CN116762010A - 用于选择高质量干细胞的标记物，以及使用其选择高质量干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于评估干细胞质量的组合物和试剂盒，以及用于产生干细胞的方法，并且可以提供用于预防或治疗免疫相关疾病的细胞治疗产品和组合物。

Description

用于选择高质量干细胞的标记物，以及使用其选择高质量干 细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种用于筛选高质量干细胞的细胞表面标记蛋白及利用该标记蛋白筛选高质量干细胞的方法。
背景技术
干细胞是未分化的细胞，其具有自我更新和分化成各种类型人体细胞的能力。当干细胞被用作治疗剂时，它们被认为通过五个主要机制提供抗炎作用和介导修复：将受损组织恢复到正常状态，募集组织生长所需的细胞例如内皮祖细胞，通过瘢痕形成的组织重塑、细胞凋亡抑制、和组织分化。
此外，已知干细胞由于其表面表达的MHC分子数量相对较少而具有低免疫原性。还发现干细胞分泌趋化因子来逃避免疫反应并促进新组织的耐受性。这允许在没有高免疫排斥风险的情况下进行同种异体治疗。一些干细胞的效力可能会受到递送方法的影响。
干细胞包括可以由人类胚胎制成的胚胎干细胞和成体干细胞，例如不断产生血细胞的骨髓细胞。胚胎干细胞可以分化成构成人体的所有细胞和组织，但由于伦理原因其使用受到限制，而成体干细胞是从脐带血或成人骨髓和血液中提取，分为间充质干细胞和造血干细胞细胞。
其中，间充质干细胞(MSCs)是存在于包括骨髓在内的全身的干细胞，其能够分化成各种细胞谱系，例如脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞。由于Alexander A.Maximow(1874-1928)发现间充质中存在可分化为血细胞的祖细胞，间充质干细胞首先由AlexanderJ.Friedenstein(1924-1998)在1976年从骨髓基质分离被命名为成纤维细胞前体。20世纪90年代，许多研究人员发现间充质干细胞具有分化成软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞等的能力，“间充质干细胞”一词开始被使用。从那时起，间充质干细胞已从许多物种中分离出来，包括人类、小鼠、大鼠、狗、山羊、兔子和猫。
在使用间充质干细胞的细胞治疗技术中，重要的是只使用高纯度和高质量的细胞。该治疗技术已被尝试用于治疗疑难杂症，例如各种炎症性疾病。因此，需要用于评估用于间充质干细胞治疗产品的间充质干细胞性能的标记物。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供一种用于评估干细胞质量的组合物和试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一种选择可用作细胞治疗产品的活化干细胞的方法。
本发明的又一个目的是提供一种用于预防或治疗免疫相关疾病的细胞治疗产品和组合物，其包含通过本发明的方法选择的干细胞。
然而，本发明所要达到的目的并不局限于上述目的，本领域技术人员将从以下描述中清楚地理解本文未提及的其他目的。
技术方案
在下文中，将参考附图来描述在此描述的各种实施方案。在以下描述中，阐述了许多具体细节，例如具体配置、组成、和过程等，以提供对本发明的透彻理解。然而，某些实施方案可以在没有这些具体细节中的一个或多个的情况下实施，或者与其他已知的方法和配置相结合。在其他情况下，没有特别详细地描述已知的过程和制备技术以避免不必要地模糊本发明。本说明书通篇对“一个实施方案”或“一实施方案”的引用意味着结合该实施方案描述的特定特征、构造、组成或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，本说明书通篇各处出现的短语“在一个实施方案中”或“一实施方案”不一定指代本发明的相同实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，可以以任何合适的方式组合特定特征、构造、组成、或特性。除非在本说明书另有说明，本说明书中使用的所有科学技术术语与本发明所属技术领域的技术人员所普遍理解的含义相同。
根据本发明的一个实施方案，提供了一种用于评估干细胞质量的组合物，所述组合物包含用于测量CD71(分化簇，Cluster of Differentiation 71)蛋白或其编码基因的表达水平的试剂。
在本发明中，所述“CD71蛋白”也称为转铁蛋白受体(TFRC)，所述CD71蛋白与转铁蛋白相互作用，该转铁蛋白结合流过血细胞的铁，通过称为受体介导的转铁蛋白内吞作用的过程为细胞提供铁。CD71蛋白可由SEQ ID NO:1代表。编码CD71蛋白的基因位于人类的3号染色体和小鼠的16号染色体上。
在本发明中，用于测量CD71蛋白表达水平的试剂可以包括选自，与该蛋白特异性结合的抗体、寡肽、配体、肽核酸(PNA)、和适配体之一，但不限于此。
在本发明中，所述“抗体”是指与抗原特异性结合并引起抗原抗体反应的物质。为了本发明的目的，所述抗体是指特异性结合CD71蛋白的抗体。
本发明的抗体的实例包括所有的多克隆抗体、单克隆抗体、和重组抗体。使用本领域熟知的技术可以容易地生产此抗体。例如，可以通过本领域公知的方法生产多克隆抗体，其包括通过将蛋白质的抗原注射到动物体内并从所述动物采集血液来获得含有所述抗体的血清的过程。这种多克隆抗体可以从任何动物产生，例如山羊、兔、绵羊、猴子、马、猪、牛、狗等。此外，可以使用本领域熟知的杂交瘤方法(参见Kohler和Milstein(1976)EuropeanJournal of Immunology 6:511-519)或噬菌体抗体库技术(参见Clackson等人，Nature,352:624-628,1991；Marks等人，J.Mol.Biol.,222:58,1-597,1991)。可以使用凝胶电泳、透析、盐沉淀、离子交换层析、或亲和层析等方法分离和纯化通过上述方法产生的抗体。此外，本发明所述抗体的实例不仅包括具有两条全长轻链和两条全长重链的完整形式，还包括抗体分子的功能片段。“抗体分子的功能片段”是指至少具有抗原结合功能的片段，其实例包括Fab、F(ab')、F(ab')2和Fv。
在本发明中，“PNA(Peptide Nucleic Acid，肽核酸)”是指人工合成的DNA或类RNA聚合物，其由丹麦的哥本哈根大学的Nielsen、Egholm、Berg和Buchardt教授于1991年首先提出。DNA具有磷酸核糖骨架，但PNA具有通过肽键连接的重复N-(2-氨基乙基)-甘氨酸骨架，因此对DNA或RNA的结合亲和力显著增加，稳定性也显著提高。因此，PNA用于分子生物学、诊断分析、和反义治疗。PNA详细公开在文献[Nielsen PE、Egholm M、Berg RH、BuchardtO(1991年12月).“用胸腺嘧啶取代的聚酰胺通过链置换对DNA进行序列选择性识别(Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide)”。科学254(5037)：1497-1500]。
