WO2005030961A1 - 新規な神経幹細胞マーカー - Google Patents

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Tomoko Syofuda
Yonehiro Kanemura
Jun Miyake
Hideo Niwa
Kenji Yamashita
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Kaneka Corporation
National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting neural stem cell Z progenitor cells from a tissue or cell population composed of a plurality of cell types.
  • the present invention also provides a method for maintaining the characteristics of neural stem cell Z progenitor cells when a process or an operation for inducing differentiation is performed on a tissue or a cell population composed of a plurality of cell types,
  • the present invention relates to a screening method for drugs, manipulations, and the like, which can induce neural stem cells Z precursor cells in a cell population.
  • Non-Patent Document 1 the discovery of neural stem cells has made it possible to screen drugs that act on neural stem cells and divide them into functional neurons such as neurons and glia (non-patented). Reference 2).
  • Non-Patent Document 1 Reynolds, B.A. et al. (1992) A multipotent EGF—responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes.J. Neurosci. 12: 4565-74
  • Non-Patent Document 2 Roy, N. et al. (2000) In vitro neurogensis by neural progenitor cells isolated from the adult human hippocampus.Nat.Med. 6: 271-77
  • Non-patent Document 3 Keyoung H.M.et al. (2001) High-yield selection and extraction of two promoters-- defined phenotyoes of neural stem cells from the fetal brain.Nat. Biotech. 19: 843-50
  • Non-Patent Document 4 Miller F. et al. (1987) Isotyoes of alpha—tubulin are di fferentially regulated during neural maturation. J. Cell. Biol. 105: 3
  • An object of the present invention is to find a new neural stem cell marker and to detect neural stem cell Z progenitor cells from a tissue or cell population composed of a plurality of cell types. It is to provide a method for sorting cells.
  • NC1 gene was found as a gene specifically expressed in the spleen of a patient with familial persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy (PHHI). It has been shown that the gene is specifically expressed in the brain.
  • PHHI familial persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy
  • the present inventors have studied the function of the NC1 gene in more detail, and have found that this gene functions as a means for detecting neural stem cell Z precursor cells by the method described below.
  • Neural stem cells can proliferate and repeat passages (self-renewal ability), and at the same time, can produce cells that constitute the central nervous system such as neuron-glial cells (probably iridani ability). Defined as cells of the undifferentiated nervous system.
  • Neural stem cells A selective culture method (neurosphere method) of Z progenitor cells has been established by Weiss et al. (Science, 255, 1707 (1992)). 0 The method of Weiss et al. Is based on the mouse embryonic spinal cord and striatum.
  • neural stem cell Z progenitor cells When cells of the central nervous system, including the obtained neural stem cell Z progenitor cells, are cultured in a serum-free medium supplemented with EGF (epidermal growth factor) or FGF2 (fibroblast growth factor 2), many cells are serum-free. Although damaged in the environment, neural progenitor cells Z progenitor cells proliferate under these culture conditions and form cell spheres (neurospheres)!
  • EGF epidermal growth factor 2
  • FGF2 fibroblast growth factor 2
  • the present inventors have established a system in which neurospheres are formed from cells prepared from the spinal cord and forebrain of a human fetus and are differentiated into Euron-glia cells by culturing them in the presence of serum. .
  • the expression of the NC1 gene was examined using this system, as described later, the expression of the neurosphere, that is, the expression of neural stem cells Z progenitor cells increased with the increase in neuron / glial cells.
  • the present invention relates to a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 which can be used for detecting the expression of the NC1 gene. That is, DNA having the whole or a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • the present invention also relates to a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 416, which specifically reacts with an NC1 gene product and serves as an epitope of an antibody that can be used for detecting the expression of the NC1 gene. That is, a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5; a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;
  • the above antibody wherein the type of the antibody is a polyclonal antibody; or the above antibody, wherein the type of the antibody is a monoclonal antibody.
  • the present invention provides a method for detecting the expression of the NC1 gene using at least one selected from the group consisting of the above DNAs, peptides and antibody proteins, and an index for the expression of the NC1 gene. And a method of screening for a drug that functions as a nerve factor. That is, a method for detecting a neural stem cell Z precursor cell using at least one selected from the group consisting of the above DNA, peptide, and antibody; functioning as a neural differentiation factor or a neural differentiation inhibitor using the above detection method. This is a method of screening for a drug.
  • the method for detecting a neural stem cell Z precursor cell of the present invention comprises a DNA having any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 13 and 13, a peptide having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 4-16, and the peptide as an antigen. Using at least one of the antibodies obtained
  • the neural stem cell Z precursor cells targeted in the present invention may be any animal species as long as they are capable of differentiating into neurons having a function such as two-way glial cells in vitro or in vivo.
  • the form, generation stage, and the like are not particularly limited. Desirably, it is derived from mammals, and further from humans from the viewpoint of clinical application.
  • Examples of a method for detecting that a target gene is expressed in a certain tissue or cell include the Northern method.
  • NC1 gene shows high expression in neural stem cells Z progenitor cells
  • using the Northern method for example, using the DNA having all or a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as a probe, Neural stem cells Z progenitor cells can be detected in living tissues or cell populations composed of multiple cell types.
  • the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 can be obtained by PCR or the like.
