KR20140049984A - 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측용 조성물 및 방법 - Google Patents

유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측용 조성물 및 방법 Download PDF

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도레이 카부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측을 위한 조성물 및 방법, 구체적으로는, 서열표에 기재되는 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편, 또는 그들에 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 Her2 단백질의 발현량의 증감을 지표로 하여 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측하기 위한 조성물, 키트, DNA 칩 및 방법 에 관한 것이다.

Description

유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측용 조성물 및 방법{COMPOSITION FOR PREDICTING SENSITIVITY TO TRASTUZUMAB THERAPY IN BREAST CANCER PATIENTS AND METHOD USING SAME}
본 발명은 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측(또는, 판정, 평가, 검출 또는 진단)에 유용한 조성물, 상기 조성물을 이용한 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측(또는, 판정, 평가, 검출 또는 진단) 방법, 및 상기 조성물을 이용한 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측(또는, 판정, 평가, 검출 또는 진단)용 키트에 관한 것이다.
유방암이란, 유방 조직 내의 세포가 악성화하여 무질서하게 증식하는 질환이며, 여성의 이환율은 일본에서 25명 내지 30명당 1명, 구미에서는 8 내지 10명당 1명이 된다. 또한, 이환율은 낮지만 남성도 유방암으로 이환하는 것이 알려져 있다. 최근의 연구에 의해, 유방암은 서로 다른 생물학적 특성을 갖는 다양한 집단으로 이루어져 있어, 치료에 대한 반응성이나 예후가 각각의 집단의 환자에게서 상이한 것을 알게 되었다. 즉, DNA 칩 해석에 의한 망라적인 발현 유전자 해석에 의해 유방암은 크게 특히 5개의 분자 서브 타입으로 분류할 수 있음이 시사되었다. 단, 일상 임상에서는, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, Her2 단백질의 발현을 검출함으로써 4개의 서브 타입으로 분류하여 치료 방침이 검토되는 경우가 많다. 유방암의 치료는 원칙적으로는 외과 요법이지만, 진행도나 전이, 전신 상태, 유방암의 분류에 따라 약물 요법이나 방사선 요법이 병용된다. 특히 약물 요법의 실시에서는, 상술한 유방암 서브 타입에 따라 대상 환자에게 투여해야 할 약물을 평가하고, 적절한 치료 방침을 선택하는 것이 중요하다(비특허문헌 1).
이러한 서브 타입 중에서, 유방암의 약 25%를 차지하는 Her2 양성 유방암은 악성도, 전이율이 높아 예후 불량이며, Her2 양성 유방암의 치료 성적의 향상은 앞으로도 매우 중요한 과제로 되어 있다.
트라스투주마브(상품명 "허셉틴"(등록 상표, 주가이 제약))는, 후생노동부에 의해 인가된 항체 의약이며, Her2 양성 유방암의 세포 표면에 존재하는 Her2 단백질에 결합함으로써 항종양 효과를 일으킨다. 트라스투주마브는 Her2 양성 유방암에 대하여 사용되는 제1 선택 약이다. 그러나 한편, Her2 양성 유방암 환자 중에는, 트라스투주마브의 효과가 없는 트라스투주마브 비감수성 유방암 환자나, 트라스투주마브의 투약에 의해 심부전·호흡 곤란·알레르기와 같은 심각한 부작용을 일으키는 환자의 존재도 알려져 있다. 현재의 임상 진단에 있어서 유방암이 Her2 양성인지의 여부를 구별하기 위해 사용되고 있는 방법은, 면역조직 화학적 방법에 의한 Her2 단백질의 과잉 발현의 검출, 및/또는 Her2 단백질에 대응하는 게놈 상의 유전자 증폭의 검출인데, 이러한 방법으로는 상술한 Her2 양성임에도 불구하고 트라스투주마브 비감수성을 나타내는 유방암 환자 및 부작용을 병발하는 유방암 환자를 판별할 수는 없다.
구체적으로는, 면역조직 화학적 방법에 의해 Her2 단백질의 과잉 발현이 인정되고, 트라스투주마브 단제에 의한 치료를 받은 환자 중 트라스투주마브에 감수성을 나타낸 환자의 비율은 35% 이하인 것으로 알려지고 있고(비특허문헌 2), 면역조직 화학적 방법에 의한 Her2 단백질의 과잉 발현의 검출 또는 Her2 단백질에 대응하는 게놈 상의 유전자 증폭의 검출에 의해 Her2 양성을 구별하는 검사 방법(비특허문헌 3의 검사 방법)에 있어서, 트라스투주마브에 다른 항암제를 조합한 치료를 받은 환자 중 트라스투주마브에 감수성을 나타낸 환자의 비율은 65.2% 이하인 것으로 알려져 있다(비특허문헌 3). 즉, 현재, 임상 현장에서 이용되고 있는 비특허문헌 3의 검사 방법에서의 트라스투주마브 감수성 예측의 정밀도는 65.2%에 그친다.
한편, 유방암 치료를 위한 약물 요법은 특히 최근에 눈부신 발전을 이루고 있어, 암의 성질에 따라서 다양한 치료약을 선택하는 것이 가능해지고 있다. 이러한 상황에서, 현재, Her2 양성을 구별하기 위해 사용되고 있는 방법 이상으로 높은 정밀도로, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측하는 것이 가능하게 되면, Her2 양성 유방암 환자의 치료법의 선택을 보다 용이하게 하고, 약물 요법의 효과의 최대화 및 부작용의 최소화를 이룰 수 있다고 생각된다.
지금까지의 Her2 양성 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성에 관한 보고에는, 비특허문헌 4에 기재된 PTEN 단백질의 활성화, 비특허문헌 5에 기재된 시클린(Cyclin) E의 유전자 증폭 및/또는 과잉 발현, 비특허문헌 6에 기재된 miR-125a 및/또는 miR-125b에 의한 Her2 단백질 발현의 제어에 대한 것이 존재한다.
비특허문헌 4에서는, Her2 양성 유방암 환자의 PTEN의 발현량을 면역조직 화학적 방법으로 평가하여, PTEN의 발현을 억제한 세포는 트라스투주마브에 의한 증식 억제를 받기 어려운 것, PTEN의 발현량이 Her2 양성 유방암 환자의 트라스투주마브에 의한 병세 진행의 억제와 상관하고 있는 것을 나타내고 있다.
또한 비특허문헌 5에서는, Her2 양성 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 환자에게서의 Cyclin E 단백질의 발현량을 면역조직 화학적 방법으로 평가하여, 트라스투주마브와 다른 항암제에 의한 치료를 받은 환자군에서 Cyclin E 단백질의 발현량이 많은 군에서는 병세가 진행되지 않은 환자의 비율이 높았던 것을 나타내고 있다.
또한, 비특허문헌 6은 miR-125a 및 miR-125b의 발현량 증가가 트라스투주마브의 표적 단백질인 Her2 단백질의 발현량을 저하시키는 것을 나타내고 있다.
또한, let-7a(특허문헌 1), let-7b(특허문헌 1), 및 miR-145(특허문헌 2)는, 유방암 환자에게서 발현량이 저하되는 것, 그리고 miR-200c(특허문헌 3)는 유방암 환자에게서 발현량이 상승하는 것으로 알려진다.
US2008/0076674 A1 일본 특허 공표 제2010-510964호 일본 특허 공표 제2010-504350호
일본 유방암 학회편 유방암 취급 규약 제16판 2008년, 일본 유방암 학회편 유방암 진료 가이드 라인 1. 약물요법 2010년판 2010년 C. L. Vogel 등, 2002년, Journal of Clinical Oncology, 제20권, p.719-726 A. U. Buzdar 등, 2005년, Journal of Clinical Oncology, 제23권, p3676-3685 Yoichi, N. 등, 2004년, Cancer Cell, 제6권, p.117-127 Maurizio, S. 등, 2011년, Proc Natl Acad Sci USA., Early Edition, pnas. 1014835108 Scott, GK. 등, 2007년, J Biol Chem., 제282권, p.1479-1486
이와 같이, 선행 기술에 있어서 트라스투주마브에 대한 치료 감수성과 결과적으로 상관하는 발현량을 나타내는 유전자, 단백질은 복수 알려져 있지만, 어느 것이든 Her2 양성 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측하는 마커로서의 가치는 충분히 발견되지 않았다.
비특허문헌 4의 PTEN은 PTEN의 발현량에 따라 개개의 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 투여 전에 예측하는 것은 불가능하다. 그리고, 비특허문헌 5의 Cyclin E는 Cyclin E 단백질의 발현량에 따라 개개의 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측할 수는 없다. 또한, 비특허문헌 6의 miR-125a 및 miR-125b는, miR-125a 및 miR-125b의 발현량 증가와 Her2 양성 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 관계가 불분명해서, 어느 것을 사용해도 개개의 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측할 수는 없다. 따라서, 이러한 발현량을 지표로 사용하여 일반적으로 임상상의 이용은 행해지고 있지 않아, 예측 정밀도가 높은 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 마커가 더욱 절실해지고 있다.
본 발명은 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측(또는, 판정, 평가, 검출 또는 진단)에 유용한 조성물, 상기 조성물을 이용한 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측(또는, 판정, 평가, 검출 또는 진단) 방법, 및 상기 조성물을 이용한 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측(또는, 판정, 평가, 검출 또는 진단)용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 감수성 예측용의 유전자 마커 탐색의 방법으로서는, 유방암 환자에 대한 트라스투주마브에 의한 치료 또는 트라스투주마브와 그 밖의 항암제의 병용에 의한 치료에 의해 검사 시, 치료 전, 치료 중, 또는 치료 후에 채취하는 유방암 환자 유래 조직, 체액 또는 분비물에 포함되는 유전자, 단백질, 또는 대사 산물 등의 양을 트라스투주마브에 대한 치료 감수성이 있는 환자와 트라스투주마브에 대한 치료 감수성이 없는 환자의 사이에서 어떠한 수단을 사용하여 비교하는 방법을 들 수 있다.
DNA 칩을 사용한 유전자 발현량 해석은, 최근 들어, 이러한 마커 탐색의 방법으로서 특히 범용되고 있다. DNA 칩에는 수백 내지 수만 종의 유전자에 대응한 염기 서열을 이용한 프로브가 고정되어 있다. 피검 시료를 DNA 칩에 첨가함으로써 시료 중의 유전자가 프로브와 결합하고, 이 결합량을 어떠한 수단에 의해 측정함으로써, 피검 시료 중의 유전자량을 알 수 있다. DNA 칩 상에 고정화하는 프로브에 대응한 유전자의 선택은 자유로우며, 또한 검사 시, 치료 전, 치료 중, 또는 치료 후에 채취하는 유방암 환자 유래 조직, FFPE 표본, 체액 또는 분비물 등의 시료를 사용하여, 상기 시료 중의 유전자 발현량을 비교함으로써 유방암의 진단에 이용 가능한 마커가 될 수 있는 유전자군을 추정하는 것이 가능하다.
상기의 과제를 해결하기 위해서, 본 발명자들은 치료 전의 유방암 환자로부터 채취한 유방암 병변부의 침생검 조직으로부터 얻은 유전자 발현량을 DNA 칩에 의해 해석하여, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측할 수 있는 마커가 되는 유전자를 발견하고, 또한 그러한 유전자 발현량이 트라스투주마브에 대한 치료 감수성이 높은 유방암 환자에게서, 유방암 환자로부터 얻은 유방암 병변부의 유전자 발현량이 감소, 저감 또는 증가, 증대하고 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.
1. 발명의 개요
본 발명은 이하의 특징을 갖는다.
본 발명은 제1 형태에서, 하기의 (a) 내지 (j)에 나타내는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체 또는 그의 단편으로 이루어지는 군에서 선택되는 2 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측용 조성물을 제공한다.
(a) 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편
(b) 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드
(c) 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편
(d) 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드
(e) 상기 (a) 내지 (d) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편
(f) 서열 번호 10 및 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편
(g) 서열 번호 10 및 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드
(h) 서열 번호 10 및 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편
(i) 서열 번호 10 및 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드
(j) 상기 (f) 내지 (i) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편.
본 발명은 제2 형태에서, 상기의 (a) 내지 (e)에 나타내는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체 및/또는 그의 단편의 2 이상을 포함하는, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측용 키트를 제공한다.
그 실시 형태에서, 상기 키트는, 상기의 (f) 내지 (j)에 나타내는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체 및/또는 그의 단편의 1 또한 2를 더 포함한다.
또한, 상기 폴리뉴클레오티드가, 서열 번호 1 내지 23 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그의 상보적 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그들의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그들의 16 이상의 연속된 염기의 2 이상을 포함하는 단편인, 상기의 키트를 제공한다.
또한 다른 실시 형태에서, 상기 폴리뉴클레오티드가 별개로 또는 임의로 조합되어 다른 용기에 포장되어 있는, 상기의 키트를 제공한다.
본 발명은 제3 형태에서, 상기의 (a) 내지 (e)에 나타내는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체 및/또는 그의 단편의 2 이상을 포함하는, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측용 DNA 칩을 제공한다.
