KR102576154B1 - 습관성 유산 예측용 바이오마커 - Google Patents

습관성 유산 예측용 바이오마커 Download PDF

Info

Publication number
KR102576154B1
KR102576154B1 KR1020220179009A KR20220179009A KR102576154B1 KR 102576154 B1 KR102576154 B1 KR 102576154B1 KR 1020220179009 A KR1020220179009 A KR 1020220179009A KR 20220179009 A KR20220179009 A KR 20220179009A KR 102576154 B1 KR102576154 B1 KR 102576154B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
miscarriage
mir
clause
tnf
polymorphism
Prior art date
Application number
KR1020220179009A
Other languages
English (en)
Inventor
이상후
박지명
백세연
이미경
이경률
Original Assignee
주식회사 에스씨엘헬스케어
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 에스씨엘헬스케어 filed Critical 주식회사 에스씨엘헬스케어
Priority to KR1020220179009A priority Critical patent/KR102576154B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102576154B1 publication Critical patent/KR102576154B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

습관성 유산(Recurrent Pregnancy Loss; RPL)은 재발 요인이 강하므로 개인별 습관성 유산의 위험성을 미리 예측하여 적절히 대응하기 위한 기술이 매우 중요하다고 할 것이나, 아직 정확도 높은 습관성 유산의 예측 방법이 부재한 실정이다.
본 발명은 습관성 유산 예측용 바이오마커에 관한 것으로, 본 발명의 바이오마커는 특정 유전자들 간의 다형성 조합에 따라 유산 위험성을 정확도 높게 예측 가능하므로, 의료 및 보건 분야에서 활발하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

습관성 유산 예측용 바이오마커{Biomarkers for Predicting Recurrent Pregnancy Loss}
본 발명은 습관성 유산 예측용 바이오마커에 관한 것이다.
습관성 유산(Recurrent Pregnancy Loss; RPL)은 임신 20주 이전에 3회 이상 자연 유산이 반복되는 경우로 정의되며, 넓게는 반복착상실패(Repeated Implantation Failure; RIF)를 포함한다. 재발률이 높아 2번 연속으로 유산한 경우는 35%, 3번 연속 유산한 경우는 47% 이른다. 임신의 유지에는 유전적, 해부학적, 및 다양한 환경적 요인이 관여되는데, 염색체 이상, 자궁기형, 내분비 질환, 항인지질항체 증후군 등의 원인에 의해 반복적으로 임신의 유지에 실패하는 것에는 보고된다. 또한 산모의 연령도 중요한 원인으로 지목되고 있다. 공지된 연구결과에 따르면 연령에 따른 자연유산율은 35세에서 20%, 40세부터 40%, 45세부터 80%로 나이가 들수록 증가한다. 현대 사회에는 산모의 연령이 지속적으로 증가되는 추세이므로 개인별 습관성 유산의 위험성을 미리 예측하여 적절히 대응하기 위한 기술이 매우 중요하다고 할 것이나, 아직 정확도 높은 습관성 유산의 예측 방법이 부재한 실정이다.
한편 최근에는 습관성 유산이 마이크로RNA(MicroRNA; miRNA) 또는 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphisms; SNP)과 관련된다고 보고되고 있다. 이는 2차적 유산의 위험성이 1차적 유산에 의해 증가된다는 연구 결과로부터 뒷받침된다. 따라서 건강한 산모와 RPL 산모의 다양한 유전적 다양성을 비교 분석하여 습관성 유산을 정확하게 예측하기 위한 바이오마커 개발의 중요성이 대두되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제의 해결을 위해 안출된 것으로, 습관성 유산 예측용 바이오마커에 관한 것이다. 본 발명의 바이오마커는 특정 유전자들 간의 다형성 조합에 따라 유산 위험성을 정확도 높게 예측 가능하므로, 의료 및 보건 분야에서 활발하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 습관성 유산 예측용 바이오마커에 관한 것이다.
본 발명은 일 양태로서, 습관성 유산의 발생 예측 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태로서, 습관성 유산의 발생 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 습관성 유산의 발생 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 습관성 유산의 발생 예측용 DNA 칩 또는 SNP칩을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 습관성 유산의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 습관성 유산 Recurrent Pregnancy Loss; RPL)이란 임신 20주 이전에 3회 이상 자연 유산이 반복되는 경우로 정의되는 것으로, 포괄적인 의미로서 반복착상실패(Repeated Implantation Failure; RIF)를 포함하는 개념이다. 습관성 유산의 원인은 일반적으로 유전적 요인, 해부학적 요인, 내분비적 요인, 감염(병원체) 요인, 면역학적 요인, 기타 요인으로 분류할 수 있으나, 특히 면역학적 요인의 항인지질항체 증후군과 유전적 요인의 유전적 혈전성향증(thrombophilia)을 혈전 요인으로 따로 분리하기도 한다. 상기 다양한 요인들 중 부모로부터 기인한 염색체 이상과 항인지질항체 증후군만이 명백한 습관성 유산 요인이라 할 수 있다. 이는 습관성 유산의 원인의 10~15% 이하에 해당된다. 각 요인의 빈도는 연구 집단 등에 따라 다양할 수 있지만, 부모로부터 기인된 유전적 요인이 3~6%, 면역학적 요인이 20~50%, 해부학적 요인이 12~16%, 내분비적 요인이 17~20%, 감염(병원체) 요인이 0.5~5%, 기타 요인이 10% 정도의 빈도를 보인다. 상기 유전적 요인에 대하여, 최근에는 습관성 유산이 마이크로RNA(MicroRNA; miRNA) 또는 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphisms; SNP)과 관련된다고 보고되고 있다. 이는 2차적 유산의 위험성이 1차적 유산에 의해 증가된다는 연구 결과로부터 뒷받침된다. 따라서 건강한 산모와 RPL 산모의 다양한 유전적 다양성을 비교 분석하여 습관성 유산을 정확하게 예측하기 위한 바이오마커 개발의 중요성이 대두되고 있다.
