KR102083916B1 - 대장암 진단을 위한 ｔｃｆ７ 돌연변이의 용도 및 게다토리십 약물내성을 갖는 대장암 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대장암 진단을 위한 TCF7 프레임쉬프트 돌연변이의 용도 및 게다토리십(Gedatolisib) 약물에 대한 내성을 갖는 대장암 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 TCF7(transcription factor 7) 돌연변이 유전자 또는 상기 TCF7 돌연변이 유전자를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암 진단용 조성물; 게다토리십 내성 대장암 진단키트; GSK3β(Glycogen synthase kinase 3 beta) 억제제 및 게다토리십(Gedatolisib)을 유효성분으로 포함하는 게다토리십 내성 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 게다토리십 내성 대장암 진단을 위한 정보 제공방법; 및 게다토리십의 내성 억제 방법에 관한 것이다.

Description

대장암 진단을 위한 ＴＣＦ７ 돌연변이의 용도 및 게다토리십 약물내성을 갖는 대장암 치료용 조성물{Use of TCF7 frameshift mutant for diagnosing colorectal cancer and composition for treating colorectal cancer having resistance of gedatolisib}

본 발명은 대장암 진단을 위한 TCF7 프레임쉬프트 돌연변이의 용도 및 게다토리십(Gedatolisib) 약물에 대한 내성을 갖는 대장암 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

암은 인류의 건강을 위협하는 대표적인 질병으로서 산업화된 국가에서 단일 질병으로는 가장 대표적인 사망 원인이다. 암의 발생원인은 아직도 규명되지 않고 있으나 내적 요인인 유전적 요소와 외적 요인인 암 발생 유발요소로 작용되는 발암화학물질, 계속적인 염증과 손상, 암 유발 바이러스 감염의 복합적 요소가 작용하는 것으로 간주된다. 내적 요인인 유전적 요소에 대해서는 동물실험상 많은 입증이 있으나 인간의 암에 대한 작용 여부는 망막아세포종이나 가족적 대장 이종증 등 일부를 제외하고는 확실한 증거가 없으며, 오히려 외적 요인인 환경적 요소와 구별하기 어려운 실정이다.

암은 불치의 병으로 단정할 만큼 절망적인 것은 아니며 조기진단과 함께 적극적인 치료에 임하면 완치될 수 있다. 따라서 조기발견과 조기치료가 암치료의 효과를 높이는 데 결정적으로 중요하며, 진행된 암에서도 다각적이고 적극적인 방법들을 동원한다면 완치 내지 생명을 연장시키고 괴로운 증세를 호전시킬 수 있다.

또한, 암의 발생에 암유전자(oncogene) 및 종양억제유전자(tumor suppressor gene)의 돌연변이가 관여한다는 사실이 알려지면서 여러 암유전자 및 종양억제유전자의 돌연변이를 검출하는 연구가 다양하게 진행되고 있다. 이에 따라, 암의 발생 및 약물의 예후판단에 관여하는 많은 돌연변이가 발견되고 있으며, 이 중 PIK3CA 유전자의 돌연변이는 PI3K(Phosphatidylinositol 3-kinase) 단백질의 활성화를 가져오고 PI3K는 타이로신 키나제 수용체의 신호전달 체계를 활성화한다. 활성화된 타이로신 키나제는 세포의 생존과 분열을 억제하는 단백질의 기능과 대사촉진을 방해하며 세포 성장을 돕는 단백질의 기능을 활성화시킴으로써 발암과정에 관여한다. 또한, PIK3CA 유전자 변이는 매우 다양한 암에서 발견되며, 특히 대장암, 위암, 폐암, 췌장암, 두부 편평상피세포암, 교모세포종, 자궁내막암, 난소암, 유방암 등에서 25 내지 40% 비율로 나타난다고 보고되어 있으며, PIK3CA 유전자 돌연변이는 암 진행 속도를 빠르게 하고 전이 빈도를 증가시켜 환자의 예후를 악화시킨다.

그러나 PIK3CA 돌연변이를 갖는 암을 효과적으로 진단하거나 치료할 수 있는 연구가 현재 미비한 실정으로 PIK3CA 돌연변이를 갖는 암을 정확하게 진단하고 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 암 치료 기술의 개발이 필요한 실정이다.

한편, 현재 개발된 항암제들 중에서는 장기적인 복용 또는 세포내 예상치 못한 작용으로 인해 타겟 암세포에서 약물에 대한 내성을 보여 항암 치료 효과를 보지 못하는 약물들이 많이 존재한다.

이 중에서 게다토리십(Gedatolisib)은 화이자에서 개발된 항암제로서 대장암 치료제로 개발된 바 있다. 그러나 게다토리십이 대장암 세포에 대해 약물 저항성, 즉 약물 내성을 유발시키는 문제점이 있어 효과적인 치료 효과를 보이지 못하고 있는 실정이다.

이에 게다토리십에 대한 약물 내성을 억제함으로써 게다토리십에 의한 우수한 항암 효과를 도출할 수 있는 새로운 암 치료 기술의 개발도 시급한 실정이다.

이에 본 발명자들은 게다토리십 약물에 내성을 갖는 대장암을 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 치료방법으로서, 게다토리십을 GSK3β 억제제와 병용처리 할 경우, 게다토리십 내성 암의 세포사멸을 증진시킬 수 있어 암세포의 약물 민감성을 유도할 수 있음을 확인하였고, 뿐만 아니라 게다토리십에 대한 내성을 갖는 암을 정확하고 신속하게 진단할 수 있는 새로운 바이오 마커로서 TCF7 프레임쉬프트(frameshift) 돌연변이를 사용할 수 있음을 최초로 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-1174452호 대한민국 공개특허 제10-2011-0079761호

따라서 본 발명의 목적은 TCF7(transcription factor 7) 돌연변이 유전자의 검출 제제를 포함하는 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는, 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암 진단키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암 진단을 위한 정보 제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 게다토리십(Gedatolisib)의 내성 억제 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 TCF7(transcription factor 7) 돌연변이 유전자 또는 상기 TCF7 돌연변이 유전자를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제제는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 TCF7 돌연변이 유전자에 특이적인 프라이머, 프로브 또는 앱타머일 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는, 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암 진단 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 GSK3β(Glycogen synthase kinase 3 beta) 억제제 및 게다토리십(Gedatolisib)을 유효성분으로 포함하는, 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 GSK3β(Glycogen synthase kinase 3 beta) 억제제는 GSK3β에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, RNAi, siRNA, shRNA, 앱타머, 항체, 화합물 또는 천연추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암은 PIK3CA(Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase Catalytic Subunit Alpha) 및 TCF7(transcription factor 7) 돌연변이를 갖는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 암 환자의 생물학적 시료로부터 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 TCF7(transcription factor 7) 돌연변이 유전자를 측정하는 단계를 포함하는, 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 TCF7 돌연변이 유전자 특이적인 프라이머, 프로브 또는 앱타머를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이분석법으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행하는 것일 수 있다.

