KR101819421B1

KR101819421B1 - 줄기세포 노화 예측용 마커로서 유비퀴틴 c의 용도

Info

Publication number: KR101819421B1
Application number: KR1020170068897A
Authority: KR
Inventors: 김명신; 김용구; 김지연
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2017-06-02
Filing date: 2017-06-02
Publication date: 2018-01-16

Abstract

본 발명은 유비퀴틴 C(ubiquitin C) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 중간엽줄기세포의 노화 진단용 조성물 및 키트에 관한 것으로서, 구체적으로 상기 유비퀴틴 C 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 물질에 의하여 상기 유비퀴틴 C의 양이 감소되면 중간엽줄기세포의 노화가 진행된 것으로 판별할 수 있어 줄기세포의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

줄기세포 노화 예측용 마커로서 유비퀴틴 C의 용도{Use of ubiquitin C as marker for predicting stem cell senescence}

본 발명은 줄기세포 노화 예측용 마커인 유비퀴틴 C의 용도에 관한 것이다.

줄기세포에는 배아줄기세포와 성체줄기세포가 있다. 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 조골세포(osteoblast), 연골세포(chondrocyte), 지방세포(adipocyte) 등으로 분화가 가능한 다분화성 성체 줄기세포로서, 조직재생이 필요한 여러 질환의 치료제로 널리 사용되고 있다. 중간엽 줄기세포는 배아줄기세포와 달리, 제한된 증식력을 가지고 있으므로 암세포화 가능성이 없으며 수정란의 파괴가 없어 윤리적으로도 문제가 되지 않는다. 따라서, 중간엽줄기세포는 신속한 연구가 진행되어 임상 적용이 가능한 단계까지 도달한 상태이다.

골수 유래 중간엽 줄기세포는 가장 활발히 연구가 이루어진 성체줄기세포로서, 단핵 골수세포 중 0.001 내지 0.01%로 구성되어 있고, 상기 중간엽 줄기세포를 임상에 적용하기 위해서는 2x10⁶ cells/kg 의 세포수가 필요하다. 따라서, in vitro에서의 인위적인 세포배양이 필수적이나, 상기 세포의 배양과정에서 세포의 노화로 인해 세포의 활성과 특징을 유지하고 관리하기가 어려운 문제점이 존재한다.

이에 본 발명자들은 세포배양 과정에서 노화의 조절 및 이의 변화를 관찰할 수 있는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

