KR101845552B1 - 뇌손상 질환 진단용 마커로서의 Ｌｉｎ-28의 용도 - Google Patents
뇌손상 질환 진단용 마커로서의 Ｌｉｎ-28의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 뇌손상 질환 진단용 마커로서의 lin-28의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 lin-28 유전자를 이용한 뇌손상 질환 진단용 마커, 이를 이용한 뇌손상 질환 진단용 조성물, 키트, 마이크로어레이 및 뇌손상 질환의 진단 방법에 관한 것이고, 또한 lin-28 유전자 또는 단백질의 발현을 증가시켜 뇌손상 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법 및 상기 물질을 포함하는 뇌손상 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 lin-28 유전자는 비 뇌손상 질환 조직 또는 세포에 비해 뇌손상 질환의 조직 또는 세포에서 발현양이 증가되는 것으로 확인됨에 따라 lin-28 유전자를 뇌손상 질환 진단용 마커로 사용할 경우 뇌손상 질환을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있으며, 뇌손상 질환 치료제의 개발을 위한 표적으로 활용할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 뇌손상 질환을 조기에 효과적으로 진단 및 예측할 수 있는 신규한 뇌손상 질환 진단용 마커, 뇌손상 질환 진단용 조성물, 상기 뇌손상 질환 진단용 마커를 이용한 뇌손상 질환의 진단 방법 및 뇌손상 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
Lin-28은 마이크로 RNA (miRNA)의 초기 발달 과정에 중요한 역할을 하는 마이크로RNA-결합 단백질로 주목받고 있다. 마이크로 RNA는 small RNA (sRNA)의 일종으로, 19-25 nt 길이의 단일가닥 RNA 분자로서 세포 내에 존재하는 헤어핀-구조 전사체(hairpin RNA)에 의해 생성된다. miRNA는 생체 내의 여러 조절과정에서 중요한 역할을 하고, 특정 메신저 RNA(mRNA)에 특이적으로 결합하여 mRNA로부터 단백질이 생성되는 프로세싱을 억제한다. 구체적으로 miRNA는 표적 mRNA에 상보적으로 결합하여 번역후 유전자 억압인자로서 작용하며, 번역 억제와 mRNA 불안정화를 유도한다. 이러한 miRNA의 기능과 관련하여 최근 miRNA와 암과의 강한 연관이 증명되어 암 생물학 분야에서 새로운 연구 주제로 떠오르고 있다(Esquela-kerscher, A. and Slack, FJ., Nat. Rev. Cancer 6(4):259-269, 2006).
Lin-28과 관련하여, 대한민국 특허출원 제2008-0027881호 "마이크로ＲＮＡ 활성 측정 방법"(2008.03.26. 출원)에서는 마이크로ＲＮＡ 활성 측정 방법에 관한 것으로서, Lin-28이 암의 발생과 관련 있다는 사실을 통해 Lin-28의 활성을 억제하는 항암제를 스크리닝하는 방법에 대한 내용이 개시되어 있으며, 대한민국 특허출원 제2008-027880호 "마이크로ＲＮＡ 생성을 억제하는 드로셔 돌연변이"(2008.03.26. 출원)는 마이크로ＲＮＡ 생성을 억제하는 드로셔 돌연변이에 관하여 기재하고 있고, Lin-28을 억제할 경우 암을 치료할 수 있다는 내용이 개시되어 있다. 또한, 미국특허출원 제2008-682149호 "METHODS TO REGULATE MIRNA PROCESSING BY TARGETING LIN-28" 역시 Lin-28의 활성 억제를 통해 암을 치료할 수 있다는 내용이 개시되어 있다.
그러나 아직까지 Lin-28이 간질 또는 발작 등을 포함한 뇌손상 관련 질환과 관련이 있다는 내용에 대해서는 알려진 바가 없다.
이에 본 발명자들은 lin-28을 뇌손상 질환의 진단용 마커로 사용할 수 있다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 lin-28 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질로 이루어진 뇌손상 질환 진단용 마커를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 lin-28 유전자 또는 Lin-28 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 뇌손상 질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 뇌손상 질환 진단용 조성물을 포함하는 뇌손상 질환 진단용 키트 및 뇌손상 질환 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 lin-28 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계를 포함하는 뇌손상 질환 진단 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 뇌손상 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
나아가, 본 발명의 다른 목적은 lin-28 유전자의 발현을 촉진하는 물질을 포함하는 뇌손상 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 lin-28 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 Lin-28 단백질로 이루어진 뇌손상 질환 진단용 마커를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 lin-28 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 뇌손상 질환은 뇌졸중, 외상성 뇌손상, 뇌 감염 질환, 뇌 염증 질환, 허혈 상태, 저산소 상태, 퇴행성 신경질환, 크로이츠펠트 야곱병 및 신경사멸로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 뇌손상 질환은 간질 또는 발작일 수 있다.