나아가 본 발명은 게다토리십(Gedatolisib)에 대한 내성을 갖는 암 세포주에 GSK3β(Glycogen synthase kinase 3 beta) 억제제 및 게다토리십(Gedatolisib)을 병용 처리하는 단계를 포함하는, 게다토리십(Gedatolisib)의 내성 억제 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 게다토리십(Gedatolisib)에 대한 내성을 갖는 암은 PIK3CA(Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase Catalytic Subunit Alpha) 및 TCF7(transcription factor 7) 돌연변이를 갖는 대장암, 췌장암, 유방암, 위암, 간암 또는 폐암일 수 있다.

본 발명은 TCF7(transcription factor 7) 돌연변이의 존재여부 검출을 통해 게다토리십(Gedatolisib) 내성을 갖는 대장암을 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 새로운 대장암 진단 방법을 제공할 수 있는 효과가 있으며, GSK3β 억제제 및 게다토리십을 병용 처리할 경우, 게다토리십 약물 내성을 억제할 수 있음을 확인함으로써 게다토리십 저항성을 갖는 암을 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 암 치료 방법을 제공하는 효과가 있다.

도 1a는 PIK3CA 돌연변이를 갖는 대장암 세포주에 게다토리십 약물을 처리하고 MTT 어세이를 통해 IC50을 측정한 결과를 나타낸 것이며, 게다토리십 약물 농도별로 처리한 세포주에서의 세포 생존율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 1b는 대장암 세포주에서 PI3K/mTOR 신호경로에 관여하는 인자들의 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 1c는 게다토리십에 대한 민감성 및 저항성 대장암 세포주에서 게다토리십을 농도별(0, 0.1, 1uM) 처리한 후 콜로니 형성능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 1d는 게다토리십에 대한 민감성 및 저항성 대장암 세포주에서 게다토리십을 농도별(0, 0.1, 1uM) 처리한 후, 세포주기에 관여하는 인자들의 발현 변화 및 G1 단계에서의 세포수의 비율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 1e는 게다토리십에 대한 민감성 및 저항성 대장암 세포주에서 게다토리십 처리 유무에 따른 PI3K/mTOR 신호경로에 관여하는 인자들의 인산화 여부 및 발현정도를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 게다토리십 민감성 세포주(HCT-116) 및 저항성 세포주(HCT-15, LS174T)에 게다토리십 처리 유무에 따른 TSC1 및 TSC2의 복합체 형성 여부를 면역침강법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 각 대장암 세포주에서 GSK3β의 발현 및 인산화 정도를 웨스턴 블럿을 통해 분석한 사진 및 발현정도를 정량화한 그래프를 나타낸 것이다.
도 2c는 HCT-15 및 LS174T 세포에 EGFP를 코딩하는 플라스미드 및 활성형이 유지되는 GSK3β-S9A가 EGFP와 융합된 플라스미드를 형질감염시킨 후, 세포 성장 정도를 BrdU 염색(빨강)을 통해 확인한 사진이며, 핵은 파란색으로, EGFP는 녹색으로 염색되어 나타낸 사진이다. 또한 각 처리 군에서의 콜로니 형성능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2d는 HCT-15 및 LS174T 세포에 게다토리십 처리 여부 및 GSK3β의 siRNA 처리 여부에 따른 Raptor 및 mTOR의 발현여부 및 상관관계를 면역침강법을 수행하여 웨스턴으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 각 대장암 세포주에서 WNT/β-catenin 경로에 관여하는 인자들의 발현 수준 및 인산화 정도를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이고(상단), TCF7 H155fs* 돌연변이에 대한 도메인 모식도를 나타낸 것이다(하단).
도 3b는 HCT-15 및 LS174T 세포에서 TCF에 대한 siRNA 처리 여부에 따른 관련 단백질의 발현수준을 웨스턴블럿을 통해 확인한 결과이다.
도 3c는 대장암 세포주에서 TCF7 siRNA 및 게다토리십 처리 여부에 따른 mTOR 및 WNT/β-catenin 경로에 관여하는 인자들의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3d는 ASE 단백질 존재 하에서 TCF7 H155fs* 돌연변이에 따른 WNT/β-catenin 신호경로와 관련된 전사 활성화 정도를 루시퍼라제 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3e는 TCF7 야생형 및 TCF7 H155fs*(TCF7 MT)으로 형질감염된 HCT-116 및 HT-29 세포주에서 게다토리십 처리 여부에 따른 세포 생존율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3f는 TCF7 야생형 및 TCF7 H155fs*(TCF7 MT)으로 형질감염된 HCT-116 및 HT-29 세포주에서 게다토리십 처리 여부에 따른 신호경로 관련 인자들의 발현 및 인산화 정도를 웨스턴블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 게다토리십에 내성을 갖는 대장암 세포주인 HCT-15 및 LS174T에서 GSK3β 억제제 및 게다토리십 병용투여에 따른 암세포 사멸정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 HCT-15 및 LS174T 세포주에 GSK3β에 대한 siRNA를 도입하고 게다리토십 처리 여부에 따른 mTOR 신호전달에 관여하는 인자, 세포사멸에 관여하는 인자 및 세포주기에 관여하는 인자들의 발현수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4c는 HCT-15 및 LS174T 세포주에 게다리토십과 GSK3β 억제제로서 CHIR을 단독 및 병용처리한 군에서의 세포생존율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4d는 HCT-15 및 LS174T 세포주에 게다리토십과 GSK3β 억제제로서 CHIR을 단독 및 병용처리한 군에서의 콜로니 형성능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4e는 HCT-15 및 LS174T 세포주에 게다리토십과 GSK3β 억제제로서 CHIR을 단독 및 병용처리한 군에서의 신호전달 경로에 관여하는 단백질들의 발현수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4f는 HCT-15 및 LS174T 세포주에 게다리토십과 GSK3β 억제제로서 SB216763을 단독 및 병용처리한 군에서의 세포생존율을 분석한 결과(상단)와 신호전달에 관여하는 단백질들의 발현수준을 분석한 결과(하단)를 나타낸 것이다.
도 4g는 HCT-15 및 LS174T 세포주에 게다리토십과 GSK3β 억제제로서 LiCl을 단독 및 병용처리한 군에서의 세포생존율을 분석한 결과(상단)와 신호전달에 관여하는 단백질들의 발현수준을 분석한 결과(하단)를 나타낸 것이다.
도 4h는 게다토리십 민감성 대장암 세포주에 게다리토십과 GSK3β 억제제로서 CHIR을 처리한 후, mTOR 및 WNT/β-catenin 신호경로에 관여하는 인자들의 발현 수준 및 인산화 정도를 웨스턴블럿을 통해 확인한 결과이다.
도 5a는 마우스 동물모델에 HCT-15 대장암 세포주를 이식한 후, 게다토리십 단독, LiCl 단독 및 게다토리십과 LiCl 병용처리 군에서의 시간에 따른 종양 크기를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 각 마우스의 종양 조직을 취해 H&E 염색 및 Ki-67 염색을 수행한 결과를 나타낸 사진이다.
도 5c는 각 마우스로부터 수득한 종양 조직을 대상으로 신호전달 경로에 관여하는 인자들의 발현수준을 웨스턴블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 새로운 대장암 진단용 마커로서 TCF7 돌연변이의 용도를 제공함에 특징이 있으며, 또한 게다토리십(Gedatolisib) 약물 내성을 갖는 대장암의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공함에 특징이 있다.