1. 한국등록특허 제10-1541958호

본 발명의 목적은 유비퀴틴 C(ubiquitin C) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 중간엽줄기세포의 노화 진단용 조성물 및 상기 중간엽줄기세포의 노화 진단용 조성물을 포함하는 중간엽줄기세포의 노화 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 중간엽줄기세포로부터 유비퀴틴 C 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 중간엽줄기세포의 노화 예측 및 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유비퀴틴 C(ubiquitin C) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 중간엽줄기세포의 노화 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 CDK1(Cyclin-Dependent Kinase 1), CCNA2(cyclin A2), MCM10(Minichromosome Maintenance complex component 10), E2F1(E2F Transcription Factor 1), HIST1H1A(Histon Cluster 1), HIST1H3B(Histon Cluster 1, H3b), BRCA1(breast cancer 1) 및 AURKB(Aurora B kinase)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현량을 측정하는 제제를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유비퀴틴 C 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유비퀴틴 C 유전자가 코딩하는 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유비퀴틴 C 유전자의 발현량을 측정하는 제제는 상기 유비퀴틴 C 유전자에 상보적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유비퀴틴 C 유전자의 발현량을 측정하는 제제는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유비퀴틴 C 단백질의 발현량을 측정하는 제제는 상기 유비퀴틴 C 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체단편, 항체모방체, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 및 펩티도모방체(peptidomimetics)로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 in vitro 세포배양으로 증식된 세포인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 골수, 제대, 제대혈, 지방, 근육, 피부, 양막 및 태반으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나에서 분리된 세포인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 중간엽줄기세포의 노화 진단용 조성물을 포함하는 중간엽줄기세포의 노화 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 중간엽줄기세포로부터 유비퀴틴 C 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 중간엽줄기세포의 노화 예측 및 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 CDK1(Cyclin-Dependent Kinase 1), CCNA2(cyclin A2), MCM10(Minichromosome Maintenance complex component 10), E2F1(E2F Transcription Factor 1), HIST1H1A(Histon Cluster 1), HIST1H3B(Histon Cluster 1, H3b), BRCA1(breast cancer 1) 및 AURKB(Aurora B kinase)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유비퀴틴 C 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현량이 대조군과 비교하여 감소된 경우 상기 중간엽줄기세포의 노화가 진행된 것으로 판별하는 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 및 면역침전분석법으로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법으로 수행되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 유비퀴틴 C(ubiquitin C) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현량을 측정하는 제제에 의하여 중간엽줄기세포의 노화를 판별하는 것에 관한 것으로서, in vitro 세포배양으로 증식된 중간엽줄기세포 또는 환자에서 분리된 중간엽줄기세포에서 노화가 진행되었는지 여부를 판별할 수 있어, 세포치료제에 사용되는 줄기세포의 품질을 평가하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 중간엽줄기세포의 계대배양 초기와 후기의 유전자 발현량을 비교하여 GO(Gene Ontology) term으로 분류한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 중간엽줄기세포의 계대배양 초기 및 후기에서의 CDK1, CCNA2, MCM10, E2F1, HIST1H1A, HIST1H3B, BRCA1 및 UBC 유전자의 발현량을 real-time PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 계대배양 후기에 유전자 발현량이 4배 이상 감소한 유전자들의 상호작용을 확인하는 위하여 IPA(Ingenuity® Pathway Analysis) 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 유전자들의 상호작용을 BisoGenet 네트워크 분석 프로그램을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 줄기세포에 UBC siRNA로 형질전환시킨 후 96시간 동안 세포의 증식능을 비교한 결과(위쪽) 및 UBS siRNA의 농도에 따른 세포의 증식능을 비교한 결과(아래쪽)를 나타낸 것이다.
도 6는 줄기세포에 UBC siRNA로 형질전환시킨 후 72시간 동안 UBC 및 UBC와 상호작용하는 유전자들(CDK1, CCNA2, MCM10, E2F1, HIST1H1A, HIST1H3B, BRCA1, AURKB)의 발현량을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 CCD986Sk(human normal fibroblast, ATCC® CRL1947™), HCC1599(human epithelial, lymphoblast from mammary gland, ATCC® CRL2331™ 및 CPAE(bovine endothelial cell, ATCC^®　CCL-209^™) 세포에서 UBC 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 나이에 따른 UBC 발현량을 차이를 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명에서의 용어, "진단"은 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 줄기세포의 노화 마커의 발현 유무를 확인하여 줄기세포의 노화 진행 여부를 확인하는 것을 의미한다.

본 발명에서의 용어, "진단용 마커(diagnosis marker)"란 노화된 줄기세포와 노화되지 않은 줄기세포를 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 노화되지 않은 줄기세포에 비하여 노화된 줄기세포에서는 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 줄기세포의 노화 진단용 마커는 노화되지 않은 줄기세포에 비해 노화된 줄기세포에서 발현량이 증가하는 유비퀴틴 C의 유전자 또는 단백질일 수 있다.

본 발명에서 상기 유비퀴틴 C의 유전자의 수준은, 바람직하게 유비퀴틴 C의 유전자가 발현된 mRNA 발현량을 의미하며, 상기 발현량을 측정할 수 있는 물질로는 유비퀴틴 C 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 유비퀴틴 C 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 서열번호 1로 나타내는 유비퀴틴 C 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.