  • the DNA used as the probe is not limited to the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and any probe that specifically recognizes the NC1 gene-derived mRNA can be used as the probe.
  • probe labeling substances include radioactive substances such as 32 P and 35 S; enzymes such as alkaline phosphatase and horseradish peroxidase; and fluorescent substances such as fluorescein and isothiocynate. It is not limited to.
  • Examples of the method for labeling the probe include a method of enzymatic binding, a method of chemically binding, and a method using an in vitro transcription system as used in Example 1 described below. It is not particularly limited to these methods.
  • the method for detecting the expression of the target gene is not limited to the Northern method, but the same method can be performed by, for example, the RT-PCR method or the primer-extension method. be able to.
  • a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 2 and a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 3 can be used as primers.
  • the DNAs having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 2 and 3 can be obtained by DNA synthesis, respectively.
  • the primers are not limited to those described above, and may be any primer that amplifies a DNA fragment having a nucleotide sequence regarded as a nucleotide sequence derived from the NC1 gene or that specifically recognizes a transcription product of the NC1 gene. All can be used as primers.
  • the Western blot method is used to detect the presence of a target protein in a living tissue or a plurality of cells using an antibody that specifically reacts with a gene product of a certain NC1 gene. It is possible to detect neural stem cell Z progenitor cells in a cell population consisting of these cell types.
  • NC1 gene product is a protein having a power of 247 amino acids.
  • Producing a protein as an antigen requires a slightly complicated production process even if genetic engineering techniques are used. Therefore, the present inventors have decided to use a peptide that can be easily prepared as an antigen, and have set forth a peptide having an amino acid sequence that has a possibility that the hydrophobicity, basicity, etc. of amino acid may also be epitope, as SEQ ID NO: A peptide having the amino acid sequence described in 416 was selected.
  • the antigen for producing an antibody that reacts with the NC1 gene product is not limited to the peptide described here, but may be a whole or a part of the NC1 gene product having 247 amino acids.
  • proteins or peptides containing amino acid sequences other than the NC1 gene product such as FLAG or Myc peptide, which function as tag sequences It is also possible to use tide as an antigen.
  • the peptide used as the antigen in the present invention such as the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 416, was prepared by a solid-phase method using a peptide synthesizer, and a method, form, and apparatus for force synthesis. Is not particularly limited.
  • the antibody that reacts with the NC1 gene product is not particularly limited, and may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • a method for producing a polyclonal antibody and a monoclonal antibody conventionally known methods can be used.
  • tissue immunostaining method an immunoprecipitation method, and the like as a method for detecting the presence of the target protein.
  • An antibody recognizing the NC1 gene product can be obtained by such a method. By using this, it is possible to detect neural stem cells and Z progenitor cells in a living tissue using a cell population composed of a plurality of cell types.
  • the method for screening a drug functioning as a nerve shunting factor or a nerve shunting inhibitor according to the present invention uses the above-described method for detecting neural stem cell Z precursor cells.
  • the following method is used to screen for a drug that functions as a nerve-inducing factor or a nerve-inhibiting factor. be able to.
  • a drug having a desired activity can be screened using the number of neural stem cells contained in the culture system or the level of expression of the NC1 gene as a neural stem cell marker as an index. .
  • the culture system for differentiating nerve cells is not particularly limited, as long as the neurosphere system is the most appropriate culture system in which the expression of the NC1 gene changes with the intensification. .
  • Quality, or extracts that may contain them include chemically synthesized compounds, culture solutions of microorganisms and cultured cells, extracts of living organisms or tissues, etc. Not something.
  • NC1 gene and NC1 protein of the present invention are considered to be involved in the process of sorting cells in the nervous system, and can be applied as neural stem cell markers capable of detecting and selecting neural stem cell Z precursor cells. .
  • Probes used for detection of gene expression were prepared by an in vitro transcription system using a vector into which a DNA fragment corresponding to the NC1 gene was incorporated. Specifically, the following method was used. Oligonucleotides having an Xhol site added to the base sequence described in SEQ ID NO: 2 and the base sequence described in SEQ ID NO: 3 were used as primers. For type ⁇ , a supernatant obtained by heat-treating a part of a human fetal cDNA library manufactured by CLONTECH and precipitating the residue by centrifugation was used. Using the above primers and type I, a DNA fragment having the NC1 gene-specific sequence was amplified by PCR.
  • Vector-1 Promega, pGEM-T Easy. This vector contains the base sequence described in SEQ ID NO: 1 as a probe fragment. Using this vector, a DIG-11-UTP (Roche Molecular Biochemicals) -labeled RNA probe was prepared by an in vitro transcription system.
  • Tissue explants from human fetal forebrain and spinal cord were collected and subjected to neurosphere culture method (Reynolds, B.A. et al., (1992) Neurosci. 12: 4565-74; Vescovi, AL et al., (199 3) Neuron 11: 951-66; Reynolds, BA and Weiss, S., (1996) Dev Bi ol. 175: 1-13), a neurosphere consisting of human neural stem cells Z progenitor cells was cultured. The details of the culture method followed the method of Kanamura et al. (Kanemura, Y. et al., (2002) J. Neurosci. Res. 69: 869-79).