특히 본 발명에서는 대장암을 진단할 수 있는 새로운 바이오 마커로서 TCF7(transcription factor 7) 돌연변이 유전자를 사용할 수 있음을 규명하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 게다토리십 약물에 대한 내성(저항성)을 갖는 대장암 세포주에서 특이적으로 TCF7의 돌연변이가 존재함을 확인하였고, TCF7의 변이가 GSK3β 및 WNT/β-catenin 의 신호전달에 관여하고 있음을 알 수 있었으며, 나아가 게다토리십 민감성 대장암 세포주에 TCF7(transcription factor 7) 돌연변이 유전자를 도입하여 발현시킨 결과, 게다토리십 민감성 세포주가 게다토리십 약물에 대해 저항성을 나타내어 항암효과가 억제됨을 확인하였다.

따라서 본 발명자들은 TCF7 돌연변이는 GSK3β 및 WNT/β-catenin의 활성화를 유도하여 게다토리십에 대한 저항성을 야기할 수 있음을 알 수 있었고, 대장암 세포주에서 TCF7 돌연변이의 존재 여부 확인을 통해 해당 암이 게다토리십 약물에 대해 저항성 또는 민감성을 나타내는지를 예측 또는 진단할 수 있음을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 TCF7 돌연변이 유전자를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암 진단용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 TCF7 돌연변이 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 TCF7(transcription factor 7) 돌연변이 유전자이며, 상기 본 발명의 TCF7의 변이는 공동 억제자의 결합 도메인이 결손된 도 3a에 기재된 도메인을 갖는 TCF7 H155fs* 변이체로서 TCF7의 전사활성을 증진시킨다.

또한, 상기 TCF7 돌연변이 유전자를 검출할 수 있는 제제는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 TCF7 돌연변이 유전자에 특이적인 프라이머, 프로브 또는 앱타머일 수 있다.

상기 TCF7 돌연변이 유전자의 검출은 TCF7 돌연변이 유전자의 발현수준 바람직하게 상기 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 측정하는 것이며, 상기 발현을 측정할 수 있는 물질로는 상기 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 TCF7 돌연변이 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 상기 TCF7 돌연변이 유전자 전체 또는 돌연변이 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.

본 발명에서 상기 “프라이머”란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.

본 발명에서, 상기 프로브라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 TCF7 돌연변이의 발현은 TCF7 돌연변이의 단백질 수준도 포함되며, 상기 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 본 발명의 TCF7 돌연변이 유전자로부터 발현된 TCF7 돌연변이 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 포함할 수 있다. 상기 단백질 수준의 측정을 위해 항체를 이용할 경우, 생물학적 시료 내의 상기 타겟 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 방법에 있어서 유전자 수준 또는 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법을 이용할 수 있다.

또한, 상기 “항체”는 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 제조된 것을 사용할 수 있는데, 상기 항체의 제조는 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al.,EuropeanJounralofImmunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol . Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

나아가, 본 발명은 본 발명에 따른 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암 진단용 조성물을 포함하는 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 상기 마커 유전자인 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 TCF7 돌연변이 유전자의 발현 수준 또는 상기 TCF7 돌연변이 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.

본 발명의 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 암 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있으며, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 게다토리십 내성 암 진단용 조성물을 포함하는 게다토리십 내성 암 진단용 마이크로어레이를 제공할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

나아가 본 발명자들은 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암을 효과적으로 치료할 수 있는 방법을 규명하였는데, 즉, GSK3β(Glycogen synthase kinase 3 beta) 억제제 및 게다토리십(Gedatolisib)을 병용처리할 경우, 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암을 효과적으로 억제하여 우수한 항암 효과를 도출할 수 있음을 확인하였다.

따라서 본 발명은 GSK3β(Glycogen synthase kinase 3 beta) 억제제 및 게다토리십(Gedatolisib)을 유효성분으로 포함하는, 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 의하면, GSK3β의 억제제로서 GSK3β에 대한 siRNA를 게다토리십 저항성 대장암 세포주인 HCT-15 및 LS174T 세포주에 처리한 후, 암 세포주의 세포사멸을 분석한 결과, GSK3β의 억제제를 게다토리십과 함께 처리할 경우, 게다토리십에 저항성을 갖는 암세포주를 효과적으로 사멸시켜, 항암 효과를 증진시킬 수 있음을 알 수 있었다. 뿐만 아니라 GSK3β의 활성이 PI3K/mTOR 억제에 대해 저항성을 가지며 이를 통해 mTOR의 신호전달을 유지하는 활성이 있음을 확인하였고, 이에 GSK3β 억제제를 게다토리십과 병용 처리하는 경우, mTORRaptor 복합체가 감소되고 p-mTOR, p-P70S6K, p-S6K 및 p-4E-BP1의 발현수준이 모두 감소됨을 확인하였다.

나아가 본 발명자들은 PI3K/mTOR 및 WNT/β-catenin의 신호전달에 모두 관여하는 GSK3β에 대해, GSK3β을 억제할 경우 TCF7 변이에 의해 활성화된 WNT/β-catenin 신호전달에 따른 게다토리십 저항성 억제 효과가 있는지를 확인하기 위해, GSK3β siRNA와 게다토리십을 약물 저항성을 갖는 대장암 세포주에 처리한 결과, 저항성 대장암 세포주의 세포생존율 및 콜로니 형성이 모두 감소되어 항암 활성을 유도함을 확인할 수 있었다.

이러한 결과는 마우스 동물 모델을 통해서도 확인할 수 있었는데, 본 발명의 일실시예에서는 HCT-15 대장암 세포주를 BALB/c 누드 마우스에 피하 주사하고, 게다토리십과 GSK3β저해제를 각각 단독처리한 군과 병용처리한 군에 대한 종양성장 정도를 분석하였다.

그 결과, 게다토리십과 GSK3β저해제를 각각 단독처리한 군에서는 종양 억제 효과가 미비한 것으로 나타난 반면, 이들을 함께 처리한 군에서는 종양의 크기가 효과적으로 감소되는 것으로 나타났다.

그러므로 본 발명은 GSK3β(Glycogen synthase kinase 3 beta) 억제제 및 게다토리십(Gedatolisib)을 유효성분으로 포함하는, 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 GSK3β(Glycogen synthase kinase 3 beta) 억제제는 GSK3β에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, RNAi, siRNA, shRNA, 앱타머, 항체, 화합물 또는 천연추출물일 수 있다.

바람직하게 상기 GSK3β(Glycogen synthase kinase 3 beta) 억제제는 서열번호 2로 나타내는 GSK3β의 염기서열에 대한 siRNA로서 5′-CAGCUAUACAGACACUAAAUU-3′ 및 5′-UUUAGUGUCUGUAUAGCUGUU-3′을 사용할 수 있으며, 또한 화합물로서 CHIR-99021(CHIR), SB216763(SB) 및 LiCl으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 사용할 수 있다.

