentemente a una temperatura de 2-8 °C o alrededor de 4 °C.

Una poblacion menor de celulas con una densidad baja puede no sedimentar y puede aislarse mediante una fijacion previa suave como se describe a continuacion, tal como en paraformaldeddo al 0,5 % seguido de centrifugacion. Fijacion

En una realizacion preferida del cuarto aspecto de la divulgacion, las celulas de la muestra de sangre materna se fijan como se describe en el primer aspecto de la invencion.

Por lo tanto, en una realizacion preferida, los eritrocitos maternos se lisan selectivamente inmediatamente despues de la fijacion.

Deteccion y diagnostico

Preferentemente, el procedimiento de la invencion se usa para la deteccion y prediccion prenatal y/o diagnostico. Por lo tanto, una celula identificada puede estar sujeta a deteccion y prediccion y/o diagnostico o una muestra de sangre materna enriquecida para celulas fetales puede estar sujeta a deteccion y prediccion y/o diagnostico.

En una realizacion, las protemas fetales estan disponibles para la deteccion, por ejemplo, mediante inmunotransferencia, secuenciacion de protemas o espectrometna de masas.

En otra realizacion preferida, la deteccion y/o diagnostico comprenden una etapa para hacer que el ADN o ARN fetal este disponible para la deteccion.

Los procedimientos de deteccion preferidos son FISH (hibridacion in situ fluorescente), transferencia Northern, transferencia Southern, secuenciacion de ADN/ARN, analisis y amplificacion de micromatrices. Dichos procedimientos pueden usarse para detectar la presencia de secuencias espedficas que indican una determinada condicion, por ejemplo, enfermedad prenatal o predisposicion a una determinada enfermedad. Los procedimientos tambien se pueden usar para detectar una aneuploidfa cromosomica tal como la trisoirna 13, la trisoirna 18 o la trisoirna 21. Los procedimientos de deteccion tambien se pueden usar para determinar el genero del feto mediante la deteccion de secuencias espedficas de Y.

En una realizacion alternativa, el numero de celulas fetales en la muestra se compara con un numero convencional.

Un mayor numero de celulas fetales en la muestra puede indicar que el embarazo esta en riesgo. El numero de celulas fetales en la muestra (asf como en una muestra de control) puede estimarse usando, por ejemplo, FACS.

Identificacion de ligandos espedficos

Un quinto aspecto de la invencion es un procedimiento para identificar un ligando espedfico de celulas fetales que comprende las etapas:

a) Proporcionar una biblioteca de candidatos ligandos espedficos de celulas fetales

b) Proporcionar un conjunto de celulas maternas

c) Poner en contacto la biblioteca de la etapa a con las celulas maternas de la etapa b

d) Seleccionar los ligandos que no se unen a las celulas maternas para generar una biblioteca agotada para ligandos que se unen a celulas maternas.

En una realizacion preferida, el procedimiento comprende ademas las etapas de

e) Poner en contacto la biblioteca de la etapa a o la biblioteca de la etapa d con una celula fetal

f) Seleccionar los ligandos que se unen a la celula fetal para generar una biblioteca que esta enriquecida en ligandos que se unen a las celulas fetales, pero no a las celulas maternas

Debe quedar claro que una celula es suficiente para la seleccion de los ligandos de la etapa f, pero que obviamente se pueden usar mas celulas fetales.

Las etapas b-f pueden realizarse mediante las etapas de

g) Proporcionar una muestra de sangre materna

h) Poner en contacto la biblioteca con una muestra de sangre materna

i) Seleccionar los ligandos que se unen a las celulas fetales mediante la eliminacion de celulas fetales individuales, que se han identificado mediante la demostracion de FISH de un cromosoma Y, y recolectar los ligandos unicamente de estas celulas.

La muestra de sangre materna puede haber sido enriquecida para celulas fetales.

En una realizacion preferida, el procedimiento comprende ademas:

j) multiplicar/amplificar los ligandos seleccionados para preparar una biblioteca amplificada para selecciones adicionales contra celulas fetales y/o contra celulas maternas.

Como queda claro, se pueden realizar multiples rondas de seleccion y amplificacion para identificar los mejores ligandos.

La biblioteca de candidatos ligandos espedficos de celulas fetales puede ser una biblioteca de anticuerpos o peptidos presentados en fagos (presentacion de fagos), ARNm (presentacion de ribosomas o presentacion de ARNm) o en ADN (presentacion covalente o seleccion de plasmidos). La biblioteca tambien puede ser una biblioteca de oligonucleotidos de ADN o ARN para la identificacion de aptameros.

El termino "candidatos" se usa para implicar que los compuestos de la biblioteca no se unen necesariamente a las celulas fetales. Deben ser probados para determinar su union para la identificacion de ligandos espedficos de celulas fetales.