  • the membrane is washed, reacted with Anti-Digoxigenin-AP, Fab Fragment (Roche Molecular Biochemicals), and detected for NCI gene expression by CDP-Star cnemilummes cent substrate (Amersham Bioscience). Was done.
  • NC1 indicates a position corresponding to the mobility of NC1 gene-derived mRNA
  • 28S rRNA indicates a position corresponding to the mobility of 28S ribosomal RNA.
  • ⁇ BXPC3J is a human spleen cancer-derived cell line BXPC3
  • ⁇ NTERA-2 '' is a human embryonic carcinoma cell line NTERA-2
  • ⁇ Jurkat '' is a human T cell urkat
  • ⁇ U251 '' is a human glioblastoma.
  • the derived cell line U251 is shown.
  • the prepared neurosphere is composed of neural stem cell Z progenitor cells.
  • the differentiation-inducing group A is composed of tubulin Bill-positive cells having neuronal traits and GFAP (glial fibrillary acidic protein) -positive cells having astrocyte traits.In the differentiation-inducing group B, almost all cells are GFAP. It consists of positive cells.
  • the expression of the NC1 gene in these culture systems was remarkably high in the neurosphere, and low in both the differentiation-inducing groups A and B (Fig. 1). This result indicates that the expression of the NC1 gene decreases in neuronal dystrocytes, which are elevated in neural stem cell Z progenitor cells.
  • the NC1 gene specifically shows high expression in neural stem cell Z precursor cells, indicating that this gene can be applied as a neural stem cell marker.
  • an antibody was produced that reacted with the NC1 gene product.
  • a peptide having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4, which is a partial peptide of the NC1 gene product was synthesized, and immunized to rabbits to obtain antiserum. It was confirmed by ELIS A that this antiserum reacted with the original peptide at a titer of 10,000 times or more, and was used as an antiserum containing an antibody against the NC1 gene product.
  • the detection of the NC1 gene product by the Western method using the antiserum prepared in (1) was examined for the neurosp here prepared from human fetal neural tissue in which the expression of the NC1 gene was detected in Example 1. .
  • detection of the NC1 gene product was performed by the Western blotting method for transformants in which the NCI gene expression vector was introduced into urkat cells and Jurkat cells in which the expression of the NC1 gene was not detected.
  • a whole cell extract was prepared from these cells, and a cytoplasmic fraction and a nuclear fraction were further prepared using an N-XTRACT kit (manufactured by SIGMA).
  • the sample prepared in (2) was heated at 95 ° C for 5 minutes, fractionated by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, and transferred to a nitrocellulose membrane.
  • the membrane is a blocking solution (5% After blocking with skim milk (Tris buffer containing 0.1% Tween-20), the antiserum prepared in (1) was added. After washing the membrane, an anti-Egret IgG antibody (manufactured by Amersham Bioscience) labeled with horseradish 'baroxidase was reacted, and the reacted fraction was detected using ECL (manufactured by Amersham Bioscience).
  • lane 1 is electrophoresis of total RNA derived from urkat cells
  • lane 2 is forcibly expressing the NC1 gene and electrophoresed of all RNA derived from ⁇ Jurkat cells.
  • lane 1 shows the whole cell extract derived from ⁇ Jurkat cells in which the NC1 gene is forcibly expressed
  • lane 2 shows the cytoplasmic fraction derived from ⁇ Jurkat cells in which the NC1 gene is forcibly expressed
  • lane 3 shows the NC (1) Electrophoresis of the nuclear fraction derived from Jurkat cells in which the gene was forcibly expressed.
  • Lane 4 shows the whole cell extract of neurosphere
  • Lane 5 shows the cytoplasmic fraction of neurosphere
  • Lane 6 shows the nucleus of neurosphere. The fraction was electrophoresed.
  • the antiserum expressed the NC1 gene did not react with Jurkat cells (Fig. 2, lane 1).
  • the NCI gene and NCI protein of the present invention are thought to be involved in the process of sorting cells in the nervous system, and can be applied as neural stem cell markers capable of detecting and selecting neural stem cell Z precursor cells. .
  • FIG. 1 is a view showing the results of NC1 gene expression analysis by Northern method.
  • NC1 indicates a position corresponding to the mobility of mRNA derived from the NC1 gene.
  • FIG. 2 is a view showing the result of detection of an NC1 gene product forcibly expressed in urkat cells by a Western method.
  • lane 1 total RNA derived from Pio urkat cells was expressed, and in lane 2, NC1 gene was forcibly expressed, and total RNA derived from ⁇ Jurkat cells was electrophoresed.
  • FIG. 2 is a view showing the result of detection of an NC1 gene product by a Western method. Lanes 1 and 4 were electrophoresed with the whole cell extract, lanes 2 and 5 with the cytoplasmic fraction, and lanes 3 and 6 with the nuclear fraction.

