KR101390611B1 - 뇌성마비 질환 진단용 마커로서 Ｌｉｎ-28의 용도 - Google Patents

뇌성마비 질환 진단용 마커로서 Ｌｉｎ-28의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뇌성마비 질환 진단용 마커로서의 lin-28의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 lin-28 유전자를 이용한 뇌성마비 질환 진단용 마커, 이를 이용한 뇌성마비 질환 진단용 조성물, 키트, 마이크로어레이 및 뇌성마비 질환 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 lin-28 유전자는 비 뇌성마비 질환 조직, 즉 정상 조직 또는 세포에 비해 뇌성마비가 유발된 조직 또는 세포에서 발현양이 증가되는 것으로 확인됨에 따라 lin-28 유전자를 뇌성마비 질환 진단용 마커로 사용할 경우 뇌성마비 질환을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있으며, 뇌성마비 질환 치료제의 개발을 위한 표적으로 활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

뇌성마비 질환 진단용 마커로서 Ｌｉｎ-28의 용도{Use of Lin-28 as a diagnostic marker for cerebral palsy}
본 발명은 뇌성마비의 발생 여부를 진단 및 예측할 수 있는 신규한 바이오마커에 관한 것이다.
Lin-28은 마이크로 RNA (miRNA)의 초기 발달 과정에 중요한 역할을 하는 마이크로RNA-결합 단백질로 주목받고 있다. 마이크로 RNA는 small RNA (sRNA)의 일종으로, 19-25 nt 길이의 단일가닥 RNA 분자로서 세포 내에 존재하는 헤어핀-구조 전사체(hairpin RNA)에 의해 생성된다. miRNA는 생체 내의 여러 조절과정에서 중요한 역할을 하고, 특정 메신저 RNA(mRNA)에 특이적으로 결합하여 mRNA로부터 단백질이 생성되는 프로세싱을 억제한다. 구체적으로 miRNA는 표적 mRNA에 상보적으로 결합하여 번역후 유전자 억압인자로서 작용하며, 번역 억제와 mRNA 불안정화를 유도한다. 이러한 miRNA의 기능과 관련하여 최근 miRNA와 암과의 강한 연관이 증명되어 암 생물학 분야에서 새로운 연구 주제로 떠오르고 있다(Esquela-kerscher, A. and Slack, FJ., Nat. Rev. Cancer 6(4):259-269, 2006).
Lin-28과 관련하여, 대한민국 특허출원 제2008-0027881호 "마이크로ＲＮＡ 활성 측정 방법"(2008.03.26. 출원)에서는 마이크로ＲＮＡ 활성 측정 방법에 관한 것으로서, Lin-28이 암의 발생과 관련 있다는 사실을 통해 Lin-28의 활성을 억제하는 항암제를 스크리닝하는 방법에 대한 내용이 개시되어 있으며, 대한민국 특허출원 제2008-027880호 "마이크로ＲＮＡ 생성을 억제하는 드로셔 돌연변이"(2008.03.26. 출원)는 마이크로ＲＮＡ 생성을 억제하는 드로셔 돌연변이에 관하여 기재하고 있고, Lin-28을 억제할 경우 암을 치료할 수 있다는 내용이 개시되어 있다. 또한, 미국특허출원 제2008-682149호 "METHODS TO REGULATE MIRNA PROCESSING BY TARGETING LIN-28" 역시 Lin-28의 활성 억제를 통해 암을 치료할 수 있다는 내용이 개시되어 있다.
그러나 아직까지 Lin-28이 뇌성마비 질환의 발생과 관련이 있다는 내용에 대해서는 전혀 알려진 바가 없다.
