KR20230170446A

KR20230170446A - Gstt1 과발현 줄기세포를 포함하는 골재생용 조성물, 이를 포함하는 세포치료제 및 gstt1 발현 확인을 통한 줄기세포의 골재생능 선별

Info

Publication number: KR20230170446A
Application number: KR1020220070931A
Authority: KR
Inventors: 임군일; 이유진
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2022-06-10
Filing date: 2022-06-10
Publication date: 2023-12-19

Abstract

본 발명은 GSTT1 과발현 지방줄기세포를 포함하는 골재생용 조성물, 이를 제조하는 방법 및 이를 포함하는 세포치료제에 관한 것으로, 이를 통해 종래 골재생 줄기세포 치료에 비해 골분화능을 향상시킬 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명은 GSTT1 유전자 발현량을 확인함으로써 골재생능이 우수한 줄기세포를 선별할 수 있다.

Description

GSTT1 과발현 줄기세포를 포함하는 골재생용 조성물, 이를 포함하는 세포치료제 및 GSTT1 발현 확인을 통한 줄기세포의 골재생능 선별 {A COMPOSITION FOR BONE REGENERATION COMPRISING STEM CELLS OVEREXPRESSING GSTT1, CELL THERAPEUTIC PRODUCT COMPRISING THE SAME AND SCREENING BONE REGENERATION of STEMM CELL BY GSTT1 EXPRESSION}

본 발명은 GSTT1 과발현 줄기세포를 포함하는 골재생용 조성물, 이를 포함하는 세포치료제 및 GSTT1 발현 확인을 통한 줄기세포의 골재생능 선별에 관한 것이다.

골의 큰 결손이나 대퇴골두 무혈성괴사와 같이 외상, 종양, 질병으로 인해 발생되는 자연 재생이 힘든 광범위한 골 결손은 치료하는 데 큰 어려움이 있고, 상당히 많은 수의 재건수술이 행하여지고 있지만 완치가 어려운 실정이다. 또한 혈관의 손상이나 질병으로 혈액공급이 차단될 경우 골재생이 더욱 힘들어지고 인공 뼈에 의존해야 하는 어려움이 있다. 특히, 대퇴골두 무혈성괴사에 경우는 20-40대의 젊은 환자들이 대다수를 차지하며 인공관절 치환술을 시행할 경우 평생을 사용하지 못하고 일생 중 1~2회의 재수술을 받을 가능성이 있고, 골 파괴가 심한 상태여서 재수술시에는 결과가 좋지 않으며 이는 환자의 노동력 상실 및 사회경제적 비용을 유발한다.

이를 해결하기 위한 방법으로 골수나 지방과 같은 자가 성체 줄기 세포 이식이 연구되고 있지만, 혈관이 손상된 뼈의 광범위한 손실 시에는, 이식된 세포는 혈액을 공급받지 못해서 이식 초기에 대부분 괴사되기 때문에 기대했던 효과를 얻지 못하고 있다. 평균 수명이 연장된 삶의 질 개선을 위해서 젊은 연령에서 증가하고 있는 혈관 부재의 골 질환 치료를 위한 비수술적 골 보존 치료로써 줄기세포의 이식의 필요성이 있었다.

글루타티온 S-트랜스퍼라제 세타-1(GSTT1) 유전자는 다양한 친수성 및 소수성 화합물에 환원된 글루타티온의 접합을 촉매하는 단백질 슈퍼패밀리의 구성원입니다. 현재까지 골 재생 분야에서 GSTT1 유전자와 관련된 알려진 연구는 없다.

이에 본 발명의 발명자들은 분화 유도를 통해 지방줄기세포의 골형성 분화능을 확인하고, 이를 구별하는 유전자를 RNA-seq 분석을 통해 선별하였다. 골 분화가 잘되는 세포주와 골 분화가 약한 세포주를 구별하고 mRNA-seq 분석을 통해 특정 유전자인 GSTT1을 선별하였다. 그리고 지방줄기세포가 골분화가 잘 되지 않고 골분화능이 세포주마다 다양하다는 것을 발견하였고, 골분화가 잘되는 세포주와 잘 되지 않는 두 세포주를 구분할 수 있는 유전자 마커에 대해 관심을 갖게 되었다. 지방줄기세포주의 골분화능을 Alzarin Red Staining을 통해서 구분하고 잘되는 세포주와 안되는 세포주를 RNA-seq 분석하였다. 그 결과 지방줄기세포의 골형성 분화와 관련된 새로운 GSTT1 유전자를 도입한 지방줄기세포로 골 재생을 개선하여 무혈성 괴사 및 대골 결손증의 치료 가능성을 확인하여 본 발명을 완성 하였다.

