KR102129380B1 - 단백질표지자 grp78을 이용한 고효율 줄기세포의 선별 방법 - Google Patents

단백질표지자 grp78을 이용한 고효율 줄기세포의 선별 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질표지자 GRP78을 이용한 고효율 줄기세포의 선별 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 GRP78의 발현이 감소된 노화된 줄기세포를 제거하고 고효율의 줄기세포만을 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 단백질표지자 GRP78를 이용하면 노화된 줄기세포를 제거하여 고효율의 줄기세포만을 분리하는 것이 가능하다. 따라서, 줄기세포 치료제의 품질관리 및 안정성, 유효성의 정도를 평가하는 효과적인 지표 물질로 활용될 수 있으며, 치료 효능이 우수한 줄기세포 치료제 제조에 유용하다.

Description

단백질표지자 GRP78을 이용한 고효율 줄기세포의 선별 방법 {Method of Screening Highly Efficient Stem Cell Using GRP78 Protein Biomarker}
본 발명은 단백질표지자 GRP78을 이용한 고효율 줄기세포의 선별 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 GRP78의 발현이 감소된 노화된 줄기세포를 제거하고 고효율의 줄기세포만을 분리하는 방법에 관한 것이다.
최근 배아줄기세포, 성체줄기세포 등의 줄기세포를 다양한 세포로 분화시킴으로써, 세포치료법(cell therapy)으로서의 활용 가능성에 관한 연구가 다양하게 진행되고 있다. 다분화능이 있는 배아줄기세포는 다양한 세포로 분화됨으로써 세포치료제로 주목되었지만 배아줄기세포를 활용함에 있어 윤리적인 문제점 때문에 실질적으로 세포 치료로 사용하기에 어려움을 가지고 있다. 이러한 윤리적인 문제점을 회피하기 위하여 성체줄기세포를 이용한 연구가 활발히 진행되고 있다 (Trends in Neurosciences 23:450, 2000).
성체줄기세포는 타인에게 이식할 때 감염의 위험이나 분화능력이 상대적으로 떨어지는 단점이 있지만, 세포 수를 많이 얻을 수는 있으며, 의학적으로 적용하기에 대단히 안전하다는 특징이 있다. 구체적으로, 장기재생을 위해 몸 안에 이식하여도 암이 발생하지 않으며, 성인의 몸속에 있었기 때문에 면역거부반응이 발생하지 않아 자기 자신의 세포를 사용하는 자가 이식(autologous transplantation)이 가능하다. 또한, 주변조직의 특성에 자신을 맞추어 분화하는 조직 특이적 분화능력(site-specific differentiation)이 있고, 미분화 상태에서 주입하여도 암을 유발하지 않기 때문에 이식된 이후 당장 필요한 세포를 만들어내는 것 이외에도 나중에 필요한 미분화 상태의 줄기세포를 다시 만들어서 저장하는 자가 재생산(self-renewal) 능력이 있는 장점이 있다 (JACC: Basic to Translational Science 2:702-716, 2017).
줄기세포의 치료제로의 개발과정 중, 최적 치료효과를 갖는데 필요한 세포 숫자를 획득하기 위해서는 분리한 줄기세포를 오랜 기간 배양하는 과정이 필수적이다. 장기간의 배양으로 인해 노화된 세포가 다수 혼재된 상태 혹은 다양한 단계의 계대별 세포가 혼재된 상태로 치료제 개발이 수행될 수 밖에 없다. 이는 줄기세포 치료제의 안정성, 유효성 뿐만 아니라, 정도 관리에 문제점을 야기할 수 있다 (European Cells and Materials 31:136-159, 2016). 따라서, 성체줄기세포를 이용한 세포치료제의 개발을 위해서는, 장기간의 배양으로 인해 혼재되어 있는 노화 세포를 선별하는 과정이 필요하다. 실제 줄기세포치료제의 정도 관리를 위한 다각적인 노력들이 지속되고 있지만, 명확한 지표물질로 확립된 것은 미비한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 노화된 줄기세포를 제거하고, 고효율의 줄기세포만을 선별할 수 있는 표지 물질을 찾아내고자 예의 연구 노력한 결과, 장기간의 배양 기간 동안 성체줄기세포를 배양하면서 계대 기간이 경과함에 따라 포도당 대사와 연관된 GRP78이라는 단백질이 노화와 관련된 줄기세포의 표지물질로 사용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 성체줄기세포를 활용한 줄기세포 치료제의 개발 및 이의 품질 관리를 위한 지표 물질 GRP78을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 효능이 우수한 줄기세포 치료제 제조를 위해 노화된 줄기세포를 제거하고 고효율의 줄기세포를 분리하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 단백질표지자 GRP78을 이용한 고효율의 줄기세포 선별용 조성물 및 키트를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 GRP78 특이적인 항체 또는 압타머를 이용한 고효율의 줄기세포를 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, GRP78 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을 측정할 수 있는 물질을 포함하는 고효율의 줄기세포 선별용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 고효율의 줄기세포 선별용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 줄기세포로부터 DNA 또는 단백질을 추출하는 단계; (b) GRP78 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (c) 상기 측정된 유전자의 mRNA 또는 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계; 및 (d) 상기 발현 수준이 대조군에 비해 증가한 경우, 고효율의 줄기세포로 선별하는 단계를 포함하는 고효율의 줄기세포를 선별하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 단백질표지자 GRP78를 이용하면 노화된 줄기세포를 제거하여 고효율의 줄기세포만을 분리하는 것이 가능하다. 따라서, 줄기세포 치료제의 품질관리 및 안정성, 유효성의 정도를 평가하는 효과적인 지표 물질로 활용될 수 있으며, 치료 효능이 우수한 줄기세포 치료제 제조에 유용하다.
