KR20110133133A - 뇌졸중 진단용 마커로서 ｖｅｇｆｒ―３의 용도 - Google Patents

뇌졸중 진단용 마커로서 ｖｅｇｆｒ―３의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뇌졸중 진단용 마커로서의 VEGFR-3의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 VEGFR-3 유전자를 이용한 뇌졸중 진단용 마커, 이를 이용한 뇌졸중 진단용 조성물, 키트, 마이크로어레이 및 뇌졸중의 진단 방법에 관한 것이고, 또한 VEGFR-3 유전자 또는 단백질의 발현을 억제하여 뇌졸중을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법 및 상기 물질을 포함하는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 VEGFR-3 유전자는 비-뇌졸중 조직 또는 세포에 비해 뇌졸중 조직 또는 세포에서 발현양이 증가되는 것으로 확인됨에 따라 VEGFR-3 유전자를 뇌졸중 진단용 마커로 사용할 경우 뇌졸중을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있다.

Description

뇌졸중 진단용 마커로서 ＶＥＧＦＲ―３의 용도 {Use of VEGFR-3 as a ischemia stroke diagnostic marker}
본 발명은 뇌졸중을 효과적으로 진단 및 예측할 수 있는 신규한 뇌졸중 진단용 마커, 뇌졸중 진단용 조성물, 뇌졸중 진단용 키트, 마이크로어레이 및 상기 뇌졸중 진단용 마커를 이용한 뇌졸중의 진단 방법에 관한 것이다.
뇌졸중(stroke)은 혈관 폐색 또는 혈관 파열에 기인한 대뇌 관류의 장애로 인한 신경 기능의 갑작스런 손실에 기인하며, 신체 장애 및 사망의 주요 원인으로서 노년 또는 중년의 건강에 심각한 영향을 미친다. 뇌졸중은 뇌로 혈액을 공급하는 중추신경계 혈관 폐색으로 인한 허혈성 뇌졸중(ischaemic stroke, cerebral infarction)과 혈관 파열에 의한 출혈성 뇌졸중(haemorrhagic stroke)으로 크게 구분된다. 그 중 뇌경색(허혈성 뇌졸중)은 전체 뇌졸중 환자의 약 80% 정도를 차지하는바 인간의 생존을 위협하는 매우 심각한 질환으로 알려져 있다. 동맥경화증이나 혈전(thrombus)에 의하여 혈관이 막히는 허혈성 뇌졸중은 막힌 혈관을 뚫어주기 위해 혈전 용해제를 투여해야 사망률과 후유장애 강도를 감소시킬 수 있으며, 뇌혈관의 파열로 인한 출혈성 뇌졸중은 파열된 부위를 막아주면서 혈종(hematoma)을 제거해야 뇌 조직의 괴사를 방지할 수 있다. 뇌졸중의 임상소견은 반신마비, 감각, 언어 및 시력장애, 치매 등 심각한 후유증을 동반한다.
세계보건기구(World Health Organization)의 2002년 보고에 따르면 전세계 심혈관계 질환으로 인한 사망자 수는 1670만명 이었으며, 그 중에 관상동맥 질환과 뇌졸중이 주요 원인으로 각각 720만명, 550만명이 사망한 것으로 보고되어 심혈관계 질환 전체 사망자의 76%에 해당했다. 국내의 경우에도 2000년도 통계청의 자료에 따르면 뇌졸중은 암에 이은 사망원인 수위를 다투고 있으며, 환자수는 약 100만명으로 추산되고 있다.
뇌졸중으로 발생하는 뇌신경 세포 손상의 원인이 과도한 흥분성 신경 전달 물질의 유리, 자유 라디칼(free radical)의 생성, 단백질 합성의 저해, 유전자 발현 이상 및 면역반응의 활성화 등으로 설명될 수 있으나, 아직까지 뇌신경세포 손상기전의 복잡성 등으로 뇌졸중으로 발생하는 뇌신경세포의 손상을 보호해 줄 수 있는 치료제가 개발되어 있지 못한 실정이다. 따라서 뇌허혈로 인한 신경계의 손상을 보호할 수 있는 물질의 개발은 작용 목표가 다양할 수밖에 없고, 그 평가 방법 또한 시험관내 시험(in vitro test)에서 생체내 시험(in vivo test)까지 다양하게 연구되고 있으나, 생약이 가지는 특수성 등으로 인하여 시험관내 시험에서는 효과가 있으나 생체 내 시험에서 효과가 없는 경우가 매우 많은 실정이다.
