CN110386973B - 具有多种功能的蛋白多肽及其医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有调控趋化功能和/或神经干细胞功能的SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的FAM19A1分泌蛋白和SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的FAM19A1分泌蛋白受体GPR1多肽GPR1‑ND。还涉及编码该蛋白多肽的多核苷酸，及含有多核苷酸的基因工程载体。还涉及药物组合物和商品化试剂，含有所述蛋白多肽或多核苷酸、基因工程载体和/或宿主细胞，及药物可接受的盐、载体或赋形剂。还涉及体外检测所述蛋白或多核苷酸表达水平变化的方法。还涉及所述蛋白多肽或多核苷酸用于预防、诊断或治疗中枢神经系统疾病、免疫调节和代谢疾病。还涉及以所述蛋白多肽或多核苷酸作为靶向开发化合物、抗体、多肽药物和商品化试剂。

Description

具有多种功能的蛋白多肽及其医药用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别地，本发明涉及具有多种功能的蛋白及编码其的多核苷酸、包含多核苷酸的基因工程载体、以及相应的药物组合物，本发明还涉及所述具有趋化功能并且能够调节脊椎动物中枢神经干细胞的增殖及分化的FAM19A1分泌蛋白和多核苷酸及其药物组合物在诊断、预防或治疗中枢神经系统损伤、神经炎症、退行性脑部疾病、免疫调节和干细胞增殖分化、肥胖和胰岛素抵抗、感染疾病、过敏疾病、炎症反应、移植排斥、自身免疫病等疾病中的医药用途，本发明还涉及所述FAM19A1蛋白受体GPR1的N端多肽GPR1-ND及编码其的多核苷酸、包含多核苷酸的基因工程载体、以及相应的药物组合物以及在药物和试剂的制备、疾病的预防和治疗中枢神经系统损伤、神经炎症、退行性脑部疾病、免疫调节和干细胞增殖分化、肥胖和胰岛素抵抗、感染疾病、过敏疾病、炎症反应、移植排斥、自身免疫病等疾病中的医药用途。

背景技术

神经干细胞(Neural stem cell,NSCs)具有持续分裂的能力，即自我更新能力，其可被分化成中枢神经系统的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。NSCs存在于胚胎期和成年哺乳动物的前脑(Weiss,S et al.,1996.Trends in neurosciences 19,387-393)。在哺乳动物胚胎发育过程中，多能NSCs存在于生发层中(Rushing,G.et al,2016.Frontiersinbiology 11,261-284)，这些特定的胚层区逐渐发育为成年脑中的侧脑室下区(SVZ)和海马齿状回的亚颗粒区(SGZ)(Eriksson,P.S.et al,1998.Nature medicine 4,1313-1317；Lois,C.et al.,1993.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 90,2074-2077；Morshead,C.M.et al.,1994.Neuron 13,1071-1082)。在啮齿动物中，大量的这些神经细胞从SVZ迁移到嗅球(OB)，在那里它们分化成神经细胞。持续不断的新生神经元为嗅觉信息的处理提供了可塑性并维持了它的功能(Lepousez,G.et al.,2013.Annual review ofphysiology 75,339-363.)。在SGZ区，大多数NSCs会分化成能进入内颗粒细胞层的齿状颗粒细胞，然后在整合到海马神经回路中发挥功能，有助于某些依赖海马的学习和记忆(Deng,W.et al.,2009.The Journal ofneuroscience:the official journal of the Society for Neuroscience 29,13532-13542.)。

在成人的大脑中，神经干细胞具有保持静息状态的能力，直到体内自稳失衡或者需要组织修复时才会被激活(Wang,X.et al.,2016.eNeuro 3.)。NSCs可以增殖并迁移到特定区域以取代老化的细胞，因此它们在大脑网络可塑性中具有关键的作用(Aarum,J.etal.,2003.Proceedings oftheNationalAcademy ofSciences ofthe United StatesofAmerica 100,15983-15988)。NSCs的增殖，迁移和分化很重要不仅对胚胎神经系统的发育和组织内稳态的发展很重要，对于受伤后神经系统的修复也很重要(Lindvall,O.etal.,2004.Nature medicine 10Suppl,S42-50；Okano,H.et al.,2007.Journalofneurochemistry 102,1459-1465)。在所有年龄段的哺乳动物的大脑中，新生成的NSCs可以从SVZ中被招募到附近的神经损伤区域以及一些特定区域进行分化，也称为神经发生(Lindvall,O.et al.,2004.Nature medicine 10Suppl,S42-50；Okano,H.et al.,2007.Journal ofneurochemistry 102,1459-1465)脑损伤后的神经发生对照射引起的脑缺血损伤过程中因神经细胞分裂引起的恶化具有重要的修复作用(Raber,J.et al.,2004.Annals ofneurology 55,381-389)。最近的研究表明，在成年鼠海马体创伤性脑损伤(TBI)后，NSCs的增殖加快(Braun,H.et al.,2002.Journal ofneurotrauma19,975-983；Chirumamilla,S.et al.,2002.Journal ofneurotrauma 19,693-703；Dash,P.K.et al.,2001.Journal of neuroscience research 63,313-319；Gao,X.et al.,2009.Experimental neurology 219,516-523)。此外，NSCs能够补偿退行性脑部疾病的神经元从而改善神经系统的认知功能(Gonzalez,R.et al.,2016.CNS&neurologicaldisorders drug targets 15,881-886；Park,D.et al.,2012.Cell transplantation 21,365-371)。另有报道表明，出生时齿状颗粒细胞数量减少的小鼠在成年后存在认知功能障碍，其特征是海马状长期空间记忆的形成缺陷，以及在语境恐惧消退方面的表现受损(Deng,W.et al.,2009.The Journal ofneuroscience:the officialjournal oftheSociety forNeuroscience 29,13532-13542)。

细胞因子是由机体各种细胞合成分泌的具有多种生理活性和参与病理反应的小分子可溶性蛋白质。细胞因子为细胞提供相互沟通的能力，并介导复杂的多细胞行为。大量的细胞因子已经被证明参与大脑发育和中枢神经系统疾病过程中的神经干细胞的增殖、迁移和分化功能，其中包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白介素-6(IL-6)超家族，白介素-18，神经营养因子-1(NF-α1)和转变生长因子-β(TGF-β)等(Adachi,T.et al.,2005.Journal ofneuroscience research 79,608-615；Barnabe-Heider,F.et al.,2005.Neuron 48,253-265；Boulanger,L.M.2009.Neuron 64,93-109；Gregg,C.,and Weiss,S.2005.Development(Cambridge,England)132,565-578)。然而，细胞因子调节神经干细胞功能的分子机制还没有完全阐明。因此，探索新型细胞因子对揭示神经干细胞的调控机制具有重要意义。

趋化因子是一类具有趋化作用的细胞因子，可以调节机体各种细胞的迁移和定植。在机体的病毒感染、过敏性疾病、炎症反应、移植排斥、脑部疾病、自身免疫病、肿瘤转移、免疫调节、干细胞增殖分化、骨质疏松症、肥胖和胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰等心血管疾病等过程中发挥重要作用。目前，趋化因子已经成为国内外研究的热点之一。近年来，免疫疗法发生了变化，从基础向临床的转化到药物开发成为更为重要的途径。通过描述免疫系统相关趋化因子及其配体如何组织在生理和病理活动中发挥作用，提示趋化因子有强大的临床应用前景，可以用作免疫疗法的治疗靶或辅助治疗剂或主要疗法。

本发明利用人类功能基因组学数据库，生物信息学分析，分子生物学、细胞生物学及免疫学技术，从人类基因数据库中发掘具有重要生理、病理意义的新基因，为阐明疾病的发病机制、发现疾病标志物、基因组药物靶标(开发化合物、抗体、多肽药物)或基因工程药物提供基础。

基因表达及其编码产物蛋白质表达的检测方法包括反转录－聚合酶链式反应、蛋白质印迹、流式微球技术、ELISA、FACS、免疫荧光、免疫组化、免疫细胞化学等检测方法。可以应用于实验研究以及临床生理和病理疾病(中枢神经系统损伤、神经炎症、退行性脑部疾病、免疫调节和干细胞增殖分化、肥胖和胰岛素抵抗、感染疾病、过敏疾病、炎症反应、移植排斥、自身免疫病)中细胞和组织的基因表达及其编码产物蛋白质表达的检测。

具有重要生理、病理意义的基因及其编码产物蛋白质，可以作为药物靶标，开发靶向这一分子本身及其相互作用分子的化合物、抗体、多肽药物或基因工程药物和商品化试剂，应用于发病机制研究、疾病标志物的研究和临床检测，及临床的药物的治疗。

发明内容

本发明首次成功地筛选出了新的具有趋化作用并且能够调控神经干细胞功能的FAM19A1分泌蛋白，即FAM19A1(Family with sequence similarity 19(chemokine(C-Cmotif)-like),member A1)。其核酸序列在Gen-bank^TM的注册登记号为NM_001252216.1,NM_213609.3，编码133个氨基酸。本发明经蛋白表达、纯化和N端测序发现一个由FAM19A1的C端98个氨基酸构成的功能活性蛋白形式。证明FAM19A1的C端98个氨基酸构成的蛋白形式具有趋化免疫细胞的作用并且调控神经干细胞的增殖和分化。本发明包括在FAM19A1的基础上陆续得到的其它一些新的蛋白。

本发明首次筛选出GPR1为FAM19A1的功能受体，并提供了拮抗FAM19A1功能的GPR1的N端30个氨基酸构成的功能活性多肽形式,在本发明中称为GPR1-ND。GPR1核酸序列在Gen-bank^TM的注册登记号为NM_001098199.1，NM_001261452.1，NM_001261453.1，NM_001261454.1，NM_001261455.1，NM_005279.3。本发明经多肽合成和酶联免疫实验发现GPR1-ND，对FAM19A1分泌蛋白具有高亲和力。证明GPR1-ND能够中和FAM19A1分泌蛋白对神经干细胞功能的调控作用。

本发明在一方面提供了一种能够调控神经干细胞功能的蛋白。

本发明在另一方面提供了一种编码本发明的蛋白的多核苷酸。本发明在另一方面提供了一种含有本发明的多核苷酸的基因工程载体。

本发明在另一方面提供了一种对调控神经干细胞功能的蛋白发挥中和作用的多肽。

本发明在另一方面提供了一种编码本发明的多肽的多核苷酸。

本发明在另一方面提供了一种药物组合物，该药物组合物含有本发明的蛋白多肽、多核苷酸和/或基因工程载体，以及一种或多种药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明在另一方面提供了本发明的蛋白多肽或多核苷酸在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用，其中所述应用包括免疫调节和神经干细胞增殖分化调节；其中所述疾病包括中枢神经系统损伤、神经炎症、退行性脑部疾病、肥胖和胰岛素抵抗、感染疾病、过敏疾病、炎症反应、移植排斥、自身免疫病。

