JP2005087018A - 新規な神経幹細胞マーカー - Google Patents
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Abstract
【課題】 複数の細胞種から構成される組織或いは細胞集団から神経幹細胞／前駆細胞を検出する方法及びそれを用いて神経分化因子等として機能する薬剤をスクリーニングする方法を提供すること。
【解決手段】 ＮＣ１遺伝子が未分化な段階の神経幹細胞で発現が高く、分化に伴って発現が低減することを見出した。ＮＣ１遺伝子及びその遺伝子産物（ＮＣ１蛋白質）、あるいはそれらに由来する塩基配列、アミノ酸配列、さらには抗体等を用いることにより、様々な方法で神経幹細胞／前駆細胞を検出することが可能となり、神経分化因子等として機能する薬剤の新たなスクリーニング法が提供された。
【選択図】 なし
【解決手段】 ＮＣ１遺伝子が未分化な段階の神経幹細胞で発現が高く、分化に伴って発現が低減することを見出した。ＮＣ１遺伝子及びその遺伝子産物（ＮＣ１蛋白質）、あるいはそれらに由来する塩基配列、アミノ酸配列、さらには抗体等を用いることにより、様々な方法で神経幹細胞／前駆細胞を検出することが可能となり、神経分化因子等として機能する薬剤の新たなスクリーニング法が提供された。
【選択図】 なし
Description
本発明は、複数の細胞種から構成される組織或いは細胞集団から神経幹細胞／前駆細胞を検出する方法に関する。また本発明は、複数の細胞種から構成される組織或いは細胞集団に対して分化を誘導する過程または操作を施した時に神経幹細胞／前駆細胞の形質を維持させる、あるいは分化した神経細胞の集団に対して神経幹細胞／前駆細胞を誘導することが可能な薬剤、操作等のスクリーニング法に関する。
従来、損傷を受けた中枢神経系は、神経機能を司るニューロン自身に分裂能がないために機能修復が不可能であると考えられていた。しかし、近年、成体・成人の中枢神経系においても自己複製能、多分化能ともに有する神経幹細胞が存在することが明らかになり、中枢神経系においても幹細胞から機能する細胞、組織を分化させることにより損傷された組織、臓器を補完する、いわゆる再生医療の可能性が現実的なものとなってきた（非特許文献１）。また、神経幹細胞が見出されたことにより、神経幹細胞に作用して、ニューロンやグリアなどの機能する神経細胞に分化させる薬剤をスクリーニングすることも可能となった（非特許文献２）。
脊髄損傷をはじめパーキンソン病やアルツハイマー病等の中枢神経系の疾患に対する治療法は様々なものが試みられているが、これらの疾患を完治できる治療法は、現在のところ見出されていない。しかし、中枢神経系に対する再生医療や神経幹細胞から機能する神経細胞への分化を誘導する薬剤は中枢神経系の疾患の根本的な治療法をもたらすことになるが、これらのことを可能にするためには、何らかのマーカーを用いて神経幹細胞を分離することが必須である。中枢神経系においてはＮｅｓｔｉｎやＭｕｓａｓｈｉ１、α−チューブリン等の神経幹細胞マーカー遺伝子が既に同定されている（非特許文献３及び４）。これらの遺伝子を用いることにより神経幹細胞／前駆細胞を同定することは基本的には可能であるが、各遺伝子ともマーカーとしての機能に一長一短がある。
Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｂ．Ａ． ｅｔ ａｌ． (１９９２) Ａ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ＥＧＦ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｓｔｒｉａｔａｌ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ． Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １２：４５６５−７４
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本発明の目的は、新たな神経幹細胞マーカーを見い出して、複数の細胞種から構成される組織或いは細胞集団から神経幹細胞／前駆細胞を検出する方法、さらにはそれを選別する方法を提供することにある。
上記課題を解決するために、本発明者らはＮＣ１遺伝子に注目した。ＮＣ１は、家族性持続性過インスリン性低血糖症（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎｅｍｉｃ ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ ｏｆ ｉｎｆａｎｃｙ；ＰＨＨＩ）患者の膵臓に特異的に発現している遺伝子として見出されたものであるが、正常組織においては、脳で特異的に発現している遺伝子であることが示されている。本発明者らはさらに詳細にＮＣ１遺伝子の機能を検討し、以下に述べる方法によりこの遺伝子が神経幹細胞／前駆細胞の検出手段として機能することを明らかにした。