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Abstract

本発明の目的は、複数の細胞種から構成される組織あるいは細胞集団から神経幹細胞／前駆細胞を検出する方法、及び、当該検出方法を用いて神経分化因子等として機能する薬剤をスクリーニングする方法を提供することである。 本発明では、ＮＣ１遺伝子が、未分化な段階の神経幹細胞で発現が高く、分化に伴って発現が低減することを見出した。また、本発明では、ＮＣ１遺伝子及びその遺伝子産物（ＮＣ１蛋白質）、あるいはそれらに由来する塩基配列、アミノ酸配列、さらには抗体等を用いることにより、様々な方法で神経幹細胞／前駆細胞を検出することが可能となり、神経分化因子等として機能する薬剤の新たなスクリーニング法が提供された。

Description

明 細 書
新規な神経幹細胞マーカー
技術分野
[oooi] 本発明は、複数の細胞種力 構成される組織あるいは細胞集団から、神経幹細胞 Z 前駆細胞を検出する方法に関する。また、本発明は、複数の細胞種から構成される 組織あるいは細胞集団に対して、分化を誘導する過程または操作を施した時に神経 幹細胞 Z前駆細胞の形質を維持させること、あるいは、分化した神経細胞の集団に 対して神経幹細胞 Z前駆細胞を誘導することが可能な、薬剤、操作等のスクリーニン グ法に関する。
背景技術
[0002] 従来、損傷を受けた中枢神経系は、神経機能を司る-ユーロン自身に分裂能がない ために機能修復が不可能であると考えられていた。しかし、近年、成体'成人の中枢 神経系においても自己複製能、多分化能ともに有する神経幹細胞が存在することが 明らかになり、中枢神経系においても幹細胞から機能する細胞、組織を分化させるこ とにより損傷された組織、臓器を補完する、いわゆる再生医療の可能性が現実的なも のとなつてきた (非特許文献 1)。また、神経幹細胞が見出されたことにより、神経幹細 胞に作用して、ニューロンゃグリア等の機能する神経細胞に分ィ匕させる薬剤をスクリ 一ユングすることも可能となった (非特許文献 2)。
[0003] 脊髄損傷をはじめパーキンソン病やアルッノ、イマ一病等の中枢神経系の疾患に対 する治療法は様々なものが試みられて ヽるが、これらの疾患を完治できる治療法は、 現在のところ見出されていない。しかし、中枢神経系に対する再生医療や、神経幹細 胞から機能する神経細胞への分化を誘導する薬剤は、中枢神経系の疾患の根本的 な治療法をもたらすことになる力 これらのことを可能にするためには、何らかのマー カーを用いて神経幹細胞を分離することが必須である。中枢神経系にお 、ては Nest inや Musashil、 α—チューブリン等の神経幹細胞マーカー遺伝子が既に同定され ている（非特許文献 3及び 4)。これらの遺伝子を用いることにより神経幹細胞 Ζ前駆 細胞を同定することは基本的には可能であるが、各遺伝子ともマーカーとしての機能 に一長一短がある。
[0004] 非特許文献 1 : Reynolds, B. A. et al. (1992) A multipotent EGF— respon sive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astroc ytes. J. Neurosci. 12 :4565-74
非特許文献 2 : Roy, N. et al. (2000) In vitro neurogensis by neural pr ogenitor cells isolated from the adult human hippocampus. Nat. M ed. 6 : 271-77
非特許文献 3 :Keyoung H. M. et al. (2001) High-yield selection and extraction of two promoter— defined phenotyoes of neural stem cell s from the fetal brain. Nat. Biotech. 19 : 843—50
非特許文献 4: Miller F. et al. (1987) Isotyoes of alpha— tubulin are di fferentially regulated during neural maturation. J. Cell. Biol. 105 : 3
065-73
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の目的は、新たな神経幹細胞マーカーを見出して、複数の細胞種から構成さ れる組織あるいは細胞集団から神経幹細胞 Z前駆細胞を検出する方法、さら〖こは、 神経幹細胞 Z前駆細胞を選別する方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0006] 上記課題を解決するために、本発明者らは NC1遺伝子に注目した。 NC1遺伝子は 、家族性持続性過インスリン性低血糖症（persistent hyperinsulinemic hypogl ycemia of infancy ;PHHI)患者の脾臓に特異的に発現している遺伝子として見 出されたものであるが、正常組織においては、脳で特異的に発現している遺伝子で あることが示されている。本発明者らは、さらに詳細に NC1遺伝子の機能を検討し、 以下に述べる方法により、この遺伝子が神経幹細胞 Z前駆細胞の検出手段として機 能することを見出した。
