KR101370108B1

KR101370108B1 - 위암 진단용 마커로서 ｈｄａｃ2의 용도

Info

Publication number: KR101370108B1
Application number: KR1020120031478A
Authority: KR
Inventors: 남석우; 김정규
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2012-03-28
Filing date: 2012-03-28
Publication date: 2014-03-20
Also published as: KR20130109600A

Abstract

본 발명은 위암 진단용 마커로서의 HDAC2의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 HDAC2 유전자를 이용한 위암 진단용 마커, 이를 이용한 위암 진단용 조성물, 키트, 마이크로어레이 및 위암의 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 HDAC2 유전자는 정상 조직 또는 정상 세포에 비해 위암의 조직 또는 세포에서 발현양이 증가하는 것으로 확인됨에 따라 HDAC2 유전자를 위암 진단용 마커로 사용할 경우 위암을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있으며, 위암 치료제의 개발을 위한 표적으로 활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

위암 진단용 마커로서 ＨＤＡＣ2의 용도{Use of HDAC2 as a diagnostic marker for gastic cancer}

본 발명은 위암을 조기에 효과적으로 진단 및 예측할 수 있는 신규한 위암 진단용 마커, 위암 진단용 조성물, 위암 진단용 키트, 마이크로어레이 및 상기 위암 진단용 마커를 이용한 위암의 진단 방법에 관한 것이다.

위암은 아시아에서 매우 흔한 암이며, 세계적으로 암 사망의 주된 원인 중 하나이다. 지난 수년간 위암의 조기진단 및 치료뿐만 아니라 그 발암 기작에 대한 이해를 증진시키기 위해, 위암의 발달과 관련된 생물학적 프로세스들을 더 잘 규명하기 위한 많은 시도들이 있었으나, 위암의 발암과 관련된 분자적 기작들은 여전히 집중적인 연구 대상으로 남아 있다.

한편, 히스톨 아세틸레이션(histone acetylation)은 유전자 전사에 영향을 주는 주요 변이(modification)이며, 히스톤 아세틸트랜스퍼레이즈(HATs, histone acetyltransferases)에 의해 조절된다. 히스톤 디아세틸레이즈(histone deacetylases, HDACs)은 과아세틸화된 히스톤(hyperacetylated histones)으로부터 아세틸 그룹을 제거하는 기능을 하는 효소로, HATs의 영향에 대응하여히스톤을 기저 상태로 되돌리고, 유전자 전사의 억제를 수반한다(Marks P, Rifkind RA, Richon VM, Breslow R, Miller T, Kelly WK. Histone deacetylases and cancer: causes and therapies. Nat Rev Cancer 2001;1:194-202). 포유류 HDACs는 네가지 다른 클래스로 나눌 수 있으며, 효모 카운터파트와 상동성을 가진 염기서열을 기반으로 한 18개의 이소폼(isoforms)를 포함한다(Glozak MA, Seto E. Histone deacetylases and cancer. Oncogene 2007;26:5420-32).

이에 본 발명과 관련된 선행문헌인 Witt O, Deubzer HE, Milde T, Oehme I. HDAC family: What are the cancer relevant targets? Cancer Lett 2009;277:8-21 에 따르면, HATs 및 HDACs는 세포 증식, 분화 및 세포 주기 조절과 연관되어 있다고 개시되어 있고, 또 다른 선행문헌인 Yang XJ, Seto E. HATs and HDACs: from structure, function and regulation strategies for therapy and prevention. nnnkkOncogene 2007;26:5310-8 에서는 HDACs의 병리학적 활성(pathological activity) 및 비조절(deregulation)이 암, 면역학적 장애 및 근육 장애(muscular dystrophy)과 같은 질환이 야기될 수 있음이 개시되어 있다.

그러나, 본 발명에 따른 HDACs 패밀리 중 하나인 HDAC2가 위암을 진단할 수 있는 진단 마커로서 사용될 수 있다거나, 위암발생과 관련한 생물학적 기능에 대해서는 거의 알려진 바가 없다.

단지 유사한 선행문헌으로는, 위암 발생을 검출하는 유전자 마커로서, 위암 특이적 메틸화 마커 유전자를 이용한 위암 진단용 키트 및 칩에 관한 한국등록특허 제0892588호를 비롯하여, 한국등록특허 제1019727호 및 제1009062호 등이 있다.

