KR102394378B1 - 피부 각질세포에서의 아릴탄화수소 수용체 억제자(AhRR) 과발현 방법 - Google Patents

Abstract

피부 각질세포에서의 질환화를 유도할 수 있는 아릴탄화수소 수용체 억제자(AhRR) 과발현 방법에 관한 것이다.

Description

피부 각질세포에서의 아릴탄화수소 수용체 억제자(AhRR) 과발현 방법{Method of overexpressing aryl hydrocarbon receptor repressor (AhRR) in keratinocytes of skin}

본 발명은 피부 각질세포에서의 아릴탄화수소 수용체 억제자(AhRR) 과발현 방법 및 상기 방법에 의해 아릴탄화수소 수용체 억제자(AhRR)가 과발현된 피부 각질세포에 관한 것으로, 보다 상세하게는 피부 각질세포에서의 질환화를 유도할 수 있는 아릴탄화수소 수용체 억제자(AhRR) 과발현 방법에 관한 것이다.

건선은 피부가 붉어지는 증상인 홍반과 하얀 각질이 일어나는 증상인 인설을 주증상으로 두꺼워진 피부에 홍반과 인설이 같이 있는 게 특징적인 모양이다. 주로 팔꿈치, 무릎, 엉덩이, 두피 등 자극을 많이 받는 부위에 발생한다. 다른 피부질환과 달리 병변과 정상피부와의 경계가 뚜렷한 특징이 있다. 물방울, 판상, 농포성, 박탈성 건선, 건선 관절염 등 다양한 임상 양상을 보손발바닥에만 농포가 존재하는 국소농포성건선(손발바닥 농포증)도 건선으로 분류한다.

건선이 심한 정도는 얼마나 넓은 부위의 피부를 침범했느냐에 따라 주로 판단한다. 10%이상의 피부가 건선으로 덮일 경우 중등증이상으로 분류하고 고강도의 치료를 하게 된다. 호전과 악화를 반복하게 되며 증상이 심한 일부의 환자는 지속적인 병원치료를 요하는 만성 피부질환이다.

최근 건선의 원인이 면역이상이라는게 밝혀지면서 피부에만 병이 있는 것이 아니라 건선 관절염을 동반하기도 하며 대사증후군, 급성심근경색 , 중풍 같은 심혈관계 질환의 발병이 일반인보다 높다는 사실이 잘 알려져 있다. 이런 이차적인 합병증을 예방하기 위해서라도 건선은 꾸준한 치료와 관리가 필요한 병이다.

또한, 붉은 반점과 각질이 나타나는 만성 염증성 피부질환인 건선은 우리 몸 속 면역계에 이상이 생길 때도 나타난다. 심하면 초기에 없던 가려움증이나 진물, 열감 등 다양한 증상이 발현되고 고혈압, 당뇨병, 염증성장질환 등 대사성·심혈관계 질환이 동반될 수 있어 주의가 필요하다.

건선 발병은 외상이나 감염, 스트레스, 술, 담배와 같은 외부자극이 더해졌을 때 높아진다. 염증 물질이 빠르게 분비되고 피부 각질형성세포가 빠르게 증식하기 때문이다. 건강보험심사평가원 통계 자료에 따르면, 국내 건선 환자 수는 2013년 16만3936명에서 2016년 16만8688명으로 꾸준히 증가하고 있다.

건선은 제대로 치료받지 못하면 증상 악화와 호전이 반복되며 완치가 어려운 질환으로 환자들의 고통이 매우 크다. 건선의 원인은 유전적인 원인과 환경적인 요인이 복합적으로 작용해 발생하는 것으로 전문가들은 추측하고 있다. 하지만 유전적인 원인에 비해 환경적인 요인에 대한 연구는 제한적이고 정확히 밝혀져 있지 않았다.