본 발명에서의 용어, "프라이머"는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유비퀴틴 C 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다. 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서의 용어, "프로브"는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 유비퀴틴 C 단백질의 발현량을 측정할 수 있는 물질로는 유비퀴틴 C 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 포함할 수 있다. 유비퀴틴 C 단백질을 이용하여 항체를 생성하는 방법은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 유비퀴틴 C 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

또한, 본 발명에서 제공되는 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 암 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

또한, 본 발명은 유비퀴틴 C 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 줄기세포의 노화 진단용 조성물을 포함하는 줄기세포의 노화 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 유비퀴틴 C 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

또한, 본 발명은 유비퀴틴 C 유전자의 발현량 또는 유비퀴틴 C 단백질 발현량을 측정하여 줄기세포의 노화를 예측 및 진단을 위해 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은 중간엽줄기세포에서 유비퀴틴 C 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및 상기 유비퀴틴 C 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현량이 대조군과 비교하여 감소한 경우 상기 중간엽줄기세포의 노화가 진행된 것으로 판별하는 단계를 포함할 수 있다. 상기에서 유비퀴틴 Cdml 발현량 또는 단백질의 발현량을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정으로 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 중간엽줄기세포는 줄기세포 치료제로 사용되기 위한 in vitro 세포배양으로 증식된 세포일 수 있고, 줄기세포 치료제를 위해 환자의 골수, 제대, 제대혈, 지방, 근육, 피부, 양막 또는 태반에서 분리된 세포일 수 있다.

상기 유비퀴틴 C 유전자의 발현량의 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 유비퀴틴 C 단백질 발현량의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 시료 내의 유비퀴틴 C 단백질에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 재료 및 방법

1.1. 세포 배양

중간엽줄기세포는 동의를 얻은 건강한 성인의 골수(BM)로부터 얻은 중간엽줄기세포 계대배양 1단계(P1) 세포를 분양 받아 실험을 진행하였고, 모든 실험은 서울성모병원의 임상연구심의위원회(Institutional Review Board of Seoul St. Mary's hospital; KC12CNSI0078)의 승인을 받아 진행하였다. 분양받은 P1 세포의 계대배양은 세포가 배양접시에 70~80% 정도 자랐을 때, 0.25% 트립신-EDTA(Gibco) 으로 처리하여 수확하였고, 세포계수를 통해 150mm 배양접시에 300세포/1cm 다시 접종하여 배양하였다. 중간엽줄기세포는 alpha-MEM(alpha-modified minimum essential medium, Gibco) 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 중간엽줄기세포의 계대배양은 세포의 증식능이 멈출때까지 반복하여 배양하였다.

중간엽줄기세포 이외의 세포의 경우 CCD986Sk(human normal fibroblast, ATCC® CRL1947™), HCC1599(human epithelial, lymphoblast from mammary gland, ATCC® CRL2331™ 및 CPAE(bovine endothelial cell, ATCC^®　CCL-209^™) 세포를 사용하였다.

1.2. 마이크로어레이 ( Microarray ) 분석

중간엽줄기세포의 계대배양 초기와 후기의 유전적 발현의 차이를 알아보기 위하여 마이크로어레이 분석을 실시하였다. 계대배양 초기와 후기의 중간엽줄기세포에서 RNA를 추출하여 질(quality)과 양(quantity)을 확인한 후, SurePrint G3 Hmn GE 8 × 60K V2 Microarray Kit(Agilent Technologies, Cedar Creek, TX)를 이용하여 실험을 진행하였다. 200ng의 RNA를 합성하여 이중가닥인 cRNA로 합성하여 증폭시킨 후, 프로브(probe)가 붙어있는 칩(chip)에 반응시켜 데이터를 산출하였다. 그 후 GeneSpring GX 7.3(Agilent Technologies, Cedar Creek, TX) 분석프로그램을 데이터를 분석하였고, GeneCards (http://www.genecards.org/), DAVID (http://david.abcc. ncifcrf.gov/), QIAGEN's Ingenuity® Pathway Analysis (IPA; Qiagen Redwood City, www.qiagen.com/ingenuity), BisoGenet 프로그램들을 이용하여 중간엽줄기세포의 계대배양 초기를 기준으로 계대배양 후기의 세포에서 유전자 발현량이 증가 혹은 감소한 유전자들의 특징을 알아보았다.