따라서 뇌졸중은 신속한 진단을 통해 조기 발견하는 것이 그 피해를 줄일 수 있는 최선의 방어책이 된다. 뇌졸증의 진단법은 예방 진단법과 발병 후 진단법으로 구분되어지는데, 상기 예방 진단법으로는 혈액 검사법이 대표적이며, 상기 발병 후 진단법으로는 우선 허혈성 뇌졸중과 출혈성 뇌졸중의 지극히 상반된 치료 기전으로 인해 뇌졸중 발생 초기에 출혈성인지 경색성인지로 이분되는 병인론적인 진단을 위해서 뇌 전산화 단층촬영(CT, computer aided tomography) 또는 자기공명촬영(MRI, magnetic resonance imaging)을 수행하며, 이외에도, 방사성동위원소 또는 초음파을 이용한 뇌혈류 측정법, 뇌혈관 촬영 등이 가능하다. 허혈성 뇌졸중과 출혈성 뇌졸중의 감별진단에는 CT가 가장 도움이 되며 급성기의 허혈성 뇌졸중 정도와 혈관 상태 파악을 위해서는 MRI가 우수하다는 평가를 받고 있다. 그러나 고가 장비의 사용으로 인한 고 비용 및 진단 장소의 제한 등 단점이 있다.
상기 종래의 뇌졸중 진단법은 예방 진단법이 혈액검사 이외에는 없고, 발병 후 진단법은 인체에 해로운 방사성 동위원소를 사용하는 진단이 다수이며, 고가 장비의 사용으로 진단비용이 비싸며, 진단장소가 제한되는 문제점을 구비할 뿐 아니라, 진단결과가 나오는 데까지도 상당 기간이 소요되는 문제점을 발생시키고 있다.
그러나 뇌 조직은 한 번 손상되면 재생되지 않고 일단 발생하면 후유증이 심각하기에, 상기와 같은 발병 이후의 치료법 결정을 위한 진단의 중요성이 사회 경제적 손실비용 감소 측면 외에도 사망률 감소 및 국가 질병관리 측면에서 그 순기능적 가치가 매우 높다 하겠다. 따라서 뇌졸중 조기 진단을 효과적으로 가능하게 하는 새로운 뇌졸중 마커의 개발이 무엇보다 시급한 실정이다.
이에 본 발명자들은 간편한 혈청 검사를 통해 신속하게 조기 뇌졸중을 진단할 수 있는 바이오 마커로써 뇌졸중 조기 진단율을 높여 줄 수 있는 강점을 가진 새로운 바이오 마커를 개발하던 중, 혈관 내피성 성장인자 수용체-3(vascular endothelial growth factor receptor-3, VEGFR-3) 유전자가 비-뇌졸중 조직에 비해 뇌졸중 조직에서 차별적으로 발현이 증가된다는 사실을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 본 발명은 VEGFR-3 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 VEGFR-3 단백질로 이루어진 뇌졸중 진단용 마커를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 VEGFR-3 유전자의 수준 또는 VEGFR-3 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 뇌졸중 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 뇌졸중 진단용 조성물을 포함하는 뇌졸중 진단용 키트 및 뇌졸중 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 VEGFR-3 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계를 포함하는 뇌졸중을 예측 및 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 VEGFR-3 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 VEGFR-3 단백질로 이루어진 뇌졸중 진단용 마커를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 VEGFR-3 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 VEGFR-3 유전자의 수준 또는 VEGFR-3 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 뇌졸중 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 VEGFR-3 유전자의 수준을 측정하는 물질은 VEGFR-3 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 2 또는 3의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 VEGFR-3 단백질의 수준을 측정하는 물질은 VEGFR-3 단백질을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은,
(a) 생물학적 시료에 존재하는 VEGFR-3 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 정상대조군 시료의 VEGFR-3 유전자의 발현양 또는 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 뇌졸중을 예측 및 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 VEGFR-3 유전자는 비-뇌졸중의 조직 또는 세포에 비해 뇌졸중의 조직 또는 세포에서 발현양이 증가되는 것으로 확인되었다. 따라서 VEGFR-3 유전자를 뇌졸중 진단용 마커로 사용할 경우 뇌졸중을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명을 이용해 현재 뇌졸중 진단에 사용되고 있는 뇌졸중 표지자의 낮은 예민도나 특이도를 높일 수 있고 새로운 바이오 마커의 개발로 중복 검사를 피함으로써 환자가 부담하는 의료비를 감소시킬 수 있으며, 뇌졸중의 조기발견과 조기치료를 통해 환자의 생존률을 증가시킬 수 있다.
도 1은 MCA 차단으로 뇌허혈이 발생된 조직(오른쪽)과 비-뇌허혈 조직(왼쪽)에서의 VEGFR-3 mRNA의 발현양의 차이를 형광 염색법을 통해 확인한 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 허혈증 유도 후 허혈 재관류를 시키고, 3일이 지난 다음의 쥐의 경색 현상이 일어나지 않은 반구(왼쪽)와 경색이 일어난 반구(오른쪽)에서의 VEGFR-3 mRNA의 발현양의 차이를 형광 염색법을 통해 확인한 사진을 나타낸 것이다.