나아가 본 발명은 암 환자의 생물학적 시료로부터 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 TCF7(transcription factor 7) 돌연변이 유전자를 측정하는 단계를 포함하는, 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암 진단을 위한 정보 제공방법을 제공할 수 있다.

상기에서 TCF7(transcription factor 7) 돌연변이 유전자가 존재하거나 상기 돌연변이 유전자의 발현수준이 대조군 시료와 비교하여 증가되어 있는 경우, 상기 암은 게다토리십 약물에 대해 저항성을 갖는 것으로 판단할 수 있으며, 이 경우 게다토리십과 GSK3β(Glycogen synthase kinase 3 beta) 억제제를 병용처리하여 효과적인 항암 치료를 시도할 수 있다.

또한, 상기 측정은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 TCF7 돌연변이 유전자 특이적인 프라이머, 프로브 또는 앱타머를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이분석법으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행하는 것일 수 있다.

나아가 본 발명은 게다토리십(Gedatolisib)에 대한 내성을 갖는 암 세포주에 GSK3β(Glycogen synthase kinase 3 beta) 억제제 및 게다토리십(Gedatolisib)을 병용 처리하는 단계를 포함하는, 게다토리십(Gedatolisib)의 내성 억제 방법을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 게다토리십(Gedatolisib)에 대한 내성을 갖는 암은 PIK3CA(Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase Catalytic Subunit Alpha) 및 TCF7(transcription factor 7) 돌연변이를 갖는 대장암, 췌장암, 유방암, 위암, 간암 또는 폐암일 수 있으며, 바람직하게는 대장암일 수 있다.

본 발명에서 상기 약물에 대한 민감성(sensitive)이란, 처리한 약물에 대해 반응을 나타내는 것을 말하는 것으로 암세포 또는 암조직에 약물을 처리한 경우, 암세포의 증식 및 활성이 억제되고, 세포사멸이 감소 또는 억제되는 현상이 나타나는 것으로 즉, 투여한 약물에 대한 항암 활성이 있는 것을 의미한다.

반면 본 발명에서 상기 저항성(resistance), 즉 내성(약물내성)이란, 처리한 약물에 대해 반응을 나타내지 않는 것, 즉 목적하는 효과를 보이지 않는 것으로 말하는 것으로 암세포 또는 암조직에 약물을 처리한 경우, 암세포의 증식 및 활성의 억제가 미비하거나 또는 억제 활성이 아예 나타나지 않고, 세포사멸의 감소 또는 억제 현상이 나타나지 않는 것으로 즉, 투여한 약물에 대한 항암 활성이 없는 것을 의미한다.

또한, 본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 암의 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<준비예>

시약준비

Gedatolisib (일명 PKI-587 또는 PF-05212384이라고 함)은 Pfizer (New York, NY, USA)로부터 구입하여 사용하였고, CHIR-99021 (HCl) 및 SB216763은 Selleck Chemicals (Houston, TX, USA)의 것을 구입하여 사용하였으며, LiCl은 Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 스탁(STOCK) 용액들은 DMSO에서 용해시켜 제조하였고 실험에 사용하기 전까지는 20℃에서 저장하였다.

세포주 준비

HCT-116, WiDr, HT-29, SNU-C5, DLD-1, HCT-15 및 LS174T을 포함하는 인간 CRC 세포주는 Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea)로부터 입수하여 사용하였다. 세포주들은 열처리 비활성화된 10% 소태아혈청(fetal bovine serum) 및 10ug/ml 젠타마이신이 함유된 RPMI-1640 배지를 이용하여 37℃ 온도 및 5% 이산화탄소 조건 하에서 배양하였다.

<실험방법>

① 세포생존율 분석(Cell viability assay)

세포들의 생존율은 MTT 분석(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)을 이용하여 분석하였다. 96웰 플레이트에 2 × 10³ 세포들을 분주하고 24시간 동안 배양시킨 후, 37℃ 에서 시험 시약을 처리 후, 72시간 동안 배양시켰다. 이후, 각 웰의 배지에 MTT 시약을 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 반응시킨 다음, 배지를 제거하였고 디메틸설폭사이드를 첨가한 다음, 10분 동안 상온에서 반응시켰다. 세포 생존율은 540nm의 흡광도에서 VersaMax 마이크로플레이트 리더기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였으며, 세포의 성장률을 50%로 감소시킬 수 있는 약물의 농도는 Calcusyn software (Biosoft, Ferguson, MO, USA)을 이용한 농도 반응 커브를 이용하여 분석하였다. 실험은 각 샘플에 대해 6번씩 반복 수행하였고, 적어도 3번은 독립적인 분석을 하였으며, 95%의 신뢰구간을 갖는 의미있는 데이터로 판단하였다.

② 웨스턴 블럿

배양된 세포들을 PBS로 세척한 후, 용해버퍼(lysis buffer; 50mM Tris-HCl, pH 7.5 1% NP-40, 0.1% sodium deoxycholate, 150mM NaCl, 50mM NaF, 1mM sodium pyrophosphate, 1mM EDTA and protease/phosphatase inhibitors)를 이용하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해물(lysates)들을 13000g에서 20분동안 원심분리 시켰다. 단백질의 농도는 Bicinchoninic Acid Protein Assay Reagent (Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 정량하였고, 각 동량의 단백질 샘플들은 SDS polyacrylamide denaturing gels을 이용하여 전기영동시킨 후, 니트로셀룰로스막으로 전기이동시켰다. 이후 니트로셀룰로스막을 1% 스킴밀크 및 1% BSA가 함유된 블록킹 버퍼로 1시간 동안 상온에서 반응시킨 다음, 1차 항체를 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 이때 PI3K p110, phosphorylated (p)-AKT (pS473), p-AKT (pThr308), p-TSC2 (pS1462), p-mTOR (pS2481), p-p70S6K (pThr389), p-p70S6K (pS371), p-S6K (pS240/244), p-4E-BP1 (pS65), p-LRP6 (pS1490), p-GSK3β (pS9/21), p-β-catenin, p-GS, AXIN2, AKT, TSC1, TSC2, mTOR, Raptor, p70S6K, S6K, 4E-BP1, GSK3B, TCF7, caspase-3, cleaved PARP 및 CDK4에 대한 항체들은 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로부터 구입하여 사용하였고, β-tubulin, cyclin D, p27, β-catenin 및 active β-catenin에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas,TX , USA)로부터 구입한 것을 사용하였다. 웨스턴블럿 상의 밴드 강도의 정량적 측정은 ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 분석하였다.

③ 세포주기 분석(Cell cycle analysis)

배양한 각 세포들을 수집한 후, PBS 버퍼로 2회 세포들을 세척하고 70% 에탄올로 고정시킨 후, -20℃에서 보관하였다. 분석 이전에 세포 현탁액(suspension)은 PBS로 세척하였고 RNase A (50 μg/mL)를 이용하여 상온에서 15분 동안 반응시켰다. 이후 propidium iodide (50 μg/mL)을 이용하여 염색을 수행하였다. 세포 내 DNA 농도(10,000 cells per experiment)는 ModFit LT 프로그램(Verity Software House, Inc.)이 장착된 FACS 유세포 분석기(Becton Dickinson Biosciences)를 이용하여 분석하였다.