도 1a는 노화로 인한 성체줄기세포의 모양 변화를 보여주는 그림이다.
도 1b는 젊은 세포와 노화된 세포의 성체줄기세포 특이적인 세포 표지자 변화를 보여주는 그림이다.
도 1c는 계대 과정동안 노화된 세포의 특성을 가지고 있는지 확인하는 결과를 나타내는 그림이다.
도 2는 성체줄기세포의 계대별 단백체 분석을 통한 결과 중에서 유의적으로 얻어진 GRP78을 보여주는 그림이다.
도 3은 노화가 진행된 성체 줄기세포에서의 GRP78 유전자 수준의 변화를 보여주는 그림이다.
도 4는 노화가 진행된 성체 줄기세포에서의 GRP78 단백질 수준의 변화를 보여주는 그림이다.
도 5는 노화가 진행될수록 GRP78의 세포 내에서의 발현 위치를 나타내는 그림이다.
도 6은 GRP78 단백질 수준이 성체 줄기세포 특이적인 변화임을 나타내는 그림이다.
도 7은 GRP78 단백질의 세포내 구획별 발현량을 나타내는 그림이다.
도 8은 성체 줄기세포에서 GRP78을 자석을 이용한 분리 방법으로 분리하여, GRP78 표면 표지자를 나타낸 그림이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 성체 줄기세포의 노화 진행에 따른 단백체 변화를 조사하여, 노화된 줄기세포에서 발현 변화가 유의한 GRP78 (Glucose-regulated protein 78)을 동정하였다. 노화된 줄기세포에서 GRP78 유전자 및 단백질의 발현이 유의하게 감소하였으며, 노화된 줄기세포에서는 GRP78 단백질의 세포질 및 세포막으로의 이동이 감소하고, 노화가 진행될수록 세포질 및 세포막에서 GRP78 단백질의 발현이 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 또한, MACS (Magnetic-activated cell sorting)를 이용하여 GRP78 단백질이 발현되지 않는 노화된 줄기세포를 제거하고, 세포막에 GRP78 단백질이 발현하는 고효율의 줄기세포만을 특이적으로 선별하여 분리할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일관점에서, GRP78 특이적인 항체 또는 압타머를 이용한 고효율의 줄기세포를 분리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 (a) 줄기세포에 GRP78 특이적인 1차 항체를 결합시키는 단계; (b) 상기 1차 항체에 2차 항체가 고정화된 자성 비드를 결합시키는 단계; 및 (c) MACS (Magnetic-activated cell sorting)를 이용하여 GRP78을 발현하는 줄기세포를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 고효율의 줄기세포는 세포막에서 GRP78을 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 세포막에서 GRP78의 발현 수준이 낮은 줄기세포를 제거하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 세포막에서 GRP78의 발현 수준이 낮은 줄기세포는 노화된 줄기세포인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 GRP78의 염기서열 및 아미노산 서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다 (예: GenBank Accession AAA52614.1).
본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 성체 줄기세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "줄기세포"란, 동물의 내배엽(endoderm), 중배엽(mesoderm) 및 외배엽(ectoderm) 유래의 세포로 분화할 수 있는 전분화능(pluripotency), 또는 조직 또는 기능에 있어 밀접하게 관련된 세포로 분화할 수 있는 다분화능(multipotency)을 가지는 세포를 의미한다. 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cells), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능(다능성) 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있다.