그 실시 형태에서, 상기 DNA 칩은, 상기의 (f) 내지 (j)에 나타내는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체 및/또는 그의 단편의 1 또한 2를 더 포함한다.
본 발명은 제4 형태에서, 상기의 조성물의 폴리뉴클레오티드의 유방암 환자 유래의 시료에서의 표적 핵산의 발현량의 2 이상을 측정하여, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 시험관내에서 예측, 판정 또는 평가하는 것을 포함하는, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측을 위한 방법을 제공한다.
그 실시 형태에서, 상기의 방법은, 본 발명의 제2 형태에 기재된 키트를 사용한다.
다른 실시 형태에서, 상기의 방법은, 본 발명의 제3 형태에 기재된 DNA 칩을 사용한다.
본 발명은 또한, 제5 형태에서, 상기 중 어느 한 항에 기재된 조성물, 상기 중 어느 한 항에 기재된 키트, 상기 중 어느 한 항에 기재된 DNA 칩, 또는 그들의 조합을 사용하여, 유방암 환자가 트라스투주마브에 대하여 치료 감수성을 갖는 것이 기지의 복수의 시료 중 표적 핵산의 발현량을 시험관내에서 측정하는 제1 공정, 상기 제1 공정에서 얻어진 상기 표적 핵산의 발현량을 측정하여, 상기 표적 핵산의 발현량으로부터 산출되는 유전자 발현량을 교사(training sample)로 한 판별식(서포트 벡터 머신)을 작성하는 제2 공정, 유방암 환자의 수술시 또는 생검 검사시에 채취한 시료 중의 상기 표적 핵산의 발현량을 제1 공정과 마찬가지로 시험관내에서 측정하는 제3 공정, 상기 제2 공정에서 얻어진 판별식에 제3 공정에서 얻어진 상기 표적 핵산의 발현량으로부터 산출한 유방암 병변부에서의 유전자 발현량을 대입하여, 상기 판별식으로부터 얻어진 결과에 기초해서 유방암 환자가 트라스투주마브에 대하여 치료 감수성을 발휘하는 것의 가능성을 예측, 판정 또는 평가하는 제4 공정을 포함하는, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측을 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 제6 형태에서, 상기의 어느 한쪽의 조성물, 상기의 어느 한쪽의 키트, 또는 상기의 어느 한쪽의 DNA 칩, 또는 그들의 조합의, 유방암 환자가 트라스투주마브에 대하여 치료 감수성을 갖는 것의 가능성을 시험관내에서 예측, 판정 또는 평가하기 위한 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측용 조성물 및 방법에 대한 사용을 제공한다.
2. 정의
본 명세서 중에서 사용하는 용어는, 이하의 정의를 갖는다.
뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA 등의 약호에 의한 표시는, "염기 서열 또는 아미노산 서열을 포함하는 명세서 등의 작성을 위한 가이드 라인"(일본 특허청편) 및 당 기술분야에서의 관용에 따르는 것으로 한다.
본 명세서에서 "폴리뉴클레오티드"란, RNA 및 DNA 모두 포함하는 핵산에 대하여 사용된다. 또한, 상기 DNA에는, cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA 모두가 포함된다. 또한 상기 RNA에는, 전체 RNA, mRNA, rRNA, miRNA, siRNA, snoRNA, snRNA, 비코딩 RNA 및 합성 RNA 모두가 포함된다. 또한, 본 명세서에서는, 폴리뉴클레오티드는 핵산과 호환적으로 사용된다.
본 명세서에서 "유전자"란, RNA, 및 2본쇄 DNA뿐만 아니라, 그것을 구성하는 정쇄(또는 센스쇄) 또는 상보쇄(또는 안티센스쇄) 등의 각 1본쇄 DNA를 포함하는 것을 의도하여 사용된다. 또한 그 길이에 따라 특별히 제한되는 것은 아니다.
따라서, 본 명세서에서 "유전자"는, 특별히 언급하지 않는 한, 인간 게놈 DNA를 포함하는 2본쇄 DNA, cDNA를 포함하는 1본쇄 DNA(정쇄), 상기 정쇄와 상보적인 서열을 갖는 1본쇄 DNA(상보쇄), 및 이들의 단편, 및 인간 게놈 모두 포함한다. 또한 상기 "유전자"는 특정한 염기 서열(또는 서열 번호)로 나타내는 "유전자"뿐만 아니라, 이것들에 의해 코딩되는 RNA와 생물학적 기능이 동등한 RNA, 예를 들어 동족체(즉, 호몰로그 또는 오솔로그), 유전자 다형 등의 변이체, 및 유도체를 코딩하는 "핵산"이 포함된다. 이와 같은 동족체, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 "핵산"으로서는, 구체적으로는, 나중에 기재한 엄격한 조건하에서, 상기의 서열 번호 1 내지 23으로 나타내는 어느 하나의 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열의 상보 서열과 혼성화하는 염기 서열을 갖는 "핵산"을 들 수 있다. 또한, "유전자"는, 기능 영역별에 관계없이, 예를 들어 발현 제어 영역, 코드 영역, 엑손 또는 인트론을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 "전사 산물"이란, 유전자의 DNA 서열을 주형으로 하여 합성된 RNA를 말한다. RNA 폴리메라아제가 유전자의 상류에 있는 프로모터라고 불리는 부위에 결합하고, DNA의 염기 서열에 상보적이 되도록 3' 말단에 리보뉴클레오티드를 결합시켜 나가는 형태로 RNA가 합성된다. 이 RNA에는 유전자 그 자체뿐만 아니라, 발현 제어 영역, 코드 영역, 엑손 또는 인트론을 비롯한 전사 개시점에서부터 폴리 A 서열의 말단에 이르기까지의 전체 서열이 포함된다.
또한, 본 명세서에서 "마이크로 RNA(miRNA)"는, 특별히 언급하지 않는 한, 헤어핀 형상 구조의 RNA 전구체로서 전사되고, RNase III 절단 활성을 갖는 dsRNA 절단 효소에 의해 절단되어, RISC라고 불리는 단백질 복합체에 도입되고, mRNA의 번역 억제에 관여하는 16 내지 25 염기, 바람직하게는 16 내지 25 염기, 보다 바람직하게는 20 내지 25 염기의 비코딩 RNA를 의도하여 사용된다. 또한 본 명세서에서 사용하는 "miRNA"는 특정한 염기 서열(또는 서열 번호)로 나타내는 "miRNA"뿐만 아니라, 상기 "miRNA"의 전구체(pre-miRNA 또는 pri-miRNA)를 함유하고, 이것들에 의해 코딩되는 miRNA와 생물학적 기능이 동등한 miRNA, 예를 들어 동족체(즉, 호몰로그 또는 오솔로그), 유전자 다형 등의 변이체, 및 유도체를 코딩하는 "miRNA"도 포함한다. 이와 같은 전구체, 동족체, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 "miRNA"로서는, 구체적으로는, miRBase release16(http://www.mirbase.org/)에 의해 동정할 수 있고, 나중에 기재한 엄격한 조건하에서, 상기의 서열 번호 1 내지 23으로 나타내는 어느 하나의 특정 염기 서열의 상보 서열과 혼성화하는 염기 서열을 갖는 "miRNA"를 들 수 있다.
본 명세서에서 "프로브"란, 유전자의 발현에 의해 발생한 RNA 또는 거기에서 유래되는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출하기 위해 사용되는 폴리뉴클레오티드 및/또는 그것에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 명세서에서 "프라이머"란, 유전자의 발현에 의해 발생한 RNA 또는 거기에서 유래되는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 인식하여 증폭시킨, 연속하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 그것에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
여기서 상보적인 폴리뉴클레오티드(상보쇄, 역쇄)란, 서열 번호에 의해 정의되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 전장 서열, 또는 그의 부분 서열(여기에서는 편의상, 이것을 정쇄라고 칭함)에 대하여 A:T(U), G:C와 같은 염기쌍 관계에 기초하여, 염기적으로 상보적인 관계에 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 단, 이와 같은 상보쇄는, 대상으로 하는 정쇄의 염기 서열과 완전히 상보 서열을 형성하는 경우에 한하지 않고, 대상으로 하는 정쇄와 엄격한 조건에서 혼성화할 수 있을 정도의 상보 관계를 갖는 것이어도 된다.
본 명세서에서 "엄격한 조건"이란, 프로브가 다른 서열에 대해서보다, 검출 가능하게 보다 큰 정도(예를 들어 백그라운드 측정값의 평균+백그라운드 측정값의 표준 오차×2 이상의 측정값)로, 그의 표적 서열에 대하여 혼성화하는 조건을 말한다. 엄격한 조건은 서열 의존성이며, 혼성화가 행해지는 환경에 따라 상이하다. 혼성화 및/또는 세정 조건의 엄격성을 제어함으로써, 프로브에 대하여 100% 상보적인 표적 서열이 동정될 수 있다.
본 명세서에서 "변이체"란, 핵산의 경우, 다형성, 돌연변이 등에 기인한 천연의 변이체, 또는 서열 번호 1 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열, 또는 그의 부분 서열에서 1, 2 또는 3 또는 그 이상, 바람직하게는 1 또는 2개의 염기의 결실, 치환, 부가 또는 삽입을 포함하는 변이체, 또는 서열 번호 1 내지 23의 miRNA의 전구체 RNA의 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열, 또는 그의 부분 서열에서 1 또는 2 이상, 바람직하게는 1 또는 수개의 염기의 결실, 치환, 부가 또는 삽입을 포함하는 변이체, 또는 상기 염기 서열의 각각 또는 그의 부분 서열과 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 % 동일성을 나타내는 변이체, 또는 상기 염기 서열 또는 그의 부분 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드와 상기 정의의 엄격한 조건에서 혼성화하는 핵산을 의미한다.
본 명세서에서 "수개"란, 약 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개의 정수를 의미한다.
본 명세서에서, 변이체는, 부위 특이적 돌연변이 유발법, PCR법을 이용한 돌연변이 도입법 등의 주지의 기술을 사용하여 제작 가능하다.
본 명세서에서 "% 동일성"은, 2개의 서열을 최대 일치도가 되도록 정렬(얼라인먼트)했을 때에, 총 염기 수(갭이 있을 경우에는, 갭수도 포함함)당의 동일 염기의 수의 비율(%)을 나타내고, 상기의 BLAST나 FASTA에 의한 단백질/유전자의 검색 시스템을 사용하여 갭을 도입하거나 또는 갭을 도입하지 않고 결정할 수 있다(Karlin, S. 등, 1993년, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 제90권, p.5873-5877; Altschul, S. F. 등, 1990년, Journal of Molecular Biology, 제215권, p.403-410; Pearson, W. R. 등, 1988년, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 제85권, p.2444-2448).
본 명세서에서 "유도체"란, 수식 핵산, 비한정적으로 예를 들어, 형광단 등에 의한 라벨화 유도체, 수식 뉴클레오티드(예를 들어 할로겐, 메틸 등의 알킬, 메톡시 등의 알콕시, 티오, 카르복시메틸 등의 기를 포함하는 뉴클레오티드, 및 염기의 재구성, 이중 결합의 포화, 탈아미노화, 산소 분자의 황 분자로의 치환 등이 발생한 뉴클레오티드 등)를 포함하는 유도체, PNA(peptide nucleic acid; Nielsen, P. E. et al., 1991, Science 254: 1497), LNA(locked nucleic acid; Obika, S. et al., 1998, Tetrahedron Lett. 39: 5401) 등을 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "예측, 판정, 검출 또는 진단용 조성물"이란, 유방암의 이환의 유무, 이환의 정도, 유방암의 개선의 유무나 개선의 정도, 유방암의 치료에 대한 감수성을 진단하기 위해서, 또한 유방암의 예방, 개선 또는 치료에 유용한 후보 물질을 스크리닝하기 위해서, 직접 또는 간접적으로 이용되는 것을 말한다. 이것에는 유방암의 이환에 관련하여 생체내, 특히 유방 조직에 있어서 발현이 변동하는 유전자를 특이적으로 인식하고, 또한 결합할 수 있는 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이들 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드는, 상기 성질에 기초하여 생체내, 조직이나 세포내 등에서 발현한 상기 유전자를 검출하기 위한 프로브로서, 또한 생체 내에서 발현한 상기 유전자를 증폭하기 위한 프라이머로서 유효하게 이용할 수 있다.
본 명세서에서 "예측"이란, 예측, 판정, 평가, 검출 또는 진단을 가리킨다.
본 명세서에서 예측, 판정, 평가, 검출 또는 진단의 대상이 되는 "시료"란, 유방암의 발생, 및 유방암에 대한 치료 효과의 발휘에 수반해서 본 발명의 유전자가 발현 변화하는 조직 및 생체 재료를 가리킨다. 구체적으로는 유방 조직 및 그 주변의 맥관, 림프절 및 장기, 또한 전이가 의심되는 장기, 피부, 및 혈액, 소변, 타액, 땀, 조직 침출액 등의 체액, 그 밖에 대변, 모발 등을 가리킨다.