1.3. 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time polymerase chain reaction; real-time PCR )

마이크로어레이 분석에서 중간엽줄기세포의 배양 초기와 배양 후기에서 유전자 발현 차이가 분명하게 보였던 유전자를 선택하여 TaqMan® gene expression array(Applied Biosystems, Foster City, CA)로 실험을 실시하였고, 2^- ^ΔΔCt 법으로 데이터를 도출하였다. 유전자는 UBC(ubiquitin C; Hs01871556_s1), CDK1(Cyclin-Dependent Kinase 1; Hs00938777_m1), CCNA2(cyclin A2; Hs00996788_m1), MCM10(Minichromosome Maintenance complex component 10; Hs00960349_m1), E2F1(E2F Transcription Factor 1; Hs00153451_m1), HIST1H1A(Histon Cluster 1, H1a; Hs00271225_s1), HIST1H3B(Histon Cluster 1, H3b; Hs00605810_s1), BRCA1(breast cancer 1; Hs01556193_m1) 및 AURKB(Aurora B kinase; Hs00177782_m1)를 선택하여 계대배양 초기와 후기의 발현량 비교뿐만 아니라 단계별 유전자 발현량 변화를 확인하였다.

유전자	방향	서열
UBC	Forward	5'- CTGTGATCGTCACTTGACAATGCAG - 3' (서열번호 3)
UBC	Reverse	5'- AGGAGGGATCCTTCCTTATCTTGGA - 3' (서열번호 4)
CDK1	Forward	5'- TTTTGTCACTCTAGAAGAGTTCT - 3' (서열번호 5)
CDK1	Reverse	5'- TCCAAAAGCTCTGGCAAGGCCAAA - 3' (서열번호 6)
CCNA2	Forward	5'- TGGAAAGCAAACAGTAAACAGCC - 3' (서열번호 7)
CCNA2	Reverse	5'- GGGCATCTTCACGCTCTATTT - 3' (서열번호 8)
MCM10	Forward	5'- GCCAAGATTCTACATTGCTCAT - 3' (서열번호 9)
MCM10	Reverse	5'- ATTGTCTTCCTCCTCATCCAT - 3' (서열번호 10)
E2F1	Forward	5'- GGAGAAGTCACGCTATGAGACC - 3' (서열번호 11)
E2F1	Reverse	5'- ACGACACCGTCAGCCGAGTGGCTC - 3' (서열번호 12)
HIST1H1A	Forward	5'- CTCCTCTAAGGAGCGTGGTG - 3' (서열번호 13)
HIST1H1A	Reverse	5'- GAGGACGCCTTCTTGTTGAG - 3' (서열번호 14)
HIST1H3B	Forward	5'- TCGGAAATCCACCGGCGGTAAA - 3' (서열번호 15)
HIST1H3B	Reverse	5'- CTGGAAGCGAAGATCGGTCTTGAA - 3' (서열번호 16)
BRCA1	Forward	5'- ACAGCTGTGTGGTGCTTCTGTG - 3' (서열번호 17)
BRCA1	Reverse	5'- CATTGTCCTCTGTCCAGGCATC - 3' (서열번호 18)
AURKB	Forward	5'- CAGAGAGATCGAAATCCAGGC - 3' (서열번호 19)
AURKB	Reverse	5'- CCTTGAGCCCTAAGAGCAGAT - 3' (서열번호 20)

1.4. 유전자 억제(Gene Knockdown)

