KR101242260B1 - 경화를 초래하는 증식성 질환의 검출방법 및 키트, 경화를초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료제, 그리고경화를 초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료에유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트 - Google Patents

경화를 초래하는 증식성 질환의 검출방법 및 키트, 경화를초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료제, 그리고경화를 초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료에유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트 Download PDF

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Abstract

생체 시료에 있어서의, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하는 것을 포함하는, 경화를 초래하는 증식성 질환의 검출방법. 그 키트. STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는 작용을 갖는 물질을 유효성분으로서 함유하는, 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료제. 피험물질이 STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는지 여부를 판정하는 것을 포함하는, 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료에 유효한 물질을 동정하는 방법. 그 키트.
액티빈 수용체

Description

경화를 초래하는 증식성 질환의 검출방법 및 키트, 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료제, 그리고 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트{METHOD AND KIT FOR DETECTING PROLIFERATIVE DISEASES CAUSING SCLEROSIS, PREVENTIVE AND/OR REMEDY FOR PROLIFERATIVE DISEASES CAUSING SCLEROSIS AND METHOD AND KIT FOR IDENTIFYING SUBSTANCE EFFICACIOUS IN PREVENTING AND/OR TREATING PROLIFERATIVE DISEASES CAUSING SCLEROSIS}
본 발명은, 경화를 초래하는 증식성 질환의 검출방법 및 키트, 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료제, 그리고 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트에 관한 것이다.
α1 IV 형 콜라겐 (Col4) 은 혈관 내피 세포와 중막 평활근 세포 사이에 존재하는 혈관 기저막의 주요한 구성성분으로, Col4 의 과잉 생성은 당뇨병성 혈관 장애, 동맥경화, 노화에 관련된 질환에 결정적인 역할을 한다. 또한, 지속적인 고혈당 상태는 당뇨병 합병증의 주요한 원인으로 인식되어 있다 (비특허문헌 1 및 2). 과잉의 Advanced glycation end products (AGEs) 는 고혈당에 의해 일어나, 혈관 및 기타 세포에 있어서 각종 이벤트를 유도하는 것이 알려져 있으며, 아 마도 수 종류의 AGEs 리셉터를 통해서 병태에 관계하고 있는 것으로 생각된다 (비특허문헌 3, 4 및 5).
최근에는 AGEs 가 당뇨병 합병증에 관계할 뿐만 아니라, 노화에 의한 동맥경화에도 관계한다는 생각이 받아들여져 있다 (비특허문헌 6 및 7). 또한, 절단형의 가용성 AGEs 리셉터가 당뇨병성 동맥경화의 진전을 억제한다고 하는 보고가 있다 (비특허문헌 8).
당뇨병성 신증의 진행은, 형태학적으로는 신사구체 기저막 (GBM) 의 비후 및 세포외 기질 (ECM) 의 증대에 의해 특징지어진다. Col4 는 사구체 기저막 비후 및 세포외 기질 증대의 주요한 구성성분이기 때문에, Col4 가 당뇨병의 상태에 있어서 어떻게 전사 제어되는가를 명확하게 하는 것은 중요한 일이다. Col4 의 쌍방향성 130bp 의 프로모터는, 몇개의 DNA 결합 단백과 반응하는 것이 알려져 있는 큰 스템 루프 구조 (CIV) 를 갖는다 (비특허문헌 9). 본 발명자들은, 앞서의 보고에 있어서 겔 시프트 분석에 의해, 미지의 단백이 AGEs 에 대해 노출됨으로써 Col4 가 유도되는 경우에만 CIV 에 결합하는 것을 나타내었다 (비특허문헌 10).
메산지움 세포 (mesangium cell) 의 증식과 사구체 경화는 모두 진행성 사구체 장애의 주요한 병리학적 특징이다. 많은 사구체 경화를 동반하는 질환에서 메산지움 세포의 증식이 관찰되는 것은 진행성 사구체 장애에 있어서 이 프로세스가 중요하다는 것을 시사하고 있다 (비특허문헌 11(A1), 비특허문헌 12(A2)). 2가지 이벤트는 대부분의 사구체 질환에서 동시에 관찰되지만, 메산지움 세포의 증식이 어떻게 사구체 경화의 진전에 관여하고 있는가는 분명하지 않다.
혈소판 유래 증식인자 (PDGF) 가 메산지움 세포의 중요한 분열 촉진인자임이 in vivo 에서도 in vitro 에서도 나타나 있다 (비특허문헌 13(A3), 비특허문헌 14(A4)). PDGF 가 사구체 경화 진전의 열쇠가 되는 역할을 하고 있는 것에 대해서는, 실험 모델뿐만 아니라 인간의 사구체 질환에서도 몇가지 증거가 있다 (비특허문헌 13(A3)). PDGF-BB 도 또한 메산지움 세포의 증식에 중요하다고 보고되어 있고 (비특허문헌 15(A5)), 잔존 신장 모델에서는 계속해서 사구체 경화의 진전이 일어난다 (비특허문헌 16(A6)). 래트의 사구체 신염 모델에 있어서 PDGF 에 대한 중화 항체를 투여한 결과, 메산지움 세포의 증식과 사구체 경화의 양쪽이 현저하게 회복되었지만 (비특허문헌 17(A7)), 세포 증식의 억제가 사구체 경화 병변을 억제하는 기전은 거의 알려져 있지 않다.
비특허문헌 1: The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. N. Engl. J. Med. 329, 977-986 (1993).
비특허문헌 2: UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group. Lancet 352, 837-853 (1998)
비특허문헌 3: H. Vlassara, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA91, 11704-11708 (1994).
비특허문헌 4: M. Brownlee, A. Cerami, H. Vlassara, N. Engl. J. Med. 318, 1315-1321 (1988).
비특허문헌 5: T. Doi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA89, 2873-2877 (1992).
비특허문헌 6: H. Vlassara, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA89, 12043-12047 (1992).
비특허문헌 7: M. S. Huijberts, et al., J. Clin. Invest. 92, 1407-1411 (1993)
비특허문헌 8: S. L. Park, et al., Nature Med. 9, 1025-1031 (1998)
비특허문헌 9: L. A. Bruggeman, P. D. Burbelo, Y. Yamada, P. E. Klotman, Oncogene 7, 1497-1502 (1992).
비특허문헌 10: N. Iehara, H. Takeoka, Y. Yamada, T. Kita, T. Doi, Kidney lnt. 50, 1166-1172 (1996).
비특허문헌 11: Fogo A, Ichikawa I. Evidence for the central role of glomerular growth promoters in the development of sclerosis. Semin Nephrol. 1989 Dec; 9(4):329-42.
비특허문헌 12: Striker LJ, Doi T, Elliot S, Striker GE. The contribution of glomerular mesangial cells to progressive glomerulosclerosis. Semin Nephrol. 1989 Dec; 9(4):318-28. Review.
비특허문헌 13: Floege J, Johnson RJ: Multiple roles for platelet-derived growth factor in renal disease. Miner Electrolyte Metab 21: 271-282, 1995
비특허문헌 14: Doi T, Vlassara H, Kirstein M, Yamada Y, Striker GE, Striker LJ: Receptor-specific increase in extracellular matrix production by mesangial cells by advanced glycosylation end products is mediated via platelet-derived growth factor. Proc Natl Acad Sci USA 89: 2873-2877, 1992
비특허문헌 15: Barnes JL, Hevey KA. Glomerular mesangial cell migration in response to platelet-derived growth factor. Lab Invest. 1990 Mar; 62(3):379-82.
비특허문헌 16: Floege, J., Burns, M. W., Alpers, C. E., Yoshimura, A., Pritzl, P., Gordon, K., Seifert, R. A., Bowen-Pope, D. F., Couser, W. G., and Johnson, R. J.: Glomerular cell proliferation and PDGF expression precede glomerulosclerosis in the remnant kidney model. Kidney Int. 41:297-309, 1992
비특허문헌 17: Johnson, R. J., Raines, E. W., Floege, J, et al: Inhibition of mesangial cell proliferation and matrix expansion in glomerulonephritis in the rat by antibody to platelet-derived growth factor. J Exp Med 175: 1413-1416, 1992
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
당뇨병성 신증은 말기 신부전의 주된 원인이다. IV 형 콜라겐은 혈관 기저막이나 신사구체 메산지움 기질의 주요한 구성성분으로, 당뇨병에 있어서의 혈관 장애에 중대한 역할을 하고 있지만, 당뇨병 상태에서 무엇이 IV 형 콜라겐의 과잉 생성에 직접 관계하고 있는지는 알려져 있지 않다. 본 발명은, IV 형 콜라겐의 과잉 생성에 직접 관계하고 있는 물질을 동정하여, 그 물질이 당뇨병성 신증의 병인으로서 결정적인 역할을 가짐을 나타내는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은, IV 형 콜라겐의 과잉 생성에 직접 관계하고 있는 물질을 이용한 당뇨병성 신증의 검출방법 및 키트를 제공하는 것도 목적으로 한다. 그리고 본 발명은, IV 형 콜라겐의 과잉 생성에 직접 관계하고 있는 물질의 발현을 억제하는 작용을 갖는 물질의 용도를 제공하는 것도 목적으로 한다. 나아가 본 발명은, 당뇨병성 신증의 예방 및/또는 치료에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트, 세포외 매트릭스의 증식 저해에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트, 그리고 α1 IV 형 콜라겐의 발현 억제에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트를 제공하는 것도 목적으로 한다.
또한, 본 발명은, PDGF-B 사슬에 의한 활성화를 저해하는 PDGF β 수용체 항체 (APB5) 투여의 효과를 래트의 사구체신염에 있어서 나타내고, PDGF 시그널 전달계가 사구체 세포 증식과 사구체 경화의 양쪽을 조절하고 있는 것을 in vivo 와 in vitro 에서 나타내는 것을 목적으로 한다. 본 발명은, 사구체 세포 증식과 사구체 경화에 관계하고 있는 물질을 이용한, 경화를 초래하는 증식성 질환의 검출방법 및 키트를 제공하는 것도 목적으로 한다. 또, 본 발명은, 사구체 세포 증식과 사구체 경화에 관계하고 있는 물질의 발현을 억제하는 작용을 갖는 물질의 용도를 제공하는 것도 목적으로 한다. 그리고 또, 본 발명은, 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트, 세포외 매트릭스의 증식 저해에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트, 및 α1 IV 형 콜라겐의 발현 억제에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트를 제공하는 것도 목적으로 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은, IV 형 콜라겐의 과잉 생성에 직접 관계하고 있는 물질로서 Smad1 을 동정하여, Smad1 이 당뇨병성 신증의 병인으로서 결정적인 역할을 갖는 것을 나타내었다. 또한, 본 발명자들은, 건강한 사람 및 당뇨병성 신증 환자의 신사구체에 있어서의 Smad1 및 액티빈 수용체형 키나아제 1 (activin-receptor-like kinase 1: ALK1) 의 발현을 조사한 결과, 당뇨병성 신증 환자에 있어서의 Smad1 및 ALK1 의 발현은 경화성 병변의 중증도와 비례하지만, 건강한 사람에서는 Smad1 및 ALK1 의 발현이 거의 확인되지 않는 것도 발견하였다. 그리고, Smad1 의 발현을 제어하는 BMP2 및 4 의 발현이 AGEs 자극 하에서 증가하는 것도 발견하였다.
그런데, 다수의 사구체 경화를 동반하는 질환군에 있어서 메산지움 세포의 증식이 확인되는 것은 진행성 사구체 장애에 있어서 이 프로세스가 중요하다는 것을 시사하고 있지만, 세포 증식과 사구체 경화의 관련은 분명하지 않다. 최근 본 발명자들은 당뇨병성 사구체 경화에 있어서, 사구체 경화의 주요한 구성성분인 IV 형 콜라겐 (Col4) 의 과잉 발현이 Smad1 에 의해 전사 조절되고 있음을 나타내었다. 본 연구에 있어서, 본 발명자들은 PDGF-B 사슬에 의한 활성화를 저해하는 PDGF β 수용체 항체 (APB5) 투여의 효과를 래트의 사구체신염에 있어서 나타내어, PDGF 시그널 전달계가 사구체 세포 증식과 사구체 경화의 양쪽을 조절하고 있음을 in vivo 와 in vitro 에서 나타내었다.
메산지움 증식성 사구체신염의 실험 모델 (Thy1 GN) 은 항 래트 Thy-1.1 모노클로날 항체의 1회의 정맥 주사에 의해 유발되었다. Thy1 GN 에 있어서 메산지움 세포의 증식과 Col4 의 발현은 6일째에서 최대가 되었다. Smad1, 인산화 Smad1 (pSmad1), 인산화 STAT3 (pSTAT3) 에 대하여 면역 조직 염색한 결과, 사구체의 Smad1 의 발현 피크는 6일째로, 메산지움 증식과 피크가 일치하고 있었다. 사구체의 pSmad1 의 발현은 Thyl GN 의 1일째보다 상승하여, 발병 후 4일째에 최대가 되었다. APB5 에 의해 처치한 그룹에서는 메산지움 세포 증식도 사구체 경화도 유의하게 감소하였다. Smad1, pSmad1, pSTAT3 의 발현도 또한 APB5 의 투여에 의해 조사한 모든 포인트에서 유의하게 감소하고 있었다. APB5 처리는 in vitro 에서 pSmad1, pSTAT3 의 발현 저하나 Col4 단백의 발현 감소와 부수하여 메산지움 세포의 증식을 감소시켰다. 배양 메산지움 세포에서, 도미넌트 네거티브(dominant negative)한 STAT3 의 도입은 Col4 의 발현을 유의하게 저하시켰다. 이들 데이터는, STAT3 과 Smad1 의 활성화가 메산지움 세포 증식으로부터 사구체 경화로의 진전에 관여하고 있음을 시사하고 있다.
본 발명은, 이들 지견에 기초하여 완성된 것이다.
본 발명의 요지는 다음과 같다.
(1) 생체 시료에 있어서의, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하는 것을 포함하는, 경화를 초래하는 증식성 질환의 검출방법.
(2) 생체 시료에 있어서의, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하는 것을 포함하는, 경화를 초래하는 증식성 질환의 진행도 및/또는 치료의 유효성을 평가하는 방법.
(3) STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하기 위한 시약을 포함하는, 경화를 초래하는 증식성 질환을 검출하기 위한 키트.
(4) STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하기 위한 시약을 포함하는, 경화를 초래하는 증식성 질환의 진행도 및/또는 치료의 유효성을 평가하기 위한 키트.
(5) 생체 시료에 있어서의, Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 발현을 측정하는 것을 포함하는, 당뇨병성 신증의 검출방법.
(6) 생체 시료에 있어서의, Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 발현을 측정하는 것을 포함하는, 당뇨병성 신증의 진행도 및/또는 치료의 유효성을 평가하는 방법.
(7) Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 발현을 측정하기 위한 시약을 포함하는, 당뇨병성 신증을 검출하기 위한 키트.
(8) Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 발현을 측정하기 위한 시약을 포함하는, 당뇨병성 신증의 진행도 및/또는 치료의 유효성을 평가하기 위한 키트.
(9) STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는 작용을 갖는 물질을 유효성분으로서 함유하는, 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료제.
(10) STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는 작용을 갖는 물질을 유효성분으로서 함유하는, 세포외 매트릭스의 증식을 저해하는 약제.
(11) STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는 작용을 갖는 물질을 유효성분으로서 함유하는, α1 IV 형 콜라겐의 발현을 억제하는 약제.
(12) 피험물질이, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는지 여부를 판정하는 것을 포함하는, 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료에 유효한 물질을 동정하는 방법.
(13) 피험물질이, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는지 여부를 판정하는 것을 포함하는, 세포외 매트릭스의 증식 저해에 유효한 물질을 동정하는 방법.
(14) 피험물질이, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는지 여부를 판정하는 것을 포함하는, α1 IV 형 콜라겐의 발현 억제에 유효한 물질을 동정하는 방법.
(15) STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하기 위한 시약을 포함하는, 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료에 유효한 물질을 동정하기 위한 키트.
(16) STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하기 위한 시약을 포함하는, 세포외 매트릭스의 증식 저해에 유효한 물질을 동정하기 위한 키트.
(17) STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하기 위한 시약을 포함하는, α1 IV 형 콜라겐의 발현 억제에 유효한 물질을 동정하기 위한 키트.
발명의 효과
본 발명에 의해, IV 형 콜라겐의 과잉 생성에 직접 관계하고 있는 물질로서 Smad1 이 동정되고, Smad1 이 당뇨병성 신증의 병인으로서 결정적인 역할을 갖는 것이 개시되었다. 이것에 의해 당뇨병성 신증의 검출이 가능해져서, 또, 당뇨병성 신증의 예방 및/또는 치료제, 세포외 매트릭스의 증식을 저해하는 약제, α1 IV 형 콜라겐의 발현을 억제하는 약제가 제공되었다. 또한, 본 발명에 의해, 당뇨병성 신증의 예방 및/또는 치료에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트, 세포외 매트릭스의 증식 저해에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트, 그리고 α1 IV 형 콜라겐의 발현 억제에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트가 제공되었다.
또한, 본 발명에 의해, STAT3 과 Smad1 의 활성화가 진행성의 사구체 장애시의 2가지 현상, 세포 증식과 사구체 경화의 상호 작용을 조절하는 열쇠가 되는 패스웨이에 있음이 개시되었다. 이것에 의해, 경화를 초래하는 증식성 질환의 검출이 가능해져서, 나아가 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료제, 세포외 매트릭스의 증식을 저해하는 약제, α1 IV 형 콜라겐의 발현을 억제하는 약제가 제공되었다. 또한, 본 발명에 의해, 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트, 세포외 매트릭스의 증식 저해에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트, 그리고 α1 IV 형 콜라겐의 발현 억제에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트가 제공되었다.
본 명세서는, 본원의 우선권의 기초인 일본국 특허출원, 특원 2003-319538호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1 은 Smad1 에 의해 Col4 프로모터가 활성화되는 것을 나타낸다.
(A): AGEs 존재 하 또는 BSA 존재 하 (대조) 에서의 배양 메산지움 세포를 사용하여, 도면에 나타낸 항체를 사용해서 크로마틴 면역 침강법을 실시하였다. CIV-1 모티브에 대한 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 3회 반복하여 실시한 실험 중 1회의 결과를 나타낸다.
(B): CIV-1-LacZ 리포터 플라스미드와 야생형 Smad1 을 넣은 벡터, 또는 벡터만 (mock) 을 CMV-LUC 를 내부 컨트롤로서 배양 세포에 동시 도입하였다. 세포 유출액을 웨스턴 블롯법에 의해 항 Smad1 항체와 항 pSmad1 항체로 해석하였다. 3회 반복하여 실시한 실험의 1회의 결과를 나타낸다.
(C): 48시간 후, 배양 세포를 용해하여, β-갈락토시다아제 활성과 루시페라아제 활성을 측정하였다. 측정은 각 3회 실시하여 SD 를 나타낸다.
도 2 는 AGEs 에 노출시킴으로써 다이나믹하게 변동하는 Smad1 발현을 나타낸다.
(A): AGEs 또는 BSA 에 노출된 메산지움 세포의 Smad1 과 Col4 mRNA 발현의 경시적 변화를 RNase protection assay 에 의해 관찰하였다. AGEs 에 지속적으로 노출시키는 것은 Smad1 의 발현을 지속적으로 항진하고, Col4 의 발현도 평행하여 증가한다. 3회 반복하여 실시한 실험의 1회의 결과를 나타내었다.
(B): AGEs 또는 BSA 존재 하에서 72시간, 120시간 배양한 메산지움 세포의 면역 형광 사진. 3회 반복하여 실시한 실험의 1회의 결과를 나타낸다.
(C): AGEs 또는 BSA 존재 하에서 72시간 배양되었을 때의 Smad1 과 pSmad1 을 웨스턴 블롯으로 관찰하였다. 3회 반복하여 실시한 실험의 1회의 결과를 나타내었다.
도 3 은 메산지움 세포에 있어서의 Smad1 에 대한 특이적 안티센스 올리고의 효과를 나타낸다.
(A): 72시간의 AGEs 처리 후, 메산지움 세포는 Smad1 에 대한 안티센스 올리고, 또는 4미스매치 올리고 (대조) 로 16시간 처리하였다. 안티센스 올리고로 처리된 세포의 메산지움 세포를 항 Smad1 항체 (녹색) 으로 면역 형광 염색하고, 또 DAPI 염색하였다 (blue). 3회 반복하여 실시한 실험의 1회의 결과를 나타낸 다.
(B): AGEs 노출 후의 메산지움 세포에 Smad1 에 대한 안티센스 올리고 또는 4미스매치 올리고 (대조) 를 도입하였다. 3회 반복하여 실시한 실험의 1회의 결과를 나타낸다.
(C): Smad1 에 대한 안티센스 올리고는 Smad1 의 발현 항진을 저해하지만, 동시에 Col4 의 발현 항진도 저해한다. 3회 반복하여 실시한 실험의 1회의 결과를 나타낸다.
도 4 는 Smad1 과 ALK1 의 발현을 당뇨병성 신증의 인간에서 검출한 결과를 나타낸다. 당뇨병 5예, 비당뇨병 3예의 사구체를 항 Smad1 항체와 항 ALK1 항체를 사용하여 면역 조직 염색하였다. 사구체에서의 Smad1 과 ALK1 의 발현은 당뇨병에서는 현저히 확인되었지만, 비당뇨병에서는 확인되지 않았다. 모든 절편은 헤마톡실린에 의해 대비 염색하였다. 사진의 확대율은 모두 400배이다.
도 5 는 AGEs 존재 하에 배양한 메산지움 세포에 있어서의 mRNA 의 발현량을 BSA 존재 하에서의 배양 메산지움 세포의 mRNA 발현량과 비교한 결과를 나타낸다.
도 6 은 당뇨병성 신증 환자의 뇨 중 BMP2 를 웨스턴 블롯법으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 7 은 TGF-β 시그널에 의한 만성적 자극 하에서의 BMP2 및 BMP4 단백의 발현을 웨스턴 블롯법으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 8 은 실시예 1 의 결과에 기초한 시그널 전달 경로의 모식도이다.
