CN1871347B

CN1871347B - 引起硬化的增殖性疾病的检测方法和试剂盒、引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗药、以及对在引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗中有效的物质进行鉴定的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN1871347B
Application number: CN2004800263069A
Authority: CN
Inventors: 土井俊夫; 安部秀齐
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; Hubit Genomix Inc
Current assignee: Doi Toshio; Hubit Genomix Inc
Priority date: 2003-09-11
Filing date: 2004-09-09
Publication date: 2011-05-25
Anticipated expiration: 2024-09-09
Also published as: US9359645B2; KR20070026303A; EP1672062B1; US7901874B2; CN1871347A; EP2261331A1; WO2005026344A1; JP5199322B2; KR101242260B1; EP1672062A1; ATE557087T1; US20160333412A1; US20100135988A1; JPWO2005026344A1; EP1672062A4; JP2011050383A; US20080025967A1; JP4664815B2; HK1097880A1

Abstract

本发明提供引起硬化的增殖性疾病的检测方法及其试剂盒，包括：对生物体样品中的从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的表达进行测定。本发明还提供引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗药，其中作为有效成分含有具有对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1以及磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达进行抑制的作用的物质。本发明还提供对在引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗中有效的物质进行鉴定的方法及其试剂盒，其中包括判定受检物质是否抑制从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1以及磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达。

Description

引起硬化的增殖性疾病的检测方法和试剂盒、引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗药、以及对在引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗中有效的物质进行鉴定的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及引起硬化的增殖性疾病的检测方法和试剂盒、引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗药、以及对在引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗中有效的物质进行鉴定的方法和试剂盒。

背景技术

α1IV胶原(collagen)(Col4)是存在于血管内皮细胞与中膜平滑肌细胞之间的血管基底膜的主要构成成分，Col4的过量产生在糖尿病性血管损害、动脉硬化、老化相关疾病中起到决定性作用。另外，持续的高血糖状态被认为是糖尿病的并发症的主要原因(非专利文献1和2)。已知过量的晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end products：AGEs)通过高血糖存在，在血管和其它细胞中诱导各种事件，认为可能是通过多种AGEs受体与病情相关(非专利文献3、4和5)。

近年来，认为AGEs不仅与糖尿病合并症有关，而且还与由老化引起的动脉硬化有关(非专利文献6和7)。进而，切断型的可溶性AGEs受体被报道为抑制糖尿病性动脉硬化的进展(非专利文献8)。

糖尿病性肾病的进展的特征在于，在形态学上肾小球基底膜(GBM)的肥厚和细胞外基质(ECM)的增大。由于Col4为肾小球基底膜肥厚和细胞外基质增大的主要构成成分，所以弄清Col4在糖尿病的状态中怎样被转录控制比较重要。Col4的双向性130bp的启动子(promoter)具有已知与几种DNA结合蛋白发生反应的大的茎-环(stem-loop)结构(CIV)(非专利文献9)。本发明人等在以前的报道中显示，利用凝胶迁移检测(gel shift assay)，未知的蛋白质只在通过向AGEs的暴露来诱导Col4的情况下才会结合CIV(非专利文献10)。

肾小球系膜细胞的增殖和肾小球硬化均为进行性肾小球损害的主要病理学特征。在很多伴随肾小球硬化的疾病中可见肾小球系膜细胞的增殖，这表明在进行性肾小球损害中，该过程很重要(非专利文献11(A1)、非专利文献12(A2))。这两个事件几乎在所有的肾小球疾病中均可见到，但尚不清楚肾小球系膜细胞的增殖到底怎样参与肾小球硬化的进展。

体内(in vivo)和体外(in vitro)均显示血小板来源增殖因子(PDGF)为肾小球系膜细胞的重要分裂促进因子(非专利文献13(A3)、非专利文献14(A4))。对于PDGF起到肾小球硬化的进展的关键作用这一点，不仅用实验模型(model)，而且在人的肾小球疾病中也有几个证据(非专利文献13(A3))。PDGF-BB也被报道成在肾小球系膜细胞的增殖中有重要作用(非专利文献15(A5))，在残存肾模型中，肾小球硬化持续进展(非专利文献16(A6))。在大鼠的肾小球肾炎模型中，给针对PDGF的中和抗体后，肾小球系膜细胞的增殖和肾小球硬化这双方均显著恢复(非

专利文献17(A7))，但几乎不清楚抑制细胞增殖会抑制肾小球硬化病变的机制。

非专利文献1：The Diabetes Control and Complications Trial ResearchGroup.N.Engl.J.Med.329，977-986(1993).

非专利文献2：UK Prospective Diabetes Study(UKPDS)Group.Lancet352，837-853(1998)

非专利文献3：H.Vlassara，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，11704-11708(1994).

非专利文献4：M.Brownlee，A.Cerami，H.Vlassara，N.Engl.J.Med.318，1315-1321(1988).

非专利文献5：T.Doi，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，2873-2877(1992).

非专利文献6：H.Vlassara，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，12043-12047(1992).

非专利文献7：M.S.Huijberts，et al.，J.Clin.Invest.92，1407-1411(1993).

非专利文献8：S.L.Park，et al.，Nature Med.9，1025-1031(1998)

非专利文献9：L.A.Bruggeman，P.D.Burbelo，Y.Yamada，P.E.Klotman，Oncogene 7，1497-1502(1992).

非专利文献10：N.Iehara，H.Takeoka，Y.Yamada，T.Kita，T.Doi，Kidney Int.50，1166-1172(1996).

非专利文献11：Fogo A，Ichikawa I.Evidence for the central role ofglomerular growth promoters in the development of sclerosis.Semin Nephrol.1989 Dec；9(4)：329-42

非专利文献12：Striker LJ，Doi T，Elliot S，Striker GE.The contributionof glomerular mesangial cells to progressive glomerulosclerosis.SeminNephrol.1989 Dec；9(4)：318-28.Review.

非专利文献13：Floege J，Johnson RJ：Multiple roles for platelet-derivedgrowth factor in renal disease.Miner Electrolyte Metab 21：271-282，1995

非专利文献14：Doi T，Vlassara H，Kirstein M，Yamada Y，Striker GE，Striker LJ：Receptor-specific increase in extracellular matrix production bymesangial cells by advanced glycosylation end products is mediated viaplatelet-derived growth factor.Proc Natl Acad Sci USA 89：2873-2877，1992

非专利文献15：Barnes JL，Hevey KA.Glomerular mesangial cellmigration in response to platelet-derived growth factor.Lab Invest.1990Mar；62(3)：379-82.

非专利文献16：Floege，J.，Burns，M.W.，Alpers，C.E.，Yoshimura，A.，Pritzl，P.，Gordon，K.，Seifert，R.A.，Bowen-Pope，D.F.，Couser，W.G.，andJohnson，R.J.：Glomerular cell proliferation and PDGF expression precedeglomerulosclerosis in the remnant kidney model.Kidney Int.41：297-309，1992

非专利文献17：Johnson，R.J.，Raines，E.W.，Floege，J，et al：Inhibitionof mesangial cell proliferation and matrix expansion in glomerulonephritis inthe rat by antibody to platelet-derived growth factor.J Exp Med 175：1413-1416，1992

发明内容

糖尿病性肾病为晚期肾功能衰竭的主要原因。IV型胶原是血管基底膜或肾小球的肾小球系膜基质的主要构成成分，在糖尿病中的血管损害中起到重大作用，在糖尿病状态下，什么与IV型胶原的过量产生直接相关尚不清楚。本发明的目的在于，鉴定与IV型胶原的过量产生直接相关的物质，显示该物质作为糖尿病性肾病的病因起到决定性作用。另外，本发明的目的还在于，提供一种利用了与IV型胶原的过量产生直接相关的物质的糖尿病性肾病的检测方法和试剂盒。进而，本发明的目的还在于，提供一种具有对与IV型胶原的过量产生直接相关的物质的表达进行抑制的作用的物质的用途。进而，本发明的目的还在于，提供一种鉴定在糖尿病性肾病的预防和/或治疗中有效的物质的方法和试剂盒、鉴定在抑制细胞外基质增殖中有效的物质的方法和试剂盒、以及鉴定在抑制α1IV型胶原的表达中有效的物质的方法和试剂盒。

另外，本发明的目的在于，在大鼠的肾小球肾炎中显示对PDGF-B链引起的活化进行抑制的PDGFβ受体抗体(APB5)的用药效果，在体内和体外显示PDGF信号传导系统调节肾小球细胞增殖和肾小球硬化两方面。本发明在目的还在于，提供一种利用了与肾小球细胞增殖和肾小球硬化相关的物质的、引起硬化的增殖性疾病的检测方法和试剂盒。进而，另外，本发明在目的还在于，提供一种具有对与肾小球细胞增殖和肾小球硬化相关的物质的表达进行抑制的作用的物质的用途。进而，另外本发明在目的在于，提供一种鉴定在引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗中有效的物质的方法和试剂盒、鉴定在抑制细胞外基质的增殖中有效的物质的方法和试剂盒、以及鉴定在抑制α1IV型胶原的表达中有效的物质的方法和试剂盒。

本发明人等鉴定了作为与IV型胶原的过量产生直接相关的物质的Smad1，并揭示了Smad1作为糖尿病性肾病的病因具有决定性作用。另外，本发明人等研究了正常人和糖尿病性肾病患者的肾小球中的Smad1和活化素(activin)受体样激酶1(ALK1)的表达，结果发现，在糖尿病性肾病患者中Smad1和ALK1的表达与硬化性病变的严重程度成比例，在正常人中几乎未见Smad1和ALK1的表达。进而，还发现在AGEs的刺激下，控制Smad1表达的BMP2和4的表达增加。

不过，在很多伴随肾小球硬化的疾病人群中，可见肾小球系膜细胞的增殖，这表明在进行性肾小球损害中，该过程很重要，但细胞增殖与肾小球硬化之间的关系不明。最近，本发明人等揭示了在糖尿病性肾小球硬化中，作为肾小球硬化的主要构成成分的IV型胶原(Col4)的过量表达由Smad1转录调节。在本研究中，本发明人等在大鼠的肾小球肾炎中显示了对由PDGF-B链引起的活化进行抑制的PDGFβ受体抗体(APB5)的给药效果，在体内和体外揭示了PDGF信号传导系统调节肾小球细胞增殖和肾小球硬化两方面。

肾小球系膜增殖性肾小球肾炎的实验模型(Thy1 GN)被抗大鼠Thy-1.1单克隆抗体的一次静脉注射所诱发。在Thy1 GN中，肾小球系膜细胞的增殖和Col4的表达在第六天变为最大。对Smad1、磷酸化Smad1(pSmad1)、磷酸化STAT3(pSTAT3)进行免疫组织染色的结果，肾小球的Smad1的表达峰值在第六天，与肾小球系膜增殖的峰值一致。肾小球的pSmad1的表达从Thy1GN的第一天开始上升，发病后第四天成为最大。在用APB5处置后的组中，肾小球系膜细胞增殖和肾小球硬化均有意义地减少。Smad1、pSmad1、pSTAT3的表达也在通过APB5的给药进行研究的所有方面存在有意义的减少。APB5处理在体外随着pSmad1、pSTAT3的表达降低或Col4蛋白的表达减少而使肾小球系膜细胞的增殖减少。在培养肾小球系膜细胞中，显性阴性的STAT3的导入使Col4的表达有意义地降低。这些数据表明STAT3和Smad1的活化与从肾小球系膜细胞增殖到肾小球硬化的进展相关。

本发明正是基于这些发现而完成的发明。

本发明的目的如下所述。

(1)引起硬化的增殖性疾病的检测方法，其中，包括：测定生物体样品中的从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1(activin receptor-like kinase 1)、活化素受体样激酶3(activinreceptor-like kinase 3)以及骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein)中选择的至少一种物质的表达。

