KR100794694B1 - 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자로부터 유래되는 인간배아줄기세포의 분화 또는 미분화 검출용 마커, 프라이머,또는 이를 이용한 검출 방법 - Google Patents

탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자로부터 유래되는 인간배아줄기세포의 분화 또는 미분화 검출용 마커, 프라이머,또는 이를 이용한 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특정한 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자로부터 유래되는 뉴클레오티드 또는 상보적 뉴클레오티드로 이루어진, 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출용 마커 또는 인간 배아줄기세포의 미분화 검출용 마커, 이를 포함하는 마이크로어레이를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 뉴클레오티드 및 상보적 뉴클레오티드로 이루어진, 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출 또는 인간 배아줄기세포의 미분화 검출을 위한 증폭용 프라이머쌍을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출 방법 또는 인간 배아줄기세포의 미분화 검출 방법을 제공한다.
탈유비퀴틴화 효소, 인간 배아 줄기 세포

Description

탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자로부터 유래되는 인간 배아줄기세포의 분화 또는 미분화 검출용 마커, 프라이머, 또는 이를 이용한 검출 방법{Markers or primers for detecting differentiation or undifferentiation of human embryonic stem cells derived from genes coding deubiquitinating enzymes and methods for detecting using the same}
도 1은 미분화된 인간 배아줄기세포 및 혈관 내피세포에서의 탈유비퀴틴화 효소의 발현량을 역전사 중합효소 연쇄 반응으로 측정한 결과를 나타낸다.
본 발명은 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자로부터 유래되는 인간 배아줄기세포의 분화 또는 미분화 검출용 마커 및 프라이머에 관한 것이며, 또한, 이를 이용한 인간 배아줄기세포의 분화 또는 미분화 검출 방법에 관한 것이다.
생물체에서 일어나는 수많은 신진대사는 유비퀴틴화와 탈유비퀴틴화에 의해 조절된다. 상기 유비퀴틴(Ubiquitin, Ub)은 76개의 아미노산으로 구성되어 있고, 분자량이 8,565 달톤인 비교적 작은 단백질로서 모든 진핵세포에 존재하며, 단백질의 선택적인 분해 및 세포 분열의 조절 등 수많은 세포 내의 기능에 관여한 다(Annu. Rev. Nutr. 15, 161-189 (1995); Annu. Rev. Biochem. 61, 761-807 (1992); Annu. Rev. Genet. 26, 179-207 (1992); Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 4606-4601 (1991); Nature 349, 132-138 (1991); Annu. Rev. Cell Biol. 3, 1-30 (1987); Mol. Cell. Biol. 6, 4602-4610 (1986)). 유비퀴틴에 의해 매개되는 단백질 분해과정은 표적 단백질들에 유비퀴틴이 결합함으로써 시작된다. 이러한 과정에는 ubiquitin activating enzyme (E1), ubiquitin carrier proteins (E2), ubiquitin ligase (E3), ubiquitin factors (E4) 등이 관여하게 된다. 유비퀴틴화된 단백질들은 26S 프로테아좀에 의해 인식되게 되고, ATP 의존적으로 반응이 진행되게 된다. 이렇게 유비퀴틴화된 단백질들은 탈유비퀴틴화 됨으로써 단백질의 분해를 막을 수 있다. 이러한 탈유비퀴틴화는 탈유비퀴틴화 효소에 의해 진행되는데, 유비퀴틴이 결합되어 있는 단백질에서 유비퀴틴을 자르는 역할을 하며, 잘려진 유비퀴틴은 다시 다른 단백질과 결합할 수 있게 된다. 탈유비퀴틴화 효소는 C-terminal hydrolases (UCH), the ubiquitin specific processing proteases (UBP or USP), Jab1/Pad1/MPN domain-containing metallo enzymes (JAMM), Otu-domain ubiquitin-aldehyde-binding proteins (Otubain), Ataxin-3/Josephin 등으로 나눌 수 있다.
한편, 배아줄기세포는 전지전능한 세포로서 외배엽, 중배엽과 내배엽을 포함하는 배아의 전체에서 생긴다. 인간 배아줄기세포는 배반포의 내부 세포 괴(inner cell mass)로부터 분리된다. 인간 배아줄기세포는 시험관 내(in vitro)에서 배아체 형성에 의해 다양한 조직으로 분화될 수 있다. 시험관 내(in vitro)에서 인간 배아 줄기세포가 특정 세포로 분화되는 특성은 임상적용에 있어 매우 유용하다.