또한, 본 발명은 lin-28 유전자 또는 Lin-28 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 뇌손상 질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 lin-28 유전자의 수준을 측정하는 물질은 lin-28 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Lin-28 단백질의 수준을 측정하는 물질은 Lin-28 단백질을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 뇌손상 질환은 뇌졸중, 외상성 뇌손상, 뇌 감염 질환, 뇌 염증 질환, 허혈 상태, 저산소 상태, 퇴행성 신경질환, 크로이츠펠트 야곱병 및 신경사멸로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은,
(a) 생물학적 시료에 존재하는 lin-28 유전자의 발현양 또는 Lin-28 단백질의 양을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 lin-28 유전자의 발현양 또는 Lin-28 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 뇌손상 질환 진단방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 및 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis)으로 이루어진 군중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 뇌손상 질환은 뇌졸중, 외상성 뇌손상, 뇌 감염 질환, 뇌 염증 질환, 허혈 상태, 저산소 상태, 퇴행성 신경질환, 크로이츠펠트 야곱병 및 신경사멸로 이루어진 군 중에서 선택된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은,
(a) lin-28 유전자 또는 Lin-28 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계;
(b) 상기 lin-28 유전자의 발현양, Lin-28 단백질의 양 또는 Lin-28 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, lin-28 유전자의 발현양, Lin-28 단백질의 양 또는 Lin-28 단백질의 활성이 증가되는 경우에 상기 시료는 뇌손상 질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 뇌손상 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 및 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 뇌손상 질환은 뇌졸중, 외상성 뇌손상, 뇌 감염 질환, 뇌 염증 질환, 허혈 상태, 저산소 상태, 퇴행성 신경질환, 크로이츠펠트 야곱병 및 신경사멸로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
나아가 본 발명은 lin-28 유전자의 발현유도를 통해 성체신경세포의 생성을 촉진시키는 물질을 포함하는 뇌손상 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 lin-28 유전자는 비 뇌손상 질환 조직 또는 세포에 비해 뇌손상 질환의 조직 또는 세포에서 발현양이 증가되는 것으로 확인됨에 따라 lin-28 유전자를 뇌손상 질환 진단용 마커로 사용할 경우 뇌손상 질환을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있으며, 나아가 뇌손상 질환 치료제의 개발을 위한 표적으로 활용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 필로카르핀으로 유도한 생쥐 경련중첩 모델에 대해 Nissl 염색으로 세포사멸 정도를 평가한 결과를 나타낸다. 경련중첩 손상 후 6시간째부터 치아이랑문(dentate hilar region)에서 신경세포의 사멸이 관찰되었으며(도 1B, 1D), 경련중첩 3일째부터는 해마의 CA1과 CA3 지역에서도 핵농축 세포가 관찰되었다(도 1G, 1H). 이러한 신경세포 사멸은 각 부위에서 처음 핵농축 세포가 관찰된 시점 이후로 지속적으로 유지됨을 확인하였다(도 1J-1L).
도 2 내지 4는 측두엽 간질 생쥐 모델을 이용하여 경련중첩 해마 손상을 가한 후, lin-28의 시간에 따른 발현 양상 변화를 확인한 결과를 나타낸다. 경련중첩 후 면역조직화학염색법으로 lin-28의 발현을 관찰한 결과, lin-28의 면역염색성이 치아이랑과 해마의 CA1, CA3 영역에서 나타남을 확인하였다(도 2). 치아이랑 부위를 확대하여 관찰하였을 때, lin-28은 경련중첩 후 6시간째 치아이랑의 아래쪽 과립세포층에서 발현되었고, 3일째 치아이랑의 아래쪽 과립세포층과 내분자층(inner molecular layer)에서 나타났다가, 이후 점차 감소하는 경향을 보였다(도 3B-3H). 해마의 CA3 지역에서는 경련중첩 후 3일째 투명층(stratum lucidum)에서 lin-28의 면역염색성이 현저히 증가하였으며, 경련중첩 7일에서 14일까지는 염색성이 지속되다가, 이후 감소하는 경향이 나타났다(도 4).
도 5는 일과성 전뇌 허혈 모델과 필로카르핀으로 유도한 경련 중첩 모델에서의 lin-28 발현을 비교한 결과이다. 일과성 전뇌 허혈, 필로카르핀으로 유도한 경련 중첩 손상 조직 및 각각의 sham을 제작하여 면역조직화학 염색을 실시한 결과, 일과성 전뇌 허혈 손상 조직에서는 lin-28의 면역염색성이 약하였으나, 경련중첩 후 3일째인 조직에서는 치아이랑에서의 면역염색성이 강하게 나타나는 것이 확인되었다(도 5).