Turkish Journal of Biology 39(5):682-691

본 발명의 목적은 GSTT1 유전자가 과발현된 지방줄기세포를 포함하는 골 재생용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 1) GSTT1 유전자 과발현 벡터를 제조하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)에서 제조된 벡터를 지방줄기세포에 도입하는 단계; 를 포함하는 GSTT1 유전자가 과발현된 지방줄기세포를 포함하는 골재생용 조성물 제조방법을 제공하는 것이다.

그리고 본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 골재생용 세포치료제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 GSTT1 유전자의 발현량을 확인할 수 있는 제제를 포함하는 지방줄기세포의 골분화능 선별용 조성물 및 선별용 키트를 제공하는 것이다.

그리고, 지방줄기세포의 GSTT1 유전자 발현량을 확인하는 단계를 포함하는 지방줄기세포의 골분화능 선별에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 GSTT1 유전자가 과발현된 지방줄기세포를 포함하는 골 재생용 조성물을 제공한다.

상기한 GSTT1 (glutathione S-transferases theta 1)은 글루타티온 S- 트랜스퍼라아제(GST) 중 하나로서 염증과 관련된 유전자로 알려져 있다. 구체적으로, 상기 GSTT1 유전자는 서열번호 1일 수 있다. 본 발명의 발명자들은 GSTT1 유전자를 발굴하였고, GSTT1 유전자를 과발현한 줄기세포의 경우 골 분화능이 향상되어 골재생에 효과적인 것을 확인하였다.

GSTT1

atggttctgg agctgtacct ggatctgctg tcgcagccct gtcgcgccat ttatatcttc gccaagaaga acaatatccc gttccagatg cacacggtgg agctgcgcaa gggtgagcac
ctcagcgatg cgtttgcccg ggtgaacccc atgaagaggg taccagccat gatggatggt ggcttcaccc tgtgtgagag tgtggctatc ttgctctacc tggcacacaa gtataaggtt cctgaccact ggtaccccca agacctgcag gctcgtgctc gtgtagacga gtacctggca tggcagcata cgggccttcg gagaagctgc ctcagggccc tgtggcataa ggtgatgttc cctgttttcc ttggtgagca aatacctcct gaaacactgg cagccacgtt ggcagaactg gatgttaacc tacaggtgct tgaagacaag ttcctccagg acaaagactt ccttgttggg ccccacatct ccctggccga cttggtggcc atcacagagc tgatgcatcc tgtaggtggt ggctgcccag tctttgaagg gcatcccagg ctggctgcat ggtaccagcg agtggaggca gctgtgggga aggacctctt ccgggaagcc catgaagtca tcctgaaggt gaaggactgt ccccctgctg acctcatcat aaagcagaag ctgatgccca gagtgctggc aatgatccag

서열번호 1

또한, 상기 염기서열의 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함되며, 구체적으로, 상기 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

상기 GSTT1 유전자의 과발현은 GSTT1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 전기천공법으로 지방줄기세포에 도입하여 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "작동가능하게 연결된"은 유전자 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 유전자 발현 조절 서열은 복제원점(replication origin), 프로모터 및 전사 종결 서열(terminator) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 전사 종결 서열은 폴리아데닐화 서열(pA)일 수 있으며, 복제 원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 또는 BBV 복제원점 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, "프로모터"는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며, 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.