En una realizacion, la biblioteca de candidatos ligandos espedficos de celulas fetales es una biblioteca completamente aleatoria. En dicho caso, la biblioteca puede seleccionarse primero iterativamente contra las celulas fetales y amplificarse, antes de que se realice la seleccion del contador (seleccion negativa) contra las celulas maternas. En otra realizacion, la biblioteca de ligandos espedficos de celulas fetales candidatas se basa en ligandos conocidos de celulas fetales. Dicha biblioteca puede crearse, por ejemplo, mostrando un anticuerpo que se une a las celulas fetales en un fago y la mutagenesis del gen que codifica el anticuerpo para crear una biblioteca. En dicho caso, la mutagenesis puede mejorar la especificidad mientras conserva o incluso mejora la afinidad por las celulas fetales. En una realizacion, el ligando se une a un antfgeno codificado por un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en tomoregulina, EDN1, AHNAK, CD 105, SYT 9, KMO, HMGA1, raton T, ACVR2B, CD141, CD135, CD142/F3, CD146 , CD33, CD68, CD144, CD62E, GAP/GJA5, ITGA5, KCNK3/TASK-1, CNTFR, JAM-1, SDC4/Syndecan 4, ACVR2B, ACVR2A, CD44v6 CD44v4/5, STX1A, TEK/Tie2, DC NCAM/CD56, ALPP, ALPPL2 y MMP23A/MMP23B. Por lo tanto, la afinidad y/o especificidad del ligando se optimizan usando el procedimiento descrito anteriormente.

Ligados especificos de celulas fetales y sondas de hibridacion

Un sexto aspecto de la invencion es

i. un ligando que se une a un antigeno codificado por un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en TMEFF2, ABHD2, ACVR2B, ADAM11, AHNAK, AK000420, ALS2CL, BC089454, BC111482,CB123670, CCNA2, CD7, CPS1, CRYL1, D4ST1, DKFZp434F142, EDN1, EEF1A1, ENST00000356196, FLJ35740, FYN, GCC2, GSK3A, HIST1H2AJ, HLA-C,HMGA1, HMGN2, ITGA7, KCNK4, KMO, KY, LOC389286, MAD2L1, MAPK3, MYL6, NBR2, NTRK1, PF4, PGK1, PPIA, QPRT, RGPD2, RP11-78J21.1, RPL23, RPL23A, RPL26, RPL39, RPS27, SLAMF1, SYT9, T (BRACHYURY), THC2265980, THC2274391, TP73, TPM3, UBL4A, WRN, ZFYVE9, ZNF283, ZNF539, ZNF614, CD141, CD135, CD142/F3, CD146, CD33, CD68, CD144, CD62E, GAP/GJA5, ITGA5, KCNK3/TASK-1, CNTFR, JAM-1, SDC4/Syndecan 4, ACVR2B, ACVR2A, CD44v6+CD44v4/5, STX1A, TEK/Tie2, CD171, NCAM/CD56, ALPP, ALPPL2 y MMP23A/MMP23B

ii. o una sonda de hibridacion dirigida a un acido nucleico que comprende al menos 10 pb de un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en TMEFF2, ABHD2, ACVR2B, ADAM11, AHNAK, AK000420, ALS2CL, BC089454, BC111482,CB123670, CCNA2, CD7, CPS1, CRYL1, D4ST1, DKFZp434F142, EDN1, EEF1A1, ENST00000356196, FLJ35740, FYN, GCC2, GSK3A, HIST1H2AJ, HLA-C, HMGA1, HMGN2, ITGA7, KCNK4, KMO, KY, LOC389286, MAD2L1, MAPK3, MYL6, NBR2, NTRK1, PF4, PGK1, PPIA, QPRT, RGPD2, RP11-78J21.1, RPL23, RPL23A, RPL26, RPL39, RPS27, SLAMF1, SYT9, T (BRACHYURY), THC2265980, THC2274391, TP73, TPM3, UBL4A, WRN, ZFYVE9, ZNF283, ZNF539, ZNF614, CD141, CD135, CD142/F3, CD146, CD33, CD68, CD144, CD62E, GAP/GJA5, ITGA5, KCNK3/TASK-1, CNTFR, JAM-1, SDC4/Syndecan 4, ACVR2B, ACVR2A, CD44v6+CD44v4/5, STX1A, TEK/Tie2, CD171, NCAM/CD56, ALPP, ALPPL2 y MMP23A/MMP23B.

Mas preferentemente, el ligando es un ligando que se une a un antigeno codificado por un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en tomoregulina, EDN1, AHNAK, CD 105, SYT 9, KMO, HMGA1, raton T, ACVR2B, CD141, CD135, CD142/F3, CD146 , CD33, CD68, CD144, CD62E, GAP/GJA5, ITGA5, KCNK3/TASK-1, CNTFR, JAM-1, SDC4/Syndecan 4, ACVR2B, ACVR2A, CD44v6 CD44v4/5, STX1A, TEK/Tie2, CD171, NCAM/CD56, ALPP, ALPPL2 y MMP23A/MMP23B, es decir, antfgenos expuestos en la superficie. Preferentemente, la kd del ligando para el antfgeno elegido es inferior a 10'8M, 10'9 y 10'10 M. La kd del ligando para cualquier antfgeno presente en las celulas de sangre materna es preferentemente al menos 100 veces mas alta e incluso mas preferentemente mas de 1000 o 10.000 veces mas.