본 명세서에서 사용되는 "FFPE 표본"이란, 생체 조직을 포르말린으로 고정하고, 파라핀으로 포매한 포르말린 고정 파라핀 포매 표본을 가리킨다.
본 명세서에서 사용되는 "트라스투주마브에 대한 치료 감수성"이란, 트라스투주마브에 의한 치료에 의해, 유방암의 병세 진행이 억제되는 성질의 것을 말한다. 병세의 진행을 검출하는 방법은, 병리학적 검토에 의해도 되고, 화상 진단에 의한 종양의 크기의 평가나 환자의 상태 등의 임상적 검토에 의해도 된다. 유방암 환자에 대한 트라스투주마브에 의한 치료에 있어서는, 트라스투주마브와 함께 트라스투주마브 이외의 항암제의 하나 또는 복수가 병용되어도 된다.
본 명세서에서 사용되는 "항암제"란, 트라스투주마브와 병용되어 유방암의 약물 요법에서 사용되는 약제를 가리킨다. 항암제로서는, 예를 들어 시클로포스파미드, 티오테파 등의 알킬화제, 플루오로우라실, 테가푸르, 카르모푸르, 독시플루리딘, 카페시타빈 등의 5-FU계 대사 길항제, 메토트렉세이트, 겜시타빈 등의 대사 길항약, 아드리아마이신, 에피루비신, 피라루비신 등의 안트라사이클린계 약, 미톡산트론 등의 안트라퀴논계 약, 마이토마이신 C 등의 항암 항생 물질, 비노렐빈 등의 빈카 알카로이드, 파클리탁셀, 도세탁셀 등의 탁산계 약, 이리노테칸 등의 토포이소메라아제 I 저해약, 타목시펜, 트레미펜 등의 항에스트로겐 약, 파드로졸, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 레트로졸 등의 아로마타아제 저해약, 메드록시프로게스테론 등의 황체호르몬제, 고세렐린, 류프로렐린 등의 LH-RH 애고니스트, 시스플라틴, 카르보플라틴 등의 플라티나 제제, 에리불린 등의 비탁산계 미소관 다이내믹스 저해제, 라파티닙, 베바시주맙, 퍼트주맙 등의 분자 표적약 등을 들 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "순위"란, Rainer, B. 등, 2004년, FEBS Letters, 제573권, p.83-92에 나타내는 위양성률을 고려한 통계학적 검정에서 산출되는 순위 통계량을 가리킨다.
본 명세서에서 사용되는 "AUROC값"이란, 수신자 동작 특성 곡선(ROC 곡선) 하의 면적을 의미하고, 환자를 양성군과 음성군으로 나누기 위한 예측, 판정, 평가, 검출 또는 진단의 방법의 정밀도를 측정하는 지표가 된다. 이들 곡선에서는, 평가 대상이 되는 방법이 나타내는 결과에 대해서, 양성 환자에게서 양성의 결과가 나오는 확률(감도)과, 음성 환자에게서 음성의 결과가 나오는 확률(특이성)의 역수가 플롯된다.
본 명세서에서, "Leave-one-out crossvalidation법(이하, LOOCV법)"이란, 데이터 세트로부터 1개의 검체를 제거하여 대상군과 피대상군을 검정, 판별식을 작성하고, 제거한 1개의 검체로 판별식을 평가하며, 이것을 데이터 세트 모든 검체에 대하여 반복한 평가의 평균을 전체의 정밀도로 하는 방법을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "miR-1234 유전자" 또는 "miR-1234"라는 용어는, 서열 번호 1에 기재된 hsa-miR-1234 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0005589)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-miR-1234 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "miR-513a-5p 유전자" 또는 "miR-513a-5p"라는 용어는, 서열 번호 2에 기재된 hsa-miR-513a-5p 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0002877)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-miR-513a-5p 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "miR-494 유전자" 또는 "miR-494"라는 용어는, 서열 번호 3에 기재된 hsa-miR-494 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0002816)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-miR-494 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "miR-26a 유전자" 또는 "miR-26a"라는 용어는, 서열 번호 4에 기재된 hsa-miR-26a 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0000082)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-miR-26a 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "let-7a 유전자" 또는 "let-7a"라는 용어는, 서열 번호 5에 기재된 hsa-let-7a 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0000062)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-let-7a 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "let-7b 유전자" 또는 "let-7b"라는 용어는, 서열 번호 6에 기재된 hsa-let-7b 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0000063)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-let-7b 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "let-7g 유전자" 또는 "let-7g"라는 용어는, 서열 번호 7에 기재된 hsa-let-7g 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0000414)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-let-7g 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "miR-940 유전자" 또는 "miR-940"이라는 용어는, 서열 번호 8에 기재된 hsa-miR-940 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0004983)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-miR-940 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "miR-1470 유전자" 또는 "miR-1470"이라는 용어는, 서열 번호 9에 기재된 hsa-miR-1470 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0007348)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-miR-1470 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "miR-125a-5p 유전자" 또는 "miR-125a-5p"라는 용어는, 서열 번호 10에 기재된 hsa-miR-125a-5p 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0000443)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-miR-125a-5p 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "miR-200c 유전자" 또는 "miR-200c"라는 용어는, 서열 번호 11에 기재된 hsa-miR-200c 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0000617)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-miR-200c 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "let-7e 유전자" 또는 "let-7e"라는 용어는, 서열 번호 12에 기재된 hsa-let-7e 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0000066)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-let-7e 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "miR-1228 유전자" 또는 "miR-1228"이라는 용어는, 서열 번호 13에 기재된 hsa-miR-1228 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0005583)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-miR-1228 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "let-7c 유전자" 또는 "let-7c"라는 용어는, 서열 번호 14에 기재된 hsa-let-7c 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0000064)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-let-7c 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "miR-1229 유전자" 또는 "miR-1229"라는 용어는, 서열 번호 15에 기재된 hsa-miR-1229 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0005584)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-miR-1229 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "miR-205 유전자" 또는 "miR-205"라는 용어는, 서열 번호 16에 기재된 hsa-miR-205 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0000266)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-miR-205 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "miR-145 유전자" 또는 "miR-145"라는 용어는, 서열 번호 17에 기재된 hsa-miR-145 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0000437)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-miR-145 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "miR-181a 유전자" 또는 "miR-181a"라는 용어는, 서열 번호 18에 기재된 hsa-miR-181a 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0000256)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-miR-181a 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "miR-191 유전자" 또는 "miR-191"이라는 용어는, 서열 번호 19에 기재된 hsa-miR-191 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0000440)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-miR-191 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "miR-125b 유전자" 또는 "miR-125b"라는 용어는, 서열 번호 20에 기재된 hsa-miR-125b 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0000423)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-miR-125b 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "miR-92a 유전자" 또는 "miR-92a"라는 용어는, 서열 번호 21에 기재된 hsa-miR-92a 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0000092)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-miR-92a 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "let-7d 유전자" 또는 "let-7d"라는 용어는, 서열 번호 22에 기재된 hsa-let-7d 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0000065)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-let-7d 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "miR-23a 유전자" 또는 "miR-23a"라는 용어는, 서열 번호 23에 기재된 hsa-miR-23a 유전자(miRbase Accession No.MIMAT 0000078)나 그밖에 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등이 포함된다. hsa-miR-23a 유전자는, Lagos-Quintana, M. 등, 2001년, Science, 제294권, p.853-858에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 발명은 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측(또는, 판정, 평가, 검출 또는 진단)에 유용한 조성물, 상기 조성물을 이용한 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측(또는, 판정, 평가, 검출 또는 진단) 방법, 및 상기 조성물을 이용한 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측(또는, 판정, 평가, 검출 또는 진단)용 키트를 제공하는 것이며, 이에 의해, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성에 대하여 특이적이면서 또한 고예측율의, 및 신속하면서도 또한 간편한, 예측(또는, 판정 평가, 검출 또는 진단) 방법을 제공한다는 현저한 작용 효과를 갖는다.
도 1은 표 1에 기재된 유전자를 결정하기 위한 해석의 흐름을 나타낸다.
도 2는 표 1에 기재된 유전자에 대응하는 서열 번호 1 내지 23의 폴리뉴클레오티드를 조합하여 사용한 경우의 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측율을 나타낸다. 종축은 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측에 대한 AUROC값, 횡축은 표 1에 기재된 유전자에 대응하는 서열 번호 1 내지 23에서, 35 증례의 유방암 환자에 대하여 LOOCV법에 의한 SVM법을 사용한 경우의 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측에 필요한 유전자의 합계수를 각각 나타낸다.
도 3은 도 1에 기재된 수순으로 선택되는 SVM법을 사용한 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측에 사용되는 20종의 유전자의, LOOCV법에 의한 선택 결과를 나타낸다. 도 3에 도시하는 표의 행 방향은, 34 증례의 학습 데이터 세트와 1개의 테스트 데이터의 조합으로 이루어지는 35종류의 교사 데이터 세트를 나타낸다. 열 방향은, 각 교사 데이터 세트에서 선택된 예측용 유전자의 서열 번호를 나타낸다. 표 중의 숫자는, 각 교사 데이터 세트에서 예측용 유전자를 선택했을 때에, 당해 유전자가 몇번째로 선택되었는지의 우선 순위를 나타낸다.
이하에 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
1. 유방암의 표적 핵산
본 발명의 상기 정의의, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측용 조성물 및 키트를 사용하여 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측하기 위한 마커로서의 표적 핵산에는, 예를 들어 서열 번호 1 내지 23으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 인간 유전자(즉, 각각 miR-1234, miR-513a-5p, miR-494, miR-26a, let-7a, let-7b, let-7g, miR-940, miR-1470, miR-125a-5p, miR-200c, let-7e, miR-1228, let-7c, miR-1229, miR-205, miR-145, miR-181a, miR-191, miR-125b, miR-92a, let-7d, 및 miR-23a), 그들의 동족체, 또는 그들의 변이체 또는 유도체가 포함된다. 여기서, 유전자, 동족체, 전사 산물, 변이체 및 유도체는 상기 정의와 같다. 바람직한 표적 핵산은, 서열 번호 1 내지 23으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 인간 유전자, 그들의 전사 산물, 보다 바람직하게는 상기 전사 산물, 즉 miRNA, 그의 전구체 RNA인 pri-miRNA 및 pre-miRNA이다.
본 발명에서 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측하기 위한 표적이 되는 상기 유전자는 모두, 트라스투주마브에 대한 치료 감수성이 있는 유방암 환자와 비교하여 트라스투주마브에 대한 치료 감수성이 없는 유방암 환자에게서, 유방암 병변부에서 얻어진 유전자 발현량이 감소, 저감 또는 증가, 증대하고 있는 것이다(후술하는 실시예의 표 1 참조).
제1 표적 핵산은, miR-1234 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 miR-1234 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현이 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 마커가 될 수 있다는 보고는 알려져 있지 않다.
제2 표적 핵산은, miR-513a-5p 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 miR-513a-5p 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현이 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 마커가 될 수 있다는 보고는 알려져 있지 않다.
제3 표적 핵산은, miR-494 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 miR-494 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현이 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 마커가 될 수 있다는 보고는 알려져 있지 않다.
제4 표적 핵산은, miR-26a 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 miR-26a 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현이 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 마커가 될 수 있다는 보고는 알려져 있지 않다.
제5 표적 핵산은, let-7a 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 let-7a 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현이 유방암 환자에게서 발현량이 저하되는 것으로 알려져 있지만(상기 특허문헌 1), 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 마커가 될 수 있다는 보고는 알려져 있지 않다.
제6 표적 핵산은, let-7b 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 let-7b 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현이 유방암 환자에게서 발현량이 저하되는 것으로 알려져 있지만(상기 특허문헌 1), 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 마커가 될 수 있다는 보고는 알려져 있지 않다.
제7 표적 핵산은, let-7g 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 let-7g 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현이 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 마커가 될 수 있다는 보고는 알려져 있지 않다.
제8 표적 핵산은, miR-940 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 miR-940 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현이 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 마커가 될 수 있다는 보고는 알려져 있지 않다.
제9 표적 핵산은, miR-1470 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 miR-1470 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현이 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 마커가 될 수 있다는 보고는 알려져 있지 않다.
제10 표적 핵산은, miR-125a-5p 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 miR-125a 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현량 증가가 트라스투주마브의 표적 단백질인 Her2 단백질의 발현량을 저하시키는 것으로 알려져 있지만(상기 비특허문헌 5), miR-125a의 발현량이 Her2 양성 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측한다는 보고는 알려져 있지 않다.
제11 표적 핵산은, miR-200c 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 miR-200c 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현이 유방암 환자에게서 발현량이 저하되는 것으로 알려져 있지만(상기 특허문헌 2), 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 마커가 될 수 있다는 보고는 알려져 있지 않다.
제12 표적 핵산은, let-7e 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 let-7e 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현이 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 마커가 될 수 있다는 보고는 알려져 있지 않다.
제13 표적 핵산은, miR-1228 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 miR-1228 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현이 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 마커가 될 수 있다는 보고는 알려져 있지 않다.