本发明在另一方面提供了检测待测样品中本发明的蛋白或多核苷酸的表达水平是否变化的方法。

本发明在另一方面提供了本发明的蛋白多肽或多核苷酸在制备用于研究疾病的商品化试剂中的应用，其中所述应用包括免疫调节和神经干细胞增殖分化调节；其中所述疾病包括中枢神经系统损伤、神经炎症、退行性脑部疾病、肥胖和胰岛素抵抗、感染疾病、过敏疾病、炎症反应、移植排斥、自身免疫病等疾病。

本发明在另一方面提供了以本发明的蛋白多肽或多核苷酸或本发明蛋白多肽的相互作用分子作为靶开发化合物、抗体、多肽药物和商品化试剂的应用。

根据本发明的一些实施方式，本发明提供一种蛋白，该蛋白包含：

(1)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白；或

(2)具有与(1)所述蛋白有至少80％同源性的氨基酸序列的蛋白，其功能与(1)所述蛋白的功能相同或相似或不同。

其中，如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白，为FAM19A1蛋白的C末端98个氨基酸序列，在本发明中称为FAM19A1分泌蛋白。

本发明蛋白还包括具有与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列至少80％，优选至少85％，更为优选至少90％，更进一步优选至少95％，特别优选至少98％，更为特别优选至少99％同源性(序列匹配)的序列。这些序列可以与本发明的SEQ ID NO:1所示的序列具有相同、相似或不同的生物学功能，优选具有相同或相似的功能。

在本发明的一些优选实施方式中，本发明的蛋白包含：

(1)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白；或

(2)具有与(1)所述蛋白至少90％同源性的氨基酸序列的蛋白，其功能与(1)所述蛋白的功能相同或相似或不同。

再者，根据本发明的一些实施方式，本发明还提供一种多核苷酸，该多核苷酸包含：

(1)编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多核苷酸；或

(2)具有与(1)所述多核苷酸至少80％同源性的多核苷酸，其编码的蛋白与(1)所述多核苷酸编码的蛋白具有相同或相似或不同的生物学功能。

如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为FAM19A1分泌蛋白98个氨基酸序列。本发明的多核苷酸序列可以只编码FAM19A1分泌蛋白，也可以在上述蛋白的编码序列的基础上，增加非编码序列，例如内含子、编码序列5'或3'端的非编码序列等。本发明的多核苷酸序列最好是以分离形式提供的。本发明的多核苷酸是“分离”形式的，其不仅已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开，而且已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来。

在本发明的一些实施方式中，本发明还包括具有与编码FAM19A1分泌蛋白或其片段的多核苷酸(SEQ ID NO:2)至少70％、优选至少80％、更为优选至少85％，更进一步优选至少90％、特别优选至少95％，更为特别优选至少98％同源性的多核苷酸序列。优选地，本发明的多核苷酸为与编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多核苷酸序列或其片段具有至少80％同源性的多核苷酸，该多核苷酸编码的蛋白与SEQ ID NO:1所示的蛋白具有相同或相似或不同的生物学功能。

根据本发明的一些实施方式，本发明提供一种多肽，该多肽包含：

(1)如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的多肽；或

(2)具有与(1)所述蛋白有至少80％同源性的氨基酸序列的多肽，其功能与(1)所述多肽的功能相同或相似或不同。

其中，如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的多肽，为GPR1蛋白的N端30个氨基酸序列，在本发明中称为GPR1-ND。

本发明蛋白还包括具有与SEQ ID NO:12所示氨基酸序列至少80％，优选至少85％，更为优选至少90％，更进一步优选至少95％，特别优选至少98％，更为特别优选至少99％同源性(序列匹配)的序列。这些序列可以与本发明的SEQ ID NO:12所示的序列具有相同、相似或不同的生物学功能，优选具有相同或相似的功能。

再者，根据本发明的一些实施方式，本发明还提供一种多核苷酸，该多核苷酸包含：

(1)编码SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的多核苷酸；或

(2)具有与(1)所述多核苷酸至少80％同源性的多核苷酸，其编码的蛋白与(1)所述多核苷酸编码的蛋白具有相同或相似或不同的生物学功能。

如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列为GPR1蛋白的N端30个氨基酸序列。本发明的多核苷酸序列可以只编码GPR1-ND，也可以在上述多肽的编码序列的基础上，增加非编码序列，例如内含子、编码序列5'或3'端的非编码序列等。本发明的多核苷酸序列最好是以分离形式提供的。本发明的多核苷酸是“分离”形式的，其不仅已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开，而且已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来。

在本发明的一些实施方式中，本发明还包括具有与编码GPR1-ND的多核苷酸(SEQID NO:13)至少70％、优选至少80％、更为优选至少85％，更进一步优选至少90％、特别优选至少95％，更为特别优选至少98％同源性的多核苷酸序列。优选地，本发明的多核苷酸为与编码SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的多核苷酸序列或其片段具有至少80％同源性的多核苷酸，该多核苷酸编码的蛋白与SEQ ID NO:12所示的多肽具有相同或相似或不同的生物学功能。

还有，根据本发明的一些实施方式，本发明还涉及一种基因工程载体，该基因工程载体含有编码本发明的分泌蛋白的多核苷酸。所述基因工程载体可以是普通载体、表达载体等。

另外，根据本发明的一些实施方式，本发明还提供所述FAM19A1分泌蛋白和GPR1-ND多肽在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用，其中所述应用包括免疫调节和神经干细胞增殖分化调节；其中所述疾病包括中枢神经系统损伤、神经炎症、退行性脑部疾病、肥胖和胰岛素抵抗、感染疾病、过敏疾病、炎症反应、移植排斥、自身免疫病等疾病。

本发明通过实验证明，本发明的FAM19A1分泌蛋白具有与趋化因子相当的趋化活性，在多种疾病的预防和/或治疗方面具有广阔的应用前景。

本发明通过实验证明，本发明的兔来源抗FAM19A1分泌蛋白的多克隆抗体在Western Blot和ELISA中能特异性的识别真核FAM19A1分泌蛋白，对以后进行FM19A1分泌蛋白相关的检测提供了必要的技术手段。

本发明通过实验证明，本发明的兔来源抗FAM19A1分泌蛋白的多克隆抗体在免疫细胞化学中能特异性的识别HEK293细胞过表达的外源性FAM19A1蛋白，为以后在临床和科研中通过免疫组织化学的方法检测FAM19A1蛋白的存在提供方法。

本发明通过实验证明，本发明的兔来源的抗FAM19A1分泌蛋白的多克隆抗体和山羊来源的抗FAM19A1分泌蛋白的多克隆抗体组合可以用作微球检测系统对FAM19A1分泌蛋白的识别灵敏度可达32pg/ml，对于使用微球检测系统检测各个来源的微量的FAM19A1蛋白提供技术手段。

本发明通过实验证明，本发明FAM19A1分泌蛋白在脑组织高表达，可由神经干细胞分泌，并能够抑制神经干细胞的增殖和自我更新，并且促进神经干细胞往神经元分化，抑制神经干细胞向星形胶质细胞分化。说明FAM19A1分泌蛋白可以作用于神经干细胞，为发现更多FAM19A1分泌蛋白的靶向细胞以及靶向疾病提供新的提示。

另外，根据本发明的一些实施方式，本发明还提供所述FAM19A1分泌蛋白和GPR1-ND多肽在制备用于研究疾病的商品化试剂中的应用，其中所述应用包括免疫调节和神经干细胞增殖分化调节；其中所述疾病包括中枢神经系统损伤、神经炎症、退行性脑部疾病、肥胖和胰岛素抵抗、感染疾病、过敏疾病、炎症反应、移植排斥、自身免疫病等疾病。

另外，根据本发明的一些实施方式，本发明还提供一种体外检测来自待测者的样品中本发明所述的蛋白或多核苷酸的表达水平的方法，该方法为反转录－聚合酶链式反应、蛋白质印迹或ELISA、FACS、免疫荧光、免疫组化、免疫细胞化学检测方法。

附图说明

图1显示利用Western Blotting检测FAM19A1分泌蛋白的表达结果。加入Anti-His抗体作用后，再加入IRDyeTM 800标记的抗鼠IgG二抗反应，经Odyssey Imaging System扫描,第2泳道在10kD处有一条清晰条带。

图2显示纯化后的FAM19A1分泌蛋白样品经12.5％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。图中，第1泳道为BSA；第2泳道为FAM19A1分泌蛋白。

图3显示FAM19A1分泌蛋白N端测序结果。经纯化获得的FAM19A1分泌蛋白在10kD处条带的N端10个氨基酸的测序图。

图4显示纯化后的FAM19A1(SEQ ID NO:1)原核蛋白样品经12.5％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。图中，第1泳道为BSA；第2泳道为FAM19A1原核蛋白。

图5显示FAM19A1分泌蛋白上清液对PBMC的趋化作用。1，2，3，4分别为过表达pcDNA3.1空载体的细胞上清，过表达pcMV-SPORT6的细胞表达上清，CXCL12，过表达FAM19A1的细胞表达上清。其中过表达pcDNA3.1空载体的细胞表达上清为对照，可见FAM19A1具有一定的趋化作用。

图6显示纯化的FAM19A1(SEQ ID NO:1)原核蛋白对PBL和PBM均具有趋化作用。图6A显FAM19A1原核蛋白对PBL的趋化作用，其中CXCL12为阳性对照，可见FAM19A12000ng/ml对PBL的趋化指数大于2。图6B显示FAM19A1原核蛋白对单核细胞的趋化作用，其中CXCL12为阳性对照，可见FAM19A12ng/ml对单核细胞的趋化指数大于2。

图7显示Anti-His标签抗体识别FAM19A1-Myc-His的情况。其中，第1泳道为分子量标准，第2、3、4泳道分别为过表达pcDNA3.1空载体的293T细胞上清对照，FAM19A1-Myc-His的293T上清分泌蛋白，以及FAM19A5-Myc-His的293T上清分泌蛋白，经Anti-His标签抗体做免疫印迹实验证实过表达真实有效。

图8显示纯化的兔抗FAM19A1的多克隆抗体识别293T细胞上清中超表达的FAM19A1-Myc-his的情况。其中，第1、2、3泳道分别为过表达pcDNA3.1空载体的细胞上清对照，过表达FAM19A1-myc-his的293T上清分泌蛋白，以及过表达FAM19A5-Myc-His的293T细胞上清分泌蛋白，可见纯化后兔血清能够特异性识别FAM19A1分泌蛋白。

图9显示流式细胞术对已知浓度0-64000pg/ml的FAM19A1(SEQ ID NO:1)原核蛋白检测直方图。

图10显示FAM19A1(SEQ ID NO:1)原核蛋白的双抗夹心微球检测系统标准曲线。

图11显示双抗夹心微球检测pcDNA3.1、pcDNA3.1-FAM19A5和pcDNA3.1-FAM19A1转染293T细胞表达上清。1、2、3分别为过表达pcDNA3.1空载体的细胞上清对照，过表达FAM19A5-myc-his的293T上清，以及过表达FAM19A1-Myc-His的293T细胞上清。结果显示：FAM19A1的双抗夹心微球检测系统能够特异性的结合FAM19A1蛋白。

