KR20210098918A - Usp12의 발현량 검출을 이용한 줄기세포의 노화 진단용 조성물 - Google Patents

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Abstract

탈유비퀴틴(deubiquitin) 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 단백질의 발현량을 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 포함하는 줄기세포의 노화 진단용 조성물에 관한 것으로, 줄기세포의 노화 진행 여부를 판별할 수 있어 세포치료제에 사용되는 줄기세포의 품질을 평가하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

USP12의 발현량 검출을 이용한 줄기세포의 노화 진단용 조성물{Composition for diagnosing aging of stem cells using USP12 expression level detection}
탈유비퀴틴(deubiquitin) 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 단백질의 발현량을 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 포함하는 줄기세포의 노화 진단용 조성물에 관한 것이다.
각종 난치성 질환에 대해 기존의 치료 요법의 한계를 극복하려는 노력의 일환으로, 손상된 세포를 대체하고 재생시켜 본래 기능의 회복을 목표로 줄기세포를 이용한 재생의학적 세포 치료 연구가 전 세계적으로 활발히 진행되고 있다. 특히 여러 줄기세포들 중 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)는 자가재생(self-renewal) 능력과 다양한 조직의 세포로의 분화(differentiation) 능력을 지니며 면역거부반응을 억제시키고 체내 투여 시, 손상부위로 이동하여 손상된 세포를 대체하거나 다양한 성장인자 및 사이토카인들을 분비하여 질환의 억제 및 손상 부위의 재생을 촉진시킨다는 연구결과들을 토대로 매우 다양한 질환 치료에 적용하려는 노력이 활발하게 진행되고 있다.
한편, 최근 다양한 질환 등에서 자가 줄기세포를 이용한 다양한 치료 결과들이 보고되고 있다. 줄기세포는 기증자의 상태에 따라 영향을 받을 수 있는데, 노인의 줄기세포는 세포 노화에 의해 젊은이의 줄기 세포에 비해 기능이 떨어질 수 있다. 따라서, 줄기세포의 노화에 관여하는 효소의 규명이 필요하다.
일 양상은 탈유비퀴틴(deubiquitin) 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 단백질의 발현량을 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 포함하는 줄기세포의 노화 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 줄기세포의 노화 진단용 키트를 제공하는 것이다.
다른 양상은 줄기세포로부터 탈유비퀴틴 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 줄기세포의 노화 예측 또는 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 탈유비퀴틴(deubiquitin) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 촉진제를 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 증식, 분화 또는 노화 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 탈유비퀴틴(deubiquitin) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 촉진제를 유효성분으로 포함하는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공하는 것이다.
을 코딩하는 유전자의 발현 촉진제를 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 증식, 분화 또는 노화 억제용 조성물을 제공한다. 또 다른 양상은 줄기세포에 탈유비퀴틴(deubiquitin) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 촉진시키는 단계를 포함하는, 줄기세포의 증식, 분화 또는 노화를 억제시키는 방법을 제공한다. 상기 탈유비퀴틴 단백질을 코딩하는 유전자의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
일 구체예에서, 상기 탈유비퀴틴 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 촉진제는 PDGF 등인 것일 수 있다. 상기 탈유비퀴틴 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 촉진시킴으로써 탈유비퀴틴 단백질의 발현이 증가되는 바, 줄기세포의 증식, 분화 또는 노화가 억제될 수 있다. 일 실시예에서 줄기세포에 USP1의 발현을 촉진하는 제제를 처리함으로써, 줄기세포의 골 분화능이 향상되었음을 확인하였다. 따라서, 일 양상에 따른 조성물은 탈유비퀴틴 단백질의 발현을 증가시킴으로써 줄기세포의 중식, 분화 또는 노화를 억제할 수 있는바, 상기 조성물이 처리된 줄기세포를 골 형성, 분화를 촉진시키기 위한 세포치료제로서 활용할 수 있다.