이에 본 발명자들은 HDAC2와 위암의 직접적인 관련성을 밝힐 수 있는 실험을 수행하고, 그 결과에 따라 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 HDAC2 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질로 이루어진 위암 진단용 마커용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 HDAC2 유전자 또는 HDAC2 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 위암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 위암 진단용 조성물을 포함하는 위암 진단용 키트 및 위암 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 HDAC2 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계를 포함하는 위암을 예측 및 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 HDAC2(Histone deacetylase 2) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 HDAC2 단백질로 이루어진 위암 진단용 마커용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 HDAC2 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 HDAC2 유전자 또는 HDAC2 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 위암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 HDAC2 유전자의 수준을 측정하는 물질은 HDAC2 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 HDAC2 단백질의 수준을 측정하는 물질은 HDAC2 단백질을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.

또한, 본 발명은,

(a) 생물학적 시료에 존재하는 HDAC2 유전자의 발현양 또는 HDAC2 단백질의 양을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 HDAC2 유전자의 발현양 또는 HDAC2 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 위암을 예측 및 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 및 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 HDAC2 유전자는 비 위암 조직 또는 세포에 비해 위암의 조직 또는 세포에서 발현양이 증가하는 것으로 확인됨에 따라 HDAC2 유전자를 위암 진단용 마커로 사용할 경우 위암을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있으며, 나아가 위암 치료제의 개발을 위한 표적으로 활용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 인간 위암 세포에서의 비정상적 HDAC2 발현을 나타낸 사진이다. (A) 위암 조직의 서브세트에서의 HDAC2 발현양상을 나타낸 것이며, (B) RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 통해 다양한 위암 셀라인에서의 HDAC2 발현을 분석한 결과이며, (C) qRT-PCR(real time quantitative RT-PCR)을 통한 MKN-1 세포에서의 HDAC의 다른 양적 발현양상을 나타낸 그래프이다.
도 2는 위암 세포에서 p16 ^INK4a 유전자의 후생적 불활성 매커니즘(Epigenetic inactivating mechanism)을 나타낸 그래프이다.
도 3은 HDAC2가 세포주기 단백질의 조절 이상으로 위암 세포의 성장을 유도하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 4는 위암 세포에서 HDAC2 저해를 통해 세포적 아팝토시스(cellular apoptosis) 및 오토파직 세포 죽음(autophagic cell death)이 유도됨을 확인한 그래프이다.
도 5는 위암 세포에서의 전이성 포텐셜(metastatic potential)에 관한 HDAC2의 영향을 조사한 그래프이다.
도 6은 MKN-1 세포에서 지속적인 HDAC2의 억제를 통해 종양생성 포텐셜이 감소됨을 나타낸 그래프이다.
도 7은 MKN-1 세포에서 지속적인 HDAC2의 억제를 통해 종양생성을 감소시킴을 인 비보(in vivo) 실험을 통해 확인한 결과이다.

본 발명은 위암 조직에서 HDAC2의 이상 발현이 위암 발생과 관련이 있는지를 확인하고, 정상조직 및 정상세포에 비해 위암조직 및 위암세포에서 HDAC2 유전자의 발현이 과발현되어 있다는 사실을 확인함으로써 상기 유전자를 위암 진단을 위한 바이오마커로 사용할 수 있음을 규명하였다는 점에 특징이 있다.

즉, 본 발명자들은 악성위종양(gastrocarcinomagenesis)에서 HDAC2의 생물학적 기능과 관련하여, HDAC2의 비정상적 조절이 위암 세포의 악성 형질을 가능하게 한다는 사실과 이와 관련된 DNA 메틸레이션(methylation)에 의한 p16^INK4a및 HDAC2 활성 간의 상호배타적(exclusive mutual)인 유전자 조절 기작을 규명하였다. 또한, 생체 외(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 HDAC2가 결핍된 셀 라인을 이용하여 HDAC2가 종양 발생을 일으키는 잠재성이 있음을 확인하였다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 인간 위암 조직의 서브세트에서 HDAC2 유전자가 과발현 됨을 증명하였으며, 위암 세포주에서 HDAC2 불활성의 항-성장 효과를 발견하였다(도 1 참조).

또한 본 발명의 일실시예에 따르면, HDAC2 및 이의 프로모터 메틸레이션을 통해 p16^INK4a의 발현이 조절되며, 위암 세포에서 p16^INK4a의 상호 배타적 유전자 불활성이 나타남을 알 수 있었다(도 2 참조).

본 발명의 또 다른 일실시예에 따르면, 위암 세포에서 HDAC2을 타겟으로 한 저해는 전-아팝토틱 단백질인 Bax, AIF, Apaf-1 및 동시에 Bcl-2의 발현을 억제함을 확인하였다(도 3 및 4 참조).

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, HDAC2를 타겟으로 한 저해는 미토콘드리아-매개 아팝토시스 및 카스파아제-독립적 오토파직 세포 죽음을 모두 유도하며, 이러한 시너지 효과는 매우 강력한 종양형성 포텐셜을 제공함을 알 수 있었으며, 더불어 세포 운동성 및 침입과 같은 종양 침투성과 관계된 유전자를 다운-레귤레이션 시킴을 알 수 있었다(도 5 참조).