도 6 내지 10은 해마에서 lin-28을 발현하는 세포의 종류를 규명한 것이다.
도 6은 경련중첩 손상 후 lin-28의 발현이 뚜렷하게 유도되는 3일째, 세포 분화 단계에 따른 다양한 세포 표지자를 이용하여 이중 형광 표지법으로 lin-28 발현 세포의 종류를 조사한 결과이다. lin-28 면역염색성은 GFAP를 발현하는 type I 줄기세포 또는 별아교세포에서는 나타나지 않았으나(도 6A-C), nestin을 발현하는 type II 줄기세포, 신경모세포의 표지자인 PSA-NCAM, 과립세포(granule cell)와 성숙 신경세포의 표지자인 prox-1과 NeuN과는 일치하는 세포가 있음을 확인하였다(도 6D-G, H-Q). 미성숙 신경세포의 표지자인 calretinin의 경우, lin-28은 다른 표지자들에 비해 비교적 많은 세포들에서 발현되었다(도 6H-J).
도 7은 경련중첩 후 나타나는 특징인 이끼섬유발아 (mossy fiber sprouting) 관련 표지자들을 이용하여 형광 이중 표지법으로 lin-28 발현 세포의 종류를 조사한 결과이다. lin-28 면역염색성은 축삭의 표지자인 synaptophysin과 대부분 일치하였으며(도 7A-C), glutamatergic axon의 표지자인 M6a (도 7D-F)와 신경섬유의 표지자인 NFT200 (도 7G-I)과도 일치하였다.
경련 중첩 후 3일째 해마의 CA3 지역에서 lin-28의 염색상은 synaptophysin, M6a, Znt-3의 이끼섬유발아 표지자들의 염색상의 위치에서 같이 발현되는 것을 확인하였다(도 8, 9, 10).
도 2 내지 4는 측두엽 간질 생쥐 모델을 이용하여 경련중첩 해마 손상을 가한 후, lin-28의 시간에 따른 발현 양상 변화를 확인한 결과를 나타낸다. 경련중첩 후 면역조직화학염색법으로 lin-28의 발현을 관찰한 결과, lin-28의 면역염색성이 치아이랑과 해마의 CA1, CA3 영역에서 나타남을 확인하였다(도 2). 치아이랑 부위를 확대하여 관찰하였을 때, lin-28은 경련중첩 후 6시간째 치아이랑의 아래쪽 과립세포층에서 발현되었고, 3일째 치아이랑의 아래쪽 과립세포층과 내분자층(inner molecular layer)에서 나타났다가, 이후 점차 감소하는 경향을 보였다(도 3B-3H). 해마의 CA3 지역에서는 경련중첩 후 3일째 투명층(stratum lucidum)에서 lin-28의 면역염색성이 현저히 증가하였으며, 경련중첩 7일에서 14일까지는 염색성이 지속되다가, 이후 감소하는 경향이 나타났다(도 4).
도 5는 일과성 전뇌 허혈 모델과 필로카르핀으로 유도한 경련 중첩 모델에서의 lin-28 발현을 비교한 결과이다. 일과성 전뇌 허혈, 필로카르핀으로 유도한 경련 중첩 손상 조직 및 각각의 sham을 제작하여 면역조직화학 염색을 실시한 결과, 일과성 전뇌 허혈 손상 조직에서는 lin-28의 면역염색성이 약하였으나, 경련중첩 후 3일째인 조직에서는 치아이랑에서의 면역염색성이 강하게 나타나는 것이 확인되었다(도 5).
도 6 내지 10은 해마에서 lin-28을 발현하는 세포의 종류를 규명한 것이다.
도 6은 경련중첩 손상 후 lin-28의 발현이 뚜렷하게 유도되는 3일째, 세포 분화 단계에 따른 다양한 세포 표지자를 이용하여 이중 형광 표지법으로 lin-28 발현 세포의 종류를 조사한 결과이다. lin-28 면역염색성은 GFAP를 발현하는 type I 줄기세포 또는 별아교세포에서는 나타나지 않았으나(도 6A-C), nestin을 발현하는 type II 줄기세포, 신경모세포의 표지자인 PSA-NCAM, 과립세포(granule cell)와 성숙 신경세포의 표지자인 prox-1과 NeuN과는 일치하는 세포가 있음을 확인하였다(도 6D-G, H-Q). 미성숙 신경세포의 표지자인 calretinin의 경우, lin-28은 다른 표지자들에 비해 비교적 많은 세포들에서 발현되었다(도 6H-J).