본 발명의 일 구체예에 따른 프로모터는 특정 유전자의 전사 개시를 조절하는 전사 조절 서열 중 하나로, 약 100bp 내지 약 2500bp 길이의 폴리뉴클레오티드 단편일 수 있다. 프로모터는 세포, 예를 들어, 진핵 세포(예컨대, 식물 세포, 또는 동물 세포(예를 들어, 인간, 마우스 등의 포유류 세포 등) 등)에서 전사 개시를 조절할 수 있으면, 제한 없이 사용 가능하다. 예를 들어, 프로모터는 CMV 프로모터(cytomegalovirus promoter(예를 들어, 인간 또는 마우스 CMV immediate-early 프로모터), U6 프로모터, EF1-alpha(elongation factor 1-a) 프로모터, EF1-alpha short(EFS) 프로모터, SV40 프로모터, 아데노바이러스 프로모터(major late promoter), pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, HSV의 tk 프로모터, SV40E1 프로모터, 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus; RSV) 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터(metallothionin promoter), β-액틴 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 인간 IL-2(human interleukin-2) 유전자 프로모터, 인간 림포톡신(human lymphotoxin) 유전자 프로모터 및 인간 GM-CSF(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor) 유전자 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따른 재조합 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 재조합 발현벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 사용되는 플라스미드(예를 들어, pcDNA 시리즈, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 등) 또는 파지(예를 들어, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, M13 등) 등을 기본으로 하여 제작될 수 있다. 구체적으로는 비 바이러스성 미니써클 제조용 벡터 (pMC), 더욱 구체적으로는 pMCCMVMCS(MN501A-1)를 사용할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 더 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질주입된 세포를 비형질주입 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예를 들어, 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 암피실린(ampicillin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 발현벡터의 제작은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 수행될 수 있다.

상기 전기천공법은 유전자, 벡터를 세포 내로 도입하여 형질전환 시키는 방법으로, 본 발명에서는 GSTT1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 전기천공기기 (Neon^TM Transfection System, MPK5000, CA)를 사용하여 1000 내지 1300 볼트 (v), 구체적으로는, 1050 볼트 (v)로 30ms, 2 pulse의 조건으로 줄기세포에 도입시킬 수 있다.

상기 골재생용 조성물은 골 결손뿐만 아니라 다양한 골 손실 질환의 치료 또는 예방의 목적으로 사용될 수 있다. 구체적으로 골 손실 질환은 골다공증, 파제트병(Paget's disease), 치조골 손실, 골연화증 및 신성골이영양증(renal osteodeystrophy)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상 일 수 있다.

상기 골재생용 조성물은 1) GSTT1 유전자 과발현 벡터를 제조하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)에서 제조된 벡터를 지방줄기세포에 도입하는 단계를 통해 제조될 수 있다.

그리고, 본 발명은 1) GSTT1 유전자 과발현 벡터를 제조하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)에서 제조된 벡터를 지방줄기세포에 도입하는 단계; 를 포함하는 GSTT1 유전자가 과발현된 지방줄기세포를 포함하는 골재생용 조성물 제조방법을 제공한다.

상기 1) 단계는 지방줄기세포에 도입되기 위한 GSTT1 유전자 과발현 벡터를 제조하는 단계이다. 구체적으로 상기 단계 1)에서 GSTT1 유전자는 서열번호 1일 수 있다.

상기 2) 단계는 재조합 벡터를 지방줄기세포에 도입하는 단계이다. 구체적으로 상기 재조합 벡터의 도입 방법은 전기천공법으로 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물 또는 상기 제조방법으로 제조된 골재생용 조성물을 포함하는 골재생용 세포치료제을 제공한다.

본 발명에서 상기 세포치료제란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종 (allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 미국은 1993년부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다. 이러한 세포치료제는 크게 두 분야로 분류할 수 있으며 그 첫 번째는 조직재생 혹은 장기기능 회복을 위한 줄기세포 치료제이며, 두 번째는 생체 내 면역 반응의 억제 혹은 면역반응의 항진 등 면역반응 조절을 위한 면역세포 치료제로 분류할 수 있다.

본 발명의 세포치료제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여(intravenous therapy, i.v), 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 직접투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 세포치료제는 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 골재생용 조성물을 포함할 수 있다. 용어 치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성 물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 세포치료제는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조 성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다.

상기 세포치료제는 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

상기 골재생용 세포치료제는 골 결손뿐만 아니라 다양한 골 손실 질환의 치료 또는 예방의 목적으로 사용될 수 있다. 구체적으로 골 손실 질환은 골다공증, 파제트병(Paget's disease), 치조골 손실, 골연화증 및 신성골이영양증(renal osteodeystrophy)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상 일 수 있다.

본 발명의 다른 일 양상은 GSTT1 유전자의 발현량을 확인할 수 있는 제제를 포함하는 지방줄기세포의 골분화능 선별용 조성물을 제공한다.