(2)对引起硬化的增殖性疾病的进展程度和/或治疗的有效性进行评价的方法，其中，包括：测定生物体样品中的从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的表达。

(3)用于对引起硬化的增殖性疾病进行检测的试剂盒，其中，含有用于对生物体样品中的从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的表达进行测定的试剂。

(4)用于对引起硬化的增殖性疾病的进展程度和/或治疗的有效性进行评价的试剂盒，其，含有用于对生物体样品中的从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的表达进行测定的试剂。

(5)糖尿病性肾病的检测方法，其中，包括对生物体样品中的Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的表达进行测定。

(6)对糖尿病性肾病的进展程度和/或治疗的有效性进行评价的方法，其中，包括对生物体样品中的Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的表达进行测定。

(7)用于检测糖尿病性肾病的试剂盒，其中含有用于对Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的表达进行测定的试剂。

(8)用于评价糖尿病性肾病的进展程度和/或治疗的有效性的试剂盒，其中含有用于对Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的表达进行测定的试剂。

(9)引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗药，其中，作为有效成分，含有：具有对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达进行抑制的作用的物质。

(10)抑制细胞外基质的增殖的药剂，其中，作为有效成分，含有：具有对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达进行抑制的作用的物质。

(11)抑制α1IV型胶原的表达的药剂，其中，作为有效成分，含有：具有对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达进行抑制的作用的物质。

(12)对在引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗中有效的物质进行鉴定的方法，其中，包括：判定受检物质是否对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达进行抑制。

(13)对在细胞外基质的增殖抑制中有效的物质进行鉴定的方法，其中，包括：判定受检物质是否对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达进行抑制。

(14)对在α1IV型胶原的表达抑制中有效的物质进行鉴定的方法，其中，包括：判定受检物质是否对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达进行抑制。

(15)用于对在引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗中有效的物质进行鉴定的试剂盒，其中，含有用于对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达进行测定的试剂。

(16)用于对在细胞外基质的增殖抑制中有效的物质进行鉴定的试剂盒，其中，含有用于对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达进行测定的试剂。

(17)用于对在α1IV型胶原的表达抑制中有效的物质进行鉴定的试剂盒，其中，含有用于对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达进行测定的试剂。

通过本发明，作为与α1IV型胶原的过量产生直接相关的物质，Smad1被鉴定，表明Smad1作为糖尿病性肾病的病因具有决定性的作用。这样，可以检测出糖尿病性肾病，进而提供了糖尿病性肾病的预防和/或治疗药、抑制细胞外基质的增殖的药剂、抑制α1IV型胶原的表达的药剂。另外，通过本发明，还提供了对在糖尿病性肾病的预防和/或治疗中有效的物质进行鉴定的方法和试剂盒、对在抑制细胞外基质增殖中有效的物质进行鉴定的方法和试剂盒、以及对在抑制α1IV型胶原的表达中有效的物质在进行鉴定的方法和试剂盒。

另外，通过本发明，还揭示了STAT3和Smad1的活化是调节进行性肾小球损害时的两个现象、细胞增殖和肾小球硬化的相互作用的关键的途径。这样，可以检测出引起硬化的增殖性疾病，进而，提供了引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗药、抑制细胞外基质增殖的药剂、抑制α1IV型胶原的表达的药剂。另外，通过本发明，还提供了对在引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗中有效的物质进行鉴定的方法和试剂盒、对在抑制细胞外基质增殖中有效的物质进行鉴定的方法和试剂盒、以及对在抑制α1IV型胶原的表达中有效的物质进行鉴定的方法和试剂盒。

本说明书包括了作为本发明的优先权基础的日本国专利申请、特愿2003-319538号说明书和/或附图中记载的内容。

附图说明

图1表示通过Smad1活化Col4启动子。(A)：使用AGEs存在下或BSA存在下(对照)的培养肾小球系膜细胞，使用图示的抗体，进行染色质免疫沉淀法。使用针对CIV-1模体的引物进行PCR。显示反复进行3次的实验中的1次结果。(B)：将CMV-LUC作为内部对照，将加入了CIV-1-LacZ报告质粒和野生型Smad1的载体或单纯载体(mock)同时导入培养细胞中。利用Western印迹法并通过抗Smad1抗体和抗pSmad1抗体，分析细胞提取液。显示反复进行3次的实验的1次结果。(C)：48小时后，溶解培养细胞，检测β-半乳糖苷酶活性和萤光素酶活性。测定各进行3次，显示SD。

图2表示通过暴露于AGEs而进行动态变动的Smad1表达。(A)：用RNA酶保护检测(RNase protection assay)观察被暴露于AGEs或BSA中的肾小球系膜细胞的Smad1和Col4mRNA表达的经时变化。持续暴露于AGEs使Smad1的表达持续亢进，Col4的表达也平行增加。显示反复进行3次的实验的1次结果。(B)：在AGEs或BSA存在下培养72小时、120小时后肾小球系膜细胞的免疫萤光照片。显示反复进行3次的实验的1次结果。(C)：用Western印迹观察在AGEs或BSA存在下已进行72小时培养时的Smad1和pSmad1。显示反复进行3次的实验的1次结果。

图3表示针对肾小球系膜细胞中的Smad1的特异性反义寡(脱氧)核苷酸的效果。(A)：72小时的AGEs处理后，用针对Samd1的反义寡(脱氧)核苷酸、和4个错配寡(脱氧)核苷酸(对照)处理肾小球系膜细胞16小时。用抗Smad1抗体(绿)对用反义寡(脱氧)核苷酸处理过的细胞的肾小球系膜细胞进行免疫萤光染色，进而进行DAPI染色(蓝)。显示反复进行3次的实验的1次结果。(B)向AGEs暴露后的肾小球系膜细胞中导入针对Smad1的反义寡(脱氧)核苷酸和4个错配寡(脱氧)核苷酸(对照)。显示反复进行3次的实验的1次结果。(C)：针对Smad1的反义寡(脱氧)核苷酸抑制Smad1的表达亢进，但同时也抑制Col4的表达亢进。显示反复进行3次的实验的1次结果。

图4表示在糖尿病性肾病的人中检测出Smad1和ALK1的表达的结果。使用抗Smad1抗体和抗ALK1抗体对5例糖尿病、3例非糖尿病的肾小球进行免疫组织染色。Smad1和ALK1糖尿病的肾小球中的的表达显著可见，而在非糖尿病的肾小球未见。用苏木精对所有的切片进行对比染色。照片的放大率全部为400倍。

图5表示将在AGEs存在下培养的肾小球系膜细胞中的mRNA的表达量与BSA存在下的培养肾小球系膜细胞进行比较的结果。

图6表示用Western印迹法测定糖尿病性肾病患者的尿中BMP2的结果。

图7表示用Western印迹法测定在通过TGF-β信号的慢性刺激下BMP2和BMP4蛋白的表达的结果。

图8是根据实施例1的结果的信号传导通路的模式图。

图9表示Thy1 GN大鼠形成弥漫性肾小球系膜基质的增殖和肾小球系膜区域的扩大的显微镜像。在使用抗Col4抗体的免疫组织染色中，在Thy1GN的肾小球的已扩大的肾小球系膜区域，可见ColIV过量表达。APB5使肾小球系膜的增殖和ColIV表达减少。在Thy1 GN肾小球中，PDGF-B链和PDGFβ受体也为显著阳性，而APB5也使它们的过量表达减少。A-C：PAM、D-F：ColIV、G-H：PDGF-B链、J-K：PDGFβ受体、A、D、G、J：正常对照大鼠、B、E、H、J：第六天的疾病对照大鼠、C、F、I、L：第六天的APB5处置大鼠

图10表示Thy GN中的组织学变化和APB5给药效果的定量。A：肾小球细胞数。在Thy1 GN组中可见肾小球细胞数的增加。B：Thy1 GN的PCNA阳性细胞数。APB5处理过的肾小球的PCNA阳性细胞数在任何调查点(point)中均有意义地减少。C：肾小球系膜基质的增殖。在第六天的Thy1 GN大鼠中，观察到肾小球系膜基质的增殖。APB5在各调查点均使肾小球系膜基质的增殖有意义地减少。D：IV型胶原的表达。在对照组中，Col4在已扩大的肾小球系膜区域为强阳性。APB5使Col4的表达有意义地减少。^*P＜0.001vs.对照组、^**P＜0.001vs.APB5非处理疾病对照组

图11表示Thy1GN中的Smad1、磷酸化Smad1、磷酸化STAT3的免疫组织化学染色。在Thy1GN大鼠的肾小球的免疫组织化学染色中，Smad1、磷酸化Smad1、磷酸化STAT3的表达上升得惊人。在Thy1GN中，明显可见磷酸化Smad1与核在相同部位。在APB5处置中，各自的减少都非常有意义。A-C：Smad1、D-F：磷酸化Smad1、G-I：磷酸化STAT3、A、D、G：正常对照大鼠、B、E、H：第六天的未处置Thy1大鼠、C、F、I：第六天的APB5处置大鼠

图12表示Smad1、pSmad1、pSTAT3表达的时程(time course)。在Thy1 GN大鼠的第0、1、2、4、6、12天的肾切片上，进行使用了针对Smad1、磷酸化Smad1、磷酸化STAT3的抗体的荧光组织染色。A：在Thy1GN中的Smad1表达。Smad1表达在第六天变为最大，在第12天沉默。B：pSmad1阳性细胞相对整个肾小球细胞的比例的时程。pSmad1的表达在第四天变为最大。C：pSTAT3表达的时程。肾小球系膜区域的pSTAT3阳性部分的比例增大到第六天，在第12天沉默。^*P＜0.001vs.对照组、^**P＜0.001vs.各调查点

图13表示Smad1、pSmad1、pSTAT3表达中的APB5的效果。进行免疫组织染色和Smad1、pSmad1、pSTAT3表达的定量，结果这些蛋白像肾小球系膜基质和肾小球的ColIV表达那样，通过APB5处置而减少。A：Smad1的表达。B：pSmad1的表达。C：pSTAT3的表达。^*P＜0.01vs.APB5非处理疾病对照

图14表示在体内的APB5的效果。A：APB5抑制肾小球系膜细胞增殖的效果。BDGF-B的添加使肾小球系膜细胞增殖增大，APB5有意义地抑制该增大。^*P＜0.05vs.对照、^**P＜0.05vs.接受PDGF-B刺激的对照、B：Western印迹分析：通过APB5的添加引起的pSTAT3、pSmad1、Col4蛋白的表达减少。显示3次独立实验中的1次。

图15表示已导入基因的肾小球系膜细胞的Western印迹分析结果。显性阴性(dominant negative)STAT3引起pSmad1和Col4蛋白的表达减少。显示3次独立的实验的1次。

图16表示根据实施例1和2的结果的信号传导通路的模式图。

图17表示用患者和正常人的尿，将抗ALK-1作为第一抗体进行Western印迹的结果。道1～5：糖尿病性肾病患者，道6：糖尿病合并伴随硬化的肾增殖性疾病的线粒体病患者，道7、8：糖尿病合并不伴随硬化的肾疾病的患者，道9～10：正常人

图18表示用治疗中的糖尿病性肾病患者尿，将抗ALK-1作为第一抗体进行Western印迹的结果。表示从左道开始，从治疗开始时每周的泳动图像。

图19表示用患者和正常人的尿，将抗Smad1作为第一抗体进行Western印迹的结果。道1～5：糖尿病性肾病患者，道6：糖尿病合并伴随硬化的肾增殖性疾病的线粒体病患者，道7、8：糖尿病合并不伴随硬化的肾疾病的患者，道9～10：正常人

具体实施方式

1.糖尿病性肾病的检测方法和试剂盒

本发明提供一种包括对生物体样品中Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的表达进行测定的糖尿病性肾病的检测方法。

生物体样品可以是能够检测出Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的任何生物体样品。作为生物体样品的例子，可以举出肾脏组织切片、血液、血清、尿等。