본 발명에서 유전적 다형성(genetic　polymorphism)이란 같은 생물 집단 속에 특정　유전자의 대립 인자가 존재하는 현상으로, 일반적으로 집단에서 가장 흔한 동형 접합체(homozygote)의 빈도가 90퍼센트 이하일 때 해당 유전자를 　다형성을 지닌 유전자로 정의할 수 있다. 유전적 다형성은 주로 마이크로RNA(MicroRNA; miRNA) 또는 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphisms; SNP)에 의한다. miRNA는 단백질을 합성하지 않는　비번역(non-coding)　RNA로 유전자 발현을 조절하는 역할을 하며, SNP는 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열(A,T,G,C)의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 의미한다. 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술자들에게 공지된 miRNA 변이, 또는 특정 유전자의 SNP는 고유의 번호로 자명하게 식별된다. 예를 들어, miR-27a(MicroRNA-27a)는 rs895819의 고유번호를 갖으며, 아데닌(A)이 구아닌(G)으로 변이될 수 있는 것이다. KDR(Kinase Insert Domain Receptor) 유전자 서열의 604번 위치에서 티민(T)이 사이토신(C)으로 변이된 것이될 수 있는 SNP는 rs2071559의 고유번호를 갖는다. 상기 rs895819, rs2071559 등의 고유번호에 대한 염기 변이 정보는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI), SNPedia(https://www.snpedia.com/) 등 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술자들에게 자명한 공공의 데이터베이스로부터 확인할 수 있다.
본 발명은 일 양태로서 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-449b(microRNA 449b) 유전자 다형성 rs10061133, eNOS(endothelial nitric oxide synthase)의 유전자 다형성 rs1799983, 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 유전자 다형성 rs1800630으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 확인하는 단계를 포함하는, 습관성 유산의 발생 예측 방법을 제공한다.
상기 방법은 바람직하게는 (a) miR-449b 유전자 다형성 rs10061133을 확인하는 단계; 및, (b) eNOS의 유전자 다형성 rs1799983, 또는 TNF-α의 유전자 다형성 rs1800630을 확인하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다. 이 때, rs10061133의 유전자형이 AG+GG 이고 rs1799983의 유전자형이 GG 일 경우, rs10061133의 유전자형이 AG+GG 이고 rs1800630 의 유전자형이 CA+AA 인 경우, rs10061133와 rs1799983의 일배체 유전자형이 G-G 인 경우, 또는 rs10061133와 rs1800630 의 일배체 유전자형이 G-A 인 경우에 상기 개체의 습관성 유산 발생 가능성이 높을 것으로 예측할 수 있다.
상기 방법은 더욱 바람직하게는 (a) miR-449b 유전자 다형성 rs10061133을 확인하는 단계; 및, (b) eNOS의 유전자 다형성 rs1799983, 및 TNF-α의 유전자 다형성 rs1800630을 확인하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다. 이 때, rs10061133의 유전자형이 AG+GG 이고 rs1799983의 유전자형이 GG 이며, rs1800630 의 유전자형이 CA+AA인 경우에 상기 개체의 습관성 유산 발생 가능성이 높을 것으로 예측할 수 있다.
본 발명은 다른 양태로서 miR-449b 유전자 다형성 rs10061133, eNOS의 유전자 다형성 rs1799983, 및 TNF-α의 유전자 다형성 rs1800630으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 결합할 수 있는 프로브 또는 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는, 습관성 유산의 발생 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 프로브는 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다.
본 발명에서 상기 프라이머는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명의 상기 습관성 유산의 발생 예측용 조성물에 있어서, 이에 제한되는 것은 아니나, 조성물은 바람직하게는 서열번호 9 내지 14로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 서열번호 9 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하고, 서열번호 11 내지 14로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 또 다른 양태로서 miR-449b 유전자 다형성 rs10061133, eNOS의 유전자 다형성 rs1799983, 및 TNF-α의 유전자 다형성 rs1800630으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 결합할 수 있는 프로브 또는 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는, 습관성 유산의 발생 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 습관성 유산의 발생 예측용 키트에 있어서, 프로브 또는 프라이머에 대한 각 부분의 제한사항은 상기 습관성 유산의 발생 예측용 조성물에서 기재한 바와 중복되어, 이하 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명에서 상기 키트는 상술한 습관성 유산의 발생 예측용 조성물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 키트는 본 발명의 습관성 유산의 발생 예측에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 예측용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 예측용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 예측용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 양태로서 miR-449b 유전자 다형성 rs10061133, eNOS의 유전자 다형성 rs1799983, 및 TNF-α의 유전자 다형성 rs1800630으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 결합할 수 있는 프로브 또는 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는, 습관성 유산의 발생 예측용 DNA칩 또는 SNP칩을 제공한다.