중간엽줄기세포의 노화를 유발하는 핵심 유전자인 UBC(ubiquitin C)의 기능을 증명하기 위해 RNA 간섭 현상을 이용하였다. RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 이란, 이중가닥 RNA 서열(double stranded RNA; dsRNA) 가 그 RNA의 염기서열에 해당하는 표적 mRNA를 선택적으로 분해하여 표적 유전자의 전사와 단백질 합성을 중단(gene silencing)시키는 과정으로 이때 표적 mRNA의 분해는 긴 dsRNA가 Dicer RNase III에 의해서 분해될 때 생성되는 small interfering RNA(siRNA)에 의해 이루어진다. 따라서, 표적 유전자의 RNAi 현상을 유도할 수 있는 siRNA(small interfering RNA)를 선정하여 UBC 유전자의 기능을 규명하였다. UBC 유전자 억제는 GenePharma(GenePharma Co., Ltd., Shanghai, China)에서 만든 UBC 특이적 siRNA(5'-GUGACACUAUCGAGAACGUTT-3': 서열번호 1)를 중간엽줄기세포의 계대배양 3단계 세포에 100 nM 농도로 처리하여 형질전환을 유도하였고, 이때 Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 형질전환 시약을 같이 처리하였다. 형질전환 6시간 후 신선한 배지로 교체한 후 3일간 배양하였고, 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포군, 형질전환 시약만 처리한 세포군, 및 표적유전자와 상동성이 없는 시퀀스로 이루어진 siRNA를 음성 대조군으로 사용하였다.

1.4.1. 유전자 발현량 측정

형질전환 직전 세포(0시간) 와 형질전환 후 6, 12, 24, 48, 72시간의 세포에서 RNA를 추출하여 UBC 유전자 억제 및 UBC 유전자와 상호작용하는 유전자들의 발현량 변화를 확인하였다. 실험군과 대조군에서 추출한 RNA는 cDNA로 합성하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 통해 UBC, CDK1, CCNA2, MCM10, E2F1, HIST1H1A, HIST1H3B, BRCA1 및 AURKB 유전자의 발현량을 측정하였다.

1.4.2. 실시간 세포 측정

UBC siRNA의 농도와 중간엽줄기세포의 증식능의 상관관계를 확인하기 위해 계대배양 5단계 세포에 각각 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100nM의 농도로 형질전환 하여 96시간 동안 실시간으로 증식능의 변화를 확인하였다. 중간엽줄기세포의 계대배양 초기(P2), 중기(P5), 후기(P7)의 세포에도 UBC siRNA를 각각 0, 5, 25, 50, 100nM의 농도로 형질전환하여 증식능의 변화를 비교하였다. 중간엽줄기세포의 증식능 변화는 실시간 세포 측정 기기(xCELLigence RTCA DP system; Roche, Mannheim, Germany)을 이용하여 확인하였다.

실시예 2. 유전자 발현 마이크로어레이를 통한 gene ontology 분석

중간엽줄기세포의 계대배양 초기에 발현된 유전자를 기준으로 계대배양 후기에 유전자 발현량이 4배 이상 감소한 유전자들을 선택하여 Gene Ontology (GO) term 으로 분류하였다(도 1).

결과를 살펴보면, 중간엽줄기세포의 계대배양 후기에서는 세포주기(cell cycle), 세포분열(cell division), 세포소기관 구성(organelle organization), DNA 복제(DNA replication), DNA 패키징(DNA packaging), 세포주기확인점(cell cycle checkpoint), DNA 자극손상 반응(response to DNA damage stimulus), DNA 회복(DNA repair), RNA 대사과정(RNA metabolic process), 단백질 조절(regulation of protein), 세포증식(cell proliferation), 및 이중가닥손상복구(DSB repair)에 관련된 유전자들의 발현량이 감소한 것으로 나타났다.

상기 GO term에 관련된 유전자는 CDK1, CCNA2, MCM10, E2F1, HIST1H1A, HIST1H3B, BRCA1 및 UBC로서, 중간엽줄기세포의 계대배양 후기에 상기 유전자의 발현량이 감소되는 여부를 real-time PCR로 확인하는 실험을 진행하였다. 상기의 모든 유전자들은 배양초기에 비하여 배양후기에 통계적으로 유효하게 발현량이 감소됨을 확인하였다(도 2; P < 0.05). 상기 real-time PCR의 결과는 GO 분석과 일치하는 결과인 것으로 나타났다.

계대배양 후기에 유전자 발현량이 4배 이상 감소한 유전자들의 상호작용을 확인하는 위하여 IPA(Ingenuity® Pathway Analysis) 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 1의 GO 분석에서와 유사한 결과를 보였다. 특히, 각각의 유전자 네트워크 분석 데이터를 병합한 결과, 계대배양 후기에 발현량이 감소한 유전자들의 핵심에 UBC 유전자와 상호작용하는 것을 확인하였다(도 3). 또한, UBC 유전자가 다른 유전자의 발현량의 감소에서의 핵심 유전자라는 것은 BisoGenet 네트워크 분석 프로그램을 통해 다시 한번 검증하였다(도 4).