도 9 는 Thy1 GN 래트가 비만성 메산지움 기질의 증식과 메산지움 영역의 확 대를 형성하고 있는 현미경 이미지이다. 항 Col4 항체를 사용한 면역 조직 염색에서 Thy1 GN 의 신사구체의 확대한 메산지움 영역에서는, ColIV 과잉 발현이 확인되었다. APB5 는 메산지움의 증식과 ColIV 발현을 감소시켰다. Thy1 GN 은 사구체에서 PDGF-B 사슬과 PDGF β 수용체도 또한 유의하게 양성이었지만, APB5 는 이들의 과잉 발현도 감소시켰다. A-C:RAM, D-F:ColIVG-H:PDGF-B 사슬, J-K:PDGF β 수용체, A, D, G, J: 정상 대조 래트, B, E, H, J: 6일째의 질환 대조 래트, C, F, I, L: 6일째의 APB5 처치된 래트
도 10 은 Thy1 GN 에 있어서의 조직학적 변화와 APB5 투여 효과의 정량.
A: 사구체 세포수. Thy1 GN 군에서는 사구체 세포수의 증가가 관찰된다.
B: Thy1 GN 의 PCNA 양성 세포수. APB5 처리된 래트의 사구체의 PCNA 양성 세포수는 어느 조사 포인트에서도 유의하게 감소하였다.
C: 메산지움 기질의 증식. 6일째의 Thy1 GN 래트에서 메산지움 기질의 증식이 관찰되었다. APB5 는 각 조사 포인트에서 메산지움 기질의 증식을 유의하게 감소시켰다.
D: IV 형 콜라겐의 발현. 대조군에서는, Col4 는 확대한 메산지움 영역에서 강한 양성으로 되었다. APB5 는 Col4 의 발현을 유의하게 감소시켰다.
*P<0.001 vs. 대조군, **P<0.001 vs. APB5 비처리 질환 대조군
도 11 은 Thy1 GN 에 있어서의 Smad1, 인산화 Smad1, 인산화 STAT3 의 면역 조직 화학 염색. Thy1 GN 래트의 사구체의 면역 조직 화학 염색에서 Smad1, 인산화 Smad1, 인산화 STAT3 의 발현은 놀랄만한 상승을 나타내었다. Thy1 GN 에 서 인산화 Smad1 은 핵과 동일한 장소에서 현저하게 확인되었다. APB5 처치는 각각의 유의한 감소를 가져왔다. A-C: Smad1, D-F: 인산화 Smad1, G-I: 인산화 STAT3, A, D, G: 정상 대조 래트, B, E, H: 6일째의 미처치 Thy1 래트, C, F, I: 6일째의 APB5 처치 래트.
도 12 는 Smad1, pSmad1, pSTAT3 발현의 타임 코스. Thy1 GN 래트의, 0, 1, 2, 4, 6, 12일째의 신장 절편에, Smad1, 인산화 Smad1, 인산화 STAT3 에 대한 항체를 사용한 면역 조직 염색이 실시되었다.
A: Thy1 GN 에 있어서의 Smad1 발현. Smad1 발현은 6일째에 최대가 되고, 12일째에 침정(沈靜)하였다.
B: 사구체 세포 전체에 대한 pSmad1 양성 세포 비율의 타임 코스. pSmad1 의 발현은 4일째에 최대가 되었다.
C: pSTAT3 발현의 타임 코스. 메산지움 영역의 pSTAT3 양성부분의 비율은 6일째까지 증대하고, 12일째에 침정하였다.
*P<0.001 vs. 대조군, **P<0.001 vs. 각 조사 포인트
도 13 은 Smad1, pSmad1, pSTAT3 발현에 있어서의 APB5 의 효과. 면역 조직 염색과 Smad1, pSmad1, pSTAT3 의 발현을 정량한 결과, 이들 단백은 메산지움 기질과 사구체의 ColIV 발현과 마찬가지로 APB5 처치에 의해 감소하였다.
A: Smad1 의 발현.
B: pSmad1 의 발현.
C: pSTAT3 의 발현.
*P<0.01 vs. APB5 비처리 질환 컨트롤
도 14 는 in vivo 에서의 APB5 의 효과.
A: APB5 의 메산지움 세포 증식의 억제 효과. BDGF-B의 첨가는 메산지움 세포 증식을 증대시키고, APB5 는 이 증대를 유의하게 저해하였다.
*P<0.05 vs. 대조, **P<0.05 vs. PDGF-B 자극을 받은 대조,
B: APB5 의 첨가에 의해 pSTAT3, pSmad1, Col4 단백의 발현이 감소한 것을 나타내는 웨스턴 블롯 해석. 3회의 독립된 실험 중의 1회를 나타내었다.
도 15 는 유전자 도입된 메산지움 세포의 웨스턴 블롯 해석 결과. pSmad1 과 Col4 단백의 발현은 도미넌트 네거티브한 STAT3 에 의해 감소하였다. 3회의 독립된 실험 중의 1회를 나타내었다.
도 16 은 실시예 1 및 2 의 결과에 기초한 시그널 전달 경로의 모식도이다.
도 17 은 환자 및 정상인의 뇨를 사용하여 항 ALK-1 항체를 일차 항체로서 웨스턴 블롯한 결과이다.
레인 1-5: 당뇨병성 신증 환자, 레인 6: 당뇨병에 경화를 동반하는 신증식성 질환을 합병한 미토콘드리아병 환자, 레인 7, 8: 당뇨병에 경화를 동반하지 않는 신질환을 합병한 환자, 레인 9-10: 정상인
도 18 은 치료 중인 당뇨병성 신증 환자의 뇨를 사용하여 항 ALK-1 항체를 일차 항체로서 웨스턴 블롯한 결과이다. 레인 왼쪽으로부터, 치료 개시시로부터 1주마다의 영동 이미지를 나타낸다.
도 19 는 환자 및 정상인의 뇨를 사용하여 항 Smad1 항체를 일차 항체로서 웨스턴 블롯한 결과이다.
레인 1-5: 당뇨병성 신증 환자, 레인 6: 당뇨병에 경화를 동반하는 신증식성 질환을 합병한 미토콘드리아병 환자, 레인 7, 8: 당뇨병에 경화를 동반하지 않는 신질환을 합병한 환자, 레인 9-10: 정상인
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
1. 당뇨병성 신증의 검출방법 및 키트
본 발명은, 생체 시료에 있어서의 Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 발현을 측정하는 것을 포함한, 당뇨병성 신증의 검출방법을 제공한다.
생체 시료는, Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질이 검출될 수 있는 어떠한 생체 시료여도 상관없다. 생체 시료의 예로는, 신조직 절편, 혈액, 혈청, 뇨 등을 들 수 있다.
Smad 는 포유류에서 1 부터 9 까지 동정되어 있고, Smad1 은 골형성 단백 (BMP) 시그널 전달계의 일원으로서 알려져 있으며, BMP 는 액티빈 수용체 키나아제 2, 3, 6 (ALK2, ALK3, ALK6) 를 통해서 표적유전자 전사를 조절한다 (Zwijsen A. et al., FEBS Letters 546, 2003, 133-139). BMP 시그널과 특이적으로 관계하는 Smad 는 그 외에 Smad5 및 8 이 있다. 그 외에 TGF-β/액티빈 시그널과 특이적으로 관계하는 것으로 간주되는 Smad 가 있으며, Smad2 와 Smad3 을 들 수 있다. 한편, Smad1 은, 내피 세포 및 조혈 세포 등에서는 액티빈 수용체형 키나아제 1 (ALK1) 를 통해서 TGF-β 의 시그널을 전달하여 표적유전자의 전사를 조절한다는 것도 알려져 있다 (Goumans MJ. et al., EMBO J., 2002, Apr 2, 21(7), 1743-53). 즉, Smad1 을 활성화함으로써 표적유전자의 전사 조절을 실시하는 시그널 전달계는, 주된 것으로서 BMP 계와 TGF-β 계의 2 방식이 존재하고 있다 (도 8). 단, 어느 조합에 의한 경로가 가장 중요한지는 충분히 검토되어 있지 않다.
「Smad1 활성화 작용을 갖는 물질」은, Smad1 을 활성화할 수 있는 물질이면 되고, 액티빈 수용체형 키나아제 1 (ALK1), 액티빈 수용체형 키나아제 3 (ALK3) 과 같이 직접적으로 Smad1 을 활성화하는 물질, 골형성 단백 (BMPs) 과 같이 액티빈 수용체 키나아제 (ALKs) 를 활성화함으로써 간접적으로 Smad1 을 활성화하는 물질이어도 된다.
PDGF 도 또한, 직접 간접의 구별은 불분명하지만, 본 발명자들의 연구 (실시예 2) 로부터 Smad1 을 활성화하는 것이 분명하다.
「Smad1 을 활성한다」란, Smad1 의 세린 잔기를 인산화하는 것 및/또는 핵내로 이행시키는 것을 말한다.
액티빈 수용체형 키나아제 1 (ALK1) 는, TGF-β 패밀리의 단백에 결합하는 typeI 리셉터의 하나이고, Smad1 을 활성화하는 작용을 갖는 것이 알려져 있다 (Chen YG, et al., Smad1 recognition and activation by the ALK1 group of transforming growth factor-β family receptors J. Biol. Chem. Vol.274, No.6, 3672-3677, 1999). ALK1 은 인간에서는 태반, 폐, 혈관 내피 세포에서 많이 발현되어 있고, ALK1 의 변이는 Osler-Rendu-Weber 증후군으로도 알려진 타입2 유전성 출혈성 모세혈관 확장증을 야기한다 (비특허문헌 17).
액티빈 수용체형 키나아제 3 (ALK3) 은 별칭 BMPR-IA 이고, 액티빈 수용체형 키나아제 3 (ALK3) 은, BMP 패밀리의 단백에 결합하는 typeI 리셉터의 하나로, 세린-트레오닌형의 리셉터이다. BMPs 와 결합한 ALK3 은 Smad1/5/8 을 활성화하여, 핵내로의 시그널 전달을 담당하고 있다.
골형성 단백 (BMPs) 은 TGF-β 슈퍼패밀리의 일원으로, 골형성을 비롯하여 발생기에 있어서의 사지의 발생이나 신경계의 분화에 관여하고 있다. 그러나 최근, BMPs 가 후신의 발생 조절에 관계한다고 하는 몇몇 보고에 의해 주목받고 있다. 신장은 중간 중배엽으로부터 발생하여, 전신(前腎), 중신(中腎), 후신(後腎)의 3단계를 거쳐 형성된다. 전신, 중신의 대부분은 나중에 퇴행 변성하고, 포유류 성체에 있어서 기능하는 신장은 후신이다. BMP 와 그 리셉터의 전사물은 발생도 중의 후신에 국재(局在)하고, BMP 2, 4, 7 은 In vitro 에서 뇨관의 분지 형태 형성과 분지 구조의 조절에 직접 또는 간접의 역할을 갖는다. In vivo 에서는, BMP7 무발현 변이 호모의 돌연변이체 마우스와 BMP4 무발현 변이 헤테로의 돌연변이체 마우스에서 신장의 표현형에 변화가 있음이 보고되어 있다 (Martinez G, et al, Int J Dev Biol. 2002; 46(4):525-33).
TGF-β 는 다방면에 걸치는 작용을 가지고, 각종 세포의 증식·분화, 세포외 매트릭스생성, 아포토시스, 면역계 등에 중요한 기능을 가지고 있다. TGF-β 는, 세포 표면의 수용체에 결합하여 세포내로 그 시그널을 전달한다. 세포내에서의 시그널 전달에는 일련의 Smad 단백 분자군이 중요한 역할을 하고 있다.
종래, 당뇨병성 신증의 발증 및 진전에는 고혈당 상태 하 TGF-β 가 ALK5 를 통해서 Smad2 및 Smad3 을 활성화하여 α1 IV 형 콜라겐을 비롯한 세포외 매트릭스를 과잉으로 생성시키는 방향으로 기능하는 경로가 관련되어 있다고 생각되고 있었지만 (Jin H. et al., Kidney International, 63, 2003, 2010-2019), 본 연구는 고혈당 상태 하에서 Smad1 을 통해서 세포외 매트릭스의 과잉 생성을 초래하는 경로가 존재한다는 것을 처음으로 보여준 것이다.
Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 발현은, 핵산 레벨 (즉, mRNA 의 발현) 및/또는 단백질 레벨에서 측정할 수 있다.
핵산 레벨에서의 측정에 관해서는, 생체 시료로부터 전 RNA 를 추출하고, 적당한 프라이머쌍을 사용하여 RT-PCR 에 의해 Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 mRNA 를 측정하면 된다. 적당한 프라이머쌍은, 예를 들어, NCBI Refseq 데이터베이스의 NM_005900 의 인간유래 Smad1 의 mRNA 의 염기 서열 (서열번호 1), NCBI Refseq 데이터베이스의 NM_000020 의 인간유래 액티빈 수용체형 키나아제 1 의 mRNA 의 염기 서열 (서열번호 2), GenBank 데이터베이스의 ACCESSION NM_001200 VERSION NM_001200.1 의 BMP2 의 mRNA 의 염기 서열 (서열번호 3), GenBank 데이터베이스의 ACCESSION NM_001202 VERSION NM_001202.2 의 BMP4 의 mRNA 의 염기 서열 (서열번호 4) 등의 특정한 영역을 특이적으로 증폭할 수 있도록 설계하면 된다. 적당한 프라이머쌍의 염기 서열을 이하에 나타낸다.
Smad1 의 mRNA 를 특이적으로 증폭하는 RT-PCR 에 사용하는 포워드 프라이머: 5'-ACTACCACCACGGCTTTCAC-3' (서열번호 5), 리버스 프라이머: 5'-AATAGGATTGTGGGGTGAGC-3' (서열번호 6)
ALK1 의 mRNA 를 특이적으로 증폭하는 RT-PCR 에 사용하는 포워드 프라이머: 5'-ccgtcaagatct tctcctcg-3' (서열번호 7), 리버스 프라이머: 5'-tcatgtctgaggcgatgaag-3' (서열번호 8)
BMP2 의 mRNA 를 특이적으로 증폭하는 RT-PCR 에 사용하는 포워드 프라이머: 5'-cccagcgtgaaaagagagac-3' (서열번호 9), 리버스 프라이머: 5'-gagaccgcagtccgtctaag-3' (서열번호 10)
BMP4 의 mRNA 를 특이적으로 증폭하는 RT-PCR 에 사용하는 포워드 프라이머: 5'-tgagcctttccagcaagttt-3' (서열번호 11), 리버스 프라이머: 5'-cttccccgtctcaggtatca-3' (서열번호 12)
또는, 생체 시료로부터 전체 RNA 를 추출하고, 적당한 프로브를 사용하여 노던 하이브리다이제이션법에 의해 Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 mRNA 를 측정해도 된다. 적당한 프로브는, 예를 들어, NCBI Refseq 데이터베이스의 NM_005900 의 인간유래 Smad1 의 mRNA 의 염기 서열 (서열번호 1), NCBI Refseq 데이터베이스의 NM_000020 의 인간유래 액티빈 수용체형 키나아제 1 의 mRNA 의 염기 서열 (서열번호 2), GenBank 데이터베이스의 ACCESSION NM_001200 VERSION NM_001200.1 의 BMP2 의 mRNA 의 염기 서열 (서열번호 3), GenBank 데이터베이스의 ACCESSION NM_001202 VERSION NM_001202.2 의 BMP4 의 mRNA 의 염기 서열 (서열번호 4) 등을 바탕으로 하여, 이들 서열의 일부 또는 전부의 영역에 특이적으로 하이브리다이즈하도록 설계하면 된다. 프로브는 32P 등으로 표지되어 있으면 된다.
단백질 레벨에서의 측정에 관해서는, 예를 들어, Smad1 에 대한 항체 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질에 대한 항체를 사용하여, 웨스턴 블롯, ELISA 또는 면역 조직 화학적 해석 등의 방법으로 Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질을 측정하면 된다. Smad1 에 대한 항체 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질에 대한 항체는, 형광색소, 효소, 중금속 등으로 표지되어 있어도 된다 (직접법). 또는, 이들 항체를 표지하는 대신에, 이들 항체 (1차 항체) 에 특이적인 항체 (2차 항체) 를 형광색소, 효소, 중금속 등으로 표지한 것을 사용해도 된다 (간접법). 항체는, 시험편 또는 라텍스 입자 등의 고상 담체에 고정되어 있는 것이 바람직하다.
Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 발현을 측정한다는 것은, Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 발현 유무를 검출하는 것, Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 발현량을 정량하는 것을 포함한다.
본 발명에 의해 당뇨병성 신증을 검출할 수 있다. 즉, Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 발현은 당뇨병성 신증의 발증을 나타낸다. 종래 당뇨병성 신증의 진단에는 뇨 중 IV 형 콜라겐, 뇨 중 알부민 측정이 사용되고 있는데, 이들을 대신하거나 또는 보완할 가능성이 있다.
또한, 본 발명에 의해, 당뇨병성 신증의 진행도 및/또는 치료의 유효성을 평가할 수 있다. 즉, Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 발현량은 당뇨병성 신증의 중증도에 비례한다. 또한, 당뇨병성 신증의 치료가 유효하면, 환자의 회복과 함께 Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 발현량이 감소한다.
당뇨병성 신증이란, 만성적인 고혈당 상태에 의해 야기되는 세소혈관 장애의 하나이다. 병리학적으로는 신사구체 기저막의 비후, 메산지움 영역의 확대, 사구체의 경화 병변을 나타내고, 임상적으로는 단백뇨 (미량 알부민뇨), 고혈압, 부종 등의 증후를 나타내며 최종적으로는 신부전이 되는 경우가 많다. 또한, 당뇨병에서는 사구체 이외의 조직에도 세동맥경화증, 뇨세관 간질의 변성ㆍ섬유화 등의 이상이 확인되어, 사구체의 병변을 보다 악화시키고 있다. 즉, 일정 기간 당뇨병을 앓은 후, 단백뇨, 고혈압, 신기능 장애가 서서히 진행되어 가는 병태를 신증으로 정의할 수 있다.
최근, 말기 신부전상태로 되어 신규하게 투석요법에 도입되는 케이스의 원(原)질환 중 30% 이상이 당뇨병성 신증이며, 현재도 증가 경향에 있다. 또, 투석 도입 후의 예후도 반드시 양호하다고는 할 수 없어, 의료상 큰 문제로 되어 있다. 따라서, 당뇨병성 신증의 발증ㆍ진전의 기전을 해명하여, 진단 및 치료를 개발하는 것이 중요한 과제로 되어 있다 (일본임상 55권ㆍ1997년 증간호 「당뇨병」(1)).
또한, 본 발명은, Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 발현을 측정하기 위한 시약을 포함하는, 당뇨병성 신증을 검출하기 위한 키트를 제공한다.
그리고 본 발명은, Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 발현을 측정하기 위한 시약을 포함하는, 당뇨병성 신증의 진행도 및/또는 치료의 유효성을 평가하기 위한 키트를 제공한다.
Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 발현을 측정하기 위한 시약의 예로는, Smad1 의 mRNA 의 염기 서열의 특정한 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍, Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 mRNA 의 염기 서열의 특정한 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍, Smad1 의 mRNA 의 일부 또는 전부의 영역에 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 프로브, Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 mRNA 의 일부 또는 전부의 영역에 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 프로브, Smad1 에 대한 항체, Smad1 활성화 작용을 갖는 물질에 대한 항체 등을 들 수 있다. 이들 프라이머쌍 및 항체는, 전술한 바와 같다.
본 발명의 키트는, 또한, 역전사효소, DNA 폴리메라아제, RNase-free water, 버퍼, 대조 mRNA, 대조 프라이머쌍, dNTP 혼합물, 키트의 사용설명서 등을 포함해도 된다 (핵산 레벨에서 프라이머쌍을 사용하여 Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 발현을 측정하는 키트인 경우).
또는, 본 발명의 키트는, 추가로, 전사용 버퍼, 블로킹 시약, 세정액, 키트의 사용설명서 등을 포함해도 된다 (웨스턴 블롯법으로 Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 발현을 측정하는 키트인 경우).
별도 양태에 있어서, 본 발명의 키트는, 또한, 표지된 2차 항체, 기질 (2차 항체가 효소로 표지되어 있는 경우), 희석액, 반응정지제, 키트의 사용설명서 등을 포함해도 된다 (ELISA 에 의해 Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 발현을 측정하는 키트인 경우).
또다른 별도 양태에 있어서, 본 발명의 키트는, 또, 발색제, 과산화수소수, 버퍼, 카운터 염색용 색소, 키트의 사용설명서 등을 포함해도 된다 (면역 조직 화학적 해석으로 Smad1 및/또는 Smad1 활성화 작용을 갖는 물질의 발현을 측정하는 키트인 경우).
2. 경화를 초래하는 증식성 질환의 검출방법 및 키트
본 발명은, 생체 시료에 있어서의, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하는 것을 포함하는, 경화를 초래하는 증식성 질환의 검출방법을 제공한다.
경화를 초래하는 증식성 질환이란, 장기의 경화가 관찰되는 질환을 말하고, 경화에 앞서, 또는 병행하여 세포 증식 및/또는 세포외 기질의 증가가 확인되는 상태를 말한다. 여기에는, 당뇨병성 신증, 만성 사구체신염, 막성 증식성 사구체신염, 소상(巢狀) 사구체 경화증, Light Chain Disease (L 사슬 침착병), 루푸스신염, 한랭 글로불린 혈증성신염, HIV 관련 신염, 자반병성 신염 등의 사구체를 침범하는 신장질환, 간섬유화, 동맥경화 등을 포함한다.
만성 사구체신염이란, 사구체의 염증과 진행성의 파괴를 일으키는, 신장질환이 만성적으로 지속되고 있는 상태를 말한다. 막성 증식성 사구체 신염, 소상 사구체 경화증, Light Chain Disease (L 사슬 침착병), 루푸스신염, 한랭 글로불린 혈증성신염, HIV 관련 신염, 자반병성 신염 등의 질환을 포함하는 증후군이다.
당뇨병성 신증이란, 당뇨병의 대표적 합병증의 하나로, 당뇨병에 의한 고혈 당 상태의 지속으로 인해 신기능이 진행성으로 감소하는 상태를 말한다.