제14 표적 핵산은, let-7c 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 let-7c 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현이 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 마커가 될 수 있다는 보고는 알려져 있지 않다.
제15 표적 핵산은, miR-1229 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 miR-1229 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현이 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 마커가 될 수 있다는 보고는 알려져 있지 않다.
제16 표적 핵산은, miR-205 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 miR-205 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현이 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 마커가 될 수 있다는 보고는 알려져 있지 않다.
제17 표적 핵산은, miR-145 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 miR-145 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현이 유방암 환자에게서 발현량이 저하되는 것으로 알려져 있지만(상기 특허문헌 3), 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 마커가 될 수 있다는 보고는 알려져 있지 않다.
제18 표적 핵산은, miR-181a 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 miR-181a 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현이 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 마커가 될 수 있다는 보고는 알려져 있지 않다.
제19 표적 핵산은, miR-191 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 miR-191 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현이 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 마커가 될 수 있다는 보고는 알려져 있지 않다.
제20 표적 핵산은, miR-125b 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 miR-125b 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현량 증가가 트라스투주마브의 표적 단백질인 Her2 단백질의 발현량을 저하시키는 것으로 알려져 있지만(상기 비특허문헌 5), miR-125b의 발현량이 Her2 양성 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측한다는 보고는 알려져 있지 않다.
제21 표적 핵산은, miR-92a 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 miR-92a 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현이 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 마커가 될 수 있다는 보고는 알려져 있지 않다.
제22 표적 핵산은, let-7d 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 let-7d 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현이 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 마커가 될 수 있다는 보고는 알려져 있지 않다.
제23 표적 핵산은, miR-23a 유전자, 그들의 동족체, 그들의 전사 산물, 또는 그들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 miR-23a 유전자 또는 그의 전사 산물의 발현이 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 마커가 될 수 있다는 보고는 알려져 있지 않다.
2. 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측용 조성물
본 발명에서, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측하기 위해 사용 가능한 핵산 조성물은, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성에 관한 표적 핵산으로서의, 인간 유래의 miR-1234, miR-513a-5p, miR-494, miR-26a, let-7a, let-7b, let-7g, miR-940, miR-1470, miR-125a-5p, miR-200c, let-7e, miR-1228, let-7c, miR-1229, miR-205, miR-145, miR-181a, miR-191, miR-125b, miR-92a, let-7d, 및 miR-23a, 그들의 동족체, 또는 그들의 변이체 또는 유도체의 존재, 유전자 발현량 또는 존재량을 정성적 및/또는 정량적으로 측정하는 것을 가능하게 한다.
상기의 표적 핵산은 모두, 트라스투주마브에 대한 치료 감수성이 높은 유방암 환자에 비해, 트라스투주마브에 대한 감수성이 낮은 유방암 환자에게서 유방암 조직으로부터 얻어진 유전자 발현량이 감소, 저감 또는 증가, 증대한다. 그로 인해, 본 발명의 조성물은, 트라스투주마브에 대한 치료 감수성이 높은 유방암 환자의 유방암 조직과 트라스투주마브에 대한 치료 감수성이 낮은 유방암 환자의 유방암 조직에 대해서, 각각 표적 핵산의 발현량을 측정하고, 그것들을 비교하기 위해 유효하게 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 조성물은, 유방암으로 이환한 환자의 시료에서 서열 번호 1 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드군 및 그의 상보적 폴리뉴클레오티드군, 상기 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건에서 각각 혼성화하는 폴리뉴클레오티드군 및 그의 상보적 폴리뉴클레오티드군, 및 그러한 폴리뉴클레오티드군의 염기 서열에서 16 이상, 바람직하게는 21 내지 24가 연속된 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드군에서 선택된 2 이상의 폴리뉴클레오티드의 조합을 포함한다. 이들 폴리뉴클레오티드는, 표적 핵산인 상기 예측용 마커를 검출하기 위한 프로브 및 프라이머로서 사용할 수 있다.
구체적으로는, 본 발명의 조성물은, 이하에 나타내는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체 또는 그의 단편으로 이루어지는 군에서 선택되는 2 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
(1) 서열 번호 1 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편.
(2) 서열 번호 1 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
(3) 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편.
(4) 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
(5) 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편.
(6) 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
(7) 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열의 각각과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편.
(8) 서열 번호 10, 및 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편.
(9) 서열 번호 10, 및 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
(10) 서열 번호 10, 및 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편.
(11) 서열 번호 10, 및 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
(12) 서열 번호 10, 및 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편.
상기 (1) 내지 (12)의 폴리뉴클레오티드의 단편은, 각 폴리뉴클레오티드의 염기 서열, 또는 각 변이체 또는 유도체의 염기 서열에서, 예를 들어 연속하는 16 내지 서열의 전체 염기 수, 16 내지 24, 18 내지 24, 21 내지 24 염기 등의 범위의 염기 수를 포함할 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는 것으로 한다.
본 발명에서 사용되는 상기 폴리뉴클레오티드류 또는 그의 단편류는 모두 DNA이어도 되고 RNA이어도 된다.
본 발명의 조성물로서의 폴리뉴클레오티드는, DNA 재조합 기술, PCR법, DNA/RNA 자동 합성기에 의한 방법 등의 일반적인 기술을 사용하여 제작할 수 있다.
DNA 재조합 기술, 부위 특이적 돌연변이 도입법, PCR법 등의 기술은, 예를 들어 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, US (1993); Sambrook 등, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, US (1989) 등에 기재되는 기술을 사용할 수 있다.
인간 유래의, miR-1234, miR-513a-5p, miR-494, miR-26a, let-7a, let-7b, let-7g, miR-940, miR-1470, miR-125a-5p, miR-200c, let-7e, miR-1228, let-7c, miR-1229, miR-205, miR-145, miR-181a, miR-191, miR-125b, miR-92a, let-7d, 및 miR-23a 유전자는 공지이며, 상술한 바와 같이 그의 취득 방법도 알려져 있다. 이로 인해, 이들 유전자를 클로닝함으로써, 본 발명의 조성물로서의 폴리뉴클레오티드를 제작할 수 있다.
본 발명의 조성물을 구성하는 폴리뉴클레오티드는, DNA 자동 합성 장치를 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이 합성에는 일반적으로 포스포르아미다이트법이 사용되며, 이 방법에 의해 전장의 microRNA에 상당하는 1본쇄 DNA를 자동 합성할 수 있다. DNA 자동 합성 장치는, 예를 들어 Polygen사, Life Technologies사 등에서 시판하고 있다.
또는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, cDNA 클로닝법에 의해 제작할 수도 있다. cDNA 클로닝 기술은, 예를 들어 microRNA Cloning Kit Wako(와코 쥰야꾸 고교) 등을 이용할 수 있다.
3. 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측용 키트
본 발명은 또한, 본 발명의 조성물에 포함되는 것과 동일한 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체 및/또는 그의 단편의 2 이상을 포함하는, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는, 상기 2에 기재한 폴리뉴클레오티드류에서 선택되는, 2 이상의 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체 및/또는 그의 단편을 포함한다. 여기서, 변이체 및 유도체는 위에서 정의된 것을 포함한다.
본 발명의 키트는, 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 그의 상보적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 그들의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그들의 폴리뉴클레오티드의 단편, 그의 변이체, 또는 그의 유도체의 2 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는, 또한 서열 번호 10 및 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 그의 상보적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 그들의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그러한 폴리뉴클레오티드의 단편의 1 또는 2를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 키트에 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드 단편은, 예를 들어 하기의 (1) 내지 (2)로 이루어지는 군에서 선택되는 2 이상의 DNA다:
(1) 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열 또는 그의 상보적 서열에서, 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 DNA.
(2) 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열 또는 그의 상보적 서열에서, 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 DNA 외에, 서열 번호 10 및 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열 또는 그의 상보적 서열에서, 각각 16 이상의 연속된 염기를 더 포함하는 DNA.
바람직한 실시 형태에서는, 상기 폴리뉴클레오티드가, 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그의 상보적 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그들의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그들의 16 이상, 바람직하게는 21 내지 24의 연속된 염기를 포함하는 단편이다.
다른 바람직한 실시 형태에서는, 본 발명의 키트는, 상기의 폴리뉴클레오티드 외에, 서열 번호 10 및 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그의 상보적 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그들의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그들의 16 이상, 바람직하게는 21 내지 24의 연속된 염기를 포함하는 단편을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 조성물에 포함되는 것과 동일한 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체 및/또는 그의 단편의 유전자 발현량으로부터 산출되는 유방암 환자의 유방암 조직에서의 유전자 발현량의 2 이상을 측정하는 것을 포함하는 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에서, 상기 폴리뉴클레오티드의 단편의 크기는, 상기의 각 폴리뉴클레오티드의 염기 서열, 또는 상기의 각 변이체 또는 유도체의 염기 서열에서, 예를 들어 연속하는 16 내지 서열의 전체 염기 수, 16 내지 24, 18 내지 24, 21 내지 24 염기 등의 범위의 염기 수이다.
본 발명의 키트에는, 위에서 설명한 본 발명에서의 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체 또는 그의 단편 외에도, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측을 가능하게 하는 기지의 또는 장래 발견되는 폴리뉴클레오티드도 포함시킬 수 있다.
본 발명의 키트에 포함되는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체 또는 그의 단편은, 개별로 또는 임의로 조합하여 서로 다른 용기에 포장된다.
4. DNA 칩
본 발명은 또한, 본 발명의 조성물 및/또는 키트에 포함되는 것과 동일한 폴리뉴클레오티드(또는, 상기의 2절의 조성물 및/또는 3절의 키트에 기재된 폴리뉴클레오티드), 변이체, 단편 및 그들의 조합을 포함하는 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측용 DNA 칩을 제공한다.
DNA 칩의 기판으로서는, DNA를 고상화할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없고, 슬라이드 글래스, 실리콘제 칩, 중합체제 칩 및 나일론 멤브레인 등을 예시할 수 있다. 또한 이들 기판에는 폴리 L 리신 코트나 아미노기, 카르복실기 등의 관능기 도입 등의 표면 처리가 되어 있어도 된다.
또한 고상화법에 대해서는 일반적으로 사용되는 방법이면 특별히 제한은 없고, 스폿터 또는 어레이어라고 불리는 고밀도 분주기를 사용하여 DNA를 스폿하는 방법이나, 노즐로부터 미소한 액적을 압전 소자 등에 의해 분사하는 장치(잉크젯)를 사용하여 DNA를 기판에 분사하는 방법, 또는 기판 위에서 순차 뉴클레오티드 합성을 행하는 방법을 예시할 수 있다. 고밀도 분주기를 사용하는 경우에는, 예를 들어 다수의 웰을 갖는 플레이트의 각각의 웰에 상이한 유전자 용액을 넣어 두고, 이 용액을 핀(바늘)으로 집어서 기판 위에 순서대로 스폿하는 것에 의한다. 잉크젯법에서는, 노즐로부터 유전자를 분사하여, 기판 위에 고속도로 유전자를 정렬 배치하는 것에 의한다. 기판 위에서의 DNA 합성은, 기판 위에 결합한 염기를 광 또는 열에 의해 탈리하는 관능기로 보호하고, 마스크를 사용함으로써 특정 부위의 염기에만 광 또는 열을 대어 관능기를 탈리시킨다. 그 후, 염기를 반응액 외에, 기판 위의 염기와 커플링시키는 공정을 반복함으로써 행해진다.
고상화되는 폴리뉴클레오티드는, 상기에서 설명한 본 발명의 모든 폴리뉴클레오티드이다.
예를 들어, 그러한 폴리뉴클레오티드는, 이하에 나타내는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체 또는 그의 단편으로 이루어지는 군에서 선택되는 2 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
(1) 서열 번호 1 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편.
(2) 서열 번호 1 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
(3) 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편.
(4) 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
(5) 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편.
(6) 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
(7) 상기 (3) 내지 (6) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편.
(8) 서열 번호 10 및 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편.
(9) 서열 번호 10 및 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
(10) 서열 번호 10 및 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편.
(11) 서열 번호 10 및 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
(12) 상기 (8) 내지 (11) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편.
본 발명에서, 상기 폴리뉴클레오티드의 단편의 크기는, 상기의 각 폴리뉴클레오티드의 염기 서열, 또는 상기의 각 변이체 또는 유도체의 염기 서열에서, 예를 들어 연속하는 16 내지 서열의 전체 염기 수, 16 내지 24, 18 내지 24, 21 내지 24 염기 등의 범위의 염기 수이다.
바람직한 실시 형태에 따르면, 본 발명의 DNA 칩은, 서열 번호 1 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열, 또는 그의 상보적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 2 이상부터 전부를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 고상화되는 폴리뉴클레오티드는, 게놈 DNA, cDNA, RNA, 합성 DNA, 합성 RNA 중 어느 것이든 좋고, 또는 1본쇄이어도 되고 또는 2본쇄이어도 된다. 여기서, 합성 DNA 및 합성 RNA는, 상기 "유도체"의 정의에서 설명한 바와 같은 수식 핵산을 포함한다.