상기 GSTT1 유전자의 발현량은 GSTT1 유전자의 발현 수준 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하여 확인할 수 있다. 발현 수준 측정 측정방법은 당업계에서 이용되는 통상의 발현 수준 방법 모두 사용될 수 있으며, 분석 방법의 예로 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA:RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), DNA 마이크로어레이 칩 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 단백질 자체 발현 수준 측정 방법은 당업계에서 사용하는 통상의 방법 모두 사용될 수 있으며, 그 예로 웨스턴 블럿팅(Western Blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사능 면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 면역조직화학, 면역침전법(immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS) 또는 단백질 칩 방법 등이 있고, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 구체예에 따르면, 상기 제제는 중합효소연쇄반응, 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이, 차세대 염기서열분석 및 노던 블랏팅(Northern blotting) 중 어느 하나에서 사용되는 것일 수 있다.

상기 중합효소연쇄반응에서 프라이머가 사용될 수 있다. 상기 "프라이머(primer)"는 DNA 합성의 개시점(starting point)으로 작용하는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)이다. 프라이머는 적합한 완충액(buffer)와 온도 조건에서 주형(template)인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고, DNA 중합효소가 프라이머에 주형 DNA에 상보적인 염기를 갖는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가하여 연결함으로써 DNA가 합성된다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며, 염기 구성과 길이에 따라 주형 가닥에 결합하는 온도(melting temperature, Tm)가 달라진다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서 GSTT1의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머는 GSTT1 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, DNA 합성을 통해 GSTT1의 mRNA 또는 GSTT1의 cDNA의 특정 구간을 증폭하여 GSTT1의 mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 충분하다. 상기 증폭반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 GSTT1의 mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트(쌍)으로 구성된다. 프라이머는 당업자라면 GSTT1의 mRNA 또는 cDNA 염기서열을 참조하여 용이하게 디자인할 수 있다.

상기 마이크로어레이는 GSTT1 유전자의 mRNA, GSTT1 단백질 및 이들의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 프로브로 할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "프로브(probe)"는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서는 GSTT1의 mRNA에 상보적인 프로브를 피검체의 시료와 혼성화 반응(hybridization)을 수행하여 GSTT1의 mRNA의 발현량을 측정함으로써 감염성 염증 질환의 진단에 이용할 수 있다. 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양상은 GSTT1 유전자의 발현량을 확인할 수 있는 제제를 포함하는 지방줄기세포의 골분화능 선별용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 일 양상은 지방줄기세포의 GSTT1 유전자 발현량을 확인하는 단계를 포함하는 지방줄기세포의 골분화능 선별에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

GSTT1 유전자의 발현 수준 측정은 전술한 바와 같다.

상기 방법은 정상 대조군에서의 GSTT1 유전자 발현 수준을 선별대상에서의 발현 수준과 비교함으로써 골분화능을 선별할 수 있다. GSTT1 유전자 발현 수준이 정상 대조군의 것보다 높을 경우, 선별대상인 지방줄기세포의 골분화능이 높은 것으로 예측할 수 있는 것이다.

본 발명에 의하면, 상기 골 재생용 조성물, 재생용 조성물 제조방법 및 이들을 포함하는 세포치료제는 종래 골재생 치료 분야에서 문제되던 줄기세포의 골분화능 및 생존율을 높일 수 있다. 이를 통해 골재생 줄기세포 치료 효과를 향상시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 GSTT1 유전자 발현량을 확인함으로써 골재생능이 우수한 줄기세포를 선별할 수 있다.

또한, 본 발명은 골재생 치료용 줄기세포의 산업적 생산을 가능케 하여 국내의 생명공학/생명과학산업에 새로운 기회를 제공하며, 기능성 줄기세포 치료물질의 개발은 골 질환 환자 (특히 20~40대의 젊은 환자)의 삶의 질 향상과 환자들의 사회활동 중단에 따르는 사회적 손실을 줄여 국민 보건복지 향상에 크게 기여할 수 있다.