다른 양상은 탈유비퀴틴(deubiquitin) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 촉진제를 유효성분으로 포함하는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공한다. 또 다른 양상은 개체에 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 투여하는 것을 포함하는 노화 관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 탈유비퀴틴 단백질을 코딩하는 유전자의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 상기 노화 관련 질환은 예를 들어, 관절염 또는 골다공증 등인 것일 수 있다.
상기 세포치료제 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 혈액 내 투여될 수 있다.
상기 조성물은 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 세포치료제 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다.
유효한 양(therapeutically effective amount)은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 세포치료제는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 상기 조성물에는 1×104 cell/kg 내지 1×108 cell/kg의 세포치료제가 포함될 수 있다.
상기 세포치료제는 USP1의 발현을 촉진함으로써 줄기세포의 증식이 촉진되는바, 노화관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 탈유비퀴틴 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 단백질의 발현량을 측정하는 제제에 의하여 줄기세포의 노화를 판별하는 것에 관한 것으로, in vitro 세포배양으로 증식된 줄기세포 또는 환자에서 분리된 줄기세포에서 노화가 진행되었는지 여부를 판별할 수 있어 세포치료제에 사용되는 줄기세포의 품질을 평가하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 중간엽줄기세포의 계대수에 따른, 노화 관련 유전자의 발현을 확인한 그래프이다.
도 2는 중간엽줄기세포의 계대수에 따른, 텔로미어의 길이를 확인한 그래프이다.
도 3은 중간엽줄기세포의 계대수에 따른, 베타-갈락토시다아제 염색을 확인한 결과이다.
도 4는 중간엽줄기세포의 노화가 진행되는 동안, 탈유비퀴틴 효소의 변화 프로파일링을 멀티플렉스 PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 5는 중간엽줄기세포의 노화가 진행되는 동안, 탈유비퀴틴 효소의 변화 프로파일링을 마이크로어레이를 통해 확인한 결과이다.
도 6은 중간엽줄기세포의 계대수별 탈유비퀴틴화 유전자의 발현 비율을 나타낸 그래프이다.
도 7(a)는 중간엽줄기세포의 계대수별 USP1, USP12 및 TNFα1P3의 발현여부를 나타낸 것이고, 도 7(b)는 USP1을 siRNA로 낙다운 시킨 후, 중간엽 줄기세포에서의 USP1 유전자 발현을 확인한 것이다.
도 8은 siRNA로 USP1을 낙다운 시킨 후, 중간엽줄기세포의 노화 관련 유전자의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 9a는 중간엽줄기세포에 USP1의 발현 억제제를 처리한 후, 세포 증식 정도를 흡광도(O.D) 값으로 나타낸 그래프이다.
도 9b는 중간엽줄기세포에 USP1의 발현 촉진제를 처리한 후, 세포 증식 정도를 흡광도(O.D) 값으로 나타낸 그래프이다.
도 9c는 중간엽줄기세포에 USP1의 발현 촉진제 및/또는 억제제를 처리한 후, 세포 증식 정도를 흡광도(O.D) 값으로 나타낸 그래프이다.
도 10a는 노화가 진행된 중간엽줄기세포에서 골 분화 여부를 Alizarin Red S 염색으로 확인한 결과이다.
도 10b는 중간엽줄기세포에 USP1의 발현 촉진제를 처리한 후, 중간엽줄기세포에서의 골 분화 여부를 Alizarin Red S 염색으로 확인한 결과이다.
도 10c는 중간엽줄기세포에 USP1의 발현 억제제를 처리한 후, 중간엽줄기세포에서의 골 분화 여부를 Alizarin Red S 염색으로 확인한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 줄기세포의 확보
동의를 얻은 건강한 성인의 지방조직을 수득하여, 메스로 잘게 자른 후 콜라게나제 Type Ⅰ을 넣고, 37℃ 진탕배양기(shaking incubation)에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 이후, 5분 동안 수직으로 세워서 지질과 지방세포를 분리시키고 상층액을 제거한 후, 남아있는 세포들을 셀 스트레이너(cell strainer)로 걸러내어 지방유래 중간엽줄기세포를 획득하였다.