수정된 배아는 분화 과정을 거쳐 외배엽(epiblast)으로 분화하게 되고 외배엽의 경우, 3개의 배아 배엽층(germ layer)으로 분화하는데, 이 중에 중배엽 계통으로 분화를 하게 되면 이것이 BMP 신호전달의 영향에 의해 HSC와 내피 세포(endothelial cell)의 전구체 격인 헴안지오블라스트(hemangioblast)로 분화하고, 다시 안지오블라스트(angioblast)로 분화하여 응집(aggregation)되면, 내피세포 (endothelial cell)로 최종 분화한다. 이렇게 분화된 내피세포는 원종 세포 (progenitor cell)의 형태로 존재하다가 순환을 하면서 성숙한 형태로 말초 혈액(peripheral blood)에 존재하게 된다. 내피세포(endothelial cell)는 크게 두 가지 과정을 거쳐 혈관을 형성하게 되는데 먼저, 내피 전구세포(endothelial progenitor cell)가 혈관 분화 (vasculogenesis)라는 과정을 거쳐 새로운 혈관을 형성함으로써 원시관을 형성하게 되고 이것이 신생혈관분화(angiogenesis) 과정을 거쳐 이미 존재하고 있는 원시관에서 새로운 혈관을 만든다. 이러한 혈관 형성은 먼저 안지오블라스트(angioblast)의 응집체(aggregate)가 혈관 분화 (vaculogenesis)를 통해 배아분화 (embryogenesis) 동안 원시관을 형성하고 이것이 신생혈관 분화 (angiogenesis)를 거쳐 성숙한 혈관계를 형성한다.
상기 인간 배아줄기세포는 인간 상실배의 내부세포 괴로부터 공지의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 제조된 인간 배아줄기세포는 계대 배양을 비롯한 다양한 방법으로 배양하거나 동결건조 등에 의해 보존시킨 후 이를 해동하여 적절한 배지에서 배양하여, 연구에 사용되게 된다. 그러나, 상기 계대배양 또는 동결건조-해동 후의 배양에 의해 얻어진 인간 배아줄기세포가 보존 및/또는 배양 조건에 따라 미분화 상태를 유지하지 못하는 경우가 발생함으로써, 이를 이용한 연구결과에 영향을 미치는 것을 배제할 수 없다. 따라서, 배양 중에 있는 인간 배아줄기세포가 미분화 상태를 유지하고 있는지 여부를 검출할 수 있는 방법이 당업계에 요구된다.
또한, 인간 배아줄기세포를 인위적으로 혈관 내피 세포로 분화시키는 경우에도 얻어지는 세포가 적절한 분화 단계를 거쳐 혈관 내피 세포로 분화된 것인지 여부를 확인할 수 있는 방법이 당업계에 요구되고 있다.
본 발명자들은 인간 배아줄기세포의 분화 과정 동안 발현의 차이를 보이는 유전자들에 대한 연구를 수행하던 중, 놀랍게도 인간 배아줄기세포의 분화 과정, 특히 혈관 내피 세포로의 분화 과정에서 특정 탈유비퀴틴화 효소의 유전자가 특이적으로 발현하거나 발현량이 유의성 있게 차이를 나타낸다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 특정한 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자로부터 유래되는 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출용 마커 또는 이를 포함한 마이크로어레이를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자로부터 유래되는 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출을 위한 증폭용 프라이머쌍을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 특정한 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자로부터 유래되는 인간 배아줄기세포의 미분화 검출용 마커 또는 이를 포함한 마이크로어레이를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자로부터 유래되는 인간 배아줄기세포의 미분화 검출을 위한 증폭용 프라이머쌍을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 인간 배아줄기세포의 미분화 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 1 내지 29의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자로부터 선택된 10 ∼ 100 개의 연속 뉴클레오티드 또는 상보적 뉴클레오티드로 이루어진, 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출용 마커가 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출용 마커를 포함하는 마이크로어레이가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 서열번호 1 내지 29의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자로부터 선택된 10 ∼ 100 개의 연속 뉴클레오티드 또는 상보적 뉴클레오티드로 이루어진, 인간 배 아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출을 위한 증폭용 프라이머쌍이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 서열번호 88 내지 94의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자로부터 선택된 10 ∼ 100 개의 연속 뉴클레오티드 또는 상보적 뉴클레오티드로 이루어진, 인간 배아줄기세포의 미분화 검출용 마커가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상기 인간 배아줄기세포의 미분화 검출용 마커를 포함하는 마이크로어레이가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 서열번호 88 내지 94의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자로부터 