在哺乳类中，Smad从1到9已被鉴定，Smad1已知作为骨形态发生蛋白(BMP)信号传导系统的一员，BMP借助活化素受体激酶2、3、6(ALK2、ALK3、ALK6)调节靶基因转录(ZwijsenA.et al.，FEBS Letters546，2003，133-139)。与BMP信号特异相关的Smad另外还有Smad5和8。另外还有与TGF-β/活化素信号特异相关的Smad，可以举出Smad2和Smad3。另一方面，Smad1已知在内皮细胞和造血细胞等中，借助活化素受体样激酶1(ALK1)传导TGF-β的信号，进行靶基因的转录调节(Goumans MJ.et al.，EMBO J.，2002，Apr 2，21(7)，1743-53)。即，通过活化Smad1来调整靶基因转录的信号传导系统，主要存在BMP系统和TGF-β系统两条途经(图8)。但是，没有充分探讨哪一种组合引导的通路最重要。

“具有Smad1活化作用的物质”，可以是能够活化Smad1的物质，可以是活化素受体样激酶1(ALK1)、活化素受体样激酶3(ALK3)之类的直接活化Smad1的物质，骨形态发生蛋白(BMPs)之类的通过活化活化素受体激酶(ALKs)而间接活化Smad1的物质。

另外，PDGF是直接、间接并不明确，但根据本发明人等的研究(实施例2)，活化Smad1是明确的。

“活化Smad1”是指磷酸化Smad1的丝氨酸残基和/或使其向核内转移。

活化素受体样激酶1(ALK1)是与TGF-β家族的蛋白结合的I型受体之一，已知具有活化Smad1的作用(Chen YG，et al.，Smad1 recognitionand activation by the ALK1 group of transforming growth factor-β familyreceptors J.Biol.Chem.Vol.274，No.6，3672-3677，1999)。ALK1在人的胎盘、肺、血管内皮细胞中大量表达，ALK1的变异会引起作为Osler-Rendu-Weber综合症而周知的2型遗传性出血性毛细血管扩张症(非专利文献17)。

活化素受体样激酶3(ALK3)又称为BMPR-IA，活化素受体样激酶3(ALK3)是与BMP家族的蛋白结合的I型受体之一，是丝氨酸-苏氨酸型受体。与BMPs结合的ALK3活化Smad1/5/8，向核内传导信号。

骨形态发生蛋白(BMPs)是TGF-β超家族的一员，以骨形成为代表，与发育期的四肢发育或神经系统的分化相关。但是，近年来，有几个报道称BMPs与后肾的发育调节有关，引起了人们的注意。肾脏从中间中胚层发育而来，经过了前肾、中肾、后肾的三个阶段而形成。几乎全部的前肾、中肾在后来发生退化变性，在发育成熟的哺乳类发挥功能的肾脏是后肾。BMP与其受体的转录产物局部存在于发育过程中的后肾，BMP2、4、7在体外具有直接或间接调节尿道的分支的形态形成和分支的结构的作用。已报道：在体内，BMP7无表达突变纯合子的突变小鼠和BMP4无表达突变杂合子的突变小鼠在肾脏的表现型上存在变化(Martinez G，et al，Int J Dev Biol.2002；46(4)：525-33)。

TGF-β具有多方面作用，在各种细胞的增殖/分化、细胞外基质产生、调亡、免疫系统等中具有重要作用。TGF-β与细胞表面的受体结合，向细胞内传导其信号。在细胞内的信号传导中，一系列的Smad蛋白分子群发挥了重要作用。

以往认为：在糖尿病性肾病的发病和进展中，在高血糖状态下，TGF-β借助ALK5活化Smad2和Smad3，与在过量产生以α1IV型胶原为代表的细胞外基质的方向上发挥作用的通路有关(Jin H.et al.，KidneyInternational，63，2003，2010-2019)，本研究首次表明在高血糖状态下存在借助Smad1引起细胞外基质的过量产生的通路。

Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的表达可以在核酸水平(即mRNA的表达)和/或蛋白质水平上进行测定。

对于在核酸水平的测定，从生物体样品提取所有RNA，使用适当的引物对，可以利用RT-PCR，对Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的mRNA进行测定。适当的引物对例如被设计成能够特异性地扩增NCBI Refseq数据库的NM_005900的人来源的Smad1的mRNA的碱基序列(序列号1)、NCBI Refseq数据库的NM_000020的人来源的活化素受体样激酶1的mRNA的碱基序列(序列号2)、GenBank数据库的ACCESSION NM_001200 VERSION NM_001200.1的BMP2的mRNA的碱基序列(序列号3)、GenBank数据库的ACCESSION NM_001202VERSION NM_001202.2的BMP4的mRNA的碱基序列(序列号4)等特定的区域。适当的引物对的碱基序列如下所示。

用于特异性扩增Smad1的mRNA的RT-PCR的正向引物：5’-ACTACCACCACGGCTTTCAC-3’(序列号5)、反向引物：5’-AATAGGATTGTGGGGTGAGC-3’(序列号6)

用于特异性扩增ALK1的mRNA的RT-PCR的正向引物：5’-ccgtcaagatcttctcctcg-3’(序列号7)、反向引物：5’-tcatgtctgaggcgatgaag-3’(序列号8)

用于特异性扩增BMP2的mRNA的RT-PCR的正向引物：5’-cccagcgtgaaaagagagac-3’(序列号9)、反向引物：5’-gagaccgcagtccgtctaag-3’(序列号10)

用于特异性扩增BMP4的mRNA的RT-PCR的正向引物：5’-tgagcctttccagcaagttt-3’(序列号11)、反向引物：5’-cttccccgtctcaggtatca-3’(序列号12)

或者，可以从生物体样品提取全RNA，使用适当的探针，利用Northern杂交(hybridization)法测定Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的mRNA。适当的探针例如可以被设计成以NCBI Refseq数据库的NM_005900的人来源的Smad1的mRNA的碱基序列(序列号1)、NCBIRefseq数据库的NM_000020的人来源的活化素受体样激酶1的mRNA的碱基序列(序列号2)、GenBank数据库的ACCESSION NM_001200VERSION NM_001200.1的BMP2的mRNA的碱基序列(序列号3)、GenBank数据库的ACCESSION NM_001202VERSION NM_001202.2的BMP4的mRNA的碱基序列(序列号4)等，特异性地与这些序列的一部分或全部区域杂交(hybridize)。探针可以用³²P等标记。

对于蛋白质水平的测定，例如使用针对Smad1和/或针对具有Smad1活化作用的物质的抗体，通过Western印迹、ELISA或免疫组织化学分析等方法，测定Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质。针对Smad1的抗体和/或针对具有Smad1活化作用的物质的抗体可以用萤光色素、酶、重金属等进行标记(直接法)。或者可以用萤光色素、酶、重金属等标记针对这些抗体(第一抗体)具有特异性的抗体(第二抗体)(间接法)来代替标记这些抗体。抗体优选被固定于试验片或乳胶(latex)颗粒等固相担体上。

对Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的表达进行测定，包括测定Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质有无表达、对Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的表达量进行定量。

通过本发明，能够检测出糖尿病性肾病。即，Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的表达表示糖尿病性肾病的发病。以往，在糖尿病性肾病的诊断中，使用尿中IV型胶原、尿中白蛋白测定，但有取代或补充这种检测的可能性。

另外，通过本发明，能够评价糖尿病性肾病的进展程度和/或治疗的有效性。即，Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的表达量与糖尿病性肾病的严重程度成比例。另外，如果糖尿病性肾病的治疗有效，则在患者恢复的同时，Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的表达量也减少。

糖尿病性肾病是由慢性高血糖状态引起的细小血管损害之一。病理学上表现出肾小球基底膜的肥厚、肾小球系膜区域的扩大、肾小球的硬化病变，临床上表现出蛋白尿(微量白蛋白尿)、高血压、浮肿等症状，大多最终成为肾功能衰竭。另外，在是糖尿病的情况下，在肾小球以外的组织也可见细动脉硬化症、肾小管间质的变性/纤维化等异常，使肾小球的病变进一步恶化。即，可以将在患有一定期间的糖尿病之后，蛋白尿、高血压、肾功能损害逐渐进展的病情定义为肾病。

近年来，成为晚期肾功能衰竭状态并新导入透析疗法中的病例的本来疾病中，30％以上是糖尿病性肾病，如今还有增加的趋势。进而，导入透析后的预后未必好，在医疗方面，正成为大问题。因而，阐明糖尿病性肾病的发病/进展机制、进行诊断和治疗的开发正在成为重要的课题。(日本临床55卷、1997年增刊号“糖尿病”(1))

另外，本发明还提供一种用于检测糖尿病性肾病的试剂盒，其含有用于对Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的表达进行测定的试剂。

进而，本发明还提供一种用于评价糖尿病性肾病的进行程度和/或治疗的有效性的试剂盒，其含有用于对Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的表达进行测定的试剂。

作为用于对Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的表达进行测定的试剂的例子，可以举出能够特异性扩增Smad1的mRNA的碱基序列的特定区域的引物对、能够特异性扩增具有Smad1活化作用的物质的mRNA的碱基序列的特定区域的引物对、能够特异性杂交Smad1的mRNA的一部分或全部区域的探针、能够特异性杂交具有Smad1活化作用的物质的mRNA的一部分或全部区域的探针、针对Smad1的抗体、针对具有Smad1活化作用的物质的抗体等。这些引物对和抗体如上所述。

本发明的试剂盒进而还可以包括逆转录酶、DNA聚合酶、无RNA酶水(RNase-free water)、缓冲液(buffer)、对照mRNA、对照引物对、dNTP混合物、试剂盒的使用说明书等(在核酸水平，使用引物对，对Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的表达进行测定的试剂盒的情况)。

或者，本发明的试剂盒另外还可以包括转录用缓冲液、封闭(blocking)试剂、清洗液、试剂盒的使用说明书等(用Western印迹法对Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的表达进行测定的试剂盒的情况)。

在其它方式中，本发明的试剂盒还可以进一步包括被标记的第二抗体、基质(第二抗体被酶标记的情况)、稀释液、反应终止剂、试剂盒的使用说明书等(用ELISA对Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的表达进行测定的试剂盒的情况)。

进而，在其它方式中，本发明的试剂盒还可以进一步包括显色剂、过氧化氢水、缓冲液、计数染色用色素、试剂盒的使用说明书等(用免疫组化学分析对Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的表达进行测定的试剂盒的情况)。

2.引起硬化的增殖性疾病的检测方法和试剂盒

本发明提供一种包括对生物体样品中的从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的表达进行测定的、引起硬化的增殖性疾病的检测方法。

引起硬化的增殖性疾病是指被观察到脏器硬化的疾病，是在硬化之前，或者并行可见细胞增殖和/或细胞外基质的增加的状态。其中包括糖尿病性肾病、慢性肾小球肾炎、膜性增殖性肾小球肾炎、局灶性肾小球硬化病、Light Chain Disease(L链沉淀病)、红斑狼疮性肾炎、冷球蛋白(cryoglobulin)血症性肾炎、HIV相关肾炎、紫癫性肾炎等损害肾小球的肾疾病，肝纤维化，动脉硬化等。

慢性肾小球肾炎是指引起肾小球的炎症和进展性破坏的、肾脏疾病慢性持续的状态。是膜性增殖性肾小球肾炎、局灶性肾小球硬化病、LightChain Disease(L链沉淀病)、红斑狼疮性肾炎、冷球蛋白(cryoglobulin)血症性肾炎、HIV相关肾炎、紫癫性肾炎等综合征。

糖尿病性肾病是糖尿病具有代表性的合并症之一，是指随着糖尿病引起的高血糖状态的持续而肾功能进行性减少的状态。

肝纤维化是指见于肝硬化或慢性肝炎等的、在肝血窦壁和肝细胞索之间(Disse腔)中可见胶原等细胞外基质的增加的状态。肝纤维化是肝细胞癌发生的危险因子，已知纤维化越进展则肝细胞癌的发病率越高。

