JP6329501B2 - 昆虫の混入時期判定方法 - Google Patents

Description

本発明は、昆虫の混入時期判定方法に関するものであり、より詳細には、医薬品や食品等の製造加工過程等において混入した可能性のある昆虫の混入時期を判定するための方法に関するものである。

医薬品や食品、あるいは、包装材料などの製品に昆虫の全体又は一部が混入した場合は大きな社会問題となり、その対策を講じるために、混入時期や混入経路を究明することが不可欠となる。昆虫の混入時期や経路を推定するためには、先ず、昆虫の種類や状態、発見状況、あるいは、製造記録や昆虫の捕獲状況等を総合的に把握することが必要となる。

医薬品や食品の製造工程において、加熱前に混入したものか、加熱後であるのかを判断するための判断材料の一つとして、カタラーゼ反応テストが提案され、加熱の有無を判断する簡便な方法であることから、多く利用されてきている。

このカタラーゼ反応テストは、動物、植物、微生物のいずれを問わず、酸素呼吸をする細胞に存在するカタラーゼの性質を利用するテストであり、昆虫などをわずかに傷付けて過酸化水素水に浸すと、酸素ガスと水が発生することを利用したものである。即ち、加熱などの加工が加えられた場合には昆虫体内のカタラーゼが失活するので、酸素の泡を観察することで、加熱前に混入したものか加熱後に混入したものかの判定を行うことができるのである。この方法は、発泡状態を目視で観察でき、写真撮影も可能であり、検査対象としての昆虫の証拠、原型保全もできるという利点のある、簡易な方法である。

しかし、このカタラーゼ反応テストについては、以下のような問題が指摘されている。
１）カタラーゼはカビのような好気性微生物にも反応することから、たとえ加熱されていたとしても、発見されるまでの種々の環境あるいは保管している間の環境で昆虫の体表面に微生物が付着していれば、一度活性を失った昆虫の体表面からも活性が見られることがある。
２）対象となる昆虫の死体が古い場合には、たとえ加熱を受けていない場合においても、カタラーゼ反応テストは不活性となる（失活は死後２カ月程度のものから見られる）。
３）低ｐＨやエタノールなどに昆虫が浸漬されている条件下においては、非加熱であってもカタラーゼは失活する。

昆虫の混入時期を判定するための他の方法として、動物体内のコリンエステラーゼという酵素の失活を利用する方法が提案されている（非特許文献１：中桐ら、１９９５）。この方法は、生物体、器官あるいは組織を、緩衝液を加えてホモジナイザーですり潰して均一化したもの、あるいは、更に精製してより純粋に酵素だけにしたものの酵素活性を測定するというものである。

しかし、この方法の場合には、次のような問題が指摘されている。
１）昆虫全体をすり潰してしまうため、問題の検査対象としての昆虫の原型保全ができなくなる。
２）検査対象としての昆虫は、比較的大きなものである必要がある。
３）ホモジナイザーに加え、恒温装置や振還装置等の装置、並びに、反応させる物質の調整、発生物質の量の測定、そのための発色又は電磁波吸収測定など、種々の技法が必要となる。

特開２０１０−１９０８８１号公報 特開２００５−５５２５２号公報 特開２００４−３３１１２号公報

「生ビール中の昆虫の混入時期の判定方法」食衛誌 Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．３（平成６年１２月８日）

上述したように、従来行われているカタラーゼ反応テストやコリンエステラーゼという酵素の失活を利用する方法の場合には、種々の問題点が指摘されており、それらに変わる方法の提案が求められていた。本発明はこのような要望に応えるためになされたもので、酵素活性を測定するという間接的な方法ではなく、検査対象としての昆虫の筋組織を迅速且つ簡易に、直接観察することによって被加熱履歴を判定することができる、昆虫の混入時期判定方法を提供することを課題とする。

上記課題を解決するための請求項１に係る発明は、昆虫の観察部位を切り出して検体を得る工程と、前記検体を包埋剤で包埋する工程と、包埋した前記検体を凍結する工程と、凍結した前記検体を薄切りして切片を作製する工程と、前記切片を伸展乾燥させる工程と、前記切片を顕微鏡観察する固定前観察工程と、前記切片を固定液により固定する固定工程と、前記切片を染色する工程と、染色した切片を顕微鏡観察する工程とから成ることを特徴とする昆虫の混入時期判定方法である。

上記課題を解決するための請求項１に記載の発明は、加熱処理を含む製品の製造工程中に昆虫が混入した場合において、当該昆虫の混入が前記加熱処理の前か後かを判定するための方法であって、
前記昆虫の観察部位を切り出して検体を得る工程と、前記検体を包埋剤で包埋し、気泡が生じた場合にそれを除去する工程と、包埋した前記検体をその垂直状態を保持しつつ凍結する工程と、凍結した前記検体を薄切りして切片を作製する工程と、前記切片を伸展乾燥させる工程と、前記切片を顕微鏡観察する固定前観察工程と、前記切片を固定液により固定する固定工程と、前記切片を染色する工程と、染色した切片を顕微鏡観察する固定後観察工程とから成り、
前記固定後観察工程において、筋組織が収縮している場合、核が粒状に収縮している場合、あるいは、固定前と比較して固定後に筋組織が膨張していない場合に、前記昆虫が加熱処理後に混入したと判定することを特徴とする昆虫の混入時期判定方法である。