도 7은 경련중첩 후 나타나는 특징인 이끼섬유발아 (mossy fiber sprouting) 관련 표지자들을 이용하여 형광 이중 표지법으로 lin-28 발현 세포의 종류를 조사한 결과이다. lin-28 면역염색성은 축삭의 표지자인 synaptophysin과 대부분 일치하였으며(도 7A-C), glutamatergic axon의 표지자인 M6a (도 7D-F)와 신경섬유의 표지자인 NFT200 (도 7G-I)과도 일치하였다.
경련 중첩 후 3일째 해마의 CA3 지역에서 lin-28의 염색상은 synaptophysin, M6a, Znt-3의 이끼섬유발아 표지자들의 염색상의 위치에서 같이 발현되는 것을 확인하였다(도 8, 9, 10).
본 발명은 Lin-28 단백질과 뇌 손상의 관련성을 규명한 것으로서, 보다 구체적으로 lin-28 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 Lin-28 단백질로 이루어진 뇌손상 질환 진단용 마커를 제공함에 그 특징이 있다.
일반적으로 뇌 손상은 성체 마우스 해마(hippocampus)의 줄기세포 활성을 자극하므로, 본 발명은 필로카르핀 유도 간질 중첩 상태(pilocarpine-induced status epilepticus (SE)) 후에 마우스 해마에서 lin-28의 발현 가능성을 실험한 결과를 바탕으로 완성되었다.
즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 생쥐에 SE를 유도하기 위하여, 8주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 아트로핀 메틸 질산염(atropine methyl nitrate)(3 mg/kg, i.p.)을 주사한 30분 후에 필로카르핀 염산염(pilocarpine hydrochloride) (280 mg/kg, i.p.)을 투여하였고, 이후 2시간이 흐른 다음 디아제팜(diazepam)(10 mg/kg, i.p.)으로 발작을 종결시켰다. 필로카르핀-주사 동물들을 SE 발발 후 다른 시간대에서 안락사 시켰다. 이후, 식염수를 투여한 대조군과 비교한 결과, 치아이랑 (DG)에서 lin-28 발현이 SE 6시간 후에 증가하기 시작한 것을 확인할 수 있었다(도 3 참조). 또한, 치아이랑에서 lin-28의 발현은 과립세포층 안쪽(subgranular zone (SGZ))에서 나타났으며, SE 3일 후에는 SGZ를 포함한 치아이랑(DG), 과립세포층(granular cell layer (GCL)) 및 내분자층(inner molecular layer (IML))에서 lin-28에 대한 현저한 면역활성이 나타났으며, SE 14일 후에 lin-28의 발현을 관찰하였다(도 5 참조).
이러한 결과를 통해, 본 발명자들은 뇌손상이 발생된 경우, 그렇지 않은 경우에 비해 세포 내에서 lin-28의 발현이 증가되어 있다는 사실을 확인함으로써 lin-28을 뇌손상 질환 발병의 여부를 진단할 수 있는 진단용 마커로 사용할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
나아가 본 발명자들은 lin-28이 뇌손상에 의한 성체신경세포에서 상기 세포들의 회복 또는 생성에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위해 본 발명의 일실시예에서는 다음과 같은 실험을 수행하였는데, 즉, 이중표지 실험을 통해 lin-28과 함께 발현되는 신경세포 표지인자들 및 lin-28이 발현되는 세포의 종류들을 조사한 결과, lin-28-양성 세포들이 SE 발발 3일째 SGZ에서 nestin, PSA-NCAM, calretinin, Prox-1 및 NeuN과 함께 위치(co-localized)하는 것으로 나타났으며(도 6 참고), 이러한 결과는 lin-28이 발현하는 세포들의 경우, type II 줄기세포, 신경모세포(neuroblast), 미성숙 및 성숙한 과립형 뉴런(granule neurons)으로 이동할 수 있다는 것을 의미하며, 나아가 뇌손상 시 발현이 유도되는 lin-28은 성체신경세포의 생성을 향상 또는 촉진하는 작용을 통해 뇌손상 정도를 감소 또는 치료하는 작용을 할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
따라서 본 발명은 lin-28 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 Lin-28 단백질로 이루어진 뇌손상 질환 진단용 마커를 제공할 수 있다.
또한, 상기 본 발명에 따른 lin-28 유전자의 염기서열은 서열번호 1에 나타내었
본 발명에서, 상기 "진단"이라는 용어는 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 뇌 손상 질환 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 뇌 손상 질환의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 "진단"은 뇌 손상 질환 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 뇌 손상 질환의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.