표적 유전자, RNA 또는 cDNA의 유전자 발현량을 검출, 측정할 수 있는 DNA 칩의 예로서는, 도레이 가부시끼가이샤의 3D-Gene(등록 상표) Human miRNA Oligo chip, 애질런트사의 Human miRNA Microarray Kit(V2), EXIQON사의 miRCURY LNA(등록 상표) microRNA ARRAY 등을 들 수 있다.
DNA 칩의 제작에 대해서, 예를 들어 미리 제조한 프로브를 고상 표면에 고정화하는 방법을 사용할 수 있다. 미리 제조한 폴리뉴클레오티드 프로브를 고상 표면에 고정화하는 방법에서는, 관능기를 도입한 폴리뉴클레오티드를 합성하고, 표면 처리한 고상 담체 표면에 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 점착하여 공유 결합시킨다(예를 들어, J. B. Lamture 등, Nucleic. Acids. Research, 1994년, 제22권, p.2121-2125, Z. Guo 등, Nucleic. Acids. Research, 1994년, 제22권, p.5456-5465). 폴리뉴클레오티드는, 일반적으로는, 표면 처리한 고상 담체에 스페이서나 크로스 링커를 개재하여 공유 결합된다. 유리 표면에 폴리아크릴아미드 겔의 미소편을 정렬시키고, 거기에 합성 폴리뉴클레오티드를 공유 결합시키는 방법도 알려져 있다(G. Yershov 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1996년, 제94권, p.4913). 또한, 실리카 마이크로 어레이 위에 미소 전극의 어레이를 제작하고, 전극 위에는 스트렙트아비딘을 포함하는 아가로오스의 침투층을 형성하여 반응 부위로 하여, 이 부위를 플러스로 하전 시킴으로써 비오틴화 폴리클레오티드를 고정하고, 부위의 하전을 제어함으로써, 고속으로 엄밀한 혼성화를 가능하게 하는 방법도 알려져 있다(R. G. Sosnowski 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1997년, 제94권, p.1119-1123).
DNA 칩 해석을 이용하는 경우에는, 본 발명의 상기 진단용 조성물을 DNA 프로브(단일쇄 또는 이중쇄)로서 기판에 부착한 DNA 칩을 사용한다. 유전자군을 기판에 고상화한 것에는, 일반적으로 DNA 칩 및 DNA 어레이라는 명칭이 있고, DNA 칩에는 DNA 매크로 어레이와 DNA 마이크로 어레이가 포함되는데, 본 명세서에서는 DNA 칩이라고 한 경우, 상기 DNA 어레이를 포함하는 것으로 한다.
5. 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측의 검출법
본 발명은 본 발명의 조성물, 키트, DNA 칩, 또는 그들의 조합을 사용하여, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 시험관내에서 예측하는 방법이며, 수술시 또는 생검 검사시에 채취한 시료인 유방암 환자의 유방암 조직을 사용하여, 시료 중의 유전자 발현량을 상기 진단용 조성물로 구성되는 DNA 칩에 의해 해석하여, 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 나타내는 유방암 환자의 시료 중의 유전자 발현량과 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 나타내지 않는 유방암 환자의 시료 중의 유전자 발현량을 비교하여, 상기 시료 중의 표적 핵산의 발현량으로부터 산출되는, 유방암 조직으로부터 얻어진 유전자 발현량이 감소, 저감 또는 증가, 증대하고 있을 경우, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측하는 것을 포함하고, 여기서, 상기 표적 핵산이 상기 조성물, 키트 또는 DNA 칩에 포함되는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체 또는 그의 단편에 의해 검출 가능한 것인 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 조성물, 조성물의 유전자 발현량을 측정함으로써 구성되는 키트 또는 DNA 칩의, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 나타내는 가능성을 시험관내에서 예측하기 위한 사용을 제공한다.
본 발명의 상기 방법에서, 조성물, 키트 또는 DNA 칩은, 위에서 설명한 바와 같은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체 또는 그의 단편을 단일하게 또는 모든 가능한 조합으로 포함하는 것이 사용된다.
본 발명의 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측에 있어서, 본 발명의 조성물, 키트 또는 DNA 칩에 포함되는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체 또는 그의 단편은, 프라이머로서 또는 프로브로서 사용할 수 있다. 프라이머로서 사용하는 경우에는, Life Technologies사의 TaqMan(등록 상표) MicroRNA Assays 등을 이용할 수 있지만, 이 방법에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물 또는 키트에 포함되는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체 또는 그의 단편은, 노던블롯법, 서든블롯법, RT-PCR법, 제자리(in situ) 혼성화법, 서든 혼성화법 등의, 특정 유전자를 특이적으로 검출하는 공지된 방법에 있어서, 통상법에 따라 프라이머 또는 프로브로서 이용할 수 있다. 측정 대상 시료로서는, 사용하는 검출 방법의 종류에 따라, 유방암 환자의 수술시 또는 생검 검사시에 채취한 시료인 유방암 조직의 시료로부터 회수한다. 유방암 환자로부터 채취된 유방암 조직의 시료의 상태는, 채취된 그대로의 상태이어도 되고, 일단 동결된 상태이어도 되고, 또한 포르말린에 의해 고정된 상태이어도 된다. 포르말린 용액은, 시판하고 있는 포르말린(포름알데히드 농도 37%)을 물로 희석한 것을 사용해도 되고, 물로 희석한 용액의 pH를 탄산칼슘, 탄산마그네슘 등으로 중성으로 조정한 것이나, 인산 완충액으로 희석하여 pH를 중성으로 조정한 것을 사용하는 것도 바람직하다. 또한, 악취, 자극 냄새를 제거하고, 농도를 제조한 포르말린 용액을 사용해도 된다. 또한, 포르말린 용액 중의 포름알데히드 함량은, 1 내지 30%가 바람직하고, 2 내지 20%가 보다 바람직하다. 또한, 포르말린 고정된 조직이 파라핀에 포매된 상태의 FFPE 표본을 시료로 해도 된다. 또한 그러한 시료/표본으로부터 통상법에 따라서 제조한 전체 RNA를 사용해도 되고, 또한 상기 RNA를 바탕으로 하여 제조되는, cDNA를 포함하는 각종 폴리뉴클레오티드를 사용해도 된다.
검체 채취의 시기는 트라스투주마브 단독 또는 트라스투주마브와 항암제의 병용에 의한 치료의 개시 전이이나 개시 후이어도 되지만, 트라스투주마브 또는 트라스투주마브와 항암제의 병용에 의한 치료의 개시 전인 것이 바람직하다.
또는, 채취한 시료에서의 본 발명의 유전자, RNA, cDNA 등의 핵산의 발현량은, DNA 칩을 사용하여 검출 또는 정량할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 조성물 또는 키트는 DNA 칩의 프로브로서 사용할 수 있다. 이와 같은 DNA 칩을 시료로부터 채취한 RNA를 바탕으로 제조되는 표식 DNA 또는 RNA와 혼성화시켜, 상기 혼성화에 의해 형성된 상기 프로브와 표식 DNA 또는 RNA의 복합체를, 상기 표식 DNA 또는 RNA의 표식을 지표로 해서 검출함으로써, 시료 중에서의 본 발명의 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측용 조성물의 발현의 유무 또는 발현한 유전자의 양(유전자 발현량)을 평가할 수 있다. 본 발명의 방법에서는, DNA 칩을 바람직하게 사용할 수 있는데, 이것은 하나의 시료에 대하여 동시에 복수 유전자의 발현의 유무 또는 유전자 발현량의 평가가 가능하다.
본 발명의 조성물, 키트 또는 DNA 칩은, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측을 위해 유용하다. 구체적으로는, 상기 조성물, 키트 또는 DNA 칩을 사용한 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측은, 수술시 또는 생검 검사시에 채취한 시료인 유방암 환자의 유방암 조직을 사용하여, 시료 중의 상기 진단용 조성물의 유전자 발현량을 측정하여, 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 나타내는 유방암 환자의 시료 중의 유전자 발현량과 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 나타내지 않는 유방암 환자의 시료 중의 유전자 발현량을 비교하여, 상기 시료 중의 표적 핵산의 발현량으로부터 산출되는, 유방암 조직으로부터 얻어진 유전자 발현량이 감소, 저감 또는 증가, 증대하고 있는 것을 비교함으로써 행할 수 있다. 이 경우, 유전자 발현량의 차이에는, 상기 진단용 조성물의 유전자 발현의 유무도 포함한다.
본 발명의 조성물, 키트 또는 DNA 칩을 이용한 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 방법은, 유방암 환자의 시료의 일부 또는 전부를 생검 검사시에 채취하거나 또는 수술에 의해 적출한 시료인 유방암 환자의 유방암 조직을 사용하여, 시료 중의 유전자 발현량을 상기 진단용 조성물의 폴리뉴클레오티드군에서 선택된 단수 또는 복수의 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체 또는 그의 단편을 사용해서 측정하여, 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 나타내는 유방암 환자의 시료 중의 유전자 발현량과 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 나타내지 않는 유방암 환자의 시료 중의 유전자 발현량을 비교하여, 상기 시료 중의 표적 핵산의 발현량으로부터 산출되는, 유방암 조직으로부터 얻어진 유전자 발현량이 감소, 저감 또는 증가, 증대하고 있는 것을 비교함으로써, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법은, 예를 들어 이하의 (a), (b) 및 (c)의 공정:
(a) 유방암 환자 유래의 시료를, 본 발명의 조성물, 키트 또는 DNA 칩의 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 공정,
(b) 시료 중의 표적 핵산의 발현량을, 상기 폴리뉴클레오티드를 프로브로서 사용하여 측정하는 공정,
(c) (b)의 결과를 바탕으로, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측하는 공정
을 포함할 수 있다.
본 발명 방법에서 사용되는 시료로서는, 유방암 환자의 시료, 예를 들어 유방 조직 및 그의 주변 조직, 유방암이 의심되는 조직 등으로부터 제조되는 시료를 들 수 있다. 구체적으로는 상기 조직으로부터 제조되는 RNA 함유 시료, 또는 그것으로부터 또한 제조되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 시료는, 유방암 환자의 시료의 일부 또는 전부를 생검 검사시에 채취하거나 또는 수술에 의해 적출한 시료로부터 회수하여 제조할 수 있다.
여기서 환자란, 유방암을 이환한 또는 유방암의 이환이 강하게 의심되는 포유 동물을 가리키며, 포유 동물이란, 예를 들어 비한정적으로 인간, 원숭이, 개, 마우스, 래트 등을 가리키고, 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 방법은, 측정 대상으로서 사용하는 시료의 종류에 따라 공정을 변경할 수 있다.
측정 대상물로서 RNA를 이용하는 경우, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측은, 예를 들어 하기의 공정 (a), (b) 및 (c):
(a) 유방암 환자의 시료로부터 제조된 RNA 또는 그것으로부터 전사된 상보적 폴리뉴클레오티드(cDNA)를 본 발명의 조성물, 키트 또는 DNA 칩의 폴리뉴클레오티드와 결합시키는 공정,
(b) 상기 폴리뉴클레오티드에 결합한 시료 유래의 RNA 또는 상기 RNA로부터 전사된 상보적 폴리뉴클레오티드를, 상기 폴리뉴클레오티드를 프로브로서 사용하여 측정하는 공정,
(c) 상기 (b)의 측정 결과에 기초하여, 유방암 환자가 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 나타내는 것 또는 나타내지 않는 것을 예측하는 공정
을 포함할 수 있다.
본 발명에 의해 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측하기 위해서, 예를 들어 다양한 혼성화법을 사용할 수 있다. 이러한 혼성화법에는, 예를 들어 노던블롯법, 서든블롯법, PCR법, RT-PCR법, DNA 칩 해석법, 제자리 혼성화법, 서든 혼성화법 등을 사용할 수 있다.
노던블롯법을 이용하는 경우에는, 본 발명의 진단용 조성물을 프로브로서 사용함으로써, RNA 중의 각 유전자 발현의 유무나 그 유전자 발현량을 검출, 측정할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 예후 예측을 위한 진단용 조성물(상보쇄)을 방사성 동위 원소(32P, 33P, 35S 등)나 형광 물질(시안계, 로다민계, 플루오레사민계 등) 등으로 표식하고, 그것을 통상법에 따라서 나일론 멤브레인 등에 트랜스퍼한 피검자의 시료 유래의 RNA와 혼성화시킨 뒤, 형성된 진단용 조성물(DNA)과 RNA의 2중쇄를 진단용 조성물의 표식물(방사성 동위 원소 또는 형광 물질)에서 유래되는 시그널을 방사선 검출기(BAS-1800II, 후지 사진 필름 가부시끼가이샤 등을 예시할 수 있음) 또는 형광 검출기(STORM860, GE 헬스케어사 등을 예시할 수 있음)로 검출, 측정하는 방법을 예시할 수 있다.