④ 콜로니 형성분석

콜로니 형성분석은 6-웰 플레이트에서 수행하였다. 세포들을 4 ×10³ 또는 1 × 10⁴cells/well의 세포수로 3세트씩 플레이트에 분주하고 2일간 배양한 후, 베히클, 게다토리십(Gedatolisib) 및 CHIR-99021을 각각 농도별로 처리하였다. 1주일 후, 각 배지를 제거하고 세포들을 Coomassie Brilliant Blue로 염색하였다. PBS로 5회 및 증류수로 1회 세척한 세포들은 공기 중에서 건조시켰다. 형성된 콜로니들은 GelCount colony counter (Oxford Optronix, Abingdon, UK)를 이용하여 계수하였다.

⑤ 면역침강(Immunoprecipitation)

mTORRaptor 복합체 및 TSC1-TSC2 복합체의 확인을 위해, HCT-116, SNU-C5, HCT-15 및 LS174T 세포를 100 mm × 20 mm 디쉬에 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 베히클 또는 게다토리십(Gedatolisib)을 최종농도 0.1uM이 되도록 각각 세포에 첨가한 후, 12시간 추가배양한 후, 세포를 수집하였다. 총 세포 추출물을 제조하고 각 단백질의 항체를 이용하여 면역침강을 수행하였다.

⑥ siRNA에 의한 덕다운

GSK3β 및 TCF7에 대한 siRNA는 mbiotech (Seoul, Korea)로부터 구입하여 사용하였다. siRNAs (50 nM)를 제조사의 방법에 따라 세포에 형질감염시키고 48시간 후, 세포 용해물을 수득하였다. 이때 사용한 siRNA는 다음과 같다.

siRNA 서열

타겟 유전자	siRNA	siRNA 서열
negative control	sense	5’- CCUCGUGCCGUUCCAUCAGGUAGUU-3’ [서열번호: 3]
	anti-sense	5’- CUACCUGAUGGAACGGCACGAGGUU-3’ [서열번호: 4]
GSK3β	sense	5′-CAGCUAUACAGACACUAAAUU-3′ [서열번호: 5]
	anti-sense	5′-UUUAGUGUCUGUAUAGCUGUU-3′ [서열번호: 6]
TCF7	sense	5′-GACAACUACGGGAAGAAGAUU-3′ [서열번호: 7]
	anti-sense	5′-UCUUCUUCCCGUAGUUGUCUU-3 [서열번호: 8]

⑦ 부위 특이적 변이(site directed mutagenesis)

TCF7을 인코딩하는 플라스미드 pcDNA3.1 은 Addgene (Cambridge, MA, USA)에서 구입하여 사용하였고, GSK3β를 인코딩하는 pOTB7은 KHGB (Korea Human Gene Bank, Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. TCF7 H155 프레임쉬프트(frameshift) 및 GSK3β S9A 변이는 TCF7 및 GSK3B의 전장 주형을 가지고 QuikChange Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 이용하여 제조하였다. TCF7 H155fs 변이제조(서열번호 1의 염기서열을 갖는 돌연변이)를 위해 사용한 프라이머 및 GSK3β S9A 변이제조(서열번호 13의 염기서열을 갖는 돌연변이)를 위해 사용한 프라이머 서열을 다음과 같다.

프라이머 서열

타겟 유전자	프라이머	서열
TCF7 H155fs 변이	정방향 프라이머	5′-TTGGGGGACACCGGTGGGGGGGCTG-3′ [서열번호: 9]
	역방향 프라이머	5′-CAGCCCCCCCACCGGTGTCCCCCAA-3′ [서열번호: 10]
GSK3β S9A 변이	정방향 프라이머	5′-TTGGGGGACACCGGTGGGGGGGCTG-3′ [서열번호: 11]
	역방향 프라이머	5′-CAGCCCCCCCACCGGTGTCCCCCAA-3' [서열번호: 12]

돌연변이 반응은 상기 프라이머의 제조사의 지침에 따라 수행하였고, 돌연변이된 서열의 시퀀싱은 생거 시퀀싱(Macrogen, Seoul, Korea)으로 분석하였다.

⑧ BrdU 도입(incorporation) 및 세포성장 분석

HCT-15 및 LS174T 세포주는 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 야생형 GSK3β 유전자 및 변이형 GSK3β-S9A 유전자를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 이후 BrdU 염색을 수행하였다.

⑨ 마우스 이종이식 모델(Mouse xenograft model)

모든 동물실험은 연구소 실험동물자원 및 서울대학교 및 서울대학교 위원회의 승인 하에 수행하였다. 4주령의 18~20g의 무게를 갖는 BALB/c 누드 마우스를 Central Lab Animal Inc. (Seoul, Korea)로부터 입수하였다. 이후 실험을 위해 1주일 정도 사육환경에 적응시킨 다음, HCT-15 세포 (10⁷/mouse)를 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. HCT-15 세포 주입 후, 종양 부피가 100-200 mm³가 될 때까지 사육시킨 후, 5마리씩을 1개군으로 그룹핑하고 각 군에 대해 베히클(vehicle) 단독, 게다톨리십(gedatolisib) 단독, LiCl 단독 및 게다톨리십(gedatolisib)과 LiCl의 혼합처리를 각각 수행하였다. 또한, LiCl을 처리한 마우스 군에는 추가로 염화나트륨을 첨가하여 전해질 불균형을 억제시켰다. Gedatolisib (10 mg/kg) 및 LiCl (80 mg/kg)은 3주 동안 주 2회씩 각각 정맥주사 및 복강 주사하였다. 종양의 크기는 일주일에 3번씩 캘리퍼를 이용하여 측정하였고, mm³ 당 종양의 부피는 하기 수식을 이용하여 계산하였다. 21일째에 최종 처치 후, 마우스들을 안락사 시켰다.

종양부피 계산= [(width)²x (height))/2]

⑩ 면역조직염색(Immunohistochemistry staining)

이종이식 종양 표본은 10%의 포르말린 용액으로 24시간 고정시키고, 파라핀으로 임베딩한 후, 절편화하였다. 이후 조직의 형상을 H&E 염색을 통해 가시화하여 확인하였으며, Ki67 분석을 당업계에 알려진 일반적인 방법으로 수행하였다.

⑪ 통계처리

모든 실험의 2회 또는 3회 반복 수행하였으며, 결과는 평균±표준편차(s.d)로 표현하였다. ANOVA로 분석한 이종이식 쥐에서 종양 크기의 차이를 제외하고 통계적 유의성을 unpaired Student 's t-test를 사용하여 계산하였으며, P < 0.05 값을 유의미한 값으로 판단하였다.

< 실시예 1>

PIK3CA 변이 대장암 세포주에서 게다토리십 ( Gedatolisib ) 처리에 의한 약물 민감성 분석 및 PI3K / AKT / mTOR 신호경로의 영향 분석

본 발명자들은 대장암 세포주에서의 게다토리십 약물 민감성 여부를 확인하기 위해, 29개의 각 대장암 세포주 종류별 게다토리십 약물을 처리한 후, 세포주에서의 세포생존율 및 IC₅₀값을 분석하였다. 이때 IC₅₀값으로 0.5uM을 기준으로, 게다토리십 약물에 대한 민감성 세포주(IC₅₀값 <0.5uM)와 저항성 세포주((IC₅₀값 >0.5uM)의 2그룹으로 구분하였다(도 1a 참고).