도 3는 허혈증 유도 후 허혈 재관류를 시키고, 7일이 지난 다음의 쥐의 경색 현상이 일어나지 않은 반구(왼쪽)와 경색이 일어난 반구(오른쪽)에서의 VEGFR-3 mRNA의 발현양의 차이를 형광 염색법을 통해 확인한 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 허혈증 유도 후 허혈 재관류를 시키고, 14일이 지난 다음의 쥐의 경색 현상이 일어나지 않은 반구(왼쪽)와 경색이 일어난 반구(오른쪽)에서의 VEGFR-3 mRNA의 발현양의 차이를 형광 염색법을 통해 확인한 사진을 나타낸 것이다.
본 발명은 VEGFR-3 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 VEGFR-3 단백질을 포함하는 신규한 뇌졸중 진단용 마커를 제공함에 그 특징이 있다.
기존에 뇌졸중 진단을 위해 사용되고 있는 방법의 경우, 많은 비용이 요구되며 비교적 간편하지 못하다는 문제점이 있었다.
이에 본 발명자들은 새로운 뇌졸중 진단용 마커를 발굴하기 위해 뇌졸중 조직 및 비-뇌졸중 조직에서 발현의 차이를 보이는 유전자를 조사한 결과, VEGFR-3 유전자가 비-뇌졸중 조직에 비해 뇌졸중 조직에서 과발현되는 것을 확인하였고(도 2 내지 4 참조), 따라서 이를 뇌졸중 진단을 위한 마커로 사용할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
한편, 뇌졸중은 국내 뿐만 아니라 국외에서도 높은 발병율을 나타내는 주요 사망원인이 되는 질병 중 하나로서, 본 발명의 대상이 되는 허혈성 뇌졸중은 뇌졸중 발병 환자의 80%가 넘는 많은 환자들이 겪고 있는 주요 뇌졸중 질병이다.
혈관내피세포성장인자(VEGFs)는 이합체 당단백질로써 성체에서의 혈관생성 뿐만 아니라 배아발생에서의 혈관발달을 조절하는 중요한 인자로서, 포유동물에서는 현재 다섯 종류의 VEGF(VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 태반성장인자(PLGF))들이 밝혀져 있다. 이들은 VEGF 수용체-1, -2, -3(VEGFR1-3)라고 알려진 세 개의 수용체 타이로신 인산화효소(RTKs) 등의 보조수용체들과 중복적으로 결합한다.
VEGFs는 수용체 이합체화, 타이로신 인산화효소의 활성화, 신호변환기의 도킹싸이트 형성 등의 기전을 통해 조절되는데, 이러한 조절기전을 통해 본 발명과 관계된 혈관내피세포성장인자 수용체(VEGFRs)는 많은 성장인자 수용체와 마찬가지로 세포이동, 생존, 증식 등을 유발한다. 그러나 VEGFRs는 다른 RTK에게는 없는 기능인 삼차원의 혈관을 형성할 수 있는 신호를 전달하거나 혈관투과성을 조절하는 기능도 가진다.
VEGFRs는 RTK 슈퍼패밀리의 구성원으로, 약 750개 아미노산잔기로 된 세포 외 영역을 가지고 있으며 이는 일곱 개의 면역글로블린(Ig) 같은 주름들로 이루어져 있다. VEGFR-3는 다섯 번째 Ig 영역이 이황화 결합으로 대체되어 있다. 세포외 영역은 단일 막 부위, juxta-membrane 영역, 70개의 아미노산 인산화 효소 삽입에 의해 잘려진 타이로신 인산화효소 영역, C-말단 꼬리와 이어져 있다.
본 발명에 따른 VEGFR-3은 196kDa 단백질로서 VEGF-C/D와 강하게 결합하고, VEGFR-1, 2와는 다르게 합성과정 중에 단백질 분해를 통해 120kDa과 75kDa 단백질로 나누어져 이황화결합으로 연결된다. 무엇보다 VEGFR-3는 림프계의 형성과 유지에 관여한다. 흥미롭게도 VEGFR-3는 자연적으로 발생하는 돌연변이가 보고된 유일한 VEGFR이기 때문에 림프관의 기능이상이 VEGFR-3의 선천적 불활성 돌연변이에 의해 일어날 가능성도 예측된다. VEGFR-3는 PI3K-AKT/PKB 경로의 활성화뿐만 아니라 PKC 의존적인 형태로 ERK 1/2의 활성화를 매개하는데, 이 경로는 VEGF-C가 기본정맥의 제한된 지역으로부터 림프전구세포의 이동과 발아를 이끄는 배아 발달과정에서 중요하다. 왜냐하면 VEGFR-3과 결합하는 VEGF-C/D는 단백질 분해과정을 통해 활성화되는데 생체외 실험에서 이둘은 내피세포의 이동과 분열을 활성화시키며, 생체 내에서 VEGF-C는 초기 림프계 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있기 때문이다. 다만 VEGF-D는 아직 그 기능이 잘 알려져 있지 않으나 암세포의 전이와 관련이 있을 것으로 추정된다. 그리하여 VEGFR-3-/- 쥐는 비정상적인 신경계 발달과 심각한 심혈관계 장애로 인해 배아기에 죽게 된다.