간섬유화란 간경변 또는 만성간염 등에서 관찰되고, 간유동벽(hepatic sinusoidal wall)과 간세포삭 사이 (Disse 강) 에 콜라겐 등의 세포외 기질의 증가가 확인되는 상태를 말한다. 간섬유화는 간세포암 발생의 위험인자로, 섬유화가 진행될수록 간세포암의 발생율이 높아지는 것으로 알려져 있다.
동맥경화란 동맥벽이 비후 또는 경화하는 병변의 총칭인데, 산화 스트레스 등에 의한 내피 세포의 상해에 기인하는 만성 염증성ㆍ증식성 병변으로 생각되고 있다. 동맥경화의 진행에 의해 동맥의 협착ㆍ폐색이 일어나면 혈압 상승, 심근경색, 뇌경색 등을 야기하지만, 장기 장애를 일으키기 전의 자각 증상은 빈약하다.
생체 시료는, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질이 검출될 수 있는 생체 시료라면 어느 것도 상관없다. 생체 시료의 예로는, 신조직 절편, 혈액, 혈청, 뇨 등을 들 수 있다.
STAT3 은, signal transducer and activator of transcription (STAT) 단백의 하나이다. STAT3 은, 인터페론, 상피 성장인자, 인터류신 5, 인터류신 6, 간세포 증식인자, 백혈병 억제인자, 골 성장인자 2 등의 다양한 사이토카인이나 증식인자가 그 수용체에 결합하면, 수용체 관련 키나아제에 의해 티로신 인산화됨으로써 활성화된다 (인산화 STAT3).
인산화 Smad1 은, Smad1 의 세린 잔기가 인산화되어 활성화된 상태의 것이다.
STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현은, 핵산 레벨 (즉, mRNA 의 발현) 및/또는 단백질 레벨에서 측정할 수 있다.
핵산 레벨에서의 측정에 관해서는, 생체 시료로부터 전체 RNA 를 추출하고, 적당한 프라이머쌍을 사용하여, RT-PCR 에 의해 STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 mRNA 를 측정하면 된다. 적당한 프라이머쌍은, 예를 들어, NCBI Refseq 데이터베이스의 NM_139276 의 인간유래 STAT3 의 mRNA 의 염기 서열 (서열번호 19), NCBI Refseq 데이터베이스의 NM_005900 의 인간유래 Smad1 의 mRNA 의 염기 서열 (서열번호 1), NCBI Refseq 데이터베이스의 NM_000020 의 인간유래 액티빈 수용체형 키나아제 1 의 mRNA 의 염기 서열 (서열번호 2), NCBI Refseq 데이터베이스의 NM_004329 의 인간유래 액티빈 수용체형 키나아제 3 의 mRNA 의 염기 서열 (서열번호 20), GenBank 데이터베이스의 ACCESSION NM_001200 VERSION NM_001200.1 의 BMP2 의 mRNA 의 염기 서열 (서열번호3), GenBank 데이터베이스의 ACCESSION NM_001202 VERSION NM_001202.2 의 BMP4 의 mRNA 의 염기 서열 (서열번호 4) 등의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있도록 설계하면 된다. 적당한 프라이머쌍의 염기 서열을 이하에 나타낸다.
STAT3 의 mRNA 를 특이적으로 증폭하는 RT-PCR 에 사용하는 포워드 프라이 머: 5'-agatgctcactgcgctgga-3' (서열번호 21), 리버스 프라이머: 5'-tccaatgcaggcaatctgtt-3' (서열번호 22)
Smad1 의 mRNA 를 특이적으로 증폭하는 RT-PCR 에 사용하는 포워드 프라이머: 5'-ACTACCACCACGGCTTTCAC-3' (서열번호 5), 리버스 프라이머: 5'-AATAGGATTGTGGGGTGAGC-3' (서열번호 6)
ALK1 의 mRNA 를 특이적으로 증폭하는 RT-PCR 에 사용하는 포워드 프라이머: 5'-ccgtcaagatct tctcctcg-3' (서열번호 7), 리버스 프라이머: 5'-tcatgtctgaggcgatgaag-3' (서열번호 8)
ALK3 의 mRNA 를 특이적으로 증폭하는 RT-PCR 에 사용하는 포워드 프라이머: 5'-tggcactgggatgaaatca-3' (서열번호 23), 리버스 프라이머: 5'-tggttacataaattggtccga-3' (서열번호 24)
BMP2 의 mRNA 를 특이적으로 증폭하는 RT-PCR 에 사용하는 포워드 프라이머: 5'-cccagcgtgaaaagagagac-3' (서열번호 9), 리버스 프라이머: 5'-gagaccgcagtccgtctaag-3' (서열번호 10)
BMP4 의 mRNA 를 특이적으로 증폭하는 RT-PCR 에 사용하는 포워드 프라이머: 5'-tgagcctttccagcaagttt-3' (서열번호 11), 리버스 프라이머: 5'-cttccccgtctcaggtatca-3' (서열번호 12)
또는, 생체 시료로부터 전체 RNA 를 추출하고, 적당한 프로브를 사용하여, 노던 하이브리다이제이션법에 의해 STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루 어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 mRNA 를 측정해도 된다. 적당한 프로브는, 예를 들어, NCBI Refseq 데이터베이스의 NM_139276 의 인간유래 STAT3 의 mRNA 의 염기 서열 (서열번호 19), NCBI Refseq 데이터베이스의 NM_005900 의 인간유래 Smad1 의 mRNA 의 염기 서열 (서열번호 1), NCBI Refseq 데이터베이스의 NM_000020의 인간유래 액티빈 수용체형 키나아제 1 의 mRNA 의 염기 서열 (서열번호 2), NCBI Refseq 데이터베이스의 NM_004329 의 인간유래 액티빈 수용체형 키나아제 3 의 mRNA 의 염기 서열 (서열번호 20), GenBank 데이터베이스의 ACCESSION NM_001200 VERSION NM_001200.1 의 BMP2 의 mRNA 의 염기 서열 (서열번호 3), GenBank 데이터베이스의 ACCESSION NM_001202 VERSION NM_001202.2 의 BMP4 의 mRNA 의 염기 서열 (서열번호 4) 등을 바탕으로 하여, 이들 서열의 일부 또는 전부의 영역에 특이적으로 하이브리다이즈하도록 설계하면 된다. 프로브는 32P 등으로 표지되어 있으면 된다.
단백질 레벨에서의 측정에 관해서는, 예를 들어, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질에 대한 항체를 사용하여, 웨스턴 블롯, ELISA 또는 면역 조직 화학적 해석 등의 방법으로, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질을 측정하면 된다. 항체는, 형광색소, 효소, 중금속 등으로 표지되어 있어도 된다 (직접법). 또는, 이들 항체를 표지하는 대신에, 이들 항체 (1차 항체) 에 특이적인 항체 (2차 항체) 를 형광색소, 효소, 중금속 등으로 표지한 것을 사용해도 된다 (간접법). 항체는, 시험편 또는 라텍스 입자 등의 고상 담체에 고정되어 있는 것이 바람직하다.
STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정한다는 것은, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현 유무를 검출하는 것, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현량을 정량하는 것을 포함한다.
본 발명에 의해, 경화를 초래하는 증식성 질환을 검출할 수 있다. 즉, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현은 경화를 초래하는 증식성 질환의 발증을 나타낸다. 종래 당뇨병성 신증이나 만성 사구체신염 등의 사구체를 침범하는 신장 질환의 진단에는 뇨 중 IV 형 콜라겐, 뇨 중 알부민 측정이 사용되고 있는데, 이들을 대신하거나, 또는 보완할 가능성이 있다.
또한, 본 발명에 의해, 경화를 초래하는 증식성 질환의 진행도 및/또는 치료 의 유효성을 평가할 수 있다. 즉, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현량은, 경화를 초래하는 증식성 질환의 중증도에 비례한다. 또한, 경화를 초래하는 증식성 질환의 치료가 유효하면, 환자의 회복과 함께, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현량이 감소한다.
또한, 본 발명은, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하기 위한 시약을 포함하는, 경화를 초래하는 증식성 질환을 검출하기 위한 키트를 제공한다.
그리고 본 발명은, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하기 위한 시약을 포함하는, 경화를 초래하는 증식성 질환의 진행도 및/또는 치료의 유효성을 평가하기 위한 키트를 제공한다.
경화를 초래하는 증식성 질환이란, 전술한 바와 같다.
STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하기 위한 시약의 예로는, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 mRNA 의 염기 서열의 특정한 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 mRNA 의 일부 또는 전부의 영역에 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 프로브, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질에 대한 항체 등을 들 수 있다. 이들 프라이머쌍 및 항체는, 전술한 바와 같다.
본 발명의 키트는, 또한, 역전사효소, DNA 폴리메라아제, RNase-free water, 버퍼, 대조 mRNA, 대조 프라이머쌍, dNTP 혼합물, 키트의 사용설명서 등을 포함해도 된다 (핵산 레벨에서 프라이머쌍을 사용하여 STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하는 키트인 경우).
혹은 또, 본 발명의 키트는, 또한, 전사용 버퍼, 블로킹 시약, 세정액, 키트의 사용설명서 등을 포함해도 된다 (웨스턴 블롯법으로, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측 정하는 키트인 경우).
별도 양태에 있어서, 본 발명의 키트는, 또한, 표지된 2차 항체, 기질 (2차 항체가 효소로 표지되어 있는 경우), 희석액, 반응정지제, 키트의 사용설명서 등을 포함해도 된다 (ELISA 에 의해, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하는 키트인 경우).
또 별도 양태에 있어서, 본 발명의 키트는, 또한, 발색제, 과산화수소수, 버퍼, 카운터 염색용 색소, 키트의 사용설명서 등을 포함해도 된다 (면역 조직 화학적 해석으로, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하는 키트인 경우).
3. 약제 및 의약 조성물
본 발명은, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는 작용을 갖는 물질을 유효성분으로서 함유하는, 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료제를 제공한다.
경화를 초래하는 증식성 질환이란, 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명은, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는 작용을 갖는 물질을 유효성분으로서 함유하는, 세포외 매트릭스의 증식을 저해하는 약제를 제공한다. 세포외 매트릭스란, 동물조직 중의 세포의 외측에 존재하는 안정적인 생체 구조물로, 세포가 합성하여 세포외에 분비ㆍ축적된 생체 고분자의 회합체이다. 배양 세포가 합성ㆍ분비하여 세포 주변에 침착시킨 구조물도 포함한다. 세포외 매트릭스는 결합 조직에 많이 관찰되지만, 기저막도 세포외 매트릭스의 일종이다.
또 본 발명은, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는 작용을 갖는 물질을 유효성분으로서 함유하는, α1 IV 형 콜라겐의 발현을 억제하는 약제를 제공한다.
이들 약제는, 의약품으로서 또는 실험용 시약으로서 사용할 수 있다.
STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는 작용을 갖는 물질의 예로는, Smad1 에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 (그 염기 서열의 일례를 서열번호 13 에 나타낸다), SANE (Smad1 Antagonistic Effector) (Raju GP et al., J Biol Chem. 2003 Jan 3; 278(1):428-437), PDGF β 수용체 항체 (APB5), STAT3 에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 등을 들 수 있다. 어느 단백질도 유전자 재조합 기술을 사용하여 대장균, 효모균, 곤충 세포, 동물 세포, 또는 무세포 단백 합성계 등에서 생성하는 것이 가능하다. Smad1 또는 STAT3 에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 시판되는 DNA 합성기를 사용하여 공지된 방법에 의해 합성할 수 있다. 항 마우스 PDGFR-β 항체인 APB5 는 다음과 같이 하여 제작할 수 있다. 마우스 PDGFR-β 의 세포외 도메인에 상당하는 cDNA 프래그먼트를 CD4Rg 벡터에 삽입하고, 인간 IgG1 과의 융합 단백 PDGFR-β/Human IgG1 을 COS-1 세포주로 발현시켰다. 상청에 의해 융합 단백을 정제하여 위스터종의 래트에 면역하고, 그 비장 세포와 미엘로머 세포주와의 융합 세포를 제작하여, PDGFR-β 에 대한 항체를 생성하는 세포를 선별하였다. APB5 에 한하지 않고, 공지된 방법에 의해 제작가능한 항 PDGFR-β 특이 항체를 APB5 와 동일하게 사용하는 것도 가능하다.
STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는 작용을 갖는 물질은, 1종류만 사용해도 되고, 복수 종을 조합하여 사용해도 된다.
STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는 작용을 갖는 물질은 단독으로, 또는, 약리학적으로 허용될 수 있는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께, 적당한 제형의 의약 조성물로서 포유동물 (예를 들어, 인간, 토끼, 개, 고양이, 래트, 마우스) 에 대하여 경구적 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 투여량은 투여대상, 질환의 종류, 증상, 투여 루트 등에 따라서 달라지지만, 예를 들어, 성인에 투여하는 경우에는, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는 작용을 갖는 물질 (예를 들어, SANE) 을 1회량으로서 통상 10∼100㎎/㎏ 체중 정도, 바람직하게는 60∼40㎎/㎏ 체중 정도를, 1개월에 1∼2회 정도, 바람직하게는 치료 개시시에 동량을 2∼3일 연속하여 정맥 주사에 의해 투여하면 된다. 다른 비경구투여 및 경구투여의 경우에도 이것에 준하는 양을 투여할 수 있다. 증상이 특히 심한 경우에는 그 증상에 따라서 증량해도 된다.
경구투여를 위한 조성물로는, 고체 또는 액체의 제형, 구체적으로는 정제 (당의정, 필름 코팅정을 포함한다), 환제, 과립제, 산제, 캡슐제 (소프트 캡슐제를 포함한다), 시럽제, 유제, 현탁제 등을 들 수 있다. 이러한 조성물은 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있고, 제제분야에서 통상적으로 사용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유해도 된다. 예를 들어, 정제용의 담체, 부형제로는, 유당, 전분, 자당, 스테아르산마그네슘 등을 들 수 있다.
비경구투여를 위한 조성물로는, 예를 들어, 주사제, 좌제 등을 들 수 있고, 주사제는 정맥주사제, 피하주사제, 피내주사제, 근육주사제, 점적주사제 등의 제형이면 된다. 이러한 주사제는 통상적인 방법, 즉 Smad1 의 발현을 억제하는 작용을 갖는 물질을 통상 주사제에 사용되는 무균의 수성 또는 유성액에 용해, 현탁 또는 유화함으로써 조제된다. 주사용의 수성액으로는 생리식염수, 포도당이나 그 밖의 보조약을 함유한 등장액 등을 들 수 있고, 적당한 용해보조제, 예를 들어, 알코올 (예를 들어, 에탄올), 폴리알코올 (예를 들어, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50㏖) adduct of hydrogenated castor oil)) 등과 병용해도 된다. 유성액으로는 참기름, 대두유 등을 들 수 있고, 용해보조제로서 벤조산벤질, 벤질알코올 등을 병용해도 된다. 조제된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전된다. 직장 투여에 사용되는 좌제는, Smad1 의 발현을 억제하는 작용을 갖는 물질을 통상의 좌약용 기제에 혼합함으로써 조제할 수 있다.
상기한 경구용 또는 비경구용 의약 조성물은, 유효성분의 투여량에 적합한 투약단위의 제형으로 조제하면 된다. 이러한 투약단위의 제형으로는, 정제, 환제, 캡슐제, 주사제 (앰플), 좌제 등을 들 수 있다.
또한, 상기한 의약 조성물은, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는 작용을 갖는 물질과의 배합에 의해 바람직하지 않은 상호 작용을 일으키지 않는 한, 다른 유효성분을 함유해도 된다.
STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는 작용을 갖는 물질이 Smad1 또는 STAT3 에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드인 경우에는, 공지된 유전자 도입법에 의해 피험자 또는 피험자의 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어, Smad1 또는 STAT3 에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 리포솜에 봉입하여, 세포 내에 도입하는 방법 ("Lipidic vector systems for gene transfer (1997) R. J. Lee and L. Huang rit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst 14, 173-206; 나카니시 마모루 등, 단백질 핵산 효소 Vol.44, No.11, 1590-1596 (1999)), 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법, 리포펙션법, 마이크로인젝션법, 유전자 건에 의한 방법 등으로 도입할 수 있다. Smad1 또는 STAT3 에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포에 도입하는 경우에는, 예를 들어, 질환 부위의 세포를 일부 취득하여, in vitro 에서 유전자 도입한 후, 그 세포를 다시 조직에 되돌리는 것도 가능하고, 또는 질환부의 조직에 직접 도입할 수도 있다.
Smad1 또는 STAT3 에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물은, 필요에 따라 의약상 허용되는 담체 (예를 들어, 생리식염수, 완충액 등의 희석제) 를 함유할 수 있다. 투여는 질병의 상태의 중증도나 생체의 응답성에 따라 다르지만, 치료의 유효성이 인정될 때까지, 또는 질병상태의 경감이 달성되기까지의 기간에 걸쳐 적당한 용량, 투여방법, 빈도로 실시하면 된다.
4. 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트, 세포외 매트릭스의 증식 저해에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트, 그리고 α1 IV 형 콜라겐의 발현 억제에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트
본 발명은, 피험물질이, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는지 여부를 판정하는 것을 포함하는, 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료에 유효한 물질을 동정하는 방법을 제공한다.
경화를 초래하는 증식성 질환이란, 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명은, 피험물질이, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는지 여부를 판정하는 것을 포함하는, 세포외 매트릭스의 증식 저해에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트도 제공한다.
그리고 또, 본 발명은, 피험물질이, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는지 여부를 판정하는 것을 포함하는, α1 IV 형 콜라겐의 발현 억제에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트도 제공한다.
본 발명의 상기 방법의 일 실시양태에 관해서 설명한다.
우선, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질을 발현하는 능력을 갖는 세포를 준비한다. STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질을 발현하는 능력을 가지는 세포로는 어떠한 세포를 사용해도 되고, 그 예로서, 동물의 신사구체유래 메산지움 세포 (예를 들어, 후술하는 인용문헌 S1 에 기재된 것), 혈관 평활근 세포 등을 들 수 있다.
STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질을 발현하는 능력을 가지는 세포를 피험물질의 존재 하 및 비존재 하에서 각각 배양하여, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정한다. 피험물질의 예로는, 예를 들어, 펩티드, 단백, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물조직 추출액 등을 들 수 있고, 이들 물질은 신규 물질이어도 되고, 공지된 물질이어도 된다. STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질을 발현하는 능력을 갖는 세포의 배양은, 그 세포의 배양에 적합한 조건에서 실시하면 된다. 예를 들어, 마우스의 신사구체유래 메산지움 세포 (후술하는 인용문헌 S1) 는, 후술의 실시예 1 에 기재된 바와 같이 하여 배양할 수 있다. STAT3 및 Smad1 의 발 현을 측정하는 방법은 전술한 바와 같다.
인산화 STAT3 및 인산화 Smad1 의 발현은, 각각, 항 인산화 STAT3 항체 (산타크루즈바이오테크놀로지) 및 항 인산화 Smad1 항체 (칼바이오켐) 를 1차 항체로서 사용하는 면역 염색에 의해 측정할 수 있다.
피험물질의 존재 하에서 세포를 배양한 경우의 STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현량과, 피험물질의 비존재 하에서 세포를 배양한 경우의 STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현량을 비교한다. 전자가 후자보다 적으면, 피험물질이 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료에 유효하다고 판정한다. 또는, 피험물질이 세포외 매트릭스의 증식 저해에 유효하거나, 또는 α1 IV 형 콜라겐의 발현 억제에 유효하다고 판정한다. 반대로, 전자가 후자와 동등하거나, 또는 전자가 후자보다 많으면, 피험물질이 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료에 유효하지 않다고 판정한다. 또는, 피험물질이 세포외 매트릭스의 증식 저해에 유효하지 않거나, 또는, α1 IV 형 콜라겐의 발현 억제에 유효하지 않다고 판정한다.
본 발명은, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하기 위한 시약을 포함하는, 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료에 유효한 물질을 동정하기 위한 키트도 제공한다.
또한, 본 발명은, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지 는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하기 위한 시약을 포함하는, 세포외 매트릭스의 증식 저해에 유효한 물질을 동정하기 위한 키트도 제공한다.
그리고 본 발명은, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하기 위한 시약을 포함하는, α1 IV 형 콜라겐의 발현 억제에 유효한 물질을 동정하기 위한 키트도 제공한다.
경화를 초래하는 증식성 질환이란, 전술한 바와 같다.
STAT3 또는 Smad1 의 발현을 측정하기 위한 시약의 예로는, STAT3 또는 Smad1 의 mRNA 의 염기 서열의 특정한 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍, STAT3 또는 Smad1 의 mRNA 의 일부 또는 전부의 영역에 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 프로브, STAT3 또는 Smad1 에 대한 항체 등을 들 수 있다. 이들 프라이머쌍 및 항체는 전술한 바와 같다.
인산화 STAT3 또는 인산화 Smad1 의 발현을 측정하기 위한 시약의 예로는, 항 인산화 STAT3 항체 (산타크루즈바이오테크놀로지) 및 항 인산화 Smad1 항체 (칼바이오켐) 등을 들 수 있다. 이들의 항체는 전술한 바와 같다.
본 발명의 키트는, 또한, 역전사효소, DNA 폴리메라아제, RNase-free water, 버퍼, 대조 mRNA, 대조 프라이머쌍, dNTP 혼합물, 키트의 사용설명서 등을 포함해도 된다 (핵산 레벨에서 프라이머쌍을 사용하여 STAT3 또는 Smad1 의 발현을 측정하는 키트인 경우).
또는, 본 발명의 키트는, 추가로, 전사용 버퍼, 블로킹 시약, 세정액, 키트의 사용설명서 등을 포함해도 된다 (웨스턴 블롯법으로 STAT3 또는 Smad1 의 발현을 측정하는 키트인 경우).
별도 양태에 있어서, 본 발명의 키트는, 또한, 표지된 2차 항체, 기질 (2차 항체가 효소로 표지되어 있는 경우), 희석액, 반응정지제, 키트의 사용설명서 등을 포함해도 된다 (ELISA 에 의해 STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 또는 인산화 Smad1 의 발현을 측정하는 키트인 경우).