图12显示real-time PCR检测FAM19A1在人类各组织的表达谱。结果显示：FAM19A1在脂肪、脑中高表达，胰腺、肺、心脏、肾、胎盘、骨髓、白细胞、胸腺、扁桃体、胎肝、淋巴结中可见表达，其余组织未见明显表达。

图13显示real-time PCR检测FAM19A1在小鼠各组织的表达谱。结果显示：FAM19A1在小鼠脂肪、脑中高表达，其他组织表达较低。

图14显示双抗夹心微球检测FAM19A1在小鼠各组织的表达谱。结果显示：FAM19A1在小鼠脑中表达较高，心脏、肺、肾、小肠、结肠、胃中可见表达。其余组织表达较低。

图15显示real-time PCR和微球检测FAM19A1在小鼠脑各分区表达谱。图15A结果显示FAM19A1的mRNA水平在海马中表达较高，大脑皮层和小脑表达较低。图15B显示FAM19A1的蛋白质表达水平在海马和皮层均较高，小脑表达较低。

图16显示兔抗FAM19A1的多克隆抗体识别脂肪组织中FAM19A1的免疫组织化学结果。可见，FAM19A1在脂肪细胞中高表达。

图17显示兔抗FAM19A1的多克隆抗体识别小鼠脑中FAM19A1的免疫组织化学结果。可见，FAM19A1在海马中特异性高表达。

图18显示real-time PCR和微球检测FAM19A1在小鼠各发育阶段的表达谱。图18A结果显示FAM19A1的mRNA表达水平从胚胎期的12.5天开始上升，在出生后1天和7天表达最高，到达峰值，然后在第8周表达可见降低。图18B显示FAM19A1的蛋白质表达水平同样从胚胎期的12.5天开始上升，在出生后7天表达最高，到达峰值，然后在第8周表达可见降低。可见，FAM19A1可能与大脑发育有关。

图19展示了通过利用组织免疫荧光来检测FAM19A1在神经干细胞的表达。图19A结果显示FAM19A1可以与神经干细胞标志性物nestin在胚胎18天的小鼠脑海马区共定位。图19B结果显示，FAM19A1可以与神经干细胞标志性物nestin在成年小鼠脑VZ/SVZ区共定位。可见FAM19A1在神经干细胞中表达。

图20展示了通过利用细胞免疫荧光来检测FAM19A1在神经干细胞的表达。结果显示：FAM19A1可以与神经干细胞标志性物nestin共定位，可见FAM19A1在神经干细胞中表达。

图21显示克隆形成实验检测FAM19A1(SEQ ID NO:1)原核蛋白对神经干细胞自我更新能力的影响。结果显示：FAM19A1可以抑制二代神经球的大小和个数，可见FAM19A1可以抑制神经干细胞的自我更新。

图22显示CCK8检测FAM19A1(SEQ ID NO:1)原核蛋白对神经干细胞增殖能力的影响。结果显示：FAM19A1原核蛋白可以抑制神经干细胞的增殖。

图23显示细胞免疫荧光检测FAM19A1(SEQ ID NO:1)原核蛋白对神经干细胞分化能力的影响。图23代表未加入FAM19A1原核蛋白和加入200nM FAM19A1原核蛋白之后神经干细胞分化结果。结果显示：FAM19A1原核蛋白可以促进神经干细胞分化为神经元，抑制神经干细胞分化成星形胶质细胞。神经元标志分子MAP2染为红色，星形胶质细胞标志分子GFAP染为绿色。

图24展示了通过利用real-time PCR来检测FAM19A1(SEQ ID NO:1)原核蛋白对神经干细胞分化能力的影响。结果显示：FAM19A1原核蛋白可以促进神将干细胞分化为神经元，抑制神经干细胞分化成星形胶质细胞。

图25展示了通过利用Western印迹法来检测FAM19A1(SEQ ID NO:1)原核蛋白对神经干细胞分化能力的影响。结果显示：FAM19A1原核蛋白可以促进神将干细胞分化为神经元，抑制神经干细胞分化成星形胶质细胞。

图26显示FAM19A1分泌蛋白可以与GPR1特异性的结合饱和曲线。X轴代表GPR1受体表达细胞裂解液的浓度(mg/ml)，Y轴代表FAM19A1-GPR1特异性结合的放射性。结果显示：随着GPR1浓度的增大，FAM19A1-GPR1复合物的量随之增加，但到达一定限度时，FAM19A1-GPR1复合物的量不再增加，说明GPR1的量已经足够结合反应体系中所有的FAM19A1。通过计算FAM19A1与GPR1的结合常数Kd＝0.014nM。

图27显示不同已知细胞因子和FAM19A1分泌蛋白自身与FAM19A1-GPR1结合复合物竞争性结合GPR1的曲线。结果显示：FAM19A1分泌蛋白随着浓度的升高，可以比较完全的竞争性结合GPR1，Chemerin则可以部分的竞争性结合GPR1，说明在反映体系中FAM19A1分泌蛋白的结合力较Chemerin稍强，而FAM19A5则不能竞争性结合GPR1。

图28显示ELISA检测GPR1的N端肽(GPR1-ND)以及三段胞外区肽(GPR1-ED1,GPR1-ED2,GPR1-ED3)与FAM19A1分泌蛋白的结合能力。结果显示：GPR1-ND肽(SEQ ID NO:12)和FAM19A1的结合最强。

图29显示ELISA检测GPR1的N端肽(GPR1-ND)以及三段胞外区肽(GPR1-ED1,GPR1-ED2,GPR1-ED3)与FAM19A1分泌蛋白结合的特异性。结果显示：GPR1-ND肽(SEQ ID NO:12)和FAM19A1分泌蛋白的结合最强。与FAM19A5分泌蛋白结合相比，GPR1-ND肽特异性结合FAM19A1分泌蛋白。

图30显示克隆形成实验检测GPR1-ND肽对FAM19A1分泌蛋白抑制神经干细胞自我更新能力的影响。结果显示：GPR1-ND肽(SEQ ID NO:12)可以中和FAM19A1分泌蛋白对神经干细胞自我更新的抑制作用。

图31显示CCK8检测GPR1-ND肽对FAM19A1分泌蛋白抑制神经干细胞增殖能力的影响。结果显示：GPR1-ND肽(SEQ ID NO:12)可以中和FAM19A1分泌蛋白对神经干细胞增殖的抑制作用。

图32显示real-time PCR检测GPR1-ND肽对FAM19A1分泌蛋白调控神经干细胞分化能力的影响。结果显示：GPR1-ND肽(SEQ ID NO:12)可以中和FAM19A1分泌蛋白对神经干细胞分化的调控作用。

图33显示Westernblotting检测GPR1-ND肽对FAM19A1分泌蛋白调控神经干细胞分化能力的影响。结果显示：GPR1-ND肽(SEQ ID NO:12)可以中和FAM19A1分泌蛋白对神经干细胞分化的调控作用。

具体实施方式

以下针对前述的发明主题就一些具体实施方式进行较为详细的说明。然而应该理解，这些说明以及后面所列的实施例不是用来限制本发明权利要求的范围。

本发明构建了FAM19A1真核表达质粒pcDNA3.1-FAM19A1(SEQ ID NO:4)-myc-his以及293T真核表达系统，经表达、纯化，获得分泌表达的FAM19A1重组蛋白。进一步通过SDS-PAGE分离获得FAM19A1蛋白条带，进行N端测序，得到一种FAM19A1分泌蛋白序列形式，为本发明通过实验在国际上的首次发现。同时，本发明构建了该分泌蛋白序列SEQ ID NO:1的原核表达质粒，并进行原核表达得到FAM19A1原核蛋白(SEQ ID NO:1)。

本发明合成了GPR1的N端30个氨基酸组成的多肽，在本发明中称为GPR1-ND(SEQID NO:12)，进一步证明GPR1-ND对FAM19A1调控神经干细胞增殖和分化的功能具有中和作用，为本发明通过实验在国际上的首次发现。

在本发明所提供的蛋白中，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白，为FAM19A1蛋白的C末端98个氨基酸序列(FAM19A1核酸序列在Gen-bank^TM的注册登记号为NM_001252216.1，NM_213609.3，编码133个氨基酸)；FAM19A1蛋白的C末端98个氨基酸序列在本发明中称为FAM19A1分泌蛋白。在本发明所提供的多肽中，SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的多肽，为GPR1的N末端30个氨基酸序列(GPR1核酸序列在Gen-bank^TM的注册登记号为NM_001098199.1，NM_001261452.1，NM_001261453.1，NM_001261454.1，NM_001261455.1，NM_005279.3，编码355个氨基酸)；GPR1蛋白的N末端30个氨基酸序列在本发明中称为GPR1-ND。本发明的蛋白和多肽还包括具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的同源性(序列匹配)超过80％，优选超过85％，更为优选超过90％，更进一步优选超过95％，特别优选超过98％，更为特别优选超过99％的序列。这些序列可以与本发明的SEQ ID NO:1或SEQID NO:12所示的序列具有相同、相似或不同的生物学功能，优选具有相同或相似的功能。

本发明FAM19A1分泌蛋白或其片段或GPR1-ND可以是天然的、合成的、半合成的、或者重组产生。本领域技术人员能够知道，可以直接使用编码本发明的蛋白或多肽的多核苷酸序列产生本发明的FAM19A1分泌蛋白或GPR1-ND，例如将编码本发明的蛋白的多核苷酸序列(如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13所示的序列或其片段)直接插入表达系统，经表达、纯化，获得本发明的蛋白或多肽。或者可使用衍生于本发明的DNA构建体的mRNA，在无细胞翻译系统中产生所需的蛋白或多肽。

本领域普通技术人员能够知道，本发明所述的蛋白或其片段或GPR1-ND可以同其它的蛋白或其片段形成融合蛋白。其它蛋白或其片段一般是已知的，有些可以以载体形式购买得到，或者可以按常规方法合成或从已知生物体中克隆得到。

如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为FAM19A1分泌蛋白98个氨基酸序列和SEQ IDNO:12所示的氨基酸序列为GPR1-ND的30个氨基酸序列。本发明的多核苷酸序列可以只编码FAM19A1分泌蛋白或GPR1-ND，也可以在上述蛋白或多肽的编码序列的基础上，增加非编码序列，例如内含子、编码序列5'或3'端的非编码序列等。本发明的多核苷酸序列最好是以分离形式提供的。本发明的多核苷酸是“分离”形式的，其不仅已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开，而且已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来。本发明的FAM19A1分泌蛋白或GPR1-ND的核苷酸序列可以来自任何物种，特别是哺乳动物，包括牛、羊、猪、鼠、马，优选人类。