본 발명에서 용어, "성체 줄기세포"란 각 조직 내 존재하는 줄기세포를 분리해 체외에서 배양한 것으로 다분화능(multipotency)을 가지는 세포를 의미하며, 골수줄기세포, 망막줄기세포, 망막 내 뮐러아교세포, 신경줄기세포 등이 있다. 상기 줄기세포는 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개, 쥐, 랫트 및 고양이 등의 가축을 포함하는 포유동물 유래일 수 있으며, 바람직하게는 인간 유래이다.
본 발명에서 용어, "노화"는 개체 연령 증가 또는 계대수의 증가로 성체 줄기세포의 분화능력 또는 증식능력이 감소하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, "계대(passage)"란 세포를 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위해 주기적으로 세포의 일부를 새로운 배양용기에 옮긴 후 배양 배지를 갈아주면서 세포의 대를 계속 이어서 배양하는 방법에서, 배양용기를 교체하는 것 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 의미하며, 한 차례 배양용기 교체 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 1 계대(passage)라고 한다. 본 발명에서 계대수가 낮은 또는 젊은 (young) 계대의 줄기세포는 분화능력 또는 치료효과가 높은 줄기세포를 의미하며, 계대수가 높은 또는 노화된 (old) 계대의 줄기세포는 분화능력 또는 치료효과가 낮은 줄기세포를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 젊은 (young) 계대란 계대수가 0 내지 3일 수 있으며, 바람직하게는 0 내지 2일 수 있다. 또한, 노화된 (old) 계대란 계대수가 15 내지 25일 수 있으며, 바람직하게는 20 내지 25일 수 있다.
즉, 본 발명의 "노화된 줄기세포"란 계대수의 증가로 성체 줄기세포의 분화능력 또는 증식능력이 감소한 줄기세포를 의미하며, "고효율의 줄기세포"란 성체 줄기세포의 분화능력 또는 증식능력이 매우 높아서 세포치료제로 효능이 우수한 줄기세포를 의미한다. 다시 말하면, "고효율의 줄기세포"란 젊은 계대의 줄기세포와 동등한 분화능력 또는 증식능력을 나타내는 것을 의미한다.
본 발명은 다른 관점에서, GRP78 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을 측정할 수 있는 물질을 포함하는 고효율의 줄기세포 선별용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 물질은 GRP78 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 GRP78 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 조성물은 또한, 시료의 DNA를 증폭시킬 수 있는 증폭수단을 더 포함할 수 있고, 또한 선택적으로 검체로부터 유전자를 추출하는 수단을 포함할 수도 있다. 상기 PCR을 이용하여 시료의 DNA를 증폭시키는 방법 및 검체로부터 유전자를 추출하는 방법은 당업계에 공지되어 있으므로, 본 명세서에서는 이에 관한 자세한 설명은 생략한다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3 hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트 (template)와 염기쌍 (base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4기지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브" 란 mRAN와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다.
프로브는 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 물질은 GRP78 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적인 항체 또는 압타머인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 단백질 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출/측정 방법으로는 예를 들면 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 용액/현탁액 중에서 표지된 항체와의 결합, 질량분석 또는 항체를 이용한 단백질 어레이 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다.
이러한 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체, 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 또는 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자 등이 사용될 수 있으며, 단백질에 특이적 결합이 가능한 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함한다.
본 발명의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 GRP78 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있고, 바람직하게는 GRP78 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 그의 일부가 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 고효율의 줄기세포는 노화되지 않은 젊은 줄기세포인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 젊은 (young) 줄기세포란 계대수가 0 내지 3일 수 있으며, 바람직하게는 0 내지 2일 수 있다. 또한, 노화된 (old) 줄기세포란 계대수가 15 내지 25일 수 있으며, 바람직하게는 20 내지 25일 수 있다.
즉, 본 발명의 "노화된 줄기세포"란 계대수의 증가로 성체 줄기세포의 분화능력 또는 증식능력이 감소한 줄기세포를 의미하며, "고효율의 줄기세포"란 성체 줄기세포의 분화능력 또는 증식능력이 매우 높아서 세포치료제로 효능이 우수한 줄기세포를 의미한다. 다시 말하면, "고효율의 줄기세포"란 젊은 계대의 줄기세포와 동등한 분화능력 또는 증식능력을 나타내는 것을 의미한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, GRP78 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을 측정할 수 있는 물질을 포함하는 고효율의 줄기세포 선별용 조성물을 포함하는 고효율의 줄기세포 선별용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성되고, RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수, 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량구조 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 키트는 상기 단백질 수준을 측정하는 제재를 포함하는 진단 키트일 수 있으며, 이때 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 상기 단백질에 특이적인 항체이다. 따라서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 키트는, 예컨대, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수요소를 포함하는 마커 검출용 키트일 수 있으며, 이러한 키트는 "항원-항체 복합체"를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예컨대, 표지된 2차 항체, 발색단 (chromophores), 효소(예: 항체와 접합) 및 그의 기질 등을 포함할 수도 있다. 또한, 정량 대조구 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
아울러, 상기 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
단백질 수준을 측정하기 위한 분석방법으로는 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니며 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 줄기세포로부터 DNA 또는 단백질을 추출하는 단계; (b) GRP78 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (c) 상기 측정된 유전자의 mRNA 또는 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계; 및 (d) 상기 발현 수준이 대조군에 비해 증가한 경우, 고효율의 줄기세포로 선별하는 단계를 포함하는 고효율의 줄기세포를 선별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 발현은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray) 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질의 발현은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay) 및 단백질 칩(protein chip)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 대조군은 노화된 줄기세포인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 고효율의 줄기세포는 노화되지 않은 젊은 줄기세포인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 젊은 (young) 줄기세포란 계대수가 0 내지 3일 수 있으며, 바람직하게는 0 내지 2일 수 있다. 또한, 노화된 (old) 줄기세포란 계대수가 15 내지 25일 수 있으며, 바람직하게는 20 내지 25일 수 있다.