선택된 10 ∼ 100 개의 연속 뉴클레오티드 또는 상보적 뉴클레오티드로 이루어진, 인간 배아줄기세포의 미분화 검출을 위한 증폭용 프라이머쌍이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 배양 중인 인간 배아줄기세포로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 얻어진 핵산 시료 중, 서열번호 1 내지 29의 폴리뉴클레오티드 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및 핵산 시료 중의 서열번호 1, 5, 6, 9, 11, 12, 15, 20, 및 26로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 유전자가 발현되거나, 서열번호 2, 3, 4, 7, 8, 11, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 및 29로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 유전자가 과발현되는 경우, 상기 배양 중인 인간 배아줄기세포가 혈관 내피 세포로 분화된 것으로 판정하는 단계를 포함하는 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 배양 중인 인간 배아줄기세포로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 얻어진 핵산 시료 중, 서열번호 88 내지 94의 폴리뉴클레오티드 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및 핵산 시료 중의 상기 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자가 과발현되는 경우, 상기 배양 중인 인간 배아줄기세포가 미분화된 것으로 판정하는 단계를 포함하는 인간 배아줄기세포의 미분화 검출 방법이 제공된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 인간 배아줄기세포의 분화 과정 동안 발현의 차이를 보이는 유전자들에 대한 연구를 수행하던 중, 인간 배아줄기세포의 분화 과정, 특히 혈관 내피 세포로의 분화 과정에서 특정한 탈유비퀴틴화 효소의 유전자가 특이적으로 발현하거나 발현량이 유의성 있게 차이를 나타낸다는 것을 발견하였다. 즉, 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 과정에서 탈유비퀴틴화 효소 유전자의 발현 차이를 측정한 결과, 놀랍게도 55개의 탈유비퀴틴화 효소 유전자 중 36개의 탈유비퀴틴화 효소 유전자의 발현량이 차이가 나는 것을 발견하였다. 이 중, 29 개의 탈유비퀴틴화 효소를 유전자가 혈관 내피 세포에서 발현량의 차이를 나타내었으며, 9개의 유전자는 혈관 내피 세포에서만 특이적인 발현을 나타내었고, 20개의 유전자는 혈관 내피 세포에서 유의성 있게 과발현되었다. 또한, 7개의 유전자는 미분화된 인간 배아줄기세포에서 유의성 있게 과발현되었다. 이를 요약하면 다음 표 1a 및 1b와 같다.
서열번호 유전자명 NCBI GenBank 등록번호 비고
1 USP2 NM_004205 특이적 발현
2 USP3 NM_006537 과발현
3 USP4 NM_003363 과발현
4 USP5 NM_003481 과발현
5 USP8 NM_005154 특이적 발현
6 USP9X NM_004652 특이적 발현
7 USP12 NM_182488 과발현
8 USP14 NM_005151 과발현
9 USP15 NM_006313 특이적 발현
10 USP16 NM_006447 과발현
11 USP18 NM_017414 특이적 발현
12 USP20 NM_006676 특이적 발현
13 USP21 NM_012475 과발현
14 USP22 NM_042698 과발현
15 USP24 NM_371254 특이적 발현
16 USP30 NM_032663 과발현
17 USP34 NM_014709 과발현
18 USP36 NM_025090 과발현
19 USP37 NM_020935 과발현
20 USP38 NM_032557 특이적 발현
21 USP39 NM_006590 과발현
22 USP41 NM_036729 과발현
23 USP42 NM_374396 과발현
24 USP46 NM_022832 과발현
25 USP48 NM_032236 과발현
26 USP49 NM_018561 특이적 발현
27 USP52 NM_014871 과발현
28 USP53 NM_019050 과발현
29 USP54 AJ583820 과발현
서열번호 유전자명 NCBI GenBank 등록번호 비고
88 USP17 NM_201402 과발현
89 USP19 NM_006677 과발현
90 USP28 NM_020886 과발현
91 USP32 NM_032582 과발현
92 USP43 AJ583817 과발현
93 USP44 NM_032147 과발현
94 USP51 NM_201286 과발현
따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 29의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자로부터 선택된 10 ∼ 100 개의 연속 뉴클레오티드 또는 상보적 뉴클레오티드로 이루어진, 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출용 마커를 제공한다. 상기 마커는 상기 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자, 즉 서열번호 1 내지 29의 유전자 서열을 기초로, 당업계의 통상적인 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 마커의 길이는 10 ∼ 100 개, 바람직하게는 10 ∼ 50 개, 더욱 바람직하게는 10 ∼ 30 개일 수 있다. 상기 마커는 통상의 방법에 따라 방사선 동위원소 및/또는 형광물질로 표지될 수 있으며, 이를 방사선 사진 및/또는 형광현미경 등을 통하여 검출할 수 있다.