실시예 3. 유전자 억제 분석

본 발명자들은 실시예 2의 결과를 바탕으로 UBC 유전자의 기능을 평가하기 위하여 UBC 유전자의 억제 실험을 수행하였다. 줄기세포에 UBC siRNA로 형질전환시킨 후, 96시간 동안 줄기세포의 증식을 실시간으로 모니터링하였다. 그 결과, UBC siRNA에 의해 UBC 유전자 발현이 억제된 세포의 경우 음성 대조군에 비하여 42.2% 세포 증식이 억제됨을 확인하였다(도 5, 위쪽 패널). 또한, UBC siRNA의 농도는 줄기세포의 증식속도에 영향을 미치는 것을 확인하였다(도 5, 아래쪽 패널).

또한, 본 발명자들은 UBC siRNA로 형질전환시킨 후 72시간 동안 시간별(0, 6, 12, 24, 48, 72시간)로 mRNA를 추출한 후, UBC 및 UBC와 상호작용하는 유전자들(CDK1, CCNA2, MCM10, E2F1, HIST1H1A, HIST1H3B, BRCA1, AURKB)의 발현량을 분석한 실험을 수행하였다. 그 결과, UBC siRNA로 형질전환된 줄기세포는 대조군에 비해 형질전환 후 6시간에서 13% 이상 감소하기 시작하여 12시간에서 최저의 발현량(5%)을 보였다(도 6, 위쪽 패널). UBC와 상호작용하는 유전자들(CDK1, CCNA2, MCM10, E2F1, HIST1H1A, HIST1H3B, BRCA1, AURKB)은 형질전환 후 24시간 이후 발현량이 감소하였고, 48시간에는 급격한 발현량의 감소를 보였으며, 72시간까지 계속하여 발현량이 감소됨을 확인하였다(도 6, 아래쪽 패널).

UBC 유전자의 발현이 증가하면 중간엽줄기세포의 증식이 활발히 일어나고, UBC 유전자의 발현이 억제되면, 다른 유전자의 발현량을 억제시켜 중간엽줄기세포의 증식이 억제됨을 확인하였다. 따라서, UBC 유전자는 중간엽줄기세포의 증식에 핵심 역할을 하고 있으며, 중간엽줄기세포의 노화를 예측할 수 있는 마커로서 사용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 4. 중간엽줄기세포 이외의 세포에서 UBC 발현량의 분석 결과

본 발명자들은 CCD986Sk(human normal fibroblast, ATCC® CRL1947™), HCC1599(human epithelial, lymphoblast from mammary gland, ATCC® CRL2331™ 및 CPAE(bovine endothelial cell, ATCC^®　CCL-209^™) 세포를 사용하여 실험을 수행하였다. 상기 세포주는 한 달 동안의 세포 배양을 통해 노화를 유도하였고, 이후 RNA를 추출하여 UBC 발현량을 측정하였다. 그 결과, 상기 세포주 모두에서 UBC 발현량이 감소하였다(도 7). 이에 대한 수치는 하기 표 2에 나타내었다.

		발현량 평균	오차
CCD986Sk	P21	0.243	0.001
CCD986Sk	P22	0.161	0.015
HCC1599	P4	0.276	0.051
HCC1599	P5	0.039	0.015
CPAE	P36	0.054	0.015
CPAE	P37	0.013	0.003

따라서, 세포 노화가 진행되면 중간엽줄기세포 뿐만 아니라 정상 섬유아세포, 외피세포 및 내피세포 등의 중간엽줄기세포 이외의 세포에서도 UBC(ubiquitin C) 발현량이 감소됨을 확인하였다.