즉, 본 발명의 "노화된 줄기세포"란 계대수의 증가로 성체 줄기세포의 분화능력 또는 증식능력이 감소한 줄기세포를 의미하며, "고효율의 줄기세포"란 성체 줄기세포의 분화능력 또는 증식능력이 매우 높아서 세포치료제로 효능이 우수한 줄기세포를 의미한다. 다시 말하면, "고효율의 줄기세포"란 젊은 계대의 줄기세포와 동등한 분화능력 또는 증식능력을 나타내는 것을 의미한다.
[ 실시예 ]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 노화된 줄기세포의 특성 확인
(1) 세포 모양의 변화
성체줄기세포의 노화가 진행될수록 세포 모양의 변화가 어떻게 변화하는지 확인하기 위하여, 각 계대별 세포 모습을 현미경으로 관찰하였다. 구체적으로, 10% FBS와 1% AA/PS가 첨가된 DMEM 배지에 세포를 풀어 배양한 후, DPBS로 2차례 씻어 내었다. 0.25% Trypsin-EDTA을 배양액의 1/6 정도로 넣어 3분 동안 36.5℃의 온도가 유지되고 5% CO₂가 주입되는 인큐베이터에 두어 세포를 떼어 내었다. Trypsin-EDTA의 작용을 저해하기 위해 중화제를 넣은 후, 4℃로 유지되고 있는 원심분리기에 3,000rpm의 속도로 5분 동안 원심분리를 진행하였다. 모아진 세포는 다시 DMEM 배지에서 배양하였다. 상기 배양액은 3일 마다 교체하였고 6계대에서 23계대까지 배양하였다.
배양 결과, 계대가 넘어감에 따라 성체 줄기세포는 면적이 넓어지고, 가장자리가 옅어지는 특징을 가지는 것이 관찰되었다(도 1a).
(2) 성체줄기세포 표지자 발현 변화
성체 줄기세포의 표지자 발현 변화를 조사하기 위해, 세포 표면의 마커를 검출하여 도 1b로 나타나는 Flow Cytometry를 이용하였다. 먼저, 젊은 세포와 노화된 세포의 수를 맞추어 배양하고 이에 세포 표지 항원-항체 반응과 형광 반응을 이용하였다. CD90은 Mesenchymal Stem Cell의 마커로 이용되었으며, 이는 노화가 진행될수록 분화능이 감소함을 나타내었다. CD146은 skeletal protein 마커로 이용되었으며, 이는 노화가 진행될수록 세포 골격을 구성하는 단백질이 감소하였음을 나타내었다.
(3) Senescence associated (SA)-β-gal 분석결과
계대 과정동안 성체 줄기세포가 노화 세포의 특성을 가지고 있는지 확인하기 위하여 SA-b-gal 분석을 시행하였다. 각 계대별 세포를 같은 세포 수로 배양시킨 후, 노화된 세포에 파란색으로 염색이 이루어지도록 X-gal과 solution을 이용하여 결과를 도출하였다(도 1c).
이는 계대가 진행될수록 성체 줄기세포가 노화 세포의 특성을 가짐을 나타낸다.