神経幹細胞は、増殖し継代を繰り返すことができる（自己複製能）と同時に、ニューロンやグリア細胞等の中枢神経系を構成する細胞を作り出すことのできる（多分化能）未分化な神経系の細胞として定義される。神経幹細胞／前駆細胞の選択的培養法（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ法）はＷｅｉｓｓらによって確立されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５，１７０７（１９９２））。Ｗｅｉｓｓらの方法は、マウス胎生期脊髄や線条体より得た神経幹細胞／前駆細胞を含む中枢神経系の細胞群をＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）またはＦＧＦ２（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２）を加えた無血清培地で培養すると多くの細胞は無血清の環境下で障害されるが、神経幹細胞／前駆細胞はこの培養条件で増殖し細胞塊（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）を形成して浮遊するというものである。
本発明者らはヒト胎児の脊髄及び前脳から調製した細胞からｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを形成させ、それを血清存在下で培養することによりニューロンやグリア細胞に分化させる系を確立している。この系を用いてＮＣ１遺伝子の発現を検討したところ、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅの状態、即ち神経幹細胞／前駆細胞ではその発現は高く、ニューロンやグリア細胞への分化にともなって発現が低減することを見出した。このことから、ＮＣ１遺伝子の発現を指標に神経幹細胞／前駆細胞を検出し、それを選別することが可能であると考えられる。したがって、新たな神経幹細胞マーカーとしてＮＣ１遺伝子を利用する妥当性が示されたことになり、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、ＮＣ１遺伝子の発現を検出するために用いることのできる配列番号１〜３の配列を有するＤＮＡに関する。
また、本発明は、ＮＣ１遺伝子産物と特異的に反応し、ＮＣ１遺伝子の発現を検出するために用いることのできる抗体のエピトープとなる配列番号４〜６のペプチドに関する。
さらに本発明は、上記のＤＮＡ、またはペプチド、またはその両方を用いてＮＣ１遺伝子の発現を検出する方法及びＮＣ１遺伝子の発現を指標に神経分化因子等として機能する薬剤をスクリーニングする方法に関する。
また、本発明は、ＮＣ１遺伝子産物と特異的に反応し、ＮＣ１遺伝子の発現を検出するために用いることのできる抗体のエピトープとなる配列番号４〜６のペプチドに関する。
さらに本発明は、上記のＤＮＡ、またはペプチド、またはその両方を用いてＮＣ１遺伝子の発現を検出する方法及びＮＣ１遺伝子の発現を指標に神経分化因子等として機能する薬剤をスクリーニングする方法に関する。
本発明のＮＣ１遺伝子及びＮＣ１タンパク質は神経系の細胞の分化過程に関与していると考えられ、神経幹細胞／前駆細胞を検出、選別できる神経幹細胞マーカーとして応用することが期待される。
本発明において対象とする神経幹細胞／前駆細胞は、試験管内または生体内でニューロンやグリア細胞等の機能を有する神経細胞に分化するものであれば動物種、形態、発生段階等特に限定されるものではないが、望ましくは哺乳動物、さらに臨床応用上の観点からヒト由来であることが望ましい。
ある組織や細胞等に目的の遺伝子が発現していることを検出する方法として例えばノーザン法がある。ＮＣ１遺伝子が神経幹細胞／前駆細胞で高い発現を示すことから、ノーザン法を用いて例えば配列番号１に記載されている塩基配列をプローブとして生体組織あるいは複数の細胞種から成る細胞集団において神経幹細胞／前駆細胞を検出することが可能である。プローブとして用いるＤＮＡはこの塩基配列のものに限定されるものではなく、ＮＣ１遺伝子由来のｍＲＮＡを特異的に認識するものであれば全てプローブとして利用することができる。
プローブの標識物質としては３２Ｐ、３５Ｓ等の放射性物質やアルカリ性ホスファターゼ、ホースラディッシュ・パーオキシダーゼ等の酵素、あるいはフルオロセイン・イソチオシアネート等の蛍光物質があるが、特に限定されるものではない。プローブの標識方法も酵素的に結合させる方法、化学的に結合させる方法、さらに（実施例１）で用いたような試験管内転写系による方法等があるが、特にこれらの方法に限定されるものではない。
また、目的の遺伝子が発現していることを検出する方法もノーザン法に限定されるものではなく、例えばＲＴ−ＰＣＲやプライマー・イクステンション法等によっても同様のことを行うことができる。この場合、配列番号２及び３に記載されている塩基配列をプライマーとして用いることができるが、これらに限定されるものではなく、ＮＣ１遺伝子由来の塩基配列と見なされる塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅する、あるいはＮＣ１遺伝子の転写産物を特異的に認識するものであれば全てプライマーとして利用することができる。
また、ある細胞に目的のタンパク質が存在することを検出する方法として例えばウェスタン法があるが、ＮＣ１遺伝子の遺伝子産物と特異的に反応する抗体を用いて生体組織あるいは複数の細胞種から成る細胞集団において神経幹細胞／前駆細胞を検出することが可能である。このような抗体を作製するためには抗原となる蛋白質またはペプチドを作製する必要がある。ＮＣ１遺伝子産物は２４７アミノ酸から成る蛋白質であるが、抗原となる蛋白質を作製することは遺伝子工学的手法を用いるとしても作製工程が若干複雑になる。そこで本発明者らは、作製の容易なペプチドを抗原として用いることとし、アミノ酸の疎水性度や塩基性度等からエピトープとなりうる可能性のある配列として配列番号４〜６に記載されているアミノ酸配列を選択した。ただし、ＮＣ１遺伝子産物と反応する抗体を作製するための抗原としては、ここで記載したペプチドに限定されるものではなく、２４７アミノ酸から成るＮＣ１遺伝子産物の全部または一部を用いてもよい。さらに抗原の作製や精製を容易にするために、タグ配列として機能するＦＬＡＧやＭｙｃペプチドのようなＮＣ１遺伝子産物以外のアミノ酸配列を含む蛋白質またはペプチドを抗原とすることも可能である。また、本発明で抗原として用いたペプチドはペプチド合成装置を用いて固相法により合成したが、合成の方法や形態、装置等は特に限定されない。