또한, 본 발명의 일실시예에 따르면, HDAC2가 결핍된 MKN-1 세포는 인 비트로 및 인 비보 실험에서 모두 성장이 지연되며 세포적 노화가 증가함을 확인하였다(도 6 및 7 참조).

결과적으로, 본 발명자들은 HDAC2가 위암에서 과발현된다는 사실과 함께, p16^INK4A 프로모터 과메틸레이션으로 p16^INK4A 상호 후생적 유전자 불활성을 매개함에 따라, HDAC2를 선택적으로 저해시켰을 경우 세포분열의 결함을 유발시켜 위암 세포의 죽음을 유발함을 알 수 있었다.

따라서 HDAC2 유전자는 위암 진단을 위한 바이오 마커로 사용할 수 있음과 동시에, HDAC2를 선택적으로 저해하는 분자 물질을 이용하여 위암을 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 HDAC2 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 HDAC2 단백질을 포함하는 신규한 위암 진단용 마커를 제공할 수 있다.

바람직하게는, 상기 HDAC2 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명에서, 상기진단이라는 용어는 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 위암 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 위암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 진단은 위암 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 위암의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.

또한, 상기 진단용 마커(diagnosis marker)란 위암의 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 위암의 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 위암 진단용 마커는 정상 세포에 비해 위암의 세포에서 발현양이 증가하는 HDAC2 유전자 또는 단백질일 수 있다.

또한, 본 발명은 HDAC2 유전자의 수준 또는 HDAC2 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 위암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 HDAC2 유전자의 수준은, 바람직하게 HDAC2 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 HDAC2 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 HDAC2 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 서열번호 1로 나타내는 HDAC2 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.

본 발명에서 상기프라이머란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 HDAC2 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머 쌍일 수 있다.

상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서, 상기프로브라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 HDAC2 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 HDAC2 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 기술한 바와 같이 위암을 진단할 수 있는 마커 단백질로서 HDAC2 단백질이 규명되었으므로, 상기 단백질을 이용하여 항체를 생성하는 방법은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 HDAC2 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol . Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

또한, 본 발명은 HDAC2 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 위암 진단용 조성물을 포함하는 위암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 위암 진단용 키트에 포함되는 위암 진단용 조성물은 HDAC2 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.

본 발명의 위암 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 위암 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다.

나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

또한, 본 발명은 HDAC2 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 위암 진단용 조성물을 포함하는 위암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, HDAC2 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다.

혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

또한, 본 발명은 HDAC2 유전자의 발현수준 또는 HDAC2 단백질 수준을 측정하여 위암을 예측 및 진단을 위해 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은 (a) 생물학적 시료에 존재하는 HDAC2 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 HDAC2 유전자의 발현양 또는 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 상기에서 HDAC2 유전자의 발현수준 또는 HDAC2 단백질 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 위암 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 HDAC2 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.

상기 HDAC2 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 HDAC2 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 HDAC2 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 HDAC2 mRNA 발현양 또는 단백질의 양과 위암 환자 또는 위암 의심환자에서의 HDAC2 mRNA 발현양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현양의 정도를 대조군과 비교함으로써 위암의 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.

한편, 본 발명자들은 앞서 기술한 바와 같이, HDAC2 유전자의 발현이 정상조직 및 세포에 비해 위암 조직 및 세포에서 현저하게 과발현 되어 있다는 사실을 통해 HDAC2 유전자가 발암 유발 인자로 작용할 수 있는지를 분석하였는데, HDAC2 유전자를 선택적으로 저해(넉아웃) 하였을 때, 암세포의 성장이 효과적으로 저해됨을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 따른 HDAC2 유전자의 과발현은 위암 세포의 성장, 증식 및 이동에 매우 밀접한 영향을 미치는바, HDAC2 유전자 발현을 억제할 수 있는 핵산 분자 등을 포함하는 조성물은 위암 치료용 조성물로 사용될 수 있다.