또한, 아토피 피부염은 아토피피부염은 주로 유아기 혹은 소아기에 시작되는 만성 재발성의 염증성 피부질환으로 소양증(가려움증)과 피부건조증, 특징적인 습진을 동반한다. 유아기에는 얼굴과 팔다리의 폄 쪽 부분에 습진으로 시작되지만, 소아기가 되면서 특징적으로 팔이 굽혀지는 부분(팔오금)과 무릎 뒤의 굽혀지는 부위(오금)에 습진을 나타낸다. 많은 경우에 성장하면서 자연히 호전되는 경향을 보이지만 알레르기 비염, 천식 같은 호흡기 아토피를 동반하는 경우도 많다.

이러한 가운데, AhRR (aryl-hydrocarbon receptor repressor)은 AhR과 경쟁하는 능력을 통해 AhR 신호 전달을 억제하는 것으로 알려져 있다. AhRR은 AhR 신호를 효과적으로 차단하기도하고 염증 반응의 억제 및 종양 억제자로서의 추정 역할하는 것으로 알려져있다. 하지만, 피부질환에서는 아직 연구가 전무한 실정이며, 본 발명자들은 피부질환과 AhRR의 관계를 보려고 AhRR을 피부각질세포에 과발현을 시도하여 피부질환화하여 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 10-2017-0045240 한국공개특허 10-2019-0113858

본 발명은 정상보다 건선이나 아토피환자의 혈액이나 피부조직에서 AhRR의 발현이 증가가 되어 있는 것을 이용하여, 피부각질세포에서의 질환화를 유도하기 위해 피부 각질세포에서의 아릴탄화수소 수용체 억제자(AhRR)의 과발현 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 피부 각질세포에서의 아릴탄화수소 수용체 억제자(AhRR)의 과발현을 시도하여 피부질환화하여 다양한 피부질환에 적용하고자 하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따라 AhRR의 유전자 서열을 설계하는 단계; AhRR 과발현 용액을 준비하는 단계;및 피부 각질 세포로 AhRR 플라스미드를 전달하는 단계;를 포함하는, 피부 각질세포에서의 아릴탄화수소 수용체 억제자(AhRR)의 과발현 방법이 제공된다.

또한, 상기 피부 각질 세포로 AhRR 플라스미드를 전달하는 단계는, (a) 피부 각질 세포를 배양하는 단계; (b) 형질감염 시약을 준비하는 단계; (c) AhRR 플라스미드-형질감염 시약 복합체를 상기 피부 각질 세포에 추가하여 배양하는 단계;를 포함할 수 있다.

또한, 상기 (a)의 피부 각질 세포는, 5 CO₂ 가습 분위기에서 배양될 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따라, 전술한 어느 하나의 방법에 의해 아릴탄화수소 수용체 억제자(AhRR)가 과발현된 피부 각질세포가 제공된다.

이때, 아릴탄화수소 수용체 억제자(AhRR)가 도입되면서, 피부 각질세포의 모형이 길쭉하게 변형되는 것일 수 있다.

또한, 아릴탄화수소 수용체 억제자(AhRR)는 피부 각질세포의 세포질에 도입되는 것일 수 있다.

또한, 피부각질세포에서의 질환화를 유도하기 위해 사용되는 것일 수 있다.

또한, 전술한 피부 각질세포를 포함하는 피부염, 아토피 및 건선 치료용 조성물이 제공된다.

본 발명의 피부 각질세포에서의 아릴탄화수소 수용체 억제자(AhRR)의 과발현 방법에 따르면, 피부 각질세포에서의 아릴탄화수소 수용체 억제자(AhRR)의 과발현을 시도하여 피부질환화하여 다양한 피부질환에 적용할 수 있는 이점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 각질세포에서의 아릴탄화수소 수용체 억제자(AhRR)의 과발현 방법의 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 피부 각질 세포로 AhRR 플라스미드를 전달하는 단계를 세분화하여 나타낸 순서도이다.
도 3과 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 조건을 간략히 도시한 것이다.
도 5는 벡터 형성 조건이다.
도 6은 벡터 형성 결과이다.
도 7은 주입(Infusion)의 조건이다.
도 8은 PCR 조건이다.
도 9는 웨스턴 블로팅(Western Blotting) 결과이다.
도 10은 세포 형태를 관찰하기 위하여 촬영한 사진이다.
도 11은 세포면역학 결과이다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 특허청구범위에 사용된 용어 또는 단어는 통상적으로 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예에 기재된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에서 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 각질세포에서의 아릴탄화수소 수용체 억제자(AhRR)의 과발현 방법의 순서도이고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 피부 각질 세포로 AhRR 플라스미드를 전달하는 단계를 세분화하여 나타낸 순서도