실시예 2: 단백체 분석결과
성체 줄기세포의 노화 진행에 따른 단백체 변화를 살펴보기 위해 계대별로 배양한 각 세포 펠렛을 이용하여 단백체 분석을 시행하였다. 세포 펠렛에 2DE Lysis solution을 직접 넣어 추출된 단백질을 정량하여 시료당 100 ug을 사용하여 2DE를 전개하여 Alkaline silver로 염색된 스팟을 비교하여 이미지 분석을 시행하였다. 스캐닝된 이미지로부터 단백질 spots의 발현변화 확인을 위한 정량적인 분석은 PDQuest software(version 7.0, BioRad)를 이용하여 수행하였다. 각 spot의 quantity는 total valid sopts의 intensity로 평준화되었으며, 노화된 세포에 비해 두 배 이상의 유의한 발현변화를 보여주는 단백질 spots을 선정하였다. 단백질 동정 결과 유의적으로 나타난 Glucose-regulated protein 78(이하 GRP78)을 선정하였다 (도 2).
실시예 3: 노화된 성체줄기세포에서의 GRP78 유전자 발현 조사
노화된 성체 줄기세포에서의 유전자 수준의 GRP78 발현 변화 조사를 위해 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)을 이용하였다. 각 계대 단계별 성체줄기세포를 모은 뒤, 세포 표면을 DPBS로 2회 세척한다. TRIzol과 chloroform, isopropanol을 이용하여 RNA만을 추출하고, 75% EtOH을 이용하여 RNA 추출물의 순도를 높인다. 이렇게 얻어진 RNA 추출물을 cDNA로 합성하여 PCR을 통해 DNA의 GRP78 유전자만을 복제하고 증폭한다. 이를 eco-dye를 섞은 2% agarose gel에 100V로 30분 전기영동하여 UV illuminator로 밴드를 확인한다.
동시에, 각 계대 별로 동일한 양의 cDNA를 사용하였으며, 전체 RT-PCR 방법이 일관적으로 수행되었음을 증명하기 위해 각 단계별로 추출된 cDNA 양을 GAPDH 유전자를 이용하여 발현 정도를 조사하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 노화가 진행됨에 따라, 성체 줄기세포 내 GRP78의 유전자적 수준이 떨어지는 것으로 조사되었다.
실시예 4: 노화된 성체줄기세포에서의 GRP78 단백질 발현 조사
각 계대 단계별 성체줄기세포를 모은 뒤, 세포 표면을 DPBS로 2회 세척한 뒤, RIPA 버퍼(25Mm Tris-HCl Ph 7.6, 150Mm NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)를 이용하여 세포내 단백질 부분을 추출하였다. 추출된 단백질은 알부민을 표준용액으로 한 BCA(bicinchoninic acid)방법으로 정량하여, 세포내 GRP78 단백질 발현 조사에 사용하였다.
12%의 SDS(Sodium Deoxycholate)-폴리아크릴아마이드 겔(SDS-PAGE)을 제조하고, 계대 기간 각 단계별로 정량한 단백질 시료 30 ug씩을 미리 준비한 SDS-PAGE에 로딩하여 전기영동함으로써, 추출한 세포내 단백질들이 각각의 크기별로 분리되도록 하였다. 전기영동 후, 겔상에서 분리한 각 크기별 단백질들을 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전기적인 방법을 통해 옮겨주었다.
멤브레인상으로 전달된 각 크기별 단백질 중, GRP78의 크기에 해당하는 멤브레인 부분만을 취하고, 취한 멤브레인에 GRP78 특이 항체를 TTBS 버퍼에 5%의 skim milk 파우더를 넣은 블락킹 버퍼에 넣어 24시간동안 4℃ 저온 상태에서 shaker를 이용하여 항체와 반응시켰다. 1차 항체와의 반응 후 (1:1,000 비율로 희석), 1차 항체 특이적은 2차 항체인 레빗-IgG-HRP (horse radish peroxidase) conjugate를 추가 반응시켜주었다 (1:3,000의 비율로 희석). ECL(enhanced chemiluminescence)방법을 통해 결합한 정도를 조사하였다.
동시에, 각 계대별로 동일한 양의 단백질을 사용하였으며, 전체 웨스턴 블롯 방법이 일관적으로 수행되었음을 증명하기 위해 각 단계별로 추출된 단백질 내에서의 β-actin 항체를 사용한 발현 정도를 조사하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 노화가 진행됨에 따라, 성체 줄기세포 내 GRP78의 단백질 수준이 떨어지는 것으로 조사되었다.
실시예 5: 노화에 따른 GRP78의 세포내 분포 변화
면역형광염색분석법 (Immunofluorescent assay; IFA)을 이용하여 성체줄기세포 노화에 따른 GRP 단백질의 세포내 분포를 조사하였다.