도 1 및 2는 실험예 1-1의 결과를 나타낸 사진으로, 도 1은 Alizarin red 염색으로 골분화가 잘되는 지방줄기세포 및 골분화가 잘 안되는 지방줄기세포를 구별하여 나타낸 것이고, 도 2는 골분화 염색이 잘된 세포주와 골분화 염색이 안된 세포주를 골결손 동물모델을 통해서 골재생을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 1-2의 결과를 나타낸 것으로, a는 지방줄기세포에서 골분화가 잘되는 세포주와 잘 안되는 세포주를 각각 6개 세포주로 나누어 RNA-sequencing 하였다. b와 c는 두 조건간의 차이나는 세포신호를 나타냈다. d와 e는 골분화가 잘되는 세포주와 안되는 세포주간의 GSTT1유전자의 mRNA와 단백질 발현이 차이가 남을 확인할 수 있다.
도 4는 실험예 2의 결과를 나타낸 것으로, 도4 a, b는 GSTT1 유전자 발현을 siRNA를 통해서 감소시킨후, GSTT1과 pERK 단백질 발현량을 나타낸 것이고, 도 4 c는 골분화 정도, 도 4d는 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 1-1에서 제조된 GSTT1 과발현 벡터의 구조를 나타낸 것이다.
도 6는 실험예 1-2의 GSTT1 시퀀싱 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 3의 결과를 나타낸 것으로, 도 7a는 GSTT1 유전자 단백질 발현결과, 도 7b는 골 생성 능력의 확인한 결과이며, 도 7c는 세포 생존율의 확인결과를 나타낸 것이다.
도 8은 실험예 4의 결과를 나타낸 것으로, 도 8a는 벡터의 도입 여부를 확인한 것이고, 도 8b는 GSTT1 유전자 단백질 발현결과를 나타낸 것이며, 도 8c는 골 생성 능력의 확인한 것이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험예 1:GSTT1 유전자 발굴

실험예 1-1. 골 분화능을 가진 지방줄기세포의 선별

지방줄기세포에서 골분화가 잘되는 세포주와 골분화가 안되는 세포주를 Alizarin Red Staining 방법으로 구분하였다.

구체적으로, 16종의 지방줄기세포를 4 well plate의 한 well 당 세포의 수가 5×10⁴개가 되도록 seeding 하고, 37℃ 및 5% CO₂의 조건에서 골형성 배지(osteogenic medium: OM)(10% FBS, 1% P/S가 포함된 Alpha MEM, 1M Beta-glycerol　phosphate, 0.1M L-Ascorbic acid2-phosphate, 500μM Dexamethasone)를 2 내지 3일 간격으로 교체하면서 골 분화를 유도하였다. 골 분화 후, 4% paraformaldehyde으로 고정하고 2% Alizarin Red S (SIGMA-ALDRICH, Cat. A5533-25G, USA)로 염색하여 골 분화 정도를 평가하였다.

그 결과 도 1에서 확인되는 바와 같이 골분화가 잘 일어나는 6종의 지방줄기세포는 Alizarin red 염색이 이루어져 mineral accumulation, 구체적으로 석회화 침착이 확인되어 골분화가 일어나고, 골분화가 적게 일어나 염색이 적에 이루어지지 않은 6종의 지방줄기세포를 구별하였다.

상기 도 1에서 확인된 골분화 염색이 잘된 세포주와 골분화 염색이 안된 세포주를 4mm 간격의 원형 드릴로 구멍을 뚫어 calvarial 두개골 골결손 동물모델과 segmental defect 동물 모델을 통해서 골재생을 확인하였다.

또한, 도2에서 확인되는 바와 같이 ARS positive 세포주에서 골재생이 잘되는 것을 확인하였다.

실험예 1-2. GSTT1 유전자 선정

골재생능을 향상시키는 유전자를 아래와 같은 방법으로 발굴하였다.

TRIzol 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 샘플에서 총 RNA를 추출하고 분광 광도계 (Bio-Tek Instruments)에서 농도와 순도를 광학 밀도 (각각 A260 및 A260 / A280)로 결정하였다. RNA 라이브러리 준비 키트 (Illumina, San Diego, CA, USA)를 사용하여 각 샘플의 RNA 시퀀싱 라이브러리를 준비하였다. Alpha MEM 배지 및 glucose 조건에 따라 만든 골형성 배지에서 배양한 3종류의 골수줄기세포에 대하여 RNA 시퀀싱 (RNA-seq) 실험을 수행하였다. RNA-seq는 Illumina HiSeq 2000 시스템을 사용하여 수행되었다. 유전자 발현은 RPKM/FPKM(reads of paired-end fragments per kilobase of exon model per million mapped reads)에 대해 normalization하였다. ExDEGA(Excel based Differentially Expressed Gene Analysis) 분석툴을 사용하여 RNA-seq 실험에서 생성된 시퀀싱 읽기의 품질을 확인하였다.

그 결과 도 3에서 확인되는 바와 같이 지방줄기세포에서 골분화가 잘되는 세포주 6개와 골분화가 안되는 6개의 세포주를 RNA-seq 분석을 통해서 특이적인 유전자 GSTT1을 발굴하였다. 이것을 mRNA와 protein에서 확인하였다.

실험예 2: GSTT1 유전자의 골분화능 확인

GSTT1 유전자를 siRNA로 넉다운 시켜 GSTT1의 골분화능을 확인하였다.