상기 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자는 혈관 내피 세포에서만 특이적으로 발현되는 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자 즉, 서열번호 1, 5, 6, 9, 11, 12, 15, 20, 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
또한 상기 뉴클레오티드 또는 상보적 뉴클레오티드는 상기 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자를 검출할 수 있는 서열로서, 서열번호 30 내지 87로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 이 중, 서열번호 30, 31, 38, 39, 40, 41, 46, 47, 50, 51, 52, 53, 58, 59, 68, 69, 80, 및 81의 서열이 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출용 마커로서 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출용 마커를 포함하는 마이크로어레이를 포함한다. 상기 마이크로어레이는 본 발명에 따른 마커를 사용하여 당업계의 통상적인 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1 내지 29의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자로부터 선택된 10 ∼ 100 개의 연속 뉴클레오티드 또는 상보적 뉴클레오티드로 이루어진, 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출을 위한 증폭용 프라이머쌍을 포함한다.
여기서 "프라이머(primer)"란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트(ATP, GTP, CTP, TTP) 및 DNA 폴리머라제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 10 ∼ 100, 바람직하게는 10 ∼ 50, 더욱 바람직하게는 10 ∼ 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 표적 DNA 즉 상기 서열번호 1 내지 16의 폴리뉴클레오티드로부터 선택된 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 DNA에서 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두 개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 증폭된 산물만을 특이적으로 염색하여 시각화한다. 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다. 여기서 사용되는 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드들이 다른 변성화 과정을 거치게 되면, InfiniumTM Assay 뿐만 아니라 다른 방법들에 의해서도 사용될 수 있다.
상기 프라이머쌍은 서열번호 30 및 31; 서열번호 32 및 33; 서열번호 34 및 35; 서열번호 36 및 37; 서열번호 38 및 39; 서열번호 40 및 41; 서열번호 42 및 43; 서열번호 44 및 45; 서열번호 46 및 47; 서열번호 48 및 49; 서열번호 50 및 51; 서열번호 52 및 53; 서열번호 54 및 55; 서열번호 56 및 57; 서열번호 58 및 59; 서열번호 60 및 61; 서열번호 62 및 63; 서열번호 64 및 65; 서열번호 66 및 67; 서열번호 68 및 69; 서열번호 70 및 71; 서열번호 72 및 73; 서열번호 74 및 75; 서열번호 76 및 77; 서열번호 78 및 79; 서열번호 80 및 81; 서열번호 82 및 83; 서열번호 84 및 85; 및 서열번호 86 및 87로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 30 및 31; 서열번호 38 및 39; 서열번호 40 및 41; 서열번호 46 및 47; 서열번호 50 및 51; 서열번호 52 및 53; 서열번호 58 및 59; 서열번호 68 및 69; 및 서열번호 80 및 81로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출용 마커 및 프라이머로서 바람직하게 사용될 수 있는 서열번호 30 내지 87의 서열은 다음 표 2a 및 2b와 같다.
서열번호 서열
30 5'-TCTTCGTCAGCTGGTGCT-3'
31 5'-ATAGGAGGACGGGGTGTA-3'
32 5'-CCTTGGGTCTGTTTGACT-3'
33 5'-TTATGCCTGTCAGCTGTG-3'
34 5'-AAGCACTGCAAAGTCGAG-3'
35 5'-TAGCACCTGACCCTGGTA-3'
36 5'-GTCCACAAAGACGAGTGC-3'
37 5'-CTAAGGTCAAATCCGCCT-3'
38 5'-ATTTCAAGCAACAGCAGGA-3'
39 5'-GGGTTTTGTCTTTGGAATC-3'
40 5'-TAGCTTCAAGGGTTCCAG-3'
41 5'-CTGTGGCTGATGAAGACT-3'
42 5'-AGTCTCCAAATTCGCCTC-3'
43 5'-GTGGCTATGCTATGGAAG-3'
44 5'-GATGAACCTCCAATGGTAT-3'
45 5'-GGCACAGAACGAATACAC-3'
46 5'-AAACCTCGCTCCGGAAAG-3'
47 5'-CCCTGTTCAACCACCTTT-3'
48 5'-CATGGGAAAGAAACGGAC-3'
49 5'-CTCCTGAGAATTTCTGCC-3'
50 5'-CCTGGAAGTGAAGTCGTG-3'
51 5'-CAAGGAGTTAAGGCAGCA-3'
52 5'-CCTATTGCTGTGGCTGAT-3'
53 5'-GGCATAGCCTCGGAACAT-3'
54 5'-AGTGGGATCCAAGCTACC-3'
55 5'-CTCACAGACTTGGAACGG-3'
서열번호 서열