본 발명의 일 실시예에 따른 피부 각질세포에서의 아릴탄화수소 수용체 억제자(AhRR)의 과발현 방법은 AhRR의 유전자 서열을 설계하는 단계(S100), AhRR 과발현 용액을 준비하는 단계(S200) 및 피부 각질 세포로 AhRR 플라스미드를 전달하는 단계(S300)를 포함한다.

이때, 피부 각질 세포로 AhRR 플라스미드를 전달하는 단계(S300)는 (a) 피부 각질 세포를 배양하는 단계(S310), (b) 형질감염 시약을 준비하는 단계(S320), (c) AhRR 플라스미드-형질감염 시약 복합체를 상기 피부 각질 세포에 추가하여 배양하는 단계(S330)을 포함할 수 있다.

이하, 본원을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

세포 배양 시약

1. HaCaT cells

일반적인 피부 각질 세포에서 유래한 것으로 AhRR 과발현을 수행하는 데 사용될 세포이다.

2. 배양 조건

HaCaT 세포는 10% (v/v) 열-불활성화 FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% (v/v) 1 x 10⁴ units/mL 페니실린을 함유하는 Dulbecco의 변형된 Eagle 's 배지 (DMEM)에서 배양되었으며, 37℃ 및 5 % CO₂의 가습 분위기에서 성장했다.

3. pH 7.4의 인삼염 완충 식염수(Phosphate Buffered Saline, PBS)를 준비하였다.

4. Gibco® 트립신 -EDTA 용액(Gibco® Trypsin-EDTA solution)

PBS에 0.25% 트립신과 0.01% EDTA를 포함하는 즉시 사용 가능한 트립신 용액이다.

5. 형질 감염 시약(Transfection Reagent)

Lipofectamine^TM 2000 (Invitrogen), 및 아릴탄화수소 수용체 억제자Arylhydrocarbon receptor repressor, AhRR)의 플라스미드(pLNPH Bglll, AhRR Bg forward: ctaatcctggctcgagat agatct atgatcccgccgggggagtg, AhRR Bg reversed: caaattggactaatcgatagatctctatggcaggaatgtgc)를 사용하였다.

항목	서열	서열번호
AhRR Bg forward	ctaatcctggctcgagat agatct atgatcccgccgggggagtg	1
AhRR Bg reversed:	caaattggactaatcgatagatctctatggcaggaatgtgc	2

클로닝

1. PCR

도 3과 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 조건을 간략히 도시한 것으로 도 3 및 도 4를 참조하면, 타겟 유전자의 템플릿(template)을 증폭시키기 위해 세포에서 genomicDNA를 분리하여 상기 세포 배양 시약을 넣고 95도에서 5분 끓여준 후 95도 30초, 55도 30초, 72도 1분에서 35회 72도에서 7분동안 Polymerase Chain Reaction (PCR) 진행하였으며, 2Kb 정도의 템플릿(template)을 만들어 주었다.

2. 디자인

도 5는 벡터 형성 조건이고, 도 6은 벡터 형성 결과이다. 도 5 및 도 6을 참조하면, 제한효소 등을 넣고 벡터가 잘 형성되기 위한 최적의 조건인 37℃에서 24시간 동안 진행하였으며, 그 결과 도 6처럼 밴드가 하나로 우수한 결과가 나왔다.

3. 주입(Infusion)

도 7은 주입(Infusion)의 조건으로, 상기 1번 PCR에서 수득한 템플릿(template)을 2번 디자인한 벡터에 삽입한 후, 25℃에서 150초, 아이스에서 10 분 정도 두었다.