실시예 5. 나이에 따른 UBC 발현량 분석 결과

본 발명자들은 나이에 따라 UBC 발현량이 감소하는지 확인하는 실험을 진행하기 위하여, 다양한 나이의 공여자(n=32, 나이: 19~81)로부터 기증받은 골수 유래 중간엽줄기세포를 분리하여 계대배양하고, 계대배양 2단계(P2)에서 RNA를 추출하여 UBC 발현량을 측정하여, 나이와 UBC 발현량에 대한 상관성을 분석하였다. 그 결과, 나이에 따라 UBC 발현량이 감소됨을 확인하였다(도 8, r = -0.307, P = 0.087).

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> Use of ubiquitin C as marker for predicting stem cell senescence <130> PN1612-465 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2309 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggagttggcg agtgtgtttt gtgagttttt aggcaccttt tgaaatgtaa tcatttgggt 60 caatatgtaa ttttcagtgt tagactagta aattgtccgc taaattctgg ccgtttttgg 120 cttttttgtt agacaatgca gatcttcgtg aagactctga ctggtaagac catcaccctc 180 gaggtggagc ccagtgacac catcgagaat gtcaaggcaa agatccaaga taaggaaggc 240 attcctcctg atcagcagag gttgatcttt gccggaaaac agctggaaga tggtcgtacc 300 ctgtctgact acaacatcca gaaagagtcc accttgcacc tggtactccg tctcagaggt 360 gggatgcaaa tcttcgtgaa gacactcact ggcaagacca tcacccttga ggtcgagccc 420 agtgacacaa tcgagaacgt caaggcaaag atccaagaca aggaaggcat tcctcctgac 480 cagcagaggt tgatctttgc cggaaagcag ctggaagatg ggcgcaccct gtctgactac 540 aacatccaga aagagtctac cctgcacctg gtgctccgtc tcagaggtgg gatgcagatc 600 ttcgtgaaga ccctgactgg taagaccatc accctcgaag tggagccgag 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1500 gggatgcaga tcttcgtgaa gaccctgact ggtaagacca tcaccctcga ggttgagccc 1560 agtgacacca tcgagaatgt caaggcaaag atccaagata aggaaggcat ccctcctgat 1620 cagcagaggt tgatctttgc tggaaaacag ctggaagatg ggcgcaccct gtctgactac 1680 aacattcaga aagagtccac cctgcacctg gtgctccgtc tcagaggtgg gatgcaaatc 1740 ttcgtgaaga cactcactgg caagaccatc acccttgagg tggagcccag tgacaccatc 1800 gagaacgtca aggcaaagat ccaggacaag gaaggcattc ctcctgacca gcagaggttg 1860 atctttgccg gaaagcagct ggaagatggg cggaccctgt ctgactacaa catccagaaa 1920 gagtctaccc tgcacctggt gctccgtctc agaggtggga tgcagatctt cgtgaagacc 1980 ctgactggta agaccattac cctcgaggtg gagcccagtg acaccatcga gaatgtcaag 2040 gcaaagatcc aagataagga aggcatccct cctgatcagc agaggttgat ctttgctggg 2100 aaacagctgg aagatggacg caccctgtct gactacaaca tccagaaaga gtccactctg 2160 cacttggtcc tgcgcttgag ggggggtgtc taagtttccc cttttaaggt ttcaacaaat 2220 ttcattgcac tttcctttca ataaagttgt tgcattccca attggtgttt tttttttttt 2280 tttttttttt tttaagttta ttttgcatt 2309 <210> 2 <211> 685 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 20 25 30 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 35 40 45 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu 50 55 60 Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe 65 70 75 80 Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser 85 90 95 Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile 100 105 110 Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp 115 120 125 Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His 130 135 140 Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu 145 150 155 160 Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu 165 170 175 Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln 180 185 190 Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu 195 200 205 Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg 210 215 220 Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr 225 230 235 240 Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala 245 250 255 Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile 260 265 270 Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn 275 280 285 Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly 290 295 300 Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 305 310 315 320 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 325 330 335 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 340 345 350 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu 355 360 365 Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe 370 375 380 Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser 385 390 395 400 Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile 405 410 415 Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp 420 425 430 Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His 435 440 445 Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu 450 455 460 Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu 465 470 475 480 Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln 485 490 495 Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu 500 505 510 Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg 515 520 525 Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr 530 535 540 Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala 545 550 555 560 Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile 565 570 575 Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn 580 585 590 Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly 595 600 605 Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 610 615 620 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 625 630 635 640 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 645 650 655 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu 660 665 670 Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Val 675 680 685 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC-F <400> 3 ctgtgatcgt cacttgacaa tgcag 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC-R <400> 4 aggagggatc cttccttatc ttgga 25 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDK1-F <400> 5 ttttgtcact ctagaagagt tct 23 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDK1-R <400> 6 tccaaaagct ctggcaaggc caaa 24 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCNA2-F <400> 7 tggaaagcaa acagtaaaca gcc 23 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCNA2-R <400> 8 gggcatcttc acgctctatt t 21 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCM10-F <400> 9 gccaagattc tacattgctc at 22 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCM10-R <400> 10 attgtcttcc tcctcatcca t 21 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E2F1-F <400> 11 ggagaagtca cgctatgaga cc 22 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E2F1-R <400> 12 acgacaccgt cagccgagtg gctc 24 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HIST1H1A-F <400> 13 ctcctctaag gagcgtggtg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HIST1H1A-R <400> 14 gaggacgcct tcttgttgag 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HIST1H3B-F <400> 15 tcggaaatcc accggcggta aa 22 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HIST1H3B-R <400> 16 ctggaagcga agatcggtct tgaa 24 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRCA1-F <400> 17 acagctgtgt ggtgcttctg tg 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRCA1-R <400> 18 cattgtcctc tgtccaggca tc 22 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AURKB forward <400> 19 cagagagatc gaaatccagg c 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AURKB reverse <400> 20 ccttgagccc taagagcaga t 21