56 5'-CAGCTTCAAGGTGGACAA-3'
57 5'-AGATGTAGTCCTGGCACA-3'
58 5'-GGCTGGATAACTTTGAACT-3'
59 5'-ACTTTGGATGAAAGTCCTG-3'
60 5'-CAGCGCTTCCTGCGGAC-3'
61 5'-TCCCTGGAGTACTGGGAG-3'
62 5'-AAGACACATCTGGAAGCG-3'
63 5'-CCAAACTCCTGAAGCTGA-3'
64 5'-AAGGACTCGGCTGATGAT-3'
65 5'-GGGGAAAAGCACTTTCTG-3'
66 5'-ACTGGAGGAATTCCAAGG-3'
67 5'-TAAGAAAGCTGCCTGCTG-3'
68 5'-CCTTGTGCAGCATATTCC-3'
69 5'-AGAACTGCAAGAGCACCA-3'
70 5'-CAAGTACTTTCAAGGCCG-3'
71 5'-TGGTACCATCATATGCCC-3'
72 5'-CCTTACGCCAGTGACTAT-3'
73 5'-CAAGGAGTTAAGGCAGCA-3'
74 5'-TAGCAATGGCCTCTGGTA-3'
75 5'-TGGCGTGTCTTTCAATGG-3'
76 5'-GGATGAGGGTAAAAAAGCT-3'
77 5'-CTTCCACAGTGAACGACC-3'
78 5'-CCGAATTGCTTGGTTGGT-3'
79 5'-CAAGTACTGGAGATGCTC-3'
80 5'-GATGCAAACATGTAGGGC-3'
81 5'-TCATTGAGCACGTAGTCC-3'
82 5'-TCTGGCAAGGTTTCCCTG-3'
83 5'-CACGCATCATGCGCAAAT-3'
84 5'-GATATGACACAGACAGCAG-3'
85 5'-AAGGGAACTTCTGCTTCC-3'
86 5'-GGTAGTGTACAAGGGATGTT-3'
87 5'-GAGAGTGTCAGATGGAAGC-3'
본 발명은 또한 서열번호 88 내지 94의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자로부터 선택된 10 ∼ 100 개의 연속 뉴클레오티드 또는 상보적 뉴클레오티드로 이루어진, 인간 배아줄기세포의 미분화 검출용 마커를 제공한다. 상기 마커는 상기 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자, 즉 서열번호 88 내지 94의 유전자 서열을 기초로, 당업계의 통상적인 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 마커의 길이는 10 ∼ 100 개, 바람직하게는 10 ∼ 50 개, 더욱 바람직하게는 10 ∼ 30 개일 수 있다. 상기 마커는 통상의 방법에 따라 방사선 동위원소 및/또는 형광물질로 표지될 수 있으며, 이를 방사선 사진 및/또는 형광현미경 등을 통하여 검출할 수 있다.
상기 뉴클레오티드 또는 상보적 뉴클레오티드는 상기 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자를 검출할 수 있는 서열로서, 서열번호 95 내지 108로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 상기 인간 배아줄기세포의 미분화 검출용 마커를 포함하는 마이크로어레이를 포함한다. 상기 마이크로어레이는 본 발명에 따른 마커를 사용하여 당업계의 통상적인 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 88 내지 94의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자로부터 선택된 10 ∼ 100 개의 연속 뉴클레오티드 또는 상보적 뉴클레오티드로 이루어진, 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출을 위한 증폭용 프라이머쌍을 포함한다.
상기 프라이머쌍은 서열번호 95 및 96; 서열번호 97 및 98; 서열번호 99 및 100; 서열번호 101 및 102; 서열번호 103 및 104; 서열번호 105 및 106; 및 서열번호 107 및 108로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출용 마커 및 프라이머로서 바람직하게 사용될 수 있는 서열번호 95 내지 108의 서열은 다음 표 3과 같다.
서열번호 서열
95 5'-CAAGGAGAGCTCAAGAGA-3'
96 5'-AAGAGAGGTTTAGCAGGG-3'
97 5'-TGTGGGCTACTGCAACCA-3'
98 5'-GCTGAATGGGGTCTCTCT-3'
99 5'-CCCACCTCTCACAGTGAT-3'
100 5'-TACACAGACACTTTTCGGA-3'
101 5'-GTCCCAGATACACTCAGG-3'
102 5'-AATGTGTGACTCCAGCCA-3'
103 5'-CAGAAGCGGAACAGCATC-3'
104 5'-TGCCTTCATGCTAATGCTT-3'
105 5'-ACCGAGTCCATTTGGGCT-3'
106 5'-ACTTCAGGTCTCCAGTTG-3'
107 5'-ACCCCAGAGACTAGGAAA-3'
108 5'-TTCTTTGGCAATCTGTTCTA-3'
본 발명은 또한 배양 중인 인간 배아줄기세포로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 얻어진 핵산 시료 중, 서열번호 1 내지 29의 폴리뉴클레오티드 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및 핵산 시료 중의 서열번호 1, 5, 6, 9, 11, 12, 15, 20, 및 26로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 유전자가 발현되거나, 서열번호 2, 3, 4, 7, 8, 11, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 및 29로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 유전자가 과발현되는 경우, 상기 배양 중인 인간 배아줄기세포가 혈관 내피 세포로 분화된 것으로 판정하는 단계를 포함하는 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출 방법을 포함한다.