따라서 본 발명자들은 수행된 실시예들을 통해 HDAC2 유전자가 가진 위암의 발생 여부를 파악할 수 있는 마커로서의 용도를 발견했으며, 위암 치료를 위한 타겟 유전자로서 가능성을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

HDAC2 의 위암세포에서의 과발현 분석

<1-1> 세포 배양 및 약제 처리

본 실시예에서 사용한 인간 위암세포(human stomach cancer cells)(MKN-1, SNU-1, -216, -484, -620, -638, -668 및 -719)는 KCLB(Korean Cell Line Bank, Seoul, South Korea)에서 구입하였으며, AGS, NIH-3T3/Ras 및 HT1080 세포들은 ATCC(Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. 각 셀라인은 10 % 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Sigma, St Louis, MO)이 보충물로 포함된 PMI1640 또는 DMEM 배지 및 100 units/ml의 페니실린, 스트렙토마이신이 모두 포함된 배지에서 배양되었으며, 5% 이산화탄소가 존재하는 인큐베이터(humidified incubator)의 37℃ 온도에서 배양하였다. 트렌스펙션(Transfection)은 올리고펙타민 시약(oligofectamine reagent)(Invirtogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 수행하였다. 종양세포의 DNA 메틸레이션을 억제하기 위하여, 세포들은 2μM의 5-aza-deoxycytidine(5-aza-dC, Sigma)으로 5일간 처리되었고, 신선한 배지는 24시간마다 보충되었다. 오토파직 반응(autophagic response)을 세포에 유도하기 위하여, DMSO에 10μM ceramide(N-acetyl-d-erythro-sphingosine; Calbiochem Co., La Jolla, CA)를 첨가하였다. 세포사이클 중 M기의 메타페이즈/아나페이즈에서 세포들을 동시 발생시키기 위하여 세포에 nocodazole(50 ng/ml; Sigma)을 20시간동안 처리하였고, 세포를 워싱한 후 세포 사이클로 다시 돌아가게 하기 위하여 nocodazole-프리 배양배지(free culture medium)에서 재부유(resuspend)하였다.

<1-2> 면역조직화학적 분석을 통한 HDAC2 의 발현양상 분석

위암세포에서의 HDAC2의 비정상적 발현을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 무작위로 선택된 12개의 인간 위 종양 조직에서 HDAC2의 이뮤노블로팅(immunoblotting)을 수행하였다.

그 결과, 도 1A에서와 같이, HDAC2는 12개의 위암 조직 샘플 중 9개의 샘플에서 비-종양 조직의 경우와 비교하여 매우 높은 수준으로 과발현되는 것으로 나타났다. 또한 도 1B에서와 같이 인간 위암 셀라인에서도 HDAC2 단백질이 몇 개의 예외만을 제외하고는 모두 과발현되는 양상을 확인할 수 있었다. 더불어 도 1C에서와 같이, MKN-1 세포들에서 HDAC 패밀리들에 속하는 유전자 각각의 특이 프라이머(표 1 참조)를 사용하여 qRT-PCR을 통해 HDACs를 분석한 결과, HDAC2가 가장 많이 발현됨을 확인하였다.

따라서 본 발명자들은 이를 통해 HDAC2가 위암 세포에서 가장 주된 히스톤 디아세틸레이즈 활성을 나타냄을 알 수 있었으며, 위암 세포주에서 HDAC2 유전자가 과발현됨을 확인하였는바, 위암 진단을 위한 진단 마커로서의 HDAC2 유전자의 용도를 확신할 수 있었다.

HDAC 패밀리에 속하는 유전자들의 프라이머 세트

유전자	포워드 프라이머 (Forward primer)	리버스 프라이머 (Reverse primer)	생성물 크기(bp)
HDAC1	GGATCGGTTAGGTTGCTTCA	CAGGCAATTCGTTTGTCAGA	428
HDAC2	GACAGGGTCATCCCATGAAG	AATTCAAGGATGGCAAGCAC	418
HDAC3	CTTTTCCAGCCGGTTATCAA	CAGCCTCATCAGTCCTGTCA	490
HDAC4	CAGAGTTCTCCACCCCAGAG	AGGATGGCGATGTGTAGAGG	429
HDAC5	TAAAGCTGAGGCTCCAGGAA	GAGCATCTCAGTGGGGATGT	495
HDAC6	ACCAGGCAGCGAAGAAGTAG	GTGCTTCAGCCTCAAGGTTC	405
HDAC7	GACAGTCTCTGAGCCCAACC	TTAAGGACTGGGCAAAGTGG	566
HDAC8	CGACGGAAATTTGAGCGTAT	ATAGCCTCCTCCTCCCAAAA	429
GAPDH	CGACCACTTTGTCAAGCTCA	GGGTCTTACTCCTTGGAGGC	102

< 실시예 2>

HDAC2 를 통한 P16 ^INK4 ^α 의 상호 후성적 ( mutual epigenetic ) 유전자 불활성화 분석

<2-1> 위암 조직 및 세포주의 준비

위암 조직은 위암 수술을 받은 환자들로부터 얻은 9개의 선별된 위암 조직을 사용하였고, 사람 위암 세포주 AGS 및 대조군으로서 원숭이 신장 섬유아세포(fibroblast) 세포주 COS-1을 American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA)에서 구입하였는데, 사람 위암 세포주로는 SNU-216, SNU-484, SNU-638, SNU-668, SNU-719, MKN-1, MKN-28 및 MKN-74 를 한국 세포주 은행 (KCLB, 대한민국)에서 구입하였다. 상기 각 세포주들은 10% 소태아혈청(fetal bovine serum) (Sigma, St Louis, MO, USA) 및 1 mg/ml 페니실린/스트렙토마이신 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 첨가한 RPMI 1640 또는 DMEM 배지에 배양하였다.