본 발명의 상기 습관성 유산의 발생 예측용 DNA칩 또는 SNP칩에 있어서, 프로브 또는 프라이머에 대한 각 부분의 제한사항은 상기 습관성 유산의 발생 예측용 조성물에서 기재한 바와 중복되어, 이하 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명에서 상기 DNA칩은 검출하고자 하는 핵산에 상보적인 서열을 갖는 핵산 프로브와, 검출 대상의 핵산의 사이의 하이브리다이제이션 반응을 이용하여 핵산을 해석하는 장치이다. 대체로 수cm의 각 슬라이드 글래스나 실리콘 기판에 10 내지 105　종류의 DNA 핵산쇄가 프로브로서 고정화된다. DNA칩을 사용하여 검체가 해석되는 경우, 우선, 포함되는 핵산을 형광 색소나 방사성 동위 원소 등에 의해 표지하고, 이어서 칩 상의 프로브와 반응시킨다. 검체 중의 핵산이 칩 상의 프로브에 상보적인 핵산을 포함시키면 하이브리다이제이션이 발생한다. 칩 상에 고정된 프로브는 그 서열과 고정 위치가 명확하다. 따라서, 표지 유래의 신호가 얻어지는 칩 상의 위치를 특정함으로써 검체 중에 포함되는 핵산의 서열을 결정할 수 있다. 바이오칩, 핵산 칩, DNA 어레이, 또는 DNA 마이크로어레이(DNA Microarray) 등과 동일한 개념으로서 서로 교환 가능하게 사용된다. 바이러스 및/또는 세균 등으로부터 유래하는 유전자 등의 특정한 핵산의 검출, 유전자 발현량의 측정, 다형에 대한 유전자형의 동정 및/또는 변이의 유무 검출을 위해 사용되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 SNP칩은 DNA칩에 포함되는 개념이다. DNA칩을 이용하는 목적이 다형성 판단일 경우에 상기 칩을 SNP칩으로 정의할 수 있다.
본 발명은 또 다른 양태로서 miR-449b 유전자 다형성 rs10061133, eNOS의 유전자 다형성 rs1799983, 및 TNF-α의 유전자 다형성 rs1800630으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현 억제제, 또는 발현된 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 습관성 유산의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 발현 억제제는 miR-449b 유전자 다형성 rs10061133, eNOS의 유전자 다형성 rs1799983, 또는 TNF-α의 유전자 다형성 rs1800630에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드,　siRNA, shRNA 및 마이크로RNA로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 특정 DNA 또는 RNA 타겟에 대해 안티센스(또는 상보)인 짧은 길이의 DNA 합성 가닥(또는 DNA 아날로그)으로서, 생체 내 뿐만 아니라 생체 외에서도 유전자-특이적 억제를 달성하기 위해 사용되는 것이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 타겟에 결합하고 전사, 번역 또는 스플라이싱의 단계에서 발현을 멈추게 함으로써 DNA 또는 RNA 타겟에 의해 인코드된 단백질의 발현을 막기 위해 제안되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포 배양 및 질병의 동물 모델에서도 성공적으로 이용되어 왔다. 올리고뉴클레오타이드가 분해되지 않도록 더욱 안정하고 저항적이 되게 하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 또 다른 변형이 당업자에게 알려져 있고 이해된다. 여기서 사용된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형된다. 이들 변형은 당분야에 알려져 있는 올리고뉴클레오타이드 백본의 변형, 당 모이어티의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
상기 siRNA(small interfering RNA)는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자치료 방법으로 사용되는 것이다. 본 발명에서 siRNA 분자가 이용되는 경우, 센스 가닥과 안티센스 가닥이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조 또는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 불일치(mismatch)(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 팽창/돌출(bulge)(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. siRNA 말단 구조는 타겟 유전자의 발현을 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다. 상기 siRNA분자는 이에 제한되지는 않으나, 전체 길이가 15 내지 30 염기, 바람직하게는 19 내지 21 염기일 수 있다.
상기 shRNA(short hairpin RNA)은 45 내지 70 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 단일가닥의 RNA로서, 타겟유전자 siRNA 염기서열의 센스가닥과 상보적인 안티센스가닥 사이에 3-10개의 염기 링커를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후, 플라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스(lentivirus) 및 아데노 바이러스(adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 루프(loop)가 있는 헤어핀 구조의 shRNA가 만들어지고 세포내의 다이서(dicer)에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타낸다.
상기 마이크로 RNA(microRNA)는 발생, 분화, 증식, 보존 및 아폽토시스 등 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 마이크로 RNA는 일반적으로 타겟 mRNA를 불안정하게 하거나, 번역을 방해함으로써 타겟 mRNA를 코딩하는 유전자의 발현을 조절한다.
상기 안티센스 올리고 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA를 지닌 발현 컨스트럭트/벡터에 유용한 조절 서열(예를 들어, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 그의 결합) 역시 당분야에서 공지된 내용으로부터 적절히 선택할 수 있으며, 상기 유전자의 발현 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA 외에도 상기 유전자의 발현을 억제하는 물질이면 어떤 것이든 가능하다.
본 발명에서 상기 발현된 단백질의 활성 억제제는 miR-449b 유전자 다형성 rs10061133, eNOS의 유전자 다형성 rs1799983, 또는 TNF-α의 유전자 다형성 rs1800630에 특이적인 항체, 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 것일 수 있다. 여기서의 "단백질 활성 억제"란, 단백질에 특이적인 항체 또는 그 항원 결합 단편으로 타겟 단백질의 활성을 억제하는 것을 의미한다.
상기 항체란는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 보다 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(Light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(Heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
이하 상기 본 발명을 실시예에 입각하여 상세히 설명한다.
본 발명의 바이오마커는 특정 유전자들 간의 다형성 조합에 따라 유산 위험성을 정확도 높게 예측 가능하므로, 의료 및 보건 분야에서 활발하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른, 다양한 유전자의 다형성 조합 중에서 RPL 그룹과 대조군 그룹간 교차값(odds)이 현저히 증가한 조합을 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
[실험방법]
1. 비교 대상의 정의
대한민국 종합병원과 난임클리닉에 등록한 53명의 RPL 진단 여성, 및 50명의 건강한(RPL 진단되지 않은) 여성이 본 연구의 시험군 및 대조군으로 그룹화되었다. 모든 여성들은 21-35일 간격으로 규칙적인 월경을 하는 20세에서 40세 사이의 여성이었고, 병원이나 클리닉 방문 전 3개월 이내에 유산을 경험한 여성은 제외되었다. RPL 그룹은 임신 20주 이전에 2회 이상의 생화학적 임신 또는 임신 손실이 있는 경우였고, 대조군 그룹은 자연 유산의 병력이 없는 산모였다. 본 연구는 연세대학교 의료원 세브란스병원 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받아 연구에 참여한 모든 산모의 동의 후 수행되었으며, 헬싱키 선언의 원칙을 준수하였다(IRB No. 4-2018-0997).