또다른 별도 양태에 있어서, 본 발명의 키트는, 또, 발색제, 과산화수소수, 버퍼, 카운터 염색용 색소, 키트의 사용설명서 등을 포함해도 된다 (면역 조직 화학적 해석으로 STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 또는 인산화 Smad1 의 발현을 측정하는 키트인 경우).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 또, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1
마우스 Col4 유전자의 프로모터 영역의 CIV 부위에 결합하는 단백을 동정하기 위해, AGEs 처리된마우스의 메산지움 세포로부터 cDNA 라이브러리를 구축하였다. 본 실험에서는 Yeast one-hybrid system 을 사용하여 라이브러리로부터 특이적인 전사인자를 코딩하는 클론을 선택해서, 그 클론이 Smad1 을 코딩하고 있는 것을 동정하였다. Smad1 의 Col4 프로모터 영역에 대한 결합을 in vivo 에서 확인하기 위해, 크로마틴 면역 침강법 (ChIP) 을 실시하였다. 침강한 DNA 를 정제하여 Col4 의 프로모터 영역을 PCR 로 검출하였다. 항 Smad1 항체는, AGEs 처리된 세포로부터 얻은 CIV-1부위를 포함하는 크로마틴을 침강시켰다 (도 1A). BSA 처리된 세포에서는 침강하지 않았다. Smad4 도 또한 CIV-1부위에 결합하는 것을 발견하였다 (도 1A). 다음으로 Col4 의 전사 활성을 리포터 분석에 의해 검토하였다. LacZ 앞에 CIV-1 프로모터를 연결한 벡터를 제작하여, 야생형 Smad1 벡터와 함께 COS7 세포에 동시 도입하였다. 우선, Western blot 에 의해 Smad1 의 발현을 확인하고 (도 1B), 야생형 Smad1 벡터를 도입한 세포 상청에 인산화 Smad1 (pSmad1) 을 검출하였다. 야생형 Smad1 의 동시 도입에 의해 Col4 단독 (Mock) 인 경우와 비교하여 β-갈락토시다아제 활성은 18배였다 (도 1C). β-갈락토시다아제 활성은 루시페라아제 활성에 의해 보정하고, Mock 벡터를 동시 도입한 세포에서의 활성을 기준으로 하였다. Mock 은 동시 도입 세포의 β-갈락토시다아제 활성에 전혀 영향을 주지 않았다. 이 결과는, Smad1 이 확실하게 Col4 유전자 전사를 유도하는 것을 시사하고 있다. 요컨대, Smad1 은 Col4 의 전사를 조절하고 있다.
Smad1 이 AGEs 에 의해 업 레귤레이트되어 있는지를 확인하기 위해, AGEs 존재 하ㆍ비존재 하에서의 메산지움 세포에서의 Smad1 의 발현을 조사하였다. AGE 존재 하에서는 Smad1 의 mRNA 양이 경시적으로 상승하였다 (도 2 A). 마찬가지로 Col4 의 mRNA 도 Smad1 의 전사가 상승하는 것과 평행하여 상승하였다. 그러나, BSA 존재 하에서는 Smad1 의 전사도 Col4 의 전사도 변화하지 않았다. Smad1 은 인산화되고, 핵내로 이동하여 표적유전자의 전사를 조절하는 것으로 알려져 있다 (11) (12). 따라서, 다음으로 본 발명자들은 AGEs 에 의해 Smad1 의 인산화 및 세포내의 이동이 영향을 받는가 하는 것을 메산지움 세포를 가지고 검토하였다 (도 2B). mRNA 의 결과와 일치하여, AGEs 존재 하 72시간 배양으로 세포질에 우선적으로 존재하였다. 그리고, AGEs 존재 하 120시간 배양으로 Smad1 과 pSmad1 의 핵내로의 집적이 확인되었다. BSA 존재 하에서의 배양에서는 Smad1 과 pSmad1 은 조금밖에 발현되지 않는다. 마찬가지로 AGEs 처리 세포의 추출액에는 Smad1 과 pSmad1 이 인정되었지만, BSA 처리 세포의 추출액에는 인정되지 않았다 (도 2C). 이들 지견은, Col4 의 조절이 AGEs 존재 하에서 Smad1 의 발현과 연동하고 있음을 나타낸다.
AGE 유도성의 Col4 의 과잉 생성을 매개하는 시그널 전달계에서의 Smad1 의 중요성을 확인하기 위해, 본 발명자들은 안티센스 유전자를 사용하여 특이적으로 이 계를 저해하였다. Smad1 의 AGE 에 의한 유도는 안티센스 유전자의 존재에 의해 완전히 소실되었지만, 컨트롤 올리고 존재 하에서는 소실되지 않았다 (4 미스매치 올리고) (도 3A, B). 그리고, Smad1 의 저해에 의해 Col4 의 과잉 발현이 현저히 감약되었다. Smad1 의 미스매치 올리고는 Col4 의 발현에는 영향을 주지 않았다 (도 3C). 이들 데이터는 Smad1 이 Col4 의 발현 제어에 결정적인 역할을 하는 것을 나타낸다. 당뇨병 환자에 있어서 당뇨병성 신증의 발증ㆍ진행은 이환률(罹患率)ㆍ사망율의 양쪽에 있어서 임상상 중대한 문제이다. 현행 치료방법에 있어서 혈당치의 컨트롤이 양호하면 당뇨병성 신증의 발증ㆍ진행을 늦출 수는 있지만, 예방이 불가능함이 명확하게 되어 있다 (1) (2). Smad1 에 대한 안티센스 올리고는 AGE 에 의한 Col4 의 과잉 발현을 현저하게 감약시킨다. 이들 지견은 Smad1 시그널계의 저해에 의해, 당뇨병성 신증에 있어서의 메산지움 세포의 ECM 의 생성을 막을 수 있다는 가능성을 시사하고 있다. 본 실험의 효과는 AGEs 의 지속적인 자극 존재 하에서 인정되었기 때문에, Smad1 이 당뇨병의 합병증이 새로운 타겟으로 시사되어, 현행의 치료법과 조합함으로써 효과를 발휘하는 것으로 생각된다. AGEs 처리에 의한 Smad1 발현의 메카니즘을 추가로 해명하기 위해, 본 발명자들은 메산지움 세포에 있어서의 activin-receptor liked kinase 1 (ALK1) 의 발현을 조사하였다. ALK1 은 TGF-β 수용체 패밀리의 단백질의 하나로, Smad1 과 Smad5 를 특이적으로 인산화하는 기능이 있다. ALK1 은 혈관내피 세포에서 많이 발현되어 있고 (13) (14), 혈관의 성숙과 안정화에 중요한 것으로 여겨지고 있다 (15) (16). ALK1 의 변이는, Osler-Rendu-Weber 증후군으로도 알려진 타입 II 유전성 출혈성 모세혈관 확장증을 일으킨다 (17). ALK1 은 TGF-β 로부터의 시그널을 Smad1 을 통해서 전달하여, TGF-β 반응성 유전자군을 조절하고 있다고 하는 최근의 보고가 있다 (18) (19). 본 발명자들은, AGEs 처리된 메산지움 세포에 있어서의 ALK1 의 발현을 RNase protection assay 법 및 Western blotting 법을 사용하여 각각 mRNA, 단백질의 양쪽을 검출하였다 (데이터는 나타내지 않음). 마지막으로, 인간의 당뇨병성 신증에 있어서의 신사구체에서의 Smad1 및 ALK1 의 발현을 조사하였다. 당뇨병성 신증 및 건강한 신장의 바이옵시를 시료로 하여 간접 항체법을 실시한 결과, 신사구체에서의 Smad1 과 ALK1 항체에 대한 반응성은 당뇨병성 신증인 사구체에서는 경화성 병변의 중증도와 비례하였지만, 건강한 신장에서는 거의 발현이 인정되지 않았다 (도 4). 이러한 조직학적인 지견은 Col4 의 정(正) 조절과 Smad1/ALK1 시그널 전달계에 관계가 있음을 시사하고 있다. 인간의 당뇨병성 신증은 오랜 세월에 걸쳐 천천히 진행되는 것이기 때문에, 이 현상을 상세하게 평가하기 위해서는 당뇨병과 Smad1 및 ALK1 의 관계를 명확하게 해야 할 것으로 보인다.
마우스에서의 Smad1 유전자의 특이적인 파괴는 태아기에 있어서 치사성이라는 점에서, Smad1 은 조기의 배발생에 결정적인 역할을 하는 것으로 생각된다 (20). 그러나, 태생기 조기에 있어서의 치사성으로 인해, Smad1 의 in vivo 에서의 역할, 특히 성인에 대해서는 그다지 알려져 있지 않다. Smad1 은 BMP 시그널을 전달하는 것으로서 알려지고 (12), 특히 신장의 발생에 있어서 중요하게 되어 있다 (21). 그러나, Smad1 은 adult mouse 의 사구체에서는 발현이 관찰되지 않았다 (22). 본 실험은, 처음으로 adult mouse 에서 Smad1 의 발현이 AGEs 에 의해 유도되는 것을 나타내었다. 본 발명자들은, AGEs 에 대한 만성적인 노출에서 Smad1 발현의 지속적인 상승, Col4 의 과잉 발현이 관찰되어, Smad1 이 당뇨병 존재 하에서는 결정적인 조절인자임을 시사하였다. AGEs 는 당뇨병의 합병증에 유의하게 관여하고 있기 때문에, 본 발명자들의 연구 결과는 콜라겐의 침착을 동반하는 당뇨병이나 노화와 같은 질환에 유용한 것으로 생각된다. GMB 의 구조의 변화는 당뇨병성 신증에 있어서 미량 알부민뇨가 일어나는 보다 이전의 초기에 일어나기 때문에, Smad1 은 당뇨병성 신증의 가장 초기적인 마커가 될 것이 다. 최근의 보고에서 ALK1 이 Smad1 을 통해서 TGF-β 의 시그널 전달을 중개하는 것이 개시되었다 (18) (19). 따라서, 본 발명자들은 마우스의 메산지움 세포와 인간의 신조직에서의 ALK1 의 발현을 검토하였다. 그 결과, ALK1 과 Smad1 은 신사구체에 있어서 당뇨병의 진행에 대응하여 발현하는 것을 본 실험에서 나타내었다. 이들 결과는 콜라겐의 병적인 생성을 억제함으로써, 여러 장기에서 일어나는 당뇨병 합병증의 치료로 이어진다 (1). 이 결과는 지속적인 혈당치의 상승이 AGEs 의 상승을 가져와, 장기적인 당뇨병 합병증의 진전에 필수적임을 확인하는 것이다 (23) (24). 당화에 의해 콜라겐이 크로스링크하여 동맥경화를 진척시킨다 (25). 또, AGEs 와 당뇨병 합병증과 동맥경화의 상관이 AGEs 에 특이적인 저해제를 사용한 연구에 의해 최근 강조되고 있다 (26) (27). Col4 는 혈관 기저막의 주요한 구성성분임에도 불구하고, 당뇨병이나 노화에 있어서의 Col4 의 생성 증진에 대해서는, 세포 레벨에서도 분자 레벨에서도 메카니즘이 거의 알려져 있지 않다. 따라서, 본 발명자들은 ALK1/Smad1 시그널 전달계가 당뇨병과 노화의 양쪽에서, ECM 을 과잉 발현시키는 것에 의해 동맥경화의 진전에 관계하고 있는 것으로 추측하고 있다. 당뇨병이나 노화의 동물 모델을 사용하여 ALK1/Smad1 시그널 전달계의 해명을 더욱 진행시키기 위해 연구 중이다.
그리고, AGEs 존재 하에서 배양한 메산지움 세포에 있어서의 mRNA 의 발현량을 BSA 존재 하에서의 배양 메산지움 세포의 mRNA 발현량과 비교하였다 (도 5). AGEs 존재 하에서는 BMPRII, BMP4 의 현저한 전사 증강이 확인된다. Smad1 의 전사량에 큰 변동은 확인되지 않지만, Smad1 은 전사인자이기 때문에 발현량의 큰 변동을 포착하기 어렵고, 또한, 전사인자의 작용에 중요한 세포질로부터 핵내로의 이행이나 인산화 등은 마이크로어레이의 결과에 반영되지 않기 때문인 것으로 생각된다.
또한, 당뇨병성 신증 환자의 뇨 중 BMP2 를 웨스턴 블롯법으로 측정한 결과, 치료에 의한 질환의 개선과 함께 뇨 중 BMP2 의 감소가 인정되었다 (도 6).
또한, TGF-β 시그널에 의한 만성적 자극에 의해 BMP2 및 BMP4 단백의 명백한 발현 항진이 확인되어 (도 7), TGF-β 시그널 전달계에 있어서 중심적인 기능을 이들 BMPs 가 담당하고 있을 가능성이 시사된다.
실험에 사용한 재료와 방법
Cell culture
정상적인 4주령의 마우스 (C57BL/6JxSJL/J) 의 신사구체유래 메산지움 세포주를 수립하고, 이전에 보고한 방법에 따라서 메산지움 세포임을 동정하였다 (S1). 메산지움 세포주는 1mM 글루타민, 100units/㎖ 페니실린, 100㎎/㎖ 스트렙토마이신, 20% FCS 를 첨가하여 B 배지 (최소 영양배지와 미량원소를 첨가한 F12 배지의 3:1 혼합 배지) 에서 배양하였다. 배양 세포는 신사구체 메산지움 세포로 판정되기 위한 일반적인 기준을 만족하였다 (S2). AGEs 또는 BSA 처리는 이전에 보고한 방법에 따라서 실시하였다 (S3).
cDNA library construction and Yeast One-hybrid screening
AGEs 처리한 마우스 신사구체배양 세포로부터 cDNA 를 조제하여 pGAD 벡터에 삽입하였다. Yeast One-hybrid screening 은 MATCHMAKER One-hybrid (Clontech, Palo Alto, California) 키트를 사용하여 실시하였다. 마우스유래 Col4 유전자의 27bp 의 탠덤 리피트 서열 (TTCCTCCCCTTGGAGGAGCGCCGCCCG : CIV-1) (서열번호 14) 을 효모의 integration and reporter vector 인 pHISi (MATCHMAKER One-hybrid (Clontech, Palo Alto, California) 또는 pLacZi (MATCHMAKER One-hybrid (Clontech, Palo Alto, California) 에 연결하여 CIV-1-pHISi 와 CIV-1-pLacZi 벡터를 제작하고, 그것을 직선화하여 효모주 YM4271 (MATCHMAKER One-hybrid (Clontech, Palo Alto, California) 의 염색체에 삽입하였다. CIV-1-pHISi 와 CIV-1-pLacZi 를 삽입한 효모를 사용하여 AGEs 처리한 마우스 메산지움 세포유래 cDNA 라이브러리의 One-hybrid screening 을 실시하였다. 45mM 3-아미노-1,2,4-트리아졸 (3-AT) 을 첨가한 SD/-His/-Leu 배지에서 적극적 클론을 선택하였다. 위양성(僞陽性) 클론을 제거하기 위해 β-galactosidase filter lift assay (Clontech) 를 실시하여, 남은 효모의 콜로니로부터 회수한 플라스미드를 대장균 (DH5α) 에 도입하였다.
ChIP assay
ChIP assay 는 Luo (S5) 의 방법에 따랐다. 항 Smad1 항체, 항 Smad-4 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California), 컨트롤 IgG 를 사용하여 4℃ 에서 오버나이트하였다. CIV-1 영역을 PCR 에 의해 증폭하였다. 사용 프라이머는 5'측 (5'-GGAGCTCCCCAATTTGTTG-3') (서열번호 15), 3'측 (5'-CAGCCTCCGCCTCTTACC-3') (서열번호 16) 이다. PCR 산물은 아갈로스겔 전기영동에서 100bp 전후였다.
Reporter assay
1.3×105 COS7 세포를 10% FBS 를 첨가한 Dulbecco 의 이글배지 (DMEM) 를 사용하여 6웰 플레이트에서 배양하였다. 8시간 후에 750ng 의 CIV-1-LacZ 와 동량의 Smad-1 을 삽입한 벡터, 또는 더미인 mock 벡터를 동시 도입하였다. 그리고, 내부 컨트롤로서 75ng 의 CMV-LUC (CMV 프로모터의 하류에 형광 루시페라아제 유전자를 연결한 것) 도 도입하였다. 도입에는 FuGENE6 (Roche molecular biochemicals, Indianapolis, Indiana) 을 사용하였다. 48시간 후에 세포를 reporter lysis buffer 에 회수하고, β-갈락토시다아제 활성과 루시페라아제 활성을 각각 β-galactosidase Reporter System (BD Bioscience, San Jose, California) 과 Lucifarase Reporter Assay System (Promega, Madison, Wisconsin) 을 사용하여 측정하고, β-갈락토시다아제 활성은 루시페라아제 활성의 측정 결과에 의해 보정하였다.
RNase protection assay
기보(旣報) (S6) 에 따라서 RNase protection assay 를 실시하였다.
이 분석에 사용한 프로브의 염기 서열은 Acc No.U58992 의 1172-1433 의 서열로 이하와 같다.
cccaccacc gtctgcaaga tccccagcgg gtgcagcttg aaaatcttca acaaccaaga gtttgctcag
ctactggcgc agtctgtgaa
ccacgggttc gagaccgtgt atgaactcac caaaatgtgc actattcgga tgagcttcgt
gaagggttgg ggagccgaat accaccggca ggatgttacc agcaccccct gctggattga
gatccatctg catggccctc tccagtggct ggataaggtt ctgacccaga tgg
(서열번호 17)
Western blotting
메산지움 세포를 AGEs 또는 대조로서 BSA 존재 하에서 72시간 배양하였다. Sample buffer 에 세포를 회수하여, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동으로 해석한 후, 니트로셀룰로오스막에 블롯팅하고, 501배로 희석한 항 Smad1 항체 및 항 pSmad1 항체 (Santa Cruz Biotechnology) 를 반응시켜, enhanced chemiluminescence detection system (Invitrogen, Carlsbad, California) 으로 검출하였다.
Immunostaining of cultured cells cytosections
배양 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하여, 100배로 희석한 항 Smad1 항체 (Santa Cruz Biotechnology), 100배로 희석한 항 pSmad-1 항체 (Calbiochem) 를 사용하였다. 적량의 플루오로세인 이소티오시아네이트를 결합 2차 항체를 레이저 현미경과 형광 현미경 (Olympus, Tokyo, Japan) 으로 관찰하였다.
Smad1 morpholino antisense oligonucleotide
Smad1 에 대한 25염기 길이의 안티센스 올리고를 합성하였다 (Genetools LLC, Philomath, Oregon). 서열은 5'-CAAGCTGGTCACATTCATAGCGGCT-3' (서열번호 13) 이다. 대조로서 합성 올리고 5'-CAtGCTcGTCACATTCAaAGCcGCT-3' (서열번호 18) 를 사용하여, 기보 (S7) 대로 in vitro RNA transcription 을 실시하였다.
Histology
병리조직학적 검토를 인간 조직을 사용하여 실시하였다. 본 실험은 헬싱키 선언에 의거하여 윤리위원회의 승인을 얻어 실시하였다. 환자로부터는 조직제공 및 연구에 사용하기 위한 승낙을 서면에 의해 얻었다. 5예의 당뇨병성 신증의 신장 생검 시료를 제공받았다. 대조로 한 정상 조직은 신장의 악성 종양에 의해 신장 적출 수술을 받은 환자의 신장의 정상 피질을 종양의 반대측으로부터 샘플링하였다. 신조직은 동결하여 5㎛ 두께의 절편을 잘라내고 아세톤으로 5분간 고정하였다. 내인성의 퍼옥시다아제의 영향을 지우기 위해 1% 과산화수소메탄올 중에 넣어 어두운 가운데에서 20분간 인큐베이트하였다. 그리고, 비특이적인 염색을 막기 위해, 적량의 면역 전 혈청을 사용하여 실온에서 20분간 인큐베이트하였다.
항 Smad1 항체 (Santa Cruz Biotechnology) 및 항 ALK1 항체 (R&D, Mickinley Place, Nebraska) 를 1차 항체로 하여 면역 염색하였다.
마이크로어레이에 의한 발현량의 해석
AGEs 존재 하에서 배양한 메산지움 세포 및 BSA 존재 하에서 배양한 메산지움 세포 각각에 있어서의 각 mRNA 의 발현량을 Agilent Technologies Mouse cDNA Microarray Kit를 사용하여 측정하였다.
실시예 2
사구체 경화는 세포외 기질 (ECM) 의 양적인 증가에 의해 특징지어진다. IV 형 콜라겐 (Col4) 은 사구체 질환에 있어서 증량된 ECM 의 주요 구성성분의 하나인 데, 본 발명자들의 최근 보고까지는 Col4 유전자의 전사 조절의 분자기구가 분명하지 않았다. 본 발명자들은, 당뇨병성 신증에 있어서 Smad1 이 Col4 의 과잉 발현을 전사 레벨에서 조절하고 있는 것을 나타내었다 (A8). Smad1 은 하류의 표적유전자로 시그널을 직접 전달한다. 예를 들어 오스테오폰틴 (A9), 분화의 저지 (A10), I 형 콜라겐 (A11), 그리고 신질환의 진전에 본질적으로 중요하다 (A12). 이들 지견은 Smad1 이 사구체 경화의 진전에 중대한 의미를 갖는 전사인자인 것을 시사하고 있다.
Signal transducer and activation (STAT) 단백은 많은 사이토카인과 증식인자의 시그널 전달에 관여하고 있다. STAT3 의 활성화는 PDGF 가 유도하는 분열 촉진의 열쇠가 되는 제어인자이다 (A13). Nakashima 들은 성상 세포의 분화에 있어서, 전사의 코액티베이터인 p300 이 STAT3 및 Smad1 과 물리적으로 상호 작용하여, 계속해서 표적유전자의 전사 활성화가 일어나는 것을 보고하였다 (A14). 이상의 지견으로부터, PDGF 가 메산지움 세포의 증식에 있어서 STAT3-Smad1 시그널 전달 경로를 활성화하고, 이 과정이 메산지움 세포의 증식으로부터 사구체 경화로 진전하는 데에 중요하다는 가설을 세웠다.
본 연구에 있어서, 본 발명자들은 래트의 사구체신염에 있어서 PDGF-B 사슬에 의한 활성화를 저해하는 항 PDGF-β 수용체 항체의 투여 효과를 나타내고, 사구체의 세포 증식, 사구체 경화의 양쪽을 조절하는 시그널 전달 경로에 관해서 in vivo, in vitro 에서 검토하였다.