一実施形態においては、前記切片伸展乾燥工程は、スライドガラスの裏に指を当てて凍結している前記切片を溶かしつつ行う。

また、一実施形態においては、前記染色は、マイヤーヘマトキシリン液とエオシンＹ液による二重染色とされる。

本発明は上述したとおりの簡易的な方法であって、検査対象としての昆虫の筋組織や核を迅速且つ容易に、直接観察することによって被加熱履歴を判定することができる効果がある。

本発明に係る方法によって得られた顕微鏡画像（非加熱の場合）を示すものである。 本発明に係る方法によって得られた顕微鏡画像（加熱処理されている場合）を示すものである。 本発明に係る方法によって得られた顕微鏡画像（非加熱の場合）を示すものである（未染色）。 本発明に係る方法によって得られた顕微鏡画像（加熱処理されている場合）を示すものである（未染色）。

本発明に係る昆虫の混入時期判定方法は、昆虫の観察部位を切り出して検体を得る工程と、前記検体を包埋剤で包埋する工程と、包埋した前記検体を凍結する工程と、凍結した前記検体を薄切りして切片を作製する工程と、前記切片を伸展乾燥させる工程と、前記切片を顕微鏡観察する固定前観察工程と、前記切片を固定液により固定する固定工程と、前記切片を染色する工程と、染色した切片を顕微鏡観察する工程とから成ることを特徴とするものである。以下、各工程ごとに詳細に説明する。

検体切り出し工程
この工程は、ピンセットやメス等を用い、昆虫の観察部位を残すようにして昆虫の両端部を切除して検体を得る工程である。観察部位である検体は、筋組織を含む胸部や脚部である。

検体の包埋工程
この包埋工程は、上記工程で得た検体を包埋処理剤に入れて包埋処理する工程である。この包埋処理は、組織片である検体を一定で均等な硬度にし、組織内の空間部を包埋剤で充填することで強度を持たせて、後述の薄切り切片作製に耐え得るようにするために行われる。包埋剤としては、市販の種々のものを用いることができる。

検体は凍結切片用トレー（クリオディッシュ等）内に入れ、包埋剤で満たす。その際に気泡が生じた場合は、ピンセットや針等を用いて取り除いておく。気泡が残ったままであると、切片の作製が困難となる。なお、切片作製時の面出しの際に出てくる面を把握するため、換言すれば、切片の切り出し位置が分かるようにするため、トレー内における切片作製部位の向きに配慮する必要がある。

検体凍結工程
次いで、トレーを凍結させ、凍結完了まで、トレー内の検体が傾倒することなく垂直状態を維持していることを監視する。ここにおいて垂直状態を維持させるのは、次工程の切片作製を可能且つ容易にするためである。次に、トレーを試料チャックに台付けする。

切片作製工程
台付け終了後、試料チャックに台付けした検体をクリオスタット内のミクロトーム部分に移し、そこにおいてミクロトームにより、例えば、１０μの厚さに薄切りして切片を作製する。

切片伸展乾燥工程
この工程は、作製した切片をスライドガラス上に拡げて伸展し、そのまま約５〜１５分間放置して表面を乾燥させる工程である。具体的には、切片をスライドガラス上に拡げ、スライドガラスの裏面に指を当てて凍結している切片を体温で溶かしつつ伸展し、切片がスライドガラス上に密着するようにする。

切片観察工程
顕微鏡で切片を観察する（固定前の切片観察）。

固定液による固定工程
この工程は、スライドガラス上に密着させた切片を、４％パラホルムアルデヒドりん酸緩衝液又は１０％ホルマリン液等の固定液に、約３分浸漬して固定する工程である。そして、更に純水に約３分間浸漬した後に純水で流すことにより、固定液及び包埋剤を除去する。この処理は、固定液や包埋剤が残ると、後述する切片観察上支障をきたすおそれがあるために行うものである。

切片染色工程
この工程は、ヘマトキシリン・エオシン染色によって、切片を染色する工程である。ヘマトキシリン・エオシン染色は、病理組織構造の光顕レベルでの全体像の把握を目的として行われる、一般的な染色法である。具体的には、上記工程で流水処理した切片を、マイヤーヘマトキシリン液に約２分間浸漬して切片中の核を青紫色に染色し、その後、純水で洗浄してマイヤーヘマトキシリン液を除去し、更に、発色をよくするために、４０℃程の温水に約５分間浸漬する。次いで、エオシンＹ液に約３０〜６０秒浸漬し、切片中の筋組織を赤色に二重染色する。そしてその後、染色した切片を、７０％程度のエタノール溶液に約２分間浸漬し、更に、１００％近くのエタノール溶液に約３分間浸漬する。この処理は、切片の余剰エオシンＹ液を分離させ、顕微鏡観察に適した切片とするために行うものである。