다양한 VEGF 패밀리 단백질들과 변종들, 그리고 여러 종의 VEGFR들은 각각 복합적으로 암의 전이나 감염, 신경의 보호, 나아가 기억과 학습능력에도 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다. 이러한 사실들을 바탕으로 최근 들어 VEGF/VEGFR 기능을 증가시키거나 억제시키는 것을 목적으로 하는 임상적 치료법이 많이 개발되고 있다. 최근 VEGF 항체를 이용하거나, VEGFR을 표적으로 하는 저분자량의 타이로신 인산화효소 억제제 등을 이용하여 항암치료법이 한창 개발 중이다. 이러한 새로운 항암치료법은 병리적 혈관신생에서 과도하게 발현되어있는 VEGF 신호전달체계를 억제하는 것이 임상적으로 적합함을 보여준다(생물학연구정보센터 biowave(http://bric.posteoh.ac.kr/webzine) vol.8, no.20).
다만, VEGF-A와 그의 수용체인 VEGFR-1과 VEGFR-2의 신경계에서의 역할에 대해 연구되어 있다고 할지라도, VEGF-C와 그의 수용체인 VEGFR-2,3이 뇌에서 어떠한 역할을 하는지에 대해서는 밝혀진 바가 없다. 앞서 설명한 바와 같이, VEGF-C는 림프계 생성작용에 관여한다고 알려져 있어, 이의 수용체인 VEGFR-2,3 또한 림프계의 내피 세포에서 대부분 발현되는 것으로 밝혀져 있고, 뇌에서의 작용에 대해서는 보고된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 뇌졸중의 발병을 진단할 수 있는 마커 물질을 개발 위하여, 뇌졸중 이후 그 전과 비교하여 발현의 정도에서 차이가 나는 단백질에 관해 연구하던 중, 본 발명에 따른 VEGFR-3이 비-뇌졸중 조직에 비해 뇌졸중 조직에서 과발현된다는 본 발명에 따른 결과를 기초로, 상기 VEGFR-3 유전자가 뇌졸중의 발병을 진단 및 예측할 수 있는 바이오 마커로서 사용할 수 있음을 예상할 수 있었다.
상기와 같은 예상은 본 발명의 일실시예를 통해 보다 확실히 규명되었는데, 즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 뇌졸중 조직과 비-뇌졸중 조직 샘플을 대상으로 인시츄 하이브리디제이션(in situ hybridization)을 통해 VEGFR-3의 발현정도를 비교한 결과, 비-뇌졸중 조직에 비해 뇌졸중 조직에서 VEGFR-3의 발현이 더욱 증가되어 있는 것으로 나타났다(실시예 2 참조).
따라서 본 발명은 VEGFR-3 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 VEGFR-3 단백질로 이루어지는 뇌졸중 진단용 마커를 제공할 수 있다.
본 발명에서, 상기 "진단"이라는 용어는 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 뇌졸중 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 뇌졸중의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 진단은 뇌졸중 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 뇌졸중의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.
또한, 상기 "진단용 마커(diagnosis marker)"란 뇌졸중의 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 뇌졸중의 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 뇌졸중 진단용 마커는 정상 세포에 비해 뇌졸중의 세포에서 발현양이 증가하는 VEGFR-3 유전자 또는 단백질일 수 있으며, 바람직하게 본 발명에서 상기 VEGFR-3 유전자는 서열번호 1로 기재된 염기서열을 갖는다.
또한, 본 발명은 VEGFR-3 유전자의 수준 또는 VEGFR-3 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 뇌졸중 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 VEGFR-3 유전자의 수준은, 바람직하게 VEGFR-3 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 VEGFR-3 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 VEGFR-3 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 서열번호 1로 나타내는 VEGFR-3 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.
본 발명에서 상기 "프라이머"란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 VEGFR-3 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 뇌졸중 진단용 조성물로서 적절한 프라이머는, 바람직하게 센스 프라이머로써 서열번호 2의 염기서열을 갖는 5’-ctgaggcagaatatcagtctggag-3' 일 수 있으며, 안티센스 프라이머는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 5’-agatgctcatacgtgtagttgtcc-3’일 수 있다.