또한, 상기 "진단용 마커(diagnosis marker)"란 뇌 손상 질환의 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 뇌 손상 질환의 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 뇌 손상 질환 진단용 마커는 정상 세포에 비해 뇌 손상 질환의 세포에서 발현양이 증가하는 lin-28 유전자 또는 단백질일 수 있으며, 바람직하게 상기 lin-28 유전자는 서열번호 1로 기재된 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 lin-28 단백질은 바람직하게 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 기능적 동등물일 수 있다
상기 '기능적 동등물'이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 lin-28과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, '실질적으로 동질의 활성'이란 상기에서 기재한 lin-28의 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 본 발명에 따른 lin-28의 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함될 수 있다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있으며, 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 lin-28의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치할 수 있다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 lin-28의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 다른 단백질과 융합으로 만들어진 융합단백질 등이 이에 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 lin-28 유전자의 수준 또는 Lin-28 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 뇌 손상 질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 lin-28 유전자의 수준은, 바람직하게 lin-28 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 lin-28 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 lin-28 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 서열번호 1로 나타내는 lin-28 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.
본 발명에서 상기 "프라이머"란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 lin-28 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.
상기 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기 "프로브"라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 Lin-28 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 lin-28 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 "항체"를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 기술한 바와 같이 뇌 손상 질환을 진단할 수 있는 마커 단백질로서 Lin-28 단백질이 규명되었으므로, 상기 단백질을 이용하여 항체를 생성하는 방법은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 Lin-28 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
또한, 본 발명은 Lin-28 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 뇌 손상 질환 진단용 조성물을 포함하는 뇌 손상 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 뇌 손상 질환 진단용 키트에 포함되는 뇌 손상 질환 진단용 조성물은 Lin-28 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.
본 발명의 뇌 손상 질환 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 뇌 손상 질환 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명은 Lin-28 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 뇌 손상 질환 진단용 조성물을 포함하는 뇌 손상 질환 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, Lin-28 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
또한, 본 발명은 lin-28 유전자의 발현수준 또는 Lin-28 단백질 수준을 측정하여 뇌 손상 질환을 진단하는 방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은 (a) 생물학적 시료에 존재하는 lin-28 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 lin-28 유전자의 발현양 또는 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
상기에서 lin-28 유전자의 발현수준 또는 Lin-28 단백질 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 뇌 손상 질환 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 lin-28 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.
상기 lin-28 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 Lin-28 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 Lin-28 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 lin-28 mRNA 발현양 또는 단백질의 양과 뇌 손상 질환 환자 또는 뇌 손상 질환 의심환자에서의 lin-28 mRNA 발현양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현양의 정도를 대조군과 비교함으로써 뇌 손상 질환의 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.
나아가 본 발명은 (a) lin-28 유전자 또는 lin-28 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 lin-28 유전자의 발현양, Lin-28 단백질의 양 또는 Lin-28 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, lin-28 유전자의 발현양, Lin-28 단백질의 양 또는 Lin-28 단백질의 활성이 증가되는 경우에 상기 시료는 뇌 손상 질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 뇌 손상 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 따르면, 먼저 lin-28 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킬 수 있다. 여기서 상기??시료??는 lin-28 유전자의 발현양, Lin-28 단백질의 양 또는 Lin-28 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 시료가 처리된 세포에서 lin-28 유전자의 발현양, Lin-28 단백질의 양 또는 Lin-28 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, lin-28 유전자의 발현양, Lin-28 단백질의 양 또는 Lin-28 단백질의 활성이 증가되는 것이 측정되면 상기 시료는 뇌 손상 질환을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판정될 수 있다.
상기에서 lin-28 유전자의 발현양, Lin-28 단백질의 양 또는 Lin-28 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 및 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis)등을 이용하여 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 lin-28 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 Lin-28 단백질의 발현 및 활성을 증가시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 뇌 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 화학물질, 뉴클레오티드 또는 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다.
상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 "투여"란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.
또한, 상기에서 "유효량" 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
생쥐의 경련중첩 유도
<1-1>
실험동물의 사육
실험에 사용하게 될 동물로 체중 22~23 g의 수컷 C57BL/6 생쥐를 선택하였고, 실험기간 내내 실내 온도 22 ± 1℃, 습도 50%로 조정하고, 주야시간을 12시간씩 자동으로 부여되는 환경을 조성하여 사육하였다.