실험예 2-1. 줄기세포의 준비

지방흡입으로 얻은 지방조직을 DPBS (Welgene, Cat. LB 001-02, Korea)로 희석한 후 10분간 원심분리하여 상층액과 하층액을 제거하였다. 그런 다음, 0.1% Collagenase Type I(Worthington Biochemical Corporation, Cat. LS004197, USA)을 첨가하고 37℃ Shaking incubator에서 배양하였다. 400xg에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛만을 남기고 ACK 용해 완충액(Gibco, Cat. A10492-01, USA)을 첨가하였다. 400xg에서 5분간 원심분리하여 펠릿만 남기고 DPBS에 현탁하고 100㎛ Cell Strainer로 3회 여과한다. 여액을 600xg에서 10분간 원심분리하여 지방유래 줄기세포(ADSC)를 얻었다. ADSC는 10% FBS(Gibco, Cat. 16000-044, USA) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 100x가 보충된 Alpha MEM(Gibco, Cat. 12571-063, USA)의 1x10⁶ 세포/100mm 접시에서 배양되었다.

실험예 2-2. 재조합 벡터의 준비

10⁶ 개의 세포 현탁액은 100 μL 의 R 버퍼 (Neon?? Transfection System, MPK10096, CA, USA) 를 추가하였고, 여기서 10 ㎍ GSTT1-발현 pACGFP1-C1 벡터 (GSTT1)를 얻었다.

실험예 2-3. 줄기세포로 재조합 벡터의 도입

상기 2-1의 줄기세포를 3분 동안 1,000rpm으로 원심분리 후, 상층액을 제거하였다. 1×10⁶ 개의 세포 당 100㎕의 R buffer(Neon^TM Transfection System, MPK10096, CA)를 첨가하고 상기 2-2 와 혼합하였다. 전기천공법 기기(Neon^TM Transfection System, MPK5000, CA)를 사용하여 1050v, 30ms, 2 pulse로 electroporation 하였다. 항생제 없는 Alpha MEM (Gibco, Cat. 12571-063, USA)에 세포를 배양하였다.

실험예 2-4. 유전자, 단백질 발현 확인

구체적으로, 상기 2-3에서 제작된 줄기세포를 14일 동안 분화시키고 PBS로 세척한 후, protease inhibitor cocktail (GenDEPOT, Barker, TX, USA)과 phosphatase inhibitor cocktail (GenDEPOT, Barker, TX, USA)을 함유한 RIPA buffer (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)에 용해하였다. 단백질 농도는 BCA 분석법으로 측정하였다. 2시간 동안 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)으로 분리하였다. NC 멤브레인(Whatman®, Cat. E06-07-111, UK)으로 옮긴 후, 1X TBS with 2% Tween-20으로 5% skim milk를 만들어 blocking하였다. 그 후, 1차 항체(1:1000)와 4℃에서 밤새 반응시킨 다음, 실온에서 2시간 동안 2차 항체(1:1000) [anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HRP)-linked antibody, Cell Signaling, #7074/anti-mouse IgG HRP-linked antibody, Cell Signaling, #7076] 와 반응시켰다. 항체-항원 복합체는 SuperSignal?? West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Scientific, Cat. 34905, USA)를 사용하여 검출하였고, 신호 강도는 ChemiDoc^TM XRS+ Imaging System (BIO-RAD, USA)을 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 4 a, b에서 확인되는 바와 같이 siRNA가 도입된 세포의 경우 GSTT1의 발현이 감소된 것을 확인하였다.

실험예 2-2. 골 분화능의 확인

실험예 1-1과 동일한 방법으로 배양 7일, 14일째의 석회화 침착 정도를 기초로 골 분화능을 확인하였다.

그 결과 도 4 c에서 확인되는 바와 같이 siRNA가 도입된 세포의 경우 석회화 수준이 큰 차이가 없는 것을 확인하였다.