상기 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기 "프로브"라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 VEGFR-3 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 VEGFR-3 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 "항체"를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 기술한 바와 같이 뇌졸중을 진단할 수 있는 마커 단백질로서 VEGFR-3 단백질이 규명되었으므로, 상기 단백질을 이용하여 항체를 생성하는 방법은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 VEGFR-3 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol . Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
또한, 본 발명은 VEGFR-3 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 뇌졸중 진단용 조성물을 포함하는 뇌졸중 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 뇌졸중 진단용 키트에 포함되는 뇌졸중 진단용 조성물은 VEGFR-3 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.
본 발명의 뇌졸중 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 뇌졸중 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명은 VEGFR-3 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 뇌졸중 진단용 조성물을 포함하는 뇌졸중 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, VEGFR-3 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
또한, 본 발명은 VEGFR-3 유전자의 발현수준 또는 VEGFR-3 단백질 수준을 측정하여 뇌졸중을 진단하는 방법을 제공할 수 있는데, 바람직하게, 상기 방법은 (a) 생물학적 시료에 존재하는 VEGFR-3 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 VEGFR-3 유전자의 발현양 또는 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
상기에서 VEGFR-3 유전자의 발현수준 또는 VEGFR-3 단백질 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 뇌졸중 조직 또는 뇌졸중 세포주를 정상 조직 또는 정상 세포주와 비교하여 각각의 세포 또는 조직에서 발현되는 VEGFR-3의 발현수준을 인시츄 하이브리디제이션(in situ hybridization)을 통해 비교하였다. 그 결과, 뇌졸중이 발생한 샘플에서의 VEGFR-3의 발현정도가 정상 샘플에 비해 증가함을 확인함으로써, 상기 본 발명에 따른 뇌졸중 진단 방법은 생물학적 시료에서의 VEGFR-3 발현 수준이 대조군에 비해 증가되는 것으로 나타날 경우, 이를 뇌졸중이 발병된 것으로 진단할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 뇌졸중 발생 또는 진행 정도에 따른 VEGFR-3 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.
상기 VEGFR-3 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준 또는 단백질의 양을 측정하는 것이며, 상기 mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 VEGFR-3 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 VEGFR-3 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 VEGFR-3 mRNA 발현양 또는 단백질의 양과 뇌졸중 환자 또는 뇌졸중 의심환자에서의 VEGFR-3 mRNA 발현양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현양의 정도를 대조군과 비교함으로써 뇌졸중의 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
뇌졸중의 유도와 조직의 채취 및 염색
<1-1> 뇌졸중 유도 조직의 생성
본 발명자들은 뇌졸중을 유발하는 뇌 허혈증(cerebral ischemia) 이후의 VEGFR-3 mRNA 발현정도를 확인하기 위해 성체(adult) 쥐의 SVZ(Subventricular zone)이 포함된 뇌 조직을 대상으로 실험을 수행하였다.
본 실험에서는 250~300g의 수컷 SD(SpragueDawley)-쥐를 실험용으로 사용하였고, 일시적인 초점성 허혈증(Transient focal ischemia)은 루멘을 통한 쓰레드 기법(intraluminal thread method)을 통해 유도하였다(Longa et al, 1989). 우선 쥐의 오른쪽 바깥 경동맥을 40 실크 봉합(silk suture)으로 묶고, 3-0 둥근 팁 나이론 봉합(rounded tip nylon suture) 시술을 안쪽 경동맥에 시행하여 중대뇌동맥(middle cerebral artery, MCA)을 차단하였다. 봉합 시술은 보통 오른쪽 경동맥에 행한다.
재관류(reperfusion)는 60분 허혈(ischemia) 이후, 보통의 경동맥으로부터 외과적 봉합을 철회함으로서 이루어졌고, 본 실험에서 행해지는 세 개의 모든 동맥들에서의 혈류의 차단과 혈류의 복원은 해부 현미경을 통해 확인되었다.
허혈 동안은 물론 허혈 이후에도 체온(37.5±0.3℃)은 히팅 램프(heating lamp)를 통해 유지되었으며, 이는 직장을 통해 측정하였다. 쉠-처리 쥐(Sham-operated rats)는 같은 MCA를 차단하는 시술만을 제외한 모든 실험 절차를 동일하게 시행하였다.
이러한 모델에서 60분 동안 계속하여 허혈을 유발시킨 결과 오른쪽 MCA의 영역에 국한되어 큰 경색 증세가 나타났으나, 왼쪽 MCA 영역에서는 형태학적 허혈적 손상이 발견되지 않았다. 따라서 상기의 처치로 본 발명과 관계된 뇌졸중을 유발하는 허혈 증상을 실험적으로 효과적인 유도가 가능함을 확인할 수 있었다.