[0007] 神経幹細胞は、増殖し継代を繰り返すことができる（自己複製能）と同時に、ニューロ ンゃグリア細胞等の中枢神経系を構成する細胞を作り出すことのできる（多分ィ匕能） 未分化な神経系の細胞として定義される。神経幹細胞 Z前駆細胞の選択的培養法（ neurosphere法）は、 Weissらによって確立されている（Science, 255, 1707 (199 2) ) 0 Weissらの方法は、マウス胎生期脊髄や線条体より得た神経幹細胞 Z前駆細 胞を含む中枢神経系の細胞群を、 EGF (epidermal growth factor)または FGF 2 (fibroblast growth factor 2)を加えた無血清培地で培養すると、多くの細胞 は無血清の環境下で障害されるが、神経幹細胞 Z前駆細胞はこの培養条件で増殖 し、細胞塊 (neurosphere)を形成して浮遊すると!/、うものである。
[0008] 本発明者らは、ヒト胎児の脊髄及び前脳から調製した細胞から neurosphereを形成 させ、それを血清存在下で培養することにより-ユーロンゃグリア細胞に分化させる 系を確立している。この系を用いて NC1遺伝子の発現を検討したところ、後述のよう に、 neurosphereの状態、即ち神経幹細胞 Z前駆細胞ではその発現は高ぐニュー ロンゃグリア細胞への分ィ匕に伴って発現が低減することを、今回初めて見出した。 このことから、新たな神経幹細胞マーカーとして NC1遺伝子を利用し、 NC1遺伝子 の発現を指標にして神経幹細胞 Z前駆細胞を検出し、神経幹細胞 Z前駆細胞を選 別することを可能とし、本発明を完成するに至った。
[0009] 即ち、本発明は、 NC1遺伝子の発現を検出するために用いることのできる配列番号 1一 3の塩基配列を有する DNAに関する。つまり、配列番号 1に記載の塩基配列全 部または一部を有する DNA；配列番号 2または配列番号 3に記載の塩基配列を有 する DNAである。
また、本発明は、 NC1遺伝子産物と特異的に反応し、 NC1遺伝子の発現を検出す るために用いることのできる抗体のェピトープとなる配列番号 4一 6のアミノ酸配列を 有するペプチドに関する。つまり、配列番号 4に記載のアミノ酸配列を有するペプチド ；配列番号 5に記載のアミノ酸配列を有するペプチド；配列番号 6に記載のアミノ酸配 列を有するペプチド；上記 、ずれかのペプチドを抗原として得られた抗体；抗体の種 類がポリクローナル抗体である上記抗体;抗体の種類がモノクローナル抗体である上 記抗体である。
さら〖こ、本発明は、上記 DNA、ペプチド及び抗体カゝらなる群より選ばれる少なくとも 1 種を用いて NC1遺伝子の発現を検出する方法、並びに、 NC1遺伝子の発現を指標 に神経分ィ匕因子等として機能する薬剤をスクリーニングする方法に関する。つまり、 上記 DNA、ペプチド及び抗体カゝらなる群より選ばれる少なくとも 1種を用いた神経幹 細胞 Z前駆細胞の検出方法；上記検出方法を用いた、神経分化因子または神経分 化抑制因子として機能する薬剤をスクリーニングする方法である。
[0010] まず、本発明の神経幹細胞 Z前駆細胞の検出方法について説明する。
本発明の神経幹細胞 Z前駆細胞の検出方法は、配列番号 1一 3のいずれかの塩基 配列を有する DNA、配列番号 4一 6のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチド、及 び当該ペプチドを抗原として得られた抗体のうちの少なくとも 1種を用いるものである
[0011] 本発明において対象とする神経幹細胞 Z前駆細胞は、試験管内または生体内で二 ユーロンゃグリア細胞等の機能を有する神経細胞に分化するものであれば、動物種
、形態、発生段階等は特に限定されるものではない。望ましくは哺乳動物由来であり 、さらに臨床応用上の観点からヒト由来であることが望ま 、。
[0012] ある組織や細胞等に目的の遺伝子が発現していることを検出する方法としては、例え ばノーザン法等がある。
後述のように、 NC1遺伝子が神経幹細胞 Z前駆細胞で高い発現を示すことから、ノ 一ザン法を用いて、例えば、配列番号 1に記載の塩基配列全部または一部を有する DNAをプローブとして、生体組織あるいは複数の細胞種力 成る細胞集団において 神経幹細胞 Z前駆細胞を検出することが可能である。なお、配列番号 1に記載の塩 基配列を有する DNAは、 PCR等により得ることができる。
プローブとして用いる DNAは、配列番号 1に記載の塩基配列を有する DNAに限定 されるものではなく、 NC1遺伝子由来の mRNAを特異的に認識するものであれば全 てプローブとして利用することができる。
[0013] プローブの標識物質としては、 32P、 35S等の放射性物質;アルカリ性ホスファターゼ、 ホースラディッシュ 'パーォキシダーゼ等の酵素；フルォロセイン'イソチオシァネート 等の蛍光物質等が挙げられる力 特にこれらに限定されるものではない。
プローブの標識方法としては、酵素的に結合させる方法、化学的に結合させる方法、 さらに後述の実施例 1で用いたような試験管内転写系による方法等が挙げられるが、 特にこれらの方法に限定されるものではな 、。
[0014] また、目的の遺伝子が発現していることを検出する方法も、ノーザン法に限定される ものではなぐ例えば RT— PCR法やプライマー'イクステンション法等によっても、同 様のことを行うことができる。