2. 생화학적 분석
그룹의 임상적 특성화를 위해 월경주기(menstrual cycle day; MCD) #2와 #5 사이의 RPL 그룹과 대조군 그룹 산모로부터 정맥혈 3 ㎖를 수득하였다. 헤모글로빈, 혈소판, 및 백혈구 분석을 수행하였고, 자연살해세포 수는 유세포 분석법으로 분석하였다. Clotting assay와 chromogenic assay로 Aptt(activated partial thromboplastin time), PT(prothrombin time), antithrombin III, protein C(기능적), 및 LA(lupus coagulant)와 같은 응고 변소를 측정하였고, 임상적으로 RPL과 관련이 있다고 추정되는 항체로서 anti-β2GP1 IgG, anti-β2GP1 IgM, anti-cardiolipin antibody (ACA) IgG, ACA IgA, ACA IgA Quantitation, TSH Receptor antibody, thyroglobulin antibody, and thyroid peroxidase antibody를 효소 결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay), 박층 면역분석법(thin layer immunoassay), 또는 전기화학발광 면역분석법(electrochemiluminescence immunoassay)으로 분석하였다. 호모시스테인(Homocysteine)과 엽산(folate) 수치는 화학발광 면역측정법(chemiluminescent immunoassay)으로 분석하였다.
3. 유전학적 분석
RPL 그룹과 대조군 그룹 산모의 응고되지 않은 말초 혈액으로부터 게놈 DNA를 QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen, Redwood, CA, USA)로 추출하고, miRNA(miR-27a, miR-449b), LEPR, KDR, 또는 eNOS를 암호화하는 유전자를 SNP 지노타이핑으로 분석하였다. 돌연변이 분석을 위해 Applied Biosystems E7500 Fast real-time PCR system (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 상에서 택맨 프로브 어세이(Taqman probe assay)를 수행하였다. TNF-α의 경우 MnlI for polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) 방법으로 유전자 조각을 분석하였다. PCR 증폭용 음성 대조군으로는 증류수를 이용하였고, PCR 증폭을 위한 프라이머는 하기 표 1에 나타내었다.
서열번호 SNP Primer 서열 (5'-> 3')
서열번호 1 LEPR
(rs1137101)		 Forward TCCTGCTTTAAAAGCCTAATCCAGTATTT
서열번호 2 Reverse AGCTAGCAAATATTTTTGTAAGCAAT
서열번호 3 LEPR
(rs7516341)		 Forward AATGSCTGAGTTCCGTGGAT
서열번호 4 Reverse AGAYGATGGTTTCTACA
서열번호 5 KDR
(rs2071559)		 Forward CGCCAAATATTTTGGGAAATAGCGGGAAAG
서열번호 6 Reverse TTGTTTGGCCAGTATAATTGTAGTTTAAAACG
서열번호 7 miR-27a
(rs895819)		 Forward GAACTTAGCCACTGTGAACACCAC TTGG
서열번호 8 Reverse TTGCTTCCTGTCACAAATCACATTG
서열번호 9 miR-449b
(rs10061133)		 Forward GGTATCCAGAGCACTTCATTGACA
서열번호 10 Reverse ACCTGAATCAGGTAGGCAGTGTCT
서열번호 11 eNOS
(rs1799983)		 Forward CATGAGGCTCAGCCCCAGAAC
서열번호 12 Reverse AGTCAATCCCTTTGGTGCTCAC
서열번호 13 TNF-α
(rs1800630)		 Forward AGGAATGGGTTACAGGAGACCACT
서열번호 14 Reverse TCTACATGGCCCTGTCTTCGTTGAG
4. 통계 분석
RPL 그룹과 대조군 그룹의 임상변수는 평균±표준편차로 계산하였고, Student's t-test를 이용하여 비교하였다. 모든 통계 분석은 MedCalc Software (MedCalc software, Mariakerke, Belgium)를 이용하였고, P < 0.05 를 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다. 유전자형 분포와 대립유전자 빈도는 Fisher's exact test, 또는 χ2 test를 이용하여 분석하였고, 일배체형 분석을 위해서는 SNPAlyze Ver. 9.0 Standard (DYNACOM Co., Ltd., Yokohama, Japan) 소프트웨어를 이용하였다. 각 SNP 마커와 RPL 위험성 간의 연관성 분석을 위해 교차비(odds ratio; OR), 상대비(relative ratio; RR), 및 95% 신뢰구간(confidence intervals; CI)을 계산하였다.