분석 결과, 상기 표 3과 같이 29개의 세포들 중에서 7개의 세포주는 PIK3CA 변이를 갖는 세포주들이었고, 이 중에서 5개의 세포주인 HCT-116, WiDr, HT-29, SNU-C5 및 DLD-1은 IC₅₀<0.5μM으로 게다토리십에 대해 민감성을 보였으나, HCT15 및 LS174T 세포주들은 IC₅₀>7μM으로 게다토리십에 대해 저항성을 보이는 것으로 나타났다.

또한, 이들 대장암 세포주, 즉 게다토리십에 민감성을 보이는 세포주 및 저항성을 보이는 세포주에서 PI3K/AKT/mTOR 신호경로에 관여하는 분자들의 발현 수준을 웨스턴 블럿을 통해 분석하였다.

그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 저항성 세포주들에 비해 게다토리십 민감성을 갖는 대장암 세포주에서 p-mTOR 의 발현수준이 증가되어 있는 것으로 나타났고, 반면 p-TSC2 의 발현수준은 감소되어 있는 것으로 나타났다.

또한, 이들 세포주들의 콜로니 형성능을 분석하였는데, 그 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 게다토리십 민감성을 보이는 대장암 세포주들에서는 게다토리십 처리에 의해 콜로니의 수 및 크기가 현저하게 감소되는 것으로 나타난 반면, 저항성을 나타내는 대장암 세포주들에서는 콜로니 감소 현상이 유발되지 않았다.

세포주기 변화도 관련성이 있는지 확인하기 위해, 세포주기 관련 인자들에 대한 발현수준 변화를 웨스턴 블럿을 통해 분석하였고, 유세포분석기를 통해 세포주기 변화를 분석하였다.

그 결과, 도 1d에 나타낸 바와 같이, 민감성 세포주들은 게다토리십 처리 농도 의존적으로 G1 어레스트가 일어나는 것으로 나타났고, cyclin D, cyclin E, 및 CDK4의 발현은 감소되고 세포주기 억제자인 p27의 발현은 증가되는 것으로 나타나, 대장암 세포가 약물에 대해 민감성을 나타내어 세포 사멸을 초래할 수 있음을 알 수 있었다. 반면, 저항성 세포주에서는 p27의 발현이 감소되는 것 이외에 다른 인자들의 발현변화는 일어나지 않는 것으로 나타났다.

또한, PI3K/mTOR 신호경로에 관여하는 인자들인 p-AKT, p-mTOR, p-p70S6K, p-S6K 및 p-4E-BP1의 발현수준을 분석한 결과, 민감성 세포주들에서는 이들 인자의 발현이 감소된 것으로 나타난 반면, 저항성 세포주들에서는 유지 또는 증가되는 것으로 나타났다(도 1e 참조).

이러한 결과를 통해, 본 발명자들은 게다토리십 약물에 대한 암세포의 저항, 즉 내성은 PI3K/mTOR 신호전달 과정이 관여한다는 것을 알 수 있었으며, 게다토리십에 민감성을 보이는 PIK3CA-mutant 대장암(CRC) 세포주에서는 게다토리십이 PI3K/mTOR 신호전달을 억제함으로써 세포 성장 및 증식을 억제하고 G1 주기의 어레스트를 유도하여 항암 활성을 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 2>

게다토리십 저항성 세포주에서의 GSKβ 의존적인 mTOR 신호전달 억제분석

앞서 실시예 1에서 확인한 바와 같이, 게다토리십은 PI3K/mTOR 신호경로의 억제를 통해 항암 활성을 유도함을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 게다토리십에 대한 약물 내성(저항성)의 원인을 분석하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다.

앞서 확인한 결과에 의하면, HCT-15 및 LS174T 세포주는 활성화된 PIK3CA 돌연변이를 가지고 있음에도 불구하고 게다토리십(gedatolisib)에 저항성이 있는 것으로 나타났고, 또한, 게다토리십 처리는 이러한 세포에서 p-mTOR의 발현을 상향 조절하는 것으로 나타났고(도 1 1d 참고), 이는 mTOR의 상류 분자가 게다토리십 내성 기전에 관여할 수 있음을 시사한다. TSC1 및 TSC2(Tuberous sclerosis proteins 1과 2)는 mTOR의 상류 억제제로 알려져 있고 mTOR와 다른 신호전달 경로 사이의 통합 자로서 기능을 하는 것으로 알려져 있으며, AKT는 TSC2의 인산화를 통해 TSC 1-2의 복합체 형성을 저해하는 역할을 한다.

이에 본 발명자들은 게다토리십에 의해 AKT의 활성이 감소되므로 TSC 1-2 복합체의 발현수준은 게다토리십 미처리군에 비해 처리된 민감성 세포주군에서 더 높을 것으로 예상하였고 이러한 가설이 맞는지 확인하기 위해 면역침강법을 활용하여 TSC 1-2 복합체를 분석하였다.

그 결과, 예상한 바와 같이, TSC 1-2 복합체는 게다토리십 처리군에서 미처리 군에 비해 민감성 세포주(HCT-116)에서 증가되어 있는 것으로 나타났고, p-p70S6K, p-S6K 및 p-4E-BP1의 발현은 감소되어 있는 것으로 나타났다(도 2a 참조). 한편, 저항성 세포주에서는 TSC 1-2 복합체의 발현변화가 게다토리십 처리와는 무관한 것으로 나타났고 조금 오히려 조금 감소된 것으로 나타났다.

이후 본 발명자들은 mTORRaptor 복합체에 대한 분석을 위해, mTOR에 대한 항체를 이용하여 면역침강법을 수행하였고, Raptor에 대한 항체를 이용하여 웨스턴블럿을 수행하였다.

분석 결과, 게다토리십이 처리된 민감성 세포주에서는 mTORRaptor 복합체가 감소되는 것으로 나타났으며, 이는 mTOR 신호경로의 활성이 감소되었기 때문이다. 반면 저항성 세포주에서는 상기 복합체에 큰 변화가 없는 것으로 관찰되었다.

나아가 상기 약물 민감성 세포주 및 저항성 세포주에서 TSC1-2 및 mTOR의 조절자로 알려진 GSK3β의 변화여부를 분석하였다.

그 결과, 게다토리십 저항성 세포주에서는 민감성 세포주에 비해 인산화된 GSK3β(p-GSK3β)의 발현이 감소되어 있는 것으로 나타났고, 민감성 세포주에서만 p-GSK3β이 발현되어 있는 것으로 나타났다(도 2b 참조). 즉, GSK3β는 저항성 세포주에서 더 활성화되어 있음을 의미한다.

나아가 저항성 세포주인 HCT-15 및 LS174T 세포주에 대해 GSK3β-S9A(즉, 지속적인 활성형을 갖는 GSK3β)으로 형질감염시키고, BrdU 염색을 통해 세포 증식 여부 및 콜로니 형성 졍도를 분석하였다.