또한, 상기 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계는 서열번호 30 및 31; 서열번호 32 및 33; 서열번호 34 및 35; 서열번호 36 및 37; 서열번호 38 및 39; 서열번호 40 및 41; 서열번호 42 및 43; 서열번호 44 및 45; 서열번호 46 및 47; 서열번호 48 및 49; 서열번호 50 및 51; 서열번호 52 및 53; 서열번호 54 및 55; 서열번호 56 및 57; 서열번호 58 및 59; 서열번호 60 및 61; 서열번호 62 및 63; 서열번호 64 및 65; 서열번호 66 및 67; 서열번호 68 및 69; 서열번호 70 및 71; 서열번호 72 및 73; 서열번호 74 및 75; 서열번호 76 및 77; 서열번호 78 및 79; 서열번호 80 및 81; 서열번호 82 및 83; 서열번호 84 및 85; 및 서열번호 86 및 87로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머쌍을 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 또는 실시간 중합효소 연쇄 반응(real time-polymerase chain reaction)을 수행하여 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한 배양 중인 인간 배아줄기세포로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 얻어진 핵산 시료 중, 서열번호 88 내지 94의 폴리뉴클레오티드 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및 핵산 시료 중의 상기 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자가 과발현되는 경우, 상기 배양 중인 인간 배아줄기세포가 미분화된 것으로 판정하는 단계를 포함하는 인간 배아줄기세포의 미분화 검출 방법을 포함한다.
또한, 상기 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계는 서열번호 95 및 96; 서열번호 97 및 98; 서열번호 99 및 100; 서열번호 101 및 102; 서열번호 103 및 104; 서열번호 105 및 106; 및 서열번호 107 및 108로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머쌍을 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 또는 실시간 중합효소 연쇄 반응(real time-polymerase chain reaction)을 수행하여 이루어질 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인간 배아줄기세포의 혈관내피세포로의 분화
인간 배아줄기세포 CHA-hES3 (Biochem Biophys Res Commun . 2006 10;340(2):403-408)를 100 mM MEM 비필수 아미노산, 100 U/ml 페니실린, 0.1 mg/ml 스트렙토마이신, 55 mM-머캅토에탄올, 20% 넉아웃 혈청 대체물(Knockout Serum Replacement)과 4 ng/ml 재조합인간 bFGF (basic fibroblast growth factor, R&D system사)가 포함된 DMEM/F12 (1:1)로 구성된 배양액에서 mitotically incubated STO (ATCC CRL-1503) 세포들 상에서 배양하였다. 배양액은 매일 갈아주었다. 인간 배아줄기세포는 7일 간격으로 새롭게 준비된 STO 세포위로 불에 달군 파스테르 피펫(Pasteur pipettes)을 이용하여 서브클로닝하였다. 모든 배양은 37 ℃, 5% CO2를 유지하였다. 모든 시약은 Gibco BRL 사에서 구입하였다.
배아체(embryoid body)를 형성시킨 후, 젤라틴(gelatin)으로 코팅한 배양 접시에 배아체를 10일간 부착시키고, 내피 세포로의 분화를 유도하기 위해 FBS를 이용한 동시(spontaneous) 분화를 이용하였다. 보다 많은 내피세포 (endothelial cell)을 얻기 위해 내피 세포 마커 (endothelial cell marker)가 표지된 개체군 (population)만을 이용하여 이를 단일 세포 (single cell)로 만들어 분화 과정을 반복하였다.
실시예 2. 탈유비퀴틴화 효소 유전자에 특이적인 프라이머 세트의 제작
모든 탈유비퀴틴화 효소의 유전자들은 길이에 상관없이 UCH라고 하는 부위를 공통적으로 가지고 있어, 해당 부위를 제외하고 각각의 탈유비퀴틴화 효소의 유전자에 특이적인 부위에서 PCR 생성물 길이가 약 350 bp 이하가 되도록 프라이머 세트를 제작하였다. 각각의 유전자 및 NCBI GenBank 등록번호는 표 4a 및 4b와 같다. 또한, 각각의 유전자에 대한 제작된 프라이머 세트는 하기 표 5a 내지 표 5d 와 같다.