<2-2> 분석 결과

하스톤 아세틸레이션과 DNA 메틸레이션은 후생적 변이(epigenetic modification)로 알려져 있고, 이는 크로마틴 구조와 유전자 발현의 조절에 필수적이다. 악성위종양에서는 p16INK4a , E- cadherin , 및 hMLH1 과 같은 몇몇 유전자들이 비정상적 메틸레이션이 되는 현상이 종종 발견된다. 그리하여 본 발명자들은 위암에서 프로모터 메틸레이션을 통한 후생적 유전자 사일렌싱(silencing)이 히스톤 디아세틸레이션으로 인한 유사분열 포텐셜(mitogenic potential)을 야기시키는지 확인하고자 하였다.

그리하여 본 발명자들은 위암에서의 CpG 아일랜드(island) 메틸레이션 표현형과 관련된 유전자 중에, 위암세포에서 p16I ^NK4a 유전자의 활성이 해당 프로모터 지역이 과메틸레이션되어 불활성되거나, 그렇지 않으면 HDAC2에 의한 히스톤 디아세틸레이션을 통해 불활성되는 것이라고 가설을 세웠다.

그리고 우선 위암세포주(gastric cancer cell lines)에서 p16I ^NK4a 유전자의 프로모터 지역의 메틸레이션 상태를 MSP(methylation-specific PCR) 어세이를 통해 확인하였다. MSP 분석을 위해 p16I ^NK4a 유전자의 전사 시작 위치(transcrition start site) 주위 부위 및 유전자 발현의 결실(loss)과 관련된 지역에 위치할 수 있는 두 타입의 프라이머(i.e. p16-150 및 p16-234)를 제작하였다. 이에 우선, MKN-1 및 SNU-484 세포를 가지고 실험을 하였는데, 그 결과 HDAC2 결실에 의해 성장이 둔화됨을 확인하였고, p16I ^NK4a 유전자 프로모터 지역의 비-메틸화된 형태를 발견할 수 있었다. 이와 대조적으로, 다른 두 셀 라인, 즉 SNU-216 및 SNU-719 에서는 HDAC2 결실로 인해 성장에 전혀 영향이 없었으나, 도 2A에서와 같이 p16I ^NK4a 유전자 프로모터 지역에서 과메틸레이션(hypermethylation)이 관찰되었다. 이는 왜 두 유형의 위암세포들이 HDAC2 억제시 종양 세포 성장률에 대한 반응이 달라지는지 설명해주는 것이다.

이후 본 발명자들은 비-메틸화 상태의 p16I ^NK4a 유전자 프로모터 지역을 가진 위암세포에서, HDAC2 결실이 p16I ^NK4a 유전자의 발현을 회복시키는지 실험하였다.

즉, MKN-1 및 SNU-484 세포에서 HDAC2 결실(depletion)이 p16I ^NK4a 유전자 발현에 미치는 영향을 살펴본 결과, 본 발명자들이 예상한대로, p16I ^NK4a 유전자의 발현이 회복되었으며, 5-aza-dC(DNA 메틸트랜스퍼레이즈 억제제(methyltransferase inhibitor))에는 아무런 영향이 없었다. 이와 대조적으로, 도 2B에서와 같이, DNA 메틸트랜스퍼레이즈의 억제는 SNU-216 및 SNU-719 세포에서 강하게 p16I ^NK4a 유전자의 발현을 회복시켰다.

상기 결과를 통해, 본 발명자들은 히스톤 아세틸레이션(histone acetylation) 및 프로모터 메틸레이션이 각각 유전자 전사 활성을 조절하며, 악성위종양생성에 있어 p16I ^NK4a 유전자의 발현을 조절하는 듀열 매카니즘(dual mechanism)이 존재한다는 사실을 알게 되었다.