상기 지방유래 중간엽줄기세포 계대배양 1단계(P1) 세포의 계대배양은 세포의 증식능이 멈출때까지 반복하였고, 계대수 별로 각각 분리하여 보관하였다.
실시예 2. 중간엽줄기세포의 세포노화 여부 확인
상기 실시예 1에서 획득한 지방유래 중간엽줄기세포의 세포노화 여부를 확인하기 위하여, 세포노화의 직접적인 표지로서 노화된 세포에서 모노사카라이드로의 가수분해를 촉진하는 효소인 SA-β-Gal(Senescence-associated beta-galactosidase)의 활성을 확인하였다. 구체적으로, Cell Signaling Technology로부터 Senescence-β-Galactosidase Staining Kit를 구입하여 ADMSCs 각각의 계대수(계대 1, 계대 3, 계대 5, 계대 7, 계대 9, 및 계대 11)에서 염색의 변화를 관찰하였다.
도 1은 중간엽줄기세포의 계대수에 따른, 노화 관련 유전자의 발현을 확인한 그래프이고, 도 2는 텔로미어의 길이를 확인한 그래프이다.
도 1에 나타난 바와 같이, 계대수가 증가할수록 노화 관련 유전자의 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, cdk 억제제의 일종인 p16의 발현의 경우, P1 보다 P7 및 P14에서 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 2에 나타난 바와 같이, 계대수가 증가할수록 텔로미어의 길이가 짧아지는 것을 확인할 수 있었다. 텔로미어는 세포분열이 진행될수록 길이가 점점 짧아져서, 노화와 수명을 결정하는 원인으로 추정되고 있는바, 실시예 1에서 획득한 중간엽줄세포의 계대수가 증가할수록 노화되었음을 알 수 있다.
도 3은 중간엽줄기세포의 계대수에 따른, 베타-갈락토시다아제 염색 여부를 확인한 결과이다. 도 3에 나타난 바와 같이, 계대수가 증가할수록 중간엽줄기세포에서 베타-갈락토시다아제로 염색된 비율이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 특히, 계대수 1과 비교하여 계대수 11에서 상기 비율이 5배 이상 증가한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 탈유비퀴틴 효소의 변화 프로파일링
3-1. 대용량 중합효소 연쇄반응(multiplex polymerase chain reaction, multiplex PCR)
대용량 중합효소 연쇄반응은 복수의 프라이머쌍을 동시에 사용하여, 복수의 표적 유전자를 같은 반응액 중에서 증폭하는 방법으로서, 상기 실시예 1에서 획득한 중간엽줄기세포 P1, P7, 및 P15에서 발현되는 78개의 탈유비퀴틴 효소를 비교하였다. 상기 효소는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다. 먼저, 대용량 중합효소 연쇄반응을 위한 RNA를 추출하고, cDNA를 합성하였다. 구체적으로 세포가 100㎜ 디쉬에 80~90% 정도 포화되었을 때 1㎖의 TRIzol 시약(Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)을 이용하여 세포를 용해(lysis)시켜 RNA를 추출하였다. 이후, ReverTra Ace qPCR Master Mix (Toyobo Life Science, Osaka, Japan)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
다음으로, 상기에서 합성한 cDNA 및 UbiProtein Corporation (Seongnam, Korea)에서 구입한 프라이머(Catalog Number MDCheck101 - MDCheck111)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 PCR을 수행하였다(78 DUB genes)[ref: Kim SY, Kwon SK, Lee SY, and Baek KH: Ubiquitin-specific peptidase 5 and ovarian tumor deubiquitinase 6A are differentially expressed in p53+/+ and p53-/- HCT116 cells. Int J Oncol. 2018.]. 구체적으로, 2X Multiplex PCR Smart Mix (Catalog Number SMP01-M25h; Solgent Co., Ltd., Daejeon, Korea)을 이용하여, 95℃에서 15분 동안 초기 변성(denaturation)시킨 후, 95℃에서 20초로 40 사이클을 진행하였다. 이후, 60℃에서 40초간 어닐링(anneling) 과정을 거치고, 72℃에서 1분, 72℃에서 3분간 연장(extension) 과정을 거쳤다. 증폭된 중합효소 연쇄반응 생성물은 2% 아가로즈 젤에서 분리하였고, StaySafe Nucleic Acid Gel Stain (Catalog Number RSS01; Real Biotech Corpration; RBC, Taipei, Taiwan)으로 염색하였다. 이때, GAPDH를 대조군 유전자로 사용하였으며, ImageJ v1.4.3.6를 이용하여 분석하였다.