上記ＮＣ１遺伝子産物と反応する抗体としては特に限定されず、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の作製方法としては、従来公知の方法を使用することができる。
目的のタンパク質が存在することを検出する方法としてウェスタン法の他にも組織免疫染色や免疫沈降法等があるが、このような方法によってもＮＣ１遺伝子産物を認識する抗体を用いて生体組織あるいは複数の細胞種から成る細胞集団において神経幹細胞／前駆細胞を検出することが可能である。
本発明による神経幹細胞／前駆細胞の検出方法を利用することにより、例えば次のような方法で神経分化因子あるいは神経分化抑制因子等として機能する薬剤をスクリーニングする方法が提供される。
神経幹細胞／前駆細胞を含むｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅは血清等の刺激によりニューロンやグリア細胞等の神経細胞に分化する。このような神経細胞を分化させる培養系に神経分化因子あるいは神経分化抑制因子等として機能する薬剤の候補となる物質、あるいはそれらが含まれる可能性のある抽出物等を添加し、本発明による検出法を用いて培養系に含まれる神経幹細胞の数、あるいは神経幹細胞マーカーであるＮＣ１遺伝子の発現の強弱等を指標に目的の活性を有する薬剤をスクリーニングすることができる。神経細胞を分化させる培養系としてはｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅの系が最も適当であるが、分化に伴ってＮＣ１遺伝子の発現が変化するような培養系であれば特に限定されるものではない。また、神経分化因子あるいは神経分化抑制因子等として機能する薬剤の候補となる物質、あるいはそれらが含まれる可能性のある抽出物等としては、化学的に合成された化合物、微生物や培養細胞の培養液、生物の個体あるいは組織の抽出物等が考えられるが特に限定されるものではない。
以下に実施例をあげて本発明をより具体的に説明するが、その要旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない
（実施例１）ノーザン法によるＮＣ１遺伝子発現の検出
ノーザン法によりＮＣ１遺伝子の発現を検出するために以下に述べる実験を行った。
ノーザン法によりＮＣ１遺伝子の発現を検出するために以下に述べる実験を行った。
（１）検出用プローブの調製
遺伝子発現の検出に用いるプローブは、ＮＣ１遺伝子に相当するＤＮＡ断片を組み込んだベクターを用いた試験管転写系により作製した。具体的には、以下に示す方法によった。プライマーとして配列番号２に記載されている塩基配列及び配列番号３に記載されている塩基配列にＸｈｏＩ部位を付加したオリゴヌクレオチドを用いた。鋳型はＣＬＯＮＴＥＣＨ社製のヒト胎児ｃＤＮＡライブラリーの一部を熱処理し、遠心により残渣を沈殿させた上清を用いた。上記プライマーと鋳型を用い、ＰＣＲによりＮＣ１遺伝子特異的配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これをＸｈｏＩで切断した後、ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製 ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ）にサブクローニングした。このベクターにはプローブ断片として配列番号１に記載されている塩基配列が含まれることになる。このベクターを用いて試験管内転写系によりＤＩＧ−１１−ＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）標識ＲＮＡプローブを作製した。
遺伝子発現の検出に用いるプローブは、ＮＣ１遺伝子に相当するＤＮＡ断片を組み込んだベクターを用いた試験管転写系により作製した。具体的には、以下に示す方法によった。プライマーとして配列番号２に記載されている塩基配列及び配列番号３に記載されている塩基配列にＸｈｏＩ部位を付加したオリゴヌクレオチドを用いた。鋳型はＣＬＯＮＴＥＣＨ社製のヒト胎児ｃＤＮＡライブラリーの一部を熱処理し、遠心により残渣を沈殿させた上清を用いた。上記プライマーと鋳型を用い、ＰＣＲによりＮＣ１遺伝子特異的配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。これをＸｈｏＩで切断した後、ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製 ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ）にサブクローニングした。このベクターにはプローブ断片として配列番号１に記載されている塩基配列が含まれることになる。このベクターを用いて試験管内転写系によりＤＩＧ−１１−ＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）標識ＲＮＡプローブを作製した。