[실험결과]
1. 비교 대상의 특성 분석
RPL 그룹과 대조군 그룹 산모의 인구학적 특성을 비교한 결과, 대조군 그룹의 평균 연령은 39.80 ± 4.54세, RPL 그룹의 평균 연령은 36.42 ± 3.23세로 통계적으로 유의한 차이를 보였다(P<0.05). 체질량 지수와 같은 인구학적 특성의 다른 요인은 두 그룹 간에 통계적으로 차이가 없었다. 임상 변수로는 RPL 그룹의 평균 hemoglobin 수치(g/dL)만 대조군 그룹보다 유의하게 높았다(각각 13.02 ± 1.16, 12.25 ± 1.72, P < 0.05). 응고 관련 변수 중에서 protein C 수준(%)이 RPL 그룹과 대조군 그룹 사이에 차이가 있었으나(각각 111.89 ± 17.05, 102.49 ± 21.62, P < 0.05), 모두 정상 범위 내인 것으로 분석되었다. Antithrombin, PT, aPTT와 같은 다른 요인들은 두 그룹 간에 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. LA, ACA IgG/IgM, 및 anti-2GP1 IgG/ IgM을 포함하는 일차 항인지질 항체의 분석 결과, anti-β2GP1 IgG와 ACA IgM만이 RPL 그룹에서 상승하였으나, 정상 범위 내로 통계적으로 유의한 차이는 없었다. 임신한 여성에서 착상을 손상시키고 태반 기능 부전을 유발하는 것으로 보고된 homocysteine (μmol/L)은 대조군 그룹에서 9.80 ± 2.51, RPL 그룹에서 8.65 ± 2.25로 대조군 그룹에서 약간 높았으나, 모두 정상 범위(5.0 μmol/L-15.0 μmol/L) 내였다. 상기 결과를 표 2에 나타내었다.
Characteristics Controls (n = 50) RPL patients (n = 53) P value
Age, year 39.80 ± 4.54 36.42 ± 3.23 < 0.001***
BMI, kg/m2 22.97 ± 7.02 22.19 ± 3.73 0.48
Previous pregnancy losses None 2.62 ± 0.92 N/A
Live births 1.52 ± 0.61 None N/A
Hb, g/dL 12.25 ± 1.72 13.02 ± 1.16 0.009**
WBC, 103/μL 5.84 ± 1.95 6.28 ± 2.17 0.283
ATIII, % 97.14 ± 7.49 97.28 ± 10.59 0.939
Protein C
(functional), %		 102.49 ± 21.62a 111.89 ± 17.05 0.016*
Protein S (immunological), % 75.94 ± 14.76 75.72 ± 14.05 0.938
LA 0.85 ± 0.05 0.84 ± 0.06 0.362
Anti-β2GP1 IgG (G units) 3.67 ± 3.66 3.83 ± 4.35 0.841
Anti-β2GP1 IgM (M units) 6.00 ± 7.12 5.63 ± 5.13 0.762
ACA IgG, GPL 6.79 ± 6.45 4.57 ± 5.37 0.06
ACA IgM, MPL 5.58 ± 2.79 6.79 ± 3.94 0.077
IgA quantitation, mg/dL 215.14 ± 90.80 234.30 ± 96.10 0.301
TSH Rc Ab, IU/L - -
Thyroglobulin Ab, IU/mL - -
TPO Ab, IU/mL 29.46 ± 72.23b 32.16 ± 83.70c 0.865
NK cells, % 15.16 ± 8.14 15.21 ± 7.00 0.973
Homocysteine, μmol/L 9.80 ± 2.51 8.65 ± 2.25 0.016*
Folate, ng/mL 14.66 ± 16.46 20.21 ± 17.30d 0.102
Platelet, Thousand/μL 288.80 ± 82.79 284.79 ± 59.39 0.777
PT, INR 0.99 ± 0.05 0.99 ± 0.06 1.000
aTT, sec 37.20 ± 3.73 36.23 ± 3.31 0.165
Values are presented as mean ± standard deviation.
RPL = recurrent pregnancy loss, BMI = body mass index, Hb = hemoglobin, WBC = white blood cell, ATIII = antithrombin III, LA = lupus anticoagulant, GPL = IgG phospholipid units, MPL = IgM phospholipid units, ACA = anti-cardiolipin antibody, TSH = thyroid-stimulating hormone, TPO = thyroid peroxidase, NK = natural killer, PT = prothrombin time, INR= international normalized ratio, aPTT = activated partial thromboplastin time, N/A = not available.
aValue for 49 control subjects; bValue for 48 control subjects; cValue for 50 RPL patients; dValue for 51 RPL patients.
* P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001.
2. 유전학적 차이 분석
RPL 그룹과 대조군 그룹간 LEPR, eNOS, KDR, miR-27a, miR-449b, 및 TNF-α 다형성의 지노타이핑 분석 결과는 하기 표 3에 나타내었다. LEPR, eNOS, KDR 및 TNF-α의 경우 서로 다른 유전자형이 RPL 그룹과 대조군 그룹간에 비슷한 분포를 보였으며, 통계적으로 유의미한 OR은 계산되지 않았다. miR-27a (A>G)의 경우, 대조군 그룹에서 가장 흔한 유전자형은 AG형이었으나, RPL 그룹에서 가장 흔한 유전자형은 AA형이었다. AA형을 기준으로 한 AG형의 OR은 0.84, 95% CI는 0.37~1.90(P=0.673)이었다. miR-449b (A>G) 다형성의 유전자형 AG형은 유전자형 AA와 비교할 때, RPL 위험성과 가장 유의미한 연관성을 보였다(AA vs. AG: OR, 2.39, 95% CI, 1.05-5.44; RR, 1.61, 95% CI, 1.01-2.57). 그러나 우성 및 열성 유전자형 모델을 포함한 다른 유전자형은 RPL 위험성과 유의미한 연관성을 나타내지 않았다.