이에 본 발명자들은 lin-28을 뇌성마비 질환의 진단용 마커로 사용할 수 있다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 lin-28 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질로 이루어진 뇌성마비 질환 진단용 마커를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 lin-28 유전자 또는 Lin-28 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 뇌성마비 질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 뇌성마비 질환 진단용 조성물을 포함하는 뇌성마비 질환 진단용 키트 및 뇌성마비 질환 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 lin-28 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계를 포함하는 뇌성마비 질환 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 lin-28 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 Lin-28 단백질로 이루어진 뇌성마비 질환 진단용 마커를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 lin-28 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 lin-28 유전자 또는 Lin-28 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 뇌성마비 질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 lin-28 유전자의 수준을 측정하는 물질은 lin-28 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Lin-28 단백질의 수준을 측정하는 물질은 Lin-28 단백질을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은,
(a) 생물학적 시료에 존재하는 lin-28 유전자의 발현양 또는 Lin-28 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 lin-28 유전자의 발현양 또는 Lin-28 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 뇌성마비 질환 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 및 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis)으로 이루어진 군중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명은 lin-28 유전자를 이용한 뇌성마비 질환 진단용 마커, 이를 이용한 뇌성마비 질환 진단용 조성물, 키트, 마이크로어레이 및 뇌성마비 질환 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 lin-28 유전자는 비 뇌성마비 질환 조직, 즉 정상 조직 또는 세포에 비해 뇌성마비가 유발된 조직 또는 세포에서 발현양이 증가되는 것으로 확인됨에 따라 lin-28 유전자를 뇌성마비 질환 진단용 마커로 사용할 경우 뇌성마비 질환을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있으며, 뇌성마비 질환 치료제의 개발을 위한 표적으로 활용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 뇌성마비가 유도된 마우스 및 정상 마우스의 뇌조직을 대상으로 lin-28의 발현 패턴을 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
본 발명은 Lin-28 단백질과 뇌성마비 질환과의 관련성을 규명한 것으로서, 보다 구체적으로 lin-28 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 Lin-28 단백질로 이루어진 뇌성마비 질환 진단용 마커를 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명에서 질환 진단의 대상이 되는 뇌성마비는 태어나기 전 뇌 발달의 이상이나 뇌손상으로 인해 생애 초기에 발생하는 운동성 질환을 일컫는 질환으로서, 일부 뇌성마비 환자는 학습, 시력, 청력, 언어 장애가 발생한다.
대부분의 뇌성마비의 경우 정확한 원인은 알려져 있지 않으나, 현재까지 보고된 뇌성마비의 원인으로는 뇌 발달 이상, 산소 부족(질식)이나 혈류 장애, 감염, 손상으로 인한 태아기 뇌손상 등의 가능성이 제기되기도 하며, 또한 진통과정 및 분만 중 발생하는 손상이나 저산소증이 뇌성마비의 주된 원인이 될 수 있다고 보고되어 있으며, 또한 현재는 진통 및 분만 과정에서 뇌성마비가 발생하는 경우는 극히 드물게 발생한다고 보고되어 있다. 다른 가능성으로는 신생아기의 심한 황달, 임신중 모체의 감염, 유전자 이상, 임신 중 뇌발달 이상이 원인이 되는 것으로 알려져 있다.
뇌성마비의 경우, 4가지 아형으로 분류하고 있는데, 먼저 경직되어 운동이 힘든 상태를 경직성 뇌성마비라고 하며, 불수의적이고 조절이 되지 않은 운동성이 있는 경우 이상 운동성 또는 무정위운동성 뇌성마비라고 하며, 조정 및 균형 장애를 일으키는 경우 운동실조성 뇌성마비라고 하며, 이러한 여러 아형이 혼합된 형태를 혼합성 뇌성마비라고 한다.
본 발명의 바이오마커가 진단할 수 있는 뇌성마비는 이상과 같은 4가지 아형의 뇌성마비를 모두 포함할 수 있다.
한편, 본 발명자들은 이러한 뇌성마비의 발병여부를 진단할 수 있는 마커로서 lin-28의 사용 가능성을 실험을 통해 확인하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 뇌성마비를 유발시킨 마우스와 정상 마우스를 대상으로 뇌 조직을 추출하고 lin-28에 대한 항체를 이용하여 뇌세포 내의 lin-28의 발현변화를 분석한 결과, 정상 마우스에 비해 뇌성마비가 유발된 마우스의 뇌 조직에서 lin-28의 발현이 증가된 것으로 나타났다(도 1 참조).