RT— PCR法やプライマー'イクステンション法を用いる場合、配列番号 2に記載の塩 基配列を有する DNA、配列番号 3に記載の塩基配列を有する DNAをプライマーと して用いることができる。なお、配列番号 2及び 3に記載の塩基配列を有する DNAは 、それぞれ DNA合成により得ることができる。
プライマーとしては、これらに限定されるものではなぐ NC1遺伝子由来の塩基配列 と見なされる塩基配列を有する DNA断片を増幅する、あるいは、 NC1遺伝子の転 写産物を特異的に認識するものであれば、全てプライマーとして利用することができ る。
[0015] また、ある細胞に目的のタンパク質が存在することを検出する方法としては、例えばゥ ヱスタン法等がある力 NC1遺伝子の遺伝子産物と特異的に反応する抗体を用いて 、生体組織あるいは複数の細胞種から成る細胞集団にお!ヽて神経幹細胞 Z前駆細 胞を検出することが可能である。
[0016] このような抗体を作製するためには、抗原となる蛋白質またはペプチドを作製する必 要がある。 NC1遺伝子産物は 247アミノ酸力も成る蛋白質である力 抗原となる蛋白 質を作製することは、遺伝子工学的手法を用いるとしても作製工程が若干複雑にな る。そこで、本発明者らは、作製の容易なペプチドを抗原として用いることとし、ァミノ 酸の疎水性度や塩基性度等カもェピトープとなりうる可能性のあるアミノ酸配列を有 するペプチドとして、配列番号 4一 6に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを選択し た。
ただし、 NC1遺伝子産物と反応する抗体を作製するための抗原としては、ここで記載 したペプチドに限定されるものではなぐ 247アミノ酸力 成る NC1遺伝子産物の全 部または一部を用いてもょ 、。
さら〖こ、抗原の作製や精製を容易にするために、タグ配列として機能する FLAGや M ycペプチドのような、 NC1遺伝子産物以外のアミノ酸配列を含む蛋白質またはぺプ チドを抗原とすることも可能である。
また、配列番号 4一 6に記載のアミノ酸配列を有するペプチド等の、本発明で抗原と して用いたペプチドは、ペプチド合成装置を用いて固相法により合成した力 合成の 方法や形態、装置等は特に限定されない。
[0017] 上記 NC1遺伝子産物と反応する抗体としては特に限定されず、ポリクローナル抗体 であっても、モノクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体及びモノクロ一 ナル抗体の作製方法としては、従来公知の方法を使用することができる。
[0018] 目的のタンパク質が存在することを検出する方法として、ウェスタン法の他にも組織免 疫染色法や免疫沈降法等があるが、このような方法によっても、 NC1遺伝子産物を 認識する抗体を用いて、生体組織ある!ヽは複数の細胞種から成る細胞集団にぉ 、 て神経幹細胞 Z前駆細胞を検出することが可能である。
[0019] 次に、本発明のスクリーニング方法について説明する。
本発明の神経分ィ匕因子または神経分ィ匕抑制因子として機能する薬剤をスクリーニン グする方法は、上記神経幹細胞 Z前駆細胞の検出方法を用いるものである。
つまり、本発明の上記神経幹細胞 Z前駆細胞の検出方法を利用することにより、例 えば次のような方法で、神経分ィ匕因子または神経分ィ匕抑制因子等として機能する薬 剤をスクリーニングすることができる。
[0020] 神経幹細胞 Z前駆細胞を含む neurosphereは、血清等の刺激により-ユーロンゃグ リア細胞等の神経細胞に分化する。このような神経細胞を分ィ匕させる培養系に、神経 分化因子または神経分化抑制因子等として機能する薬剤の候補となる物質、あるい はそれらが含まれる可能性のある抽出物等を添加し、本発明の上記検出方法を用い て、培養系に含まれる神経幹細胞の数、あるいは神経幹細胞マーカーである NC1 遺伝子の発現の強弱等を指標に、目的の活性を有する薬剤をスクリーニングすること ができる。
[0021] 神経細胞を分化させる培養系としては、 neurosphereの系が最も適当である力 分 化に伴って NC1遺伝子の発現が変化するような培養系であれば、特に限定されるも のではない。
また、神経分ィ匕因子または神経分ィ匕抑制因子等として機能する薬剤の候補となる物 質、あるいはそれらが含まれる可能性のある抽出物等としては、化学的に合成された 化合物、微生物や培養細胞の培養液、生物の個体あるいは組織の抽出物等が挙げ られる力 特に限定されるものではない。
発明の効果
[0022] 本発明の NC1遺伝子及び NC1タンパク質は、神経系の細胞の分ィ匕過程に関与して いると考えられ、神経幹細胞 Z前駆細胞を検出、選別できる神経幹細胞マーカーと して応用でさる。
発明を実施するための最良の形態
[0023] 以下に実施例をあげて本発明をより具体的に説明するが、その要旨を越えない限り 、以下の実施例に限定されるものではない。
[0024] (実施例 1)ノーザン法による NC1遺伝子発現の検出
ノーザン法により NC1遺伝子の発現を検出するために以下の実験を行った。
[0025] (1)検出用プローブの調製