USP5 USP11 USP34 JOSD2 EIF3S3 OTUD3 UCHL5 PAPR11
USP8 USP13 USP18 EIF3S5 ZRANB1 OTUD4 MYSM1 USP36
USP4 USP12 USP21 Ataxin3 OTUB1 YOD1 USP38 USP24
USP9X USP14 USP16 STAMBP OTUD1 OTUD7A USP31 MPND
USP51 USP15 USP33 COPS5 TNFAIP3 USP35 USP28 USP32
USP27 USP54 USP53 PRPF8 OTUD5 USP26 BAP1 USP39
USP47 USP48 USP3 PSMD14 VCPIP1 USP17 CYLD USP37
USP42 USP46 USP19 PSMD7 OTUB2 USP50 USP43 USPL1
USP35 USP52 JOSD1 COPS6 OTUD6B USP9Y USP20 　
USP1 USP10 BRCC3 STAMBPL1 OTUD7B USP7 USP22 　
도 4는 중간엽줄기세포의 노화가 진행되는 동안, 탈유비퀴틴 효소의 변화 프로파일링을 멀티플렉스 PCR을 통해 확인한 결과이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 중간엽줄기세포의 계대수가 증가할수록 USP12, USP14, USP15의 발현량은 증가하고, USP52의 발현량은 감소하는 것을 확인할 수 있었다(group 2). 또한, USP10 및 USP53의 발현량(group 3), PSMD14, PSMD7 및 COPS6의 발현량(group 5) 역시 중간엽줄기세포의 계대수가 증가할수록 증가하는 것을 확인할 수 있었다. Group 6의 경우, 중간엽줄기세포의 계대수가 증가할수록 OTUD1의 발현량은 감소하고, TNFαIP3의 발현량은 증가하며 Group 8의 경우, USP17의 발현량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 중간엽줄기세포의 계대수가 증가할수록 UCHL5(group 9) 및 USP31(group 10)의 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
3-2. 마이크로어레이(microarray) 분석
중간엽줄기세포의 계대배양 초기와 후기의 유전적 발현의 차이를 확인하기 위하여 마이크로어레이 분석을 실시하였다. 상기 실시예 1에서 획득한 P7 및 P15의 중간엽기세포의 탈유비퀴틴 효소 발현량을 스크리닝 하였다. 먼저, ND-1000 Spectrophotometer(NanoDrop, Wilmington, USA), Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, USA)를 이용하여 상기 실시예 3-1에 추출한 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 다음으로, 제조사의 프로토콜(GeneChip Whole Transcript PLUS reagent Kit)을 따라 Affymetrix Whole transcript Expression array를 수행하였다. 구체적으로, cDNA는 GeneChip WT(Whole Transcript) Amplification kit를 이용하여 제작하였다. 이후, 주형 cDNA를 GeneChip WT Terminal labeling kit을 이용하여 조각 내고, TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase)이 결합된 biotin을 상기 cDNA 말단에 라벨링 하였다.
비오틴이 라벨링된 DNA target 5.5 ㎍을 Affymetrix GeneChip Human 2.0 ST Array와 45℃에서 16시간 동안 혼성화하였다. 세척 후 GeneChip Fluidics Station 450에 염색하고, GCS3000 Scanner (Affymetrix)에서 스캔하였다. 이후, Signal values를 Affymetrix® GeneChip?? Command Console software을 이용하여 확인하였다. Raw data는 Affymetrix GeneChip® Command Console® Software (AGCC) 프로그램을 이용하여 확보하였다. CEL files로 되어 있는 data를 Affymetrix® Expression Console?? Software (EC)에 있는 robust multi-average (RMA) method를 사용하여 normalization 하였다. 이후, differentially expressed gene (DEG) analysis 분석 시행하였다. 구체적으로, 실험군과 대조군의 fold change 값을 비교하였으며, Gene-Enrichment와 Functional Annotation analysis는 gene ontology (http://geneontology.org/)와 KEGG (http://kegg.jp)를 이용하여 분석하였다.