실험에 사용한 재료와 방법
Animals
본 연구에는 체중 180-200g 의 수컷 위스터 래트 (닛폰크레아, 일본) 가 사용되었다. 래트는 특정 병원체 제거 환경 하에서 사육되었다. 본 연구는 도쿠시마대학의 윤리심사위원회의 승인을 받고, 모든 동물실험은 학내 가이드라인을 따라서 실시하였다.
Induction of Thy1 glomerulogephritis
실험적인 메산지움 증식성 사구체신염 (Thy1 GN) 은 항 래트 Thy-1.1 모노클로날 항체 (세다렌래보라토리즈사, 온타리오, 캐나다) 의 1회 투여 (1㎎/㎏) 에 의해, 기보와 같이 (A15) 유발되었다. 이들의 래트는 항 Thy-1.1 항체 투여 후 1, 2, 4, 6, 12일 후 (n=6/군) 에 도살되었다. 6마리의 나이가 같은 래트에 용매만 투여하여 각 군의 컨트롤로서 도살하였다.
Protocol of treatment with anti-PDGF β-R antibody in Thy1 GN
래트 모노클로날 항 PDGF β 수용체 항체 (APB5) 와, 그 PDGF β 수용체 시그널 전달계에 있어서의 길항 효과는 in vivo, in vitro 에서 이전에 보고되어 있다 (A16, A17). 래트에 APB5 (리카가쿠연구소ㆍ니시카와 신이치 교수의 후의에 의해 제공받았다) 또는 APB5 와 동일한 아이소 타입 IgG (리카가쿠연구소ㆍ니시카와 신이치 교수의 후의에 의해 제공받았다) 를 400㎍ 씩, 항 Thr1.1 의 투여 (0일) 로부터 매일 복강내 투여하여, 1, 2, 4, 6, 12일 후 (n=6/군) 에 도살하였다.
Histological examination
Light microscopy
신장을 적출 후, 조직편은 광학 현미경에 의한 연구를 위해 카르노아액 (메탄올:빙초산=3:1) 으로 고정하여 파라핀 포매하였다. 절편 (2㎛) 을 헤마톡실린ㆍ에오신 (HE), 과요오드산 시프 시약 (PAS), 과요오드산 메세나민은 시약 (PAM) 으로 염색하였다.
Immunohistochemistry
신장 절편을 통상적인 방법으로 면역 조직 염색하였다. 증식 세포핵 항원 (PCNA), Col4, Smad1 에 관해서 조사하기 위해, 카르노아액으로 고정하여 파라핀 포매한 조직편을 사용하였다. 신절편은 재수화하여, 0.3% 의 과산화수소 첨가 메탄올로 30분간, 내인성 퍼옥시다아제 실활 처리하였다. 비특이적인 염색을 제거하기 위해, 절편을 적량의 면역전 혈청 중에서 실온에서 20분간 인큐베이션하여, 아비딘 D 블로킹액과 비오틴 블로킹액 (벡터, 캘리포니아, USA) 으로 각각 15분간씩 처리하였다. 절편을 항 PCNA 항체 (1:200 희석), 항 Col4 항체 (1:200 희석), 항 Smad1 항체 (1:100 희석) (산타크루즈 바이오테크놀로지사, 캘리포니아, USA) 로 실온에서 60분간 인큐베이트하고, 적량의 비오틴화 2차 항체, 계속해서 아비딘ㆍ비오틴화 퍼옥시다아제 복합체 (벡터스태틴 ABC 시스템, 벡터사) 와 인큐베이트하여, 디아미노벤지딘 4아세트산염 (DAB) 을 사용하여 발색시켰다. 인산화 Smad1 (pSmad1) 과 인산화 STAT3 (pSTAT3) 에 관해서 조사하기 위해, 절편을 동결 절편용 포매제 OCT 화합물 (마일즈사, 인디애나, USA) 에 포매하여 냉각한 아세톤에 넣고 순간 동결하였다. 4㎛ 두께의 절편을 제작하여, 아세톤으로 5분간 고정하고, 다시 0.3% 과산화수소 첨가 메탄올로 30분간, 내인성 퍼옥시다아제 실활 처리하였다. 절편은 PCNA 와 동일한 방법으로 항 pSmad1 항체 (1:100 희석) (칼바이오켐, California, USA), 항 pSTAT3 항체 (1:100 희석) (산타크루즈 바이오테크놀로지) 를 1차 항체로 하여 면역 염색하였다. 핵 수를 조사하기 위해 절편을 헤마톡실린액으로 대비 염색하였다.
Quantitation of light microscopy
PAM 염색한 조직을 사용하여 사구체의 형태를 계측하였다. 사구체 면적에 대한 사구체 표면 및 PAM 양성의 면적 (%) 을, 화상 해석 시스템이 붙어 있는 현미경 (IPAP, 스미토모화학공업사, 오사카, 일본) 을 사용하여 기보 (A18-A20) 대로 측정하였다. 래트 1마리당 50의 사구체를 해석하였다.
Quantitation of immunohistochemistry
PCNA: 증식되어 있는 세포 (PCNA 양성 세포) 를 정량하기 위해, 1표본당 50의 사구체에 관해서 관찰자에게 시료의 정보를 알리지 않고 계수하게 하여, 1사구체당 평균치를 산출하였다. pSmad1:pSmad1 의 발현을 정량하기 위해, 사구체 세포수에 대한 pSmad1 양성 세포수를 계수하여, pSmad1 양성 세포의 비율을 산출하였다. Col4, Smad1, pSTAT3 에 관해서, 절편 상의 사구체 간질 전체에 대하여 면역 퍼옥시다아제 염색에 의해 갈색으로 염색된 부분을 컬러 레인지에서 선택하고, 그 면적이 전체 면적에서 차지하는 비율을 IPAP 를 사용하여 정량하였다. 래트 1마리에 관하여 50의 사구체를 해석하였다.
Cell culture experiment
정상의 4주령 마우스 (C57BL/6JxSJL/J) 로부터 적출한 사구체에서, 기보의 방법 (A21) 대로 메산지움 세포를 분리하여, 사구체 메산지움 세포의 세포주를 수립하였다. 메산지움 세포는 미량원소, 1mM 글루타민, 100단위/㎖ 의 페니실린, 100㎎/㎖ 의 스트렙토마이신, 20% 소태아혈청 (FCS) 을 첨가한 B 배지 (최소 영양배지와 F12배지= 3:1 혼합 배지) 중에서 배양하였다. 배양 세포는, 일반적으로 수용되어 있는 사구체 메산지움 세포로서의 요건에 적합하였다 (A22). 배양 메산지움 세포는 20% FCS 를 첨가한 B 배지에서 100mm 직경의 배양접시에 파종하였다. 24시간 후에, 0.1% BSA 를 첨가한 B 배지로 교환하여 2일간 기아 상태로 둔 후, 그 후 2% FCS 를 첨가한 B 배지에 5ng/㎖ 의 PDGF-B (칼바이오켐) 를 첨가하고, 다시 100ng/㎖ 의 APB5 또는 컨트롤로서 래트 IgG 를 첨가하여 24시간 배양하였다.
Cell proliferation test by BrdU ELISA
메산지움 세포의 증식은, 세포 증식을 정량하기 위한, DNA 합성시의 BrdU 도입의 정량을 원리로 하는 비색 이므노앗세이 (아마샴파르마시아 바이오테크, 뉴저지, USA) 에 의해서도 평가하였다. BrdU ELISA 는 키트 제조원의 매뉴얼대로 사용하였다. 메산지움 세포는, 96웰의 평저(平底) 마이크로타이터 플레이트에 10% FCS 첨가한 B 배지에서 저밀도로 파종하여, 하룻밤 동안 플레이트에 접착시켰다. 준집밀도적인 0.1% BSA 를 첨가한 B 배지로 교환하여 2일간 기아 상태로 둔 후, 2% FCS, 5ng/㎖ 의 PDGF-B, 10mM BrdU 를 첨가한 B 배지와 교환하고, 100ng/㎖ 의 APB5 를 첨가하였다. 6시간 배양 후, 플레이트를 원심하고 세포를 고정액으로 고정하여 1:100 희석한 퍼옥시다아제 표지 항 BrdU 모노클로날 항체와 30분간 인큐베이트하였다. 표지 항체를 세정한 후, 기질액을 첨가하여 15분간 두고, 1M 황산으로 반응을 정지시켰다. 5분 이내에 450㎚ 의 흡광도를 690㎚ 을 대상 파장으로 하여 ELISA 플레이트 리더에 의해 측정하였다 (모델550, 바이오래드 래보라토리즈, 캘리포니아, USA). 블랭크는 100μL 의 BrdU 를 첨가하지 않은 배지로 하였다.
Western blot analysis
배양된 메산지움 세포는 0.1% BSA 첨가 B 배지에서 24시간 기아 상태로 하였다. 100ng/㎖ 의 APB5 또는 컨트롤 IgG 를 첨가한 5ng/㎖ 의 PDGF-BB 로, 배양 세포를 120분간 자극하였다. 세포를 용해 버퍼에 현탁하여, SDS 폴리아크릴아미드 전기영동에 의해 분리하고, 니트로셀룰로오스막에 트랜스퍼하여, 1:1000 희석 항 pSTAT3 항체, 1:1000 희석 항 pSmad1 항체, 1:2000 희석 항 Col4 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅하였다. 케미 루미네선스 검출 시스템 (아마샴파르마시아) 을 사용하여 검출하였다.
Cell Transfection
발현 벡터에 삽입한 야생형의 STAT3 와 도미넌트 네거티브한 STAT3 이 들어있는 플라스미드는 Jackie. Bromberg (록펠러 대학) 의 후의에 의해 제공되었다 (A23). 메산지움 세포 (60㎜ 배양접시) 에 야생형 또는 도미넌트 네거티브한 STAT3 (8mg) 를 삽입한 발현 벡터를, 리포펙타민 2000 (인비트로겐) 을 사용하여 원래의 매뉴얼대로 도입하였다. 6시간 후, 배지를 증식배지 (60% DMEM, 20% F12,20% 소태아혈청) 로 교환하였다. 48시간 후, 세포를 용해 버퍼에 현탁하 고, 먼저 서술한 바와 같이 웨스턴 블롯 해석을 실시하였다.
Statistical analysis
모든 값은 평균치±SE 로 나타내고, Mann-Whitney 논파라메트릭 해석, 또는 t검정을 사용하여 편측의 분산 해석을 실시하였다. P<0.05 를 유의차 있음으로 하였다.
세포 증식시험과 배양 메산지움 세포에 있어서의 Smad1 mRNA 발현 데이터의 통계 해석에는 t검정을 사용하였다. 면역 조직 염색의 정량화와 사구체의 Smad1 mRNA 발현은 편측 ANOVA 를 실시한 후, 다중 비교하였다. P<0.05 를 유의차 있음으로 하였다. 데이터는 전부 평균치±SD 로 나타내었다.
실험 결과
Morphological changes in Thy1 GN
Thy1 GN 에서는, 메산지움 세포의 증식이 주사 후 2일째에 시작되어 6일째에서 최대가 되고, 12일째에 진정되었다. 도 9 에 각 군의 6일째의 대표적인 광학 현미경 이미지를 나타낸다.
Thy1 GN 군은 사구체 간질이 증가하고, 그것은 6일째에 피크를 맞이하였다 (도 9B). 사구체 세포의 증식은 PCNA 의 면역 염색으로 평가하였다. PCNA 양성 세포는 Thy1 GN 군에서 현저하게 증가하여, 6일째에 최대치가 되었다 (도 9E).
Col4 는 사구체 경화에 있어서 ECM 의 주요한 구성성분의 하나이다. Col4 는, 정상 대조군에서는, 사구체 기저막을 따라서 약하게 염색되었지만 사구체의 부 분에서는 거의 양성을 나타내지 않았다 (도 9G). 한편, Thy1 GN 군에서는 확장된 메산지움부분에 강한 Col4 양성을 나타내었다 (도 9H).
Thy1 GN 에서는, 사구체에서 PDGF-B, BDGFβ 수용체도 유의하게 양성을 나타내었다 (도 10). 이들 지견은 메산지움 세포의 과잉 증식, 사구체의 비대, 사구체 경화 병변이, 항 Thy1 항체에 의해 유발되는 사구체신염에 있어서 동시발생적으로 일어나는 것을 나타내고 있다.
Anti-PDGF β-receptor antibody inhibits both glomerular cell prolification and glomerulosclerosis in vivo
APB5 는 기보에도 서술되어 있는 바와 같이 PDGF β 수용체가 중개하는 시그널 전달계를 저해한다. Thy1 GN 에 있어서, APB5 처리는 처리 후의 어느 시점에서도 사구체 세포수와 PCNA 양성 세포수의 양쪽을 감소시켰다 (도 9C, 9F, 11A, 11B). PDGF-B 사슬의 과잉 발현과 PDGF β 수용체는 APB5 처리 후에 유의하게 감소하였다 (도 10C, 10F). APB5 처리는 Thy1 GN 에 있어서의 메산지움 간질 증대도 유의하게 감소시켰다. 이것은 사구체 전체에서 차지하는 PAM 양성 면적의 비율로 평가한 것이다 (도 11C). 또한, Thy1 GN 에 있어서의 메산지움 세포의 Col4 발현은 APB5 처리에 의해 감소하였다 (도 11D). 이들 데이터는 Thy1 GN 에 있어서, APB5 처리가 메산지움 세포의 증식과 메산지움 간질의 증대 양쪽을 감소시키는 것을 나타내고 있다.
Time course of expression of Smad1, phosphor-Smad1 (pSmad1) and phosphor-STAT3 (pSTAT3) in Thy1 GN
본 발명자들은 Thy1 GN 래트 신장에 있어서의 Smad1 의 발현을 면역 염색에 의해 검토하였다. Smad1 은 정상 대조의 사구체에서는 거의 검출되지 않았지만 (도 12A), 6일째의 Thy1 GN 군의 사구체는 전형적인 메산지움 비대 이미지를 나타내어 Smad1 이 강하게 발현되어 있다 (도 12B). Smad1 의 발현을 정량하기 위해 IPAP 화상 해석 시스템을 사용하였다. 사구체의 Smad1 발현은 6일째에 최대가 되어 (도 13A), 메산지움 세포의 증식의 피크와 일치하였다. 도 12C 에 나타낸 바와 같이, 사구체의 Smad1 발현은 6일째 이후에는 급속히 감소하였다.
본 발명자들은 다음으로, Thy1 GN 에 있어서 Smad1 의 전사와 Smad1 의 인산화가 일어나고 있는지 여부에 관해서 검토하였다. 면역 조직 염색의 결과, pSmad1 은 정상 대조군에서는 거의 인정되지 않았다 (도 14A). 그러나, Thy1 GN 군에서는, pSmad1 은 핵 부분에 강한 양성을 나타내었다 (도 14B). pSmad1 의 발현을 정량하기 위해, 사구체당 pSmad1 양성 세포를 계측하였다 (도 13B). 사구체의 pSmad1 의 발현은 Thy1 GN 의 1일째에 상승하고 있고, 세포 증식의 초기인 4일째에 피크를 맞이하였다.
PDGF-B 와 PDGF βR 이 Thy1 GN 에서 증가하고 있는 것과, APB5 가 그 과잉 발현을 억제하는 것에서, 본 발명자들은 PDGF 시그널 전달계의 전사인자인 인산화 STAT3 의 면역 염색을 실시하였다 (A24). Thy1 GN 에 있어서 pSTAT3 의 발현은 광범하게 증가하고 있고 (도 15A, 15B, 15C), 6일째에 최대가 되었다 (도 13C).
APB5 처리군에서는 Thy1 GN 에 있어서의 사구체에서의 Smad1 및 pSmad1 단백의 발현이 유의하게 감소하고 있었다 (도 12D, 12E, 14D, 14E, 16A, 16B). pSTAT3 의 과잉 발현도 또한 APB5 투여 후의 어느 조사점에 있어서도 유의하게 감소하고 있다 (도 15D, 15E, 16C).
Effect of anti-PDGFβ-R antibody in vitro
APB5 가 메산지움 세포의 증식을 저해하는지 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 APB5 존재 하, 또는 비존재 하에서의 메산지움 세포의 증식을 BrdU ELIZA 를 사용하여 검토하였다. 도 17A 에 나타낸 바와 같이, APB5 의 첨가는 PDGF 에 의해 사구체에서 일어나는 DNA 합성을 억제하였다.
APB5 가 PDGF-B 에 의해 자극된 메산지움 세포의 pSTAT3, pSmad1, Col4 의 발현을 억제하는지 여부를 웨스턴 블롯법을 사용하여 검토하였다. APB5 는 STAT3 과 Smad1 의 인산화 및 Col4 의 발현을 감소시켰다 (도 17B).
Interaction between STAT3 and Smad1
STAT3 와 Col4 발현을 증가시키는 Smad1 의 상호 작용을 밝히기 위해, 도미넌트 네거티브한 STAT3 를 삽입한 벡터를 배양 메산지움 세포에 도입하였다.
도미넌트 네거티브한 STAT3 의 도입은, 야생형의 STAT3 를 도입하였을 때와 비교하여 분명하게 pSmad1 과 Col4 의 발현을 감소시켰다 (도 18).
고찰
다수의 사구체 장애는 메산지움 세포의 증식과 사구체 경화를 특징으로 하고있지만, 이 중요한 병리 소견 2가지에 공통적인 기전에 관해서는 지금까지 해명되어 있지 않다. 본 연구에서는, 우선, STAT3 과 Smad1 의 활성화가 진행성 사구체 장애시의 2가지 현상, 세포 증식과 사구체 경화의 상호 작용을 조절하는 열쇠가 되는 패스웨이에 있는 것을 나타내었다. 이들 결과는 21세기에 세계에서 주요한 문제로 되어 있는 만성 사구체신염과 당뇨병성 신증의 병인 연구와 치료의 새로운 방향성이 있는 것을 지지하는 것이다.
사구체 경화는, 만성 사구체신염, IgA 신증, 당뇨병성 신증을 포함하는 진행성 사구체 장애의 병리학적 특징이다. 많은 사구체 질환의 초기에 사구체 세포의 증식이 일어나고, 계속해서 사구체 경화의 진전이 일어나, 점점 사구체 장애의 종기로 진행한다 (A1, A2). 이 과정의 예는 IgA 신증, 막증식성 사구체신염, 당뇨병성 신증, 인간과 Thy1 GN, 래트의 신장 절제 모델 등과 같은 전신성 경쇄병에서 관찰된다 (A25, A26). 사구체 세포의 증식을 항 PDGF 항체 (A7), 항응혈제인 헤파린 (A27), 비타민 D 유연체 (A19) 에 의해 저해하면 계속해서 진전하는 진행성의 사구체 경화가 일어나지 않는 것이 나타나 있지만, 그 기전은 알 수 없다. 본 연구에서 본 발명자들은 이들의 병리학적 과정인, 메산지움 세포의 증식과 사구체 경화의 상호 작용을 조절할 가능성이 있는 메카니즘을 제시하였다.
마우스와 인간 메산지움 세포의 PDGF 수용체는 동정되어 있다 (A28). PDGF 는 메산지움 세포의 강력한 열쇠가 되는 분열 촉진인자로, in vitro 의 메산지움 세포에서 자기분비형의 세포 증식인자로서 항상적으로 합성되어 있다 (A28, A29). PDGF 는, in vivo 에서도 in vitro 에서도 사구체신염, 당뇨병성 신증, 진행성 사구체 경화 등의 병리학적 상태의 진행에 중요한 역할을 하고 있다 (A3, A4). PDGF 수용체 티로신 키나아제가 활성화되면, STAT3 단백이 티로신 인산화되는 것은 이미 보고되어 있다 (A30, A31). 이 활성화는 증식의 조절과 분화를 조절하고 있다 (A32, A33). 발명자들은, 인산화된 STAT3 의 과잉 발현이 PDGF 와 PDGF β 수용체 양쪽의 과잉 발현에 동반하여 확인된 것을 in vivo 와 in vitro 에서 나타내고, APB5 가 PDGF, PDGF β 수용체, STAT3 의 발현량을 줄여 사구체신염을 회복시키는 것을 in vivo 와 in vitro 에서 나타내었다.
사구체 경화는 주로 메산지움의 ECM 양의 증가에 의해 특징지어진다. 사구체 경화의 주요한 구성요소의 하나가 Col4 이다 (A34). 본 발명자들은, Smad1 이 당뇨병성 신증에 있어서 in vivo 에서도 in vitro 에서도 열쇠가 되는 전사인자임을 최근 보고하였다 (A8). 인산화된 Smad1 이 Col4 의 발현 상승 및 사구체 ECM 의 증량과 병행하여 강하게 발현되는 것을 나타내었다. 이들 지견은 Smad1 이 당뇨병성 신증에 있어서의 사구체 경화뿐만 아니라 사구체신염에 있어서도 결정적인 역할을 하고 있음을 분명히 하고 있다. 본 연구에서는, in vivo 에서도 in vitro 에서도 PDGF 가 사구체의 인산화된 Smad1 의 발현을 유도하는 것도 또한 나타내고 있다.
본 발명자들은, STAT3 과 Smad1 의 상호 작용이 사구체 경화에 중요한 유전자의 조절을 실시하는 것을 확인하였다. 도미넌트 네거티브한 STAT3 을 도입함으로써, 배양 메산지움 세포에서 Col4 의 발현이 유의하게 감소하였다. STAT3 과 Smad1 의 활성화는 각각 독립되어 있는 것 같지만, 어느 쪽도 PDGF 에 의해 활성화되었다. 그리고 도미넌트 네거티브한 STAT3 를 도입하면 Smad1 의 인산화가 부분적으로 감소하는 점에서, Smad1 의 활성화는 STAT3 활성화 기전의 일부인 것으로 생각되었다. 이들 지견은, 사구체신염의 실험 모델에서는, PDGF 에 의 한 STAT3 활성화가 Smad1 발현과 상호 작용하여, 계속해서 Col4 의 활성화가 일어나는 것을 시사하고 있다. 2개의 시그널 전달 경로를 이해하는 것은, 진행성 사구체 장애의 병리학적인 프로세스를 밝히는 데에 있어서 중요하다.