정량 RT-PCR법을 이용하는 경우에는, 본 발명의 상기 진단용 조성물 중의 폴리뉴클레오티드를 프라이머로서 사용함으로써, RNA 중의 유전자 발현의 유무나 그 유전자 발현량을 검출, 측정할 수 있다. 구체적으로는, 피검자의 시료 유래의 RNA로부터 통상법에 따라서 cDNA를 제조하고, 이것을 주형으로서 표적의 각 유전자의 영역이 증폭할 수 있도록, 본 발명의 조성물을 바탕으로 제조한 1쌍의 프라이머(상기 cDNA에 결합하는 정쇄와 역쇄로 이루어짐)를 cDNA와 혼성화시켜서 통상법에 의해 PCR법을 행하여, 얻어진 이중쇄 DNA를 검출하는 방법을 예시할 수 있다. 또한, 이중쇄 DNA의 검출법으로서는, 상기 PCR을 미리 방사성 동위 원소나 형광 물질로 표식해 둔 프라이머를 사용하여 행하는 방법, PCR 산물을 아가로오스 겔로 전기 영동하고, 에튬 브로마이드 등으로 이중쇄 DNA를 염색하여 검출하는 방법, 산생된 이중쇄 DNA를 통상법에 따라서 나일론 멤브레인 등에 트랜스퍼시켜 표식한 진단용 조성물 중의 폴리뉴클레오티드를 프로브로 해서 이것과 혼성화시켜 검출하는 방법을 취할 수 있다.
혼성화 조건은, 한정되지 않지만, 예를 들어 30℃ 내지 60℃에서, SSC와 계면 활성제를 포함하는 용액 중에서 1 내지 24시간의 조건으로 한다. 여기서, 1×SSC는, 150mM 염화나트륨 및 15mM 시트르산나트륨을 포함하는 수용액(pH7.2)이며, 계면 활성제는 SDS, Triton 또는 Tween 등을 포함한다. 혼성화 조건으로서는, 보다 바람직하게는 3 내지 4×SSC, 0.1 내지 0.5% SDS를 포함한다. 혼성화 후의 세정 조건으로서는, 예를 들어 30℃의 0.5×SSC와 0.1% SDS를 포함하는 용액, 및 30℃의 0.2×SSC와 0.1% SDS를 포함하는 용액, 및 30℃의 0.05×SSC 용액에 의한 연속된 세정 등의 조건을 들 수 있다. 상보쇄는 이와 같은 조건에서 세정해도 대상으로 하는 정쇄와 혼성화 상태를 유지하는 것인 것이 바람직하다. 구체적으로는 이러한 상보쇄로서, 대상의 정쇄의 염기 서열과 완전히 상보적인 관계에 있는 염기 서열로 이루어지는 쇄, 및 상기 쇄와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%의 상동성을 갖는 염기 서열로 이루어지는 쇄를 예시할 수 있다.
본 발명의 조성물 또는 키트의 폴리뉴클레오티드 단편을 프라이머로 해서 PCR을 실시할 때의 엄격한 혼성화 조건의 예로서는, 예를 들어 10mM Tris-HCl(pH8.3), 50mM KCl, 1 내지 2mM MgCl2 등의 조성의 PCR 버퍼를 사용하여, 당해 프라이머의 서열로부터 계산된 Tm+5 내지 10℃에서 15초 내지 1분 정도 처리하는 것 등을 들 수 있다. 이와 같은 Tm의 계산 방법으로서 Tm=2×(아데닌 잔기수+티민 잔기수)+4×(구아닌 잔기수+시토신 잔기수) 등을 들 수 있다.
이러한 혼성화에서의 "엄격한 조건"의 다른 예에 대해서는, 예를 들어 Sambrook, J. & Russel, D. 저, Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001년 1월 15일 발행의 제1권 7.42 내지 7.45, 제2권 8.9 내지 8.17 등에 기재되어 있으며, 본 발명에서 이용할 수 있다.
또한, 정량 RT-PCR법을 사용하는 경우에는, TaqMan 상표 MicroRNA Assays, Life Technologies사: LNA 상표-based MicroRNA PCR, Exiqon사: Ncode 상표 miRNA qRT-PCT 키트, Invitrogen사 등의 miRNA를 정량적으로 측정하기 위해 특별히 연구된 시판되는 측정용 키트를 사용해도 된다.
본 발명은 또한, 본 발명의 조성물, 키트, DNA 칩, 또는 그들의 조합을 사용하여, 유방암 환자 유래의 시료 중의 표적 핵산 또는 유전자의 발현량을 측정하고, 상기 유전자 발현량을 사용하여 교사 데이터 세트로 한 SVM법을 사용하여, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측하는 방법을 제공한다.
즉, 본 발명은 또한, 본 발명의 조성물, 키트, DNA 칩, 또는 그들의 조합을 사용하여, 유방암 환자가 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 나타내는 것/또는 나타내지 않는 것이 기지의 복수의 시료 중 표적 핵산의 발현량을 시험관내에서 측정하는 제1 공정, 상기 제1 공정에서 얻어진 상기 표적 핵산의 발현량의 측정값을 사용하여 SVM법에 의한 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측하는 판별식을 작성하는 제2 공정, 유방암 환자의 유방암 조직으로부터 얻어지는 상기 표적 핵산의 발현량을 제1 공정과 마찬가지로 시험관내에서 측정하는 제3 공정, 상기 제2 공정에서 얻어진 판별식에 제3 공정에서 얻어진 상기 표적 핵산의 발현량을 판별식에 대입하여, 상기 판별식으로부터 얻어진 결과에 기초해서 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측하는 제4 공정을 포함하는, 여기서, 상기 표적 핵산이 상기 조성물, 키트 또는 DNA 칩에 포함되는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체 또는 그의 단편에 의해 검출 가능한 것인 상기 방법을 제공한다.
또는, 본 발명의 방법은, 예를 들어 하기의 공정 (a), (b) 및 (c):
(a) 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성이 기지의 시료 중 표적 유전자의 발현량을, 본 발명에 의한 예측(판정, 검출 또는 진단)용 조성물, 키트 또는 DNA 칩을 사용하여 측정하는 공정,
(b) (a)에서 측정된 유전자 발현량의 측정값을, 하기의 수순에 따라서 수학식 2 내지 수학식 5의 식에 대입하여, SVM법을 사용한 판별식을 작성하는 공정,
(c) 유방암 환자 유래의 시료 중의 상기 표적 유전자의 발현량을, 본 발명에 의한 예측(판정, 검출 또는 진단)용 조성물, 키트 또는 DNA 칩을 사용하여 측정하고, (b)에서 작성한 판별식에 그것들을 대입하여, 얻어진 결과에 기초해서 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측하는 공정
을 포함할 수 있다.
SVM법은, 1995년에 AT&T의 V. Vapnik가 1995년에 고안한 판별 분석법(The Nature of Statistical Leaning Theory, Springer, 1995년)이다. 분류해야 할 군 나눔이 기지의 데이터 세트의 특정한 데이터 항목을 설명 변수, 분류해야 할 군 나눔을 목적 변수로 해서, 상기 데이터 세트를 기지의 군 나눔으로 정확하게 분류하기 위한 초평면이라고 불리는 경계면을 결정하고, 상기 경계면을 사용하여 데이터를 분류하는 판별식을 결정한다. 그리고 상기 판별식은, 새롭게 부여되는 데이터 세트의 측정값을 설명 변수로서 상기 판별식에 대입함으로써, 군 나눔을 예측할 수 있다. 또한, 이때의 예측 결과는 분류해야 할 군이어도 되고, 분류해야 할 군으로 분류될 수 있는 확률이어도 되고, 초평면으로부터의 거리이어도 된다(예를 들어, 아소우 히데키 외 저, 통계 과학의 프론티어 6 "패턴 인식과 학습의 통계학 새로운 개념과 방법", 이와나미 서점(2004년)).
본 발명의 SVM법에 의한 판별식의 설명 변수는, 상기 2절에 기재한 폴리뉴클레오티드류에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편을 측정함으로써 얻어지는 값을 포함하고, 구체적으로는 본 발명의 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측하기 위한 설명 변수는, 예를 들어 하기의 (1) 내지 (2)로 이루어지는 군에서 선택되는 유전자 발현량이다:
(1) 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열 또는 그의 상보적 서열에서, 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 DNA 중 어느 하나에 의해 측정되는 유방암 환자의 유방암 조직에서의 유전자 발현량.
(2) 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열 또는 그의 상보적 서열에서, 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 DNA 외에, 서열 번호 10 및 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열 또는 그의 상보적 서열에서, 각각 16 이상의 연속된 염기를 더 포함하는 DNA 중 어느 하나에 의해 측정되는 유방암 환자의 유방암 조직에서의 유전자 발현량.
본 발명의 방법에서 사용 가능한 판별식의 산출예를 이하에 나타내었다.
우선 유방암 환자를, 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 나타내는 환자군과 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 나타내지 않는 환자군의 2군으로 나눈다. 유방암 환자가 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 나타낸다고 판단하는 기준으로서는, 트라스투주마브에 의한 치료 후의 유방암의 병세 진행이 억제된 상태를 나타내는 것으로서, 트라스투주마브 치료 후에 실시하는 병리 검사 결과가 일본 유방암 학회편 "유방암 취급 규약 제16판"에 정하는 조직학적 치료 효과 기준의 Grade 3으로 분류되는 병리학적 완전 주효, 즉 모든 암 세포가 괴사되어 있거나, 또는 소실했을 경우, 또는 육아종 모양 조직 또는 섬유화소로 치환되어 있는 상태인 것이 병리학적으로 확인되는 것을 기준으로서 사용할 수 있다. 또는, 상기한 조직학적 치료 효과 기준이 Grade 3으로 분류되는 병리학적 완전 주효가 확인되는 것 외에, 임상적으로 림프절 전이소가 확인되지 않는 것의 양자를 만족하는 것을 기준으로 할 수 있다.
이어서, 나뉘어진 2군의 유방암 환자의 유방암 조직 유래의 생체 시료의 망라적 유전자 발현량으로 이루어지는 데이터 세트(이하, 교사 데이터 세트)를 준비하여, 상기 2군의 사이에서 유전자 발현량에 명확한 차가 보이는 유전자를 설명 변수, 상기 군 나눔을 목적 변수(예를 들어 -1과 1)로 한 SVM법에 의한 판별식을 결정한다(수학식 1). 이때, 상기 판별식은 수학식 2로 정의되는 제약 조건, 및 수학식 3 내지 5로 정의되는 가중 계수(w)와 바이어스 상수(b)를 갖는다.
이때의 수학식 1 내지 수학식 5는, 이하의 식으로 이루어진다.
Figure pct00001
(여기서, x는 유방암 환자의 유방암 조직 유래의 생체 시료로부터 얻어진 망라적 유전자 발현량으로 이루어지는 데이터를 나타내고, xi는 상기 데이터에서 선택한 특정한 유전자의 발현량을 나타냄)
Figure pct00002
(여기서, T는 내적, y는 데이터의 분류, ζ는 슬랙 변수를 나타냄)
Figure pct00003
(수학식 3은 수학식 2에 Lagurange의 미정 상수법을 사용함으로써 귀착하는 Lagurange 상수(α)를 사용한 최적화 문제를 나타냄)
Figure pct00004
(여기서, C는 실험에 의해 결정되는 제약 조건 파라미터를 나타냄)
Figure pct00005
그리고, 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 나타내는지 여부가 미지인 유방암 환자에 대해서는, 상기 유방암 환자의 유방암 조직 유래의 생체 시료에서의, 상기 판별식에서 사용하는 유전자의 발현량을 측정하고, 그것들을 상기 판별식의 xi에 대입함으로써, 상기 2군 중 어디에 소속하는지를 예측할 수 있다.
이상에 나타낸 바와 같이, 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 나타내는지 여부가 미지인 유방암 환자가, 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 나타내거나 또는 나타내지 않는 중 어느 군에 속할지를 판정하는 판정식의 작성에는, 교사 데이터 세트로부터 작성한 판별식이 필요하고, 상기 판별식의 예측 정밀도를 높이기 위해서는, 교사 데이터 세트 중의 2군간에 명확한 차가 있는 유전자를 판별식에 사용할 필요가 있다.
또한, 판별식의 설명 변수에 사용하는 유전자의 결정은, 다음과 같이 행하는 것이 바람직하다. 우선, 교사 데이터 세트인, 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 나타내는 유방암 환자군의 유방암 조직 유래의 생체 시료의 망라적 유전자 발현량과 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 나타내지 않는 유방암 환자군의 유방암 조직 유래의 생체 시료의 망라적 유전자 발현량을 데이터 세트)로 하고, 파라메트릭 해석인 t-검정의 p값, 논파라메트릭 해석인 Mann-Whitney의 U 검정의 p값, 또는 RankProduct법의 순위 등을 이용하여, 상기 2군간에서의 각 유전자의 발현량의 차의 크기를 구한다.