遺伝子発現の検出に用いるプローブは、 NC1遺伝子に相当する DNA断片を組み 込んだベクターを用いた試験管内転写系により作製した。具体的には、以下に示す 方法によった。プライマーとして配列番号 2に記載されて 、る塩基配列及び配列番号 3に記載されて 、る塩基配列に Xhol部位を付加したオリゴヌクレオチドを用いた。铸 型は、 CLONTECH社製のヒト胎児 cDNAライブラリーの一部を熱処理し、遠心によ り残渣を沈殿させた上清を用いた。上記プライマーと铸型を用い、 PCRにより NC1遺 伝子特異的配列を有する DNA断片を増幅した。これを Xholで切断した後、ベクタ 一（Promega社製、 pGEM— T Easy)にサブクローユングした。このベクターには、 プローブ断片として配列番号 1に記載されて 、る塩基配列が含まれることになる。こ のベクターを用いて試験管内転写系により、 DIG— 11— UTP (Roche Molecular Biochemicals社製）標識 RNAプローブを作製した。
[0026] (2)神経幹細胞 Z前駆細胞の培養と分化誘導
ヒト胎児前脳及び脊髄力ら組織片を採取し、 neurosphere培養法 (Reynolds, B. A . et al. , (1992) Neurosci. 12 : 4565-74 ; Vescovi, A. L. et al. , (199 3) Neuron 11 : 951—66 ; Reynolds, B. A. and Weiss, S. , (1996) Dev Bi ol. 175 : 1— 13)を用い、ヒト神経幹細胞 Z前駆細胞力ら成る neurosphereを培養し た。培養法の詳細は、金村らの方法（Kanemura, Y. et al. , (2002)J. Neurosci . Res. 69 : 869— 79)に従った。
[0027] 底面積 75cm2の細胞培養用フラスコあたり 3 X 106個の細胞を 4日間前培養した後、 遠心し、レチノイン酸及び 1%ゥシ胎児血清を添加した培地に再懸濁した。培養開始 後 7日目に新鮮な培地に交換し、 14日目まで培養を続けた細胞を分ィ匕誘導群 Aとし た。また、同様に 4日間の前培養を行った後、ゥシ胎児血清の最終濃度を 10%にし た培地中で細胞を増殖させ、 2回の継代を経てコンフルーェントに達するまで培養を 続けた細胞を分化誘導群 Bとした。
[0028] (3)ノーザン法
neurosphereを構成する細胞、分化誘導群 A及び Bから全 RNAを抽出し、その 1 μ gを 1%ホルムアミドを含有するァガロースゲルに展開した後、ナイロンメンブレン (Hy bond— N;Amersham Bioscience社製）に転写した。 RNAを転写したメンブレンと (1)で作製した標識 RN Aプローブを、 DIG Easy Hyb Buffer (Roche Molecu lar Biochemicals社製）中、 68°Cで 1晚ハイブリダィゼーシヨンを行った。ノヽイブリダ ィゼーシヨン後、メンブレンを洗净し、 Anti— Digoxigenin— AP、 Fab Fragment (R oche Molecular Biochemicals社製)と反応させ、 CDP— Star cnemilummes cent substrate (Amersham Bioscience社製）により、 NCI遺伝子発現の検出 を行った。
[0029] (4)結果
上記（1)一 (3)の材料と方法により、ヒト神経幹細胞 Z前駆細胞及び分化を誘導した 細胞における NC1遺伝子の発現を検討した。図 1はその解析結果を示したものであ る。なお、図 1において、「NC1」は NC1遺伝子由来 mRNAの易動度に相当する位 置を示し、「28S rRNA」は 28Sリボゾーム RNAの易動度に相当する位置を示す。「 BXPC3Jはヒト脾臓癌由来細胞株 BXPC3を、「NTERA— 2」はヒト胎児性カルシノ 一マ由来細胞株 NTERA— 2を、「Jurkat」はヒト T細胞 urkatを、「U251」はヒトグ リオブラストーマ由来細胞株 U251を示す。
[0030] ヒト胎児組織力 調製した neurosphereは、神経幹細胞 Z前駆細胞から成る。また、 分化誘導群 Aは、ニューロンの形質を有するチューブリン B ill陽性細胞及びァストロ サイトの形質を有する GFAP (glial fibrillary acidic protein)陽性細胞から成り 、分化誘導群 Bでは、ほぼすベての細胞が GFAP陽性細胞カゝら構成される。これら の培養系における NC1遺伝子の発現は、 neurosphereでは顕著に高ぐ分化誘導 群 A及び Bではともに低い発現しか見られな力つた（図 1)。この結果は、 NC1遺伝子 の発現が、神経幹細胞 Z前駆細胞で高ぐニューロンゃァストロサイトへの分ィヒに伴 つて発現が低下することを示すものである。このように、 NC1遺伝子が神経幹細胞 Z 前駆細胞で特異的に高い発現を示すことから、この遺伝子を神経幹細胞マーカーと して応用できることが示された。
[0031] (実施例 2)ウェスタン法による NC1遺伝子産物の検出
ウェスタン法により NC1遺伝子産物を検出するために以下の実験を行った。
[0032] (1) NC1遺伝子産物に対する抗体の作製
NC1遺伝子がコードするタンパクの部分ペプチドを抗原として、 NC1遺伝子産物に 反応する抗体を作製した。実際には、 NC1遺伝子産物の部分ペプチドである配列 番号 4に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドを合成し、ゥサギに免疫して抗血 清を得た。この抗血清が元のペプチドと 1万倍以上のタイターで反応することを ELIS Aで確認し、 NC1遺伝子産物に対する抗体を含む抗血清とした。
[0033] (2)供試細胞と細胞抽出液の調製