动脉硬化是动脉壁肥厚或硬化的病变的统称，被认为是起因于氧化应激等引起的内皮细胞的伤害的慢性炎症性、增殖性病变。通过动脉硬化的进展，当引起动脉的狭窄、闭塞时，引起血压上升、心肌梗塞、脑梗塞等，但在引起脏器损害之前缺乏自觉症状。

生物体样品可以是能够检测出从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的任何生物体样品。作为生物体样品的例子，可以举出肾脏组织切片、血液、血清、尿等。

STAT3是信号传导因子和转录活化因子(signal transducer andactivator of transcription)(STAT)蛋白之一。STAT3在干扰素、上皮生长因子、白介素因子5、白介素6、肝细胞增殖因子、白血病抑制因子、成骨因子2等各种细胞因子或增殖因子与它们的受体结合时，通过受体相关激酶被酪氨酸磷酸化，由此被活化(磷酸化STAT3)。

磷酸化Smad1是指Smad1的丝氨酸残基被磷酸化而被活化的状态的Smad1。

从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的表达，可以在核酸水平(即mRNA的表达)和/或蛋白质水平进行测定。

对于在核酸水平的测定，可以从生物体样品提取全RNA，使用适当的引物对，利用RT-PCR，对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的mRNA进行测定。适当的引物对例如被设计成能够特异性地扩增NCBI Refseq数据库的NM_139276的人来源的STAT3的mRNA的碱基序列(序列号19)、NCBI Refseq数据库的NM_0059000的人来源的Smad1的mRNA的碱基序列(序列号1)、NCBIRefseq数据库的NM_000020的人来源的活化素受体样激酶1的mRNA的碱基序列(序列号2)、NCBI Refseq数据库的NM_004329的人来源的活化素受体样激酶3的mRNA的碱基序列(序列号20)、GenBank数据库的ACCESSION NM_001200VERSION NM_001200.1的BMP2的mRNA的碱基序列(序列号3)、GenBank数据库的ACCESSION NM_001202VERSION NM_001202.2的BMP4的mRNA的碱基序列(序列号4)等特定的区域。适当的引物对的碱基序列如下所示。

用于特异性扩增STAT3的mRNA的RT-PCR的正向引物：5’-agatgctcactgcgctgga-3’(序列号21)、反向引物：5’-tccaatgcaggcaatctgtt-3’(序列号22)

用于特异性扩增ALK3的mRNA的RT-PCR的正向引物：5’-tggcactgggatgaaatca-3’(序列号23)、反向引物：5’-tggttacataaattggtccga-3’(序列号24)

用于特异性扩增BMP4的mRNA的RT-PCR的正向引物：5’-tgagcctttccagcaagttt-3’(序列号11)、反向引物：5’-cttccccgtctcaggtatca-3′(序列号12)

或者，可以从生物体样品提取全RNA，使用适当的探针，利用Northern杂交法对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的mRNA进行测定。适当的探针例如被设计成基于NCBI Refseq数据库的NM_139276的人来源的STAT3的mRNA的碱基序列(序列号19)、NCBI Refseq数据库的NM_0059000的人来源的Smad1的mRNA的碱基序列(序列号1)、NCBI Refseq数据库的NM_000020的人来源的活化素受体样激酶1的mRNA的碱基序列(序列号2)、NCBI Refseq数据库的NM_004329的人来源的活化素受体样激酶3的mRNA的碱基序列(序列号20)、GenBank数据库的ACCESSION NM_001200 VERSIONNM_001200.1的BMP2的mRNA的碱基序列(序列号3)、GenBank数据库的ACCESSION NM_001202 VERSION NM_001202.2的BMP4的mRNA的碱基序列(序列号4)等，特异地与这些序列的一部分或全部区域杂交。探针可以用³²p等进行标记。

对于蛋白质水平的检测，例如可以使用针对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的抗体，用Western印迹、ELISA或免疫组织化学分析等方法，对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质进行测定。抗体可以用萤光色素、酶、重金属等标记(直接法)。或者，代替对这些抗体进行标记，可以用萤光色素、酶、重金属等标记针对这些抗体(第一抗体)具有特异性的抗体(第二抗体)(间接法)。抗体优选被固定于试验片或乳胶颗粒等固相担体上。

对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的表达进行测定，这包括检测从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质有无表达，对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的表达量进行定量。

通过本发明，能够检测引起硬化的增殖性疾病。即，从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的表达，表示引起硬化的增殖性疾病的发病。在糖尿病性肾病或慢性肾小球肾炎等损害肾小球的肾疾病的诊断中，以往使用尿中IV型胶原、尿中白蛋白测定，但有取代或补充这种检测的可能性。

另外，通过本发明，能够评价引起硬化的增殖性疾病的进展程度和/或治疗的有效性。即，从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的表达量，与引起硬化的增殖性疾病的严重程度成比例。另外，如果引起硬化的增殖性疾病的治疗是有效的，则在患者恢复的同时，从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的表达量减少。

另外，本发明还提供一种含有用于对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的表达进行测定的试剂的、用于检测引起硬化的增殖性疾病的试剂盒。

进而，本发明还提供一种含有用于对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的表达进行测定的试剂的、用于评价引起硬化的增殖性疾病的进展程度和/或治疗的有效性的试剂盒。

引起硬化的增殖性疾病如前所述。

作为用于对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的表达进行测定的试剂的例子，可以举出能够特异性扩增从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的mRNA的碱基序列的特定区域的引物对，能够特异性杂交从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的mRNA的一部分或全部区域的探针，针对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的抗体等。这些引物对和抗体如上所述。

本发明的试剂盒进而还可以包括逆转录酶、DNA聚合酶、无RNA酶水(RNase-free water)、缓冲液、对照mRNA、对照引物对、dNTP混合物、试剂盒的使用说明书等(在核酸水平，使用引物对，对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的表达进行测定的试剂盒的情况)。

或者，本发明的试剂盒另外还可以包括转录用缓冲液、封闭试剂、清洗液、试剂盒的使用说明书等(用Western印迹法，对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的表达进行测定的试剂盒的情况)。

在其它方式中，本发明的试剂盒还可以进一步包括被标记的第二抗体、基质(在第二抗体被酶标记的情况)、稀释液、反应终止剂、试剂盒的使用说明书等(用ELISA对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的表达进行测定的试剂盒的情况)。

进而，在其它方式中，本发明的试剂盒还可以进一步包括显色剂、过氧化氢水、缓冲液、计数染色用色素、试剂盒的使用说明书等(用免疫组化分析，对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的表达进行测定的试剂盒的情况)。

3.药剂和医药组合物

本发明提供含有具有对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达进行抑制的作用的物质作为有效成分的、引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗药。

引起硬化的增殖性疾病如上所述。

另外，本发明还提供含有具有对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1构成的组中选择的至少一种物质的表达进行抑制的作用的物质作为有效成分的、抑制细胞外基质的增殖的药剂。细胞外基质是指存在于动物组织中的细胞外侧的稳定的生物体结构物质，是细胞合成并分泌、蓄积于细胞外的生物体高分子的缔合体。也包括培养细胞合成、分泌并沉淀于细胞周边的结构物质。细胞外基质在结缔组织中大量可见，基底膜也是细胞外基质的一种。

进而，本发明还提供一种含有具有对STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达进行抑制的作用的物质作为有效成分的、抑制α1IV型胶原的表达的药剂。

这些药剂可以用作医药品或者实验用试剂。

作为具有对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达进行抑制的作用的物质的例子，可以举出针对Smad1的反义寡核苷酸(将其碱基序列的一个例子显示于序列号13)、SANE(Smad1拮抗效应子(Antagonistic Effector))(Raju GP et al.，J BiolChem.2003 Jan 3；278(1)：428-437)、PDGFβ受体抗体(APB5)、针对STAT3的反义寡核苷酸等。任意蛋白质均可以用基因重组技术在大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、动物细胞或无细胞蛋白合成系统等中产生。针对Smad1或STAT3的反义寡核苷酸可以用市售的DNA合成机并利用公知的方法合成。作为抗小鼠PDGFR-β抗体的APB5可以按照如下所述的方法制作。将相当于小鼠PDGFR-β的细胞外结构域的cDNA片断(frgment)插入到CD4Rg载体中，在COS-1细胞株中使与人IgG的融合蛋白质PDGFR-β/Human IgG1表达。从上清纯化融合蛋白质并免疫Wistar种的大鼠，制成其脾脏细胞与骨髓瘤(myeloma)细胞株之间的融合细胞，筛选出产生针对PDGFR-β的抗体的细胞。不仅使用APB5，还可以与APB5一样使用能通过公知的方法制成的抗PDGFR-β特异抗体。

具有抑制STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1构成的组中选择的至少一种物质的表达的作用的物质可以只使用一种，也可以组合使用多种。

具有对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达进行抑制的作用的物质，可以使用一种，还可以组合多种使用。

具有对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达进行抑制的作用的物质，可以单独或者与药理学上允许的担体、稀释剂或赋形剂一起作为适当的剂型的医药组合物，对哺乳动物(例如人、兔、狗、猫、大鼠、小鼠)经口或非经口给药。给药量根据给药对象、疾病的种类、症状、给药途经等不同，例如在向成人给药时，具有对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达进行抑制的作用的物质(例如SANE)，作为一次量，通常为10～100mg/kg体重左右，优选为60～40mg/kg体重左右，一个月1～2次左右，优选在治疗开始时连续2～3天给同样量，静脉注射即可。其它非经口给药和经口给药的情况也可以给以此为标准的量。当症状特别严重时，也可以根据其症状增量。

作为用于经口给药的组合物，可以举出固体或液体的剂型、具体地说片剂(包括糖衣片、包膜片)、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂(包括软(soft)胶囊剂)、糖浆剂、乳剂、悬浮剂等。该组合物可以利用通常的方法制造，可以含有在制剂领域中通常使用的担体、稀释剂或赋形剂。例如，作为片剂用的担体、赋形剂，可以举出乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁等。

作为用于非经口给药的组合物，例如可以举出注射剂、栓剂等，注射剂可以是静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等剂型。该注射剂是采用通常的方法、即把具有抑制Smad1的表达的作用的物质溶解、悬浮或乳化在通常用于注射剂的无菌的水性或油性液体中调制而成的。作为注射用水性液体，可以举出生理盐水、葡萄糖或含有其它辅助药物的等渗溶液等，也可以与适当的助溶剂例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子性表面活性剂(例如聚山梨酸酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加成物(polyoxyethyleneadduct of hydrogenated castor oil))等并用。作为油性液体，可以举出芝麻油、大豆油等，作为助溶剂，可以并用苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等。被调制的注射液通常被填充到适当的安瓿中。用于直肠给药的栓剂，可以通过将具有抑制Smad1的表达的作用的物质混合于通常的栓剂用基质中调制而成。

上述经口用或非经口用医药组合物，可以被调制成适合于有效成分的给药量的给药单位的剂型。作为该给药单位的剂型，可以举出片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)、栓剂等。

另外，就上述的医药组合物而言，只要与具有对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达进行抑制的作用的物质相配合时不产生不希望的相互作用，就可以含有其它有效成分。

当具有对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达进行抑制的作用的物质，是针对Smad1或STAT3的反义寡核苷酸时，可以通过公知的基因导入法导入到受检者或受检者的细胞中。例如，可以通过将针对Smad1或STAT3的反义寡核苷酸封入到脂质体(liposome)中并摄入到细胞中的方法(“Lipidic vector systems forgene transfer”(1997)R.J.Lee and L.Huang Crit.Rev.Ther.Drug CarrierSyst 14，173-206；中西守等、蛋白质核酸酶Vol.44，No.11，1590-1596(1999))、磷酸钙法、电穿孔(Electroporation)法、脂质转染(Lipofection)法、微注射法(microinjection)、利用基因枪的方法等进行。在将针对Smad1或STAT3的反义寡核苷酸导入到细胞中时，例如也可以部分取出疾病部位的细胞，在体外进行基因导入后，再将该细胞送回组织中，或者，也可以直接导入到疾病部位的组织。