<1-2>
생쥐 경련 중첩 모델
실험에 사용될 생쥐는 먼저 아트로핀과 터부탈린 각각 2 mg/kg을 복강 주사하여 필로카르핀의 말초작용을 최소화시켰다. 투여 30분 후, 필로카르핀 (280 mg/kg)을 복강 내로 투여하여 발작이 일어나는지 관찰하였다. 대조군은 필로카르핀 투여 대신 식염수를 투여하였다. 발작의 단계는 Racine Scale (Racine J.R., 1972)에 의거하여 (단계1 : Facial automatism, 단계2 : Head nodding, 단계3 : Forelimb clonus, 단계4 : Rearing, 단계5 : Rearing and Falling) 평가하였다. 이러한 단계를 거쳐 단계5의 간대성근경련 (myoclonus)의 행동을 보이는 경련중첩증 (Status Epilepticus; SE) 단계에 이르게 되었다. SE에 해당되는 동물을 선별하여 SE 시작 후 2시간 시점에서 디아제팜 (10 mg/kg, I.P.)으로 발작을 종결시켰다. 종결 후 인큐베이터(incubator) 온도를 32℃로 설정하고 5일 동안 음용수에 녹인 10% 수크로오스(sucrose)와 먹이로 회복을 도왔다. SE 발생 후 6시간, 24시간, 3일, 7일, 2주, 4주, 8주째 동물들을 안락사 시켰다.
또한, Nestin-GFP transgenic mice를 사용하여 lin-28을 발현하는 줄기세포를 확인하였다. C57BL/6 생쥐보다 경련 중첩에 더 예민하기 때문에 필로카르핀의 용량을 170 mg/kg으로 낮춰서 경련 중첩을 유도하였다. 위에 기술된 방법과 동일하게 진행하고 SE 발생 후 3일에 안락사시켰다.
<
실시예
2>
세포사멸 확인
<2-1>
조직 수집
Chloral hydrate (250 mg/kg, I.P.)로 마취하고 흉부를 절개하였다. Clamp로 하대동맥을 차단한 후 좌심실로 생리식염수를 5분간 관류시켰다. 관류 후 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 100ml를 40분에서 1시간 동안 관류하여 고정시킨 후 뇌를 적출하였다. 적당한 크기로 절단하여 4% 파라포름알데히드에 하루 동안 후고정하고 30% 수크로오스에서 3일간 탈수시켰다. OCT compound에 조직을 넣고 액체질소로 얼린 후 cryotome을 이용하여 20 ㎛ 두께로 3장당 하나씩, 각 조직 간의 간격을 100 ㎛를 유지한 상태로 슬라이드에 고정시켰다.
<2-2>
크레실
바이올렛 염색(
cresyl
violet
staining
)
100%, 95%, 90%, 80%, 70% 에탄올과 tap water에서 3분씩 수화작용하고 0.1% 크레실 바이올렛 용액에서 20분간 염색시켰다. 95% 에탄올에서 탈색시키고 크실렌 (xylene) 100%를 거쳐 Canada balsam으로 슬라이드에 고정시켰다. 그 후 광학현미경 (BX51, Olympus, Japan)을 통해 해마의 세포사멸 정도를 확인하였다.
필로카르핀으로 경련중첩을 유도한 후, Nissl 염색으로 세포사멸 정도를 평가한 결과, 경련중첩 손상 후 6시간째부터 치아이랑문(dentate hilar region)에서 신경세포의 사멸이 관찰되었으며(도 1B, 1D), 경련중첩 3일째부터는 해마의 CA1과 CA3 지역에서도 핵농축 세포가 관찰되었다(도 1G, 1H). 이러한 신경세포 사멸은 각 부위에서 처음 핵농축 세포가 관찰된 시점 이후로 지속적으로 유지됨을 확인하였다(도 1J-1L).
<
실시예
3>
면역조직화학염색
SE 발생 후 6시간, 24시간, 3일, 7일, 2주, 4주, 8주 조직에 일차항체 항-lin-28을 (1:200, Santa cruz, USA) 24시간 처리하였다. 다음날 상온에서 비오틴화된 항-토끼 IgG (1:200, Vector Laboratories, USA)를 2시간 처리하고, 아비딘-비오틴 과산화효소 복합체 용액(avidin-biotin peroxidase complex solution) (1:50, Vector Laboratories) 처리 1시간 후에 3,3-Diaminobenzidine (DAB)과 과산화수로 발색하였다. lin-28의 발현 양상을 광학현미경을 통해 SE에 의한 손상 후 해마에서 시간에 따른 lin-28의 발현 변화를 관찰하였다.