이어서, 여기에서 구한 유전자 발현량의 차가 큰 임의의 수의 유전자를 사용한 판별식을 작성하고, 이 판별식에 대해 다른 독립된 유방암 환자의 유방암 조직 유래의 생체 시료 유래의 유전자 발현량을 설명 변수에 대입하여, 이 독립된 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성에 관한 판별 결과를 결정한다. 최대의 예측 정밀도를 얻는 판별식을 구축하기 위해서는, 이 판별식의 작성과 예측 정밀도의 결정을, 유전자를 유전자 발현량의 차가 큰 순서대로 하나씩 증가시키면서 반복해서 평가한다.
또한, 상기 판별식에 사용하는 유전자의 결정과 예측 정밀도의 결정에는, LOOCV법을 사용하는 것이 바람직하다(도 1). 즉, 우선 교사 데이터 세트로부터 1개의 데이터를 테스트 데이터로서 발출하고, 나머지를 학습 데이터 세트로 한다. 그리고, 학습 데이터 세트를 사용하여 판별식을 작성하고, 상기 판별식을 사용하여 테스트 데이터가 소속하는 군을 예측한다. 그리고, 교사 데이터 세트로부터 중복하지 않고 테스트 데이터를 나눌 수 있는 복수의 조합에 대하여, 보다 바람직하게는 중복하지 않고 테스트 데이터를 나눌 수 있는 모든 조합에 대하여 판별식의 예측값을 결정하고, 결정한 예측값과 테스트 데이터가 소속하는 참된 군을 사용하여 AUROC값을 얻어, 이것을 예측 정밀도로 한다.
본 발명의 방법에서, 예를 들어 위에서 기재한 바와 같은 서열 번호 1 내지 23에 기초하는 1개 또는 복수의 상기 폴리뉴클레오티드, 및/또는 위에서 기재한 바와 같은 1 내지 23에 기초하는 1개 또는 복수의 폴리뉴클레오티드로부터의 임의의 조합을 사용하고, 또한 상기의 23종의 표적 유전자의 발현량이 모두 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 나타내는 유방암 환자와 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 나타내지 않는 유방암 환자 간에서 상이하고, 유방암 환자 유래의 유방암 병변부에서 발현이 증가/감소하고 있는 것을 지표로 하여, 이들 23종의 유전자에 대해 발현량을 측정하고, 이들 유전자의 임의의 20종류의 유전자 발현량의 조합을 사용함으로써, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 AUROC값으로 하여 0.951의 예측 정밀도로 분별할 수 있다(도 2).
(실시예)
본 발명을 이하의 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위는, 이 실시예에 의해 제한되지 않는 것으로 한다.
실시예 1
1. 시료의 채취
Her2 단백질의 면역조직 화학적 염색법의 스코어가 3+가 되는 것, 또는 상기 스코어가 2+이며, 또한 형광 제자리 혼성화법의 Her2/CEP17비가 2.2보다 크다고 판정됨으로써 Her2 양성이라고 판별된, 사전동의(informed consent)를 얻은 35 증례의 수술전 초발 유방암 환자로부터 트라스투주마브와 항암제의 병용에 의한 치료를 행하기 전에 침생검을 사용하여 유방암 조직을 채취하고, 채취한 유방암 조직으로부터 FFPE 표본을 얻었다. 그리고, FFPE 표본으로부터 두께 10㎛로 얇게 자른 유방암 조직의 병리 표본을 얻었다.
구체적으로는, 35 증례의 Her2 양성 유방암 환자에게는 트라스투주마브와 항암제의 병용에 의한 치료를 행하기 전에 침생검에 의한 유방암 조직 채취를 행하였다. 그리고, 침생검 실시 후에 트라스투주마브와, 시클로포스파미드 및 도세탁셀을 포함하는 시술전 화학 요법에 의한 치료를 행하였다. 트라스투주마브와 이들 항암제에 의한 치료 효과의 판정 기준은, 수술시에 채취된 병리 검사 표본에 대하여 행하여, 일본 유방암 학회편 "유방암 취급 규약 제16판"에서 정하는 조직학적 치료 효과의 기준에 의한, Grade 3으로 분류되는 병리학적 완전 주효가 확인되고, 또한 임상적으로 림프절 전이소가 없는 것이 확인된 경우를 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 있음으로 하였다.
이 치료 효과의 판정 기준에 따라, 비특허문헌 3의 검사 방법을 사용한 경우, 이 35 증례의 Her2 양성 유방암 환자 중, 트라스투주마브와 항암제의 병용에 의한 치료에 대하여 감수성을 나타낸 환자 수는 19 증례라고 알고 있다. 즉, 비특허문헌 3의 검사 방법의 예측 정밀도는 54.2%가 된다.
2. 전체 RNA의 추출
시료로서 상기 "1"에서 얻은, 35 증례의 Her2 양성 유방암 환자의 병리 표본으로부터 레이저 마이크로 다이섹션 시스템(라이카사)을 사용하여 유방암 병변부의 조직을 잘라냈다. 이 잘라낸 조직으로부터, Arcturus(등록 상표) Paradise(등록 상표) Plus 2 round aminoallyl 키트(Life Technologies사)를 사용하여, 동사가 정하는 수순에 따라서 전체 RNA를 얻었다.
3. 유전자 발현량의 측정
시료로서 상기 "2"에서 얻은 35 증례의 Her2 양성 유방암 환자의 전체 RNA를 사용하여, 올리고 DNA 마이크로 어레이로서, 3D-Gene(등록 상표) Human miRNA Oligo chip(도레이 가부시끼가이샤)에 의해 유전자 발현량을 측정하였다. 올리고 DNA 마이크로 어레이의 측정은, 도레이 가부시끼가이샤가 정하는 수순에 기초하여 조작하고, 혼성화를 행한 DNA 마이크로 어레이를 3D-Gene(등록 상표) 스캐너(도레이 가부시끼가이샤)를 사용해서 스캔하여, 화상을 취득하여 3D-Gene(등록 상표) Extraction(도레이 가부시끼가이샤)으로 형광 강도를 수치화하였다. 수치화된 형광 강도를, 바닥이 2인 대수값으로 변환하여 유전자 발현량으로 하고, 35 증례의 Her2 양성 유방암 환자에 대한 Human miRNA Oligo chip의 각 프로브가 혼성화에 의해 검출한 핵산 서열, 즉 망라적인 miRNA의 유전자 발현량을 얻었다.
4. 예측 스코어링 시스템
상기 "1" 내지 "3"에서 얻은 35 증례의 Her2 양성 유방암 환자의 유방암 조직 유래의 전체 RNA로부터 검출된 miRNA의 유전자 발현량을, 상기 섹션 "3"에서 얻은 각 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 유무의 임상 정보를 기초로 환자 간에서 비교하여, 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측용 유전자를 결정하고, 그 유전자를 사용한 경우의 Her2 양성 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 정밀도를 Matlab version 2011a(Mathworks사)를 사용하여 산출하였다. 즉, 도 1에 도시하는 LOOCV법에 따라, 우선 상기 섹션 "3"에서 얻은 35 증례의 Her2 양성 유방암 환자군 중, 75% 이상의 증례에서 유전자 발현량이 5 이상이 되는 miRNA를 골라냈다. 이어서, 35 증례의 Her2 양성 유방암 환자로부터 임의의 1 증례를 나누고, 이 증례의 miRNA의 유전자 발현 데이터를 테스트 데이터로 하였다. 그리고, 나머지 34 증례의 miRNA의 유전자 발현 데이터를 학습 데이터 세트로 하였다. 이어서, 학습 데이터 세트를 Her2 양성 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 유무의 임상 정보를 군 나눔의 지표로 하여 2군으로 나누고, 이 학습 데이터 세트에 대하여 RankProduct법에 의한 2군의 차의 검정을 행하여, 학습 데이터 세트 중의 각 유전자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성에 대한 관여의 높이를 나타내는 순위를 산출하였다. 이어서, RankProduct법으로부터 얻은 순위가 가장 높은 1종의 유전자를 사용하여 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측하기 위한 판별식을, SVM법(수학식 1 내지 수학식 5)을 사용하여 작성하고, 이 판별식을 사용하여 테스트 데이터의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측하였다.
계속해서, 상기한 수순을 나머지 34가지의 모든 조합에 대하여 행하고, 결과적으로 35가지의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측값을 산출하였다. 이 35가지의 예측값과 상기 "1"에서 얻은 Her2 양성 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 유무의 임상 정보를 사용하여 산출한 예측 정밀도(AUROC값)는 0.540이 되고, 35가지의 조합에서 적어도 1회 이상 선택된 유전자는 서열 번호 1의 유전자이었다.
다음으로 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 정밀도를 더욱 높이기 위해서, 트라스투주마브에 대한 치료 감수성에 대한 관여가 높은 유전자를 더 조합하였다. 즉 상기의 수순에 의해, RankProduct법에 의한 순위를 산출하여, 2번째 이후에 순위가 높은 2 이상의 유전자를 사용하여 SVM법에 의한 판별식을 작성하고, 판별식을 사용하여 테스트 세트의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측하는 수순을, LOOCV법에 의해 35가지의 모든 조합에 대하여 행하여, 각각의 유전자 수일 때의 예측 정밀도(AUROC값)를 구하였다.
그 결과, 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 정밀도는, 2 유전자일 때에 AUROC값이 0.516, 3 유전자일 때에 AUROC값이 0.664, 4 유전자일 때에 AUROC값이 0.714, 5 유전자일 때에 AUROC값이 0.674, 6 유전자일 때에 AUROC값이 0.701, 7 유전자일 때에 AUROC값이 0.707, 8 유전자일 때에 AUROC값이 0.747, 9 유전자일 때에 AUROC값이 0.813, 10 유전자일 때에 AUROC값이 0.816, 11 유전자일 때에 AUROC값이 0.839, 12 유전자일 때에 AUROC값이 0.842, 13 유전자일 때에 AUROC값이 0.780, 14 유전자일 때에 AUROC값이 0.776, 15 유전자일 때에 AUROC값이 0.757, 16 유전자일 때에 AUROC값이 0.707, 17 유전자일 때에 AUROC값이 0.737, 18 유전자일 때에 AUROC값이 0.849, 19 유전자일 때에 AUROC값이 0.901, 20 유전자일 때에 AUROC값이 0.951, 21 유전자일 때에 AUROC값이 0.908, 그리고 22 유전자일 때에 AUROC값이 0.885가 되고, 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 정밀도는 20 유전자를 사용했을 때에 예측 정밀도는 최대화되었다(도 2). 그리고, 이 20 유전자를 사용한 경우에 35가지의 조합에서 적어도 1회 이상 선택된 유전자는 서열 번호 1 내지 23의 유전자가 되고, 23종류의 각 유전자가 35가지의 조합에서 선택된 횟수는 표 1과 같이 되었다. 즉, 이 20 유전자를 사용한 본 발명에 의한 예측 정밀도는, 비특허문헌 3의 검사 방법에 의한 예측 정밀도(54.2%)보다 훨씬 높은 것으로 나타났다.
Figure pct00006
이 AUROC값이 최대화되었을 때에, SVM법을 사용한 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측에 사용되는 유전자 20종의 LOOCV법에 의한 선발 결과를 도 3에 도시한다. 표 중의 숫자는, 각 교사 데이터 세트에 있어서, 예측용 유전자를 선택했을 때에, 당해 유전자가 몇 번째로 선택되었는지의 우선 순위를 나타낸다. 예를 들어, 35가지의 각 교사 데이터 세트에 있어서, 트라스투주마브에 대한 치료 감수성에 대한 관여가 높은 1개의 유전자를 선택할 경우(도 2의 그래프에서, 유전자 수가 1인 경우)에 사용하는 예측용 유전자의 선택 방법은 35가지 있는데, 선택된 35가지의 유전자 모두는 서열 번호 1이며, 서열 번호 1을 사용한 경우의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 정밀도는 AUROC값에서 0.540밖에 없는 것을 나타낸다. 또한, 예를 들어 예측 정밀도(AUROC값)가 최대인 0.951이 되는 35 증례부터 34 증례를 골라내는 35가지의 각 교사 데이터 세트에 있어서, 트라스투주마브에 대한 치료 감수성에 대한 관여가 높은 20개의 유전자의 조합은, 서열 번호 1 내지 20, 서열 번호 1 내지 19 및 21, 서열 번호 1 내지 19 및 22, 서열 번호 1 내지 19 및 23, 서열 번호 1 내지 18, 20 및 21, 서열 번호 1 내지 18, 20 및 22, 서열 번호 1 내지 17 및 19 내지 21, 서열 번호 1 내지 17, 19, 20 및 22, 서열 번호 1 내지 17, 19, 21 및 22, 서열 번호 1 내지 16 및 18 내지 21, 서열 번호 1 내지 16, 18, 19, 21 및 22, 서열 번호 1 내지 15 및 17 내지 21, 서열 번호 1 내지 15, 17 내지 19, 22 및 23의 13가지의 조합이 된다. 즉, 각 교사 데이터 세트에 있어서 20개의 유전자를 선택하는 경우(도 2의 그래프에서, 유전자 수가 20인 경우)에 사용하는 예측용 유전자는, 서열 번호 1 내지 23의 23개의 유전자가 된다.