각 계대별 세포를 각각 다른 6-웰 플레이트에 커버글라스를 깔아 일정 세포 수까지 배양하였다. 동일한 세포 수까지 배양한 각각의 플레이트를 현미경으로 관찰한 뒤, 배양액을 제거하였다. 그리고 DPBS로 2차례 세척하여 잔여 세포 찌꺼기 (debris)를 제거한 뒤, 4% paraformaldehyde (PFA) 2 ml씩 넣어 10 ~ 20분 상온에서 방치하여 고정하였다. 고정된 세포는 0.05~0.25% Trition X-100/PBS 용액을 이용하여 10 ~ 15분 배양하여 permeabilization 시켰다. 반응이 끝난 후, PBS로 10분씩 3차례 세척해주고, 3% BSA(Bovine Serum Albumin) 용액으로 1시간 동안 블로킹하였다. 블로킹 과정이 끝난 후, 블로킹 버퍼를 모두 제거하고, kimwipes로 조심스럽게 가장자리의 물기까지 제거하였다. 3% BSA/PBS 용액에 1:100 비율로 GRP78 항체를 희석하여 세포와 함께 24시간 반응시켰다. 이때, 세포는 4℃ 챔버 쉐이커 위에 두어 반응이 잘 일어나도록 하였다. 1차 항체 반응 과정이 끝난 후, PBS로 10분 3차례 세척하였다. 2차 항체 결합 과정은 3% BSA/PBS 용액에 host에 맞는 형광이 결합된 2차 항체를 1:500의 비율로 넣어주고 1시간 동안 반응시켰다. 이때, 4℃ 챔버 쉐이커 위에 플레이트를 두고, 습도를 높여 humid한 상태로 만들었다. 2차 항체 반응 시간이 끝나면 PBS로 10분씩 3차례 세척해주고, 핵 염색을 위해 DAPI로 염색하였다. Auto-fluorescence를 방지하기 위해 Quenching 용액인 1 mg/ml Sodium borohydride(NaBH4) in PBS를 넣어 5분 동안 반응시켰다. Quenching이 끝나고 PBS로 10분씩 3차례 세척해주고, 마운팅 용액을 이용하여 마운팅 해주었다. 샘플이 모두 마른 후, confocal기기를 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 사진처럼 젊은 (young) 계대에서 멤브레인 위치를 포함하여 세포질 영역내에 고르게 발현/분포된 GRP78 단백질을 관찰하였으며, 노화된 (old) 계대로 갈수록, 핵 위치에만 특이적으로 발현된 것을 확인하였다. 세포의 노화가 진행될수록 핵 내의 GRP78 단백질이 세포질과 세포막으로의 translocation 기작이 감소하는 것으로 조사되었다.
실시예 6: 성체 줄기세포 특이적인 GRP78 단백질
실시예 4의 방법대로, 각 계대 단계별 성체 줄기세포 및 암세포, 섬유아세포를 모았다. 각 계대별 세포 표면을 DPBS로 2회 세척한 뒤, RIPA 버퍼(25Mm Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)를 이용하여 세포내 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 알부민을 표준용액으로 한 BCA(bicinchoninic acid)방법으로 정량하여, 세포내 GRP78 단백질 발현 조사에 사용하였다.
10%의 SDS(Sodium Deoxycholate)-폴리아크릴아마이드 겔(SDS-PAGE)을 제조하고, 계대 기간 각 단계별로 정량한 단백질 시료 30 ug씩을 미리 준비한 SDS-PAGE에 로딩하여 전기영동함으로써, 추출한 세포내 단백질들이 각각의 크기별로 분리하였다. 전기영동 후, 겔상에서 분리한 각 크기별 단백질들을 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전기적인 방법을 통해 옮겨주었다.
멤브레인상으로 전달된 각 크기별 단백질 중, GRP78의 크기에 해당하는 멤브레인 부분만을 취하고, 취한 멤브레인에 GRP78 특이 항체를 TTBS 버퍼에 5%의 skim milk 파우더를 넣은 블로킹 버퍼에 넣어 24시간 동안 4℃ 저온 상태에서 쉐이커를 이용하여 항체와 반응시켰다. 1차 항체와의 반응 후 (1:1,000 비율로 희석), 1차 항체 특이적은 2차 항체인 레빗-IgG-HRP (horse radish peroxidase) conjugate를 추가 반응시켜주었다 (1:3,000의 비율로 희석). ECL(enhanced chemiluminescence)방법을 통해 결합한 정도를 조사하였다.
동시에, 각 계대별로 동일한 양의 단백질을 사용하였으며, 전체 Western blot 방법이 일관적으로 수행되었음을 증명하기 위해 각 단계별로 추출된 단백질 내에서의 GAPDH 및 β-actin 항체를 사용한 발현 정도를 조사하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 대로, 성체 줄기세포는 노화가 진행됨에 따라, 세포내 GRP78의 유전자적 수준은 젊은 (young) 계대 평균값을 1로 보았을 때, 0.1 수준으로 90% 정도 감소하는 것으로 조사되었고, 단백질 수준은 젊은 계대 평균값을 1로 보았을 때, 노화된 (old) 계대 평균값은 0.7 수준으로 약 30% 정도 감소하는 것으로 조사되었다. 암세포와 섬유아세포는 계대별 GRP 78 단백질 발현 수준이 감소하지 않고, 증가하는 값도 일정하지 않아 변화가 없는 것으로 조사되었다.
실시예 7: GRP78 단백질의 세포내 구획별 발현량
젊은 (young) 계대 성체 줄기세포와 노화된 (old) 계대 성체 줄기세포에서의 GRP78 세포내 구획별 발현량을 조사하기 위해 세포질, 세포막 단백질을 분리하였다. 모든 원심 분리는 4℃에서 수행하였으며, 단백질은 얼음에 보관하였다.
노화 성체 줄기세포 및 미분화 성체 줄기세포에서 세포질에서의 단백질을 추출해내기 위하여, 세포질 용핵 버퍼 (CST, subcellular fractionation kit)를 200 ml 분주하여 스크래퍼로 긁어내었다. 얻어진 세포에서 추출되어 나온 현탁액을 얼음에서 20분간 반응시켰다. 냉장 원심분리기를 활용하여 3,000rpm에서 5분 동안 시료를 원심 분리시키고, 펠렛을 제외한 상층액을 따로 뽑아내어 분리하였다.
또한, 세포막에서의 단백질을 추출해내기 위하여 이전 단계에서의 세포 펠렛에 막 용해 버퍼 (CST, subcellular fractionation kit)를 100 ul 분주하여 25 게이지 바늘을 활용하여 펠렛을 긁어냈다. 펠렛을 현탁시킨 후, 원심분리기를 활용하여 3,000rpm에서 10분 동안 시료를 원심 분리시켰다. 이 또한, 펠렛을 제외한 상층액을 따로 뽑아내어 분리시켰다. 얻어진 세포질 단백질과 세포막 단백질을 활용하여 실시예 4 및 실시예 6에서 활용한 Western blot 분석을 수행하여 단백질 발현 수준의 변화를 확인하였다.
그 결과, 세포질 내에서 GRP78 단백질의 발현 변화는 세포질에서의 표준 마커로 쓰이는 α-tubulin 단백질 발현량에 근거하여 노화가 진행될수록 발현 수준이 감소하였음을 확인할 수 있었다. 세포막 내에서의 GRP78 단백질의 발현 변화는 세포막에서의 표준 마커로 활용되는 ATPase 단백질의 발현량에 근거하여 노화가 진행될수록 발현 수준이 감소하였음을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 세포막에서의 GRP78 단백질 발현정도를 조사함으로써, 세포막에서의 높은 GRP78 발현을 가진 성체 줄기세포를 분리해냄으로써, 노화된 줄기세포와 젊은 줄기세포를 구분하는 방법으로 제시될 수 있음을 확인하였다.
실시예 8: MACS을 통한 GRP78 분리 및 표지자 발현 조사
실시예 7에서 확인한 결과를 토대로, 성체 줄기세포 세포막 내 존재하는 GRP78 단백질을 선택적으로 분리하기 위하여 MACS (Magnetic activated cell sorting) 기법을 활용하여 세포막에 GRP78 단백질이 발현하는 성체 줄기세포를 분리하였다.
Magnetic을 이용하여 GRP78을 분리하기 위하여, 1 x 107 개수로 준비하였다. 준비된 성체 줄기세포에 GRP78 1차 항체를 결합시킨 다음, 세포를 원심분리기를 활용하여 300 ×g, 10분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 남은 펠렛을 70 ㎕ 세척 버퍼 (MACS 세척 용액과 MACS BSA 스톡 용액을 합친 것)로 풀어준다. 블로킹 제제 (MACS 블로킹 용액)을 10 ul 넣어 타 단백질과의 결합을 방지하고, 항-rabbit microbeads를 20 ㎕ 첨가해준다. 이를 vortexing하여, 2-8℃ 냉장고에서 빛을 차단하여 15분 동안 반응시킨다. 15분 반응이 끝난 후, 세척 버퍼를 1 ml 첨가하여 원심분리기를 활용하여 300 x g, 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거한 뒤,세척 버퍼 500 ㎕로 펠렛을 풀어준다.
MACS 분리기를 이용하여 microbeads가 붙은 성체 줄기세포를 분리하기 위해 magnetic 필드에 컬럼을 장착하고, 밑에는 15 ml 코니컬 튜브를 장착한다. 컬럼의 세척을 위하여 세척 버퍼 3 ml을 컬럼 내에 첨가한 후, 중력에 의해 모두 내려온 뒤 새 15 ml 코니컬 튜브를 장착하여 준다. 컬럼 안에 준비한 세포를 넣어주고, 중력으로 흐르도록 둔다. 이때 코니컬 튜브 내 모인 세포들은 GRP78 magnetic 비드가 붙지 않은 세포들로 비선별군 세포이고, 컬럼 내에 모인 세포들은 GRP78 특이적인 선별군 세포이다. 컬럼 내 용액이 중력에 의해 떨어진 후, 컬럼을 MACS 분리기에서 제거하고, 새로운 15 ml 코니컬 튜브를 준비하여 컬럼 안에 plunger를 끼우고 밀어내어 GRP78 특이적인 선별군 세포를 수집한다.
상기 방법으로 분리된 세포들을 GRP78 항체와 특이적으로 결합하는 형광 항체를 붙인 뒤, 표지자를 확인하는 유세포 분석을 활용하여 결과를 도출하였다.
그 결과, 젊은 계대 및 노화된 계대 성체 줄기세포에서 GRP78 선별군 그래프와 비선별군 그래프의 분리를 확인하였으며, 이를 이용하여 GRP78 단백질이 세포막 내 존재하는 세포만을 특이적으로 선별할 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (16)

  1. 다음 단계를 포함하는 GRP78 특이적인 항체를 이용한 세포막에서 GRP78을 발현하고, 핵에서 GRP78을 발현하지 않는 고효율의 젊은 줄기세포를 분리하는 방법:
    (a) 줄기세포의 세포막에 GRP78 특이적인 1차 항체를 결합시키는 단계;
    (b) 상기 1차 항체에 2차 항체가 고정화된 자성 비드를 결합시키는 단계; 및
    (c) MACS (Magnetic-activated cell sorting)를 이용하여 핵에서 GRP78을 발현하는 노화된 줄기세포를 제거하고, 세포막에서 GRP78을 발현하는 줄기세포를 수득하는 단계.
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  12. 다음 단계를 포함하는 세포막 및 세포질에서 GRP78을 발현하고, 핵에서 GRP78을 발현하지 않는 고효율의 젊은 줄기세포를 선별하는 방법:
    (a) 줄기세포를 배양하는 단계;
    (b) 상기 줄기세포에 GRP78 특이적인 1차 항체를 결합시키는 단계;
    (c) 상기 1차 항체에 형광이 결합된 2차 항체를 결합시키는 단계; 및
    (d) GRP78의 발현 수준이 대조군에 비해 세포막 및 세포질에서 증가하고 핵에서는 감소한 경우, 고효율의 젊은 줄기세포로 선별하는 단계.
  13. 제12항에 있어서, 상기 (a) 단계는 세포의 고정 및 투과화 (permeabilization)를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 GRP78의 발현은 면역형광염색법(immunofluorescence)으로 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 대조군은 노화된 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8192740B2 (en) * 2007-02-27 2012-06-05 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising anti-GRP78 antibody as active ingredient
KR101175175B1 (ko) * 2008-07-28 2012-08-20 서울대학교병원 인간 줄기세포에서 고활성 줄기세포를 분리하는 방법 및상기 방법에 의해 분리된 고활성 줄기 세포
CA2743057C (en) * 2008-11-07 2019-11-26 Research Development Foundation Compositions and methods for the inhibition of cripto/grp78 complex formation and signaling
KR101355176B1 (ko) * 2012-03-22 2014-01-27 한국과학기술원 혈중종양세포 진단용 조성물 및 이를 이용한 혈중종양세포 검출방법
PE20151893A1 (es) * 2013-03-14 2015-12-30 Parkash Gill Tratamiento del cancer usando anticuerpos que se unen a grp78 en la superficie celular
CN103205398A (zh) * 2013-04-11 2013-07-17 山西大学 高效表达grp78蛋白的dld1稳定细胞株及其构建方法
KR101508129B1 (ko) * 2013-06-18 2015-04-06 한국원자력의학원 세포 노화 진단용 마커 및 이의 용도
KR101828812B1 (ko) * 2016-04-08 2018-02-13 파미셀 주식회사 줄기세포의 세포노화 검출용 키트

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Kenichi Miharada et al, Cell Stem Cell (2011), vol 9, pp 330-344.
Kyle T Pfaffenbach et al, Curr Opin Cell Biol (2011), vol 23(2), pp 150-156.
M Styner et al, PLOS ONE (2012), vol 7, issue 12, e51613.
S Wey et al, PLOS ONE (2012), vol 7, issue 6, e39047.
Toshio Suda et al, Cell Stem Cell (2011), vol 9, pp 298-310.
Zongwei Li et al, Biochimica et Biophysica Acta (2012), vol 1826, pp 13-22.

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