그 결과, GSK3β-S9A은 게다토리십 저항성 세포주에서 발현이 증가되어 있으며 콜로니도 형성되는 것으로 나타났으나, 민감성 세포주에서는 이러한 결과를 보이지 않았다(도 2c 참조). 즉 이러한 결과는 GSK3β의 활성화는 대장암 세포주의 활성 및 증식을 촉진시키는 역할을 한다는 것을 알 수 있었으며, 암 세포의 증식억제와 항암 효과도출을 위해서는 GSK3β의 발현 및 활성을 억제할 필요가 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

GSK3β억제제 및 게다토리십의 병용처리에 따른 약물 저항성 대장암 세포주의 항암활성 분석

GSK3β의 억제제로서 GSK3β에 대한 siRNA를 게다토리십 저항성 대장암 세포주인 HCT-15 및 LS174T 세포주에 처리한 후, 게다토리십 약물 처리 여부에 따른 저항성 대장암 세포주에서의 mTORRaptor 복합체 형성 및 mTOR 신호경로에 관여하는 인자들의 발현 변화를 분석하였다.

그 결과, 도 2d에 나타낸 바와 같이, GSK3β siRNA와 게다토리십이 함께 처리된 저항성 세포의 경우, mTORRaptor 복합체가 감소되고 p-mTOR, p-P70S6K, p-S6K 및 p-4E-BP1의 발현수준이 모두 감소되는 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 게다토리십 처리에 의해 감소된 AKT의 활성이 TSC1-2 복합체의 형성을 증가시켰고, 이는 mTORRaptor 복합체의 형성을 저해하여 mTOR의 신호전달 과정을 억제한다는 것을 알 수 있었다. 뿐만 아니라 siRNA로 매개된 GSK3β의 넉다운(KD)는 게다토리십이 처리된 저항성 세포주에서 TSC1-2의 복합체를 형성시키는 것을 알 수 있었다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 GSK3β의 활성이 PI3K/mTOR 억제에 대해 저항성을 가지며 이를 통해 mTOR의 신호전달 유지에 중요한 작용을 함을 알 수 있었고, 궁극적으로 GSK3β의 억제제를 게다토리십과 함께 처리할 경우, 게다토리십에 저항성을 갖는 암세포주를 효과적으로 사멸시켜, 항암 효과를 증진시킬 수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 4>

게다토리십 ( Gedatolisib ) 저항성 세포주에 특이적인 TCF 돌연변이 분석

앞서 실험을 통해 확인된 게다토리십 약물에 대해 저항성을 갖는 세포주인 HCT-15 및 LS174T 세포주에 대해 유전자 특이적 변이체가 있는지 분석한 결과, 이들 세포주에 TCF7의 변이(c.465_466insC; TCF7 H155fs* 변이)가 존재함을 확인하였다. 상기 TCF7의 변이는 공동 억제자의 결합 도메인이 결손된 도 3a에 기재된 도메인을 갖는 변이체로서(TCF7 H155fs*) TCF7의 전사활성을 증진시킨다. 이에 본 발명자들은 상기 본 발명의 TCF7의 변이가 GSK3β 및 WNT/β-catenin 의 신호경로를 활성화시킬 수 있는지 분석하였다.

그 결과, 도 3a에 나타낸 웨스턴블럿 결과, WNT/β-catenin 신호에 관여하는 인자인 p-LRP6, AXIN2 및 active β-catenin의 발현수준은 민감성 세포주에 비해 저항성 세포주인 HCT-15 및 LS174T에서 더 높은 것으로 나타났고, 이들 저항성 세포주에 TCF7의 siRNA를 처리한 결과, p-LRP6, AXIN2 및 active β-catenin의 발현수준이 감소된 것으로 나타났고, 반면 비활성형 p-GSK3β-ser9의 발현은 증가된 것으로 나타났다(도 3b 참조). 나아가 TCF7 siRNA와 게다토리십 약물을 함께 처리한 경우, 저항성 세포주에서는 mTOR 및 WNT/β-catenin 신호경로가 억제됨을 알 수 있었다(도 3c 참조).

이러한 결과는 TCF7 H155fs* 변이가 GSK3β 및 WNT/β-catenin 신호전달에 관여하고 있음을 의미하는 것이며, 전사억제자인 AES 단백질 처리 유무에 따른 TCF7의 활성을 루시퍼라제 활성을 통해 분석한 결과, 도 3d에 나타낸 바와 같이, TCF7 H155fs* 변이가 있는 경우 다른 군에 비해 WNT/β-catenin 신호전달에 관여하는 전사 활성이 증가되어 있는 것으로 나타났다.

또한, 게다토리십 민감성 세포주인 HCT-116 및 HT-29 세포주에 베히클 mock 벡터 및 TCF7 H155fs* 변이 함유 벡터를 도입한 후, 게다토리십 약물 처리 결과, TCF7 H155fs* 변이발현에 의해 민감성 세포주가 게다토리십 처리에 대해 저항성을 나타내어 세포 사멸이 유도되지 않음을 알 수 있었다(도 3e 참조). 또한 이들 세포주에 대해 p-AKT, p-mTOR, p-S6K, p-P70S6K, p-4E-BP1, p-LRP6, AXIN2 및 active β-catenin의 발현수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과, 크게 변화가 없거나 또는 게다토리십 처리에 의해 상향 조절되는 것으로 나타났다(도 3f 참조).

그러므로 TCF7 H155fs* 변이는 GSK3β 및 WNT/β-catenin의 활성화를 유도하여 게다토리십에 대한 저항성을 야기할 수 있음을 알 수 있었고, 대장암 세포주에서 TCF7 H155fs* 변이의 존재 여부를 확인함으로써 해당 암 세포주가 게다토리십 약물에 대한 저항성 또는 민감성을 나타내는지 예측할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 5>

GSK3β 억제에 의한 게다토리십 약물 민감성에 미치는 영향 분석

PI3K/mTOR 및 WNT/β-catenin의 신호전달에 모두 관여하는 GSK3β에 대해, 본 발명자들은 GSK3β을 억제할 경우, TCF7 변이에 의해 활성화된 WNT/β-catenin 신호전달에 따른 게다토리십 저항성 억제 효과가 있는지의 여부를 확인하였다.

이를 위해, 약물 저항성 세포주에 GSK3β에 대한 siRNA와 게다토리십을 함께 처리하고 이들 암세포의 세포사멸 여부와 신호전달에 관여하는 인자들의 발현 변화를 분석하였다.