固定後観察工程
エタノール浸漬した切片を、必要に応じて、オイキット液を用いてカバーガラスで封入した後、顕微鏡で観察し、加熱されているかの判断を行う。以上の検体切り出し工程から固定後観察工程までの所要時間は、約１時間である。

図１は、上記各工程を経て得た、加熱処理のされていないクロゴキブリ成虫の後脚腿節の厚さ１０μの切片画像（４０倍、４００倍）であり、図２は、同じく上記各工程を経て得た、６０℃３０分間加熱処理したクロゴキブリ成虫の後脚腿節の厚さ１０μの切片画像（４０倍、４００倍）である。この２つの画像を対比すれば明らかなように、加熱処理されている場合は、筋組織が収縮し、核が粒状に収縮しているため、加熱処理されていると判断することができる。

図３は、上記各工程を経て得た、加熱処理のされていないノシメマダラメイガ成虫の胸部の厚さ１０μの切片画像（１００倍）（固定前、固定後）（未染色）であり、図４は、同じく上記各工程を経て得た、１００℃５分間加熱処理したノシメマダラメイガ成虫の胸部の厚さ１０μの切片画像（４０倍）（固定前、固定後）（未染色）である。これらの画像を対比すれば明らかなように、加熱処理されている場合は、固定前と比較して固定後に筋組織が膨張しないことから、加熱処理されていると判断することができる。

本発明者らは、上記工程から成る本発明に係る方法の実施に当たり、先ず、１０種の昆虫を対象に、種々の加熱条件で加熱処理した。その結果、１０種すべての昆虫において、６０℃からの明確な筋組織の変化が見られ始めた。６０℃１５分の加熱では、種によって変化にバラツキが見られたが、６０℃３０分以上、並びに、８０℃、１００℃の全加熱区では、ほぼ同様の変化が観察された。そして、これら加熱処理後の昆虫の筋組織に見られる特徴は、加熱を受けずに死亡した昆虫のものとは明確に異なっていた。

また、本発明に係る方法により、加熱後に微生物が発生した個体についての観察も行った。その結果、加熱後に微生物が発生したことでカタラーゼが活性を示してしまう個体であっても、加熱の痕跡を確認することができることが判明した。

本発明に係る方法の利点をまとめると、以下のとおりである。
１）微生物の影響を受けず、死後経過した昆虫の死体の場合でも加熱の有無を推定することができる。
２）カタラーゼ反応テストによる加熱判断ができる条件が８０℃で１５分以上であるのに対して、本発明の場合は６０℃３０分以上からである。
３）加熱処理後の昆虫の筋組織や核に見られる特徴は、加熱を受けずに死亡した昆虫のものとは明確に区別できる。
４）筋組織がある胸部や脚部を切断（破壊）するので、完全に原型保全は難しいが、その他の部分は残存する。

この発明をある程度詳細にその好ましい実施形態について説明してきたが、この発明の精神と範囲に反することなしに広範に異なる実施形態を構成することができることは言うまでもない。従って、この発明は添付請求の範囲において限定した以外はその特定の実施形態に制約されるものではない。

Claims (4)

1. 加熱処理を含む製品の製造工程中に昆虫が混入した場合において、当該昆虫の混入が前記加熱処理の前か後かを判定するための方法であって、
   前記昆虫の観察部位を切り出して検体を得る工程と、前記検体を包埋剤で包埋し、気泡が生じた場合にそれを除去する工程と、包埋した前記検体をその垂直状態を保持しつつ凍結する工程と、凍結した前記検体を薄切りして切片を作製する工程と、前記切片を伸展乾燥させる工程と、前記切片を顕微鏡観察する固定前観察工程と、前記切片を固定液により固定する固定工程と、前記切片を染色する工程と、染色した切片を顕微鏡観察する固定後観察工程とから成り、
   前記固定後観察工程において、筋組織が収縮している場合、核が粒状に収縮している場合、あるいは、固定前と比較して固定後に筋組織が膨張していない場合に、前記昆虫が加熱処理後に混入したと判定することを特徴とする昆虫の混入時期判定方法。
2. 前記検体の凍結工程から切片の作製工程までをクリオスタット内において行う、請求項１に記載の昆虫の混入時期判定方法。
3. 前記伸展乾燥工程は、スライドガラスの裏面に指を当てて凍結している前記切片を溶かしつつ行う、請求項１又は２に記載の昆虫の混入時期判定方法。
4. 前記染色は、マイヤーヘマトキシリン液とエオシンＹ液による二重染色である、請求項１乃至３のいずれかに記載の昆虫の混入時期判定方法。