En una realizacion, el ligando es caractenstico porque permite el 90 % de seleccion correcta de celulas en una muestra de prueba que comprende 99,9 % de celulas maternas y 0,1 % de celulas fetales. Es decir, cuando se hace referencia a una identificacion correcta del 90 %, lo que se entiende en este documento es que cuando se realiza la seleccion con la muestra de prueba y con el ligando, se recolectaran 90 celulas fetales por cada 10 celulas maternas y, analogamente, para una mejor/peor correccion. Un procedimiento de seleccion preferido es MACS. Mas preferido es un ligando que permita una seleccion correcta del 95 %, una seleccion correcta del 98 % o incluso una seleccion de celulas correcta del 99 % aun mas preferida. Dado que una muestra de sangre materna tiene una muy baja abundancia de celulas fetales, es aun mas preferible que el ligando permita una seleccion de celulas correcta del 99,9 %, 99,99 % o 99,999 % de una muestra de prueba como se describio anteriormente.

Preferentemente, los ligandos del sexto aspecto son aptameros, peptidos o anticuerpos como se describe en el cuarto y quinto aspecto. Los mas preferidos son los anticuerpos.

Los ligandos se identifican preferentemente usando el procedimiento del quinto aspecto tal como para tener una especificidad mejorada.

Un septimo aspecto de la invencion es el uso de ligandos o sondas de hibridacion del sexto aspecto para enriquecer una muestra de sangre materna para celulas fetales o para identificar celulas fetales en una muestra de sangre materna. Preferentemente, el uso de los ligandos o las sondas de hibridacion es como se describe en el cuarto aspecto de la invencion.

Un octavo aspecto de la divulgacion es un kit que comprende un ligando o una sonda de hibridacion como se describe en el sexto aspecto de la divulgacion y las instrucciones de uso.

Preferentemente, el kit comprende un primer ligando para enriquecimiento y un segundo ligando y /o una sonda de hibridacion para identificacion.

En una realizacion preferida, el kit tambien comprende un tampon de fijacion y un tampon de lisis como se describe en el primer aspecto de la divulgacion.

EJEMPLOS

El ejemplo 1 esta escrito en tiempo presente porque describe las etapas metodicas que deben realizarse al enriquecer y/o identificar celulas fetales a partir de una muestra de sangre materna usando los procedimientos de la invencion. La smtesis de ADNc y las micromatrices tfpicamente no son necesarias para el enriquecimiento y/o la identificacion, pero se pueden usar en algunas situaciones. Debe quedar claro que las etapas descritas en el ejemplo 1 se han llevado a cabo realmente para la identificacion de los ARNm expresados preferentemente en celulas fetales a partir de una muestra de sangre materna.

Ejemplo 1

Identificacion de los ARNm expresados preferentemente en celulas fetales de una muestra de sangre materna. Fijacion, lisis y permeabilizacion de la sangre materna.

Las muestras de sangre periferica de 10 a 30 ml se obtienen de mujeres embarazadas de 11 a 14 semanas de edad gestacional. Las muestras de sangre se extraen antes de un procedimiento invasivo y despues del consentimiento informado. Todas las muestras de sangre se recogen en tubos heparinizados y se procesan inmediatamente despues de recolectarse.

Ademas de la sangre de heparina, se extraen 5 ml de sangre en tubos de EDTA. Esta sangre se usa para el analisis de genero fetal. El genero del feto se establece mediante el analisis del ADN fetal libre.

Para cada muestra, se suministran alfcuotas de 3 ml de sangre completa en tubos de centrifugacion pre-recubiertos de 50 ml (3 a 10 tubos de 50 ml por muestra) con pipetas recubiertas previamente (el tampon de recubrimiento previo es de ASB al 2 % en PBS sin Ca2+, Mg2+). Se anaden dos ml de formaldelddo al 10 % en PBS a cada tubo usando pipetas recubiertas previamente. Despues de mezclar cuidadosamente, las celulas sangumeas se fijan durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Despues de la fijacion, se anaden 30 ml de Triton X-100 al 0,12 % en PBS (sin Ca2+, Mg2+) a cada tubo. Los tubos se invierten 3 veces y los globulos rojos se lisan durante 45 minutos a temperatura ambiente. Despues de la lisis, se anaden 15 ml de ASB al 2 % en fno (4 °C) en PBS (sin Ca2+, Mg2+) a cada tubo. Despues de mezclar invirtiendo los tubos 2 veces, las celulas no lisadas se sedimentan mediante centrifugacion a 500 g durante 15 minutos a 4 °C. Despues de eliminar el sobrenadante, las celulas se vuelven a suspender en 10 ml de PBS fno a 4 °C sin Ca2+, Mg2+ y las muestras se almacenan a 4 °C durante la noche.