실험예 2-3. 세포 생존율 확인

세포 생존율 분석은 수용성의 테트라졸륨염(tetrazolium salt)이 세포 내의 미토콘드리아 NADH-dehydrogenase에 의해 환원되어 유색의 포르마잔(formazan)으로 전환되는 정도를 측정하였다. 상기 2-1에서 제작된 유전자가 이입된 지방줄기세포는 골 형성 배지를 사용하여 96well plate에 well 당 10⁴개씩 seeding하고, 37℃ 및 5% CO₂의 조건에서 골분화 하였다. 그리고 EZ-Cytox (DoGEN, Cat. EZ-1000, Republic of Korea)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 WST 분석을 수행하였다. 상기 키트에 포함된 시약을 배지 100㎕당 10㎕씩 넣어주고, 37℃ 및 5% CO₂의 조건에서 60분 후 VersaMax Microplate Reader (Molecular Devices, USA)로 450nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 2, 4, 5, 7, 14 및 21 일에서의 세포 생존율을 분석하였다.

그 결과 도 4 d에서 확인되는 바와 같이 14일 이후에서 siRNA로 GSTT1 유전자 발현이 큰 차이가 없음을 확인하였다. 이를 통해 GSTT1 유전자가 발현 억제 (넉다운)될 경우 세포 GSTT1 유전자는 줄기세포의 주입 및 분화에 있어 줄기세포의 분화능에는 영향을 주지만 생존율에는 큰 영향을 주지 않는 것으로 추측된다.

실시예 1: 세포 치료제의 제조

실시예 1-1. 지방줄기세포의 준비

상기 실험예 2-1과 같은 방식으로 줄기세포를 준비하였다.

실시예 1-2. GSTT1 과발현 벡터의 제조

pAcGFP1-C1 Vector를 기본 골격으로 이용하였다. 유전자 클로닝을 위한 BglII 제한 효소 부위를 사용하여 유전자가 발현될 수 있는 서열을 CMV 프로모터의 하류에 삽입하였다.

GSTT1 유전자 (723bp)는 Invitrogen 사에서 구입하여 DNA PCR을 위한 주형(template)으로 사용하였다. 유전자의 PCR 반응용 프라이머는 다음과 같다: GTCCGGACTCAGATCTATGGGCCTGGAGCTGTAC (For. Primer, GSTT1_BgIII_F, 서열번호 2), CTTGAGCTCGAGATCTTCACCGGATCATGGCCAG (Rev. Primer, GSTT1_BgIII_r, 서열번호 3). PCR 반응 후 확보된 유전자 (서열번호 1)는 pAcGFP1-C1 Vector 벡터에 연결하여 전체 유전자 서열분석(full gene sequencing)을 통해 유전자 서열의 이상 여부를 확인하였다. 유전자 서열이 정확히 일치하는 GSTT1 유전자를 연결하여, GSTT1 유전자 발현 벡터를 제조하였다 (pAcGFP1-C1_GSTT1).

실시예 1-3. 과발현 벡터의 지방줄기세포 내 도입

상기 실시예 1-1. 에서 제조된 GSTT1 과발현 벡터를 상기 실험예 2-3. 에서 개시된 방법과 동일한 방법으로, 실시예 1-1에서 준비된 지방줄기세포에 도입하였다.

그리고, 도입된 GSTT1 유전자의 염기서열을 확인한 결과 도 6에서 확인되는 바와 같이 GSTT1의 염기서열에 문제가 없음을 확인하였다.

실험예 3: 세포치료제의 골분화능 확인

실험예 3-1. GSTT1 유전자 단백질 발현의 확인

GSTT1 단백질 발현은 상기 GSTT1 유전자가 도입된 줄기세포에 대해 상기 실험예 2-4에서 개시된 방법과 동일한 방법으로 확인하였다. GSTT1이 과발현된 세포의 단백질 발현을 확인한 결과, 도 7a에서 확인되는 바와 같이 세포치료제의 증가된 GSTT1 발현을 확인하였다.

실험예 3-2. 골 생성 능력의 확인 (Alizarin Red staining)

실험예 1-1과 동일한 방법으로 2주(2W)째의 석회화 침착 정도를 기초로 골 분화능을 확인하였다

그 결과 도 7b에서 확인되는 바와 같이 GSTT1이 과발현된 조건에서 골분화가 확연히 증가함을 확인하였다.

실험예 3-3. 세포 생존율의 확인

실험예 2-3과 동일한 방법으로 2, 4 및 8 일에서의 세포 생존율을 분석하였다.

도 7c에서 확인되는 바와 같이 GSTT1의 과발현에도 세포 생존율은 크게 차이나지 않은 것을 확인하였다.

실험예 4: 다른 벡터를 이용한 세포치료제의 골분화능 확인

상기 실시예 1과 벡터 종류만 pAcGFP1-C1 벡터로 변경한 것 외에는 동일한 방법으로 세포치료제를 제작하였고 이하의 실험을 진행하였다.