Genotype Controls
(n = 50) 		RPL patients
(n = 53) 		OR (95% CI) P value
LEPR rs1137101(G>A)
GG 37 (74.0) 38 (71.7) 1
GA 12 (24.0) 15 (28.3) 1.22 (0.50-2.95) 0.663
AA 1 (2.0) 0 0.32 (0.01-8.23) 0.495
Dominant (GG vs. GA+AA) 1.12 (0.47-2.68) 0.793
Recessive (GG+GA vs. AA) 0.31 (0.01-7.75) 0.475
LEPR rs7516341(T>C)
CC 37 (74.0) 47 (88.7) 0.42 (0.02-10.66) 0.601
TC 13 (26.0) 5 (9.4) 0.14 (0.00-3.87) 0.243
TT 0 1 (1.9) 1 　
Dominant
(TT vs. TC+CC)		 　 　 0.35 (0.01-8.71) 0.519
Recessive (TT+TC vs. CC) 　 　 2.75 (0.95-7.94) 0.061
eNOS rs1799983(G>T)
GG 44 (88.0) 43 (81.1) 1
GT 6 (12.0) 8 (15.1) 1.36 (0.44-4.26) 0.593
TT 0 2 (3.8) 5.11 (0.24-109.64) 0.297
Dominant (GG vs. GT+TT) 1.71 (0.57-5.10) 0.340
Recessive (GG+GT vs. TT) 4.90 (0.23-104.69) 0.309
KDR rs2071559(T>C)
TT 23 (46.0) 27 (50.9) 1 　
TC 19 (38.0) 24 (45.3) 1.08 (0.47-2.44) 0.861
CC 8 (16.0) 2 (3.8) 0.21 (0.04-1.10) 0.066
Dominant (TT vs. TC+CC) 　 　 0.82 (0.38-1.78) 0.616
Recessive (TT vs. TC+CC) 　 　 0.21 (0.04-1.02) 0.053
miR-27a rs895819(A>G)
AA 23 (46.0) 24 (45.3) 1
AG 24 (48.0) 21 (39.6) 0.84 (0.37-1.90) 0.673
GG 3 (6.0) 8 (15.1) 2.56 (0.60-10.84) 0.203
Dominant (AA vs. AG+GG) 1.03 (0.47-2.24) 0.942
Recessive (AA vs. AG+GG) 2.79 (0.69-11.17) 0.148
miR-449b rs10061133(A>G)
AA 30 (60.0) 22 (41.5) 1 　
AG 16 (32.0) 28 (52.8) 2.39 (1.05-5.44) 0.039*
GG 4 (8.0) 3 (5.7) 1.02 (0.21-5.04) 0.978
Dominant (AA vs. AG+GG) 　 　 2.11 (0.96-4.64) 0.062
Recessive (AA vs. AG+GG) 　 　 0.69 (0.15-3.25) 0.639
TNF-α rs1800630(C>A)
CC 37 (74.0) 34 (64.2) 1
CA 11 (22.0) 14 (26.4) 1.39 (0.55-3.46) 0.486
AA 2 (4.0) 5 (9.4) 2.72 (0.49-14.96) 0.250
Dominant (CC vs. CA+AA) 1.59 (0.68-3.70) 0.282
Recessive
(CC+CA vs. AA)		 　 　 2.50 (0.46-13.52) 0.287
Values are presented as number (%) of cases.
eNOS = endothelial nitric oxide synthase, KDR = kinase insert domain-containing receptor, TNF = tumor necrosis factor, RPL = recurrent pregnancy loss, OR = odds ratio; CI = confidence interval.
* P < 0.05.
한국인 RPL 그룹과 대조군 그룹간 eNOS 894G>T, miR-499b A>G, 및 TNF-α-863C>A 다형성의 조합 분석 결과는 하기 표 4에 나타내었고, 교차값(odds)이 현저히 증가한 조합을 도 1에 나타내었다. 조합 분석을 위해 eNOS/miR-449b/TNF-α의 지배적 모델(각각 GG vs. GT+TT, AA vs. AG+GG, CC vs. CA+AA)을 평가한 결과, 다양한 유전자형 조합 중에서 eNOS/miR-449b/TNF-α에 대한 유전자형 GG/AG+GG/CA+AA는 참조된 다른 유전자형에 비해 RPL 위험성이 7.36배 더 높은 것으로 나타났다(OR, 7.36, 95% CI, 1.34-40.55; RR, 4.50, 95% CI, 1.11-18.27). eNOS/miR-449b 조합만 분석하더라도 GG/AG+GG 조합의 유전자형은 참조된 다른 유전자형에 비해 RPL 위험성이 2.43배나 더 높았고(OR, 2.43, 95% CI, 1.03-5.75; RR, 1.57, 95% CI, 1.00-2.44), miR-449b/TNF-α의 조합 유전자형 AG+GG/CA+AA도 RPL 위험성 증가와 상당한 연관성을 보였다(OR, 7.60, 95% CI, 1.47-39.29; RR, 4.67, 95% CI,1.17-18.63). 그러나 GG/CA+AA 조합의 유전자형과 다른 모든 eNOS/TNF-α의 유전자형 조합은 RPL 위험성 증가와 통계적으로 유의한 연관성을 나타내지 않았다.
Combined genotype Controls
(n = 50) 		RPL patients
(n = 53) 		OR (95% CI) P value
eNOS/miR-449b/TNF-α
GG/AA/CC 18 (36.0) 11 (20.8) 1
GG/AA/CA+AA 9 (18.0) 6 (11.3) 1.09 (0.30-3.91) 0.894
GG/AG+GG/CC 15 (30.0) 17 (32.1) 1.85 (0.67-5.15) 0.236
GG/AG+GG/CA+AA 2 (4.0) 9 (17.0) 7.36 (1.34-40.55) 0.022*
GT+TT/AA/CC 1 (2.0) 4 (7.5) 6.55 (0.65-66.35) 0.112
GT+TT/AA/CA+AA 2 (4.0) 1 (1.9) 0.82 (0.07-10.12) 0.876
GT+TT/AG+GG/CC 3 (6.0) 2 (3.8) 1.09 (0.16-7.59) 0.930
GT+TT/AG+GG/CA+AA 0 3 (5.7) 11.26 (0.53-238.56) 0.120
eNOS/miR-449b
GG/AA 27 (54.0) 17 (32.1) 1 　
GG/AG+GG 17 (34.0) 26 (49.1) 2.43 (1.03-5.75) 0.043*
GT+TT/AA 3 (6.0) 5 (9.4) 2.65 (0.56-12.53) 0.220
GT+TT/AG+GG 3 (6.0) 5 (9.4) 2.65 (0.56-12.53) 0.220
eNOS/TNF-α
GG/CC 33 (66.0) 28 (52.8) 1
GG/CA+AA 11 (22.0) 15 (28.3) 1.61 (0.64-4.06) 0.316
GT+TT/CC 4 (8.0) 6 (11.3) 1.77 (0.45-6.90) 0.412
GT+TT/CA+AA 2 (4.0) 4 (7.5) 2.36 (0.40-13.85) 0.343
miR-449b/TNF-α
AA/CC 19 (38.0) 15 (28.3) 1 　
AA/CA+AA 11 (22.0) 7 (13.2) 0.81 (0.25-2.58) 0.717
AG+GG/CC 18 (36.0) 19 (35.8) 1.34 (0.53-3.41) 0.543
AG+GG/CA+AA 2 (4.0) 12 (22.6) 7.60 (1.47-39.29) 0.016*
Values are presented as number (%) of cases.