여러 장기에서 일어나는 경화에 대한 치료는, 이들 장기의 기능이 상실되는 것을 감속시킨다는 보조적인 것에 한정되어 있다. 본 발명자들의 지견은, 경화를 초래하는 다른 증식성 질환의 본질에도 통찰을 주는 것이다. Smad1 과 STAT3 은 정상인 사구체에서는 거의 인정되지 않기 때문에, Smad1 및/또는 STAT3 시그널을 저해하는 것은 병적으로 활성화된 세포 증식 및 ECM 생성을 억제한다는 기전에 의해, 경화를 초래하는 각종 신질환의 진전을 억제하는 데에 유용한 것으로 생각된다.
실시예 3
당뇨병성 신증 환자 5명, 당뇨병에 경화 병변을 동반하는 신염이 발증된 환자 1명, 당뇨병에 경화 병변을 동반하지 않는 신염이 발증된 환자 2명, 정상인 2명의 뇨를 샘플로 하여 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동을 실시하고, 니트로셀룰로오스막에 블롯팅하였다. 항 Smad-1 항체 (산타크루즈 바이오테크놀로지) 및 항 ALK-1 항체 (R&S 시스템, 미니애폴리스, 미국) 를 1차 항체로 하여, 웨스턴 브리드 키트 (인비트로겐, 동경, 일본) 를 사용하여 웨스턴 블롯법을 실시하였다.
당뇨병성 신증인 입원 환자의 치료 개시 전의 뇨 검체, 그 후 치료 개시 후 1주마다 뇨 검체를 채취하여, 항 ALK-1 항체를 1차 항체로 하여 동일하게 웨스턴 블롯법을 실시하였다.
Smad-1 및 ALK-3 은 당뇨병성 신증 및 신장에 경화가 확인된 환자 뇨에 있어서 검출되었지만, 정상인 및 경화를 동반하지 않는 신염환자의 뇨에서는 검출되지 않았다 (도 17, 도 19). 또한, ALK-1 은 당뇨병성 신증의 치료와 함께, 뇨 중으로의 배설량이 경시적으로 감소하였다 (도 18).
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28. We thank K. Miyazono for providing a plasmid encoding Smad1, and Y. Takishita for his assistance with histological analysis. We also thank the members of ourlaboratory for discussion.
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본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 수용하는 것으로 한다.
본 발명에 의해, IV 형 콜라겐의 과잉 생성에 직접 관계하고 있는 물질로서 Smad1 이 동정되고, Smad1 이 당뇨병성 신증의 병인으로서 결정적인 역할을 갖는 것이 개시되었다. 이것에 의해, 당뇨병성 신증의 검출이 가능해지고, 또 당뇨병성 신증의 예방 및/또는 치료제, 세포외 매트릭스의 증식을 저해하는 약제, α1 IV 형 콜라겐의 발현을 억제하는 약제가 제공되었다. 또한, 본 발명에 의해, 당뇨병성 신증의 예방 및/또는 치료에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트, 세포외 매트릭스의 증식 저해에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트, 그리고 α1 IV 형 콜라겐의 발현 억제에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트가 제공되었다.
또한, 본 발명에 의해, STAT3 와 Smad1 의 활성화가 진행성 사구체 장애시의 2가지 현상, 세포 증식과 사구체 경화의 상호 작용을 조절하는 열쇠가 되는 패스웨이에 있는 것이 개시되었다. 이것에 의해, 경화를 초래하는 증식성 질환의 검출이 가능해지고, 나아가, 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료제, 세포외 매트릭스의 증식을 저해하는 약제, α1 IV 형 콜라겐의 발현을 억제하는 약제가 제공되었다. 또한, 본 발명에 의해, 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방 및/또는 치료에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트, 세포외 매트릭스의 증식 저해에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트, 및 α1 IV 형 콜라겐의 발현 억제에 유효한 물질을 동정하는 방법 및 키트가 제공되었다
서열표 프리텍스트
<서열번호 1>
서열번호 1 은, 인간유래 Smad1 의 mRNA 의 염기 서열을 나타낸다.
<서열번호 2>
서열번호 2 는, 인간유래 ALK1 의 mRNA 의 염기 서열을 나타낸다.
<서열번호 3>
서열번호 3 은, 인간유래 BMP2 의 mRNA 의 염기 서열을 나타낸다.
<서열번호 4>
서열번호 4 는, 인간유래 BMP4 의 mRNA 의 염기 서열을 나타낸다.
<서열번호 5>
서열번호 5 는, Smad1 의 mRNA 를 특이적으로 증폭하는 RT-PCR 에 사용하는 포워드 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
<서열번호 6>
서열번호 6 은, Smad1 의 mRNA 를 특이적으로 증폭하는 RT-PCR 에 사용하는 리버스 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
<서열번호 7>
서열번호 7 은, ALK1 의 mRNA 를 특이적으로 증폭하는 RT-PCR 에 사용하는 포워드 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
<서열번호 8>
서열번호 8 은, ALK1 의 mRNA 를 특이적으로 증폭하는 RT-PCR 에 사용하는 리버스 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
<서열번호 9>
서열번호 9 는, BMP2 의 mRNA 를 특이적으로 증폭하는 RT-PCR 에 사용하는 포워드 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
<서열번호 10>
서열번호 10 은, BMP2 의 mRNA 를 특이적으로 증폭하는 RT-PCR 에 사용하는 리버스 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
<서열번호 11>
서열번호 11 은, BMP4 의 mRNA 를 특이적으로 증폭하는 RT-PCR 에 사용하는 포워드 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
<서열번호 12>
서열번호 12 는, BMP4 의 mRNA 를 특이적으로 증폭하는 RT-PCR 에 사용하는 리버스 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
<서열번호 13>
서열번호 13 은, Smad1 에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 염기 서열을 나타낸다.
<서열번호 14>
서열번호 14 는, 마우스유래 Col4 유전자의 27bp 의 탠덤 리피트 서열을 나타낸다.
<서열번호 15>
서열번호 15 는, ChIP assay 에 사용한 5'측 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
<서열번호 16>
서열번호 16 은, ChIP assay 에 사용한 3'측 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
<서열번호 17>
서열번호 17 은, RNase protection assay 에 사용한 프로브의 염기 서열을 나타낸다.
<서열번호 18>
서열번호 18 은, 합성 올리고뉴클레오티드의 염기 서열을 나타낸다.
<서열번호 19>
서열번호 19 는, 인간유래 STAT3 의 mRNA 의 염기 서열을 나타낸다.
<서열번호 20>
서열번호 20 은, 인간유래 ALK3 의 mRNA 의 염기 서열을 나타낸다.
<서열번호 21>
서열번호 21 은, 인간유래 STAT3 의 mRNA 를 특이적으로 증폭하는 RT-PCR 에 사용하는 포워드 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
<서열번호 22>
서열번호 22 는, 인간유래 STAT3 의 mRNA 를 특이적으로 증폭하는 RT-PCR 에 사용하는 리버스 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
<서열번호 23>
서열번호 23 은, 인간유래 ALK3 의 mRNA 를 특이적으로 증폭하는 RT-PCR 에 사용하는 포워드 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
<서열번호 24>
서열번호 24 는, 인간유래 ALK3 의 mRNA 를 특이적으로 증폭하는 RT-PCR 에 사용하는 리버스 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> HuBit Genomix, Inc. Doi, Toshio <120> A method for detecting diabetic nephropathy and kits therefor, agents for preventing and/or treating diabetic nephropathy, a method for identifying substances effective in prevention and/or treatment and kits therefor <130> FP-039PCT <150> JP P2003-319538 <151> 2003-09-11 <160> 24 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1990 <212> mRNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (433)..(1830) <400> 1 gaattccggg ggtattggca gctgaggagt ggaggctggg cagctccgac tccctgacgc 60 cagcgcgacc agatcaatcc aggctccagg agaaagcagg cgggcgggcg gagaaaggag 120 aggccgagcg gctcaacccg ggccgaggct cggggagcgg agagtggcgc accgcccggc 180 cgtccggacc cgggccgcga gaccccgctc gcccggccac tcgtgctccc gcacggacgg 240 gcgcgccgcc aacccggtgc tgactgggtt acttttttaa acactaggaa tggtaatttc 300 tactcttctg gacttcaaac taagaagtta aagagacttc tctgtaaata aacaaatctc 360 ttctgctgtc cttttgcatt tggagacagc tttatttcac catatccaag gagtataact 420 agtgctgtca tt atg aat gtg aca agt tta ttt tcc ttt aca agt cca gct 471 Met Asn Val Thr Ser Leu Phe Ser Phe Thr Ser Pro Ala 1 5 10 gtg aag aga ctt ctt ggg tgg aaa cag ggc gat gaa gaa gaa aaa tgg 519 Val Lys Arg Leu Leu Gly Trp Lys Gln Gly Asp Glu Glu Glu Lys Trp 15 20 25 gca gag aaa gct gtt gat gct ttg gtg aaa aaa ctg aag aaa aag aaa 567 Ala Glu Lys Ala Val Asp Ala Leu Val Lys Lys Leu Lys Lys Lys Lys 30 35 40 45 ggt gcc atg gag gaa ctg gaa aag gcc ttg agc tgc cca ggg caa ccg 615 Gly Ala Met Glu Glu Leu Glu Lys Ala Leu Ser Cys Pro Gly Gln Pro 50 55 60 agt aac tgt gtc acc att ccc cgc tct ctg gat ggc agg ctg caa gtc 663 Ser Asn Cys Val Thr Ile Pro Arg Ser Leu Asp Gly Arg Leu Gln Val 65 70 75 tcc cac cgg aag gga ctg cct cat gtc att tac tgc cgt gtg tgg cgc 711 Ser His Arg Lys Gly Leu Pro His Val Ile Tyr Cys Arg Val Trp Arg 80 85 90 tgg ccc gat ctt cag agc cac cat gaa cta aaa cca ctg gaa tgc tgt 759 Trp Pro Asp Leu Gln Ser His His Glu Leu Lys Pro Leu Glu Cys Cys 95 100 105 gag ttt cct ttt ggt tcc aag cag aag gag gtc tgc atc aat ccc tac 807 Glu Phe Pro Phe Gly Ser Lys Gln Lys Glu Val Cys Ile Asn Pro Tyr 110 115 120 125 cac tat aag aga gta gaa agc cct gta ctt cct cct gtg ctg gtt cca 855 His Tyr Lys Arg Val Glu Ser Pro Val Leu Pro Pro Val Leu Val Pro 130 135 140 aga cac agc gaa tat aat cct cag cac agc ctc tta gct cag ttc cgt 903 Arg His Ser Glu Tyr Asn Pro Gln His Ser Leu Leu Ala Gln Phe Arg 145 150 155 aac tta gga caa aat gag cct cac atg cca ctc aac gcc act ttt cca 951 Asn Leu Gly Gln Asn Glu Pro His Met Pro Leu Asn Ala Thr Phe Pro 160 165 170 gat tct ttc cag caa ccc aac agc cac ccg ttt cct cac tct ccc aat 999 Asp Ser Phe Gln Gln Pro Asn Ser His Pro Phe Pro His Ser Pro Asn 175 180 185 agc agt tac cca aac tct cct ggg agc agc agc agc acc tac cct cac 1047 Ser Ser Tyr Pro Asn Ser Pro Gly Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Pro His 190 195 200 205 tct ccc acc agc tca gac cca gga agc cct ttc cag atg cca gct gat 1095 Ser Pro Thr Ser Ser Asp Pro Gly Ser Pro Phe Gln Met Pro Ala Asp 210 215 220 acg ccc cca cct gct tac ctg cct cct gaa gac ccc atg acc cag gat 1143 Thr Pro Pro Pro Ala Tyr Leu Pro Pro Glu Asp Pro Met Thr Gln Asp 225 230 235 ggc tct cag ccg atg gac aca aac atg atg gcg cct ccc ctg ccc tca 1191 Gly Ser Gln Pro Met Asp Thr Asn Met Met Ala Pro Pro Leu Pro Ser 240 245 250 gaa atc aac aga gga gat gtt cag gcg gtt gct tat gag gaa cca aaa 1239 Glu Ile Asn Arg Gly Asp Val Gln Ala Val Ala Tyr Glu Glu Pro Lys 255 260 265 cac tgg tgc tct att gtc tac tat gag ctc aac aat cgt gtg ggt gaa 1287 His Trp Cys Ser Ile Val Tyr Tyr Glu Leu Asn Asn Arg Val Gly Glu 270 275 280 285 gcg ttc cat gcc tcc tcc aca agt gtg ttg gtg gat ggt ttc act gat 1335 Ala Phe His Ala Ser Ser Thr Ser Val Leu Val Asp Gly Phe Thr Asp 290 295 300 cct tcc aac aat aag aac cgt ttc tgc ctt ggg ctg ctc tcc aat gtt 1383 Pro Ser Asn Asn Lys Asn Arg Phe Cys Leu Gly Leu Leu Ser Asn Val 305 310 315 aac cgg aat tcc act att gaa aac acc agg cgg cat att gga aaa gga 1431 Asn Arg Asn Ser Thr Ile Glu Asn Thr Arg Arg His Ile Gly Lys Gly 320 325 330 gtt cat ctt tat tat gtt gga ggg gag gtg tat gcc gaa tgc ctt agt 1479 Val His Leu Tyr Tyr Val Gly Gly Glu Val Tyr Ala Glu Cys Leu Ser 335 340 345 gac agt agc atc ttt gtg caa agt cgg aac tgc aac tac cat cat gga 1527 Asp Ser Ser Ile Phe Val Gln Ser Arg Asn Cys Asn Tyr His His Gly 350 355 360 365 ttt cat cct act act gtt tgc aag atc cct agt ggg tgt agt ctg aaa 1575 Phe His Pro Thr Thr Val Cys Lys Ile Pro Ser Gly Cys Ser Leu Lys 370 375 380 att ttt aac aac caa gaa ttt gct cag tta ttg gca cag tct gtg aac 1623 Ile Phe Asn Asn Gln Glu Phe Ala Gln Leu Leu Ala Gln Ser Val Asn 385 390 395 cat gga ttt gag aca gtc tat gag ctt aca aaa atg tgt act ata cgt 1671 His Gly Phe Glu Thr Val Tyr Glu Leu Thr Lys Met Cys Thr Ile Arg 400 405 410 atg agc ttt gtg aag ggc tgg gga gca gaa tac cac cgc cag gat gtt 1719 Met Ser Phe Val Lys Gly Trp Gly Ala Glu Tyr His Arg Gln Asp Val 415 420 425 act agc acc ccc tgc tgg att gag ata cat ctg cac ggc ccc ctc cag 1767 Thr Ser Thr Pro Cys Trp Ile Glu Ile His Leu His Gly Pro Leu Gln 430 435 440 445 tgg ctg gat aaa gtt ctt act caa atg ggt tca cct cat aat cct att 1815 Trp Leu Asp Lys Val Leu Thr Gln Met Gly Ser Pro His Asn Pro Ile 450 455 460 tca tct gta tct taa atggccccag catctgcctc tggaaaacta ttgagccttg 1870 Ser Ser Val Ser 465 catgtacttg aaggatggat gagtcagaca cgattgagaa ctgacaaagg agccttgata 1930 atacttgacc tctgtgacca actgttggat tcagaaattt aaacaaaaaa aaaaaaaaaa 1990 <210> 2 <211> 1970 <212> mRNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (283)..(1794) <400> 2 aggaaacggt ttattaggag ggagtggtgg agctgggcca ggcaggaaga cgctggaata 60 agaaacattt ttgctccagc ccccatccca gtcccgggag gctgccgcgc cagctgcgcc 120 gagcgagccc ctccccggct ccagcccggt ccggggccgc gccggacccc agcccgccgt 180 ccagcgctgg cggtgcaact gcggccgcgc ggtggagggg aggtggcccc ggtccgccga 240 aggctagcgc cccgccaccc gcagagcggg cccagaggga cc atg acc ttg ggc 294 Met Thr Leu Gly 1 tcc ccc agg aaa ggc ctt ctg atg ctg ctg atg gcc ttg gtg acc cag 342 Ser Pro Arg Lys Gly Leu Leu Met Leu Leu Met Ala Leu Val Thr Gln 5 10 15 20 gga gac cct gtg aag ccg tct cgg ggc ccg ctg gtg acc tgc acg tgt 390 Gly Asp Pro Val Lys Pro Ser Arg Gly Pro Leu Val Thr Cys Thr Cys 25 30 35 gag agc cca cat tgc aag ggg cct acc tgc cgg ggg gcc tgg tgc aca 438 Glu Ser Pro His Cys Lys Gly Pro Thr Cys Arg Gly Ala Trp Cys Thr 40 45 50 gta gtg ctg gtg cgg gag gag ggg agg cac ccc cag gaa cat cgg ggc 486 Val Val Leu Val Arg Glu Glu Gly Arg His Pro Gln Glu His Arg Gly 55 60 65 tgc ggg aac ttg cac agg gag ctc tgc agg ggg cgc ccc acc gag ttc 534 Cys Gly Asn Leu His Arg Glu Leu Cys Arg Gly Arg Pro Thr Glu Phe 70 75 80 gtc aac cac tac tgc tgc gac agc cac ctc tgc aac cac aac gtg tcc 582 Val Asn His Tyr Cys Cys Asp Ser His Leu Cys Asn His Asn Val Ser 85 90 95 100 ctg gtg ctg gag gcc acc caa cct cct tcg gag cag ccg gga aca gat 630 Leu Val Leu Glu Ala Thr Gln Pro Pro Ser Glu Gln Pro Gly Thr Asp 105 110 115 ggc cag ctg gcc ctg atc ctg ggc ccc gtg ctg gcc ttg ctg gcc ctg 678 Gly Gln Leu Ala Leu Ile Leu Gly Pro Val Leu Ala Leu Leu Ala Leu 120 125 130 gtg gcc ctg ggt gtc ctg ggc ctg tgg cat gtc cga cgg agg cag gag 726 Val Ala Leu Gly Val Leu Gly Leu Trp His Val Arg Arg Arg Gln Glu 135 140 145 aag cag cgt ggc ctg cac agc gag ctg gga gag tcc agt ctc atc ctg 774 Lys Gln Arg Gly Leu His Ser Glu Leu Gly Glu Ser Ser Leu Ile Leu 150 155 160 aaa gca tct gag cag ggc gac acg atg ttg ggg gac ctc ctg gac agt 822 Lys Ala Ser Glu Gln Gly Asp Thr Met Leu Gly Asp Leu Leu Asp Ser 165 170 175 180 gac tgc acc aca ggg agt ggc tca ggg ctc ccc ttc ctg gtg cag agg 870 Asp Cys Thr Thr Gly Ser Gly Ser Gly Leu Pro Phe Leu Val Gln Arg 185 190 195 aca gtg gca cgg cag gtt gcc ttg gtg gag tgt gtg gga aaa ggc cgc 918 Thr Val Ala Arg Gln Val Ala Leu Val Glu Cys Val Gly Lys Gly Arg 200 205 210 tat ggc gaa gtg tgg cgg ggc ttg tgg cac ggt gag agt gtg gcc gtc 966 Tyr Gly Glu Val Trp Arg Gly Leu Trp His Gly Glu Ser Val Ala Val 215 220 225 aag atc ttc tcc tcg agg gat gaa cag tcc tgg ttc cgg gag act gag 1014 Lys Ile Phe Ser Ser Arg Asp Glu Gln Ser Trp Phe Arg Glu Thr Glu 230 235 240 atc tat aac aca gta ttg ctc aga cac gac aac atc cta ggc ttc atc 1062 Ile Tyr Asn Thr Val Leu Leu Arg His Asp Asn Ile Leu Gly Phe Ile 245 250 255 260 gcc tca gac atg acc tcc cgc aac tcg agc acg cag ctg tgg ctc atc 1110 Ala Ser Asp Met Thr Ser Arg Asn Ser Ser Thr Gln Leu Trp Leu Ile 265 270 275 acg cac tac cac gag cac ggc tcc ctc tac gac ttt ctg cag aga cag 1158 Thr His Tyr His Glu His Gly Ser Leu Tyr Asp Phe Leu Gln Arg Gln 280 285 290 acg ctg gag ccc cat ctg gct ctg agg cta gct gtg tcc gcg gca tgc 1206 Thr Leu Glu Pro His Leu Ala Leu Arg Leu Ala Val Ser Ala Ala Cys 295 300 305 ggc ctg gcg cac ctg cac gtg gag atc ttc ggt aca cag ggc aaa cca 1254 Gly Leu Ala His Leu His Val Glu Ile Phe Gly Thr Gln Gly Lys Pro 310 315 320 gcc att gcc cac cgc gac ttc aag agc cgc aat gtg ctg gtc aag agc 1302 Ala Ile Ala His Arg Asp Phe Lys Ser Arg Asn Val Leu Val Lys Ser 325 330 335 340 aac ctg cag tgt tgc atc gcc gac ctg ggc ctg gct gtg atg cac tca 1350 Asn Leu Gln Cys Cys Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ala Val Met His Ser 345 350 355 cag ggc agc gat tac ctg gac atc ggc aac aac ccg aga gtg ggc acc 1398 Gln Gly Ser Asp Tyr Leu Asp Ile Gly Asn Asn Pro Arg Val Gly Thr 360 365 370 aag cgg tac atg gca ccc gag gtg ctg gac gag cag atc cgc acg gac 1446 Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Asp Glu Gln Ile Arg Thr Asp 375 380 385 tgc ttt gag tcc tac aag tgg act gac atc tgg gcc ttt ggc ctg gtg 1494 Cys Phe Glu Ser Tyr Lys Trp Thr Asp Ile Trp Ala Phe Gly Leu Val 390 395 400 ctg tgg gag att gcc cgc cgg acc atc gtg aat ggc atc gtg gag gac 1542 Leu Trp Glu Ile Ala Arg Arg Thr Ile Val Asn Gly Ile Val Glu Asp 405 410 415 420 tat aga cca ccc ttc tat gat gtg gtg ccc aat gac ccc agc ttt gag 1590 Tyr Arg Pro Pro Phe Tyr Asp Val Val Pro Asn Asp Pro Ser Phe Glu 425 430 435 gac atg aag aag gtg gtg tgt gtg gat cag cag acc ccc acc atc cct 1638 Asp Met Lys Lys Val Val Cys Val Asp Gln Gln Thr Pro Thr Ile Pro 440 445 450 aac cgg ctg gct gca gac ccg gtc ctc tca ggc cta gct cag atg atg 1686 Asn Arg Leu Ala Ala Asp Pro Val Leu Ser Gly Leu Ala Gln Met Met 455 460 465 cgg gag tgc tgg tac cca aac ccc tct gcc cga ctc acc gcg ctg cgg 1734 Arg Glu Cys Trp Tyr Pro Asn Pro Ser Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg 470 475 480 atc aag aag aca cta caa aaa att agc aac agt cca gag aag cct aaa 1782 Ile Lys Lys Thr Leu Gln Lys Ile Ser Asn Ser Pro Glu Lys Pro Lys 485 490 495 500 gtg att caa tag cccaggagca cctgattcct ttctgcctgc agggggctgg 1834 Val Ile Gln gggggtgggg ggcagtggat ggtgccctat ctgggtagag gtagtgtgag tgtggtgtgt 1894 gctggggatg ggcagctgcg cctgcctgct cggcccccag cccacccagc caaaaataca 1954 gctgggctga aacctg 1970 <210> 3 <211> 1547 <212> mRNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (324)..