따라서 본 발명자들은 lin-28을 뇌성마비의 발병 여부를 진단할 수 있는 바이오마커로 사용할 수 있다는 사실을 알 수 있었고, 특히 약 7일령의 어린 마우스를 대상으로 얻은 결과라는 점에서 성인이 아닌 어린이를 대상으로 한 뇌성마비 발병 여부의 가능성도 진단할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
따라서 본 발명은 lin-28 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 Lin-28 단백질로 이루어진 뇌성마비 질환 진단용 마커를 제공할 수 있다.
또한, 상기 본 발명에 따른 lin-28 유전자의 염기서열은 서열번호 1에 나타내었
본 발명에서, 상기 '진단'이라는 용어는 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 뇌성마비 질환 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 뇌성마비 질환의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 진단은 뇌성마비 질환 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 뇌성마비 질환의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.
또한, 상기 '진단용 마커(diagnosis marker)'란 뇌성마비 질환의 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 뇌성마비 질환의 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 뇌성마비 질환 진단용 마커는 정상 세포에 비해 뇌성마비 질환의 세포에서 발현양이 증가하는 lin-28 유전자 또는 단백질일 수 있으며, 바람직하게 상기 lin-28 유전자는 서열번호 1로 기재된 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 lin-28 단백질은 바람직하게 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 기능적 동등물일 수 있다
상기 '기능적 동등물'이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 lin-28과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, '실질적으로 동질의 활성'이란 상기에서 기재한 lin-28의 활성을 의미한다. 상기 '기능적 동등물'에는, 예를 들어, 본 발명에 따른 lin-28의 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함될 수 있다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있으며, 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 lin-28의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치할 수 있다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 lin-28의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 다른　단백질과　융합으로　만들어진 융합단백질 등이 이에 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 lin-28 유전자의 수준 또는 Lin-28 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 뇌성마비 질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 'lin-28 유전자의 수준'은, 바람직하게 lin-28 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 lin-28 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 lin-28 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 서열번호 1로 나타내는 lin-28 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.
본 발명에서 상기 '프라이머'란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 lin-28 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.
상기 '증폭 반응'은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기 '프로브'라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 Lin-28 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 lin-28 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 기술한 바와 같이 뇌성마비 질환을 진단할 수 있는 마커 단백질로서 Lin-28 단백질이 규명되었으므로, 상기 단백질을 이용하여 항체를 생성하는 방법은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 Lin-28 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol . Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
또한, 본 발명은 Lin-28 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 뇌성마비 질환 진단용 조성물을 포함하는 뇌성마비 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 뇌성마비 질환 진단용 키트에 포함되는 뇌성마비 질환 진단용 조성물은 Lin-28 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.
본 발명의 뇌성마비 질환 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 뇌성마비 질환 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명은 Lin-28 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 뇌성마비 질환 진단용 조성물을 포함하는 뇌성마비 질환 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, Lin-28 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
또한, 본 발명은 lin-28 유전자의 발현수준 또는 Lin-28 단백질 수준을 측정하여 뇌성마비의 질환을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은 (a) 생물학적 시료에 존재하는 lin-28 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 lin-28 유전자의 발현양 또는 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
상기에서 lin-28 유전자의 발현수준 또는 Lin-28 단백질 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 뇌성마비 질환 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 lin-28 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.