도 5는 중간엽줄기세포의 노화가 진행되는 동안, 탈유비퀴틴 효소의 변화 프로파일링을 마이크로어레이를 통해 확인한 결과이다.
도 5에 나타난 바와 같이, 세포가 노화하면서 다양한 탈유비퀴틴화 효소들이 변화를 보였으나, 그 중 USP1이 -2,45배 감소하여 가장 큰 차이를 보이는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 중간엽줄기세포의 생존, 분화능 조절 확인
상기 실시예 3에서 선정된 탈유비퀴틴화 효소의 계대수별 유전자 발현 변화를 mRNA와 단백질 수준에서 관찰하기 위해 PCR을 수행하였다.
먼저, 상기 실시예 1에서 수득한 중간엽줄기세포 계대별(P1, P7, P15) 1 x 105 cell 당 Trizol 용액 1000㎕을 첨가하여 갈아준 후, 4℃, 12,000 x g에서 10분간 원심분리 하였다. 상층액을 새 튜브로 옮긴 후, 클로로포름을 첨가하고, 세게 흔들어 주었다. 다시 상층액을 새 튜브로 옮기고 상층액과 이소프로판올의 비율이 1:1이 되도록 이소프로판올을 첨가하였다. 10회 세게 흔든 다음 실온에서 15분 동안 방치하고, 12,000 x g, 4℃에서 10분간 원심분리 시킨 후 상층액을 제거하고, 남은 침전물에 70% 에탄올 1 ㎖을 가한 후 7,500 x g, 4℃에서 5분 동안 원심분리 하였다. 에탄올을 제거한 후 RNA 침전물이 담긴 튜브를 실온에서 15분 동안 건조시키고, nuclease free water를 사용하여 RNA pellet을 용해시켰다. UV/VIS spectrophotometer(Beckman coulter, DU730)를 이용하여 260 nm 및 280 nm 파장에서 추출된 RNA 시료의 농도를 측정하고, 아가로즈 젤 전기영동을 실시하여 RNA 시료의 integrity를 확인하였다.
중간엽줄기세포에서 추출된 RNA시료를 대상으로 oligo dT primer와 superscript reverse transcriptase (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD, USA)을 이용하여 reverse transcription을 수행함으로써 cDNA를 합성하였다. Reverse transcription을 통해 얻은 cDNA를 template로 하고 증폭하고자 하는 유전자 cDNA의 5'과 3' flanking sequence를 primer로 사용하여 PCR을 수행하였으며, 이때 사용된 primer sequence를 [표 2]에 나타냈다. 증폭된 PCR 산물 1 ㎕를 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 DNA band를 확인하였다.
유전자 프라이머 서열번호 염기서열 (5’→3') 어닐링 온도
(℃)
USP1 F 1 TCAAGTTGTTCCTGCTGCAC 70
R 2 TGCAGCTTCCCTTATCCTTC
USP12 F 3 TACATGGACCAGCTTCATCG 70
R 4 GATTGGGACCACTTCCACAG
TNFαIP3 F 5 TGGTTCCAATTTTGCTCCTT 70
R 6 CGTTGATCAGGTGAGTCGTG
도 6은 중간엽줄기세포의 계대수별 탈유비퀴틴화 유전자의 발현 비율을 나타낸 그래프이다. 도 6에 나타난 바와 같이, 계대수가 증가할수록 USP12 및 TNFαIP3 유전자의 발현 비율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 상기 실시예 3-1의 대용량 중합효소 연쇄반응 결과와 일치하는 것을 확인할 수 있다. 도 7(a)는 중간엽줄기세포의 계대수별 USP1, USP12 및 TNFα1P3의 유전자 발현여부를 나타낸 것이고, 도 7(b)는 USP1을 siRNA로 낙다운 시킨 후, 중간엽 줄기세포에서의 USP1 유전자 발현을 확인한 것이다.