Solo se analizan mas las muestras de sangre de mujeres embarazadas con un feto masculino. Estas muestras se permeabilizan anadiendo10 ml de metanol fno (- 20 °C) al almacen de suspension celular de 10 ml durante la noche, y las celulas se permeabilizan durante 10 minutos a 4 °C. Despues de la centrifugacion a 500 g durante 10 minutos, los sedimentos celulares se agrupan en un tubo con pipetas recubiertas previamente. Los tubos vados se enjuagan con 1 ml de PBS, ASB al 0,5 %, EDTA 2 mM. Las celulas agrupadas se transfieren luego a un tubo de 15 ml y se centrifugan a 500 g durante 10 minutos y se vuelven a suspender en lo que corresponde a 40 ul de PBS que contiene ASB al 0,5 % y EDTA 2 mM por 1 ml de sangre completa, y las celulas se manchan en portaobjetos recubiertos con polilisina (4 pl cada uno). Se hacen un total de 60 portaobjetos de cada muestra de sangre masculina. Despues de secar al aire los portaobjetos se sellan individualmente en bolsas de plastico hermeticas y se almacenan a -20 °C hasta un analisis adicional.

Identificacion de celulas fetales masculinas mediante FISH de color inverso y escaneo automatizado. Los portaobjetos se recuperan del congelador y las bolsas de plastico hermeticas se retiran. Antes de la hibridacion, los portaobjetos se enjuagan en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y, durante 5 minutos antes, se deshidratan 3 minutos cada uno en etanol al 60 %, 80 % y 99,9 % y se secan al aire.

Para la primera hibridacion se usan sondas de repeticion espedficas de cromosoma, DXZ1 marcadas con espectro verde y DYZ1 marcadas con espectro naranja (Abbott Molecular). La mezcla de hibridacion que contiene ambas sondas se prepara mezclando 1 parte de la sonda X, 1 parte de la sonda Y, 1 parte de agua destilada y 7 partes de tampon de hibridacion (Vysis). Para FISH de portaobjetos completo, se anaden 28 j l de la mezcla de hibridacion y se cubren con un cubreobjetos de 22 x 50 mm. Los cubreobjetos se sellan con cemento de caucho y los ADN se desnaturalizan en una placa caliente a 83,5 °C durante 7 minutos y se hibridan durante la noche en una atmosfera humidificada a 42 °C.

Al dfa siguiente, los portaobjetos hibridados se lavan durante 2 minutos en 0,4 x SSC/Tween 20 al 0,3 % a 73 °C y durante 1 minuto en 2 x SSC/Tween 20 al 0,1 % a temperatura ambiente. Luego se montan los portaobjetos en Vectashield con 1,5 jg/ml de DAPI como tincion contraria.

Las celulas que contienen una senal roja ubicada en un nucleo tenido con DAPI se identifican mediante escaneo automatico usando dos tipos diferentes de escaneres. El sistema de escaneo de portaobjetos MDS (version 5.8.0) desarrollado originalmente por Applied Imaging, y el sistema de escaneo MetaCyte desarrollado por MetaSystems. Con el sistema de escaneo MDS, los portaobjetos se escanean con un aumento de 20 usando la funcion de escaneo 5. Con los portaobjetos MetaCyte se escanean con un aumento de 10 usando un clasificador optimizado internamente para detectar senales de FISH de espectro naranja verdaderas. Despues del escaneo, las celulas identificadas por el escaner se inspeccionan visualmente mediante reubicacion automatica. Las celulas que tienen una senal roja pero dos senales X verdes se descartan, mientras que las celulas que tienen una senal roja y una senal X verde o una senal X verde dividida se clasifican como celulas fetales masculinas candidatas.

El verdadero origen fetal de las celulas fetales candidatas se analiza mediante la re-hibridacion de celulas candidatas con las mismas sondas X e Y en colores inversos. En primer lugar, los cubreobjetos se eliminan incubando los portaobjetos en 4xSSC/Tween 20 0,1 % durante 10 minutos. Los portaobjetos se lavan luego en 2xSSC durante 5 minutos, se deshidratan con etanol al 60 %, 80 % y 99,9 % y se secan al aire. La mezcla de hibridacion que contiene 1 parte de las sondas de repeticion espedficas del cromosoma, DXZ1 marcado con espectro rojo, 1 parte de la sonda de repeticion espedfica del cromosoma DYZ1 marcado con espectro verde, 1 parte de agua destilada y 7 partes de tampon de hibridacion se usa para la re-hibridacion. Para FISH de portaobjetos completo, se anaden 28 j l de la mezcla de hibridacion y se cubren con un cubreobjetos de 22 x 50 mm. Para el FISH selectivo, se aplican 2,5 j l de mezcla de hibridacion en las posiciones de los portaobjetos donde se encontraron las celulas fetales candidatas y la mezcla se extiende cubriendola con un cubreobjetos circular de 10 mm. Los cubreobjetos se sellan luego con cemento de caucho y los ADN se desnaturalizan en una placa caliente a 83,5 °C durante 7 minutos y se hibridan durante la noche en una atmosfera humidificada a 42 °C.