(1514) <400> 3 ggggacttct tgaacttgca gggagaataa cttgcgcacc ccactttgcg ccggtgcctt 60 tgccccagcg gagcctgctt cgccatctcc gagccccacc gcccctccac tcctcggcct 120 tgcccgacac tgagacgctg ttcccagcgt gaaaagagag actgcgcggc cggcacccgg 180 gagaaggagg aggcaaagaa aaggaacgga cattcggtcc ttgcgccagg tcctttgacc 240 agagtttttc catgtggacg ctctttcaat ggacgtgtcc ccgcgtgctt cttagacgga 300 ctgcggtctc ctaaaggtcg acc atg gtg gcc ggg acc cgc tgt ctt cta gcg 353 Met Val Ala Gly Thr Arg Cys Leu Leu Ala 1 5 10 ttg ctg ctt ccc cag gtc ctc ctg ggc ggc gcg gct ggc ctc gtt ccg 401 Leu Leu Leu Pro Gln Val Leu Leu Gly Gly Ala Ala Gly Leu Val Pro 15 20 25 gag ctg ggc cgc agg aag ttc gcg gcg gcg tcg tcg ggc cgc ccc tca 449 Glu Leu Gly Arg Arg Lys Phe Ala Ala Ala Ser Ser Gly Arg Pro Ser 30 35 40 tcc cag ccc tct gac gag gtc ctg agc gag ttc gag ttg cgg ctg ctc 497 Ser Gln Pro Ser Asp Glu Val Leu Ser Glu Phe Glu Leu Arg Leu Leu 45 50 55 agc atg ttc ggc ctg aaa cag aga ccc acc ccc agc agg gac gcc gtg 545 Ser Met Phe Gly Leu Lys Gln Arg Pro Thr Pro Ser Arg Asp Ala Val 60 65 70 gtg ccc ccc tac atg cta gac ctg tat cgc agg cac tca ggt cag ccg 593 Val Pro Pro Tyr Met Leu Asp Leu Tyr Arg Arg His Ser Gly Gln Pro 75 80 85 90 ggc tca ccc gcc cca gac cac cgg ttg gag agg gca gcc agc cga gcc 641 Gly Ser Pro Ala Pro Asp His Arg Leu Glu Arg Ala Ala Ser Arg Ala 95 100 105 aac act gtg cgc agc ttc cac cat gaa gaa tct ttg gaa gaa cta cca 689 Asn Thr Val Arg Ser Phe His His Glu Glu Ser Leu Glu Glu Leu Pro 110 115 120 gaa acg agt ggg aaa aca acc cgg aga ttc ttc ttt aat tta agt tct 737 Glu Thr Ser Gly Lys Thr Thr Arg Arg Phe Phe Phe Asn Leu Ser Ser 125 130 135 atc ccc acg gag gag ttt atc acc tca gca gag ctt cag gtt ttc cga 785 Ile Pro Thr Glu Glu Phe Ile Thr Ser Ala Glu Leu Gln Val Phe Arg 140 145 150 gaa cag atg caa gat gct tta gga aac aat agc agt ttc cat cac cga 833 Glu Gln Met Gln Asp Ala Leu Gly Asn Asn Ser Ser Phe His His Arg 155 160 165 170 att aat att tat gaa atc ata aaa cct gca aca gcc aac tcg aaa ttc 881 Ile Asn Ile Tyr Glu Ile Ile Lys Pro Ala Thr Ala Asn Ser Lys Phe 175 180 185 ccc gtg acc aga ctt ttg gac acc agg ttg gtg aat cag aat gca agc 929 Pro Val Thr Arg Leu Leu Asp Thr Arg Leu Val Asn Gln Asn Ala Ser 190 195 200 agg tgg gaa agt ttt gat gtc acc ccc gct gtg atg cgg tgg act gca 977 Arg Trp Glu Ser Phe Asp Val Thr Pro Ala Val Met Arg Trp Thr Ala 205 210 215 cag gga cac gcc aac cat gga ttc gtg gtg gaa gtg gcc cac ttg gag 1025 Gln Gly His Ala Asn His Gly Phe Val Val Glu Val Ala His Leu Glu 220 225 230 gag aaa caa ggt gtc tcc aag aga cat gtt agg ata agc agg tct ttg 1073 Glu Lys Gln Gly Val Ser Lys Arg His Val Arg Ile Ser Arg Ser Leu 235 240 245 250 cac caa gat gaa cac agc tgg tca cag ata agg cca ttg cta gta act 1121 His Gln Asp Glu His Ser Trp Ser Gln Ile Arg Pro Leu Leu Val Thr 255 260 265 ttt ggc cat gat gga aaa ggg cat cct ctc cac aaa aga gaa aaa cgt 1169 Phe Gly His Asp Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg 270 275 280 caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag aga 1217 Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg 285 290 295 cac cct ttg tac gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg att 1265 His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile 300 305 310 gtg gct ccc ccg ggg tat cac gcc ttt tac tgc cac gga gaa tgc cct 1313 Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro 315 320 325 330 ttt cct ctg gct gat cat ctg aac tcc act aat cat gcc att gtt cag 1361 Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln 335 340 345 acg ttg gtc aac tct gtt aac tct aag att cct aag gca tgc tgt gtc 1409 Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val 350 355 360 ccg aca gaa ctc agt gct atc tcg atg ctg tac ctt gac gag aat gaa 1457 Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu 365 370 375 aag gtt gta tta aag aac tat cag gac atg gtt gtg gag ggt tgt ggg 1505 Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly 380 385 390 tgt cgc tag tacagcaaaa ttaaatacat aaatatatat ata 1547 Cys Arg 395 <210> 4 <211> 1999 <212> mRNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (478)..(1704) <400> 4 gagggagggg ccgccgggga agaggaggag gaaggaaaga aagaaagcga gggagggaaa 60 gaggaggaag gaagatgcga gaaggcagag gaggagggag ggagggaagg agcgcggagc 120 ccggcccgga agctaggtga gtgtggcatc cgagctgagg gacgcgagcc tgagacgccg 180 ctgctgctcc ggctgagtat ctagcttgtc tccccgatgg gattcccgtc caagctatct 240 cgagcctgca gcgccacagt ccccggccct cgcccaggtt cactgcaacc gttcagaggt 300 ccccaggagc tgctgctggc gagcccgcta ctgcagggac ctatggagcc attccgtagt 360 gccatcccga gcaacgcact gctgcagctt ccctgagcct ttccagcaag tttgttcaag 420 attggctgtc aagaatcatg gactgttatt atatgccttg ttttctgtca agacacc 477 atg att cct ggt aac cga atg ctg atg gtc gtt tta tta tgc caa gtc 525 Met Ile Pro Gly Asn Arg Met Leu Met Val Val Leu Leu Cys Gln Val 1 5 10 15 ctg cta gga ggc gcg agc cat gct agt ttg ata cct gag acg ggg aag 573 Leu Leu Gly Gly Ala Ser His Ala Ser Leu Ile Pro Glu Thr Gly Lys 20 25 30 aaa aaa gtc gcc gag att cag ggc cac gcg gga gga cgc cgc tca ggg 621 Lys Lys Val Ala Glu Ile Gln Gly His Ala Gly Gly Arg Arg Ser Gly 35 40 45 cag agc cat gag ctc ctg cgg gac ttc gag gcg aca ctt ctg cag atg 669 Gln Ser His Glu Leu Leu Arg Asp Phe Glu Ala Thr Leu Leu Gln Met 50 55 60 ttt ggg ctg cgc cgc cgc ccg cag cct agc aag agt gcc gtc att ccg 717 Phe Gly Leu Arg Arg Arg Pro Gln Pro Ser Lys Ser Ala Val Ile Pro 65 70 75 80 gac tac atg cgg gat ctt tac cgg ctt cag tct ggg gag gag gag gaa 765 Asp Tyr Met Arg Asp Leu Tyr Arg Leu Gln Ser Gly Glu Glu Glu Glu 85 90 95 gag cag atc cac agc act ggt ctt gag tat cct gag cgc ccg gcc agc 813 Glu Gln Ile His Ser Thr Gly Leu Glu Tyr Pro Glu Arg Pro Ala Ser 100 105 110 cgg gcc aac acc gtg agg agc ttc cac cac gaa gaa cat ctg gag aac 861 Arg Ala Asn Thr Val Arg Ser Phe His His Glu Glu His Leu Glu Asn 115 120 125 atc cca ggg acc agt gaa aac tct gct ttt cgt ttc ctc ttt aac ctc 909 Ile Pro Gly Thr Ser Glu Asn Ser Ala Phe Arg Phe Leu Phe Asn Leu 130 135 140 agc agc atc cct gag aac gag gcg atc tcc tct gca gag ctt cgg ctc 957 Ser Ser Ile Pro Glu Asn Glu Ala Ile Ser Ser Ala Glu Leu Arg Leu 145 150 155 160 ttc cgg gag cag gtg gac cag ggc cct gat tgg gaa agg ggc ttc cac 1005 Phe Arg Glu Gln Val Asp Gln Gly Pro Asp Trp Glu Arg Gly Phe His 165 170 175 cgt ata aac att tat gag gtt atg aag ccc cca gca gaa gtg gtg cct 1053 Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Val Met Lys Pro Pro Ala Glu Val Val Pro 180 185 190 ggg cac ctc atc aca cga cta ctg gac acg aga ctg gtc cac cac aat 1101 Gly His Leu Ile Thr Arg Leu Leu Asp Thr Arg Leu Val His His Asn 195 200 205 gtg aca cgg tgg gaa act ttt gat gtg agc cct gcg gtc ctt cgc tgg 1149 Val Thr Arg Trp Glu Thr Phe Asp Val Ser Pro Ala Val Leu Arg Trp 210 215 220 acc cgg gag aag cag cca aac tat ggg cta gcc att gag gtg act cac 1197 Thr Arg Glu Lys Gln Pro Asn Tyr Gly Leu Ala Ile Glu Val Thr His 225 230 235 240 ctc cat cag act cgg acc cac cag ggc cag cat gtc agg att agc cga 1245 Leu His Gln Thr Arg Thr His Gln Gly Gln His Val Arg Ile Ser Arg 245 250 255 tcg tta cct caa ggg agt ggg aat tgg gcc cag ctc cgg ccc ctc ctg 1293 Ser Leu Pro Gln Gly Ser Gly Asn Trp Ala Gln Leu Arg Pro Leu Leu 260 265 270 gtc acc ttt ggc cat gat ggc cgg ggc cat gcc ttg acc cga cgc cgg 1341 Val Thr Phe Gly His Asp Gly Arg Gly His Ala Leu Thr Arg Arg Arg 275 280 285 agg gcc aag cgt agc cct aag cat cac tca cag cgg gcc agg aag aag 1389 Arg Ala Lys Arg Ser Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys 290 295 300 aat aag aac tgc cgg cgc cac tcg ctc tat gtg gac ttc agc gat gtg 1437 Asn Lys Asn Cys Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val 305 310 315 320 ggc tgg aat gac tgg att gtg gcc cca cca ggc tac cag gcc ttc tac 1485 Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr Gln Ala Phe Tyr 325 330 335 tgc cat ggg gac tgc ccc ttt cca ctg gct gac cac ctc aac tca acc 1533 Cys His Gly Asp Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr 340 345 350 aac cat gcc att gtg cag acc ctg gtc aat tct gtc aat tcc agt atc 1581 Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Ser Ile 355 360 365 ccc aaa gcc tgt tgt gtg ccc act gaa ctg agt gcc atc tcc atg ctg 1629 Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu 370 375 380 tac ctg gat gag tat gat aag gtg gta ctg aaa aat tat cag gag atg 1677 Tyr Leu Asp Glu Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Glu Met 385 390 395 400 gta gta gag gga tgt ggg tgc cgc tga gatcaggcag tccttgagga 1724 Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg 405 tagacagata tacacaccac acacacacac cacatacacc acacacacac gttcccatcc 1784 actcacccac acactacaca gactgcttcc ttatagctgg acttttattt aaaaaaaaaa 1844 aaaaaaaaat ggaaaaaatc cctaaacatt caccttgacc ttatttatga ctttacgtgc 1904 aaatgttttg accatattga tcatatattt tgacaaaata tatttataac tacgtattaa 1964 aagaaaaaaa taaaatgagt cattatttta aaggt 1999 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 5 actaccacca cggctttcac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 6 aataggattg tggggtgagc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 7 ccgtcaagat cttctcctcg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 8 tcatgtctga ggcgatgaag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 9 cccagcgtga aaagagagac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 10 gagaccgcag tccgtctaag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 11 tgagcctttc cagcaagttt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 12 cttccccgtc tcaggtatca 20 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 13 caagctggtc acattcatag cggct 25 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 ttcctcccct tggaggagcg ccgcccg 27 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 15 ggagctcccc aatttgttg 19 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 16 cagcctccgc ctcttacc 18 <210> 17 <211> 262 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 17 cccaccaccg tctgcaagat ccccagcggg tgcagcttga aaatcttcaa caaccaagag 60 tttgctcagc tactggcgca gtctgtgaac cacgggttcg agaccgtgta tgaactcacc 120 aaaatgtgca ctattcggat gagcttcgtg aagggttggg gagccgaata ccaccggcag 180 gatgttacca gcaccccctg ctggattgag atccatctgc atggccctct ccagtggctg 240 gataaggttc tgacccagat gg 262 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 18 catgctcgtc acattcaaag ccgct 25 <210> 19 <211> 4978 <212> mRNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (241)..(2553) <400> 19 ggtttccgga gctgcggcgg cgcagactgg gagggggagc cgggggttcc gacgtcgcag 60 ccgagggaac aagccccaac cggatcctgg acaggcaccc cggcttggcg ctgtctctcc 120 ccctcggctc ggagaggccc ttcggcctga gggagcctcg ccgcccgtcc ccggcacacg 180 cgcagccccg gcctctcggc ctctgccgga gaaacagttg ggacccctga ttttagcagg 240 atg gcc caa tgg aat cag cta cag cag ctt gac aca cgg tac ctg gag 288 Met Ala Gln Trp Asn Gln Leu Gln Gln Leu Asp Thr Arg Tyr Leu Glu 1 5 10 15 cag ctc cat cag ctc tac agt gac agc ttc cca atg gag ctg cgg cag 336 Gln Leu His Gln Leu Tyr Ser Asp Ser Phe Pro Met Glu Leu Arg Gln 20 25 30 ttt ctg gcc cct tgg att gag agt caa gat tgg gca tat gcg gcc agc 384 Phe Leu Ala Pro Trp Ile Glu Ser Gln Asp Trp Ala Tyr Ala Ala Ser 35 40 45 aaa gaa tca cat gcc act ttg gtg ttt cat aat ctc ctg gga gag att 432 Lys Glu Ser His Ala Thr Leu Val Phe His Asn Leu Leu Gly Glu Ile 50 55 60 gac cag cag tat agc cgc ttc ctg caa gag tcg aat gtt ctc tat cag 480 Asp Gln Gln Tyr Ser Arg Phe Leu Gln Glu Ser Asn Val Leu Tyr Gln 65 70 75 80 cac aat cta cga aga atc aag cag ttt ctt cag agc agg tat ctt gag 528 His Asn Leu Arg Arg Ile Lys Gln Phe Leu Gln Ser Arg Tyr Leu Glu 85 90 95 aag cca atg gag att gcc cgg att gtg gcc cgg tgc ctg tgg gaa gaa 576 Lys Pro Met Glu Ile Ala Arg Ile Val Ala Arg Cys Leu Trp Glu Glu 100 105 110 tca cgc ctt cta cag act gca gcc act gcg gcc cag caa ggg ggc cag 624 Ser Arg Leu Leu Gln Thr Ala Ala Thr Ala Ala Gln Gln Gly Gly Gln 115 120 125 gcc aac cac ccc aca gca gcc gtg gtg acg gag aag cag cag atg ctg 672 Ala Asn His Pro Thr Ala Ala Val Val Thr Glu Lys Gln Gln Met Leu 130 135 140 gag cag cac ctt cag gat gtc cgg aag aga gtg cag gat cta gaa cag 720 Glu Gln His Leu Gln Asp Val Arg Lys Arg Val Gln Asp Leu Glu Gln 145 150 155 160 aaa atg aaa gtg gta gag aat ctc cag gat gac ttt gat ttc aac tat 768 Lys Met Lys Val Val Glu Asn Leu Gln Asp Asp Phe Asp Phe Asn Tyr 165 170 175 aaa acc ctc aag agt caa gga gac atg caa gat ctg aat gga aac aac 816 Lys Thr Leu Lys Ser Gln Gly Asp Met Gln Asp Leu Asn Gly Asn Asn 180 185 190 cag tca gtg acc agg cag aag atg cag cag ctg gaa cag atg ctc act 864 Gln Ser Val Thr Arg Gln Lys Met Gln Gln Leu Glu Gln Met Leu Thr 195 200 205 gcg ctg gac cag atg cgg aga agc atc gtg agt gag ctg gcg ggg ctt 912 Ala Leu Asp Gln Met Arg Arg Ser Ile Val Ser Glu Leu Ala Gly Leu 210 215 220 ttg tca gcg atg gag tac gtg cag aaa act ctc acg gac gag gag ctg 960 Leu Ser Ala Met Glu Tyr Val Gln Lys Thr Leu Thr Asp Glu Glu Leu 225 230 235 240 gct gac tgg aag agg cgg caa cag att gcc tgc att gga ggc ccg ccc 1008 Ala Asp Trp Lys Arg Arg Gln Gln Ile Ala Cys Ile Gly Gly Pro Pro 245 250 255 aac atc tgc cta gat cgg cta gaa aac tgg ata acg tca tta gca gaa 1056 Asn Ile Cys Leu Asp Arg Leu Glu Asn Trp Ile Thr Ser Leu Ala Glu 260 265 270 tct caa ctt cag acc cgt caa caa att aag aaa ctg gag gag ttg cag 1104 Ser Gln Leu Gln Thr Arg Gln Gln Ile Lys Lys Leu Glu Glu Leu Gln 275 280 285 caa aaa gtt tcc tac aaa ggg gac ccc att gta cag cac cgg ccg atg 1152 Gln Lys Val Ser Tyr Lys Gly Asp Pro Ile Val Gln His Arg Pro Met 290 295 300 ctg gag gag aga atc gtg gag ctg ttt aga aac tta atg aaa agt gcc 1200 Leu Glu Glu Arg Ile Val Glu Leu Phe Arg Asn Leu Met Lys Ser Ala 305 310 315 320 ttt gtg gtg gag cgg cag ccc tgc atg ccc atg cat cct gac cgg ccc 1248 Phe Val Val Glu Arg Gln Pro Cys Met Pro Met His Pro Asp Arg Pro 325 330 335 ctc gtc atc aag acc ggc gtc cag ttc act act aaa gtc agg ttg ctg 1296 Leu Val Ile Lys Thr Gly Val Gln Phe Thr Thr Lys Val Arg Leu Leu 340 345 350 gtc aaa ttc cct gag ttg aat tat cag ctt aaa att aaa gtg tgc att 1344 Val Lys Phe Pro Glu Leu Asn Tyr Gln Leu Lys Ile Lys Val Cys Ile 355 360 365 gac aaa gac tct ggg gac gtt gca gct ctc aga gga tcc cgg aaa ttt 1392 Asp Lys Asp Ser Gly Asp Val Ala Ala Leu Arg Gly Ser Arg Lys Phe 370 375 380 aac att ctg ggc aca aac aca aaa gtg atg aac atg gaa gaa tcc aac 1440 Asn Ile Leu Gly Thr Asn Thr Lys Val Met Asn Met Glu Glu Ser Asn 385 390 395 400 aac ggc agc ctc tct gca gaa ttc aaa cac ttg acc ctg agg gag cag 1488 Asn Gly Ser Leu Ser Ala Glu Phe Lys His Leu Thr Leu Arg Glu Gln 405 410 415 aga tgt ggg aat ggg ggc cga gcc aat tgt gat gct tcc ctg att gtg 1536 Arg Cys Gly Asn Gly Gly Arg Ala Asn Cys Asp Ala Ser Leu Ile Val 420 425 430 act gag gag ctg cac ctg atc acc ttt gag acc gag gtg tat cac caa 1584 Thr Glu Glu Leu His Leu Ile Thr Phe Glu Thr Glu Val Tyr His Gln 435 440 445 ggc ctc aag att gac cta gag acc cac tcc ttg cca gtt gtg gtg atc 1632 Gly Leu Lys Ile Asp Leu Glu Thr His Ser Leu Pro Val Val Val Ile 450 455 460 tcc aac atc tgt cag atg cca aat gcc tgg gcg tcc atc ctg tgg tac 1680 Ser Asn Ile Cys Gln Met Pro Asn Ala Trp Ala Ser Ile Leu Trp Tyr 465 470 475 480 aac atg ctg acc aac aat ccc aag aat gta aac ttt ttt acc aag ccc 1728 Asn Met Leu Thr Asn Asn Pro Lys Asn Val Asn Phe Phe Thr