<1-2> 뇌졸중이 유도 후의 조직 채취
상기의 방법으로 실험용 쥐에게 허혈 증상을 유발시킨 후, 우선 허혈 재관류(reperfusion)를 시킨 후에 1, 3, 7, 14일간 생존할 수 있도록 하였다. 각각의 시점에 허혈증을 유발시킨 그룹은 총 7마리, 쉠-처리를 한 대조군(Sham-operated rats) 그룹은 총 3마리를 대상으로 실험을 진행하였는바, 이들은 16.9% 우레탄(urethane) 10ml/kg를 이용하여 깊이 마취시켰다. 마취된 쥐는 pH7.4의 0.1M 인산 버퍼(phosphate buffer)에 4%의 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 포함한 고정액을 경심 관류 고정(transcardial perfusion)방법을 사용하여 죽인 후, 뇌조직을 절단하여 VEGFR-3 발현 정도를 관찰하였다.
동물을 이용한 본 실험의 모든 절차는 가톨릭 대학교의 가톨릭 윤리 위원회(Catholic Ethics Committee)의 승인을 받아 이루어졌고, 미국 국립 보건원의 실험실 동물의 관리와 사용에 대한 가이드(NIH Publication No. 80-23, revised 1996)에 따라 행하였다.
<1-3> 인시츄 혼성화 기법( in situ hybridization ) 수행
인시츄 혼성화 기법을 실시하기 위해, 먼저 VEGFR-3의 정확한 시퀀스는 RT-PCR를 이용해 획득하였다. 이때 사용한 센스 프라이머의 시퀀스는 5’-ctgaggcagaatatcagtctggag-3' 였고, 안티센스 프라이머의 시퀀스는 5’-agatgctcatacgtgtagttgtcc-3’였다. 증폭된 시퀀스를 생체 밖에서의 전사를 통해 DIG(digoxigenin)으로 레이블을 하여 센스 및 안티센스 프로브를 작성하였다(Y.J. Shin, 2008).
<1-2>에서 채취한 25μm 두께의 관상 동결 절편(Coronal cryostat sections)은 18시간동안 52℃의 혼성화 용매 (150 ng/ml)에서 희석된 안티센스 혹은 센스 프로브를 이용해 혼성화 되었다.
혼성화시킨 조직은 기질로 5-브로모-클로로-3-인돌릴 포스페이트(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)(0.18mg/ml)와 4-니트로블루 테트라졸리움 클로라이드(4-nitroblue tetrazolium chloride)(0.35mg/ml)를 사용하여 알칼린 포스파테아제가 접합된 양의 항-DIG 항체(Roche, Germany; 희석비율 1:2000)를 이용하여 확인해 볼 수 있다.
혼성화 이후에는 비오틴이 접합된 쥐의 모노클로날 항-DIG 항체(Jackson Immuno Research, West Grove, PA, USA; 희석비율 1:200)를 섹션된 조직과 함께 상온에서 2시간 동안 인큐베이션 하였다.
항체 염색은 Cy3가 접합된 스트렙타비딘(streptavidin)(Jackson ImmunoResearch; 희석비율 1:1500), FITC가 접합된 항-쥐 항체(Jackson ImmunoResearch; 희석비율 1:50), FITC가 접합된 항-토끼 항체(Jackson ImmunoResearch; 희석비율 1:50), Cy5가 결합된 항-토끼 항체(Jackson ImmunoResearch; 희석비율 1:500)인 2차 항체를 통해 가능하였다.
대조군에서는 1차 항체를 인큐베이션 용매로부터 누락하였고, 세포 핵의 대조염색(Counterstaining)은 DAPI(4,6-diamidino-2-phenyindole; Roche; 희석비율 1:1000)를 이용하여 10분간 절편을 인큐베이팅 함으로서 수행하였다.
슬라이드는 4개의 레이저(Diode 405, Argon 488, HeNe 543, HeNe 633)가 구비된 콘포칼 현미경(LSM 510 Meta; Carl Zeiss Co. Ltd., Germany)을 이용하여 관찰하였으며, 이미지는 TIFF 포맷으로 변환하였고, 대비 정도(contrast level)는 아도브 포토샵 v.7.0(Adobe Systems, San Jose, CA, USA)를 통해 조정하였다.
< 실시예 2>
뇌졸중 조직과 비-뇌졸중 조직에서 VEGFR -3의 발현 차이 분석
상기와 같이 치명적이지 않은 뇌졸중 유발을 위해 1시간 동안 MCA 차단을 쥐에게 행하였을 때, 허혈증이 유발된 모든 동물에서 경색 증상이 일관적으로 앞쪽 피질(cortex), 두정엽(dorsal parietal) 피질, 측면 선조체(striatum,STR)을 포함한 MCA 지역에서 확인되었다. 이러한 경색 부위는 형광-제이드 염색(도 1 참조)과 경색이 발생한 조직(도 1의 오른쪽)과 그렇지 않은 조직(도 1의 왼쪽) 사이의 경계를 확실하게 보여주는 크레실-바이올렛-염색 세포(cresyl-violet-stained cells)의 손실을 통해 확인할 수 있었다.