이러한 사실을 좀 더 증명하기 위해, 본 발명자들은 인간 위암 조직에서의 p16I ^NK4a 유전자 발현 및 프로모터 메틸레이션에 대해 분석하였다. 상기 실험한 위암 조직의 서브세트(subset)로부터, 종양암세포에서 HDAC2가 과발현된 비-종양 조직에 해당되는 4쌍의 위종양, 정상 및 종양 사이에 HDAC2 발현에서 상대적으로 차이가 없는 3쌍을 선택하였다. 이에 도 2C에 나타난 바와 같이, 선택한 모든 위암 종양 조직은 명백한 암 조직에서 p16I ^NK4a 유전자 발현이 나타나지 않는 것으로 드러났다.

나아가, 상기 조직들을 가지고 p16I ^NK4a 유전자 프로모터 지역의 메틸레이션 상태를 분석하였다. 정상 위 점액질 조직(mucous tissue)들은 p16I ^NK4a 유전자 프로모터 지역의 비-미틸화 또는 메틸화된 형태 모두를 가진 혼합형 형태가 나타났다.

그러나, 위 종양 조직은 악성(cancer)일 경우 HDAC2-과발현을 나타냈으며, 그 결과 p16I ^NK4a 유전자 프로모터 지역의 온전한 비-메틸화 형태가 나타났다. 이와 대조적으로, 종양 샘플들(#592, #805 및 #1033)은 도 2D에서와 같이, 악성(cancer)에서의 HDAC2 발현의 변화가 나타나지 않았고, p16I ^NK4a 유전자 프로모터 지역의 메틸화된 형태가 나타났다. 마지막으로, 도 2E에서와 같이, p16I ^NK4a 유전자 프로모터 지역의 특정 프라이머를 가진 MKN-1 세포의 크로마틴 면역침전 어세이(chromatin immunoprecipitaion assay) 결과, 동일 프로모터 지역에서 히스톤 H4의 디아세틸레이션을 이끄는 HDAC2 단백질은 p16I ^NK4a 유전자 프록시말(proximal) 프로모터 지역과 연관되어 있음을 알 수 있었다.

<실시예 3>

HDAC2 를 매개로한 G1 /S 세포주기 단백질의 발현 비조적을 통한 위암 세포의 비정상적 증식 분석

위암형성과정에서 HDAC2의 비정상적 과발현의 결과를 분석하기 위하여, 본 발명자들은 암 세포의 특징을 형성하는데 영향을 주는 분자적 표지를 확인하기 위하여 대규모의 유전자 발현 분석을 실시하였다. HDAC2 siRNAs로 트랜스펙션한 MKN-1 세포에서 다른게 발현되는 유전자들을 분석했으며, 전형적인 암의 특징과 관련된 분자적 표지들에 관해 분석하였다.

우선, HDAC2의 타겟으로한 유전자 저해는 위암세포의 성장 저해를 유도한다는 결과를 통해, 도 3A 및 3B에서 나타난 바와 같이 세포적 성장과 죽음의 경로와 관계된 구체적인 유전적 인자들을 발견하였다. 세포 주기와 관련된 유전적 표지들 중, 본 발명자들은 p16 발현은 CDK4 발현의 억제로 유도된다는 사실을 발견하였는바, HDAC2 과발현이 세포 주기 조절 단백질 비조절(deregulation)을 통해 G1/S 주기를 방해하는 것을 시사함을 알 수 있었다.

따라서, 세포 주기 진행에 있어 HDAC2의 역할을 규명할 수 있었다. 본 발명자들은 HDAC2-넉아웃 MKN-1 세포에 노코다졸(nocodazole)을 처리하여 모든 세포를 G2/M 주기에 동시에 맞추었다. 노코다졸 차단하고 릴리즈시킨 후 G1-주기 세포의 비율을 분석하였다.

그 결과 도 3C에서와 같이, HDAC2 억제는 G1/S 주기의 억류를 유도하고 세포 주기 이동을 지연시킴을 알 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 HDAC2 결핍으로 인한 MKN-1 세포의 증식능 결함 및/또는 성장 저해는 세포 주기 조절에서의 특정 G1 억류로 인해 유도됨을 알 수 있었다.

또한 G1/2 단계로의 이행에서 p15^INK4B, p16^INK4A, p18^INK4C, p19I^NK4D, p27^Kip1 및 p21^WAF1/Cip1 와 같은 음성적 세포 주기 조절자들은 사이클린 D1/CDK4 및 6 또는 사이클린 E/CDK2 복합체를 억제하는 주요 조절자임을 알 수 있었다. 이러한 세포 주기 조절자들을 실험하였을 때, 본 발명자들은 오직 p16INK4a만이 선택적으로 HDAC2 결핍에 의해 MKN-1 세포에서 유도됨을 알 수 있었다.