在含有针对Smad1或STAT3的反义寡核苷酸作为有效成分的医药组合物中，根据需要，可以含有医药上允许的担体(例如生理盐水、缓冲液等稀释剂)。用药是根据疾病的状态的严重程度或生物体的敏感度，但在治疗的有效性被认可之前或者在实现减轻疾病状态的目的之前的期间，可以以适当的用量、给药方法、频率进行用药。

4.对在引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗中有效的物质进行鉴定的方法和试剂盒、对在细胞外基质的增殖抑制中有效的物质进行鉴定的方法和试剂盒、以及对在α1IV型胶原的表达抑制中有效的物质进行鉴定的方法和试剂盒

本发明提供一种包括判定受检物质是否抑制从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达的、对在引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗中有效的物质进行鉴定的方法和试剂盒。

引起硬化的增殖性疾病如上所述。

另外，本发明还提供一种包括判定受检物质是否抑制从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达的、对在细胞外基质的增殖抑制中有效的物质进行鉴定的方法和试剂盒。

进而，本发明还提供一种包括判定受检物质是否抑制从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达的、对在α1IV型胶原的表达抑制中有效的物质进行鉴定的方法和试剂盒。

对本发明的上述方法的一种实施方式进行说明。

首先，准备具有表达从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的能力的细胞。作为具有表达从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的能力的细胞，可以使用任何细胞，但作为其中的例子，可以举出动物的肾小球来源的肾小球系膜细胞(例如，后述的引用文献S1中记载的细胞)、血管平滑肌细胞等。

在受检物质的存在或不存在下，分别对具有表达从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的能力的细胞进行培养，测定从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达。作为受检物质的例子，例如可以举出肽、蛋白质、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取物、植物提取液、动物组织提取液等，这些物质可以是新物质，也可以是公知的物质。就对具有表达从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的能力的细胞进行培养而言，可以在适合培养该细胞的条件下进行。例如，小鼠的肾小球来源的肾小球系膜细胞(后述的引用文献S1)，可以如后述的实施例1中记载的那样来培养。对STAT3和Smad1的表达进行测定的方法如上所述。

磷酸化STAT3和磷酸化Smad1的表达分别可以通过将抗磷酸化STAT3抗体(Santa Cruz Biotechnology)和抗磷酸化Smad1抗体(Calbiochem)用作第一抗体的免疫染色来进行测定。

比较在受检物质的存在下培养细胞时的从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达量，和在受检物质不存在下培养细胞时的从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达量。如果前者比后者少，则判定为受检物质对引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗有效。或者，另外，受检物质在细胞外基质的增殖抑制中有效，或者，被判定为在α1IV型胶原的表达抑制中有效。相反，如果前者与后者相同，或者比后者多，则判定为受检物质对引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗无效。或者，另外，受检物质在细胞外基质的增殖抑制中无效，或者，被判定为在α1IV型胶原的表达抑制中无效。

本发明提供一种含有用于对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达进行测定的试剂的、用于对在引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗中有效的物质进行鉴定的试剂盒。

另外，本发明还提供一种含有用于对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达进行测定的试剂的、用于对在细胞外基质的增殖抑制中有效的物质进行鉴定的试剂盒。

进而，本发明还提供一种含有用于对从STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达进行测定的试剂的、用于对在α1IV型胶原的表达抑制中有效的物质进行鉴定的试剂盒。

引起硬化的增殖性疾病如上所述。

作为用于对STAT3或Smad1的表达进行测定的试剂的例子，可以举出能够特异性扩增STAT3或Smad1的mRNA的碱基序列的特定区域的引物对、能够特异性杂交STAT3或Smad1的mRNA的一部分或全部区域的探针、针对STAT3或Smad1的抗体等。这些引物对和抗体如上所述。

作为用于对磷酸化STAT3或磷酸化Smad1的表达进行测定的试剂的例子，可以举出抗磷酸化STAT3抗体(Santa Cruz Biotechnology)和抗磷酸化Smad1抗体(Calbiochem)等。这些抗体如上所述。

本发明的试剂盒进而还可以包括逆转录酶、DNA聚合酶、无RNA酶水、缓冲液、对照mRNA、对照引物对、dNTP混合物、试剂盒的使用说明书等(在核酸水平，使用引物对，对STAT3或Smad1的表达进行测定的试剂盒的情况)。

或者，本发明的试剂盒另外还可以包括转录用缓冲液、封闭试剂、清洗液、试剂盒的使用说明书等(用Western印迹法，对STAT3或Smad1的表达进行测定的试剂盒的情况)。

在其它方式中，本发明的试剂盒还可以进一步包括被标记的第二抗体、基质(第二抗体被酶标记的情况)、稀释液、反应终止剂、试剂盒的使用说明书等(用ELISA对STAT3、磷酸化STAT3、Smad1或磷酸化Smad1的表达进行测定的试剂盒的情况)。

进而，在其它方式中，本发明的试剂盒还可以进一步包括显色剂、过氧化氢水、缓冲液、计数染色用色素、试剂盒的使用说明书等(用免疫组织化学分析对STAT3、磷酸化STAT3、Smad1或磷酸化Smad1的表达进行测定的试剂盒的情况)。

下面，通过实施例对本发明进行具体说明。此外，这些实施例是用于说明本发明，并不限定本发明的范围。

实施例1

为了鉴定在小鼠Col4基因的启动子区域的CIV部位结合的蛋白质，从AGEs处理过的小鼠的肾小球系膜细胞建立cDNA文库。在本实验中，使用酵母单杂交系统(Yeast one-hybrid system)，从文库选择编码特异性转录因子的克隆，对该克隆编码Smad1进行鉴定。为了在体内确认Smad1与Col4启动子区域的结合，进行染色质免疫沉淀法(ChIP)。纯化已沉淀的DNA，用PCR检测出Col4的启动子区域。抗Sma1抗体使含有从被AGEs处理过的细胞得到的CIV-1部位的染色质沉淀(图1A)。在已被BSA处理过的细胞中不沉淀。发现Smad4另外也与CIV-1部位结合(图1A)。接着，利用报告基因检测(reporter assay)研究Col4的转录活性。制作在LacZ前连接CIV-1启动子的载体，与野生型Smad1载体一起同时导入到COS7细胞中。首先，利用Western印迹确认Smad1的表达(图1B)，在导入了野生型Samd1载体的细胞上清中检测出磷酸化Smad1(pSmad1)。通过野生型Smad1的同时导入，与Col4单独(Mock)的情况相比，β-半乳糖苷酶的活性为18倍(图1C)。用萤光素酶活性校正β-半乳糖苷酶活性，以同时导入了Mock载体的细胞中的活性为基准。Mock对同时导入细胞的β-半乳糖苷酶活性没有带来任何影响。结果表明Smad1确实诱导了Col4基因转录。即，Smad调节Col4的转录。

为了确认Smad1是否被ADEs上调(up regulate)，检查在AGEs存在下、不存在下的肾小球系膜细胞中的Smad1的表达。在AGE存在下，Smad1的mRNA量经时上升(图2A)。同样，Col4的mRNA也与Smad1的转录上升平行上升。但是，在BSA存在下，Smad1的转录和Col4的转录均没有变化。已知Smad1通过被磷酸化，向核内移动，调节靶基因的转录(11)(12)。因而，本发明人等接着用肾小球系膜细胞研究是否通过AGEs，Smad1的磷酸化和向细胞内转移受到影响(图2B)。与mRNA的结果一致，在AGEs存在下培养72小时，优先在细胞质中存在。进而，在AGEs存在下培养120小时，可见Smad1和pSmad1向核内集聚。当在BSA存在下培养时，仅表达少量Smad1和pSmad1。同样在AGEs处理细胞的提取液中可见Smad1和pSmad1，而在BSA处理细胞的提取液中未见(图2C)。这些发现表明Col4的调节在AGEs存在下与Smad1的表达联动。

为了确认在介导AGE诱导性的Col4的过量产生的信号传导系统中的Smad1的重要性，本发明人等使用反义基因特异性地抑制该系统。在反义基因存在下，Smad1通过AGE的诱导完全消失，而在对照寡(脱氧)核苷酸的存在下不消失(4个错配寡(脱氧)核苷酸)(图3A、B)。接着，通过Smad1的抑制，Col4的过量表达被显著减弱。Smad1的错配寡(脱氧)核苷酸不对Col4的表达造成影响(图3C)。这些数据表明：Smad1在Col4的表达控制中起到决定性作用。在糖尿病患者中，糖尿病性肾病的发病、进展在患病率/死亡率两方面均为临床上的重大问题。在现行的治疗方法中，只要血糖值的控制良好，就可以延缓糖尿病性肾病的发病、进展，但不能预防。(1)(2)针对Smad1的反义寡(脱氧)核苷酸会使AGE引起的Col4的过量表达显著减弱。这些发现表明：通过Smad1信号系统的抑制，可以防止糖尿病性肾病中的肾小球系膜细胞的ECM的产生。由于可以在AGEs的持续刺激存在下可见本实验的效果，所以提示Smad1是糖尿病的合并症的新靶点(target)，通过与目前的治疗方法组合发挥效果。为了进一步阐明AGEs处理引起的Smad1表达的机制，本发明人等检测了肾小球系膜细胞中的活化素受体样激酶1(ALK1)的表达。ALK1是TGF-β受体家族的蛋白质之一，具有特异性地对Smad1和Smad5进行磷酸化的作用。ALK1在血管内皮细胞中大量表达(13)(14)，对血管的成熟和稳定化很重要(15)(16)。ALK1的变异会引起作为Osler-Rendu-Weber综合症而周知的II型遗传性出血性毛细血管扩张症(17)。有最近的报道称ALK1借助Smad1传导来自TGF-β的信号，调节TGF-β反应性基因群(18)(19)。本发明人等使用RNA酶保护检测法和Western印迹法，对AGEs处理过的肾小球系膜细胞中的ALK1的表达，分别检测出mRNA、蛋白质两方面(数据未显示)。最后，检测了人的糖尿病性肾病中的Smad1和ALK1在肾小球的表达。将糖尿病性肾病和健康肾的活组织检查(biopsy)作为样品，实施间接抗体法，在作为糖尿病性肾病的肾小球中，在肾小球中的针对Smad1与ALK1抗体的反应性与硬化性疾病的严重程度成比例，但在健康肾中几乎未见表达(图4)。这些组织学发现提示Col4的正调节与Smad1/ALK1信号传导系统相关。由于人的糖尿病性肾病长年缓慢地进展，所以为了详细评价这种现象，不得不弄清糖尿病与Smad1和ALK1的关系。