유전자명 NCBI GenBank 등록번호
USP1 NM_003368
USP2 NM_004205
USP3 NM_006537
USP4 NM_003363
USP5 NM_003481
USP6 NM_004505
USP7 NM_003470
USP8 NM_005154
USP9X NM_004652
USP9Y NM_004654
USP10 NM_005153
USP11 NM_004651
USP12 NM_182488
USP13 NM_003940
USP14 NM_005151
USP15 NM_006313
USP16 NM_006447
USP17 NM_201402
USP18 NM_017414
USP19 NM_006677
USP20 NM_006676
USP21 NM_012475
USP22 XM_042698
USP24 XM_371254
USP25 NM_013396
유전자명 NCBI GenBank 등록번호
USP26 NM_031907
USP27 XM_372212
USP28 NM_020886
USP29 NM_020903
USP30 NM_032663
USP31 NM_020718
USP32 NM_032582
USP33 NM_015017
USP34 NM_014709
USP35 AJ586137
USP36 NM_025090
USP37 NM_020935
USP38 NM_032557
USP39 NM_006590
USP40 AJ583821
USP41 XM_036729
USP42 XM_374396
USP43 AJ583817
USP44 NM_032147
USP45 AJ583819
USP46 NM_022832
USP47 NM_017944
USP48 NM_032236
USP49 NM_018561
USP50 NM_203494
USP51 NM_201286
USP52 NM_014871
USP53 NM_019050
USP54 AJ583820
USP55 NM_173369
Figure 112006050398937-pat00001
Figure 112006050398937-pat00002
Figure 112006050398937-pat00003
Figure 112006050398937-pat00004
실시예 3. 역전사 중합효소 연쇄 반응
인간 배아줄기세포와 혈관 내피 세포의 총 세포내 RNA는 TRIzolTM 시약(Invitrogen사, 미국)을 이용하여 분리하였다. 분리된 RNA는 50 μL의 DEPC가 처리된 물로 녹였으며 UV 260nm에서 그 농도를 측정하였다. 2 μg의 RNA를 Superscript™ II (Invitrogen사, 미국)를 가지고 제조업체의 지시에 따라 최초 cDNA를 합성하였다. 이러한 cDNA들을 역전사 중합효소 연쇄반응을 위한 주형가닥으로 사용하였다.
실시예 2에서 제작한 프라이머 세트를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응을 수행하였다. 중합효소 연쇄반응 조건은 94 ℃에서 5분 진행하였고 이후 94 ℃에서 40초, 46 ℃에서 40초, 72 ℃에서 40초로 40 사이클을 진행하고, 이후 72 ℃에서 5분간 연장과정을 거쳤다. 증폭된 중합효소 연쇄반응 생성물은 0.8% 아가로즈 젤에서 분리하였고, 에티디움 브라마이드(ethidium bromide)로 염색하였다. 유전자들의 발현량의 표준화를 위해 G3PDH (정방향 프라이머 5'-ACTGGTGCTGCCAAGGCTGT-3', 역방향 프라이머 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3')를 사용하였다.
역전사 중합효소 연쇄 반응을 수행한 결과는 도 1과 같다. 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, USP2(NM_004205), USP15(NM_006313), USP18(NM_017414), USP20(NM_006676), USP8(NM_005154), USP9X(NM_004652), USP24(NM_371254), USP38(NM_032557), USP49(NM_018561)의 탈유비퀴틴화 효소가 혈관 내피 세포에서 특이적이고 발현되었다.
또한, USP3(NM_006537), USP4(NM_003363), USP5(NM_003481), USP12(NM_182488), USP14(NM_005151), USP16(NM_006447), USP21(NM_012475), USP22(NM_042698), USP30(NM_032663), USP34(NM_014709), USP36(NM_025090), USP37(NM_020935), USP39(NM_006590), USP41(NM_036729), USP42(NM_374396), USP46(NM_022832), USP48(NM_032236), USP52(NM_014871), USP53(NM_019050), 및 USP54(AJ583820)의 탈유비퀴틴화 효소가 인간 배아줄기세포에 비하여 혈관 내피 세포에서 유의성 있게 과발현되었다.
또한, USP17(NM_201402), USP19(NM_006677), USP28(NM_020886), USP32(NM_032582), USP43(AJ583817), USP44(NM_032147), 및 USP51(NM_201286)의 탈유비퀴틴화 효소가 혈관 내피 세포에 비하여 인간 배아줄기세포에서 유의성 있게 과발현되었다.