Lys Pro 485 490 495 cca att gga acc tgg gat caa gtg gcc gag gtc ctg agc tgg cag ttc 1776 Pro Ile Gly Thr Trp Asp Gln Val Ala Glu Val Leu Ser Trp Gln Phe 500 505 510 tcc tcc acc acc aag cga gga ctg agc atc gag cag ctg act aca ctg 1824 Ser Ser Thr Thr Lys Arg Gly Leu Ser Ile Glu Gln Leu Thr Thr Leu 515 520 525 gca gag aaa ctc ttg gga cct ggt gtg aat tat tca ggg tgt cag atc 1872 Ala Glu Lys Leu Leu Gly Pro Gly Val Asn Tyr Ser Gly Cys Gln Ile 530 535 540 aca tgg gct aaa ttt tgc aaa gaa aac atg gct ggc aag ggc ttc tcc 1920 Thr Trp Ala Lys Phe Cys Lys Glu Asn Met Ala Gly Lys Gly Phe Ser 545 550 555 560 ttc tgg gtc tgg ctg gac aat atc att gac ctt gtg aaa aag tac atc 1968 Phe Trp Val Trp Leu Asp Asn Ile Ile Asp Leu Val Lys Lys Tyr Ile 565 570 575 ctg gcc ctt tgg aac gaa ggg tac atc atg ggc ttt atc agt aag gag 2016 Leu Ala Leu Trp Asn Glu Gly Tyr Ile Met Gly Phe Ile Ser Lys Glu 580 585 590 cgg gag cgg gcc atc ttg agc act aag cct cca ggc acc ttc ctg cta 2064 Arg Glu Arg Ala Ile Leu Ser Thr Lys Pro Pro Gly Thr Phe Leu Leu 595 600 605 aga ttc agt gaa agc agc aaa gaa gga ggc gtc act ttc act tgg gtg 2112 Arg Phe Ser Glu Ser Ser Lys Glu Gly Gly Val Thr Phe Thr Trp Val 610 615 620 gag aag gac atc agc ggt aag acc cag atc cag tcc gtg gaa cca tac 2160 Glu Lys Asp Ile Ser Gly Lys Thr Gln Ile Gln Ser Val Glu Pro Tyr 625 630 635 640 aca aag cag cag ctg aac aac atg tca ttt gct gaa atc atc atg ggc 2208 Thr Lys Gln Gln Leu Asn Asn Met Ser Phe Ala Glu Ile Ile Met Gly 645 650 655 tat aag atc atg gat gct acc aat atc ctg gtg tct cca ctg gtc tat 2256 Tyr Lys Ile Met Asp Ala Thr Asn Ile Leu Val Ser Pro Leu Val Tyr 660 665 670 ctc tat cct gac att ccc aag gag gag gca ttc gga aag tat tgt cgg 2304 Leu Tyr Pro Asp Ile Pro Lys Glu Glu Ala Phe Gly Lys Tyr Cys Arg 675 680 685 cca gag agc cag gag cat cct gaa gct gac cca ggt agc gct gcc cca 2352 Pro Glu Ser Gln Glu His Pro Glu Ala Asp Pro Gly Ser Ala Ala Pro 690 695 700 tac ctg aag acc aag ttt atc tgt gtg aca cca acg acc tgc agc aat 2400 Tyr Leu Lys Thr Lys Phe Ile Cys Val Thr Pro Thr Thr Cys Ser Asn 705 710 715 720 acc att gac ctg ccg atg tcc ccc cgc act tta gat tca ttg atg cag 2448 Thr Ile Asp Leu Pro Met Ser Pro Arg Thr Leu Asp Ser Leu Met Gln 725 730 735 ttt gga aat aat ggt gaa ggt gct gaa ccc tca gca gga ggg cag ttt 2496 Phe Gly Asn Asn Gly Glu Gly Ala Glu Pro Ser Ala Gly Gly Gln Phe 740 745 750 gag tcc ctc acc ttt gac atg gag ttg acc tcg gag tgc gct acc tcc 2544 Glu Ser Leu Thr Phe Asp Met Glu Leu Thr Ser Glu Cys Ala Thr Ser 755 760 765 ccc atg tga ggagctgaga acggaagctg cagaaagata cgactgaggc 2593 Pro Met 770 gcctacctgc attctgccac ccctcacaca gccaaacccc agatcatctg aaactactaa 2653 ctttgtggtt ccagattttt tttaatctcc tacttctgct atctttgagc aatctgggca 2713 cttttaaaaa tagagaaatg agtgaatgtg ggtgatctgc ttttatctaa atgcaaataa 2773 ggatgtgttc tctgagaccc atgatcaggg gatgtggcgg ggggtggcta gagggagaaa 2833 aaggaaatgt cttgtgttgt tttgttcccc tgccctcctt tctcagcagc tttttgttat 2893 tgttgttgtt gttcttagac aagtgcctcc tggtgcctgc ggcatccttc tgcctgtttc 2953 tgtaagcaaa tgccacaggc cacctatagc tacatactcc tggcattgca ctttttaacc 3013 ttgctgacat ccaaatagaa gataggacta tctaagccct aggtttcttt ttaaattaag 3073 aaataataac aattaaaggg caaaaaacac tgtatcagca tagcctttct gtatttaaga 3133 aacttaagca gccgggcatg gtggctcacg cctgtaatcc cagcactttg ggaggccgag 3193 gcggatcata aggtcaggag atcaagacca tcctggctaa cacggtgaaa ccccgtctct 3253 actaaaagta caaaaaatta gctgggtgtg gtggtgggcg cctgtagtcc cagctactcg 3313 ggaggctgag gcaggagaat cgcttgaacc tgagaggcgg aggttgcagt gagccaaaat 3373 tgcaccactg cacactgcac tccatcctgg gcgacagtct gagactctgt ctcaaaaaaa 3433 aaaaaaaaaa aaagaaactt cagttaacag cctccttggt gctttaagca ttcagcttcc 3493 ttcaggctgg taatttatat aatccctgaa acgggcttca ggtcaaaccc ttaagacatc 3553 tgaagctgca acctggcctt tggtgttgaa ataggaaggt ttaaggagaa tctaagcatt 3613 ttagactttt ttttataaat agacttattt tcctttgtaa tgtattggcc ttttagtgag 3673 taaggctggg cagagggtgc ttacaacctt gactcccttt ctccctggac ttgatctgct 3733 gtttcagagg ctaggttgtt tctgtgggtg ccttatcagg gctgggatac ttctgattct 3793 ggcttccttc ctgccccacc ctcccgaccc cagtccccct gatcctgcta gaggcatgtc 3853 tccttgcgtg tctaaaggtc cctcatcctg tttgttttag gaatcctggt ctcaggacct 3913 catggaagaa gagggggaga gagttacagg ttggacatga tgcacactat ggggccccag 3973 cgacgtgtct ggttgagctc agggaatatg gttcttagcc agtttcttgg tgatatccag 4033 tggcacttgt aatggcgtct tcattcagtt catgcagggc aaaggcttac tgataaactt 4093 gagtctgccc tcgtatgagg gtgtatacct ggcctccctc tgaggctggt gactcctccc 4153 tgctggggcc ccacaggtga ggcagaacag ctagagggcc tccccgcctg cccgccttgg 4213 ctggctagct cgcctctcct gtgcgtatgg gaacacctag cacgtgctgg atgggctgcc 4273 tctgactcag aggcatggcc ggatttggca actcaaaacc accttgcctc agctgatcag 4333 agtttctgtg gaattctgtt tgttaaatca aattagctgg tctctgaatt aagggggaga 4393 cgaccttctc taagatgaac agggttcgcc ccagtcctcc tgcctggaga cagttgatgt 4453 gtcatgcaga gctcttactt ctccagcaac actcttcagt acataataag cttaactgat 4513 aaacagaata tttagaaagg tgagacttgg gcttaccatt gggtttaaat catagggacc 4573 tagggcgagg gttcagggct tctctggagc agatattgtc aagttcatgg ccttaggtag 4633 catgtatctg gtcttaactc tgattgtagc aaaagttctg agaggagctg agccctgttg 4693 tggcccatta aagaacaggg tcctcaggcc ctgcccgctt cctgtccact gccccctccc 4753 catccccagc ccagccgagg gaatcccgtg ggttgcttac ctacctataa ggtggtttat 4813 aagctgctgt cctggccact gcattcaaat tccaatgtgt acttcatagt gtaaaaattt 4873 atattattgt gaggtttttt gtcttttttt tttttttttt tttttggtat attgctgtat 4933 ctactttaac ttccagaaat aaacgttata taggaaccgt aaaaa 4978 <210> 20 <211> 3631 <212> mRNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (549)..(2147) <400> 20 gcggccgctg cagagattgg aatccgcctg ccgggcttgg cgaaggagaa gggaggaggc 60 aggagcgagg agggaggagg gccaagggcg ggcaggaagg cttaggctcg gcgcgtccgt 120 ccgcgcgcgg cgaagatcgc acggcccgat cgaggggcga ccgggtcggg gccgctgcac 180 gccaagggcg aaggccgatt cgggccccac ttcgccccgg cggctcgccg cgcccacccg 240 ctccgcgccg agggctggag gatgcgttcc ctggggtccg gacttatgaa aatatgcatc 300 agtttaatac tgtcttggaa ttcatgagat ggaagcatag gtcaaagctg tttggagaaa 360 atcagaagta cagttttatc tagccacatc ttggaggagt cgtaagaaag cagtgggagt 420 tgaagtcatt gtcaagtgct tgcgatcttt tacaagaaaa tctcactgaa tgatagtcat 480 ttaaattggt gaagtagcaa gaccaattat taaaggtgac agtacacagg aaacattaca 540 attgaaca atg cct cag cta tac att tac atc aga tta ttg gga gcc tat 590 Met Pro Gln Leu Tyr Ile Tyr Ile Arg Leu Leu Gly Ala Tyr 1 5 10 ttg ttc atc att tct cgt gtt caa gga cag aat ctg gat agt atg ctt 638 Leu Phe Ile Ile Ser Arg Val Gln Gly Gln Asn Leu Asp Ser Met Leu 15 20 25 30 cat ggc act ggg atg aaa tca gac tcc gac cag aaa aag tca gaa aat 686 His Gly Thr Gly Met Lys Ser Asp Ser Asp Gln Lys Lys Ser Glu Asn 35 40 45 gga gta acc tta gca cca gag gat acc ttg cct ttt tta aag tgc tat 734 Gly Val Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu Lys Cys Tyr 50 55 60 tgc tca ggg cac tgt cca gat gat gct att aat aac aca tgc ata act 782 Cys Ser Gly His Cys Pro Asp Asp Ala Ile Asn Asn Thr Cys Ile Thr 65 70 75 aat gga cat tgc ttt gcc atc ata gaa gaa gat gac cag gga gaa acc 830 Asn Gly His Cys Phe Ala Ile Ile Glu Glu Asp Asp Gln Gly Glu Thr 80 85 90 aca tta gct tca ggg tgt atg aaa tat gaa gga tct gat ttt cag tgc 878 Thr Leu Ala Ser Gly Cys Met Lys Tyr Glu Gly Ser Asp Phe Gln Cys 95 100 105 110 aaa gat tct cca aaa gcc cag cta cgc cgg aca ata gaa tgt tgt cgg 926 Lys Asp Ser Pro Lys Ala Gln Leu Arg Arg Thr Ile Glu Cys Cys Arg 115 120 125 acc aat tta tgt aac cag tat ttg caa ccc aca ctg ccc cct gtt gtc 974 Thr Asn Leu Cys Asn Gln Tyr Leu Gln Pro Thr Leu Pro Pro Val Val 130 135 140 ata ggt ccg ttt ttt gat ggc agc att cga tgg ctg gtt ttg ctc att 1022 Ile Gly Pro Phe Phe Asp Gly Ser Ile Arg Trp Leu Val Leu Leu Ile 145 150 155 tct atg gct gtc tgc ata att gct atg atc atc ttc tcc agc tgc ttt 1070 Ser Met Ala Val Cys Ile Ile Ala Met Ile Ile Phe Ser Ser Cys Phe 160 165 170 tgt tac aaa cat tat tgc aag agc atc tca agc aga cgt cgt tac aat 1118 Cys Tyr Lys His Tyr Cys Lys Ser Ile Ser Ser Arg Arg Arg Tyr Asn 175 180 185 190 cgt gat ttg gaa cag gat gaa gca ttt att cca gtt gga gaa tca cta 1166 Arg Asp Leu Glu Gln Asp Glu Ala Phe Ile Pro Val Gly Glu Ser Leu 195 200 205 aaa gac ctt att gac cag tca caa agt tct ggt agt ggg tct gga cta 1214 Lys Asp Leu Ile Asp Gln Ser Gln Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu 210 215 220 cct tta ttg gtt cag cga act att gcc aaa cag att cag atg gtc cgg 1262 Pro Leu Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Lys Gln Ile Gln Met Val Arg 225 230 235 caa gtt ggt aaa ggc cga tat gga gaa gta tgg atg ggc aaa tgg cgt 1310 Gln Val Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Met Gly Lys Trp Arg 240 245 250 ggc gaa aaa gtg gcg gtg aaa gta ttc ttt acc act gaa gaa gcc agc 1358 Gly Glu Lys Val Ala Val Lys Val Phe Phe Thr Thr Glu Glu Ala Ser 255 260 265 270 tgg ttt cga gaa aca gaa atc tac caa act gtg cta atg cgc cat gaa 1406 Trp Phe Arg Glu Thr Glu Ile Tyr Gln Thr Val Leu Met Arg His Glu 275 280 285 aac ata ctt ggt ttc ata gcg gca gac att aaa ggt aca ggt tcc tgg 1454 Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Ile Lys Gly Thr Gly Ser Trp 290 295 300 act cag ctc tat ttg att act gat tac cat gaa aat gga tct ctc tat 1502 Thr Gln Leu Tyr Leu Ile Thr Asp Tyr His Glu Asn Gly Ser Leu Tyr 305 310 315 gac ttc ctg aaa tgt gct aca ctg gac acc aga gcc ctg ctt aaa ttg 1550 Asp Phe Leu Lys Cys Ala Thr Leu Asp Thr Arg Ala Leu Leu Lys Leu 320 325 330 gct tat tca gct gcc tgt ggt ctg tgc cac ctg cac aca gaa att tat 1598 Ala Tyr Ser Ala Ala Cys Gly Leu Cys His Leu His Thr Glu Ile Tyr 335 340 345 350 ggc acc caa gga aag ccc gca att gct cat cga gac cta aag agc aaa 1646 Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser Lys 355 360 365 aac atc ctc atc aag aaa aat ggg agt tgc tgc att gct gac ctg ggc 1694 Asn Ile Leu Ile Lys Lys Asn Gly Ser Cys Cys Ile Ala Asp Leu Gly 370 375 380 ctt gct gtt aaa ttc aac agt gac aca aat gaa gtt gat gtg ccc ttg 1742 Leu Ala Val Lys Phe Asn Ser Asp Thr Asn Glu Val Asp Val Pro Leu 385 390 395 aat acc agg gtg ggc acc aaa cgc tac atg gct ccc gaa gtg ctg gac 1790 Asn Thr Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Asp 400 405 410 gaa agc ctg aac aaa aac cac ttc cag ccc tac atc atg gct gac atc 1838 Glu Ser Leu Asn Lys Asn His Phe Gln Pro Tyr Ile Met Ala Asp Ile 415 420 425 430 tac agc ttc ggc cta atc att tgg gag atg gct cgt cgt tgt atc aca 1886 Tyr Ser Phe Gly Leu Ile Ile Trp Glu Met Ala Arg Arg Cys Ile Thr 435 440 445 gga ggg atc gtg gaa gaa tac caa ttg cca tat tac aac atg gta ccg 1934 Gly Gly Ile Val Glu Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asn Met Val Pro 450 455 460 agt gat ccg tca tac gaa gat atg cgt gag gtt gtg tgt gtc aaa cgt 1982 Ser Asp Pro Ser Tyr Glu Asp Met Arg Glu Val Val Cys Val Lys Arg 465 470 475 ttg cgg cca att gtg tct aat cgg tgg aac agt gat gaa tgt cta cga 2030 Leu Arg Pro Ile Val Ser Asn Arg Trp Asn Ser Asp Glu Cys Leu Arg 480 485 490 gca gtt ttg aag cta atg tca gaa tgc tgg gcc cac aat cca gcc tcc 2078 Ala Val Leu Lys Leu Met Ser Glu Cys Trp Ala His Asn Pro Ala Ser 495 500 505 510 aga ctc aca gca ttg aga att aag aag acg ctt gcc aag atg gtt gaa 2126 Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ala Lys Met Val Glu 515 520 525 tcc caa gat gta aaa atc tga tggttaaacc atcggaggag aaactctaga 2177 Ser Gln Asp Val Lys Ile 530 ctgcaagaac tgtttttacc catggcatgg gtggaattag agtggaataa ggatgttaac 2237 ttggttctca gactctttct tcactacgtg ttcacaggct gctaatatta aacctttcag 2297 tactcttatt aggatacaag ctgggaactt ctaaacactt cattctttat atatggacag 2357 ctttatttta aatgtggttt ttgatgcctt tttttaagtg ggtttttatg aactgcatca 2417 agacttcaat cctgattagt gtctccagtc aagctctggg tactgaattg cctgttcata 2477 aaacggtgct ttctgtgaaa gccttaagaa gataaatgag cgcagcagag atggagaaat 2537 agactttgcc ttttacctga gacattcagt tcgtttgtat tctacctttg taaaacagcc 2597 tatagatgat gatgtgtttg ggatactgct tattttatga tagtttgtcc tgtgtcctta 2657 gtgatgtgtg tgtgtctcca tgcacatgca cgccgggatt cctctgctgc catttgaatt 2717 agaagaaaat aatttatatg catgcacagg aagatattgg tggccggtgg ttttgtgctt 2777 taaaaatgca atatctgacc aagattcgcc aatctcatac aagccattta ctttgcaagt 2837 gagatagctt ccccaccagc tttatttttt aacatgaaag ctgatgccaa ggccaaaaga 2897 agtttaaagc atctgtaaat ttggactgtt ttccttcaac caccattttt tttgtggtta 2957 ttatttttgt cacggaaagc atcctctcca aagttggagc ttctattgcc atgaaccatg 3017 cttacaaaga aagcacttct tattgaagtg aattcctgca tttgatagca atgtaagtgc 3077 ctataaccat gttctatatt ctttattctc agtaactttt aaaagggaag ttatttatat 3137 tttgtgtata atgtgcttta tttgcaaatc acccactcct ttacaaccat actttatata 3197 tgtacataca ttcatactgt agaaaccagc tcatgtgtac ctcatatccc atccttaaga 3257 gaagaaatgt tataaagtag aactaaatat aaattttcag aattaatgca ttcaaagtaa 3317 tatatcaaat ccaggacttt gttaacttca ggtaaaaact tcattagggt aatatcatct 3377 caattttttc aaatgaaagg attctctaat tagaaattta tatgtcagag ctgttataaa 3437 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Claims (19)

  1. 생체 시료에 있어서의, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하는 것을 포함하는, 경화를 초래하는 증식성 질환의 검출방법.
  2. 생체 시료에 있어서의, STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하는 것을 포함하는, 경화를 초래하는 증식성 질환의 진행도, 치료의 유효성, 또는 양자 모두를 평가하는 방법.
  3. STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하기 위한 시약을 포함하는, 경화를 초래하는 증식성 질환을 검출하기 위한 키트.
  4. STAT3, 인산화 STAT3, Smad1, 인산화 Smad1, 액티빈 수용체형 키나아제 1, 액티빈 수용체형 키나아제 3 및 골형성 단백으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하기 위한 시약을 포함하는, 경화를 초래하는 증식성 질환의 진행도, 치료의 유효성, 또는 양자 모두를 평가하기 위한 키트.
  5. 생체 시료에 있어서의, Smad1, Smad1 활성화 작용을 갖는 물질, 또는 양자 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하는, 당뇨병성 신증의 검출방법.
  6. 생체 시료에 있어서의, Smad1, Smad1 활성화 작용을 갖는 물질, 또는 양자 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하는, 당뇨병성 신증의 진행도, 치료의 유효성, 또는 양자 모두를 평가하는 방법.
  7. Smad1, Smad1 활성화 작용을 갖는 물질, 또는 양자 모두의 발현을 측정하기 위한 시약을 포함하는, 당뇨병성 신증을 검출하기 위한 키트.
  8. Smad1, Smad1 활성화 작용을 갖는 물질, 또는 양자 모두의 발현을 측정하기 위한 시약을 포함하는, 당뇨병성 신증의 진행도, 치료의 유효성, 또는 양자 모두를 평가하기 위한 키트.
  9. STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는 작용을 갖는 물질을 유효성분으로서 함유하는, 신장질환, 간섬유화 및 동맥경화질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료제.
  10. 제 9 항에 있어서, 세포외 매트릭스의 증식을 저해하는 예방, 치료, 또는 예방 및 치료제.
  11. 제 9 항에 있어서, α1 IV 형 콜라겐의 발현을 억제하는 예방, 치료, 또는 예방 및 치료제.
  12. 피험물질이 STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는지 여부를 판정하는 것을 포함하는, 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료에 유효한 물질을 동정하는 방법.
  13. 피험물질이 STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는지 여부를 판정하는 것을 포함하는, 세포외 매트릭스의 증식 저해에 유효한 물질을 동정하는 방법.
  14. 피험물질이 STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는지 여부를 판정하는 것을 포함하는, α1 IV 형 콜라겐의 발현 억제에 유효한 물질을 동정하는 방법.
  15. STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하기 위한 시약을 포함하는, 경화를 초래하는 증식성 질환의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료에 유효한 물질을 동정하기 위한 키트.
  16. STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하기 위한 시약을 포함하는, 세포외 매트릭스의 증식 저해에 유효한 물질을 동정하기 위한 키트.
  17. STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 측정하기 위한 시약을 포함하는, α1 IV 형 콜라겐의 발현 억제에 유효한 물질을 동정하기 위한 키트.
  18. STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는 작용을 갖는 물질을 유효성분으로서 함유하는, 세포외 매트릭스의 증식을 저해하는 시약.
  19. STAT3, 인산화 STAT3, Smad1 및 인산화 Smad1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 발현을 억제하는 작용을 갖는 물질을 유효성분으로서 함유하는, α1 IV 형 콜라겐의 발현을 억제하는 시약.
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