从小鼠中的Smad1基因的特异性破坏在胎儿期是致死性的可知：Smad1在早期胚发育中起到决定性作用(20)。但是，由于胚胎期早期的致死性，所以Smad1在体内的作用、尤其是对于成人，不是很清楚。已知Smad1传导BMP信号(12)，特别在肾发育中很重要(21)。但是，Smad1在成年小鼠的肾小球中未见表达(22)。本实验首先揭示了在成年小鼠中，Smad1被AGEs诱导。本发明人等观察到慢性暴露于AGEs时Smad1表达的持续性上升，Col4的过量表达，表明Smad1在糖尿病存在下是决定性调节因子。AGEs由于与糖尿病的并发症显著相关，所以本发明人等的研究结果在伴随胶原沉淀的糖尿病或老化之类的疾病中是有用的。在糖尿病性肾病中，GMB的结构变化由于是在微量白蛋白尿发生以前的初期发生，所以Smad1可能是糖尿病性肾病的最初期的标志物质(marker)。在最近的报道中，表明ALK1借助Smad1介导TGF-β的信号传导(18)(19)。因而，本发明人等研究了小鼠的肾小球系膜细胞与人的肾组织中的ALK1的表达。其结果，在本实验中揭示了ALK1和Smad1在肾小球中与糖尿病的进展对应表达。这些结果通过抑制胶原的病理产生而与在各种脏器中发生的糖尿病的合并症的治疗联系在一起(1)。该结果确认了：持续的血糖值上升会带来AGEs的上升，在长期糖尿病的合并症的进展中是必须的(23)(24)。通过糖化，胶原交联而促进动脉硬化(25)。进而，近年来通过使用了AGEs特异性抑制剂的研究，强调AGEs与糖尿病的合并症和动脉硬化的相关(26)(27)。与Col4是血管基底膜的主要构成成分无关，关于糖尿病或老化中的Col4的产生增进，无论在细胞水平还是在分子水平，其机制都不清楚。因而，本发明人等推测：ALK1/Smad1信号传导系统在糖尿病和老化两方面，通过使ECM过量表达而与动脉硬化的进展关联。使用糖尿病或老化的动物模型，进一步阐明ALK1/Smad1信号传导系统，这正处于研究中。

进而，将AGEs存在下培养的肾小球系膜细胞中的mRNA的表达量与BSA存在下培养的肾小球系膜细胞进行比较(图5)。在AGEs存在下，可见BMPRII、BMP4的显著的转录增强。未见Smad1的转录量有大的变动，而这是由于Smad1是转录因子，很难捕捉到表达量的大的变动，另外，在转录因子的作用中比较重要的从细胞质向核内的转移或磷酸化等，在微阵列(microarray)的结果中不被反映出来。

另外，用Western印迹法测定糖尿病性肾病患者的尿中BMP2，可见通过治疗疾病得到改善，同时尿中BMP2减少(图6)。

另外，通过TGF-β信号导致的慢性刺激，可见BMP2和BMP4蛋白的显著表达亢进(图7)，在TGF-β信号传导系统中，这些BMPs可能承担了中心功能。

在实验中使用的材料和方法

细胞培养

建立正常的4周龄小鼠(C57BL/6JxSJL/J)的肾小球来源的肾小球系膜细胞株，按照以往报道的方法鉴定为肾小球系膜细胞(S1)。加入1mM谷氨酰胺、100units/ml青霉素、100mg/ml链霉素、20％FCS，在B培养基(最低限度营养培养基和添加了微量元素的F12培养基的3∶1混合培养基)中培养肾小球系膜细胞株。培养细胞满足通常用于判定肾小球系膜细胞的基准(S2)。AGEs或BSA处理按照以往已报道的方法进行(S3)。cDNA文库的构建和酵母单杂交筛选

从已进行AGEs处理的小鼠肾小球培养细胞制备cDNA，插入到pGAD载体中。酵母单杂交筛选使用MATCHMAKER单杂交(Clontech，Palo Alto，California)试剂盒进行。使小鼠来源Col4基因的27bp的串联反复序列(TTCCTCCCCTTGGAGGAGCGCCGCCCG：CIV-1)(序列号14)与酵母的作为整合和报告基因载体(integration and reporter vector)的pHISi(MATCHMAKER单杂交(Clontech，Palo Alto，Califomia)或pLacZi(MATCHMAKER单杂交(Clontech，Palo Alto，California)连接，制作CIV-1-pHISi和CIV-1-pLacZi载体，使其直线化，插入到酵母株YM4271(MATCHMAKER单杂交(Clontech，Palo Alto，California)的染色体中。使用已插入CIV-1-pHISi和CIV-1-pLacZi的酵母，进行已进行AGEs处理的小鼠肾小球系膜细胞来源的cDNA文库的单杂交筛选。在已添加45mM的3-氨基-1，2，4-三唑(3-AT)的SD/-His/-Leu培养基中选择阳性克隆(positive clone)。为了除去假阳性克隆，进行β-半乳糖苷酶滤提检测(β-galactosidase filter lift assay)(Clontech)，将从残留的酵母克隆中回收的质粒导入到大肠杆菌(DH5α)。

ChIP检测

ChIP检测是按照Luo(S5)的方法进行的。使用抗Smad1抗体、抗Smad-4抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，California)、对照IgG，在4℃下过夜(over night)。用PCR扩增CIV-1区域。使用引物为5’侧(5’-GGAGCTCCCCAATTTGTTG-3’)(序列号15)、3’侧(5’-CAGCCTCCGCCTCTTACC-3’)(序列号16)。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中为100bp左右。

报告基因检测

使用已添加10％FBS的Dulbecco的Eagle培养基(DMEM)，在六孔板中培养1.3×10⁵COS7细胞。8小时后，同时导入750ng的CIV-1-LacZ和等量的结合Smad-1的载体、或者作为空载体(dummy)的mock载体。接着，作为内部对照，也导入75ng的CMV-LUC(在CMV启动子的下游连接萤光素酶基因)。在导入中使用FuGENE6(Roche molecularbiochemicals，Indianapolis，Indiana)。48小时后，将细胞回收到报告基因溶胞缓冲液(reporter lysis buffer)中，分别使用β-半乳糖苷酶报告基因系统(BD Bioscience，San Jose，California)和萤光素酶报告基因检测系统(Promega，Madison，Wisconsin)，测定β-半乳糖苷酶活性和萤光素酶活性，用萤光素酶活性的测定结果校正β-半乳糖苷酶活性。

RNA酶保护检测

按照以往的报道(S6)进行RNA酶保护检测。

用于该检测的探针的碱基序列为Acc No.U58992的1172-1433的序列，如下所述。

cccaccacc gtctgcaaga tccccagcgg gtgcagcttg aaaatcttca acaaccaaga gtttgctcag

ctactggcgc agtctgtgaa

ccacgggttc gagaccgtgt atgaactcac caaaatgtgc actattcgga tgagcttcgt

gaagggttgg ggagccgaat accaccggca ggatgttacc agcaccccct gctggattga

gatccatctg catggccctc tccagtggct ggataaggtt ctgacccaga tgg

(序列号17)

Western印迹

在ADEs或作为对照的BSA的存在下，培养肾小球系膜细胞72小时。将细胞回收到样品缓冲液(Sample buffer)中，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，转(blotting)到硝酸纤维素膜上，使其与已稀释501倍的抗Smad1和抗pSmad1抗体(Santa Cruz Biotechnology)发生反应，用增强化学发光探测系统(enhanced chemiluminescence detection system)(Invitrogen，Carlsbad，California)检测。

培养细胞细胞片的免疫染色(Immunostaining of cultured cells cytosections)

用4％多聚甲醛(paraformaldehyde)固定培养细胞，使用已稀释100倍的抗Smad1抗体(Santa Cruz Biotechnology)、已稀释100倍的抗pSmad-1抗体(Calbiochem)。用激光显微镜和荧光显微镜(Olympus，Tokyo，Japan)观察适量的fluoroscein isothiocyanate结合第二抗体。Smad1吗啉代(morpholino)反义寡核苷酸

合成针对Smad1的25个碱基长度的反义寡核苷酸(Genetools LLC，Philomath，Oregon)。序列为5’-CAAGCTGGTCACATTCATAGCGGCT-3’(序列号13)。作为对照，使用合成寡核苷酸5’-CAtGCTcGTCACATTCAaAGCcGCT-3’(序列号18)，按照已经报道的

(S7)进行体外RNA转录(in vitro RNA transcription)。组织学(Histology)

使用人组织进行病理组织学研究。本实验基于赫尔辛基宣言而得到了伦理委员会的许可而进行的。从患者取得了组织提供和用于研究的书面承诺。得到5例糖尿病性肾病的肾活检样品的提供。就作为对照的正常组织而言，从肿瘤的相反侧将由于肾的恶性肿瘤而接受肾摘除手术的患者的肾的正常皮质制成样品。冰冻肾组织后切出5μm厚的切片，用丙酮固定5分钟。为了消除内源性过氧化物酶的影响，放入到1％过氧化氢-甲醇中，遮光孵育20分钟。进而，为了防止非特异性染色，使用适量的免疫前血清，在室温下，孵育20分钟。将抗Smad1抗体(Santa Cruz Biotechnology)和抗ALK1抗体(R&D，Mickinley Place，Nebraska)作为第一抗体进行免疫染色。

通过微阵列的表达量的分析

用Agilent技术小鼠cDNA微阵列试剂盒(Agilent Technologies MousecDNA Microarray Kit)，分别检测AGEs存在下培养的肾小球系膜细胞和BSA存在下培养的肾小球系膜细胞中的各mRNA的表达量。

实施例2

肾小球硬化具有细胞外基质(ECM)的量增加的特征。IV型胶原(Col4)在肾小球疾病中是已增量的ECM的主要构成成分之一，但在本发明人等的最近的报道之前，Col4基因的转录调节的分子机制尚不清楚。本发明人等揭示了在糖尿病性肾病中，Smad1在转录水平调节Col4的过量表达(A8)。Smad1直接向下游的靶基因传导信号。例如，在骨桥蛋白(osteopontin)(A9)、分化的抑制(A10)、I型胶原(A11)、甚至在肾疾病的进展中，本质上很重要(A12)。这些发现表明：Smad1是对肾小球硬化的进展具有重大的意义的转录因子。

信号传导因子和活化因子(signal transducer and activator)(STAT)蛋白与很多细胞因子和增殖因子的信号传导有关。STAT3的活化是PDGF诱导的分裂促进的关键控制因子(A13)。Nakashima等报道了在星型胶质细胞(astrocyte)的分化中，作为转录的共活化剂(coactivator)的p300与STAT3和Smad1发生物理性相互作用，接着，引起靶基因的转录活化(A14)。从以上发现可以建立如下所述的假说：PDGF在肾小球系膜细胞的增殖中，活化STAT3-Smad1信号传导通路，此过程在从肾小球系膜细胞增殖进展到肾小球硬化中很重要。

在本研究中，本发明人等揭示了在大鼠的肾小球肾炎中抑制PDGF-B链引起的活化的抗PDGF-β受体抗体的给药效果，在体内、体外对调节肾小球的细胞增殖、肾小球硬化两方面的信号传导通路进行了研究。

在实验中使用的材料和方法

动物

在本研究中使用体重180～200g的雄性Wsitar大鼠(日本クレア，日本)。大鼠在除去特定病原体的环境下饲养。本研究得到了德岛大学的伦理审查委员会的许可，所有的动物实验都在学科内的方针(guideline)下进行。

Thy1肾小球性肾炎的诱导(Induction of Thy1 glomerulogephritis)

按照已经报道的方法(A15)，通过抗大鼠Thy-1.1单克隆(monoclonal)抗体(セダ一レ一ンラボラトリ一ズ公司，ォンタリォ，加拿大)的一次给药(1mg/kg)，诱发实验性肾小球系膜增殖性肾小球肾炎(Thy1GN)。这些大鼠在抗Thy-1.1抗体给药后1、2、4、6、12天之后(n＝6/组)被处死。向6只符合年龄数的大鼠只给溶剂，作为各组的对照，处死。

用抗PDGFβ-R抗体处理Thy1GN的草案(protocol)

此前已有报道：在体内、体外，大鼠单克隆抗PDGFβ受体抗体(APB5)和其在PDGFβ受体信号传导系统中的拮抗效果(A16、A17)。从抗Thy-1.1(0天)的给药开始，每日向大鼠给APB5(理化学研究所/西川伸一教授惠赠)或与APB5相同的同型(isotype)IgG(理化学研究所/西川伸一教授惠赠)，每天腹腔内给药各400μg，在1、2、4、6、12天后(n＝6/组)处死。

组织学检查(Histology examination)

光学显微镜检查(Light microscopy)