서열번호 1 내지 29의 탈유비퀴틴화 효소 유전자의 발현량을 측정할 경우, 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화를 검출할 수 있다. 또한, 서열번호 88 내지 94의 탈유비퀴틴화 효소 유전자의 발현량을 측정할 경우, 인간 배아줄기세포의 미분화를 검출할 수 있다. 따라서, 상기 서열번호 1 내지 29 또는 서열번호 88 내지 94의 탈유비퀴틴화 효소 유전자로부터 얻어지는 마커 및 프라이머들은 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화를 검출하거나 인간 배아줄기세포의 미분화를 검출하는데 유용하게 사용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (17)

  1. 서열번호 1 내지 29의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자로부터 선택된 10 ∼ 100 개의 연속 뉴클레오티드 또는 상보적 뉴클레오티드로 이루어진 마커를 포함하는 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출용 마이크로어레이.
  2. 제1항에 있어서, 상기 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자가 서열번호 1, 5, 6, 9, 11, 12, 15, 20, 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출용 마이크로어레이.
  3. 제1항에 있어서, 상기 연속 뉴클레오티드 또는 상보적 뉴클레오티드가 서열번호 30 내지 87로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출용 마이크로어레이.
  4. 제1항에 있어서, 상기 연속 뉴클레오티드 또는 상보적 뉴클레오티드가 서열번호 30, 31, 38, 39, 40, 41, 46, 47, 50, 51, 52, 53, 58, 59, 68, 69, 80, 및 81로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출용 마이크로어레이.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 서열번호 88 내지 94의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자로부터 선택된 10 ∼ 100 개의 연속 뉴클레오티드 또는 상보적 뉴클레오티드로 이루어진 마커를 포함하는 인간 배아줄기세포의 미분화 검출용 마이크로어레이.
  10. 제9항에 있어서, 상기 연속 뉴클레오티드 또는 상보적 뉴클레오티드가 서열번호 95 내지 108로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 인간 배아줄기세포의 미분화 검출용 마이크로어레이.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 배양 중인 인간 배아줄기세포로부터 핵산 시료를 얻는 단계;
    얻어진 핵산 시료 중, 서열번호 1 내지 29의 폴리뉴클레오티드 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및
    핵산 시료 중의 서열번호 1, 5, 6, 9, 11, 12, 15, 20, 및 26로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 유전자가 발현되거나, 서열번호 2, 3, 4, 7, 8, 10, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 및 29로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 유전자가 과발현되는 경우, 상기 배양 중인 인간 배아줄기세포가 혈관 내피 세포로 분화된 것으로 판정하는 단계
    를 포함하는 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계가 서열번호 30 및 31; 서열번호 32 및 33; 서열번호 34 및 35; 서열번 호 36 및 37; 서열번호 38 및 39; 서열번호 40 및 41; 서열번호 42 및 43; 서열번호 44 및 45; 서열번호 46 및 47; 서열번호 48 및 49; 서열번호 50 및 51; 서열번호 52 및 53; 서열번호 54 및 55; 서열번호 56 및 57; 서열번호 58 및 59; 서열번호 60 및 61; 서열번호 62 및 63; 서열번호 64 및 65; 서열번호 66 및 67; 서열번호 68 및 69; 서열번호 70 및 71; 서열번호 72 및 73; 서열번호 74 및 75; 서열번호 76 및 77; 서열번호 78 및 79; 서열번호 80 및 81; 서열번호 82 및 83; 서열번호 84 및 85; 및 서열번호 86 및 87로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머쌍을 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 또는 실시간 중합효소 연쇄 반응(real time-polymerase chain reaction)을 수행하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 인간 배아줄기세포의 혈관 내피 세포로의 분화 검출 방법.
  16. 배양 중인 인간 배아줄기세포로부터 핵산 시료를 얻는 단계;
    얻어진 핵산 시료 중, 서열번호 88 내지 94의 폴리뉴클레오티드 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및
    핵산 시료 중의 상기 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자가 과발현되는 경우, 상기 배양 중인 인간 배아줄기세포가 미분화된 것으로 판정하는 단계
    를 포함하는 인간 배아줄기세포의 미분화 검출 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계가 서열번호 95 및 96; 서열번호 97 및 98; 서열번호 99 및 100; 서열번호 101 및 102; 서열번호 103 및 104; 서열번호 105 및 106; 및 서열번호 107 및 108로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머쌍을 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 또는 실시간 중합효소 연쇄 반응(real time-polymerase chain reaction)을 수행하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 인간 배아줄기세포의 미분화 검출 방법.
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