実施例 1で NC1遺伝子の発現が検出されたヒト胎児神経組織カゝら調製した neurosp hereに対して、（1)で作製した抗血清を用いた、ウェスタン法による NC1遺伝子産物 の検出を検討した。また、 NC1遺伝子の発現が検出されな力つ urkat細胞及び Ju rkat細胞に NCI遺伝子発現ベクターを導入した形質転換株についても同様に、ゥェ スタン法による NC1遺伝子産物の検出を試みた。これらの細胞から全細胞抽出液を 調製し、さらに N— XTRACTキット（SIGMA社製)を用いて、細胞質画分と核画分を 調製した。
[0034] (3)ウェスタン法
(2)で調製した試料を 95°Cで 5分間加熱後、 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に より分画し、ニトロセルロースメンブランに転写した。メンブランはブロッキング液（5% スキムミルク、 0. l%Tween— 20を含有するトリス緩衝液）でブロッキングした後、（1) で作製した抗血清を添加した。メンブランを洗浄した後、ホースラディッシュ'バーオ キシダーゼで標識した抗ゥサギ IgG抗体 (Amersham Bioscience社製）を反応さ せ、 ECL (Amersham Bioscience社製）を用いて、反応する画分を検出した。
[0035] (4)結果
上記（1)一（3)の材料と方法により、作製した抗血清による NC1遺伝子産物の検出 を検討した。その結果を図 2、 3〖こ示す。なお、図 2において、レーン 1〖お urkat細胞 由来の全 RNAを、レーン 2は NC 1遺伝子を強制発現させ^ Jurkat細胞由来の全 R NAを電気泳動したものである。また、図 3において、レーン 1は NC1遺伝子を強制 発現させ^ Jurkat細胞由来の全細胞抽出液を、レーン 2は NC 1遺伝子を強制発現 させ^ Jurkat細胞由来の細胞質画分を、レーン 3は NC 1遺伝子を強制発現させた J urkat細胞由来の核画分を電気泳動したものであり、レーン 4は neurosphereの全 細胞抽出液を、レーン 5は neurosphereの細胞質画分を、レーン 6は neurosphere の核画分を電気泳動したものである。
[0036] 上記抗血清は、 NC1遺伝子を発現して 、な 、Jurkat細胞とは反応しな 、（図 2、レ ーン 1)力 Jurkat細胞に NC1遺伝子を強制発現させた形質転換株 (Jurkat— NC1 )とは反応し、 NC1遺伝子産物に相当するバンドが検出された（図 2、レーン 2)。これ は（1)で作製した抗血清が、 NC1遺伝子産物を認識し、少なくともウェスタン法により 検出することが可能であることを示すものである。
[0037] また、ヒト胎児神経組織力 調製した neurosphereに対してウェスタン法を行ったとこ ろ、 NC1遺伝子を強制発現させ urkat-NClと同 Cf立置に、抗血清と反応するバ ンドが検出された（図 3)。さらに、 Jurkat— NC1では細胞質画分、核画分双方に反応 しているが、 neurosphereでは細胞質画分にのみ反応性が認められた。したがって 、この抗血清を用いたウェスタン法により、 neurosphere等の神経幹細胞 Z前駆細 胞における NC1遺伝子産物の存在を検出できる。また、この抗血清は、全細胞抽出 液だけでなく分画した抽出液とも反応することから、 NC1遺伝子産物の細胞内局在 性を示すことも可能である。
産業上の利用可能性 [0038] 本発明の NCI遺伝子及び NCIタンパク質は、神経系の細胞の分ィ匕過程に関与して いると考えられ、神経幹細胞 Z前駆細胞を検出、選別できる神経幹細胞マーカーと して応用でさる。
図面の簡単な説明
[0039] [図 1]ノーザン法による NC1遺伝子の発現解析の結果を示す図である。 NC1は NC1 遺伝子由来 mRNAの易動度に相当する位置を示す。
[図 2 urkat細胞に強制発現させた NC1遺伝子産物をウェスタン法により検出した結 果を示す図である。レーン 1に ίお urkat細胞由来の全 RNAを、レーン 2には NC1遺 伝子を強制発現させ^ Jurkat細胞由来の全 RNAを電気泳動した。
[図 3 urkat細胞に強制発現させた NC1遺伝子産物及び neurosphereに存在する
NC1遺伝子産物をウェスタン法により検出した結果を示す図である。レーン 1、 4には 全細胞抽出液を、レーン 2、 5には細胞質画分を、レーン 3、 6には核画分を電気泳動 した。

Claims

請求の範囲
[1] 配列番号 1に記載の塩基配列全部または一部を有する DNA。
[2] 配列番号 2または配列番号 3に記載の塩基配列を有する DNA。
[3] 配列番号 4に記載のアミノ酸配列を有するペプチド。
[4] 配列番号 5に記載のアミノ酸配列を有するペプチド。
[5] 配列番号 6に記載のアミノ酸配列を有するペプチド。
[6] 請求項 3— 5の 、ずれかに記載のペプチドを抗原として得られた抗体。
[7] 抗体の種類がポリクローナル抗体である請求項 6に記載の抗体。
[8] 抗体の種類がモノクローナル抗体である請求項 6に記載の抗体。
[9] 請求項 1一 2に記載の DNA、請求項 3— 5に記載のペプチド、及び請求項 6— 8に記 載の抗体力 なる群より選ばれる少なくとも 1種を用いた神経幹細胞 Z前駆細胞の検 出方法。
[10] 請求項 9に記載の検出方法を用いた、神経分ィ匕因子または神経分ィ匕抑制因子とし て機能する薬剤をスクリーニングする方法。
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