그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 다른 처리군에 비해 GSK3β siRNA와 게다토리십을 함께 처리한 군의 경우, 저항성 세포주인 HCT-15 및 LS174T의 세포생존율이 감소하는 것으로 나타났고, p-mTOR, p-P70S6K, p-S6K 및 p-4E-BP1의 발현수준도 감소하는 것으로 나타났다(도 4b 참조). 흥미롭게도 p-LRP6, AXIN2 및 active β-catenin의 발현도 GSK3β siRNA와 게다토리십을 함께 처리한 군에서 감소 현상을 보였다. 이러한 결과는 GSK3β의 선택적 저해제인 CHIR-99021(CHIR)을 게다토리십와 함께 처리한 군에서도 확인할 수 있었으며, 세포생존율 및 콜로니 형성 모두 억제되는 것을 확인할 수 있었고(도 4c 및 4d 참조), p-mTOR, p-P70S6K, p-S6K, p-4E-BP1, p-LRP6, p-GS, AXIN2 및 active β-catenin의 발현수준도 모두 감소되는 것으로 나타났다(도 4e 참조). 뿐만 아니라 세포주기에서 G1 단계의 마커인 cyclin D1 마커는 감소되었고 세포사멸 인자인 활성형 카스파제-3의 발현은 증가되는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 GSK3β 억제제인 SB216763(SB) 또는 LiCl을 게다토리십 약물과 함께 처리한 군에서도 동일하게 나타났다(도 4f 및 4g 참조).

한편, 게다토리십 민감성 세포주인 WiDr 및 HT-29 세포주에 gedatolisib와 GSK3β 억제제인 CHIR을 함께 처리한 경우, S6, 4E-BP1, AXIN2 및 active β-catenin의 발현수준 및 인산화된 형태가 증가되어 mTOR 및 WNT 의 신호경로가 유도되는 것으로 나타났다(도 4h 참조).

즉, 이러한 결과는 GSK3β의 저해가 PI3K 및 mTOR 억제에 대한 HCT-15 및 LS174T 세포의 민감성을 회복시킬 수 있음을 시사한다.

< 실시예 6>

GSK3β 억제제 및 게다토리십 병용처리에 따른 이종이식 마우스 모델에서 대장암에 대한 항암활성 분석

GSK3β의 저해가 게다토리십 약물에 대한 암세포의 민감성을 회복시킬 수 있는지 확인하기 위해, HCT-15 대장암 세포주를 BALB/c 누드 마우스에 피하 주사하였고, 이후 베히클 단독, 게다토리십 단독, LiCl 단독, 게다토리십+LiCl 병용처리를 각각 마우스에 적용하였으며, 각 마우스에서 성장된 종양의 부피를 측정하였다.

그 결과, 게다토리십과 LiCl을 단독처리한 군의 경우, 베히클을 처리한 대조군과 종양크기에서 차이를 보이지 않았으며, 게다토리십과 GSK3β의 저해제인 LiCl을 병용처리한 군에서 효과적으로 종양의 크기가 감소되는 것으로 나타났다(도 5a 및 도 5b 참조). 또한, PI3K/mTOR 및 WNT/β-catenin 신호경로에 있어서 관여 인자들의 발현 여부를 분석하였는데, 그 결과, p-GS, p-AKT, p-S6K, p-4E-BP1, p-LRP6, AXIN2, active β-catenin 및 cyclin D1의 발현이 단독 처리군에 비해 병용 처리군에서만 효과적으로 감소되는 것으로 나타났다(도 5c 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 대장암의 효과적인 치료를 위한 방법으로 GSK3β의 저해제 및 게다토리십을 병용처리할 수 있음을 알 수 있었고, 특히 게다토리십에 내성을 갖는 대장암 세포의 경우 GSK3β의 저해제 및 게다토리십 병용처리로 효과적인 항암 활성을 도출할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry academic cooperation foundation of seoul national university <120> Use of TCF7 frameshift mutant for diagnosing colorectal cancer and composition for treating colorectal cancer having resistance of gedatolisib <130> NPDC62739 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1156 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TCF7 H155fs* mutant sequence <400> 1 atgccgcagc tggactccgg cgggggcggc gcgggcggcg gcgacgacct cggcgcgccg 60 gacgagctgc tggccttcca ggatgaaggc gaggagcagg acgacaagag ccgcgacagc 120 gccgccggtc ccgagcgcga cctggccgag ctcaagtcgt cgctcgtgaa cgagtccgag 180 ggcgcggccg gcggcgcagg gatcccgggg gtcccggggg ccggcgccgg ggcccgcggc 240 gaggccgagg ctctcgggcg ggaacacgct gcgcagagac tcttcccgga caaacttcca 300 gagcccctgg aggacggcct gaaggccccg gagtgcacca gcggcatgta caaagagacc 360 gtctactccg ccttcaatct gctcatgcat tacccacccc cctcgggagc agggcagcac 420 ccccagccgc agcccccgct gcacaaggcc aatcagcccc ccccacggtg tcccccaact 480 ctctctctac gaacatttca acagcccaca tcccacccct gcacctgcgg acatcagcca 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Claims (10)

1. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 TCF7(transcription factor 7) 돌연변이 유전자 또는 상기 TCF7 돌연변이 유전자를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암 진단용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 제제는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 TCF7 돌연변이 유전자에 특이적인 프라이머, 프로브 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는, 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암 진단용 조성물.
3. 제1항의 조성물을 유효성분으로 포함하는, 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암 진단 키트.
4. GSK3β(Glycogen synthase kinase 3 beta) 억제제 및 게다토리십(Gedatolisib)을 유효성분으로 포함하며,
   상기 GSK3β(Glycogen synthase kinase 3 beta) 억제제는 GSK3β에 특이적인 5′-CAGCUAUACAGACACUAAAUU-3′ 및 5′-UUUAGUGUCUGUAUAGCUGUU-3′로 이루어진 siRNA; CHIR-99021(CHIR) 화합물; SB216763(SB) 화합물; 또는 LiCl 화합물인 것을 특징으로 하는,
   게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 삭제
6. 제4항에 있어서,
   상기 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암은 PIK3CA(Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase Catalytic Subunit Alpha) 및 TCF7(transcription factor 7) 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는, 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
7. 암 환자의 생물학적 시료로부터 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 TCF7(transcription factor 7) 돌연변이 유전자를 측정하는 단계를 포함하는, 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암 진단을 위한 정보 제공방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 측정은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 TCF7 돌연변이 유전자에 특이적인 프라이머, 프로브 또는 앱타머를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법 및 노던 블랏으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 게다토리십(Gedatolisib) 내성 대장암 진단을 위한 정보 제공방법.
9. 게다토리십(Gedatolisib)에 대한 내성을 갖는 대장암 세포주에 GSK3β(Glycogen synthase kinase 3 beta) 억제제 및 게다토리십(Gedatolisib)을 병용 처리하는 단계를 포함하되,
   상기 GSK3β(Glycogen synthase kinase 3 beta) 억제제는 GSK3β에 특이적인 5′-CAGCUAUACAGACACUAAAUU-3′ 및 5′-UUUAGUGUCUGUAUAGCUGUU-3′로 이루어진 siRNA; CHIR-99021(CHIR) 화합물; SB216763(SB) 화합물; 또는 LiCl 화합물인 것을 특징으로 하는,
   게다토리십(Gedatolisib)의 내성 억제 방법.
10. 제9항에 있어서,
    상기 게다토리십(Gedatolisib)에 대한 내성을 갖는 대장암은 PIK3CA(Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase Catalytic Subunit Alpha) 및 TCF7(transcription factor 7) 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는, 게다토리십(Gedatolisib)의 내성 억제 방법.

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