Despues de la re-hibridacion, los portaobjetos se lavan durante 2 minutos en 0,4 x SSC/Tween 20 al 0,3 % a 73 °C y durante 1 minuto en 2 x SSC/Tween 20 al 0,1 % a temperatura ambiente. Los portaobjetos se montan en Vectashield que contiene DAPI.

Los portaobjetos re-hibridados se colocan en el microscopio de escaneo y las celulas fetales candidatas se reubican y las senales de FISH se analizan visualmente. Las celulas fetales candidatas que se vuelven a hibridar cuando la senal roja permanece roja y la senal verde cambia a rojo se clasifican como celulas fetales falsas (<5 %), mientras que las celulas fetales candidatas que se vuelven a hibridar cuando la senal roja cambia a verde y la senal verde a rojo se clasifican como celulas fetales verdaderas (> 95 %).

PALM

Cuando se han detectado 23 celulas fetales mediante re-hibridacion, las posiciones exactas (coordenadas) de las celulas fetales individuales en los portaobjetos del microscopio se determinan mediante el uso de un Englandfinder, por lo que las celulas fetales se pueden encontrar en otros microscopios.

Las celulas fetales se extraen de los portaobjetos del microscopio usando la tecnologfa de microdiseccion laser y catapulta a presion (LMPC) en un sistema de microscopio PALm MicroBeam de Carl Zeiss. Los portaobjetos de microscopio que contienen celulas fetales se transportan a Carl Zeiss MicroImaging GmbH, (ubicado en Munich, Alemania), donde las celulas fetales se vuelven a encontrar usando sus coordenadas espedficas en el Englanfinder. Los cubreobjetos se retiran cuidadosamente despues de remojar los portaobjetos en PBS durante 10-15 minutos. Los portaobjetos se enjuagan luego durante 10 minutos en PBS antes de deshidratarse cada 3 minutos en etanol al 60 %, 80 % y 99,9 % y se secan al aire. A continuacion, las celulas fetales se extraen del portaobjetos en una tapa adhesiva de un tubo del tamano de RCP mediante catapultacion con laser usando un microscopio PALM MicroBeam. Las 23 celulas fetales se recolectan en la misma tapa. En otra tapa, se recolectan celulas de control maternas: de cada portaobjetos que contiene una celula fetal, 100 celulas maternas circundantes se recolectan en la tapa de control, lo que da un numero total de 2300 celulas de control maternas. Los dos tubos que contienen celulas fetales y celulas de control en sus tapas, respectivamente, se env^an a Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemania, para un analisis detallado.

El ARN de la muestra fetal y la muestra de control es amplificado por Miltenyi Biotec por su servicio SuperAmp como se describe en su pagina de inicio. El ADNc amplificado se usa para hacer dos tipos diferentes de micromatrices: micromatriz de genoma completo de Agilent y micromatriz de celulas madre PIQOR™, como se describe en la pagina principal de Miltenyi Biotec.

De los resultados de la micromatriz, primero se seleccionan 61 genes (enumerados en la tabla 1) como posibles candidatos para marcadores de celulas fetales. Se seleccionan en funcion de tres criterios diferentes: se seleccionan 41 genes porque tienen 2 o mas sondas diferentes en la matriz que muestran senales fuertes en la matriz del genoma completo de Agilent fetal y senales no o muy debiles en la matriz del genoma completo de Agilent materno. Se seleccionan 10 genes debido a senales muy fuertes en la matriz del genoma completo de Agilent fetal.

Los ultimos 10 genes se seleccionan porque, tanto en las matrices del genoma completo de Agilent como en la matriz de celulas madre PIQOR™, muestran senales en la matriz fetal (Agilent)/canal (micromatriz de celulas madre PIQOR™), pero no en la matriz/canal materno. Los 61 genes se estudian exhaustivamente en la bibliograffa y, sobre la base de esto, se seleccionan 9 genes como candidatos a marcadores de celulas fetales expuestas en la superficie celular: EDN1, AHNAK, tomoregulina, CD 105, SYT 9, KMO, HMGA1, raton T, ACVR2B.

Tabla 1:

Ejemplo 2

Identificacion de celulas fetales a partir de una muestra de sangre materna usando ligandos.

Agotamiento de celulas maternas CD45 y GPA positivas.