（２）神経幹細胞／前駆細胞の培養と分化誘導
ヒト胎児前脳及び脊髄から組織片を採取し、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ培養法（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｂ．Ａ． ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １２：４５６５−７４；Ｖｅｓｃｏｖｉ，Ａ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｎｅｕｒｏｎ １１：９５１−６６； Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｂ．Ａ． ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ，Ｓ．，（１９９６） Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ． １７５：１−１３）を用い、ヒト神経幹細胞／前駆細胞から成るｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを培養した。培養法の詳細は金村らの方法（Ｋａｎｅｍｕｒａ，Ｙ． ｅｔ ａｌ．， （２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ． ６９：８６９−７９）に従った。
ヒト胎児前脳及び脊髄から組織片を採取し、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ培養法（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｂ．Ａ． ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １２：４５６５−７４；Ｖｅｓｃｏｖｉ，Ａ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｎｅｕｒｏｎ １１：９５１−６６； Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｂ．Ａ． ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ，Ｓ．，（１９９６） Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ． １７５：１−１３）を用い、ヒト神経幹細胞／前駆細胞から成るｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを培養した。培養法の詳細は金村らの方法（Ｋａｎｅｍｕｒａ，Ｙ． ｅｔ ａｌ．， （２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ． ６９：８６９−７９）に従った。
底面積７５ｃｍ２の細胞培養用フラスコあたり３×１０６個の細胞を４日間前培養した後、遠心し、レチノイン酸及び１％ウシ胎児血清を添加した培地に再懸濁した。培養開始後７日目に新鮮な培地に交換し、１４日目まで培養を続けた細胞を分化誘導群Ａとした。また、同様に４日間の前培養を行った後、ウシ胎児血清の最終濃度を１０％にした培地中で細胞を増殖させ、２回の継代を経てコンフルーエントに達するまで培養を続けた細胞を分化誘導群Ｂとした。
（３）ノーザン法
ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを構成する細胞、分化誘導群Ａ及びＢから全ＲＮＡを抽出し、その１μｇを１％ホルムアミドを含有するアガロースゲルに展開した後、ナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）に転写した。ＲＮＡを転写したメンブレンと（１）で作製した標識ＲＮＡプローブをＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）中で６８℃１晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後メンブレンを洗浄し、Ａｎｔｉ−Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−ＡＰ、Ｆａｂ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）と反応させ、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）により検出を行った。
ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを構成する細胞、分化誘導群Ａ及びＢから全ＲＮＡを抽出し、その１μｇを１％ホルムアミドを含有するアガロースゲルに展開した後、ナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）に転写した。ＲＮＡを転写したメンブレンと（１）で作製した標識ＲＮＡプローブをＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）中で６８℃１晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後メンブレンを洗浄し、Ａｎｔｉ−Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−ＡＰ、Ｆａｂ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）と反応させ、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）により検出を行った。