더불어, HDAC2 결핍은 CDK4 및 CDK2를 동시에 억제함을 유도하고(도 3D 참조), 이러한 결과들은 HDAC2 과발현이 p16^INK4a과 같은 음성적 세포주기 조절자의 억제를 야기함며, 동시에 MKN-1 세포의 G1/S 단계로의 이행에서 그들의 특정 조절자인 사이클린 D1 및 CDK4의 발현을 유도함을 알 수 있었다. 따라서 HDAC2 억제는 Rb 단백질을 과인산화 상태로 만드는 것을 확인할 수 있었다(도 3D 참조).

<실시예 4>

위암 세포에서의 HDAC2 의 저해를 통한 세포적 아팝토시스 및 자가탐식( autophagic cell death ) 현상 분석

본 발명자들은 도 4A에서와 같이, 본 발명자들은 HDAC2 불활성이 선택적으로 Bax, AIF 및 Apaf-1 발현을 선택적으로 유도하며, Bcl-2 단백질 발현을 동시에 억제하는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과를 통해 HDAC2 불활성이 Bcl-2를 억제하며, 이는 Bcl-2 (항-아팝토틱 조절자)를 정상적으로 억제함으로서 Bax 및 Apaf-1 (전-아팝토틱 인자)의 활성을 가능케 함을 알 수 있었다.

도 4B에서와 같이, 본 발명자들은 대조군과 비교하여 HDAC2 녹다운(knockdown) 세포에서의 아팝포틱 세포의 유의미한 유도를 발견하였다. 또한, 상기 아팝토틱 세포들 중 스크램플 시퀀스(si-Scr)를 처리한 군과 비교하여(4.97%), 본 발명의 실험군인 HDAC2 siRNA transfectant에서는 8.14% 증가하였다. 이러한 결과는 HDAC2 과발현은 아팝토시스 단백질을 비조절하며, 이는 위암에서 아팝토틱 시그날에 대한 저항성을 의미하는 것으로 판단되었다.

상기 결과들은 HDAC2 억제는 Bcl-2 저해를 유도하고, 이는 아팝토시스와 오토파직 시그날링(autophagic signaling) 사이의 크로스톡(crosstalk)을 의미한다. 도 4C에서와 같이, HDAC2 결실은 Bcl-2 발현을 억제하고, LC3B Ⅱ의 증가를 야기하였다(오토파직 활성의 전형적인 특징). 이러한 결과는 오토파직 세포 죽음의 유도자인 20μM 세라마이드의 처리를 통해 확인하였다. 즉, HDAC2을 타겟으로 한 억제는 Bcl-2 억제를 유도하고, Beclin 1을 자유롭게 하여 오토파직 활성을 가능케 함을 알 수 있었다.

또한 본 발명자들은 HDAC2 억제를 통한 오토파직 활성을 명확하게 밝히기 위하여, HDAC2 넉아웃 MKN-1 세포의 TEM을 통한 세포 초미세구조를 확인하였다. 예상한 것과 같이, 도 4D에서와 같이, 대략적으로 HDAC2 siRNA가 트랜스펙션된 세포들의 40-45% 정도가 후-트렌스펙션의 48시간 이후 오토파직 액포(vacuoles)가 발달하였고, 이들 중 일부는 더 큰 액포로 축적되었다. 좀더 높은 배율의 확대에서는 대부분의 액포는 전자고밀도 물질 및 퇴화된 소기관을 포함하고 있었다. 대조적으로, 대조 siRNA (si-Scr)가 트랜스펙션된 세포는 거의 액포가 생성되지 않았으며, 적은 세포들이 세포질에서 액포를 포함하고 있는 것으로 관찰되었다.

이러한 결과를 통해, HDAC2을 타겟으로 한 억제는 미토콘드리아를 매개로 한 아팝토시스 및 카스파아제-독립적 오토파직 세포 죽음 모두를 유도함을 알 수 있었다.

<실시예 5>

비정상적 HDAC2 발현과 위암 세포의 전이성 특성과의 관련성 분석

본 발명자들은 HDAC2의 비정상적 발현이 위암 세포의 전이성 특성에 어떠한 유전적 관련성이 있는지 확인하기 위하여, HDAC2 녹다운 세포의 유전자 발현 데이터로부터 암세포의 전이성 특성을 가능케하는 유전적 요인들에 관해 공지의 방법으로 마이크로어레이를 실시하여 분석하였다.

그 결과, 도 5A에서와 같이 전이성 경로와 관련된 유전적 인자들을 나열한 히트맵(heatmap)을 얻을 수 있었다. 또한 이동성과 침투성과 관련된 유전자들 중, HDAC2 억제가 콜라겐(collagens), 매트릭스 메탈로펩타이다아제(metallopeptidases), TGF-시그날링 관련 유전자 및 카플레인(caplains)의 다운-레귤레이션을 유도하는 것으로 드러났다(도 5B 참조).