Las muestras de sangre materna usadas para la identificacion de celulas fetales usando ligandos espedficos de celulas fetales se procesan como se describe en el ejemplo 1. Despues de la centrifugacion final a 500 g durante 10 minutos, se descarta el sobrenadante y el sedimento celular se vuelve a suspender en 80 pl por 107 celulas de PBS fno con ASB al 0,5 % y EDTA 2 mM usando una micro punta recubierta previamente. Se anadieron 20 pl de microperlas CD45 y 40 pl de microperlas de GPA. Despues de mezclar usando una micro punta pre-recubierta, las celulas se incuban durante 15 minutos a 4 °C. Las celulas se lavan anadiendo 5 ml de PBS fno con ASB al 0,5 % y EDTA 2 mM y se centrifugan a 500 g durante 10 minutos. El sobrenadante se elimina y el sedimento celular se vuelve a suspender en 2 ml de PBS con ASB al 0,5 % y EDTA 2 mM usando una punta de pipeta recubierta previamente. La suspension de celulas se carga en una columna LD prelavada y el flujo se recoge en un tubo recien recubierto. Una vez que la suspension celular ha atravesado, la columna se lava 3 veces con 1 ml de PBS fno con ASBal 0,5 % y EDTA 2 mM. El tubo que contiene el flujo se centrifuga luego a 500 g durante 10 minutos. El sobrenadante se desecha y el sedimento celular se vuelve a suspender en 400-600 pl (si se trata de 24 ml de sangre) PBS con ASB al 0,5 % y EDTA 2 mM usando puntas de pipeta recubiertas previamente y las celulas se colocan en portaobjetos recubiertos con polilisina y los portaobjetos se secan al aire durante la noche. Una muestra de sangre de 24 ml normalmente proporciona de 10 a 15 portaobjetos con un area de frotis de celulas de 15 x 15 mm por portaobjeto.

Identificacion de celulas fetales.

Las celulas fetales se identifican usando un anticuerpo contra el producto de uno de los genes expresados preferentemente en celulas fetales como, por ejemplo, la sinaptotagmina IX, que es el producto de SYT9.

Despues del secado al aire, los portaobjetos se rehidratan en 4xSSC durante 5 minutos, luego se incuban previamente durante 30 minutos a temperatura ambiente con 100 pl de tampon de bloqueo que consiste en 4xSSC que contiene ASB al 1 % y reactivo de bloqueo al 0,5 % (Roche). A continuacion, los portaobjetos se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente con 100 pl de solucion de anticuerpo primario biotinilado diluida en tampon de bloqueo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Despues de la incubacion del anticuerpo, los portaobjetos se lavan tres veces durante 5 minutos en 4xSSC. Para detectar anticuerpos unidos a celulas fetales, los portaobjetos se incuban con 100 pl de estreptavidina conjugada con FITC diluida 1:100 en tampon de bloqueo durante 30 minutos a TA. Despues de lavar dos veces durante 5 minutos cada uno en 4xSSC y una vez durante 5 minutos en 2xSSC, los portaobjetos se montaron en Vectashield que contema 1,5 pg de 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para contrarrestar el nucleo.

Las celulas fetales tenidas con anticuerpos se identifican mediante escaneo automatico usando el programa Metafer desarrollado por Metasystems. Los portaobjetos se escanean con un aumento de 10 usando un clasificador desarrollado en la empresa optimizado para detectar celulas tenidas con sinaptotagmina. El verdadero origen fetal de las celulas tenidas con anticuerpos se puede confirmar con XY FISH como se describe en el ejemplo 1.

Ejemplo 3

Enriquecimiento de celulas fetales a partir de una muestra de sangre materna

Marcado de anticuerpos.

Las muestras de sangre materna usadas para el enriquecimiento de celulas fetales usando un ligando espedfico de celulas fetales se procesan como se describe en el ejemplo 1. Despues de la centrifugacion final a 500 g durante 10 minutos, el sobrenadante se descarta y el sedimento celular se vuelve a suspender en 95 j l de PBS fno con ABS al 0,5 % y EDTA 2 mM por 107celulas. Se anaden 5 j l por 107celulas de anticuerpo TMEFF biotinilado usando puntas de pipetas recubiertas previamente. Despues de mezclar, las celulas se incuban durante 30 a 60 minutos a 4 °C o a temperatura ambiente. Despues de la incubacion, las celulas se lavan anadiendo 5 ml de PBS fno con ASB al 0,5 % y EDTA 2 mM. Despues de la centrifugacion durante 10 minutos a 500 g, el sobrenadante se desecha y el sedimento celular se vuelve a suspender en 80 j l de PBS fno con ABS al 0,5 % y EDTA 2 mM por 107celulas. Se anaden 20 j l de microperlas antibiotina por 107celulas usando una punta de pipeta recubierta previamente. Despues de mezclar, las celulas se incuban durante 30 minutos a 40 °C. Las celulas se lavan de nuevo anadiendo 5 ml de PBS fno con ASB al 0,5 % y EDTA 2 mM. Despues de la centrifugacion durante 10 minutos a 500 g, el sobrenadante se desecha y el sedimento celular se vuelve a suspender en 5 ml de PBS fno con ASB al 0,5 % y EDTA 2 mM.