本发明还包括具有与编码FAM19A1分泌蛋白或其片段或GPR1-ND的多核苷酸至少70％、优选至少80％、更为优选至少85％，更进一步优选至少90％、特别优选至少95％，更为特别优选至少98％同源性的多核苷酸序列。特别涉及在严格条件下与FAM19A1分泌蛋白或GPR1-ND的多核苷酸杂交的多核苷酸，所说的“严格条件”意指发生杂交的前提是序列间至少具备FAM19A1或GPR1-ND的95％的同源性。这样的序列可以是天然存在或人工产生的，可以包括FAM19A1分泌蛋白或GPR1-ND的多核苷酸序列的等位基因变异体、也可以包括FAM19A1分泌蛋白多核苷酸序列中碱基的缺失、插入及置换。这样的序列编码的蛋白可以在功能上与本发明的FAM19A1分泌蛋白相同、相似、或不同，但最好是编码与FAM19A1分泌蛋白或GPR1-ND的生物学活性基本相同的蛋白或多肽。因此，优选地，本发明的多核苷酸为具有编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的多核苷酸序列或其片段至少80％同源性的多核苷酸，该多核苷酸编码的蛋白与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:12所示的蛋白或多肽具有相同或相似或不同的生物学功能。

免疫调节、中枢神经系统损伤、神经炎症、退行性脑部疾病、肥胖和胰岛素抵抗、感染疾病、过敏疾病、炎症反应、移植排斥、自身免疫病与趋化因子及其受体密切相关；中枢神经发育、中枢神经系统损伤、退行性脑部疾病与神经干细胞增殖分化密切相关。细胞因子的激动剂、拮抗剂的脱敏作用，中和抗体等是针对药物靶标的主要治疗手段。本发明通过实验证明，本发明的FAM19A1分泌蛋白具有与趋化因子相当的趋化活性和显著的神经干细胞增殖分化的调节作用，而其又衍生自人类蛋白序列，所以FAM19A1分泌蛋白在多种疾病的预防和/或治疗方面具有广阔的应用前景。

根据本发明的具体实施例，FAM19A1在脊椎动物的脂肪细胞特异性高表达。FAM19A1可通过其数量上的量变来调节免疫细胞移动的数量，从而可知FAM19A1为免疫调节因子。因此，本发明首次证明了FAM19A1趋化免疫细胞的免疫调节作用。

因此，本发明提供用于调节免疫细胞的组合物，该组合物包含可作为调节免疫细胞移动数量的调节剂的FAM19A1或其抑制剂。

根据本发明的另一具体实施例，FAM19A1在脑中特异性高表达。FAM19A1在脑组织中的海马内分布最多，由神经干细胞分泌，在出生后1天到7天最高。本发明FAM19A1分泌蛋白可通过其数量上的量变来调节从神经干细胞分化的神经元或星形胶质细胞的数量。亦即，由于可通过增加FAM19A1分泌蛋白数量来增加分化神经元细胞的数量，降低星形胶质细胞的数量，从而可知FAM19A1分泌蛋白为分化调节因子。因此，本发明首次证明了FAM19A1分泌蛋白对完整的中枢神经系统的形成有重要作用，并且在干细胞生成的细胞向不同类型分化的过程中，FAM19A1分泌蛋白是一种重要的肽，参与调节中枢神经系统的神经元和胶质细胞的形成。

此外，根据本发明的另一个具体实施例，确定了可通过提高FAM19A1分泌蛋白原核蛋白浓度来降低神经干细胞的增殖，增加分化神经元细胞的数量，降低星形胶质细胞的数量。由此可知，FAM19A1分泌蛋白原核蛋白可作为干细胞的增殖或分化调节因子，或者可作为针对中枢神经系统疾病的治疗手段。

因此，本发明提供用于调节增殖或分化干细胞的组合物，该组合物包含可作为干细胞增殖或分化的调节剂的FAM19A1分泌蛋白或其抑制剂。

本发明的用于调节干细胞的增殖或分化的组合物可包含天然或重组FAM19A1、与之具有实质上等同的生理活性的FAM19A1蛋白质、过度表达所述天然或重组FAM19A1的转基因神经干细胞，或FAM19A1抑制剂。所述具有实质上等同的生理活性的蛋白质包含天然/重组FAM19A1、其功能性等同物和功能性衍生物。

根据本发明的另一具体实施例，GPR1的N端多肽能够中和FAM19A1对神经干细胞的增殖和分化的调控作用，作为FAM19A1的功能拮抗剂。由此可知，GPR1-ND也可作为干细胞的增殖或分化调节因子，或者也可作为针对中枢神经系统疾病的治疗手段。

因此，本发明提供用于调节增殖或分化干细胞的组合物，该组合物包含可作为干细胞增殖或分化的调节剂的FAM19A1分泌蛋白的一种抑制剂为GPR1-ND、与之具有实质上等同的生理活性的功能性等同物和功能性衍生物。

所述术语“功能性等同物”是指部分或全部的天然蛋白质的氨基酸被置换或部分氨基酸被删除或添加的氨基酸序列变异体，而且与天然FAM19A1具有实质上等同的生物活性。或者部分或全部多肽的氨基酸被置换或部分氨基酸被删除或添加的氨基酸序列变异体，而且与GPR1-ND具有实质上等同的生物活性。

所述术语“功能性衍生物”是指经修饰的蛋白质，其能增强或降低所述FAM19A1蛋白质的物理和化学性质，而且与天然FAM19A1具有实质上等同的生物活性。或者经修饰的多肽，其能增强或降低所述GPR1-ND的物理和化学性质，而且与GPR1-ND具有实质上等同的生物活性。

所述FAM19A1抑制剂还可以为反义寡核苷酸、siRNA、shRNA、miRNA或包含其的载体，或者受体序列，或者抗体中的任一种。本发明所述的反义链可以为如SEQ ID NO:1所示的序列的互补序列。本领域普通技术人员已知，反义链或者其一部分(反义寡核苷酸)可用于抑制细胞内FAM19A1分泌蛋白的表达。

当体外培养神经干细胞时，可添加本发明的用于调节增殖或分化干细胞的组合物，作为增殖或分化调节因子。例如，在进行诱导增殖或分化的神经干细胞培养时，添加天然或重组FAM19A1、或者其抑制剂，以通过天然或重组FAM19A1、或者其抑制剂的数量变化来调节干细胞增殖的增加或降低，或者以调节神经元或星形胶质细胞的数量。

此外，根据本发明的另一具体实施例，不同浓度的FAM19A1可抑制神经干细胞向星形胶质细胞的分化，促进神经干细胞向神经元分化，因此可预期，从长远来看，在体内FAM19A1会促进脑部受损区域的神经元的再生。因此，FAM19A1可用作生物标记，用来诊断由中枢神经系统损伤引起的退行性脑部疾病或中枢神经系统疾病。

本说明书中使用的术语“中枢神经系统损伤”包括能够引起脑脊髓细胞的破坏或退化的所有种类的中枢神经系统损伤。例如，外伤性脑损伤、肌萎缩侧索硬化症等，但所述损伤不限于此。

所述术语“退行性脑部疾病或中枢神经系统疾病”是指，由中枢神经系统损伤导致的神经胶质增生引起的退行性脑部疾病或中枢神经系统疾病。这种疾病的例子包括阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、帕金森氏病、中风或脑肿瘤，但该疾病不限于任何具体的疾病种类。

所述术语“诊断”是指，病理状态的确定。鉴于本发明的目的，所述诊断是指，测定FAM19A1表达作为中枢神经系统损伤、退行性脑部疾病或中枢神经系统疾病的诊断标记，以确认中枢神经系统损伤、退行性脑部疾病和中枢神经系统疾病的发病、进展及缓解。

所述术语“诊断标记”是指，能够从普通细胞中分别诊断出中枢神经系统损伤、退行性脑部疾病或中枢神经系统疾病的细胞的物质，其包括有机生物分子，如多肽或核酸(如mRNA)、脂质、糖脂、糖蛋白以及糖(单糖、二糖、寡糖等)，这些在中枢神经系统损伤、退行性脑部疾病或中枢神经系统疾病的细胞中比起正常细胞有增加或减少。本发明所提供的用于中枢神经系统损伤、退行性脑部疾病或中枢神经系统疾病的诊断标记可以为蛋白质，该蛋白质是由FAM19A1基因表达的。

本发明的用于诊断中枢神经系统损伤、退行性脑部疾病或中枢神经系统疾病的组合物，包含用来测量FAM19A1基因的mRNA表达水平或其蛋白质表达量的制剂。这种制剂可包括，例如，具有与FAM19A1mRNA互补的序列的寡核苷酸，与FAM19A1mRNA特异性结合的引物或核酸探针，以及FAM19A1蛋白质特异性抗体。

所述引物是指，在适当的温度和缓冲液中并在适当条件(即，不同的核苷三磷酸和聚合酵素的四种类型)下可用作模板导向DNA合成的起始点的单链寡核苷酸。所述引物的合适长度可因各种因素，如温度和所述引物的用途，而有变化。此外，所述引物的序列不需要具有与所述模板序列完全互补的序列。在序列可杂交并所述引物可完成其功能的范畴内所述序列具有充分的互补性就足够了。因此，本发明的引物不需要具有与作为模板的基因的核苷酸序列完全互补的序列。在序列可杂交并所述引物可完成其功能的范畴内所述序列具有充分的互补性就足够了。此外，本发明的引物可优选地用于基因扩增反应。所述扩增反应是指，能够扩增核酸分子的反应。这种基因的扩增反应在本领域内已被广泛知晓，其可包括，如聚合酶链反应(PCR)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、连接酶链反应(LCR)、转录介导的扩增(TMA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。

所述核酸探针是指天然或变形的单体或线性连接的低聚物，包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，其能够与靶核苷酸序列特异性杂交，而且会自然产生或被人工合成。本发明的探针可以为单链，优选为寡脱氧核苷酸(oligodeoxyribonucleotide)。本发明的探针可以包括天然dNMP(即，dAMP、dGMP、dCMP和dTMP)、以及核苷酸类似物或衍生物。此外，本发明的探针可包括核糖核苷酸(ribonucleotide)。例如，其可包括：经骨架修饰的核苷酸，例如肽核酸(PNA)(M.Egholm etal.,Nature,365:566-568(1993))、硫代磷酸酯DNA、二硫代磷酸酯DNA、磷酰胺酯DNA、酰胺连接的DNA、MMI连接的DNA、2'-O-甲基RNA、α-DNA和甲基膦酸DNA；经糖修饰的核苷酸，例如2'-O-甲基RNA、2'-氟RNA、2'-氨基RNA、2'-O-烷基DNA、2'-O-烯丙基DNA、2'-O-炔基DNA、己糖DNA、吡喃糖RNA和失水己糖醇DNA；以及，具有碱基变异的核苷酸，例如C-5取代嘧啶(取代基包括氟代、溴代、氯代、碘代、甲基、乙基、乙烯基、甲酰基、ethnyl-、丙炔基、炔基、噻唑基、咪唑基和吡啶基)、具有C-7取代基的7-脱氮嘌呤(取代基包括氟代、溴代、氯代、碘代、甲基、乙基、乙烯基、甲酰基、炔基、烯基、噻唑基、咪唑基和吡啶基)、肌苷和二氨基嘌呤作为FAM19A1特异性抗体，可使用多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体和人源化抗体。

所述抗体片段的例子包括：Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双特异抗体(diabody)；线性抗体(Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子；和从抗体片段中形成的多特异性抗体等。