경련중첩 후 면역조직화학염색법으로 lin-28의 발현을 관찰한 결과, lin-28의 면역염색성이 치아이랑과 해마의 CA1, CA3 영역에서 나타남을 확인하였다(도 2). 치아이랑 부위를 확대하여 관찰하였을 때, lin-28은 경련중첩 후 6시간째 치아이랑의 아래쪽 과립세포층에서 발현되었고, 3일째 치아이랑의 아래쪽 과립세포층과 내분자층(inner molecular layer)에서 나타났다가, 이후 점차 감소하는 경향을 보였다(도 3B-3H). 해마의 CA3 지역에서는 경련중첩 후 3일째 투명층(stratum lucidum)에서 lin-28의 면역염색성이 현저히 증가하였으며, 경련중첩 7일에서 14일까지는 염색성이 지속되다가, 이후 감소하는 경향이 나타났다(도 4).
일과성 전뇌 허혈, 필로카르핀으로 유도한 경련 중첩 손상 조직 및 각각의 대조군인 sham을 제작하여 면역조직화학염색을 실시한 결과, 일과성 전뇌 허혈 손상 조직에서는 lin-28의 면역염색성이 약하나, 경련중첩 후 3일째 조직에서는 치아이랑에서의 면역염색성이 강하게 나타나는 것이 확인되었다(도 5).
또한, lin-28을 발현하는 세포유형을 규명하기 위해 항-lin-28 항체를 다음과 같은 일차항체들과 함께 24시간 냉장 처리하였다. 세포 발생 단계에 해당되는 표지자들로 Type Ⅰ stem cell: GFAP; Type Ⅱ progenitor cell: nestin-GFP; type Ⅲ progenitor cell: PSA-NCAM; immature granule cell: calretinin, prox-1; mature granule cell: NeuN의 표지자들로 확인할 수 있고 각 단계에 해당되는 일차항체들을 조직에 배양하였다. 이끼섬유발아 (mossy fiber sprouting) 관련 표지자들로 synaptophysin, neurofliament 200, M6a, Znt-3의 일차 항체들로 확인하였고 수상돌기 표지자로 MAP-2의 일차 항체를 사용하였다. 다음날 상온에서 Cy3-conjugated anti-rabbit IgG (1:500, Jackson Laboratories, USA)과 Alexa 488 anti-mouse IgG (1:200, Invitrogen, USA)를 처리하였다. 다중 공초점 현미경 (MRC 1024, Bio-Rad, USA)을 이용하여 해마의 치아이랑과 CA3 지역에서 lin-28과 각 표지자들 간에 병합이 되는지 관찰하였다.
그 결과, 경련중첩 손상 후 lin-28의 발현이 뚜렷하게 유도되는 3일째, 세포 분화 단계에 따른 다양한 세포 표지자를 이용하여 이중 형광 표지법으로 lin-28 발현 세포의 종류를 조사하였더니, 도 6에 나타난 바와 같이, lin-28 면역염색성은 GFAP를 발현하는 type I 줄기세포 또는 별아교세포에서는 나타나지 않았으나(도 6A-C), nestin을 발현하는 type II 줄기세포, 신경모세포의 표지자인 PSA-NCAM, granule cell과 성숙 신경세포의 표지자인 prox-1과 NeuN과는 일치하는 것으로 나타났다(도 6D-G, H-Q). 또한, 미성숙 신경세포의 표지자인 calretinin의 경우, lin-28은 다른 표지자들에 비해 비교적 많은 세포들에서 발현되었다(도 6H-J).
또한, 경련중첩 후 나타나는 특징인 이끼섬유발아(mossy fiber sprouting) 관련 표지자들을 이용하여 형광 이중 표지법으로 lin-28 발현 세포의 종류를 조사하한 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, lin-28 면역염색성은 축삭의 표지자인 synaptophysin과 대부분 일치하였으며(도 7A-C), glutamatergic axon의 표지자인 M6a (도 7D-F)와 신경섬유의 표지자인 NFT200(도 7G-I)과도 일치하였다. 경련 중첩 후 3일째 해마의 CA3 지역에서 lin-28의 염색상은 synaptophysin, M6a, Znt-3의 이끼섬유발아 표지자들의 염색상의 위치에서 같이 발현되는 것을 확인하였다(도 8, 9, 10).