4. 변환(Transformation)

템플릿을 삽입한 3번의 벡터에 박테리아 배양으로 항생제와 넣은 후, 24시간 배양시켜 증폭시켰다.

5. 콜로니 PCR(Colony PCR)

상기 4번의 박테리아에서 배양한 후, genomicDNA를 뽑아 AhRR primer와 넣고 도 8의 조건으로 PCR을 진행하여 AhRR 플라스미드를 수득하였다.

실험예

1. 유전자 특이적 AhRR 서열 설계 (Design of Gene-specific AhRR sequence)

표적 유전자의 성공적인 과발현의 다음 단계는 매우 특정한 유전자 서열을 찾는 것이다. AhRR의 삽입을 위해 pLNPH Bglll 벡터를 사용하였다. 구현은 코스모진텍(Cosmogenetech)에 의해 설정되었다.

2. AhRR 과발현 용액의 준비

AhRR 유전자는 코스모진텍 클로닝 프로토콜(Cosmogenetech Cloning Protocol)에 따라 pLNPH Bglll 벡터를 사용하여 구축되었다.

3. 세포로 플라스미드 전달

제조업체의 프로토콜에 따라 리포펙타민 2000 시약(Lipofectamine 2000 Reagent, Invitrogen)를 사용하여 형질 감염을 수행하였다. AhRR 플라스미드의 최종 농도는 0.3μg/ml이였다. HaCaT 세포 (7 x 10₅)를 1.2ml 배양 배지와 함께 6 웰 플레이트에서 24 시간 동안 배양하였다. 렌티 바이러스 형질 도입 농도는 5x10⁶ 형질 도입 단위 렌티 바이러스 항생제 내성은 암피실린 (100μg / ml)을 사용하여 구축되었다.

(1) 100 x 21 mm 세포 배양 접시에서 HaCaT 세포를 70-90% confluency로 성장시킨다. 5 mL PBS로 세포를 두 번 세척한 후, 500μL의 트립신 용액을 세포에 넣고 가습된 CO₂ 인큐베이터에서 2분 동안 배양하였다. 10% FBS를 포함하는 5 mL의 세포 성장 배지 (DMEM)를 추가하여 트립신화를 중지하였다. 세포와 매체를 15 mL 원추형 튜브로 옮기고 튜브를 2000 × g에서 3 분 동안 원심 분리하여 세포를 펠릿화 하였다. 그런 다음 10 mL 혈청 함유 성장 배지에서 세포를 재현하여 셀 카운터에서 셀을 계산하였다.

(2) 6 웰 배양 플레이트에 10 % FBS를 함유한 1.2 mL 성장 배지에 7 × 10⁵ 세포/배양 플레이트를 시드하였다. 가습된 5% CO₂ 인큐베이터에서 세포가 37℃에서 밤새 성장하도록 하였다.

(3) 형질 감염할 6개의 웰 배양 플레이트에 대해 4μL의 LipofectamineTM 용액을 추가하여 1.2 mL 튜브에 100μL의 형질 감염 시약 용액을 준비하고 5분 동안 배양하였다.

(4) 먼저 AhRR 플라스미드를 0.66μL에서 100μL의 무 혈청 배지로 희석하여 수행하고, AhRR 플라스미드 용액을 희석된 LipofectamineTM 용액에 추가하고, 혼합 용액을 실온에서 20 분 동안 배양하였다.

(5) 200μL의 AhRR 플라스미드/LipofectamineTM 복합체를 세포에 추가하고, 가습 5% CO₂ 인큐베이터에서 37℃에서 세포를 배양하였다.

(6) 형질 감염 24 시간 후 세포를 수확하였다.

(7) 유전자 발현에 의해 증가되었는지 확인한다.

평가예

하기와 같이 웨스턴 블로팅, 세포 형태 및 면역 세포 화학을 사용한 유전자 과발현 평가하였다.

1. 웨스턴 블로팅(Western Blotting)

AhRR plasmid를 HaCaT 세포에 AhRR 과발현(pAhRR)하였을 때 세포에서 단백질 발현이 증가되었는지를 보기 위해 Western Blotting 방법을 진행하였으며 결과를 도 9에 도시하였다. 도 9를 참조하면, AhRR 항체로 검출(detection) 하였고 AhRR plasmid 처리한 두번째 줄에서 첫번째 줄보다 band의 진하기가 진한것으로 보아 AhRR 단백질양이 증가되었다는 것을 알 수 있다. GAPDH는 세포에 있는 유전자로 정량적으로 판단하기 위해 이용한 것이다.

2. 세포 형태

도 10은 세포 형태를 관찰하기 위하여 촬영한 사진으로, HaCaT 세포에 AhRR 과발현 했을때 세포의 모양이 둥글둥글한 모양에서 길쭉하게 변하는 것을 보고 AhRR plasmid가 세포 안으로 잘 들어갔다는 것을 확인할 수 있다.

3. 세포면역학

세포에서 AhRR이 증가되었는지 localization 보기위해 Immunocytochemistry실험방법을 이용하였으며, 결과를 도 11에 도시하였다. AhRR 항체를 넣고 현미경으로 관찰하면 파란색은 세포의 핵이고 형광부분이 세포질이다. AhRR은 세포질에서 주로 발현되므로 AhRR plasmid를 넣은 샘플에서 control 에서보다 세포질에서 형광이 많이 증가되었다. 이것은 AhRR plasmid에 의해 과발현이 잘 되었다는 것을 의미한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation Hallym University <120> Method of overexpressing aryl hydrocarbon receptor repressor (AhRR) in keratinocytes of skin <130> P202000 <140> 10-2020-0132481 <141> 2020-10-14 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid <400> 1 ctaatcctgg ctcgagatag atctatgatc ccgccggggg agtg 44 <210> 2 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid <400> 2 caaattggac taatcgatag atctctatgg caggaatgtg c 41

Claims (10)

1. AhRR의 유전자 서열을 설계하는 단계;
   AhRR 과발현 용액을 준비하는 단계;및
   피부 각질 세포로 AhRR 플라스미드를 전달하는 단계;를 포함하는, 피부 각질 세포에서의 아릴탄화수소 수용체 억제자(AhRR)의 과발현 방법으로,
   상기 과발현 방법은,
   피부 각질 세포로 AhRR 플라스미드를 전달하는 단계;를 포함하고,
   상기 피부 각질 세포로 AhRR 플라스미드를 전달하는 단계는,
   (a) 피부 각질 세포를 배양하는 단계; 및
   (c) AhRR 플라스미드-형질감염 시약 복합체를 상기 피부 각질 세포에 추가하여 배양하는 단계;를 포함하고,
   상기 AhRR 플라스미드는 서열번호 1 및 2의 뉴클레오타이드를 포함하는 pLNPH Bglll 벡터이고,
   상기 형질감염 시약은 리포펙타민을 포함하고,
   상기 (a)의 피부 각질 세포는, 35℃ 내지 39℃의 온도 및 3 내지 5%의 CO₂ 가습 분위기에서 배양되고,
   상기 (c)의 피부 각질 세포는, FBS를 함유한 배지 조건으로, 5 × 10⁵ 내지 9 × 10⁵ 세포/배양 플레이트의 밀도로 시드하여, 35℃ 내지 39℃의 온도 및 3 내지 5%의 CO₂ 가습 분위기에서 22시간 내지 26시간 동안 배양되고,
   시험관 내(in vitro)에서 상기 아릴탄화수소 수용체 억제자(AhRR)가 도입되어 피부 각질 세포 형태가 길쭉하게 변형되는 것을 확인하는 단계를 더 포함하고,
   시험관 내(in vitro)에서 상기 아릴탄화수소 수용체 억제자(AhRR)가 피부 각질 세포의 세포질에 도입된 것을 확인하는 단계를 더 포함하고,
   시험관 내(in vitro)에서 상기 피부 각질 세포에서의 피부 질환화를 유도하기 위한 것인,
   방법.
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