상기 마이크로어레이 결과를 좀더 정확히 확인하기 위하여, 본 발명자들은 HDAC2 넉다운 세포들을 이용하여 인 비트로(in vitro) 종양형성 어세이(tumorigenesis assay)를 실시하였다. 그 결과, 도 5C 및 5D에서와 같이, HDAC2 발현이 억제될 경우 종양 세포 이동성(motility) 및 침투성(invasion)이 보이덴 챔버 어세이(Boyden chamber assay) 결과 나타났음을 확인할 수 있었으며, HDAC2 결핍이 종양세포의 부착비의존성(anchorage-independent) 성장 능력을 감소시킴을 도 5E를 통해 알 수 있었다.

<실시예 6>

HDAC2 의 지속적인 억제( sustained - supression )에 따른 종양생성 억제능 분석

HDAC2의 안정적 억제가 악성위종양생성 억제를 유도하는지 여부를 확인하기 위하여, 두 개의 안정된 HDAC2 녹아웃 셀라인(HDAC2 KD1 및 HDAC2 KD2)을 제작하고, 도 6A에서와 같이, p16INK4a 유도 검출 및 제작된 셀 라인의 사이클린 D1 감소를 통해 HDAC2 결핍을 확인하였다. 또한 상기 세포들은 대조군(MKN-1) 세포 또는 MOCK-transfectant 둘 중 하나와 비교하여 감소된 성장률을 나타냈다(도 6B 참조).

상기 결과들을 토대로, 본 발명자들은 앵커리지-독립적 콜로니 어세이(anchorage-independent colony assay), 세포 이동(cell migration) 및 침습 어세이(invasion assay)와 같은 생체외(in vitro) 종양형성 어세이(tumorgenic assay)를 실시하였다. 그 결과 도 6C, D 및 E에서와 같이, HDAC2의 지속적인 억제(sustained suppression)는 세포 운동성(motility), 침습적 특성(invasive property) 및 MKN-1 세포의 클로날(colonal) 성장 능력을 저하시켰다.

일시적 트랜스펙션(transient transfection) 연구로부터, 본 발명자들은 HDAC2가 G1/S 세포 사이클을 중단시킴을 알게 되었다. G1/S 세포 사이클 중단으로 인한 생물학적 결과 중 하나는 세포적 노쇠(cellular senescence)이다. 그리하여 본 발명자들은 SA-β-Gal 염색(senescence-associated-β-galactosidase staining)을 통해 HDAC2 결핍이 안정된 셀라인의 세포적 노쇠를 강화시키는지 여부를 확인하였다. 도 6F에서와 같이, 제작된 HDAC2 KD1 및 HDAC2 KD2와 같은 HDAC2 결핍 셀라인은 Mock 또는 MKN-1 세포들과 비교하여 세포적 노쇠가 증가했음을 관찰할 수 있었다.

생체내(in vivo) 악성위종양생성에 HDAC2 과발현이 기여하는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 누드 마우스(athymic nude mice)에게 이러한 셀라인(i.e. HDAC2 KD1 및 HDAC2 KD2)을 피하 주사한 결과, 주입 9일 후 Mock 또는 대조군에서는 종양 덩어리가 발견되었으며, 이와 반대로 상기 셀라인을 주사한 마우스들에는 오로지 주사 후 14일에 종양 덩어리가 발견되었다.

또한, 상기 HDAC2 결핍 셀라인에서 총 종양 성장률은 도 7A에서와 같이 Mock 또는 MKN-1 세포와 비교하여 매우 감소하였다(P≤0.05). 종양발생에 있어서도, 대조군 및 Mock 그룹 모두 주사된 9마리의 동물에서 모두 종양이 발생되었으나, HDAC2 결핍 셀라인은 9마리의 주사된 동물 중 7 또는 8개의 종양만이 관찰되었다.

희생된 시기의 종양 평균 볼륨은 HDAC2 결핍 셀라인을 주입한 그룹은 Mock 또는 MKN-1 세포보다 훨씬 작았다(도 7B 참조). HDAC2 결핍 셀 라인에서 감소된 종양 볼륨은 HDAC2의 낮은 발현 및 제노그라프트(xenograft) 종양 조직에서의 p16INK4a 유전자 발현 증가를 검출함으로서 증명하였다(도 7C 참조).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다.

본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 HDAC2 유전자의 발현 억제제 또는 상기 염기서열에 의해 코딩되는 HDAC2 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 위암 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 HDAC2 유전자의 발현 억제제는 서열번호 1로 표시되는 HDAC2의 염기서열에 대한 siRNA인 것을 특징으로 하는 위암 치료용 약학적 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제