eNOS = endothelial nitric oxide synthase, TNF = tumor necrosis factor, RPL = recurrent pregnancy loss, OR = odds ratio, CI = confidence interval.
* P < 0.05.
RPL 그룹과 대조군 그룹간 3가지 miRNA 다형성(eNOS G>T, miR-499b A>G 및 TNF-α C>A)의 일배체형 분석 결과는 하기 표 5에 나타내었고, 교차값(odds)이 현저히 증가한 조합을 도 1에 나타내었다. 분석 결과, 3가지 다형성의 유전자형 모델 중에서 G-G-A 일배체형은 RPL 위험성 증가와 관련이 있었다(OR, 19.31, 95% CI, 1.09-342.87; RR, 16.72, 95% CI, 0.99-283.13; P = 0.051). miR-449b/TNF-α의 2가지 다형성의 유전자형 모델 중에서 G-A 일배체형 또한 RPL 위험성 증가와 관련이 있었으나(OR, 22.08, 95% CI, 1.26-385.34; RR, 18.87, 95% CI, 1.13-315.40; P = 0.041), eNOS/miR-449b 또는 eNOS/TNF-α 다형성 조합의 유전자형 모델 중에서는 어느 것도 RPL 위험성 증가와 유의미한 연관성을 보이지 않았다.
Haplotype Controls
(2n = 100) 		RPL patients
(2n = 106) 		OR (95% CI) P value
eNOS/miR-449b/TNF-α
G-A-C 58 (58.0) 51 (48.1) 1
G-A-A 14 (14.0) 12 (11.3) 0.97 (0.41-2.30) 0.954
G-G-C 22 (22.0) 22 (20.8) 1.14 (0.56-2.29) 0.719
G-G-A 0 (0.0) 8 (7.5) 19.31 (1.09-342.87) 0.044*
T-A-C 3 (3.0) 7 (6.6) 2.65 (0.65-10.80) 0.173
T-A-A 1 (1.0) 2 (1.9) 2.27 (0.20-25.83) 0.507
T-G-C 2 (2.0) 2 (1.9) 1.14 (0.15-8.37) 0.900
T-G-A 0 2 (1.9) 5.68 (0.27-121.06) 0.266
eNOS/miR-449b
G-A 72 (72.0) 63 (59.4) 1 　
G-G 22 (22.0) 31 (29.2) 1.61 (0.85-3.06) 0.146
T-A 4 (4.0) 9 (8.5) 2.57 (0.76-8.76) 0.131
T-G 2 (2.0) 3 (2.8) 1.71 (0.28-10.59) 0.562
eNOS/TNF-α
G-C 80 (80.0) 74 (69.8) 1
G-A 14 (14.0) 20 (18.9) 1.54 (0.73-3.28) 0.258
T-C 5 (5.0) 8 (7.5) 1.73 (0.54-5.52) 0.355
T-A 1 (1.0) 4 (3.8) 4.32 (0.47-39.58) 0.195
miR-449b/TNF-α
A-C 61 (61.0) 58 (54.7) 1 　
A-A 24 (24.0) 24 (22.6) 1.05 (0.54-2.06) 0.883
G-C 15 (15.0) 14 (13.2) 0.98 (0.44-2.21) 0.964
G-A 0 (0.0) 10 (9.4) 22.08 (1.26-385.34) 0.034*
Values are presented as number (%) of cases.
eNOS = endothelial nitric oxide synthase, TNF = tumor necrosis factor, RPL = recurrent pregnancy loss, OR = odds ratio, CI = confidence interval.
* P < 0.05.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (15)

  1. 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-449b 유전자 다형성 rs10061133, 및 TNF-α의 유전자 다형성 rs1800630을 확인하는 단계를 포함하는, 습관성 유산의 발생 예측 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 방법은,
    eNOS의 유전자 다형성 rs1799983을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 방법은 rs10061133의 유전자형이 AG+GG 이고 rs1799983의 유전자형이 GG 일 경우, 상기 개체의 습관성 유산 발생 가능성이 높을 것으로 예측하는 것인, 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 방법은 rs10061133의 유전자형이 AG+GG 이고 rs1800630 의 유전자형이 CA+AA 인 경우, 상기 개체의 습관성 유산 발생 가능성이 높을 것으로 예측하는 것인, 방법.
  5. 제 2항에 있어서,
    상기 방법은 rs10061133와 rs1799983의 일배체 유전자형이 G-G 인 경우, 상기 개체의 습관성 유산 발생 가능성이 높을 것으로 예측하는 것인, 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 방법은 rs10061133와 rs1800630 의 일배체 유전자형이 G-A 인 경우, 상기 개체의 습관성 유산 발생 가능성이 높을 것으로 예측하는 것인, 방법.