각 교사 데이터 세트에 있어서 선택하는 유전자 수(도 2의 그래프에서의 유전자 수)가 1개 내지 20개인 경우에, 각각 사용하는 예측용 유전자(서열 번호), 또한 그 유전자를 사용할 때의 예측 정밀도(AUROC값)는 표 2에 나타내는 바와 같이 된다.
Figure pct00007
이상으로부터, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측에 있어서, 가장 높은 AUROC값을 나타내는 유전자 수는 도 2의 그래프에서, 유전자 수가 20인 경우이며, 이때에 사용하는 예측용 유전자는, 표 2에 나타내는 서열 번호 1 내지 23의 23개의 유전자가 된다.
실시예 2
서열 번호 1 내지 23을 사용하여 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측을 행하는 경우에, 종래법보다 높은 정밀도로 트라스투주마브 감수성을 예측할 수 있는 가장 적은 유전자의 조합을 확인하기 위해, 실시예 1에서 대상으로 한 35 증례의 Her2 양성 유방암 환자군, 및 이 환자군과는 다른 48 증례의 독립된 환자군에 대한 예측 정밀도를 확인하였다.
1. 48 증례의 환자군에서의 시료의 채취
Her2 단백질의 면역조직 화학적 염색법의 스코어가 3+가 되는 것, 또는 상기 스코어가 2+이며, 또한 형광 제자리 혼성화법의 Her2/CEP17비가 2.2보다 크다고 판정됨으로써, Her2 양성이라고 판별된, 사전동의를 얻은 실시예 1에서 수집한 증례와는 다른 48 증례의 수술전 초기 유방암 환자로부터 트라스투주마브와 항암제의 병용에 의한 치료를 행하기 전에 침생검을 사용하여 유방암 조직을 채취하고, 채취한 유방암 조직으로부터 FFPE 표본을 얻었다. 그리고, FFPE 표본으로부터 두께 10㎛로 얇게 자른 유방암 조직의 병리 표본을 얻었다.
구체적으로는, 48 증례의 Her2 양성 유방암 환자에는 트라스투주마브와 항암제의 병용에 의한 치료를 행하기 전에 침생검에 의한 유방암 조직 채취를 행하였다. 그리고, 침생검 실시 후에 트라스투주마브와, 플루오로우라실, 에피루비신, 시클로포스파미드 및 도세탁셀을 포함하는 시술전 화학 요법에 의한 치료를 행하였다. 트라스투주마브와 이들 항암제에 의한 치료 효과의 판정 기준은, 실시예 1의 판정 기준과 동일하게, 수술시에 채취된 병리 검사 표본에 대하여 행하고, 일본 유방암 학회편 "유방암 취급 규약 제16판"에서 정하는 조직학적 치료 효과의 기준에 의한, Grade 3으로 분류되는 병리학적 완전 주효가 확인되고 또한 임상적으로 림프절 전이소가 없는 것이 확인된 경우를 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 있음으로 하였다.
이 치료 효과의 판정 기준에 따라, 현재, 임상 현장에서 이용되고 있는 비특허문헌 3의 검사 방법을 사용한 검사법을 사용한 경우, 이 48 증례의 Her2 양성 유방암 환자 중, 트라스투주마브와 항암제의 병용에 의한 치료에 대하여 감수성을 나타낸 환자 수는 20 증례라고 알고 있다. 즉, 비특허문헌 3의 검사 방법의 예측 정밀도는 41.7%가 된다.
2. 48 증례의 환자군 유래 시료로부터의 전체 RNA의 추출
실시예 1의 "2"와 동일하게, 시료로서 상기 "1"에서 얻은, 48 증례의 Her2 양성 유방암 환자의 병리 표본으로부터 레이저 마이크로 다이섹션 시스템(라이카사)을 사용하여 유방암 병변부의 조직을 잘라냈다. 이 잘라낸 조직으로부터, Arcturus(등록 상표) Paradise(등록 상표) Plus 2 round aminoallyl 키트(Life Technologies사)를 사용하여, 동사가 정하는 수순에 따라서 전체 RNA를 얻었다.
3. 48 증례의 환자군 유래 시료 유전자 발현량의 측정
실시예 1의 "2"와 동일하게, 시료로서 상기 "2"에서 얻은 48 증례의 Her2 양성 유방암 환자의 전체 RNA를 사용하여, 올리고 DNA 마이크로 어레이로서, 3D-Gene(등록 상표) Human miRNA Oligo chip(도레이 가부시끼가이샤)에 의해 유전자 발현량을 측정하였다. 올리고 DNA 마이크로 어레이의 측정은, 도레이 가부시끼가이샤가 정하는 수순에 기초하여 조작하고, 혼성화를 행한 DNA 마이크로 어레이를 3D-Gene(등록 상표) 스캐너(도레이 가부시끼가이샤)를 사용해서 스캔하여, 화상을 취득하여 3D-Gene(등록 상표) Extraction(도레이 가부시끼가이샤)으로 형광 강도를 수치화하였다. 수치화된 형광 강도를, 바닥이 2인 대수값으로 변환하여 유전자 발현량으로 하고, 48 증례의 Her2 양성 유방암 환자에 대한 Human miRNA Oligo chip의 각 프로브가 혼성화에 의해 검출한 핵산 서열, 즉 망라적인 miRNA의 유전자 발현량을 얻었다.
4. 예측 스코어링 시스템
실시예 1의 "1" 내지 "3"에서 얻은 35 증례의 Her2 양성 유방암 환자의 유방암 조직 유래의 전체 RNA로부터 검출된 서열 번호 1 내지 23의 miRNA의 유전자 발현량을, 실시예 1의 "3"에서 얻은 각 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 유무의 임상 정보를 바탕으로 환자 간에서 비교하여, 서열 번호 1 내지 23의 miRNA에서 선택되는 임의의 2 유전자를 사용한 경우의, Her2 양성 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측하는 예측 스코어링 시스템을, Matlab version 2011a(Mathworks사)를 사용하여 작성하였다.
즉, 35 증례의 Her2 양성 유방암 환자로부터 임의의 1 증례를 나누고, 이 증례의 miRNA의 유전자 발현 데이터를 테스트 데이터로 하였다. 그리고, 나머지 34 증례의 miRNA의 유전자 발현 데이터를 학습 데이터 세트로 하였다. 이어서, 학습 데이터 세트를 Her2 양성 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 유무의 임상 정보를 군 나눔의 지표로 하여 2군으로 나누고, 이 학습 데이터 세트에 대하여 서열 번호 1 내지 23의 miRNA에서 선택되는 임의의 2 유전자를 사용하여 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측하기 위한 판별식을, SVM법(수학식 1 내지 수학식 5)을 사용하여 작성하고, 이 판별식을 사용하여 테스트 데이터의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측하였다. 계속해서, 상기한 수순을 나머지 34가지의 모든 조합에 대하여 행하고, 결과적으로 35가지의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측값을 산출하여, 35 증례의 환자군에 대한 예측 정밀도(AUROC값)을 구하였다.
최종적으로, 35 증례의 환자군에 대하여 서열 번호 1 내지 23의 miRNA에서 선택되는 모든 2 유전자의 조합에 대하여 AUROC값을 구하고, 비특허문헌 3의 검사 방법의 예측 정밀도의 65.2%를 상회하는 2 유전자의 조합, 및 그의 예측 정밀도를 구하였다.
5. 서열 번호 1 내지 23에서 선택되는 2 유전자를 사용한 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측
실시예 2의 "1" 내지 "3"에서 얻은 48 증례의 Her2 양성 유방암 환자의 유방암 조직 유래의 전체 RNA로부터 검출된 miRNA의 유전자 발현량에 대하여 상기 "4"에서 작성한, 서열 번호 1 내지 23의 miRNA에서 선택되는 2 유전자의 조합을 사용하여 작성한 예측 스코어링 시스템을 사용한 경우의, Her2 양성 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 정밀도를 Matlab version 2011a(Mathworks사)를 사용하여, 모든 2 유전자의 조합에 대하여 결정하였다.
그 결과, 실시예 1에서 대상으로 한 35 증례의 Her2 양성 유방암 환자, 및 실시예 2에서 대상으로 한 48 증례의 Her2 양성 유방암 환자의 양쪽에 대하여, 트라스투주마브에 대한 치료 감수성의 예측 정밀도가 함께 높아지는 실시예 1에서 얻은 서열 번호 1 내지 23의 유전자에서 선택되는 2 유전자의 조합, 및 그의 예측 정밀도는 표 3에 나타내는 바와 같이 된다. 즉, 표 3의 2 유전자의 조합의 본 발명에 의한 예측 정밀도는, 실시예 1의 35 증례의 Her2 양성 유방암 환자에 대한 비특허문헌 3의 검사 방법의 예측 정밀도(54.2%), 및 실시예 2의 48 증례의 Her2 양성 유방암 환자에 대한 비특허문헌 3의 검사 방법의 예측 정밀도(41.7%)보다 훨씬 높은 값을 나타낸다.
Figure pct00008
본 발명에 의해, 예측 정밀도가 우수한 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측용 조성물을 제공할 수 있기 때문에, 유방암 환자의 트라스투주마브 또는 트라스투주마브와 항암제의 병용에 의한 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 예측하기 위해 매우 유용하다.
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Claims (12)

  1. 하기의 (a) 내지 (e)에 나타내는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체 또는 그의 단편으로 이루어지는 군에서 선택되는 2 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측용 조성물:
    (a) 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편
    (b) 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드
    (c) 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편
    (d) 서열 번호 1 내지 9, 서열 번호 11 내지 19, 및 서열 번호 21 내지 23으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드
    (e) 상기 (a) 내지 (d) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 하기의 (f) 내지 (j)에 나타내는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체 또는 그의 단편으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2를 더 포함하는, 조성물:
    (f) 서열 번호 10 및 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편
    (g) 서열 번호 10 및 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드
    (h) 서열 번호 10 및 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편
    (i) 서열 번호 10 및 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드
    (j) 상기 (f) 내지 (i) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 그의 단편.
  3. 제1항에 기재된 (a) 내지 (e)에 나타내는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체 및/또는 그의 단편의 2 이상을 포함하는, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측용 키트.
  4. 제3항에 있어서, 제2항에 기재된 (f) 내지 (j)에 나타내는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체 및/또는 그의 단편의 1 또는 2를 더 포함하는, 키트.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가, 서열 번호 1 내지 23 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그의 상보적 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그들의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그들의 16 이상의 연속된 염기를 포함하는 단편인, 키트.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 별개로 또는 임의로 조합되어 다른 용기에 포장되어 있는, 키트.
  7. 제1항에 기재된 (a) 내지 (e)에 나타내는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체 및/또는 그의 단편의 2 이상을 포함하는, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측용 DNA 칩.
  8. 제7항에 있어서, 제2항에 기재된 (f) 내지 (j)에 나타내는 폴리뉴클레오티드, 그의 변이체, 그의 유도체 및/또는 그의 단편의 1 또는 2를 더 포함하는, DNA 칩.
  9. 제1항 또는 제2항에 기재된 조성물, 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 키트, 또는 그들의 조합을 사용하여, 유방암 환자 유래의 시료에서의 표적 핵산의 발현량의 2 이상을 측정하여, 유방암 환자가 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 발휘하는 것의 가능성을 시험관내에서 예측, 판정 또는 평가하는 것을 포함하는, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측을 위한 방법.
  10. 제9항에 있어서, DNA 칩을 사용하는, 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 기재된 조성물, 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 키트, 제7항 또는 제8항에 기재된 DNA 칩, 또는 그들의 조합을 사용하여, 유방암 환자가 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 갖는 것이 기지의 복수의 시료 중 표적 핵산의 발현량을 시험관내에서 측정하는 제1 공정, 상기 제1 공정에서 얻어진 상기 표적 핵산의 발현량을 측정하고, 상기 표적 핵산의 발현량으로부터 산출되는 유전자 발현량을 교사(training sample)로 한 판별식(서포트 벡터 머신)을 작성하는 제2 공정, 유방암 환자의 수술시 또는 생검 검사시에 채취한 시료 중의 상기 표적 핵산의 발현량을 제1 공정과 마찬가지로 시험관내에서 측정하는 제3 공정, 상기 제2 공정에서 얻어진 판별식에 제3 공정에서 얻어진 상기 표적 핵산의 발현량으로부터 산출한 유방암 병변부에서의 유전자 발현량을 대입하여, 상기 판별식으로부터 얻어진 결과에 기초해서 유방암 환자가 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 갖는 것을 예측, 판정 또는 평가하는 제4 공정을 포함하는, 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측을 위한 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 기재된 조성물, 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 키트, 제7항 또는 제8항에 기재된 DNA 칩, 또는 그들의 조합의, 유방암 환자가 트라스투주마브에 대한 치료 감수성을 갖는 것을 시험관내에서 예측, 판정 또는 평가하기 위한 유방암 환자의 트라스투주마브에 대한 치료 감수성 예측용 조성물 및 방법에 대한 용도.
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