当用木瓜蛋白酶分解抗体时，形成两个相同的抗原结合片段，即具有单个抗原结合位点的“Fab”片段和余下的“Fc”片段。当用胃蛋白酶进行处理时，形成具有两个抗原结合位点且仍能与所述抗原交联的F(ab')2片段。Fv为包括完整的抗原识别和结合区的小抗体片段。该区由一个重链与一个轻链可变区的二聚物组成，并紧紧地通过非共价键偶联。

用于制备多克隆抗体的方法对本领域的技术人员来说是熟知的。多克隆抗体可通过向哺乳动物注射一次或多次免疫剂来制备的，而且根据需要，同时可注射免疫佐剂。通常，向哺乳动物的皮下或腹膜内注射多次免疫剂和/或免疫佐剂。所述免疫剂可以为本发明的蛋白质或其融合蛋白。当向哺乳动物一同注射已知有免疫原性的蛋白质和免疫剂来进行免疫化时，可能会有效。

本发明的用于诊断中枢神经系统损伤、退行性脑部疾病或中枢神经系统疾病的组合物可以为包含于试剂盒的形式。

所述试剂盒可包含用来测量FAM19A1基因的表达水平或蛋白质的量的所述引物、探针或抗体。对其的定义与如上所述的内容相同。

当所述试剂盒应用于PCR扩增过程中时，PCR扩增所必要的试剂可有选择地包括，如缓冲液、DNA聚合酶(如，从Thermus aquaticus(Taq)、Thermus thermophiles(Tth)、Thermus filiformis、Thermis flavus、Thermococcus literalis或Pyrococcus furiosus(PFU)中获得的热稳定性DNA聚合酶)、DNA聚合酶辅助因子和dNTP。但所述试剂盒应用于免疫分析时，其可有选择性地包括二抗和做标记的底物。进一步，本发明的试剂盒可制成能够包含上述试剂化合物的多个单独的包裹或隔室(compartment)。

此外，本发明提供用于诊断中枢神经系统损伤、退行性脑部疾病或中枢神经系统疾病的方法，该方法利用了测量所述FAM19A1基因或蛋白质的表达水平的方法，更为具体地，所述方法包括：(a)从疑似患有中枢神经系统损伤、退行性脑部疾病或中枢神经系统疾病的患者的生物样品中测量FAM19A1基因的表达水平或所表达的蛋白质的量；及(b)从正常对照组样品中测量基因的表达水平或所表达的蛋白质的量，并将其结果与(a)测量结果进行对比。

如上所述的用于测量基因的表达水平或所表达的蛋白质的量的方法可公知技术，其包括从生物样品中分离出mRNA或蛋白质的已知过程。

所述生物样品是指，从中枢神经系统损伤、退行性脑部疾病或中枢神经系统疾病的发病或进展程度与正常对照组进行对比时具有不同的基因或蛋白质表达水平的生物体中收集的样品。所述样品的例子可包括组织、细胞、血液、血清、血浆、唾液和尿，但不限于此。

当测量所述基因的表达水平时，优选会测量mRNA的水平。作为测量mRNA的水平的方法可使用RT-PCR、real-time PCR、核糖核酸酶保护分析法、Northern印迹法、DNA芯片等，但不限于此。

当测量所述蛋白质水平时，可使用抗体。此时，生物样品中的FAM19A1蛋白质和其特异性抗体可形成结合物(conjugate)，即抗原-抗体复合物。所形成的抗原-抗体复合物的量可通过由检测标记产生的信号的大小进行定量测定。此检测标记可选自酶、荧光物配体、发光物质、微粒、氧化还原分子或放射性同位素，但不限于此。用于测定蛋白质水平的分析方法包括Western印迹法、ELISA、放射免疫分析法、放射免疫扩散法、Ouchterlony免疫扩散法、火箭免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、FACS、蛋白质芯片等，但不限于此。

因此，通过利用所述检测方法，本发明可确定对照组中表达的mRNA或蛋白质的量、以及疑似患有中枢神经系统损伤、退行性脑部疾病或中枢神经系统疾病的患者中表达的mRNA或蛋白质的量。然后，可互相对比所述结果，以诊断中枢神经系统损伤、退行性脑部疾病或中枢神经系统疾病的发病、进展程度等。

此外，在本发明的用于诊断中枢神经系统损伤、退行性脑部疾病或中枢神经系统疾病的方法中，当本发明的FAM19A1基因的表达水平或所表达的蛋白质的量与所述正常对照组样品相比有区别时，可判断中枢神经系统损伤、退行性脑部疾病或中枢神经系统疾病的存在。

本发明还提供用于脑部疾病或中枢神经系统疾病的预防性或治疗性药物的筛选方法，该方法包括：在体外使FAM19A1基因与候选物质进行接触，并且判断所述候选物质能否促进或抑制所述基因的表达。

本发明还提供用于脑部疾病或中枢神经系统疾病的预防性或治疗性药物的筛选方法，该方法包括：在体外使FAM19A1蛋白质与候选物质进行接触，并且判断所述候选物质能否提高或抑制所述蛋白质的功能或活性。

根据本发明的筛选方法，首先，将待分析的候选物质与包含所述基因或蛋白质的脑部疾病或中枢神经系统疾病的细胞进行接触。

根据传统的选取方法，所述候选物质可包含，能够促进或抑制在FAM19A1基因序列中转录成mRNA和翻译成蛋白质的物质、被推测具有能够促进或抑制FAM19A1蛋白质的功能或活性的医学上应用的可能性的物质、或随机选取的单个的核酸、蛋白质、肽、其它提取物、天然产物、化合物等。

然后，在处理候选物质的细胞中可测量基因表达的量、蛋白质的量或蛋白质的活性。在所测结果中，当测到基因表达的量、蛋白质的量或蛋白质的活性有增加或降低时，可判断所述候选物质为能够治疗或预防脑部疾病或中枢神经系统疾病的物质。

在如上所述中，可通过各种本领域内公知的方法对所述基因表达的量、蛋白质的量或蛋白质的活性进行测量，如RT-PCR、实时聚合酶链反应、Western印迹法、Northern印迹法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、放射免疫扩散法、免疫沉淀法等，但不限于此。

通过本发明的筛选方法，可获得展示出能够促进基因表达或促进蛋白质功能的候选物质、以及反之展示出能够抑制基因表达或抑制蛋白质功能的候选物质。

用于退行性脑部疾病或中枢神经系统疾病的治疗制剂候选物质可在后期的用于退行性脑部疾病或中枢神经系统疾病的治疗制剂的研发过程中起到主导化合物的作用。当对所述主导化合物的结构进行变形和最优化以促进或抑制FAM19A1基因或从其中表达出的蛋白质的功能时，可研发出一种新型的用于退行性脑部疾病或中枢神经系统疾病的治疗制剂。

本发明还提供本发明的FAM19A1分泌蛋白或GPR1-ND多肽在制备商品化试剂研究免疫调节和干细胞增殖分化、中枢神经系统损伤、神经炎症、退行性脑部疾病、肥胖和胰岛素抵抗、感染疾病、过敏疾病、炎症反应、移植排斥、自身免疫病的应用。

在本发明中，与基因工程技术有关的内容可从Sambrook(Sambrook,etal.Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))and Frederick(Frederick M.Ausubel et al.,Current protocols in molecular biology volume1,2,3,John Wiley&Sons,Inc.(1994))一书所公开的内容中得到清晰的理解。

实施例

实施例1、构建pcDNA3.1-FAM19A1-myc-his蛋白表达质粒

构建pcDNA3.1-FAM19A1-myc-his质粒，用于表达FAM19A1-myc-his蛋白。

一、方法：

使用限制性内切酶XhoI(SEQ ID NO：5)和KpnI(SEQ ID NO：6)，将FAM19A1编码序列(SEQ ID NO：4)插入pcDNA3.1-myc-his(Invitrogen公司)表达载体，构建pcDNA3.1-FAM19A1-myc-his6表达质粒。测序验证质粒的正确性后，进行质粒扩增，用Axygen公司质粒大提试剂盒提取质粒，用于细胞转染。

二、结果：

经DNA测序编码区序列正确。

实施例2、FAM19A1分泌蛋白的纯化与N端测序

一、方法：

将293T细胞消化离心后调成1.5×10⁷细胞密度接种在直径为150mm平皿中，同时进行转染。pcDNA3.1-FAM19A1-myc-his DNA 12.5μg，PEI(威格拉斯生物技术有限公司)50μg，混合液慢慢滴入准备好的细胞中，同时pcDNA3.1-myc-his空载体转染细胞对照，16小时后换无血清培养基HEKG,37℃5％CO₂培养48小时，收获转染后的上清。2000rpm/min，10分钟，0.22μm滤膜过滤。取Ni Sepharose 6Fast Flow(GE healthcare)柱料，20倍体积水平衡，5mM咪唑200mM NaCl平衡液平衡，上清过柱后先用杂蛋白洗液洗柱，再用含1M咪唑的蛋白洗液洗脱。经过纯化，洗脱后样品经12.5％SDS-PAGE电泳转移至PVDF膜上，用考马斯亮兰染色，甲醇/冰乙酸脱色后裁下与Westernblot检测阳性位置相同的带进行蛋白质的N端测序(委托上海基康生物技术有限公司测序)。经过纯化，洗脱后样品经超滤管(milipore3000D)超滤后浓缩。BCA定量后冻存于-80℃用于后续功能实验。利用WesternBlot检查目的蛋白的表达

二、结果：

利用Western Blotting检测FAM19A1分泌蛋白的表达，结果如图1所示。加入Anti-His抗体作用后，再加入IRDyeTM 800标记的抗鼠IgG二抗反应，经Odyssey Imaging System扫描，在10kD处有清晰的条带。

如图2所示，纯化后的FAM19A1分泌蛋白样品经12.5％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，在第2泳道10kD处有清晰的FAM19A1分泌蛋白条带。

如图3所示，纯化后的FAM19A1分泌蛋白样品经12.5％SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜后做N端测序。FAM19A1(NM_001252216.1)-myc-his在10kD处有一条清晰条带。全部送至上海基康生物技术有限公司进行N端测序。蛋白质的N端测序结果为L-H-R-P-E-G-G-T-C-E。

实施例3、构建pET32a-FAM19A1原核表达质粒

构建pET32a-FAM19A1原核表达质粒，用于表达FAM19A1原核蛋白。

一、方法：

使用限制性内切酶XhoI(SEQ ID NO：5)和Nde1(SEQ ID NO：7)，将FAM19A1编码序列(SEQ ID NO：4)插入pET32a(Novagen)表达载体，构建pET32a-FAM19A1原核表达质粒。测序验证质粒的正确性后，进行质粒扩增，用维格拉斯小提试剂盒提取质粒，用于后续原核表达宿主菌转染。