상기 lin-28 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 Lin-28 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 Lin-28 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 lin-28 mRNA 발현양 또는 단백질의 양과 뇌성마비 질환 환자 또는 뇌성마비 질환 의심환자에서의 lin-28 mRNA 발현양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현양의 정도를 대조군과 비교함으로써 뇌성마비 질환의 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
뇌성마비 유발 마우스 모델 제조
실험에 사용하게 될 마우스로서 체중 3~5 g의 C57BL/6 생쥐를 선택하였고, 실험기간 내내 실내 온도 22 ± 1℃, 습도 50%로 조정하고, 주야시간을 12시간씩 자동으로 부여되는 환경을 조성하여 사육하였다. 이후 상기 마우스를 대상으로 뇌성마비 질환 유도 방법은 1981년 Rice에 의해 보고된 방법에 의해 수행하였으며, 약간의 실험방법 만을 변경하여 수행하였다. 즉, 시험에 사용될 마우스로 7일령된 마우스를 4%의 헬로테인(halothane)이 함유되고 산화질소(70%)와 산소(30%)가 혼합된 혼합물로 마취시켰으며, 이때 마취 상태의 유지는 1.5%의 헬로테인을 사용하여 수행하였다. 이후, 목의 측면부를 절개하여, 우측 총경동맥(right common carotid artery)을 분리, 결찰하였다. 이후, 상처부위를 봉합하고 다시 사육장 내에서 2시간 동안 회복기를 갖도록 하였다. 그런 뒤, 항습온조에서 저산소 상태(8% 산소 및 질소 유지)에서 37℃의 온도 하에 35분간 방치하였다. 이후 1일이 지난 후, 희생시켜 하기 실험을 수행하였으며, 이때 대조군으로는 총경맥동맥 결찰을 제외하고는 모든 조건이 동일한 왼쪽 해마를 사용하였다.
< 실시예 2>
조직학적 분석
상기 실시예 1에서 제조된 뇌성마비 질환 마우스 동물모델을 대상으로 4% 파라포름알데히드가 함유된 0.1M 포스페이트 버퍼(PB;pH 7.4)로 관류하여 고정시킨 후, 마우스의 뇌를 적출한 다음, 30% 수크로오스에서 동결보호 시켰다. 이후 Tissue-tek(Sakura finetechnical, tokyo, japan)으로 임베드 시키고 액체 질소로 동결시켰다. 이후 뇌 조직을 20um 두께가 되도록 절편화 시킨 다음, 0.1M 포스페이트-버퍼-살린 용액(PBS; pH 7.4)으로 세척하고, 2% BSA(bovine serum albumin), 10% 정상 goat serum 및 0.1% Triton X-100이 함유된 0.01M PBS 용액으로 1시간 동안 블록킹 하였고, 4℃에서 밤새도록 래빗 항-lin28 항체(1:200, Santa cruz, USA)와 밤새도록 반응시켰다. 이후, 각 절편들은 Alexa Fluor 488-접합 항-래빗 IgG(1:500; Jackson ImmunoResearch, USA)과 2시간 동안 상온에서 반응시켰고, DAPI가 함유된 용액으로 상온에서 15분간 반응시켰다. 그런 뒤, 각 절편은 ProLong Gold Antifade 시약(Life technilogies, Grand Island, USA)을 사용하여 고정시켰고, 이후 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 허혈 손상을 받지 않은 반대쪽 뇌조직(도 1의 A, C는 A를 확대한 그림)에 비해 저산소성 허혈 손상이 가해진 뇌성마비가 유발된 마우스의 뇌조직의 신경세포(도 1의 B, D는 B의 확대 그림)에서 Lin-28의 발현이 증가하는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 lin-28의 유전자를 뇌성마비 질환 진단을 위한 바이오마커로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
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Claims (7)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. lin-28 유전자 또는 Lin-28 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 뇌성마비 질환 진단용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 lin-28 유전자의 수준을 측정하는 물질은 lin-28 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 뇌성마비 질환 진단용 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 Lin-28 단백질의 수준을 측정하는 물질은 Lin-28 단백질을 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 뇌성마비 질환 진단용 조성물.
  6. (a) 생물학적 시료에 존재하는 lin-28 유전자의 발현양 또는 Lin-28 단백질의 양을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 lin-28 유전자의 발현양 또는 Lin-28 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 뇌성마비 질환 진단을 위한 정보제공 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 및 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis)으로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 뇌성마비 질환 진단을 위한 정보제공 방법.
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