取出肾脏后，为了进行通过光学显微镜的研究而用carnoy液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)固定并石蜡包埋组织片。用苏木精/伊红(eosin)(HE)、过碘酸希夫(shift)试剂(PAS)、过碘酸六亚甲四胺(methenamine)银试剂(PAM)对切片(2μm)进行染色。

免疫组化(Immunohistochemistry)

用通常的方法对肾切片进行免疫组织染色。为了检验增殖细胞核抗原(PCNA)、Col4、Smad1，使用用carnoy液固定并用石蜡包埋的组织片。肾切片发生再水化并用0.3％的过氧化氢加甲醇在30分钟进行内源性过氧化物酶失活处理。为了除去非特异性染色，在适量的免疫前血清中室温下孵育切片20分钟，分别用亲和素(avidin)D封闭液和生物素(biotin)封闭液(Vector，加利福尼亚，美国)各处理15分钟。用抗PCNA抗体(1∶200稀释)、抗Col4抗体(1∶200稀释)、抗Smad1抗体(1∶100稀释)(Santa Cruz Biotechnology公司，加利福尼亚，美国)室温孵育切片60分钟，与适量的生物素化第二抗体、然后与亲和素-生物素化过氧化物酶复合物(ベクタスタチンABC系统，Vector公司)孵育，使用二氨基联苯胺(diaminobenzidine)四醋酸盐(DAB)使其显色。为了验证磷酸化Smad1(pSmad1)和磷酸化STAT3(pSTAT3)，将切片包埋于冰冻切片用包埋剂OCT复合物(マィルズ公司，印第安纳，美国)，放入冷却后的丙酮中，瞬间冷冻。制作4μm厚的切片，用丙酮固定5分钟，进而用0.3％的过氧化氢加甲醇30分钟进行内源性过氧化物酶失活处理。用与PCNA同样的方法，将抗pSmad1抗体(1∶100稀释)(Calbiochem，加利福尼亚，美国)、抗pSTAT3抗体(1∶100稀释)(Santa CruzBiotechnology)作为第一抗体，对切片进行免疫染色。为了研究核数，用苏木精液体对切片进行对比染色。

光学显微镜定量

使用已PAM染色的组织，进行肾小球的形态测量。使用带有图像分析系统的显微镜(IPAP，住友化学工业公司，大阪，日本)，按照已经报道的方法(A18～A20)来测量相对肾小球面积的肾小球表面和PAM阳性的面积(％)。对每一只大鼠分析50个肾小球。

免疫组化的定量

PCNA：为了对增殖的细胞(PCNA阳性细胞)进行定量，在观察者没有样品的信息的情况下，对每一个标本的50个肾小球进行计数，算出每一个肾小球的平均值。为了对pSmad1：pSmad1的表达进行定量，计数相对于肾小球细胞数的pSmad1阳性细胞数，算出pSmad1阳性细胞的比例。对于Col4、Smad1、pSTAT3，相对切片上的整个肾小球间质，用范围(カラ一レンジ)选择被免疫过氧化物酶染色染成茶色的部分，用IPAP对其面积占全部面积的比例进行定量。对每一只大鼠分析50个肾小球。细胞培养实验(Cell culture experiment)

按照已经报道的方法(A21)，从正常的4周龄的小鼠(C57BL/6JxSJL/J)摘出的肾小球中分离肾小球系膜细胞，建立肾小球肾系膜细胞的细胞株。在添加了微量元素、1mM谷氨酰胺、100单位/ml的青霉素、100mg/ml的链霉素、20％胎牛血清(FCS)的B培养基(最低限度营养培养基与F12培养基＝3∶1混合培养基)中培养肾小球系膜细胞。培养细胞满足通常被接受的作为肾小球系膜细胞的必要条件(A22)。将培养肾小球系膜细胞用已添加了20％FCS的B培养基种在100mm直径的培养皿中。24小时后换成已添加了0.1％BSA的B培养基，在饥饿状态下放置2天，然后向已添加2％FCS的B培养基中添加5ng/ml的PDGF-B(Calbiochem)，进而加入100ng/ml的APB5或作为对照的大鼠IgG，培养24小时。

利用BrdU ELISA的细胞增殖实验

肾小球系膜细胞的增殖可以通过用于定量细胞增殖的、将DNA合成时的摄取BrdU的定量作为原理的比色免疫测定法(immunoassay)(Amersham Pharmacia Biotech，新泽西，美国)进行评价。BrdU ELISA按照试剂盒制造商的手册使用。用添加了10％FCS的B培养基以低密度将肾小球系膜细胞种于96孔的平底微滴定板中，使其过夜贴壁。换成准集密度的添加了0.1％BSA的B培养基，在饥饿状态下放置2天，然后换成已添加2％FCS、5ng/ml的PDGF-B、10mM BrdU的B培养基，进而添加100ng/ml的APB5。培养6小时后，将板离心，用固定液固定细胞，与1∶100稀释过的过氧化物酶标记抗BrdU单克隆抗体孵育30分钟。清洗标记抗体之后，加基质液，放置15分钟，用1M硫酸使反应停止。在5分钟内用ELISA板阅读器(plate reader)，将690nm作为对象波长，测量450nm的吸光度(Model550，バィォラッドラボラトリ一ズ，加利福尼亚，美国)。空白(blank)是不添加100μL的BrdU的培养基。

Western印迹分析

培养的肾小球系膜细胞在添加0.1％BSA的B培养基中24小时处于饥饿状态。用添加了100ng/ml的APB5或对照IgG的5ng/ml的PDGF-BB，刺激培养细胞120分钟。将细胞悬浮于溶解缓冲液中，通过SDS-聚丙烯酰胺电泳分离。转移到硝酸纤维素膜上，使用1∶1000稀释抗pSTAT抗体、1∶1000稀释抗pSmad1抗体、1∶2000稀释抗Col4抗体，进行Wetern印迹。使用化学发光检测系统(Amersham Pharmacia)检测。细胞转染(Cell Transfection)

已与表达载体结合的野生型STAT3和加入了显性阴性的STAT3的质粒由Jackie.Bromberg(洛克菲勒大学)惠赠(A23)。使用脂质转染胺试剂(Lipofectamine)2000(Invitrogen)，按照厂商的手册，将已结合野生型或显性阴性STAT3(8mg)的表达载体导入到肾小球系膜细胞(60mm培养皿)中。6小时后，将培养基换成增殖培养基(60％DMEM、20％F12、20％胎牛血清)。48小时后，将细胞悬浮于溶解缓冲液中，如上所述地进行Western印迹分析。

统计学分析(Statistical analysis)

全部数值用平均值±SE表示，使用Mann-Whitney非参数分析或者t检验，进行单侧的方差分析。设P＜0.05为具有显著差异。

在细胞增殖试验和培养肾小球系膜细胞中的Smad1 mRNA表达数据的统计分析中使用t检验。免疫组织染色的定量和肾小球的Smad1 mRNA表达是进行单侧ANOVA之后，然后进行多重比较。设P＜0.05为具有显著差异。全部数值用平均值±SD表示。

实验结果

Thy1GN的形态改变

在Thy1GN中，肾小球系膜细胞的增殖在注射后第二天开始到第六天变为最大，在第12天平静下来。图9表示各组在第六天的代表性光学显微镜像。Thy1GN组的肾小球间质增加，这与第六天的峰值一致(图9B)。用PCNA的免疫染色评价肾小球细胞的增殖。PCNA阳性细胞在Thy1GN组中显著增加，在第六天变为最大值(图9E)。

Col4在肾小球硬化中是ECM的主要构成成分之一。Col4在正常对照组中沿着肾小球基底膜被弱染色，但肾小球部分几乎不显示阳性(图9G)。另一方面，在Thy1GN组中，在已扩张的肾小球系膜部分显示强阳性(图9H)。

在Thy1 GN中，在肾小球，PDGF-B、BDGFβ受体也有意义地显示阳性(图10)。这些发现揭示了：肾小球系膜细胞的过量增殖、肾小球的肥大、肾小球硬化病变是在由抗Thy1抗体诱发的肾小球肾炎中同时发生的。

抗PDGFβ受体抗体在体内抑制肾小球细胞增殖和肾小球硬化

如已报道中的所述的那样，APB5抑制PDGFβ受体介导的信号传导系统。在Thy1 GN中，APB5处理在处理后的任何时刻都会使肾小球细胞数和PCNA阳性细胞数两方面减少(图9C、9F、11A、11B)。PDGF-B链的过量表达和PDGFβ受体在APB5处理后呈有意义的减少(图10C、10F)。就APB5处理而言，也使Thy1 GN中的肾小球系膜间质增大有意义地减少。这是用占整个肾小球的PAM阳性的面积的比例来评价(图11C)。另外，Thy1 GN中的肾小球系膜细胞的Col4表达在APB5处理下减少(图11D)。在Thy1 GN中，这些数据揭示了APB5处理会使肾小球系膜细胞的增殖和肾小球系膜间质的增大这两方面减少。

在Thy1GN中Smad1、磷酸化Smad1(pSmad1)和磷酸化STAT3(pSTAT3)的表达的时程

本发明人等用免疫染色对Thy1GN大鼠肾中的Smad1的表达进行了研究。Smad1在正常对照的肾小球中几乎没有被检测出(图12A)，第六天的Thy1GN组的肾小球显示了典型的肾小球系膜肥大像，Smad1强表达(图12B)。为了定量Smad1的表达，使用IPAP图像分析系统。肾小球的Smad1表达在第六天变为最大(图13A)，与肾小球系膜细胞的增殖的峰值一致。如图12C所示，肾小球的Smad1表达在第六天以后急剧地减少。

本发明人等接着研究了在Thy1GN中是否发生Smad1的转录和Samd1的磷酸化。免疫组织染色的结果，在正常对照组中几乎未见pSmad1(图14A)。但是，在Thy1GN组中，pSmad1在核部分显示强阳性(图14B)。为了定量pSmad1的表达，检测了每个肾小球的pSmad1阳性细胞(图13B)。肾小球的pSmad1的表达在Thy1GN的第一天上升，在作为细胞增殖的初期的第四天与峰值一致。

从PDGF-B和PDGFβR在Thy1 GN中增加以及APB5抑制其过量表达的情况出发，本发明人等进行了作为PDGF信号传导系统的转录因子的磷酸化STAT3的免疫染色(A24)。在Thy1 GN中，pSTAT3的表达在广泛增加(图15A、15B、15C)，在第六天变为最大(图13C)。

在APB5处理组中，在Thy1 GN的肾小球中的Smad1和pSmad1蛋白的表达有意义地减少(图12D、12E、14D、14E、16A、16B)。pSTAT3的过量表达也在APB5给药后的任意调查点有意义地减少(图15D、15E、16C)。

体外的抗PDGFβ-R抗体效应

为了确认APB5是否抑制肾小球系膜细胞的增殖，本发明人等用BrdU

ELIZA对在APB5存在下或者不存在下的肾小球系膜细胞的增殖进行探研究。如图17A所示，APB5的添加抑制由PDGF引起的在肾小球中发生的DNA合成。

使用Wetern印迹研究APB5是否抑制用PDGF-B刺激的肾小球系膜细胞的pSTAT3、pSmad1、Col4的表达。APB5使STAT3和Smad1的磷酸化以及Col4的表达减少(图17B)。

STAT3和Smad1的相互作用

为了明确STAT3与使Col4表达增加的Smad1的相互作用，将结合了显性阴性的STAT3的载体导入培养肾小球系膜细胞中。

显性阴性的STAT3的导入与导入野生型STAT3时相比，确实使pSmad1和Col4的表达减少(图18)。

分析

很多肾小球损害都以肾小球系膜细胞的增殖和肾小球硬化为特征，但这两个重要的病理所见中共通的机制至今不明。在本研究中，首次揭示了STAT3和Smad1的活化是调节进行性肾小球损害时的两个现象、细胞增殖和肾小球硬化的相互作用的关键的路径(pathway)。这些结果支持在成为21世纪全世界的主要问题的慢性肾小球肾炎和糖尿病性肾病的病因研究和治疗中存在新方向性。