Seleccion positiva usando MACS

Una columna LD prelavada y una columna MS prelavada se colocan en los imanes, apilados. La suspension de celulas marcadas se aplica a la columna LD superior. Cuando las celulas han atravesado la columna LD, se lavan dos veces con 2 ml y PBS fno con ASB al 0,5 % y EDTA 2 mM. La columna LD se retira del iman y se coloca en un tubo de centrifugacion de 15 ml recien recubierto. Las celulas se eluyen aplicando 2 veces 5 ml de PBS fno con ASB al 0,5 % y EDTA 2 mM. Los primeros 5 ml de tampon atraviesan la columna sin aplicar el embolo. Los segundos 5 ml de tampon atraviesan la columna aplicando el embolo. La columna MS se retira luego del iman y se coloca en el tubo de recogida. Las celulas se eluyen de la misma manera que para la columna LD usando 2 veces 1 ml de tampon fno en lugar de 2 x 5 ml. El tubo de recogida se centrifuga durante 10 minutos a 500 g. El sobrenadante se desecha y el sedimento celular se vuelve a suspender en PBS fno con ASB al 0,5 % y EDTA 2 mM. La suspension celular se coloca luego en un portaobjetos recubierto con polilisina, y el portaobjetos se seca al aire antes de un analisis adicional.

Deteccion de celulas fetales masculinas

Las celulas fetales masculinas aisladas usando el anticuerpo TMEFF se identifican mediante FISH XY seguido de escaneo automatico y validacion manual como se describe en el ejemplo 1. El origen fetal de las celulas candidatas fetales se confirma mediante FISH de color inverso como se describe en el ejemplo 1.

Ejemplo 4

Analisis cromosomica de celulas fetales de sangre materna

El analisis para el smdrome de Down en celulas fetales de sangre materna se realiza mediante FISH usando el LSI 21 de Abbott Molecular. Antes de FISH, el cubreobjetos se lava con una incubacion de 10 minutos en 2xSSC. El portaobjetos se enjuaga luego en PBS y se deshidrata en concentraciones crecientes de etanol. Despues del secado al aire, se aplican 10 j l de la mezcla de la sonda en la posicion del portaobjetos donde se ubican las celulas fetales y la mezcla se extiende cubriendo el area con un cubreobjetos de 22 x 22 mm. A continuacion, el cubreobjetos se sella con cemento de caucho y los ADN se desnaturalizan en una placa caliente durante 7 minutos a 83,5 °C, y se hibridan durante la noche en una atmosfera humidificada a 37 °C. Al dfa siguiente, los portaobjetos hibridados se lavan a 73 °C durante 2 minutos en 0,4 x SSC con Tween 20 al 0,3 %, seguido de 1 minuto en 2 x SSC con Tween 20 al 0,1 % a temperatura ambiente. Los portaobjetos se montan en Vectashield que contiene 1,5 jg/ml de DAPI como contratincion. Los numeros de las senales de FISH del cromosoma 21 presentes en las celulas fetales se cuentan en el microscopio reubicandose en las celulas espedficas usando el archivo de escaneo original.

Ejemplo 5

Identificacion de los ARNm expresados preferentemente en celulas fetales de una muestra de sangre materna, enriquecida con la seleccion positiva para CD105.

Las muestras de sangre periferica de mujeres embarazadas se fijan, los globulos rojos se lisan y los globulos blancos se permeabilizan como se describe en el ejemplo 1.

A 500 j l de suspension celular se anadieron130 j l de microperlas CD105 (Miltenyi) y la suspension celular se incubo durante 60 minutos a 4 °C. Las celulas se lavaron luego anadiendo 6 ml de tampon MACS fno seguido de una centrifugacion durante 10 minutos a 500 g. El sobrenadante se elimino y las celulas se volvieron a suspender en 2 ml de tampon MACS fno.

La suspension celular marcada con CD105 se aplico a una columna MS prelavada (Miltenyi) ya situada en el iman y se apilo encima de una columna MS prelavada (Miltenyi). Cuando las celulas atravesaron la columna LD, se lavaron dos veces con 2 ml de tampon MACS fno. La columna MS se lavo con 1 ml de tampon MACS fno. Luego se retiro luego la columna LD del iman, se coloco en un tubo de 15 ml recubierto previamente, y las celulas se eluyeron aplicando 2 veces 5 ml de tampon MACS fno. Los primeros 5 ml de tampon atravesaron la columna sin aplicar un embolo. Los segundos 5 ml de tampon se forzaron a traves de la columna aplicando un embolo. La columna MS se retiro entonces del iman y se coloco en el tubo de recogida. Las celulas se eluyeron de la misma manera que para la columna LD usando 2 veces 1 ml de tampon MACS fno en lugar de 2 veces 5 ml de tampon. El tubo de recogida se centrifugo a 500 g durante 10 minutos. El sobrenadante se descarto y el sedimento celular se volvio a suspender en tampon MACS fno. La suspension celular se coloco luego sobre portaobjetos recubiertos con poli-lisina, y los portaobjetos se secaron al aire (durante la noche) antes de un analisis adicional.