실험예 4-1. 벡터의 도입 여부 확인

제작된 줄기세포에 재조합 벡터 (GSTT1 및 pAcGFP1-C1) 의 도입을 광학 현미경 (Bright light) 및 RFP를 통해 확인하였다.

그 결과 도 8a에서 확인되는 바와 같이 줄기세포에 GSTT1 및 pAcGFP1-C1 가 도입된 것을 확인할 수 있다.

실험예 4-2. GSTT1 유전자 단백질 발현의 확인

GSTT1 단백질 발현은 상기 줄기세포에 대해 상기 실험예 2-4에서 개시된 방법과 동일한 방법으로 확인하였다.

그 결과, 도 8b에서 확인되는 바와 같이 대조군(Control)에 비하여 GSTT1 군은 GSTT1 단백질 발현량이 대조군에 비하여 증가하는 것을 확인할 수 있다.

실험예 4-3. 골 생성 능력의 확인 (Alizarin Red staining)

실험예 1-1과 동일한 방법으로 2주(2W)째의 석회화 침착 정도를 기초로 골 분화능을 확인하였다.

그 결과 도 8c에서 확인되는 바와 같이 GSTT1이 과발현된 조건에서 골분화가 확연히 증가함을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> DONGGUK UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> A COMPOSITION FOR BONE REGENERATION COMPRISING STEM CELLS OVEREXPRESSING GSTT1, CELL THERAPEUTIC PRODUCT COMPRISING THE SAME AND SCREENING BONE REGENERATION of STEMM CELL BY GSTT1 EXPRESSION <130> BPN211101 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GSTT1 DNA sequence <400> 1 atggttctgg agctgtacct ggatctgctg tcgcagccct gtcgcgccat ttatatcttc 60 gccaagaaga acaatatccc gttccagatg cacacggtgg agctgcgcaa gggtgagcac 120 ctcagcgatg cgtttgcccg ggtgaacccc atgaagaggg taccagccat gatggatggt 180 ggcttcaccc tgtgtgagag tgtggctatc ttgctctacc tggcacacaa gtataaggtt 240 cctgaccact ggtaccccca agacctgcag gctcgtgctc gtgtagacga gtacctggca 300 tggcagcata cgggccttcg gagaagctgc ctcagggccc tgtggcataa ggtgatgttc 360 cctgttttcc ttggtgagca aatacctcct gaaacactgg cagccacgtt ggcagaactg 420 gatgttaacc tacaggtgct tgaagacaag ttcctccagg acaaagactt ccttgttggg 480 ccccacatct ccctggccga cttggtggcc atcacagagc tgatgcatcc tgtaggtggt 540 ggctgcccag tctttgaagg gcatcccagg ctggctgcat ggtaccagcg agtggaggca 600 gctgtgggga aggacctctt ccgggaagcc catgaagtca tcctgaaggt gaaggactgt 660 ccccctgctg acctcatcat aaagcagaag ctgatgccca gagtgctggc aatgatccag 720 720 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> For. Primer, GSTT1_BgIII_F <400> 2 gtccggactc agatctatgg gcctggagct gtac 34 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rev. Primer, GSTT1_BgIII_r <400> 3 cttgagctcg agatcttcac cggatcatgg ccag 34

Claims

GSTT1 유전자가 과발현된 지방줄기세포를 포함하는 골 재생용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 GSTT1 유전자는 서열번호 1인 골재생용 조성물.
1) GSTT1 유전자 과발현 벡터를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 제조된 벡터를 지방줄기세포에 도입하는 단계;
를 포함하는 GSTT1 유전자가 과발현된 지방줄기세포를 포함하는 골재생용 조성물 제조방법.
제3항에 있어서,
상기 단계 1)에서 GSTT1 유전자는 서열번호 1인 골재생용 조성물 제조방법.
제 1항의 조성물 또는 제 3항의 제조방법으로 제조된 골재생용 조성물을 포함하는 골재생용 세포치료제.
GSTT1 유전자의 발현량을 확인할 수 있는 제제를 포함하는 지방줄기세포의 골분화능 선별용 조성물.
GSTT1 유전자의 발현량을 확인할 수 있는 제제를 포함하는 지방줄기세포의 골분화능 선별용 키트.
지방줄기세포의 GSTT1 유전자 발현량을 확인하는 단계를 포함하는 지방줄기세포의 골분화능 선별에 필요한 정보를 제공하는 방법.