반면 쉠-처리 쥐(Sham-operated rats)에서는 VEGFR-3 mRNA의 혼성화 신호가 매우 미약했다. 상기 쥐의 절편들은 VEGFR-3 센스 프로브(sense probe)로 인시츄 혼성화 기법(in situ hybridization)을 시행하였는데, 모든 개체에서 세포내 특별한 레이블링은 나타나지 않았다.
뇌졸중이 유발시킨 후에, 본 발명자들은 인시츄 혼성화 기법을 이용하여 SVZ에서의 시간 경과에 따른 VEGFR-3 발현 정도를 분석하였다. 도 2에서와 같이 허혈증이 유도된 지 3일 이후, 허혈이 일어나지 않은 반구에서의 발현 양상(도 2의 왼쪽)과 비교하여, 경색이 일어난 반구의 SVZ(도 2의 오른쪽)에서는 VEGFR-3 mRNA의 증가된 발현을 발견할 수 있었다.
이러한 발현 패턴은 7일째에서도 유지되었다(도 3 참조). 그리고 14일 째 역시 샴-처리 대조군(sham-operated control animals)(왼쪽)과 비교하여 보다 더 많은 VEGFR-3 mRNA 발현 정도를 보였으나(도 4 참조), 그 정도가 7일째보다는 감소한 것을 알 수 있었다.
따라서 상기의 결과를 통해 뇌졸중이 일어난 조직의 경우, 일어나지 않은 조직에 비해 VEGFR-3이 발현되어 염색된 부분이 더 많은 것으로 나타났다. 그리하여 본 발명자들은 VEGFR-3이 정상 조직에 비해 뇌졸중 조직에서 과발현되고 있다는 사실을 알 수 있었고, 나아가 상기 VEGFR-3을 뇌졸중을 진단하기 위한 마커로 사용할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> Use of VEGFR3 as a ischemia stroke diagnostic marker <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 4360 <212> DNA <213> VEGFR-3 gene sequence <400> 1 atgcagccgg gcgctgcgct gaaccggcgc ctgtggctct gcctcggact cctccaaggc 60 ctggcaaatg gctactccat gacccctcca actctgaaca tcacagagga ttcatatgtc 120 attgacaccg gggacagcct atccatatcc tgcagggggc agcaccccct cgagtggacc 180 tggcgagggg cccaagaggt actgaccaca ggtgggaagg acagcgagga cacgcaggtt 240 gtgcaagact gtgaaggcac agaagctagg ccctactgca aggtgctgtc gctggcccag 300 actcacgcca acaacacggg cagctattac tgctactaca agtatatcaa ggcccggatt 360 gagggcacca cagctgccag cacctatgtg tttgtaagag actttgaaca gcctttcatc 420 aacaaacctg acacgctcct ggtcaacagg aaggactcga tgtgggtgcc ctgcttggtg 480 tccattcccg gcctcaacat cacactgcgc tcgcaaagtt cggtgctgca ccctgatggg 540 caggaggtgt tgtgggacga ccgccggggc atgcgggtgc ccactctact gttgcgtgac 600 gccctgtacc tgcagtgcga gaccacctgg ggagaccagg acttcctttc caatcccttc 660 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tggacacctg gaccgagtct gtggagggca agaacaagac ggtgagcaag 1560 ctggtgattc aggatgccaa tgtgtcagcc atgtacaaat gcgtggtctt caacaaagtg 1620 ggccaggacg agcggctcat ctacttctat gtgaccacca tccctgacgg cttcagtatc 1680 gaatcagagc catccgagga tcccttagaa ggccagtccg tgcgcctcag ctgccgggcg 1740 gacaactaca cgtatgagca tctgcgctgg taccggctca acctctccac gctgcacgac 1800 gctcaaggga accccctact gctcgactgc aagaacgtgc acctgtttgc cacgccccta 1860 gaggccaacc tagaggaggc ggagcctggg gcccgccacg ccaccctcag cttgaatatc 1920 ccccgagtgg cgcccgagga cgagggtgac tacgtgtgtg aagtgcagga taggcgcagc 1980 caggacaagc actgccacaa gaagtacctg tccgtgcagg ccctggaagc tcctcggctc 2040 acgcagaact taaccgacct cctggtgaac gtgagaacct ccctggagat gcgatgtccg 2100 gtagccggag cacatgtgcc cagtattgtg tggtacaaag atgaaaggct cctggagaaa 2160 gagtcgggaa tcgacctggc agactccaat cagaggctga gcatccaacg cgtgcgcgag 2220 gaggacgcag gtcgttacct gtgcagtgtg tgcaatgcca agggctgcgt aaactcctcc 2280 gccagcgtgg ccgtagaagg ctcggaagat aaaggcagca tggagattgt gatactcatt 2340 ggcactggcg tcatcgcagt cttcttctgg gtcctcctcc tgctcatctt ctgtaacatg 2400 aaaaggcctg cccatgcaga catcaagacg ggctacctgt ccatcatcat ggaccccggg 2460 gaggtgcctt tggaggagca gtgtgaatac ctgtcctatg acgtcagcca gtgggagttc 2520 cccagggaaa ggttgcacct cgggagagtc ctaggccatg gggcttttgg gaaggtggtg 2580 gaagcctcag cctttggcat caataaaggc agcagctgtg ataccgtggc ggtgaagatg 2640 ctgaaagagg gcgctactgc cagcgaacac cgtgccctga tgtccgagct caagatccta 2700 attcacatcg gtaaccacct caatgtggtc aacctcctag gggcgtgcac caagcccaat 