Claims

유비퀴틴 C(ubiquitin C) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 중간엽줄기세포의 노화 진단용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 CDK1(Cyclin-Dependent Kinase 1), CCNA2(cyclin A2), MCM10(Minichromosome Maintenance complex component 10), E2F1(E2F Transcription Factor 1), HIST1H1A(Histon Cluster 1), HIST1H3B(Histon Cluster 1, H3b), BRCA1(breast cancer 1) 및 AURKB(Aurora B kinase)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현량을 측정하는 제제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 유비퀴틴 C 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 유비퀴틴 C 유전자가 코딩하는 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 유비퀴틴 C 유전자의 발현량을 측정하는 제제는 상기 유비퀴틴 C 유전자에 상보적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 유비퀴틴 C 유전자의 발현량을 측정하는 제제는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 유비퀴틴 C 단백질의 발현량을 측정하는 제제는 상기 유비퀴틴 C 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체단편, 항체모방체, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 및 펩티도모방체(peptidomimetics)로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 중간엽줄기세포는 in vitro 세포배양으로 증식된 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 중간엽줄기세포는 골수, 제대, 제대혈, 지방, 근육, 피부, 양막 및 태반으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나에서 분리된 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 중간엽줄기세포의 노화 진단용 키트.
제 10 항에 있어서,
상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
중간엽줄기세포로부터 유비퀴틴 C 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 중간엽줄기세포의 노화 예측 및 진단을 위한 정보제공 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 방법은 CDK1(Cyclin-Dependent Kinase 1), CCNA2(cyclin A2), MCM10(Minichromosome Maintenance complex component 10), E2F1(E2F Transcription Factor 1), HIST1H1A(Histon Cluster 1), HIST1H3B(Histon Cluster 1, H3b), BRCA1(breast cancer 1) 및 AURKB(Aurora B kinase)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 유비퀴틴 C 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현량이 대조군과 비교하여 감소된 경우 상기 중간엽줄기세포의 노화가 진행된 것으로 판별하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 및 면역침전분석법으로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 중간엽줄기세포는 in vitro 세포배양으로 증식된 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 중간엽줄기세포는 골수, 제대, 제대혈, 지방, 근육, 피부, 양막 및 태반으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나에서 분리된 세포인 것을 특징으로 하는 방법.