二、结果：

经DNA测序编码区序列正确。

实施例4、FAM19A1原核蛋白表达以及纯化

一、方法：

将pET32a-FAM19A1原核表达质粒转染入Origami B宿主菌后,280rpm/min 37℃LA培养基中培养，待菌生长至OD 0.6时，加入IPTG终浓度为25μM 250rpm/min 25℃诱导过夜后，离心后弃去培养基，PBS 7.4重悬，超声破碎菌体。收获破碎菌体后上清液，离心12000rpm/min，10分钟，0.22μm滤膜过滤。取Ni Sepharose 6HP(GE healthcare)柱料，20倍体积水平衡，20mM咪唑和500mM NaCl平衡液平衡，上清过柱后先用杂蛋白洗液洗柱，再用含500mM咪唑的蛋白洗液洗脱。经过纯化，洗脱后样品经超滤管(milipore3000D)超滤后浓缩。最后过DEAE(GE healthcare)除内毒素，BCA定量后冻存于-80℃用于后续功能实验。

二、结果：

如图4所示，纯化后的蛋白质样品经12.5％SDS-PAGE电泳，直接考马斯亮蓝染色。图中在10kD附近一条清晰的条带即为FAM19A1目的蛋白条带。

BCA定量结果示纯化后的FAM19A1浓度为1mg/ml。

实施例5、人外周血单个核细胞的分离

一、方法：

浓缩白细胞由北京市血液中心提供，采用淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司)获得人外周血单个核细胞。用含10％热灭活的胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640(Life Technologies,Inc.)培养。

二、结果：

获得人外周血单个核细胞，进行体外培养备用。

实施例6、FAM19A1上清的趋化功能

一、方法：

FAM19A1上清的趋化功能检测：趋化实验在48孔的趋化小室(Neuroprobe；CabinJohn，MD，U.S.A.)里进行。用作趋化检测的上清加到小室的下孔里(28μl/孔)，然后用HepesRPMI 1640稀释后同样的培养基重悬为1×10⁶个细胞/ml，加到小室的上孔中(55μl/孔)，上下孔用无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯滤膜相隔，PBMC细胞使用滤膜孔径为3μm。将小室放入培养箱37℃，5％CO2，孵育3h。趋化结束时PBMC吸取小室下孔的细胞使用luciferase-containing reagent Cell-Titer Glo(Promega)测量其化学发光值反应细胞计数值。转染pcDNA3.1空载体转染上清作为阴性对照。

趋化指数CI为迁移细胞数除以对照组细胞数。所有实验至少重复3次。CI≥2有显著性意义。

二、结果：

如图5所示，FAM19A1培养上清对PBMC具有趋化作用。

实施例7、FAM19A1原核蛋白的趋化功能

一、方法：

人外周血单个核细胞(PBMC)的分离和培养同实施例5，细胞贴壁过夜后，人外周血淋巴细胞(PBL)和单核细胞(PBM)得以分离，PBL悬浮生长，吸出培养基离心后继续趋化实验；加入新鲜培养基，单核细胞贴壁生长，用细胞刮刮下离心后继续趋化实验。

FAM19A1原核蛋白的趋化功能检测：趋化实验在48孔的趋化小室(Neutroprobe；Cabin John，MD，U.S.A.)里进行。用作趋化检测的上清加到小室的下孔里(28μl/孔)，然后用Hepes RPMI 1640稀释后同样的培养基重悬为1×10⁶个细胞/ml，加到小室的上孔中(55μl/孔)，上下孔用无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯滤膜相隔，PBL细胞和单核细胞均使用滤膜孔径为3μm。将小室放入培养箱37℃，5％CO₂，分别孵育3.5h和5h。趋化结束时PBMC吸取小室下孔的细胞使用luciferase-containing reagent Cell-Titer Glo(Promega)测量其化学发光值反应细胞计数值。转染pcDNA3.1空载体转染上清作为阴性对照。

趋化指数CI为迁移细胞数除以对照组细胞数。所有实验至少重复3次。CI≥2有显著性意义。

二、结果：

如图6A和6B所示，FAM19A1原核真核蛋白对淋巴细胞PBL(图6A)和单核细胞(图6B)均具有趋化作用。

实施例8、兔抗人FAM19A1多克隆抗体的制备、鉴定和纯化

一、方法：

用纯化的FAM19A1原核蛋白免疫家兔制备多克隆抗体。三次免疫后，采集兔血清，ELISA检测显示兔血清效价升至1:10000以上。将兔血清1:2000稀释后进行免疫印迹检测，初步结果证实抗血清可以在过表达FAM19A1-myc-his的293T细胞裂解液中识别出特异性条带，免疫前兔血清对照则无特异性条带。将家兔处死，心脏取血，获取大量血清。血清用耦联FAM19A1原核蛋白的CNBr活化的Sepharose 4B亲和柱进行纯化，获得的抗FAM19A1兔多克隆抗体经过Western免疫印迹验证，FAM19A1兔多克隆抗体能特异识别FAM19A1纯化蛋白。

二、结果：

如图7所示，第1泳道为分子量标准，第2泳道为过表达pcDNA3.1空载体对照，第3泳道为过表达FAM19A1-myc-his的293T的分泌蛋白，第4泳道为过表达FAM19A5-myc-his的293T的分泌蛋白。经Anti-His标签抗体做免疫印迹实验证实过表达真实有效。

如图8所示，第1泳道为过表达pcDNA3.1空载体对照，第2泳道为过表达FAM19A1-myc-his的293T的分泌蛋白，第3泳道为过表达FAM19A5-myc-his的293T的分泌蛋白。可见纯化后兔抗体只能特异性地识别FAM19A1。

实施例9、FAM19A1双抗夹心微球检测系统的建立

一、方法：

取100μl微球(Thermo Fisher Scientific)和100μl兔抗FAM19A1多克隆抗体(1mg/ml)加入至终体积为3mL的MES Buffer(0.025M，pH＝6.0)室温缓慢转动过夜。按照Latex BeadProtein Coupling Protocols(Thermo Fisher Scientific)将包被FAM19A1兔多抗的微球进行处理后分装。微球检测的标准过程如下：微球预处理：每个样品1μl微球，再加1μl 10％BSA混匀后室温孵育30分钟。样品预处理：组织匀浆离心机3000g/5min后吸取上清，定量后，根据匀浆蛋白的浓度将蛋白匀浆稀释5-10倍后使用，稀释液为5％BSA，终浓度为1μg/ml，总体积50μl。293T细胞培养上清不作稀释。标准品为纯化定量后的FAM19A1重组蛋白，稀释液体为5％BSA，倍比稀释后浓度为0-64000ng/ml。将处理好的样品50μl每管加入处理好的微球2μl混均匀后室温晃动2个小时。离心机3000g/5min后吸走上清。用50μl的检测抗体稀释液(山羊抗FAM19A1多克隆抗体：0.5mg/mL，1/250稀释至5％BSA的PBS溶液)重悬微球，室温缓慢晃动1小时。离心机3000g/5min后吸走上清。用50μl的PE-anti-goat IgG(eBiosciense)5％BSA的PBS溶液稀释液(1/500)重悬微球，避光孵育30分钟后。离心机3000g/5min后吸走上清。300μl的PBS重悬微球后上机。使用FACS Verse流式细胞仪检测，通过Median以及标准品的浓度拟合标准曲线，通过标准曲线计算待测样品的FAM19A1浓度。

二、结果：

如图9所示，通过流式细胞仪检测样品中已知FAM19A1原核蛋白的浓度，以荧光强度的Median值计算制得其标准曲线。图10标准曲线表明，该检测方法可检测的浓度范围为32.25-64000pg/ml，线性系数R²为0.9935。利用FAM19A家族成员之一FAM19A5作为交叉反应的对照。用pcDNA3.1、pcDNA3.1-FAM19A5或者pcDNA3.1-FAM19A1分别转染293T细胞，收获它们的48小时无血清培养上清，进行CBA检测。如图11所示，微球检测系统能够识别pcDNA3.1-FAM19A1转染的293T细胞上清中的FAM19A1蛋白，而对pcDNA3.1和pcDNA3.1-FAM19A5组并无交叉反应。提示双抗夹心微球检测系统具有特异性。

实施例10、FAM19A1在人类各组织的表达谱

一、方法：

人类各组织cDNA文库购自Clontech公司。以FAM19A1上游F(5'CCAGGAGTCTACAGCAAGTGCTAC 3'(SEQ ID NO:8))，下游R(5'AGCAGCAGTGAGCAGTCAGCA 3'(SEQ ID NO:9))GAPDH上游F(5'CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT 3'(SEQ ID NO:10))，下游R(5'AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC 3'(SEQ ID NO:11))为引物，进行real-time PCR扩增40轮。

二、结果：

结果如图12显示，FAM19A1在脑和脂肪中高表达，肺、心脏、肾、胎盘、骨髓、白细胞、胸腺、扁桃体、胰腺、胎肝、淋巴结中可见表达，其余组织未见明显表达。

实施例11、FAM19A1在小鼠各组织的表达谱

一、方法：

从北京大学医学部实验动物部购买6周龄黑色雄性小鼠(C57BL/6，小鼠)。购买的小鼠在鼠笼里进行饲养，在该鼠笼内有供应适当的食物和水，温度维持在20～24℃，湿度保持在40～70％。此外，在12/12光暗周期(上午八点开灯，下午八点关灯)内保管这些野生型的小鼠。所有实验被设计成均使用最少数量的小鼠，根据动物实验伦理，实施了麻醉方法，以最大程度降低实验中所用的小鼠的痛苦。小鼠麻醉后心脏灌注，取小鼠各器官，提取每个对应组织中总RNA，从然后通过使用逆转录酶和随机六聚体来制备互补DNA(cDNA)。随后，通过利用相应的引物进行实时定量聚合酶链反应检测各器官FAM19A1的表达。Real-time PCR中所用的引物与实施例10中的引物一致。另取小鼠各器官匀浆后取上清，利用双抗夹心微球检测体系检测各脏器FAM19A1的表达。

二、结果：

结果显示，FAM19A1的mRNA水平(图13)以及蛋白水平(图14)均在小鼠脑中表达较高，其余组织表达较低。

实施例12、FAM19A1基因在小鼠脑部各分区的表达

一、方法：

用与上述方法相同的方式管理小鼠。小鼠麻醉后心脏灌注，取小鼠脑并将海马，大脑皮层和小脑分开提取每个对应组织中总RNA，从然后通过使用逆转录酶和随机六聚体来制备互补DNA(cDNA)。随后，通过利用相应的引物进行实时定量聚合酶链反应检测各分区FAM19A1的表达。Real-time PCR中所用的引物与实施例10中的引物一致。另取小鼠脑并将海马，大脑皮层和小脑分开匀浆后取上清，利用双抗夹心微球检测体系检测各分区FAM19A1的表达。

二、结果：

结果显示，FAM19A1的mRNA水平(图15A)在小鼠脑海马中表达较高，在大脑皮层和小脑的表达量较低。其余区域表达较低。FAM19A1的蛋白水平(图15B)小鼠脑海马和大脑皮层的表达量均较高，在小脑的表达量较低。

实施例13、通过免疫组织化学检测FAM19A1蛋白表达

一、方法：

这里使用免疫组织化学法，以确认翻译后的FAM19A1蛋白表达的组织细胞分布。用与上述方法相同的方式管理小鼠。处死小鼠取得脑和脂肪组织。在含有4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲液中固定(后固定)24～48小时，梯度酒精逐级脱水后,包埋、3μm切片，用于后续免疫组织化学实验。