2760 ggccctctca tggtgatcgt ggagttttgc aaatacggca acctctccaa cttcttgcgt 2820 gtcaagcggg agacgttcga cccctacgca gagaagtctc ccgagcaacg caggcgcttc 2880 cgcgcgatgg tagaaggcgc caaggctgat aggaggagac ttggaagcac cgacagagcc 2940 ctgtttacaa ggttcctgat gggcaaagga agtgcacggc gagccccatt tgtccaagaa 3000 gctgaggacc tgtggttgag cccgctgacc atggaggacc ttgtctgcta cagtttccaa 3060 gtggcccggg gaatggagtt cctggcttcc cgcaagtgca ttcacagaga cctggctgct 3120 cggaacattt tactgtcaga aagtgacata gtgaagatct gtgactttgg cctcgctcgg 3180 gacatctaca aagaccctga ctatgtccga aagggcagcg cccgactgcc tctgaaatgg 3240 atggcccccg agagcatctt tgataaggtg tacaccacgc agagtgatgt gtggtccttc 3300 ggcgtgctgc tgtgggagat cttctcattg ggggcctctc cataccctgg ggtacagatc 3360 aatgaggaat tctgccagcg gctgaaagac ggcacacgaa tgagggcccc agaactggcc 3420 actcctgcca tacgccacat catgcagagt tgctggtctg gagaccctaa agcgaggcct 3480 gctttctctg acctagtgga gatcctgggg gacctgcttc agggtggagg ctggcaggag 3540 gaggaggagg aatgcatggc cctgcacagt tctcagagct cagaggagga tggcttcatg 3600 caggcatcca ccacagctct acatatcacg gaggctgacg ctgagagcag tccacccagc 3660 atgcattgcc acagcctggc agccagatat tacaactgtg tgtcctttcc tgggcgcctg 3720 gtcaggggga ctaaggctcc aggttcctcc aggatgaaga cgtttgaaga attgcccatg 3780 acccctacaa cctacaaagc ctctgtggat aaccaaacag acagcgggat ggtgctggcc 3840 tcagaagagt ttgagcagat agaaagcagg catagacaag aaggcagctt cagccgtaaa 3900 gatcctggcc agcacatgga tatttccaga ggacacccgg acctccaggg gaggcggcga 3960 cggcccaccc agggggcaca aggaggcaag gtgttttaca acaacgagta tggggaggtc 4020 tcccagccgt gtacagaagg tgactgctgc ccgtctgctg gctccacctt cttcgcagac 4080 agcaactact aaggaacacg cggcaaggcc tcctgcccct ggctgcaacc cagctacgac 4140 ggctgggctg gagagacatc cctagcaggg caaggctgga ggcccaggct gggaagtcaa 4200 ctcctctagt tccagccctg gaggtgtttt gtgtcccacc cctaccccct gccccttaca 4260 gcctccctat ccaggaagag tcaaactcag acaacgaggg ctcccttgaa ctcgatatca 4320 ctgggcagtc accctcaccc tcgcattcaa ttcccttgta 4360 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for VEGFR-3 <400> 2 ctgaggcaga atatcagtct ggag 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for VEGFR-3 <400> 3 agatgctcat acgtgtagtt gtcc 24

Claims (9)

  1. VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 VEGFR-3 단백질로 이루어진 뇌졸중 진단용 마커.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 VEGFR-3 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 진단용 마커.
  3. VEGFR-3 유전자의 수준 또는 VEGFR-3 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 뇌졸중 진단용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 VEGFR-3 유전자의 수준을 측정하는 물질은 VEGFR-3 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 뇌졸중 진단용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 프라이머는 서열번호 2 또는 3의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 진단용 조성물.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 VEGFR-3 단백질의 수준을 측정하는 물질은 VEGFR-3 단백질을 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 뇌졸중 진단용 조성물.
  7. (a) 생물학적 시료에 존재하는 VEGFR-3 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 (a)단계의 측정결과를 정상대조군 시료의 VEGFR-3 유전자의 발현양 또는 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 뇌졸중을 예측 및 진단하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 뇌졸중을 예측 및 진단하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 뇌졸중을 예측 및 진단하는 방법.
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