（４）結果
上記（１）〜（３）の材料と方法によりヒト神経幹細胞／前駆細胞及び分化を誘導した細胞におけるＮＣ１遺伝子の発現を検討した。図１はその解析結果を示したものである。ヒト胎児組織から調製したｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅは神経幹細胞／前駆細胞から成る。また、分化誘導群Ａはニューロンの形質を有するチューブリンΒIII陽性細胞及びアストロサイトの形質を有するＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）陽性細胞から成り、分化誘導群Ｂではほぼすべての細胞がＧＦＡＰ陽性細胞から構成される。これらの培養系におけるＮＣ１遺伝子の発現は、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅでは顕著に高く、分化誘導群Ａ及びＢではともに低い発現しか見られなかった（図１）。この結果は、ＮＣ１遺伝子の発現が神経幹細胞／前駆細胞で高く、ニューロンやアストロサイトへの分化に伴って発現が低下することを示すものである。このようにＮＣ１遺伝子が神経幹細胞／前駆細胞で特異的に高い発現を示すことから、この遺伝子を神経幹細胞マーカーとして応用できる可能性が示された。
上記（１）〜（３）の材料と方法によりヒト神経幹細胞／前駆細胞及び分化を誘導した細胞におけるＮＣ１遺伝子の発現を検討した。図１はその解析結果を示したものである。ヒト胎児組織から調製したｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅは神経幹細胞／前駆細胞から成る。また、分化誘導群Ａはニューロンの形質を有するチューブリンΒIII陽性細胞及びアストロサイトの形質を有するＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）陽性細胞から成り、分化誘導群Ｂではほぼすべての細胞がＧＦＡＰ陽性細胞から構成される。これらの培養系におけるＮＣ１遺伝子の発現は、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅでは顕著に高く、分化誘導群Ａ及びＢではともに低い発現しか見られなかった（図１）。この結果は、ＮＣ１遺伝子の発現が神経幹細胞／前駆細胞で高く、ニューロンやアストロサイトへの分化に伴って発現が低下することを示すものである。このようにＮＣ１遺伝子が神経幹細胞／前駆細胞で特異的に高い発現を示すことから、この遺伝子を神経幹細胞マーカーとして応用できる可能性が示された。
（実施例２）
ウェスタン法によるＮＣ１遺伝子産物の検出
ウェスタン法によりＮＣ１遺伝子産物を検出するために以下の実験を行った。
ウェスタン法によるＮＣ１遺伝子産物の検出
ウェスタン法によりＮＣ１遺伝子産物を検出するために以下の実験を行った。
（１）ＮＣ１遺伝子産物に対する抗体の作製
ＮＣ１遺伝子がコードするタンパクの部分ペプチドを抗原として、ＮＣ１遺伝子産物に反応する抗体を作製した。実際にはＮＣ１遺伝子産物の部分ペプチドである配列番号４に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドを合成し、ウサギに免疫して抗血清を得た。この抗血清が元のペプチドと１万倍以上のタイターで反応することをＥＬＩＳＡで確認し、ＮＣ１遺伝子産物に対する抗体を含む抗血清とした。
ＮＣ１遺伝子がコードするタンパクの部分ペプチドを抗原として、ＮＣ１遺伝子産物に反応する抗体を作製した。実際にはＮＣ１遺伝子産物の部分ペプチドである配列番号４に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドを合成し、ウサギに免疫して抗血清を得た。この抗血清が元のペプチドと１万倍以上のタイターで反応することをＥＬＩＳＡで確認し、ＮＣ１遺伝子産物に対する抗体を含む抗血清とした。
（２）供試細胞と細胞抽出液の調製
（実施例１）でＮＣ１遺伝子の発現が検出されたヒト胎児神経組織から調製したｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅに対して、（１）で作製した抗血清を用いたウェスタン法によるＮＣ１遺伝子産物の検出を検討した。またＮＣ１遺伝子の発現が検出されなかったＪｕｒｋａｔ細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞にＮＣ１遺伝子発現ベクターを導入した形質転換株についても同様にウェスタン法によるＮＣ１遺伝子産物の検出を試みた。これらの細胞から全細胞抽出液を調製し、さらにＮ−ＸＴＲＡＣＴキット（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて細胞質画分と核画分を調製した。