도 7(a)에 나타난 바와 같이, 중간엽줄기세포의 계대수가 증가할수록 USP1 및 USP12의 발현량이 감소하며, TNFα1P3의 발현량은 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 7(b)에 나타난 바와 같이, USP1을 siRNA로 낙다운 시킨 경우, USP1의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
또한 이전에 보고된 논문(1. Wenjia Liu, Meng Qi, Anna Konermann, Liqiang Zhang, Fang Jin, Yan Jin. 2015. The p53/miR-17/Smurf1 pathway mediates skeletal deformities in an age-related model via inhibiting the function of mesenchymal stem cells. Aging. 3, 205-218.
2. Li Y, Hu J, Guan F, Song L, Fan R, Zhu H, Hu X, Shen E, Yang B. 2013. Copper induces cellular senescence in human glioblastoma multiforme cells through downregulation of Bmi-1. Oncol Rep. 5, 1805-1810)들을 통해 노화에 관련된 유전자들의 프라이머를 제작하였다. 후보군 유전자가 낙다운(knock down)되거나 과발현 되었을 때 노화에 관련된 유전자들의 변화를 mRNA 수준에서 관찰하기 위해 si-RNA를 구입하고, gene cloning을 하여 형질주입(transfection)을 수행하였다. 후보군 유전자 중 USP1을 siRNA로 낙다운 시킨 후, 중간엽줄기세포의 노화 관련 유전자를 분석하였다.
도 8은 siRNA로 USP1을 낙다운 시킨 후, 중간엽줄기세포의 노화 관련 유전자의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 8에 나타난 바와 같이, USP1을 siRNA로 낙다운 시킨 경우, p16, p21, p53 및 TNF-β의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, IGFβP3의 발현량은, 유의한 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 노화된 중간엽줄기세포에서 USP1의 발현을 억제함으로써, cdk 억제제의 발현을 증가시키므로, DNA 주기의 G1기의 정지를 야기시킬 수 있는바 세포의 분열을 억제할 수 있다.
실시예 5. USP1의 발현 조절을 통한 중간엽줄기세포의 증식 확인
USP1의 발현이 증가 또는 감소됨으로써 중간엽줄기세포의 증식이 조절됨을 확인하기 위해, USP1 발현 촉진제 및 억제제를 처리하였다. 구체적으로, USP1 발현 촉진제인 PDGF-bb를 중간엽줄기세포에 2~3일 간격으로 5일 동안 처리하였다. 또한, USP1 발현 억제제는 DMSO에 1000:1의 비율로 희석한 pimozide 용액을 중간엽줄기세포에 2~3일 간격으로 5일 동안 처리하였다. 이후, 배양액 100 ㎍ 당 10 ㎍의 CCK-8 용액 희석하여, 중간엽줄기세포에 처리한 후, 450㎚ 대 파장에서의 흡광 정도를 측정하였다. 도 9a는 중간엽줄기세포에 USP1의 발현 억제제를 처리한 후, 세포 증식 정도를 흡광도(O.D) 값으로 나타낸 그래프이다.
도 9a에 나타난 바와 같이, USP1의 발현 억제제인 Pimozide를 처리한 경우, 450㎚ 대 파장의 흡광도가 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, USP1의 발현이 감소하는 경우, 중간엽줄기세포의 증식이 억제 될 수 있다.
도 9b는 중간엽줄기세포에 USP1의 발현 촉진제를 처리한 후, 세포 증식 정도를 흡광도(O.D) 값으로 나타낸 그래프이다.
도 9b에 나타난 바와 같이, USP1의 발현 촉진제인 PDGF를 처리한 경우, 450㎚ 대 파장의 흡광도가 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, UPS1의 발현이 증가하는 경우, 중간엽줄기세포의 증식이 촉진될 수 있다.
도 9c는 중간엽줄기세포에 USP1의 발현 촉진제 및/또는 억제제를 처리한 후, 세포 증식 정도를 흡광도(O.D) 값으로 나타낸 그래프이다.