免疫组织化学染色方法如下：梯度酒精下行水化，高压法进行抗原修复，3％过氧化氢溶液去除内源性过氧化氢酶，封闭(5％山羊血清)。为了通过免疫组织化学确认小鼠脑和脂肪细胞中的FAM19A1蛋白质表达的区域和强度，使用了实施例7中所制备的多克隆抗体作为可与所述FAM19A1蛋白质反应的抗体，即rabbit anti-FAM19A1。如最终的图像所示，为了避免邻近的非特异性抗原-抗体反应并准确区分FAM19A1特异性表达区域，将FAM19A1抗体与封闭溶液之比设成1：500。FAM19A1抗体与抗原在4℃下过夜反应或在常温(25℃)下反应约3小时。待一抗-抗原反应结束后，用磷酸盐缓冲液清洗所述组织切片3次，每次5分钟。然后，以抗兔IgG(中杉金桥)作为二抗后进行使用。待完成二抗-抗原反应后，DAKO显色试剂盒显色。苏木精复染细胞核后中性树胶封片。显微镜下观察拍照。

二、结果：

如图16和17所示，在蛋白质水平上，FAM19A1蛋白质在附睾脂肪(图16)和脑(图17)的海马区高表达。

实施例14、FAM19A1基因在小鼠不同发育阶段的表达

一、方法：

用与上述方法相同的方式管理小鼠。小鼠麻醉后心脏灌注。处死(断头)出生前胚胎期12.5天、16.5天以及出生后过1天、7天和8周的小鼠而从其颅骨中取得脑。提取每个对应组织中总RNA，从然后通过使用逆转录酶和随机六聚体来制备互补DNA(cDNA)。随后，通过利用相应的引物进行实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测各组织FAM19A1的表达。同样方式处理小鼠得到不同发育阶段脑组织，匀浆后取上清，利用双抗夹心微球检测体系检测各脏器FAM19A1的表达。

二、结果：

结果显示，FAM19A1的mRNA(图18A)和蛋白(图18B)表达水平和在出生前胚胎期第12.5天开始增多，在出生后第7天表达到达峰值，在成年8周小鼠脑中可见降低。这表明FAM19A1蛋白表达伴随中枢神经系统的形成过程，发挥调节作用。

实施例15、通过组织免疫荧光检测FAM19A1蛋白在神经干细胞的表达

一、方法：

利用组织免疫荧光法，检测到FAM19A1蛋白在神经干细胞表达。用与上述方法相同的方式管理小鼠。小鼠麻醉后心脏灌注。处死(断头)出生前胚胎期18天以及出生后8周的小鼠而从其颅骨中取得脑组织。在含有4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲液中固定(后固定)24～48小时，梯度酒精逐级脱水后,包埋、4μm切片，用于后续组织免疫荧光实验。

组织免疫荧光方法如下：梯度酒精下行水化，高压法进行抗原修复，3％过氧化氢溶液去除内源性过氧化氢酶，封闭(5％山羊血清)。为了通过组织免疫荧光确认小鼠脑神经干细胞是否表达FAM19A1蛋白，使用了实施例7中所制备的多克隆抗体作为可与所述FAM19A1蛋白质反应的抗体，即10μg/ml的rabbit anti-FAM19A1以及商品化的神经干细胞标志物nestin抗体，即10μg/ml的rabbit anti-nestin(Abcam)。抗体与抗原在4℃下过夜反应，待一抗-抗原反应结束后，用磷酸盐缓冲液清洗所述组织切片3次，每次5分钟。然后，以Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG和Alexa Fluor 594(1:200；中杉金桥)作为二抗，常温孵育1小时。待完成二抗-抗原反应后，用磷酸盐缓冲液清洗所述组织切片3次，每次5分钟。然后以10μg/ml的DAPI(Sigma)常温孵育20分钟染核。用磷酸盐缓冲液清洗所述组织切片3次后用抗荧光淬灭封片剂封片。显微镜下观察拍照。

二、结果：

结果显示，在蛋白质水平上，FAM19A1与nestin在胚胎小鼠脑的海马区(图19A)以及成年小鼠脑VZ/SVZ区(图19B)均存在共定位，这表明神经干细胞表达FAM19A1蛋白。

实施例16、通过细胞免疫荧光检测FAM19A1蛋白在神经干细胞表达

一、方法：

利用细胞免疫荧光法，检测FAM19A1蛋白质是否在神经干细胞表达。用与上述方法相同的方式管理小鼠。处死小鼠取得神经球。培养七天后用Accutase(Innovative CellTechnologies Inc.)酶消化成单个细胞，接种在预先包被左旋多聚赖氨酸的细胞爬片上，并加入10％FBS刺激1.5小时使细胞贴壁。冰磷酸盐缓冲液清洗所述细胞爬片3次，用含有4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲液中固定15-20分钟后使用0.5％Triton-100打孔10分钟。5％牛血清白蛋白溶液封闭30分钟。使用与实施例15相同的抗体，即10μg/ml的rabbit anti-FAM19A1以及商品化的rabbit anti-nestin。抗体与抗原在4℃下过夜反应。待一抗-抗原反应结束后，用冰磷酸盐缓冲液清洗所述组织切片3次。然后，以Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG和AlexaFluor 594(1:200；中杉金桥)作为二抗，常温孵育1小时。待完成二抗-抗原反应后，用磷酸盐缓冲液清洗所述细胞爬片3次。然后以1μg/ml的DAPI(Sigma)常温孵育10分钟染核。用磷酸盐缓冲液清洗所述细胞爬片3次后用抗荧光淬灭封片剂封片。显微镜下观察拍照。

二、结果：

如图20所示，在蛋白质水平上，FAM19A1与nestin在分离的神经干细胞存在共定位，这表明神经干细胞表达FAM19A1蛋白。

实施例17、FAM19A1(SEQ ID NO:1)原核蛋白对神经干细胞自我更新的影响

一、方法：

为了确认FAM19A1分泌蛋白是否影响神经干细胞的自我更新，将神经球解离成单个细胞，在96孔板中每孔加入1,000个细胞，并加入含有生长因子的培养液诱导增殖7天，同时每天以20和200nM的FAM19A1(SEQ ID NO:1)的原核蛋白来进行处理。7天后将形成的神经球拍照统计神经球的大小和直径。

二、结果：

如图21所示，可发现，由于FAM19A1分泌蛋白(SEQ ID NO:1)的存在，神经球的大小和直径较对照组明显下降。

实施例18、FAM19A1原核蛋白对神经干细胞增殖的影响

一、方法：

为了确认FAM19A1蛋白质是否影响神经干细胞的增殖，使用了FAM19A1的原核蛋白。为了进行增殖实验，将神经球解离成单个细胞。在96孔板中每孔加入1,000个细胞，并加入含有生长因子的培养液诱导增殖，同时每天以0.2，2，20和200nM的FAM19A1原核蛋白来进行处理。分别在1天，3天，5天和7天后，将形成的神经球解离成单个细胞，并测量细胞数。

二、结果：

如图22所示，可发现，由于FAM19A1原核表达分泌蛋白(SEQ ID NO:1)的存在，神经干细胞的增殖较对照组明显下降。

实施例19、FAM19A1原核蛋白对神经干细胞分化的影响

一、方法：

为了进行分化测试，通过利用Accutase(Innovative Cell Technologies Inc.,USA)将神经球解离成单个细胞。在24孔板中每孔加入50,000个细胞并在含有生长因子的培养液中放置一天以使之稳定。第二天，将所述溶液更换成含有能够促进分化的因子的分化培养溶液继续诱导分化6天。同时每天以0.2，2，20和200nM的FAM19A1原核蛋白来进行处理。通过细胞免疫荧光、实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)和免疫印迹法(Westernblotting)进行二种类型的神经系统细胞(神经元和星形胶质细胞)标记物的检测。

二、结果：

如图23-25所示，在使用FAM19A1原核蛋白的实验组中，MAP2红色标记的神经元的数量较对照组提高了约两倍，而标有GFAP绿色标记的星形胶质细胞的数量显著减少。由此，在从干细胞到其他类型细胞的分化过程中FAM19A1蛋白质可作为调节分子，尤其是，可参与促进神经元细胞的形成。

实施例20、¹²⁵I-FAM19A1与GPR1的结合实验及与FAM19A1、Chemerin、FAM19A5的竞争结合实验

一、方法：

使用电穿孔技术将GPR1-EGFP质粒转染至HEK293,培养36小时候收细胞裂解液。¹²⁵INa，1.5Mci与FAM19A1真核蛋白反应将FAM19A1标记为¹²⁵I-FAM19A1。将终浓度为7μM的¹²⁵I-FAM19A1与不同浓度梯度的GPR1-EGFP的提取物混匀，室温放置15分钟，3500rpm/min，4℃离心20分钟，去上清，测定沉淀cpm值。获得结合的饱和曲线，并计算反应亲和常数。

将7μM的¹²⁵I-FAM19A1与适量的GPR1-EGFP稳定株膜提取物以及不同浓度梯度的FAM19A1、chemerin、FAM19A5混匀，室温放置15分钟，3500rpm/min，4℃离心20分钟，去上清，测定沉淀cpm值。获得竞争结合曲线。

二、结果：

如图26所示，根据不同的受体浓度梯度以及测得相应的cpm值得到饱和曲线，采用五参数Logistic曲线拟合，方程:y＝(A-D)/[(1+(x/C)^B)]^n+D，计算得出Kd＝0.014nM，表明FAM19A1与GPR1有高亲和力。

如图27所示，FAM19A1可以与自身竞争性结合GPR1，竞争效率大于95％，Chemerin也可与FAM19A1竞争性结合GPR1，竞争效率大于70％，而与FAM19A1同家族的另一成员FAM19A5无法与FAM19A1竞争结合GPR1，表明FAM19A1可以与其受体GPR1特异性结合，并且二者的结合可被FAM19A1本身或Chemerin所竞争。

实施例21、GPR1的四段胞外区肽段的制备和鉴定

一、方法：

通过生物信息学的方法找出GPR1的四段胞外区的序列并合成多肽(杭州中肽)。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定了受体肽的结合能力:96孔板每孔都包被200ng待检测的多肽GPR1-ND，GPR1-ED 1，GPR1-ED 2，GPR1-ED 3或肽混合物，并4℃包被过夜。在室温下，200μl 1％的BSA/PBS的封闭液室温封闭1h。加入最终浓度分别为5、25或125nM的FAM19A1或FAM19A5，以1％BSA/PBS缓冲(100μl/孔)的浓度，4℃孵育过夜。每孔加入100μl 1μg/ml的Anti-His室温孵育1h，然后加入1/10，000中HPR标记的山羊抗小鼠IgG的抗体室温孵育1h，之后用PBS/Tween 20(0.05％)缓冲液洗4次。然后在100μl/孔中加入基底液，并通过加入100μl H₂SO₄(1M)来终止反应，酶标仪检测(公司)。