Las celulas fetales masculinas se identificaron mediante FISH espedfico para los cromosomas X e Y escaneo automatico. Antes de la hibridacion, los portaobjetos se enjuagaron en PBS durante 5 minutos y se deshidrataron durante 3 minutos cada uno en etanol al 60 %, 80 % y 99,9 %. Para este analisis, se uso el ADN satelite CEP X alfa de la sonda de repeticion DXZ1 espedfico para el cromosoma marcado con el espectro verde y el satelite III CEP Y de la sonda DYZ1 marcado con el espectro naranja (Abbott Molecular). Las mezclas de hibridacion que conteman ambas sondas se prepararon mezclando 1 parte de la sonda X, 1 parte de la sonda Y, 1 parte de agua destilada y 7 partes de tampon de hibridacion. Se anadieron quince pl de mezcla de hibridacion y se cubrieron con un cubreobjetos de 24 x 24 mm. Los cubreobjetos se sellaron con cemento de caucho y los ADN se desnaturalizaron en una placa caliente a 83,5 °C durante 7 minutos y se hibrido durante la noche en una atmosfera humidificada a 42 °C. Los portaobjetos hibridados se lavaron durante 2 minutos a 73 °C en 0,4 x SSC con Tween 20 al 0,3 % y durante 1 minuto a temperatura ambiente en 2xSSC con Tween 20 al 0,1 %. Los portaobjetos se montaron luego en Vectashield con DAPI.

Las celulas que conteman una senal de FISH roja localizada en un nucleo tenido con DAPI se identificaron mediante escaneo automatico usando dos tipos diferentes de escaneres. El sistema de escaneo de portaobjetos MDS (version 5.8.0) desarrollado originalmente por Applied Imaging, y el sistema de escaneo MetaCyte desarrollado por MetaSystems. Con el sistema de escaneo MDS, los portaobjetos se escanearon con un aumento de 20 usando la funcion de escaneo 5. Con MetaCyte, los portaobjetos se escanearon con un aumento de 10 usando un clasificador desarrollado y optimizado internamente para la deteccion de senales de FISH de verdadero espectro naranja. Despues del escaneo, las celulas identificadas por el escaner se inspeccionaron visualmente mediante reubicacion automatica. Las celulas que teman una senal X verde y una senal Y naranja significativamente mayor que la senal X se clasificaron como celulas fetales masculinas.

Se afslan dos veces 98 celulas fetales CD105 positivas masculinas identificadas por un FISH XY y dos veces 980 celulas maternas circundantes mediante microdiseccion laser y catapulta a presion como se describe en el ejemplo 1. El ARN de las dos muestras fetales y las dos muestras de control se amplifican por Miltenyi Biotec por su Servicio SuperAmp, y los ADNc amplificados se usan para hacer dos micromatrices de celulas madre PIQOR™ (replica biologica), como se describe en el ejemplo 1.

De los resultados de la micromatriz PIQOR, se seleccionan 24 genes adicionales (tabla 2) sobre la base de 3 criterios diferentes. Primero, el gen debe mostrar una relacion de senal fetal/materna alta o relativamente alta en ambas matrices PIQOR fabricadas de celulas fetales positivas para CD105 que se hibridaron una vez (la replica biologica). Ademas, el gen debe mostrar una relacion de senal fetal/materna alta o relativamente alta en al menos uno de las dos matrices PIQOR fabricadas de las 23 celulas fetales no enriquecidas que se hibridan dos veces (la replica tecnica). Finalmente, el gen debe mostrar una expresion muy baja o nula en sangre completa.

Tabla 2

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de deteccion de una celula fetal que comprende las etapas de

a. Proporcionar una muestra de sangre materna o una fraccion de la misma

b. Fijar las celulas

c. Lisar selectivamente los eritrocitos

d. Poner en contacto las celulas fijadas resultantes de la etapa c con

i. una sonda de hibridacion dirigida a un acido nucleico que comprende al menos 10 pb de un gen CD146 expresado diferencialmente en celulas fetales de una muestra de sangre materna, o

ii. un ligando dirigido a un antigeno codificado por un gen CD146 expresado diferencialmente en celulas fetales de una muestra de sangre materna.

2. El procedimiento de la reivindicacion 1, que comprende ademas una etapa de identificacion de celulas fetales de la muestra o una etapa de enriquecimiento de celulas fetales de la muestra.

3. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, donde la identificacion comprende detectar la presencia del ligando o la sonda de hibridacion en o sobre las celulas fetales.

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, donde el enriquecimiento comprende poner en contacto la muestra de sangre materna con un ligando dirigido a un antfgeno expuesto en la superficie celular codificado por un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en CD146, tomoregulina, EDN1, AHNAK, , CD 105, SYT 9, KMO, HMGA1, raton T, ACVR2B, CD141, CD135, CD142/F3, CD33, CD68, CD144, CD62E, GAP/GJA5, ITGA5, KCNK3/TASK-1, CNTFR, JAM-1, SDC4/Syndecan 4, ACVR2B, ACVR2A, CD44v6+CD44v4/5, STX1A, TEK/Tie2, CD171, NCAM/CD56, ALPP, ALPPL2 y MMP23A/MMP23B.