（実施例１）でＮＣ１遺伝子の発現が検出されたヒト胎児神経組織から調製したｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅに対して、（１）で作製した抗血清を用いたウェスタン法によるＮＣ１遺伝子産物の検出を検討した。またＮＣ１遺伝子の発現が検出されなかったＪｕｒｋａｔ細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞にＮＣ１遺伝子発現ベクターを導入した形質転換株についても同様にウェスタン法によるＮＣ１遺伝子産物の検出を試みた。これらの細胞から全細胞抽出液を調製し、さらにＮ−ＸＴＲＡＣＴキット（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて細胞質画分と核画分を調製した。
（３）ウェスタン法
（２）で調製した試料を９５℃で５分間加熱後ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画し、ニトロセルロースメンブランに転写した。メンブランはブロッキング液（５％スキムミルク、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するトリス緩衝液）でブロッキングした後、（１）で作製した抗血清を添加した。メンブランを洗浄した後ホースラディッシュ・パーオキシダーゼで標識した抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を反応させ、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて反応する画分を検出した。
（２）で調製した試料を９５℃で５分間加熱後ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画し、ニトロセルロースメンブランに転写した。メンブランはブロッキング液（５％スキムミルク、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するトリス緩衝液）でブロッキングした後、（１）で作製した抗血清を添加した。メンブランを洗浄した後ホースラディッシュ・パーオキシダーゼで標識した抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を反応させ、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて反応する画分を検出した。
（４）結果
上記（１）〜（３）の材料と方法により、作製した抗血清によるＮＣ１遺伝子産物の検出を検討した。この抗血清はＮＣ１遺伝子を発現していないＪｕｒｋａｔ細胞とは反応しない（図２ レーン１）が、Ｊｕｒｋａｔ細胞にＮＣ１遺伝子を強制発現させた形質転換株（Ｊｕｒｋａｔ−ＮＣ１）とは反応し、ＮＣ１遺伝子産物に相当するバンドが検出された（図２ レーン２）。これは（１）で作製した抗血清がＮＣ１遺伝子産物を認識し、少なくともウェスタン法により検出することが可能であることを示すものである
上記（１）〜（３）の材料と方法により、作製した抗血清によるＮＣ１遺伝子産物の検出を検討した。この抗血清はＮＣ１遺伝子を発現していないＪｕｒｋａｔ細胞とは反応しない（図２ レーン１）が、Ｊｕｒｋａｔ細胞にＮＣ１遺伝子を強制発現させた形質転換株（Ｊｕｒｋａｔ−ＮＣ１）とは反応し、ＮＣ１遺伝子産物に相当するバンドが検出された（図２ レーン２）。これは（１）で作製した抗血清がＮＣ１遺伝子産物を認識し、少なくともウェスタン法により検出することが可能であることを示すものである
また、ヒト胎児神経組織から調製したｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅに対してウェスタン法を行ったところ、ＮＣ１遺伝子を強制発現させたＪｕｒｋａｔ−ＮＣ１と同じ位置に抗血清と反応するバンドが検出された（図３）。さらにＪｕｒｋａｔ−ＮＣ１では細胞質画分、核画分双方に反応しているが、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅでは細胞質画分にのみ反応性が認められた。したがって、この抗血清を用いたウェスタン法によりｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ等の神経幹細胞／前駆細胞におけるＮＣ１遺伝子産物の存在を検出できる。また、全細胞抽出液だけでなく分画した抽出液とも反応することから、ＮＣ１遺伝子産物の細胞内局在性を示すことも可能である。
Claims (10)
- 配列番号１に記載の塩基配列全部または一部を有するＤＮＡ。
- 配列番号２または配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
- 配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するペプチド。
- 配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するペプチド。
- 配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するペプチド。
- 請求項３〜５のいずれかに記載のペプチドを抗原として得られた抗体。
- 抗体の種類がポリクローナル抗体である請求項６に記載の抗体。
- 抗体の種類がモノクローナル抗体である請求項６に記載の抗体。
- 請求項１もしくは２に記載のＤＮＡ、または、請求項３〜５のいずれかに記載のペプチド、または全てを用いた神経幹細胞／前駆細胞の検出方法。
- 請求項９に記載の方法のいずれか、または全てを用いた神経分化因子あるいは神経分化抑制因子として機能する薬剤をスクリーニングする方法。
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