二、结果：

图28显示ELISA检测GPR1的N端肽(GPR1-ND)以及三段胞外区(GPR1-ED1,GPR1-ED2,GPR1-ED3)与FAM19A1蛋白的结合能力。可见，GPR1-ND(SEQ ID NO:12)和FAM19A1的结合最强。

图29显示ELISA检测GPR1的N端肽(GPR1-ND)以及三段胞外区(GPR1-ED1,GPR1-ED2,GPR1-ED3)与FAM19A1蛋白结合的特异性。可见，GPR1-ND(SEQ ID NO:12)和FAM19A1的结合最强。与FAM19A5分泌蛋白结合相比，GPR1-ND肽特异性结合FAM19A1分泌蛋白。

实施例22、GPR1-ND对FAM19A1蛋白抑制神经干细胞自我更新的影响

一、方法：

为了确认GPR1-ND对FAM19A1蛋白抑制神经干细胞自我更新的影响，使用了FAM19A1的原核蛋白和GPR1的N端多肽(GPR1-ND)。利用Accutase(Innovative CellTechnologies Inc.,USA)将神经球解离成单个细胞，在96孔板中每孔加入1,000个细胞，并加入含有生长因子的培养液。用所述生长因子诱导增殖7天，同时每天以20nM和200nM的FAM19A1原核蛋白和1μM的GPR1-ND来进行处理。7天后将形成的神经球拍照统计神经球的大小和直径。

二、结果：

如图30所示，在使用FAM19A1原核蛋白的实验组中，二代神经球的个数和直径较对照组明显下降，而当添加GPR1-ND来进行处理时，二代神经球的个数和直径为与正常组相当。可见，GPR1-ND肽(SEQ ID NO:12)能够中和FAM19A1蛋白对神经干细胞自我更新的抑制作用。

实施例23、GPR1-ND对FAM19A1蛋白抑制神经干细胞增殖的影响

一、方法：

为了确认GPR1-ND对FAM19A1蛋白抑制神经干细胞增殖的影响，使用了FAM19A1的原核蛋白和GPR1的N端多肽(GPR1-ND)。利用Accutase将神经球解离成单个细胞，在96孔板中每孔加入1,000个细胞，并加入含有生长因子的培养液。用所述生长因子诱导增殖，同时每天以2nM和200nM的FAM19A1原核蛋白和1μM的GPR1-ND来进行处理。分别在1天，3天，5天和7天后一天，将形成的神经球解离成单个细胞，并测量细胞数。

二、结果：

如图31所示，在使用FAM19A1原核蛋白的实验组中，神经干细胞的增殖能力较对照组明显下降，而当添加GPR1-ND来进行处理时，神经干细胞的增殖能力与对照组相当。可见，GPR1-ND肽(SEQ ID NO:12)能够中和FAM19A1分泌蛋白对神经干细胞增殖的抑制作用。

实施例24、GPR1-ND对FAM19A1蛋白调控神经干细胞分化的影响

一、方法：

为了验证GPR1-ND对FAM19A1蛋白调控神经干细胞分化的影响，用了FAM19A1的原核蛋白和GPR1的N端多肽(GPR1-ND)。利用Accutase将神经球解离成单个细胞。在24孔板中每孔加入50,000个细胞并在含有生长因子的培养液中放置一天以使之稳定。第二天，将所述溶液更换成含有能够促进分化的因子的分化培养溶液。诱导分化6天，同时每天以20nM和200nM的FAM19A1原核蛋白和1μM的GPR1-ND来进行处理。通过使用二种类型的神经系统细胞(神经元和星形胶质细胞)的标记，来进行实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)和免疫印迹法(Westernblotting)检测。

二、结果：

如图32-33所示，在使用FAM19A1原核蛋白的实验组中，MAP2标记的神经元的数量较对照组提高了约两倍，而标有GFAP的星形胶质细胞的数量相应减少。而当添加GPR1-ND来进行处理时，神经干细胞的分化状态与对照组一致。可见，GPR1-ND肽(SEQ ID NO:12)能够中和FAM19A1蛋白对神经干细胞分化的调控作用。

工业应用性

本发明的FAM19A1或其抑制剂可用作免疫细胞和神经干细胞增殖或分化的调节剂、以及用于中枢神经系统损伤、退行性脑部疾病或中枢神经系统疾病的诊断试剂盒、芯片或将治疗剂。

本文通过一些实施方式和具体的实施例对本发明进行了说明，而且为了描述的目的还针对许多细节进行了描述。对于本领域技术人员而言，本发明可以通过采用一些其它的具体实施方式来实现，也可以在不偏离本发明主旨的情况下针对所披露的内容进行调整和变化。本发明的内容应当包括针对本文所披露内容的调整或变化，或者说应当包括由所附权利要求书所定义的以及与之等同的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大学

<120> 具有多种功能的蛋白多肽及其医药用途

<130> 2018

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 98

<212> PRT

<213> 人FAM19A1分泌蛋白氨基酸序列

<400> 1

Leu His Arg Pro Glu Gly Gly Thr Cys Glu Val Ile Ala Ala His

5 10 15

Arg Cys Cys Asn Lys Asn Arg Ile Glu Glu Arg Ser Gln Thr Val

20 25 30

Lys Cys Ser Cys Leu Pro Gly Lys Val Ala Gly Thr Thr Arg Asn

35 40 45

Arg Pro Ser Cys Val Asp Ala Ser Ile Val Ile Gly Lys Trp Trp

50 55 60

Cys Glu Met Glu Pro Cys Leu Glu Gly Glu Glu Cys Lys Thr Leu

65 70 75

Pro Asp Asn Ser Gly Trp Met Cys Ala Thr Gly Asn Lys Ile Lys

80 85 90

Thr Thr Arg Ile His Pro Arg Thr

95

<210> 2

<211> 297

<212> DNA

<213> 人FAM19A1分泌蛋白核苷酸序列

<400> 2

ctgcacagac cagaaggagg gacgtgtgaa gtgatagcag cacaccgatg ttgtaacaag 60

aatcgcattg aggagcggtc acaaacagta aagtgttcct gtctacctgg aaaagtggct 120

ggaacaacaa gaaaccggcc ttcttgcgtc gatgcctcca tagtgattgg gaaatggtgg 180

tgtgagatgg agccttgcct agaaggagaa gaatgtaaga cactccctga caattctgga 240

tggatgtgcg caacaggcaa caaaattaag accacgagaa ttcacccaag aacctaa 297

<210> 3

<211> 133

<212> PRT

<213> 人FAM19A1全长蛋白氨基酸序列

<400> 3

Met Ala Met Val Ser Ala Met Ser Trp Val Leu Tyr Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Ala Cys Ala Met Leu Leu Cys His Gly Ser Leu Gln His Thr Phe Gln

20 25 30

Gln His His Leu His Arg Pro Glu Gly Gly Thr Cys Glu Val Ile Ala

35 40 45

Ala His Arg Cys Cys Asn Lys Asn Arg Ile Glu Glu Arg Ser Gln Thr

50 55 60

Val Lys Cys Ser Cys Leu Pro Gly Lys Val Ala Gly Thr Thr Arg Asn

65 70 75 80

Arg Pro Ser Cys Val Asp Ala Ser Ile Val Ile Gly Lys Trp Trp Cys

85 90 95

Glu Met Glu Pro Cys Leu Glu Gly Glu Glu Cys Lys Thr Leu Pro Asp

100 105 110

Asn Ser Gly Trp Met Cys Ala Thr Gly Asn Lys Ile Lys Thr Thr Arg

115 120 125

Ile His Pro Arg Thr

130

<210> 4

<211> 402

<212> DNA

<213> 人FAM19A1全长蛋白核苷酸序列

<400> 4

atggcaatgg tctctgcgat gtcctgggtc ctgtatttgt ggataagtgc ttgtgcaatg 60

ctactctgcc atggatccct tcagcacact ttccagcagc atcacctgca cagaccagaa 120

ggagggacgt gtgaagtgat agcagcacac cgatgttgta acaagaatcg cattgaggag 180

cggtcacaaa cagtaaagtg ttcctgtcta cctggaaaag tggctggaac aacaagaaac 240

cggccttctt gcgtcgatgc ctccatagtg attgggaaat ggtggtgtga gatggagcct 300

tgcctagaag gagaagaatg taagacactc cctgacaatt ctggatggat gtgcgcaaca 360

ggcaacaaaa ttaagaccac gagaattcac ccaagaacct aa 402

<210> 5

<211> 6

<212> DNA

<213> 酶切位点

<400> 5

ctcgag 6

<210> 6

<211> 6

<212> DNA

<213> 酶切位点

<400> 6

ggtacc 6

<210> 7

<211> 6

<212> DNA

<213> 酶切位点

<400> 7

catatg 6

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 引物

<400> 8

ccaggagtct acagcaagtg ctac 24

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 引物

<400> 9

agcagcagtg agcagtcagc a 21

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 引物

<400> 10

cggagtcaac ggatttggtc gtat 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213>

<220>

<223> 引物

<400> 11

agccttctcc atggtggtga agac 24

<210> 12

<211> 30

<212> PRT

<213>

<220>

<223> GPR1-ND多肽氨基酸序列

<400> 12

Met Glu Asp Leu Glu Glu Thr Leu Phe Glu Glu Phe Glu Asn Tyr

5 10 15

Ser Tyr Asp Leu Asp Tyr Tyr Ser Leu Glu Ser Asp Leu Glu Glu

20 25 30

<210> 13

<211> 90

<212> DNA

<213> GPR1-ND多肽核苷酸序列

<400> 13

atggaagatt tggaggaaac attatttgaa gaatttgaaa actattccta tgacctagac 60

tattactctc tggagtctga tttggaggag 90

Claims (11)

1.一种蛋白，其由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成。

2.一种多核苷酸，其编码权利要求1所述的蛋白。

3. 一种多肽，其由SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列组成。

4.一种多核苷酸，其编码权利要求3所述的多肽。

5.一种基因工程载体，其含有权利要求2或4所述的多核苷酸。

6.一种药物组合物，其含有权利要求1所述的蛋白，以及一种或多种药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。

7.一种药物组合物，其含有权利要求3所述的多肽，以及一种或多种药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。

8.权利要求1所述的蛋白、权利要求2所述的多核苷酸、和/或含有权利要求2所述多核苷酸的基因工程载体在制备药物中的应用，所述药物用于免疫调节和/或调节神经干细胞的增殖分化。

9.权利要求3所述的多肽、权利要求4所述的多核苷酸、和/或含有权利要求4所述多核苷酸的基因工程载体在制备药物中的应用，所述药物用于免疫调节和/或调节神经干细胞的增殖分化。

10.一种制备试剂的方法，所述试剂用于体外检测来自待测者的样品中权利要求1所述的蛋白、或权利要求3所述的多肽、或权利要求2或4所述的多核苷酸的表达水平。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述检测中采用反转录－聚合酶链式反应、蛋白质印迹、ELISA、FACS、流式微球技术、免疫荧光、免疫组织化学检测。

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