  7. miR-449b 유전자 다형성 rs10061133에 결합할 수 있는 프로브 또는 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머, 및 TNF-α의 유전자 다형성 rs1800630에 결합할 수 있는 프로브 또는 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는, 습관성 유산의 발생 예측용 조성물.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 조성물은 eNOS의 유전자 다형성 rs1799983에 결합할 수 있는 프로브 또는 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 조성물은 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 13, 및 서열번호 14로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 조성물.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 조성물은 서열번호 11, 및 서열번호 12로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  11. miR-449b 유전자 다형성 rs10061133에 결합할 수 있는 프로브 또는 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머, 및 TNF-α의 유전자 다형성 rs1800630에 결합할 수 있는 프로브 또는 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는, 습관성 유산의 발생 예측용 키트.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 키트는 eNOS의 유전자 다형성 rs1799983에 결합할 수 있는 프로브 또는 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 추가로 포함하는 것인, 키트.
  13. miR-449b 유전자 다형성 rs10061133의 발현 억제제 또는 발현된 단백질의 활성 억제제, 및 TNF-α의 유전자 다형성 rs1800630의 발현 억제제 또는 발현된 단백질의 활성 억제제를 포함하는, 습관성 유산의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 발현 억제제는 miR-449b 유전자 다형성 rs10061133, 또는 TNF-α의 유전자 다형성 rs1800630에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드,　siRNA, shRNA 및 마이크로RNA로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 약학조성물.
  15. 제 13항에 있어서,
    상기 발현된 단백질의 활성 억제제는 miR-449b 유전자 다형성 rs10061133, 또는 TNF-α의 유전자 다형성 rs1800630에 특이적인 항체, 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 것인, 약학조성물.
KR1020220179009A 2022-12-20 2022-12-20 습관성 유산 예측용 바이오마커 KR102576154B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220179009A KR102576154B1 (ko) 2022-12-20 2022-12-20 습관성 유산 예측용 바이오마커

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220179009A KR102576154B1 (ko) 2022-12-20 2022-12-20 습관성 유산 예측용 바이오마커

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR102576154B1 true KR102576154B1 (ko) 2023-09-12

Family

ID=88019641

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020220179009A KR102576154B1 (ko) 2022-12-20 2022-12-20 습관성 유산 예측용 바이오마커

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102576154B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101169653B1 (ko) * 2011-12-09 2012-08-03 의료법인 성광의료재단 마이크로 알엔에이 염기서열 다형을 이용한 원인불명 반복 자연 유산 진단에 필요한 정보제공 방법 및 진단용 조성물
KR20190123928A (ko) * 2018-04-25 2019-11-04 (주) 메디젠휴먼케어 Hmgb1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 증상 예측 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101169653B1 (ko) * 2011-12-09 2012-08-03 의료법인 성광의료재단 마이크로 알엔에이 염기서열 다형을 이용한 원인불명 반복 자연 유산 진단에 필요한 정보제공 방법 및 진단용 조성물
KR20190123928A (ko) * 2018-04-25 2019-11-04 (주) 메디젠휴먼케어 Hmgb1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 증상 예측 방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Jang, Hyo Geun et al., ‘Polymorphisms in tumor necrosis factor-alpha (- 863C> A,- 857C> T and+ 488G> A) are associated with idiopathic recurrent pregnancy loss in Korean women’, Human Immunology, 2016 *
Luo, L. et al., ‘Polymorphisms in the endothelial nitric oxide synthase gene associated with recurrent miscarriage’, Genet Mol Res, 2013, 12.3: 3879-86. *
Rah, HyungChul et al., ‘miR-27a and miR-449b polymorphisms associated with a risk of idiopathic recurrent pregnancy loss’, PLoS One, 2017, 12.5: e0177160. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10407738B2 (en) Markers for breast cancer
US20190203295A1 (en) Methods of predicting complication and surgery in crohn&#39;s disease
US20050130193A1 (en) Methods for detecting, diagnosing and treating human renal cell carcinoma
KR20220153109A (ko) Rnaset2를 통한 염증성 장 질환의 진단 방법
US20100305103A1 (en) Genes differentially expressed in bipolar disorder and/or schizophrenia
RU2014146594A (ru) Способы лечения анкилозирующего спондилита с использованием антагонистов il-17
KR102576154B1 (ko) 습관성 유산 예측용 바이오마커
KR101657051B1 (ko) 만성폐쇄성폐질환 진단용 마커 조성물
US10428384B2 (en) Biomarkers for post-traumatic stress states
EP2904107B1 (en) Methods for vel blood group typing
WO2008067459A9 (en) Single nucleotide polymorphisms associated with amyotrophic lateral sclerosis
KR101873903B1 (ko) 고혈압의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트
WO2024138106A1 (en) Compositions and methods for identification of hypomorphic p53 variants
Pruner et al. The C20068T gene variant in the 3end of the prothrombin gene and recurrent pregnancy loss: A pilot study
WO2020136216A1 (en) Methods of identifying subjects having or at risk of having a coagulation related disorder
JP5235448B2 (ja) 糖尿病性腎症感受性遺伝子、および糖尿病性腎症の予防または治療剤の有効成分のスクリーニング方法
JP2023516497A (ja) Ｉｌ３３にリスクアレルを有する対象を治療するための治療方法
KR20210119131A (ko) 천식 진단 및 중증도와 치료 반응 예측용 조성물
WO2012070510A1 (ja) 心筋梗塞のリスク検査法
JP2005295948A (ja) 骨髄異形成症候群特異的遺伝子同定方法
KR20120001916A (ko) 아스피린 과민성 천식의 진단용 ｓｎｐ 유전자 세트

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant