CN111254175B - 体外收集Midkine蛋白并用于处理细胞的方法 - Google Patents

体外收集Midkine蛋白并用于处理细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种体外收集Midkine蛋白并用于处理细胞的方法，培养高表达Midkine蛋白的细胞，利用Midkine蛋白的分泌特性，在培养基中收集Midkine蛋白，利用Western blot实验检测Midkine蛋白分泌量；通过Western blot实验检测发现MK蛋白可以转运至细胞内，并抑制AMPK的磷酸化水平；在细胞外施加Midkine蛋白的同时加入肝素(heparin)，通过Western blot实验检测发现Heparin抑制了Midkine蛋白进入细胞，并提高了AMPK蛋白的活性。本方法为研究Midkine的作用机制提供了新方法。

Description

体外收集Midkine蛋白并用于处理细胞的方法
技术领域
本发明属于细胞生物学和转化医学领域，尤其涉及一种midkine蛋白稳定高表达细胞系的构建和鉴定方法。
背景技术
Midkine蛋白是一种可分泌蛋白，在翻译完成后，去除信号肽的Midkine分子量约为13kD。研究显示，Midkine在人体组织中广泛表达，并可以通过分泌进入循环系统在体内进行转运。Midkine广泛参与到免疫炎症反应，神经发育，血压调控等多种生理过程的调控中。最新的临床样本数据显示，在乳腺癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌等多种恶性肿瘤中，Midkine的表达水平呈现上调趋势，且高表达midkine的病人组生存率显著下调，表明Midkine是一种促癌因子。基于上述现象，Midkine的功能研究一直都是研究的热点。
根据报道，Midkine蛋白属于多效生长因子(pleiotrophin,PTN)家族。经典理论认为，分泌到细胞外的Midkine蛋白通过与细胞膜上的受体相互结合调控下游信号通路，影响细胞的生理行为。已经发现的细胞膜midkine受体包括ALK(anaplastic lymphomakinase)，PTPζ(protein tyrosine phosphataseζ),Notch2，低密度脂蛋白(low densitylipoprotein，LDL)受体LRP1(LDL receptor protein 1)等。Midkine可以通过与这些受体结合，激活下游Akt，Erk等信号通路，促进细胞增殖等活动，但这些机制尚未与肿瘤的发生发展建立直接的联系。
此外，也有一些研究认为，细胞外的Midkine单蛋白可以通过结合LRP1受体，通过胞吞作用进入细胞；进入细胞后Midkine蛋白主要进入溶酶体降解，少数Midkine蛋白可以进入细胞核，调控核糖体RNA(rRNA)的合成核修饰。但关于Midkine在细胞内地功能研究很少，是关于Midkine功能核作用机制研究的重大不足。
Midkine是一种肝素(heparin)结合蛋白，可强烈而稳定地与heparin分子互作。由于肝素是一种由多糖构成地多聚体，分子量在15kD左右，不能被细胞吸收，因此，在细胞外与肝素结合地Midkine蛋白即失去进入细胞地能力。
我们在研究中发现细胞外的Midkine蛋白可以快速高效地转运进入细胞，在细胞中，Midkine蛋白主要定位于细胞质中，与报道不甚吻合，可能与细胞特异性有关。更重要的是，我们发现Midkine在细胞中行使重要的功能，例如调控AMPK信号通路。
AMPK(AMP-activated protein kinase)蛋白是真核生物特有的能量感受和调节因子，在细胞的代谢平衡调控中处于核心地位。AMPK是由α，β，γ三个亚基组成的异三聚体，其中β和γ亚基为调节亚基，γ亚基结合AMP(5’-adenosine monophosphate)使催化亚基α发生变构，被上游激酶LKB1(liver kinase 1)激活。当能量胁迫发生，细胞中AMP/ATP(5'-Adenylate triphosphate)比例发生变化时，AMPK大量磷酸化激活，进而发挥激酶活性通过磷酸化激活或抑制众多不同的下游底物，调控糖酵解，脂肪酸合成和β氧化，氨基酸代谢，糖原合成，细胞自噬等众多通路，达到促进分解代谢，抑制合成代谢，终止耗能生理过程的目的，使细胞适应能量胁迫的环境。如果在能量胁迫环境中AMPK不能很好地激活，细胞会由于能量缺乏受损，发生细胞凋亡。
我们在研究中发现，Midkine通过抑制上游LKB1蛋白的活性阻止LKB1对AMPK蛋白的磷酸化作用，从而抑制AMPK通路的激活。通过研究，我们发现Midkine蛋白对LKB1-AMPK通路的抑制作用发生于细胞内，即Midkine蛋白需要进入细胞才可以对AMPK的激活产生抑制作用。
基于以上研究现状，获得有活性的Midkine蛋白，用于处理细胞，是研究Midkine蛋白在细胞内功能的必要手段，对于进一步揭示Midkine的作用机制具有极大的推动作用，对早日实现Midkine在临床转化中的应用大有助益。
发明内容
1.本发明的目的是提供一种体外收集Midkine蛋白并用于处理细胞的方法，此方法获得的Midkine蛋白，可用于研究Midkine蛋白在细胞内的功能核作用机制。
2.本发明提供体外收集的Midkine蛋白，是通过收集Midkine该表达细胞的培养基，进行过滤核超滤浓缩获得的；这种Midkine蛋白浓缩液可以用于处理Midkine地表达细胞，使Midkine蛋白进入细胞内；利用heparin，可以阻止浓缩液中的Midkine进入细胞；通过Western Blot检测细胞内外Midkine蛋白水平AMPK的磷酸化程度，可以验证Midkine蛋白是否成功收集并进入细胞发挥功能。
3.本发明提供了一种体外收集Midkine蛋白并用于处理细胞的方法，其步骤如下：
(1)通过Western blot实验找到Midkine高表达核低表达的细胞系，并确认其具备分泌Midkine蛋白至细胞外的能力(图1A，B)；
(2)选择Midkine高表达细胞，按照2-5X106细胞/皿的数量将细胞接种到10cm培养皿中，用含有10％胎牛血清(FBS，SERANA，S-FBS-SA-015)的培养基进行培养；
(3)待24小时，细胞贴壁后，将细胞的培养基替换成无胎牛血清的培养基进行培养，使Midkine蛋白分泌至培养基中；
(4)培养Midkine低表达细胞，使用无胎牛血清培养基培养Midkine高表达细胞24小时后，按照0.5-1.5X106细胞/皿的数量将Midkine低表达细胞接种到6cm培养皿中；
(5)使用无胎牛血清培养基培养Midkine高表达细胞48小时后，用注射器吸取含有Midkine蛋白的培养基，使用0.22μm滤膜(Millipore,SLGP033RB)过滤，去除死细胞，细胞碎片等杂质；
(6)过滤后，将含有Midkine蛋白的培养基转移至10kD超滤管(Millipore,UFC901096)中，以3000-5000g离心力离心0.5-3小时，将10ml细胞培养基浓缩至250-1000μl，获得Midkine蛋白浓缩液；
(7)将获得的Midkine蛋白浓缩液加入Midkine低表达细胞培养基中，可在加入Midkine浓缩液时同时加入终浓度为10-50μg/ml的heparin，处理0-4小时；
(8)处理后，每个Midkine低表达细胞的培养皿加入1-2ml PBS(Hyclone，SH30256.01)洗去剩余培养基，吸走PBS，将细胞培养皿置于液氮中淬灭；
(9)每个培养皿加入100-200μl的RIPA裂解液(CST，9806S)，用细胞刮铲将细胞刮下，转移至1.5ml离心管中，4℃静止0.5至1小时，裂解细胞；
(10)4℃，12000rpm离心15min，吸取上清，获得细胞蛋白样品，按比例加入4XLoading Buffer(Takara，9173)，97℃变性10分钟，做好上样准备；
(11)将蛋白样品加入上样孔中进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后用湿转法将丙烯酰胺凝胶上的蛋白转印至0.45μm的PVDF膜上，使用5％脱脂奶粉(BD，232100)孵育1-3小时进行封闭，分别使用β-actin(Proteintech，20536-1-AP)和midkine(Origene，TA310977)，AMPKα(CST，5831)，p-AMPKαT72(CST，2535)，p-LKB1S428(CST，3482),LKB1(CST,3047),p-Akt S473(CST,4060),Akt(CST,4691)特异兔源一抗4℃孵育过夜.第二天，回收一抗，用TBST buffer(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％Tween-20)洗PVDF膜三次，每次10min，加入溶于5％脱脂奶粉(BD，232100)的羊抗兔二抗(Millipore，AP-132-P)，室温反应1小时，用TBST buffer(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％Tween-20)洗PVDF膜三次，每次10min，完成发光准备工作；
(12)使用ECL发光液(Tanon，180-501)进行化学发光反应，检测蛋白表达水平。可检测到外部施加的Midkine蛋白已经转移到细胞内部，并引起LKB1和AMPK蛋白磷酸化程度降低(图1C，D)，在加入heparin的实验组中，Midkine未能进入细胞，使AMPK磷酸化维持在较高水平(图1D)；
(14)与现有技术相比，应用本发明利用Midkine蛋白的分泌特性，使用Midkine高表达细胞为来源，保证了Midkine蛋白的生物学活性；通过无血清培养，使获得的Midkine浓缩液中减少了其它生长因子的干扰，同时降低生长因子总浓度，便于超滤操作；本发明利用Midkine蛋白与heparin结合的特性，在培养基中加入肝素分子，改变Midkine蛋白进入细胞的能力，丰富了实验设计的灵活性；本发明为研究Midkine在细胞内的功能和作用机制提供了新的方法，为实现Midkine的临床转化应用埋下了基石。
附图说明
图1：体外收集Midkine蛋白并用于处理细胞的方法。(A)利用Western Blot实验检测不同细胞中Midkine表达水平；(B)利用Western Blot检测不同细胞中培养基中Midkine分泌情况；(C)体外收集Midkine蛋白后用于处理MHCC97H细胞，在不同时间通过WesternBlot实验检测Midkine蛋白转运进入细胞地情况以及相应LKB1，AMPK蛋白地磷酸化水平改变；(D)体外收集Midkine蛋白后用于处理MHCC97H细胞，同时加入heparin处理，通过Western Blot实验检测Midkine蛋白转运进入细胞地情况以及相应LKB1，AMPK蛋白地磷酸化水平改变。
具体实施方式
下面通过体外收集Midkine蛋白并用于处理细胞的实例，详细描述本发明的效果
实例1
体外收集LM3细胞分泌的Midkine蛋白并用于处理MHCC97H细胞
1)使用Western blot的方法检测不同细胞中Midkine的表达水平，发现在LM3和HepG2细胞中Midkine蛋白表达水平远高于正常细胞THLE-2(图1A)，同时，在LM3和HepG2细胞的培养基中也可以检测到大量分泌的Midkine蛋白(图1B)，说明这两种细胞可以作为Midkine蛋白的供体，而在7402和MHCC97H细胞中，Midkine表达水平远低于正常细胞THLE-2，可作为Midkine蛋白的接受细胞；
(2)选择Midkine高表达细胞LM3进行培养，按照2X106细胞/皿的数量将LM3细胞接种到10cm培养皿中，用含有10％胎牛血清(SERANA，S-FBS-SA-015)的DMEM培养基(gibco，C11995500BT)进行培养；
(3)待24小时后，通过显微镜观察到LM3细胞已经贴壁生长，将LM3细胞的培养基替换成无胎牛血清的DMEM培养基(gibco，C11995500BT)进行培养，使Midkine蛋白分泌至培养基中；
(4)培养Midkine低表达细胞MHCC97H，在使用无胎牛血清DMEM培养基(gibco，C11995500BT)培养LM3细胞24小时后，按照1.2X106细胞/皿的数量将MHCC97H细胞接种到6cm培养皿中，使用含10％胎牛血清(SERANA，S-FBS-SA-015)的RPMI-1640培养基(gibco，C11875500BT)进行培养；
(5)在使用无胎牛血清DMEM培养基(gibco，C11995500BT)培养LM3细胞48小时后，用注射器吸取含有Midkine蛋白的培养基，使用0.22μm滤膜(Millipore,SLGP033RB)过滤，去除死细胞，细胞碎片等杂质；
(6)过滤后，将含有Midkine蛋白的培养基转移至10kD超滤管(Millipore,UFC901096)中，以4800g离心力离心1.5小时，将10ml细胞培养基浓缩至250μl，获得Midkine蛋白浓缩液；
(7)将获得的Midkine蛋白浓缩液加入3个培养MHCC97H细胞的6cm培养皿中，分别处理0，0.5和1小时；
(8)处理后，向MHCC97H细胞的培养皿中加入1-2ml PBS(Hyclone，SH30256.01)洗去剩余培养基，吸走PBS，将细胞培养皿置于液氮中淬灭；
(9)每个培养皿加入100-200μl的RIPA裂解液(CST，9806S)，用细胞刮铲将细胞刮下，转移至1.5ml离心管中，4℃静止0.5小时，裂解细胞；
(10)4℃，12000rpm离心15min，吸取上清，获得细胞蛋白样品，按比例加入4XLoading Buffer(Takara，9173)，97℃变性10分钟，做好上样准备；
(11)将蛋白样品加入上样孔中进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后用湿转法将丙烯酰胺凝胶上的蛋白转印至0.45μm的PVDF膜(Millipore，IPVH00010)上，使用5％脱脂奶粉(BD，232100)孵育1-3小时进行封闭，分别使用β-actin(Proteintech，20536-1-AP)和midkine(Origene，TA310977)，AMPKα(CST，5831)，p-AMPKαT72(CST，2535)，p-LKB1S428(CST，3482),LKB1(CST,3047),p-Akt S473(CST,4060),Akt(CST,4691)特异兔源一抗4℃孵育过夜；第二天，回收一抗，用TBST buffer(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％Tween-20)洗PVDF膜三次，每次10min，加入溶于5％脱脂奶粉(BD，232100)的羊抗兔二抗(Millipore，AP-132-P)，室温反应1小时，用TBST buffer(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％Tween-20)洗PVDF膜三次，每次10min，完成发光准备工作；
(12)使用ECL发光液(Tanon，180-501)进行化学发光反应，检测蛋白表达水平。可检测到外部施加的Midkine蛋白已经转移到细胞内部，并引起LKB1和AMPK蛋白磷酸化程度降低，而Akt磷酸化程度升高(图1C)，与已知Midkine的功能吻合，证明收集Midkine并处理细胞的操作成功。
实例2
体外收集LM3细胞分泌的Midkine蛋白并结合heparin用于处理MHCC97H细胞
(1)使用Western blot的方法检测不同细胞中Midkine的表达水平，发现在LM3和HepG2细胞中Midkine蛋白表达水平远高于正常细胞THLE-2(图1A)，同时，在LM3和HepG2细胞的培养基中也可以检测到大量分泌的Midkine蛋白(图1B)，说明这两种细胞可以作为Midkine蛋白的供体，而在7402和MHCC97H细胞中，Midkine表达水平远低于正常细胞THLE-2，可作为Midkine蛋白的接受细胞；
(2)选择Midkine高表达细胞LM3进行培养，按照2X106细胞/皿的数量将LM3细胞接种到10cm培养皿中，用含有10％胎牛血清(SERANA，S-FBS-SA-015)的DMEM培养基(gibco，C11995500BT)进行培养；
(3)待24小时后，通过显微镜观察到LM3细胞已经贴壁生长，将LM3细胞的培养基替换成无胎牛血清的DMEM培养基(gibco，C11995500BT)进行培养，使Midkine蛋白分泌至培养基中；
(4)培养Midkine低表达细胞MHCC97H，在使用无胎牛血清DMEM培养基(gibco，C11995500BT)培养LM3细胞24小时后，按照1.2X106细胞/皿的数量将MHCC97H细胞接种到6cm培养皿中，使用含10％胎牛血清(SERANA，S-FBS-SA-015)的RPMI-1640培养基(gibco，C11875500BT)进行培养；
(5)在使用无胎牛血清DMEM培养基(gibco，C11995500BT)培养LM3细胞48小时后，用注射器吸取含有Midkine蛋白的培养基，使用0.22μm滤膜(Millipore,SLGP033RB)过滤，去除死细胞，细胞碎片等杂质；
(6)过滤后，将含有Midkine蛋白的培养基转移至10kD超滤管(Millipore,UFC901096)中，以4800g离心力离心1.5小时，将10ml细胞培养基浓缩至250μl，获得Midkine蛋白浓缩液；
(7)将获得的Midkine蛋白浓缩液加入2个培养MHCC97H细胞的6cm培养皿中，并在其中一个皿中加入终浓度为30μg/ml的肝素，处理2小时；
(8)处理后，向MHCC97H细胞的培养皿中加入1-2ml PBS(Hyclone，SH30256.01)洗去剩余培养基，吸走PBS，将细胞培养皿置于液氮中淬灭；
(9)每个培养皿加入100-200μl的RIPA裂解液(CST，9806S)，用细胞刮铲将细胞刮下，转移至1.5ml离心管中，4℃静止0.5小时，裂解细胞；
(10)4℃，12000rpm离心15min，吸取上清，获得细胞蛋白样品，按比例加入4XLoading Buffer(Takara，9173)，97℃变性10分钟，做好上样准备；
(11)将蛋白样品加入上样孔中进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后用湿转法将丙烯酰胺凝胶上的蛋白转印至0.45μm的PVDF膜(Millipore，IPVH00010)上，使用5％脱脂奶粉(BD，232100)孵育1-3小时进行封闭，分别使用β-actin(Proteintech，20536-1-AP)和Midkine(Origene，TA310977)，AMPKα(CST，5831)，p-AMPKαT72(CST，2535)特异兔源一抗4℃孵育过夜；第二天，回收一抗，用TBST buffer(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％Tween-20)洗PVDF膜三次，每次10min，加入溶于5％脱脂奶粉(BD，232100)的羊抗兔二抗(Millipore，AP-132-P)，室温反应1小时，用TBST buffer(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％Tween-20)洗PVDF膜三次，每次10min，完成发光准备工作；
(12)使用ECL发光液(Tanon，180-501)进行化学发光反应，检测蛋白表达水平。可检测到外部施加的Midkine蛋白已经转移到细胞内部，并导致AMPK蛋白磷酸化程度降低，而加入heparin处理阻止了Midkine蛋白进入细胞，从而维持了AMPK的磷酸化激活状态(图1D)，与已知Midkine的功能吻合，证明收集Midkine并处理细胞，以及用heparin干扰Midkine进入细胞的操作成功。

Claims (4)

1.一种抑制AMPK的磷酸化水平或提高AMPK蛋白活性的方法，其包括：体外收集Midkine蛋白并用于处理细胞，具体步骤如下：
1）培养高表达Midkine蛋白的细胞，利用Midkine蛋白的分泌特性，在培养基中收集Midkine蛋白；收集细胞培养基中分泌的Midkine蛋白，过滤除去细胞碎片；超滤浓缩后得Midkine蛋白浓缩液；
2）采用Midkine蛋白浓缩液处理低表达Midkine蛋白的细胞， Midkine蛋白转运至细胞内，并抑制AMPK的磷酸化水平；
或，在低表达Midkine蛋白的细胞外施加Midkine蛋白浓缩液的同时加入肝素（heparin），检测发现Heparin抑制了Midkine蛋白进入细胞，并提高了AMPK蛋白的活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养高表达Midkine蛋白的细胞包含以下步骤：
（1）选择Midkine高表达细胞，接种到10cm培养皿；
（2）24小时后，使用无血清培养基培养细胞，使Midkine蛋白分泌到培养基中；
（3）培养48小时后，获得含有Midkine蛋白的细胞培养基。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述高表达Midkine蛋白的细胞为Midkine蛋白表达水平高于正常组织细胞的细胞株，低表达Midkine蛋白的细胞为Midkine表达水平低于正常组织细胞的细胞株。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）包含以下步骤：提取细胞蛋白，进行Western Blot实验，通过特异抗体检测细胞中Midkine表达水平以及AMPK蛋白磷酸化水平，证明Midkine蛋白是否进入细胞并发挥功能；发现Midkine蛋白转运至Midkine低表达细胞内，并抑制AMPK的磷酸化水平；而Heparin抑制了Midkine蛋白进入细胞，并提高了AMPK蛋白的活性。
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Title
Li-Cheng Dai等.Midkine accumulated in nucleolus of HepG2 cells involved in rRNA transcription.《World J Gastroenterol》.2008,第14卷(第40期),6249-6253. *

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