肾小球硬化是包括慢性肾小球肾炎、IgG肾病、糖尿病性肾病的进行展性肾小球损害的病理学特征。在很多肾小球疾病的初期，都发生肾小球细胞的增殖，接着发生肾小球硬化的进展，逐渐进入肾小球损害的晚期(A1、A2)。该过程的例子可在IgA肾病、膜增殖性肾小球肾炎、糖尿病性肾病、人和Thy1 GN、大鼠的肾切除模型等之类的全身性轻链病(A25、A26)。揭示了当通过抗PDGF抗体(A7)、作为抗凝血剂的肝素(A27)、维生素D类似物(A19)抑制肾小球细胞的增殖时，可以使持续进展的进行性肾小球硬化不发生，但其机制不明。在本研究中，本发明人等提示了有可能调节作为它们的病理学过程的、肾小球系膜细胞的增殖与肾小球硬化的相互作用的机制。

对小鼠和人肾小球系膜细胞的PDGF受体进行鉴定(A28)。PDGF是肾小球系膜细胞的强大的成为关键的分裂促进因子，在体外的肾小球系膜细胞中，作为自身分泌型的细胞增殖因子而被持续恒定地合成(A28、A29)。PDGF无论在体内还是在体外，都在肾小球肾炎、糖尿病性肾病、进行性肾小球硬化等病理学状态的进展中起到重要的作用(A3、A4)。已有报道：PDGF受体酪氨酸激酶如果被活化，则STAT3蛋白被酪氨酸磷酸化(A30、A31)。该活化调节增殖和分化(A32、A33)。发明人等在体内和体外揭示了已磷酸化的STAT3的过量表达伴随PDGF和PDGF β受体两方面的过量表达已被确认，在体内和体外揭示了APB5减少PDGF、PDGF β受体、STAT3的表达量而使肾小球肾炎恢复。

肾小球硬化的主要特征在于肾小球系膜的ECM量的增加。肾小球硬化的主要构成要素之一是Col4(A34)。本发明人等最近报道了：在糖尿病肾病中，Smad1无论在体内还是在体外都是关键的转录因子(A8)。揭示了已被磷酸化的Smad1与Col4的表达上升和肾小球ECM的增量并行强表达。这些发现明确了：Smad1不仅在糖尿病性肾病中的肾小球硬化而且在肾小球肾炎中起到决定性的作用。本研究揭示了无论在体内还是在体外，PDGF均诱导肾小球的已被磷酸化的Samd1的表达。

本发明人等确认了：STAT3和Smad1的相互作用调节肾小球硬化中的重要基因。通过导入显性阴性的STAT3，在培养肾小球系膜细胞中Col4的表达有意义地减少。STAT3和Smad1的活化可能分别独立，但均被PDGF活化。进而，从导入显性阴性STAT3时Smad1的磷酸化会部分减少可以认为：Smad1的活化是STAT3活化机制的一部分。这些发现提示：在肾小球肾炎的实验模型中，PDGF引起的STAT3活化与Smad1表达发生相互作用，然后发生Col4的活化。理解这两个信号传导通路在明确进行性肾小球损害的病理学过程方面很重要。

针对在各种脏器中发生的硬化的治疗，被限定为对失去这些脏器功能进行减速的辅助性治疗。本发明人等的发现为引起硬化的其它增殖性疾病的本质带来了深入探讨的空间。Smad1和STAT3由于在正常的肾小球中几乎没有，所以抑制Smad1和/或STAT3信号会通过所谓抑制病态活化的细胞增殖和ECM产生的机制，而在抑制引起硬化的各种肾疾病的进展中发挥作用。

实施例3

对糖尿病性肾病患者5名、糖尿病伴随硬化病变的肾炎发病患者1名、糖尿病不伴随硬化病变的肾炎发病患者2名、正常人2名的尿进行取样，进行SDS-聚丙烯酰胺电泳，转印到硝酸纤维素膜上。将抗Smad-1抗体(Santa Cruz Biotechnology)和抗ALK-1抗体(R&S systems，ミネアポリス，美国)作为第一抗体，使用Weaternブリ一ズ试剂盒(Invitrogen，东京，日本)，进行Western印迹法。

提取作为糖尿病性肾病住院的患者的治疗开始前的尿样，然后在治疗开始后每周提取尿样，将抗ALK-1抗体作为第一抗体，同样进行Western印迹法。

Smad-1和ALK-3在糖尿病性肾病和已在肾中可见硬化的患者尿中检测出，但在正常人和不伴随硬化的肾炎患者的尿中没有检测出(图17、图19)。另外，ALK-1随着糖尿病性肾病的治疗而向尿中的排泄量经时减少(图18)。

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28.We thank K.Miyazono for providing a plasmid encoding Smad1，and Y.Takishita for his

assistance with histological analysis.We also thank the members of ourlaboratory for discussion.

Supproted by Grant-in Aid from the Ministry of Education，Science，Sportsand Culture of Japan.

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在本说明书中引用的全部刊物、专利以及专利申请被直接作为参考引入本说明书中。

工业上的可利用性

通过本发明，揭示了：Smad1作为与IV型胶原的过量产生直接相关的物质而被鉴定，Smad1作为糖尿病性肾病的病因具有决定性的作用。这样，糖尿病性肾病的检测成为可能，进而，提供了糖尿病性肾病的预防和/或治疗药、抑制细胞外基质增殖的药剂、抑制α1IV型胶原的表达的药剂。另外，通过本发明，还提供了对在糖尿病性肾病的预防和/或治疗中有效的物质进行鉴定的方法和试剂盒、对在抑制细胞外基质增殖中有效的物质进行鉴定的方法和试剂盒、以及对在抑制α1IV型胶原的表达中有效的物质进行鉴定的方法和试剂盒。

另外，通过本发明，还揭示了STAT3和Smad1的活化是调节进行性肾小球损害时的两个现象、细胞增殖和肾小球硬化的相互作用的关键路径。这样，引起硬化的增殖性疾病的检测成为可能，进而，提供了引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗药、抑制细胞外基质增殖的药剂、抑制α1IV型胶原的表达的药剂。另外，本发明还提供了对在引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗中有效的物质进行鉴定的方法和试剂盒、对在抑制细胞外基质增殖中有效的物质进行鉴定的方法和试剂盒，以及对在抑制α1IV型胶原的表达中有效的物质进行鉴定的方法和试剂盒。

序列表自由文本(free text)

<序列号1>

序列号1表示人来源的Smad1的mRNA的碱基序列。

<序列号2>

序列号2表示人来源的ALK1的mRNA的碱基序列。

<序列号3>

序列号3表示人来源的BMP2的mRNA的碱基序列。

<序列号4>

序列号4表示人来源的BMP4的mRNA的碱基序列。

<序列号5>

序列号5表示在对Smad1的mRNA进行特异性扩增的RT-PCR中使用

的正向引物(forward primer)的碱基序列。

<序列号6>

序列号6表示在对Smad1的mRNA进行特异性扩增的RT-PCR中使用的反向引物(reverse primer)的碱基序列。

<序列号7>

序列号7表示在对ALK1的mRNA进行特异性扩增的RT-PCR中使用的正向引物的碱基序列。

<序列号8>

序列号8表示在对ALK1的mRNA进行特异性扩增的RT-PCR中使用的反向引物的碱基序列。

<序列号9>

序列号9表示在对BMP2的mRNA进行特异性扩增的RT-PCR中使用的正向引物的碱基序列。

<序列号10>

序列号10表示在对BMP2的mRNA进行特异性扩增的RT-PCR中使用的反向引物的碱基序列。

<序列号11>

序列号11表示在对BMP4的mRNA进行特异性扩增的RT-PCR中使用的正向引物的碱基序列。

<序列号12>

序列号12表示在对BMP4的mRNA进行特异性扩增的RT-PCR中使用的反向引物的碱基序列。

<序列号13>

序列号13表示相对Smad1的反义寡核苷酸的碱基序列。

<序列号14>

序列号14表示小鼠来源Col4基因的27bp的串联反复序列。

<序列号15>

序列号15表示在ChIP检测(assay)中使用的5’侧的引物的碱基序列。

<序列号16>

序列号16表示在ChIP检测中使用的3’侧的引物的碱基序列。

<序列号17>

序列号17表示在RNA酶保护检测中使用的探针的碱基序列。

<序列号18>

序列号18表示合成寡核苷酸的碱基序列。

<序列号19>

序列号19表示人来源的STAT3的mRNA的碱基序列。

<序列号20>

序列号20表示人来源的ALK3的mRNA的碱基序列。

<序列号21>

序列号21表示在对人来源的STAT3的mRNA进行特异性扩增的RT-PCR中使用的正向引物的碱基序列。

<序列号22>

序列号22表示在对人来源的STAT3的mRNA进行特异性扩增的RT-PCR中使用的反向引物的碱基序列。

<序列号23>

序列号23表示在对人来源的ALK3的mRNA进行特异性扩增的RT-PCR中使用的正向引物的碱基序列。

<序列号24>

序列号24表示在对人来源的ALK3的mRNA进行特异性扩增的RT-PCR中使用的反向引物的碱基序列。

Claims

1.试剂在制备检测引起硬化的增殖性疾病的诊断剂中的应用，所述试剂用于对生物体样品中的从Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的表达进行测定，并且所述试剂是选自以下组成的组：

●能够特异性扩增选自下组的至少一种物质的mRNA的碱基序列的特定区域的引物对：Smad1，磷酸化Smad1，活化素受体样激酶1，活化素受体样激酶3和骨形态发生蛋白；

●能够杂交选自下组的至少一种物质的mRNA的一部分或全部区域的探针：Smad1，磷酸化Smad1，活化素受体样激酶1，活化素受体样激酶3和骨形态发生蛋白；和

●针对选自下组的至少一种物质的抗体：Smad1，磷酸化Smad1，活化素受体样激酶1，活化素受体样激酶3和骨形态发生蛋白。

2.试剂在制备评价引起硬化的增殖性疾病的进展程度和/或治疗的有效性的诊断剂中的应用，所述试剂用于对生物体样品中的从Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的表达进行测定，并且所述试剂是选自以下组成的组：

3.一种用于检测引起硬化的增殖性疾病的试剂盒，其中，含有：用于对生物体样品中的从Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的表达进行测定的试剂。

4.一种用于评价引起硬化的增殖性疾病的进展程度和/或治疗的有效性的试剂盒，其中，含有：

用于对生物体样品中的从Smad1、磷酸化Smad1、活化素受体样激酶1、活化素受体样激酶3以及骨形态发生蛋白中选择的至少一种物质的表达进行测定的试剂。

5.试剂在制备检测糖尿病性肾病的诊断剂中的应用，所述试剂用于对生物体样品中Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的表达进行测定，并且所述试剂是选自以下组成的组：

6.试剂在制备评价糖尿病性肾病的进展程度和/或治疗的有效性的诊断剂中的应用，所述试剂用于对生物体样品中Smad1和/或具有Smad1活化作用的物质的表达进行测定，并且所述试剂是选自以下组成的组：

7.一种用于对在引起硬化的增殖性疾病的预防和/或治疗中有效的物质进行鉴定的试剂盒，其中，含有：

用于对从Smad1、磷酸化Smad1中选择的至少一种物质的表达进行测定的试剂。

8.一种用于对在细胞外基质的增殖抑制中有效的物质进行鉴定的试剂盒，其中，含有：

用于对从Smad1、磷酸化Smad1选择的至少一种物质的表达进行测定的试剂。

9.一种用于对在α1IV型胶原的表达抑制中有效的物质进行鉴定的试剂盒，其中，含有：