도 9c에 나타난 바와 같이, USP1의 발현 촉진제인 PDGF를 처리한 경우에는 무처리 대조군에 비하여 450㎚ 대 파장의 흡광도가 증가하였고, USP1의 발현 억제제인 Pimozide를 처리한 경우에는 무처리 대조군에 비하여 450㎚ 대 파장의 흡광도가 감소하였으며, 촉진제 및 억제제를 동시에 처리한 경우에는 억제제 처리군에 비하여 450㎚ 대 파장의 흡광도가 증가한 것을 확인할 수 있었다. 따라서, USP1의 발현 촉진제는 중간엽줄기세포의 증식을 촉진시키고, USP1의 발현 억제제는 중간엽줄기세포의 증식을 억제시킴을 알 수 있다.
실시예 6. 노화된 중간엽줄기세포에서의 골 분화(osteogenesis) 확인
노화가 진행된 지방유래 중간엽줄기세포에서의 골 분화를 Alizarin Red S 염색을 통해 평가하였다. 구체적으로, 노화가 진행된 지방유래 중간엽줄기세포와 대조군인 초기 계대(early passage) 중간엽줄기세포를 골형성 분화 배지에서 2~3일에 한번 배지를 교체해주며 14~21일 동안 배양하였다. 이후, 2%의 물에 희석시킨 Alizarin Red 용액을 5분 동안 처리하고 세포염색 여부를 현미경을 통해 확인하였다.
도 10a는 노화가 진행된 중간엽줄기세포에서 골 분화 여부를 Alizarin Red S 염색으로 확인한 결과이다.
도 10a에 나타난 바와 같이, 골 분화 초기와 비교하여 후기에서의 흡광도가 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 즉, 노화가 진행된 중간엽줄기세포에서는 골 분화가 진행됨에 따라 골 형성이 감소됨을 알 수 있다.
노화가 진행된 지방유래 중간엽줄기세포에서 USP1의 발현의 증가 또는 감소 여부에 따라 골 분화가 증가 또는 감소되는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, USP1 발현 촉진제인 PDGF 20 ng/㎖과 억제제인 pimozide 3μM를 각각 골 형성 분화배지에 섞어 처리한 지방유래 중배엽줄기세포를 2~3일에 한 번 배지를 교체해주며 14~21일 동안 배양하였다. 이후, 2%의 물에 희석시킨 Alizarin Red 용액을 5분 동안 처리하고 세포염색 여부를 현미경을 통해 확인하였다.
도 10b는 중간엽줄기세포에 USP1의 발현 촉진제를 처리한 후, 중간엽줄기세포에서의 골 분화 여부를 Alizarin Red S 염색으로 확인한 결과이다.
도 10b에 나타난 바와 같이, PDGF를 처리한 중간엽줄기세포에서 흡광도가 유의적으로 증가하였으며, USP1의 발현 증가는 중간엽줄기세포에서의 골 분화를 증가시킴을 알 수 있다.
도 10c는 중간엽줄기세포에 USP1의 발현 억제제를 처리한 후, 중간엽줄기세포에서의 골 분화 여부를 Alizarin Red S 염색으로 확인한 결과이다.
도 10c에 나타난 바와 같이, Pimozide, ML323를 처리한 중간엽줄기세포에서 흡광도가 유의적으로 감소하였으며, USP1의 발현 감소는 중간엽줄기세포에서의 골 분화를 감소시킴을 알 수 있다.
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Claims (1)

  1. 탈유비퀴틴(deubiquitin) 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 단백질의 발현량을 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 포함하는 줄기세포의 노화 진단용 조성물로서,
    상기 탈유비퀴틴 단백질은 USP14, USP15, USP10, USP53, PSMD14, PSMD7, COPS6, UCHL5, USP31, USP52, OTUD1 및 USP17으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 단백질, USP12, TNFαIP3 및 USP1이며,
    상기 줄기세포는 골수, 제대, 제대혈, 지방, 근육, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나에서 분리된 것인, 조성물.
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