在本发明中，所述“适体”是指寡核苷酸或肽分子，适体的一般内容公开在文献[Bock LC等,自然355(6360):5646(1992)；Hoppe-Seyler F，Butz K“肽适体：分子医学的强大新工具(Peptide aptamers:powerful new tools for molecular medicine)”.分子医学杂志.78(8):42630(2000)；Cohen B A,Colas P,Brent R.“从组合库中分离出来的人工细胞周期抑制剂(An artificial cell-cycle inhibitor isolated from acombinatorial library)”.Proc Natl Acad Sci美国.95(24):142727(1998)]。
在本发明中，用于测定编码CD71的基因的表达水平的试剂可以包含选自，与该基因特异性结合的引物、探针、和反义核苷酸中的至少一种。
在本发明中，术语“引物”是指识别目标基因序列的片段，包括一对正向和反向引物，但优选为提供具有特异性和灵敏度的分析结果的一对引物。当引物的核酸序列与样品中存在的非目标序列不一致时，引物可由此仅扩增含有互补引物结合位点的靶基因序列而不诱导非特异性扩增，可赋予高特异性。
在本发明中，术语“探针”是指能够与样品中待检测的目标物质特异性结合的物质，指能够通过结合特异性检测样品中目标物质的存在的物质。探针的类型没有特别限制，只要它是本领域常用的即可。优选地，所述探针可以是PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)、肽、多肽、蛋白质、RNA或DNA，最优选PNA。更具体地，所述探针是源自生物体或其类似物的生物分子，或者是在体外产生的。探针的实例包括酶、蛋白质、抗体、微生物、动物和/或植物细胞和器官、神经元、DNA、和RNA。DNA的实例包括cDNA、基因组DNA和寡核苷酸，RNA的实例包括基因组RNA、mRNA和寡核苷酸，蛋白质的实例包括抗体、抗原、酶、肽等。
在本发明中，术语“LNA(锁核酸，locked nucleic acid)”是指含有2'-O或4'-C亚甲基桥的核酸类似物[J Weiler,J Hunziker和J Hall基因疗法(Gene Therapy)(2006)13,496.502]。LNA核苷包含DNA和RNA的常见核碱基，可以根据Watson-Crick碱基对规则形成碱基对。然而，由于亚甲基桥导致分子“锁定”，LNA无法在Watson-Crick键中形成理想的形状。当LNA掺入DNA或RNA寡核苷酸时，它可以更快地与互补核苷酸链配对，从而增加双链的稳定性。在本发明中，术语“反义”是指在亚基之间具有核苷酸序列和主链的寡聚体，其中反义寡聚体通过Watson-Crick碱基配对与RNA中的靶序列杂交以通常允许在靶序列中形成mRNA和RNA：寡聚异二聚体。所述寡聚体可与靶序列具有准确或近似的序列互补性。
本发明的CD71蛋白的序列的信息是已知的。因此，基于该信息，本领域的任何技术人员将能够容易地设计特异性结合编码CD71蛋白的基因的引物、探针或反义核苷酸。
在本发明中，当所述CD71蛋白或其编码基因在干细胞中的表达水平低于对照时，可以确定所述干细胞是高质量的。这里，所述对照可以是CD71蛋白或其编码基因在任何干细胞中的表达水平，也可以是CD71蛋白或其编码基因在干细胞中的表达水平的平均值，且不限于此。在本发明中，“干细胞”是指具有分化成两种或多种新细胞的能力、同时具有自我更新能力的细胞。干细胞按分化潜能可分为全能干细胞、多能干细胞、多能干细胞和单能干细胞，按其来源组织可分为成体干细胞、胚胎干细胞、和去分化干细胞。全能或多能干细胞是指具有分化成构成活体的所有组织或细胞的能力的细胞。此外，多能干细胞是指具有分化成多种类型组织或细胞的能力的细胞。单能干细胞是指具有分化成特定类型组织或细胞能力的细胞。全能干细胞的实例包括胚胎干细胞(ES细胞)、未分化胚胎生殖细胞(EG细胞)和诱导多能干细胞(iPS细胞)。多能干细胞的实例包括成体干细胞，例如间充质干细胞(来源于脂肪、骨髓、脐带血或脐带)、造血干细胞(来源于骨髓或外周血)、神经系统干细胞、以及生殖干细胞。此外，单能干细胞的实例包括定型干细胞，它们通常具有低分裂能力，但一旦被激活，就会剧烈分裂和自我更新而无分化潜能。成体干细胞是少量存在于身体各组织中的细胞，是构成特定组织的细胞。此外，成体干细胞提供身体始终保持健康状态所必需的细胞，当组织发生损伤时，与从其他组织迁移到损伤部位的干细胞一起分化修复损伤组织。本发明所属领域的技术人员普遍认为，具有更小尺寸和更少细胞内颗粒(更低细胞粒度)的干细胞是“更高质量的干细胞”(Lengefeld J等人，细胞大小是衰老过程中干细胞潜能的决定因素(Cell size is a determinant of stem cell potential during aging).SciAdv.2021年11月12日；7(46)：Epub 2021年11月12日.)。此外，具有更好集落形成能力(集落形成单位的数量)的干细胞被认为是“更高质量的干细胞”(Christine Fehrer等人，间充质干细胞老化(Mesenchymal stem cell aging).Experimental Gerontology.第40卷，第12期，2005年12月，第926-930页)。
术语“高质量”是指干细胞作为细胞治疗产品时高度有效。因此，选择高质量干细胞的标准可以是1)细胞大小和粒度，2)集落形成能力，或3)细胞蛋白表达标志物。上述表达标记物可以是，与在一般干细胞群中相比，在高质量干细胞群中表达量比一般干细胞群增加30％以上的蛋白质(阳性标记物)，或，与在一般干细胞群中相比，在高质量干细胞群中，表达量下降30％以上的蛋白质(阴性标记物)。例如，众所周知，血管内皮生长因子(VEGF)的表达在年轻和健康的细胞中增加。在这种情况下，VEGF可以定义为高质量干细胞的阳性标记。或者，已知随着细胞衰老，IL-6或IL-8的表达增加(Jing Liu等人，间充质干细胞的衰老：功能改变、分子机制和再生策略(Senescence in Mesenchymal Stem Cells:Functional Alterations,Molecular Mechanisms,and Rejuvenation Strategies).Front.Cell Dev.Biol.,2020年5月5日)。在这种情况下，IL-6或IL-8表达较低的细胞可以说是年轻健康的，IL-6或IL-8可以定义为高质量干细胞的阴性标志。
在本发明中，所述干细胞可以是间充质干细胞(MSC)，但不限于此。
在本发明中，术语“间充质干细胞”是指具有分化成各种间充质组织的能力(可塑性)，同时保持干性和自我更新的细胞。因此，通过使用本发明的组合物测量它们的质量而选择的间充质干细胞作为细胞治疗产品是高度有效的。
在本发明中，所述间充质干细胞可以是选自以下的任意一种或多种细胞类型：人胚胎干细胞来源的间充质基质细胞(hES-MSCs)、脐带间充质干细胞(UC-MSCs)、脐带血间充质干细胞(UCB-MSCs)、骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)、脂肪来源间充质干细胞(ADMSCs)、肌肉来源间充质干细胞、神经来源间充质干细胞、皮肤来源间充质干细胞、羊膜来源的间充质干细胞和胎盘来源的间充质干细胞，但不限于此。
在本发明中，间充质干细胞可以来源于生物样品，优选人生物样品，例如骨髓、骨小梁、骨膜、牙髓、肌腱、脂肪组织、血液、脐带、胎盘、胎儿卵黄囊、或皮肤(真皮)，但不限于此。
如本文所用，术语“生物样品”或“样品”是指从生物来源获得的任何材料、组织或细胞，例如生物体如动物或人类受试者、细胞培养物、组织样品等。来自动物或人类受试者的生物样品可包括一种或多种组织类型和一种或多种组织类型的细胞。来自动物或人类受试者的生物样品可以包括根据本领域已知的任何方法分离的任何干细胞，并且优选地，干细胞可以是间充质干细胞。
在本发明中，所述间充质干细胞能够产生间充质谱系的细胞，通常是两种或更多种间充质谱系，更通常是三种或更多种间充质谱系，例如骨软骨细胞(骨和软骨)、成骨细胞(骨)、成软骨细胞(软骨)、肌细胞(肌肉)、肌腱细胞(肌腱)、成纤维细胞(结缔组织)、脂肪细胞(脂肪)和基质细胞(骨髓间质)谱系。
在本发明中，“干细胞质量”包括但不限于干细胞样品中干细胞的各种状态，但优选地，涉及干细胞样品是否适用于临床(例如，细胞治疗产品)。
在本发明中，干细胞质量可以是指干细胞的分化程度(例如，未分化或骨细胞分化)，或者生长因子、细胞因子和其他蛋白质的表达水平，但不限于此，只要它涉及适用于大量使用干细胞作为细胞治疗产品的要求。
在本发明中，“评估”或“确定”包括定量和/或定性分析，其包括存在或不存在的检测，或表达水平和浓度的测量。这些方法是本领域已知的，本领域技术人员将能够选择合适的方法来实施本发明。
本发明的另一个实施方案涉及一种干细胞质量评估试剂盒，所述试剂盒包含本发明的干细胞质量评估组合物。可以使用用于评估干细胞质量的试剂盒来测量干细胞的质量。
在本发明中，关于干细胞、干细胞质量和测量的细节与上述内容重叠，因此将省略其详细描述以避免说明书过于复杂。
在本发明中，所述试剂盒可以是RT-PCR试剂盒、DNA芯片试剂盒、ELISA试剂盒、蛋白质芯片试剂盒、或快速试剂盒，但不限于此。
根据本发明的用于评估干细胞质量的试剂盒还可以包括一种或多种适合于所述分析方法的其他组分组合物、溶液、或装置。
例如，根据本发明的用于评估干细胞质量的试剂盒还可以包括进行逆转录聚合酶链式反应所需的必要元件。逆转录聚合酶链式反应试剂盒包含对编码标记蛋白的基因具有特异性的引物对。所述引物是具有对该基因的核酸序列特异的序列的寡核苷酸，其长度可为约7bp至50bp，更优选约10bp至30bp。所述试剂盒还可以包含对对照基因的核酸序列具有特异性的引物。此外，所述逆转录聚合酶链反应试剂盒可以包括试管或其他合适的容器、反应缓冲液(在不同的pH和镁浓度下)、脱氧核苷酸(dNTPs)如Taq-聚合酶和逆转录酶的酶、DNA酶和/或RNA酶抑制剂、DEPC水、无菌水等。
此外，根据本发明的用于评估干细胞质量的试剂盒可包含进行DNA芯片分析所需的基本元件。所述DNA芯片试剂盒可以包括附着有对应于基因或其片段的cDNA或寡核苷酸的底物，以及用于产生荧光标记探针的试剂、药剂、酶等。所述底物还可以包含对应于对照基因或其片段的cDNA或寡核苷酸。
此外，根据本发明的用于评估干细胞质量的试剂盒可以包括进行ELISA所需的必需元件。所述ELISA试剂盒包含对蛋白质具有特异性的抗体。所述抗体对标记蛋白具有高特异性和亲和力，与其他蛋白的交叉反应性小，为单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体。所述ELISA试剂盒还可以包含对对照蛋白具有特异性的抗体。此外，所述ELISA试剂盒可包含能够检测结合的抗体的试剂，例如标记的二抗、发色团、酶(例如，与抗体偶联的)及其底物、或可与抗体结合的其他物质。
在本发明的干细胞质量评价试剂盒中，抗原抗体结合反应的载体可以选自硝酸纤维素膜、PVDF膜、聚乙烯或聚苯乙烯树脂制成的孔板、载玻片，而不限于此。
另外，本发明所述的干细胞质量评价试剂盒中，所述二抗优选标记有参与显色反应的常规显色剂。所述显色剂可以选自荧光素和染料，而不限于此。所述荧光素可以是例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、胶体金、聚-L-赖氨酸-异硫氰酸荧光素(FITC)和罗丹明-B-异硫氰酸酯(RITC)。
另外，在本发明的干细胞品质评价用试剂盒中，根据参与显色反应的标记，优选使用诱导显色的显色底物。所述底物可以选自3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、2,2'-叠氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS)、邻苯二胺(OPD)等。此时，所述显色基质更优选以溶解于缓冲液(0.1M NaAc、pH 5.5)的状态提供。TMB等显色底物被作为二抗偶联物标记物的HRP降解，产生显色沉积物，目视检查显色沉积物的沉积水平，从而检测标记蛋白的存在与否。
在本发明所述的干细胞质量评价试剂盒中，所述洗涤液优选包括磷酸盐缓冲液、NaCl和Tween20，更优选为0.02M磷酸盐缓冲液、0.13M NaCl和0.05％Tween20组成的缓冲液(PBST)。抗原抗体结合反应后，让二抗与抗原抗体偶联物反应后，在支持物上加入适量的洗涤液，洗涤底物3～6次。硫酸溶液(H 2SO4)可优选用作反应终止溶液。
本发明的又一个实施方案涉及一种选择活化干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：获得干细胞；并测量CD71(分化簇71)蛋白或编码该蛋白的基因在干细胞中的表达水平。
在本发明中，获得干细胞的步骤可以通过从分离自受试者的生物样品中分离干细胞来进行。
在本发明中，术语“受试者”是指具有干细胞的受试者，包括需要干细胞治疗的受试者和单纯捐献干细胞的受试者，可以包括哺乳动物和非哺乳动物。这里，哺乳动物的例子包括但不限于人类、非人类灵长类动物如黑猩猩、其他猿类或猴类；牲畜，例如牛、马、绵羊、山羊和猪；家养动物，例如兔子、狗或猫；实验室动物，例如大鼠、小鼠或豚鼠等啮齿动物。此外，本发明中的非哺乳动物的例子包括但不限于鸟类或鱼类。
如本文所用，术语“生物样品”或“样品”是指从生物来源获得的任何材料、组织或细胞，例如生物体如动物或人类受试者、细胞培养物、组织样品等。来自动物或人类受试者的生物样品可包括一种或多种组织类型和一种或多种组织类型的细胞。来自动物或人类受试者的生物样品可以包括根据本领域已知的任何方法分离的任何干细胞，并且优选地，干细胞可以是间充质干细胞。
在本发明中，所述生物样品可来源于骨髓、小梁骨、骨膜、牙髓、肌腱、脂肪组织、血液、脐带、胎盘、胎儿卵黄囊或皮肤(真皮)，而不限于此。
在本发明中，“分离”是从生物样品分离干细胞的过程，其实例包括使用手动方法从脂肪组织分离干细胞的方法。此方法基于在37℃下用0.075％ I型胶原酶溶液处理脂肪抽吸物30分钟，然后以800g离心所得悬浮液。离心后，所述细胞悬浮液分为两部分：含有脂肪细胞的上清液层和沉淀物中含有血细胞污染的溶液。
在本发明中，用于测量CD71蛋白表达水平的试剂可以包括选自，与该蛋白特异性结合的抗体、寡肽、配体、肽核酸(PNA)、和适配体的至少一种，而不限于此。
在本发明中，CD71蛋白表达水平的测量可以通过选自下组中的至少一种来进行：蛋白质芯片分析、免疫测定、配体结合测定、MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离时间飞行质谱)分析、SELDI-TOF(表面增强激光解吸/电离-飞行时间质谱)测定、辐射免疫测定、辐射免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、组织免疫染色、补体结合测定、2D电泳测定、液体色谱-质谱法(LC-MS)、蛋白质印迹法、和酶联免疫吸附测定法(ELISA)，而不限于此。
在本发明中，用于测量编码CD71蛋白的基因的表达水平的试剂可以是选自，与该基因特异性结合的引物、探针、和反义核苷酸中的至少一种，而不限于此。
在本发明中，测量mRNA的量以确认编码CD71蛋白的基因的存在或表达水平的分析方法的实例包括但不限于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、RNase保护测定(RPA)、Northern印迹、和DNA芯片测定。
在本发明中，当CD71蛋白或其编码基因在干细胞中的表达水平低于对照时，可以确定所述干细胞是高质量的。这里，所述对照可以是CD71蛋白或其编码基因在任何干细胞中的表达水平，也可以是CD71蛋白或其编码基因在干细胞中的表达水平的平均值，而不限于此。
在本发明中，所选择的干细胞的表型可以是CD71低干细胞。
在本发明中，根据与CD71蛋白表达水平的相关性，可将干细胞的表型分为三类：细胞表面分子的阴性表达模式；低表达水平；和高表达水平。例如，基于细胞表面分子的表达水平，前30％可定义为高群体，而后30％可定义为低群体，而不限于此。
本发明的选择方法还可以包括测量干细胞的氧化应激的步骤，从而提高选择适合用作细胞治疗产品的活化干细胞的准确性。
在本发明中，“氧化应激”是指由于活性氧的产生和降解之间的不平衡，细胞暴露于活性氧(ROS)过度积累的状态的情况。活性氧非选择性地攻击作为细胞成分的蛋白质、脂质和DNA，造成不可逆转的损害。因此，当另外测量氧化应激时，可以测量所述干细胞的质量。
在本发明中，测量氧化应激的步骤可以在测量细胞内谷胱甘肽(GSH)水平的同时进行。
在本发明中，谷胱甘肽是一种在体内氧化还原反应中起重要作用的抗氧化剂。当细胞中的谷胱甘肽水平高时，可以将细胞定义为年轻、健康且治疗有效的细胞。细胞内谷胱甘肽水平的测量可以使用与谷胱甘肽结合时和不与谷胱甘肽结合时波长不同的探针进行。例如，所述探针可以是一种小分子探针(FreSHtracer)，它可以很容易地进入细胞和细胞器，并可以与谷胱甘肽的硫醇(-SH)基团结合。当FreSHtrace与谷胱甘肽结合时，它会发出波长为510nm的荧光(F510)，当它不与谷胱甘肽结合时，它会发出波长为580nm的荧光(F580)。细胞中谷胱甘肽的量可以使用如此测量的F510/F580的荧光值来测量，F510/F580表示为FR(FreSHtracer Ratio)。FreSHtracer与GSH的反应是可逆的，测量时不消耗细胞内的GSH。在本发明中，所述干细胞可以是间充质干细胞(MSC)。
在本发明中，间充质干细胞可以是选自下组的任意一种或多种细胞类型：人胚胎干细胞来源的间充质基质细胞(hES-MSCs)、脐带间充质干细胞(UC-MSCs)、脐带血间充质干细胞(UCB-MSCs)、骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)、脂肪来源间充质干细胞(ADMSCs)、肌肉来源间充质干细胞、神经来源间充质干细胞、皮肤来源间充质干细胞、羊膜来源的间充质干细胞、和胎盘来源的间充质干细胞，而不限于此。
在本发明中，如上述选择的干细胞中生长因子的表达水平可以高于对照，并且生长因子可以是血管内皮生长因子(VEGF)，而不限于此。这里，所述对照可以是任何干细胞中VEGF的表达水平，或显示CD71低表型的干细胞中VEGF的表达水平，或干细胞中VEGF表达水平的平均值，而不限于此。
在本发明中，VEGF是促进新血管生长的信号传导蛋白，并且在因血液受损导致含氧血液被剥夺时，形成了恢复细胞和组织的血液供应以用于血管形成和血管生成的机制的一部分循环。通常，已知VEGF表达在年轻和健康的干细胞中增加。
在本发明中，如上述选择的干细胞中白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)和血红素加氧酶1(HMOX1)中至少一种的表达水平可以低于所述对照。这里，所述对照可以是任何干细胞中IL-6、IL-8或HMOX1的表达水平，或显示CD71高表型的干细胞中IL-6、IL-8或HMOX1的表达水平，或干细胞中IL-6、IL-8或HMOX1表达水平的平均值，而不限于此。
在本发明中，IL-6是在T细胞、B细胞、巨噬细胞、和成纤维细胞等多种细胞中产生的抗炎性细胞因子。除了阻止细胞周期和诱导骨髓细胞系分化外，IL-6还可以在包括神经系统在内的关键生理系统中发挥许多重要作用。IL-8是参与急性炎症反应期间中性粒细胞迁移激活的重要因素。HMOX1与IL-6和IL-8一样，是一种抗炎因子，具有抗氧化功能。由于HMOX1在炎症细胞中高表达，长期以来一直被免疫学家认为是治疗慢性炎症和自身免疫性疾病的靶点(Nicole K.Campbell等人，抗氧化血红素加氧酶1对炎症的调节(Regulationof inflammation by the antioxidant haem oxygenase 1).Nature ReviewsImmunology第21卷，第411-425页.2021)。
在本发明中，关于干细胞和生物样品的细节与上述内容重叠，因此将省略其详细描述以避免说明书过于复杂。
本发明的另一个实施方案涉及一种细胞治疗产品，其包含显示CD71低表达模式的干细胞作为活性成分，所述干细胞是通过本发明的选择方法选择的干细胞。
在本发明中，“细胞治疗产品”是指通过一系列旨在恢复细胞和组织功能的过程(例如在活的自体、同种异体或异种细胞的体外增殖或选择，或通过其他方法改变细胞的生物学特性)而用于治疗、诊断和预防目的的药物。美国(自1993)和韩国(自2002)将细胞治疗产品管理在医疗物质类别下。所述细胞治疗产品可用于组织再生或器官功能恢复。
本发明的细胞治疗产品可以通过所有一般途径给药，只要它能到达靶组织。它可以肠胃外给药，例如腹膜内、静脉内、肌内、皮下或皮内，而不限于此。
本发明的细胞治疗产品可用于脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、神经细胞、心肌细胞、肝细胞、β细胞、血管细胞或肺细胞的再生或保护。此外，本发明的细胞治疗产品可用于选自下组中的任一种：肺部疾病的治疗、肺部疾病引起的炎症的抑制或治疗、肺组织的再生、和抑制肺纤维化，并可用于抑制或减轻肺部疾病引起的炎症反应和纤维化。此外，本发明的细胞治疗产品可用于心血管疾病的治疗或软骨的再生。此外，本发明的细胞治疗产品可改善免疫调节功能，或降低免疫反应、免疫细胞穿透或免疫原性中的一种、和抑制炎症反应。
还可利用将细胞治疗产品递送至靶细胞的任何装置来施用本发明的细胞治疗产品。
本发明的细胞治疗剂可以以治疗疾病的治疗有效量含有。治疗有效量是指由研究人员、兽医、医生或其他临床医生确定的在组织系统、动物或人中诱导生物或医学反应的活性成分或药物组合物的量，即诱导正在治疗的疾病或病症的症状缓解的量。
对本领域技术人员显而易见的是，包含在本发明的组合物中的细胞治疗产品根据所需的效果而有所不同。因此，本领域技术人员可以容易地确定细胞治疗产品的最佳剂量，并且可以根据多种因素进行调整，包括疾病的类型、疾病的严重程度、组合物中其他成分的含量、制剂的类型、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、给药时间、给药途径、组合物的分泌速率、治疗持续时间、以及与其同时使用的药物。考虑到所有上述因素，重要的是以最小的量施用所述细胞治疗产品，以发挥最大的作用而不引起副作用。
在本发明中，关于干细胞的细节与上述内容重叠，因此将省略其详细描述以避免说明书过于复杂。
本发明的另一个实施方案涉及一种用于预防或治疗免疫相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有作为活性成分的表现出CD71低表达模式的干细胞，该干细胞是通过本发明选择方法选择的干细胞。
本发明的干细胞的特征在于其中VEGF或GSH的表达水平高于对照，而其中CD71、IL-6、IL-8、或HMOX1的表达水平低于对照。由于这些特性，所述干细胞可以调节免疫耐受，有效预防、改善或治疗免疫相关疾病(Jisun Lim等,谷胱甘肽动力学决定了间充质干细胞通过CREB1-NRF2途径治疗移植物抗宿主病的疗效(Glutathione dynamics determine thetherapeutic efficacy of mesenchymal stem cells for graft-versus-host diseasevia CREB1-NRF2pathway).Sci Adv.2020年4月15日；6(16)：eaba1334.)(Eui Man Jeong等人，实时监测活细胞中的谷胱甘肽表明，维持干细胞功能需要高水平的谷胱甘肽(Real-Time Monitoring of Glutathione in Living Cells Reveals that High GlutathioneLevels Are Required to Maintain Stem Cell Function).干细胞报导(Stem CellReports).2018年2月13日；10(2)：600-614.)。
对照的定义与上述的定义重叠，将省略其详细描述以避免说明书过于复杂。
在本发明中，“免疫相关疾病”是指各种免疫细胞和炎症细胞的过度活化和表达所引起的疾病，例如可为选自，自身免疫性疾病、移植物-免疫性疾病、抗宿主病、器官移植排斥、哮喘、特应性、特发性肺纤维化和急性或慢性炎症性疾病中的至少一种，而不限于此。
此外，在本发明中，“自身免疫疾病”可为选自，类风湿性关节炎、系统性硬皮病、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、牛皮癣、斑秃、哮喘、克罗恩病、白塞氏病(Behcet’s disease)、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、格林巴利综合征、慢性甲状腺炎、多发性硬化症、多发性肌炎、强直性脊柱炎、纤维肌痛和结节性多动脉炎的至少一种，而不限于此。
同时，在本发明中，“预防”可以包括而不限于通过使用本发明的药物组合物阻断、抑制或延迟疾病症状的任何作用。
此外，在本发明中，“治疗”可以包括而不限于任何通过使用本发明的药物组合物减轻或有益地改变疾病症状的作用。
在本发明中，所述药物组合物可以是胶囊剂、片剂、颗粒剂、注射剂、软膏剂、散剂或饮料的形式，并且所述药物组合物可以用于对人给药。
使用时，本发明的药物组合物可以按照各自的常规方法配制成散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、水混悬剂等口服制剂、外用制剂、栓剂、无菌注射液等形式，而不限于此。本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的载体。作为药学上可接受的载体，可以使用粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、助悬剂、着色剂、矫味剂等口服给药；注射用缓冲剂、防腐剂、镇痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等；局部给药可使用基质、赋形剂、润滑剂、防腐剂等。此外，本发明的药物组合物可以通过与如上所述的药学上可接受的载体混合而制备成各种剂型。例如，对于口服给药，所述药物组合物可以配制成片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等形式。对于注射，所述药物组合物可以配制成单位剂量安瓿形式或多剂量形式。此外，所述药物组合物可以配制成溶液剂、混悬剂、片剂、胶囊剂、缓释制剂等。
同时，适用于制剂的载体、赋形剂和稀释剂的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、和矿物油。此外，本发明的药物组合物还可以含有填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂、防腐剂等。
根据本发明的药物组合物的给药途径包括而不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、硬膜内、心内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、胃肠道、局部、舌下和直肠内途径。优选口服或肠胃外给药。
在本发明中，“肠胃外”包括皮下、透皮、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、硬膜内、损伤内和颅内注射或输注技术。本发明的药物组合物还可以配制成用于直肠内给药的栓剂。
本发明的药物组合物可根据多种因素而有所不同，包括所用特定化合物的活性、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄率、药物含量、以及要预防或治疗的特定疾病的严重程度。所述药物组合物的剂量可由本领域技术人员根据患者的病情和体重、疾病的严重程度、药物的形式以及给药途径和给药时间适当选择，可以是0.0001至50mg/kg/天或0.001至50mg/kg/天。所述药物组合物可以每天给药一次或数次。所述剂量不旨在以任何方式限制本发明的范围。根据本发明的药物组合物可以配制成丸剂、糖衣片剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、或混悬剂。
在本发明中，关于干细胞的细节与上述内容重叠，因此将省略其详细描述以避免说明书过于复杂。
有益效果
本发明提供了一种能够选择适合用作细胞治疗产品并且具有例如VEGF或GSH基因的表达水平增加，以及例如CD71、IL-6、IL-8或HMOX1基因表达水平降低的高质量干细胞的方法。
附图简述
图1显示CD71对实验例1中施加于间充质干细胞的氧化应激的反应。
图2显示实验例2中CD71低表达间充质干细胞与CD71高表达间充质干细胞的细胞大小和细胞粒度比较结果。
图3显示实验例3中CD71低表达间充质干细胞与CD71高表达间充质干细胞VEGF、IL-6、IL-8、HMOX1基因表达量比较结果。
图4显示比较实验例4中CD71低表达的间充质干细胞与CD71高表达的间充质干细胞的集落形成能力(集落形成单位数)的结果。
图5显示在实验例5中，根据衰老程度而在年轻代干细胞(P4)、中期代干细胞(P8)和老代干细胞(P14)之间确认细胞活性有所不同的结果。
图6显示实验例5中年轻代干细胞(P4)与老代干细胞(P14)CD71基因表达量比较结果。
图7显示实验例6中CD71低表达GSH高表达干细胞(CD71低MSC)的特发性肺纤维化治疗效果评价结果。
图8显示实验例6中CD71低表达GSH高表达干细胞(CD71低MSC)的抗纤维化和抗炎作用评价结果。
最佳实施方式
作为在对细胞施加氧化应激后进行FACS分析的结果，可以看出细胞根据GSH水平(FR)和CD71表达水平(CompR1-A)分为两个细胞群，并且当CD71表达水平低，GSH水平高，因此CD71表达水平低的MSCs可判定为高质量的MSC治疗产物。
本发明实施方式
在下文中，将参考以下实施例详细描述本发明。然而，以下实施例仅用于说明本发明，本发明的范围不受以下实施例限制。
实施例
[实验例1]用于间充质干细胞质量评价的FACS分析
为了评估间充质干细胞(MSC)的质量，鉴定了对施加于细胞的氧化应激有反应的候选标记物。具体而言，MSCs用能够诱导氧化应激的试剂处理，并用mitoFreSHtracer染色，其可以测量线粒体GSH水平。此后，染色的细胞被分离，然后用标记候选物中的CD71标记染色并进行FACS分析(BD LyoplateTM，cat.#560747)以确定GSH水平和每个标记的表达水平。结果示于图1。
如图1所示，作为对细胞施加氧化应激后进行FACS分析流式细胞术的结果，可以看出，根据GSH水平(FR)和CD71表达水平(Comp R1-A)将细胞分为两个细胞群，当CD71表达水平低时，GSH水平高，因此MSCs具有高表达CD71水平可以确定是高质量的MSC治疗产品。
[实验例2]CD71低表达细胞的细胞大小和细胞粒度分析
本发明所属领域的技术人员普遍认为，干细胞体积越小、胞内颗粒越少(细胞粒度越低)，就是“高质量干细胞”。所述“高品质”是指干细胞作为细胞治疗产品的高度有效、高效率。因此，本发明人检查了具有低表达水平的CD71的MSC的细胞大小和细胞粒度之间是否存在相关性。为此，分析了MSCs中CD71的表达模式，在进行FACS分析的细胞中，前30％ CD71高表达(CD71_高)的间充质干细胞，和后30％ CD71低表达(CD71_低)的间充质干细胞被选取，并比较两个细胞群的细胞大小和细胞粒度。结果示于图2。
如图2所示，可以确认，在进行FACS分析的细胞中，前30％ CD71高表达(CD71_高)的间充质干细胞比后30％ CD71低表达(CD71_低)的间充质干细胞，具有更小的平均细胞大小和更低的细胞粒度。
由此，可以确认CD71低表达的间充质干细胞的细胞体积小、细胞粒度低，因此判定为高质量。
[实验例3]细胞中CD71低表达的主要标志蛋白表达量的变化分析
为了确认CD71低表达的间充质干细胞的品质，对实验例1的FACS分析结果进行定量分析。具体地，在进行FACS分析的细胞中，选择前30％ CD71高表达(CD71_高)的间充质干细胞和后30％ CD71低表达(CD71_低)的间充质干细胞，在两个细胞群之间比较VEGF、IL-6、IL-8和HMOX1的表达水平。结果示于图3。
如图3所示，可以证实，在进行FACS分析的细胞中，相比于后30％ CD71低表达(CD71_低)的间充质干细胞，前30％ CD71高表达(CD71_高)的间充质干细胞的VEGF表达水平显著升高，IL-6、IL-8和HMOX1表达水平显著降低。
本发明所属领域的技术人员通常已知，在年轻和健康的细胞中VEGF的表达增加，并且随着细胞变得衰老IL-6、IL-8和HMOX1的表达增加。
因此，可以证实，在CD71低表达的间充质干细胞中，VEGF表达增加，IL-6、IL-8和HMOX1表达减少。因此，这些干细胞被判定为高质量的。
CD71低表达细胞集落形成能力分析
众所周知，干细胞固有的自我更新能力得到完好保存的年轻健康的干细胞，具有优异的集落形成能力(集落形成单位数)。因此，为了评估CD71低表达的间充质干细胞的质量，比较CD71低表达(CD71_低)的间充质干细胞和CD71高表达(CD71_高)的间充质干细胞的集落形成能力，结果如图4所示。
如图4所示，可以看出，在进行FACS分析的细胞中，后30％ CD71低表达(CD71_低)的间充质干细胞的集落形成能力比前30％ CD71高表达(CD71_高)的间充质干细胞高约2倍。因此，后30％ CD71低表达(CD71_低)的间充质干细胞可被确定为高质量。
[实验例5]依赖于细胞衰老程度的CD71表达量分析
随着干细胞开始衰老，细胞的干性和治疗效果会下降。因此，根据MSC传代次数，将干细胞分为年轻代干细胞(P4)、中代干细胞(P8)、和老代干细胞(P14)。对于分裂的细胞，测定了已知在细胞衰老过程中积累的脂褐素(FITC_自发荧光)，并确认细胞活性因衰老程度而异。结果示于图5。
分析年轻代干细胞(P4)和老代干细胞(P14)中CD71标记蛋白的表达水平，结果见图6。
如图6所示，老代干细胞(P14)中CD71的表达明显高于年轻代干细胞(P4)。由此证实，CD71标记可作为选择年轻、健康、高质量干细胞的标记。
[实验例6]CD71表达量分析
在实验例1中，确认了CD71的表达量低时GSH量高。由此，评价了CD71低表达、GSH高表达的干细胞(CD71低MSC)对特发性肺纤维化的治疗效果，结果如图7和8所示。
如图7所示，与博来霉素处理诱导的损伤组织相比，博来霉素和CD71低MSC共同处理的组织中炎症细胞的浸润显著减少。
此外，如图8所示，通过分析肺组织中的mRNA水平，可以确认，与博来霉素处理诱导的病变组织相比，在用博来霉素和CD71低MSC共同处理的肺组织中，纤维化标志物aSMA和col1a1的表达水平以及促炎细胞因子IL-6和IL-8的表达水平显著降低，抗-炎性细胞因子IL-10增加。因此，可以确认具有低表达水平的CD71的CD71低MSC细胞表现出抗纤维化和抗炎作用。
如上所述，作为根据本发明评估干细胞质量的结果，CD71低表达的间充质干细胞可被确定为比CD71高表达的间充质干细胞质量更高。由此可以证实，当选择CD71低表达的间充质干细胞用于治疗时，这些干细胞将表现出进一步增强的治疗效果。
工业适用性
在使用间充质干细胞的细胞治疗技术中，重要的是只使用高纯度和高质量的细胞。此治疗技术已被尝试用于治疗疑难杂症，例如各种炎症性疾病。因此，需要用于评估用于间充质干细胞治疗产品的间充质干细胞性能的标记物。
本发明的用于选择高质量干细胞的细胞表面标记蛋白和使用该标记蛋白选择高质量干细胞的方法使得可以有效地仅选择高质量细胞，于是根据本发明选择的干细胞有望积极用于预防或治疗免疫相关疾病，如自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、器官移植排斥反应、哮喘、特应性、特发性肺纤维化、急性炎症、和慢性炎症。
序列表自由文本
SEQ ID NO.1：CD71(分化簇71)蛋白。
/>
<110> 塞尔吐温株式会社
<120> 用于选择优质干细胞的标记物，以及使用其选择优质干细胞的方法
<130> POPB214657PCT
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 760
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD71蛋白
<400> 1
Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu
1 5 10 15
Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp
20 25 30
Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala
35 40 45
Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly
50 55 60
Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly
65 70 75 80
Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr
85 90 95
Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro
100 105 110
Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys
115 120 125
Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile
130 135 140
Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln
145 150 155 160
Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val
180 185 190
Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg
195 200 205
Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys
210 215 220
Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys
225 230 235 240
Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile
245 250 255
Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu
260 265 270
Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe
275 280 285
Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly
290 295 300
Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln
305 310 315 320
Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr
325 330 335
Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp
340 345 350
Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser
355 360 365
Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile
370 375 380
Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp
385 390 395 400
His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala
405 410 415
Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met
420 425 430
Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile
435 440 445
Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr
450 455 460
Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr
465 470 475 480
Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val
485 490 495
Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn
500 505 510
Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp
515 520 525
Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe
530 535 540
Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp
545 550 555 560
Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu
565 570 575
Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu
580 585 590
Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn
595 600 605
Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp
610 615 620
Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln
625 630 635 640
Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu
645 650 655
Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys
660 665 670
Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro
675 680 685
Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser
690 695 700
Gly Ser His Thr Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys
705 710 715 720
Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala
725 730 735
Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp
740 745 750
Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe
755 760

Claims (15)

1.一种用于评价干细胞质量的组合物，所述组合物含有用于测量CD71(分化簇71)蛋白质或编码所述蛋白质的基因的表达水平的试剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，当所述CD71蛋白或编码所述蛋白的基因的表达水平低于对照时，所述干细胞被判定为高质量。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述干细胞是间充质干细胞(MSC)。
4.一种干细胞品质评价试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1-3任一项所述的干细胞品质评价组合物。
5.一种活化干细胞的筛选方法，所述方法包括以下步骤：
获得干细胞；和
测量所述干细胞中CD71(分化簇71)蛋白或编码该蛋白的基因的表达水平。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，当所述干细胞中CD71蛋白或编码所述蛋白的基因的表达水平低于对照时，则判定所述干细胞为高质量干细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中被判定为高质量的活化干细胞是CD71低表型干细胞。
8.根据权利要求5所述的方法，其进一步包括测量干细胞的氧化应激的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其中测量所述氧化应激的步骤通过测量细胞中的谷胱甘肽(GSH)水平来进行。
10.根据权利要求5所述的方法，其中所述干细胞是间充质干细胞(MSC)。
11.根据权利要求5所述的方法，其中所选择的干细胞中血管内皮生长因子(VEGF)的表达水平高于对照。
12.根据权利要求5所述的方法，其中所选择的干细胞中白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、和血红素加氧酶1(HMOX1)中至少一种的表达水平低于对照。
13.一种细胞治疗产品，其含有作为活性成分的显示CD71低表型的干细胞。
14.一种用于预防或治疗免疫相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有作为活性成分的显示CD71低表型的干细胞。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述免疫相关疾病是选自，自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、哮喘、特应性、特发性肺纤维化、急性炎症、和慢性炎症的至少一种。
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