따라서 이와 같은 결과를 통해 본 발명자들은 뇌손상이 유발되었을 경우, 뇌손상에 유발되지 않은 경우에 비해 lin-28의 발현이 증가되는 것으로 나타났고, 이를 통해 lin-28을 뇌손상 질환 진단용 마커로 사용할 수 있다는 사실을 알 수 있었다. 뿐만아니라 경련중첩 후 lin-28의 발현이 유도되는 세포들의 분석 결과, 성체신경세포 생성과 관련된 유전자들의 발현이 lin-28의 발현과 일치한다는 사실을 통해 lin-28은 뇌손상 시 성체신경세포의 생성이 작용하여 뇌손상 질환을 치료 또는 예방하는 기작에 관여한다는 사실을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University of Korea
<120> Use of Lin-28 as a diagnostic marker for brain injury
<160> 2
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 630
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> lin-28 cDNA sequence
<400> 1
atgggctcgg tgtccaacca gcagtttgca ggtggctgcg ccaaggcagc ggagaaggcg 60
ccagaggagg cgccgcctga cgcggcccga gcggcagacg agccgcagct gctgcacggg 120
gccggcatct gtaagtggtt caacgtgcgc atggggttcg gcttcctgtc tatgaccgcc 180
cgcgctgggg tcgcgctcga ccccccggtg gacgtctttg tgcaccagag caagctgcac 240
atggaagggt tccgaagcct caaggagggt gaggcggtgg agttcacctt taagaagtct 300
gccaagggtc tggaatccat ccgtgtcact ggccctggtg gtgtgttctg tattgggagt 360
gagcggcggc caaaagggaa gaacatgcag aagcgaagat ccaaaggaga caggtgctac 420
aactgcggtg ggctagacca tcatgccaag gaatgcaagc tgccacccca gcccaagaag 480
tgccactttt gccaaagcat caaccatatg gtggcctcgt gtccactgaa ggcccagcag 540
ggccccagtt ctcagggaaa gcctgcctac ttccgggagg aagaggaaga gatccacagc 600
cctgccctgc tcccagaagc ccagaattga 630
<210> 2
<211> 209
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> lin-28 amino acid sequence
<400> 2
Met Gly Ser Val Ser Asn Gln Gln Phe Ala Gly Gly Cys Ala Lys Ala
1 5 10 15
Ala Glu Lys Ala Pro Glu Glu Ala Pro Pro Asp Ala Ala Arg Ala Ala
20 25 30
Asp Glu Pro Gln Leu Leu His Gly Ala Gly Ile Cys Lys Trp Phe Asn
35 40 45
Val Arg Met Gly Phe Gly Phe Leu Ser Met Thr Ala Arg Ala Gly Val
50 55 60
Ala Leu Asp Pro Pro Val Asp Val Phe Val His Gln Ser Lys Leu His
65 70 75 80
Met Glu Gly Phe Arg Ser Leu Lys Glu Gly Glu Ala Val Glu Phe Thr
85 90 95
Phe Lys Lys Ser Ala Lys Gly Leu Glu Ser Ile Arg Val Thr Gly Pro
100 105 110
Gly Gly Val Phe Cys Ile Gly Ser Glu Arg Arg Pro Lys Gly Lys Asn
115 120 125
Met Gln Lys Arg Arg Ser Lys Gly Asp Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Gly
130 135 140
Leu Asp His His Ala Lys Glu Cys Lys Leu Pro Pro Gln Pro Lys Lys
145 150 155 160
Cys His Phe Cys Gln Ser Ile Asn His Met Val Ala Ser Cys Pro Leu
165 170 175
Lys Ala Gln Gln Gly Pro Ser Ser Gln Gly Lys Pro Ala Tyr Phe Arg
180 185 190
Glu Glu Glu Glu Glu Ile His Ser Pro Ala Leu Leu Pro Glu Ala Gln
195 200 205
Asn
Claims (15)
- lin-28 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 Lin-28 단백질로 이루어진 뇌전증 진단용 마커.
- 제1항에 있어서,
상기 lin-28 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 마커.
- 삭제
- 삭제
- lin-28 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 Lin-28 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 뇌전증 진단용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- (a) 생물학적 시료에 존재하는 lin-28 유전자의 발현양 또는 Lin-28 단백질의 양을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 lin-28 유전자의 발현양 또는 Lin-28 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물의 뇌전증진단방법. - 제9항에 있어서,
상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 및 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis)으로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물의 뇌전증 진단방법. - 제9항 또는 제10항에 있어서,
상기 뇌전증의 원인은 뇌졸중, 외상성 뇌손상, 뇌 감염 질환, 뇌 염증 질환, 허혈 상태, 저산소 상태, 퇴행성 신경질환 및 신경사멸로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물의 뇌전증 진단방법. - (a) lin-28 유전자 또는 Lin-28 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계;
(b) 상기 lin-28 유전자의 발현양, Lin-28 단백질의 양 또는 Lin-28 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, lin-28 유전자의 발현양, Lin-28 단백질의 양 또는 Lin-28 단백질의 활성이 감소되는 경우에 상기 시료는 뇌손상 질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 뇌전증 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법. - 제12항에 있어서,
상기 (b) 단계의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 및 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis)으로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 뇌전증 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법.
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- 삭제
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