KR20150019326A - 성체줄기세포의 노화 검출용 마커 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본원은 세포노화 마커로서 사용가능한 라이소포스파티딜콜린 및 라이소포스파티딜에탄올아민의 검출용 물질을 포함하는 줄기세포 노화 판별 조성물 및 그 용도를 개시한다. 본원에 따른 조성물은 인비트로 배양을 통한 증폭이 필수적인 줄기세포의 배양에 있어, 세포의 품질관리는 물론 임상 등에 적용전에 노화여부를 판별할 수 있어 임상적용의 성공률을 높일 수 있다.

Description

성체줄기세포의 노화 검출용 마커 및 그 용도 {Markers for detecting senescence in adult stem cells and its uses}

줄기세포 배양과 관련된 기술분야이다.

줄기세포는 어느 조직으로든지 분화할 수 있는 태생기의 전능세포이다. 대표적인 줄기세포로는 인간배아를 이용한 배아줄기세포와 성체줄기세포를 들 수 있다. 이 중 성체줄기세포는 신체의 각 조직에 소량으로 존재하는 세포로, 특정한 조직을 구성하는 세포이며 이의 대표적인 예로 다분화성 조혈모세포와 중간엽줄기세포가 있다. 이러한 성체줄기세포는 몸이 항상 건강한 상태로 유지되는 데에 필요한 세포를 제공하며, 또한 손상이 발생하였을 때 손상된 부위로 이동한 다른 장기에 있던 줄기세포와 함께 손상된 조직으로 분화하여 복구한다.

중간엽줄기세포는 배아줄기세포와 다르게 제한된 증식력을 가지고 있으므로 암세포화 가능성이 없으며 수정란의 파괴가 없어 윤리적으로도 문제가 되지 않는다. 이에 따라 중간엽줄기세포는 신속한 연구가 진행되어 임상 적용이 가능한 단계까지 도달한 상태이다.

다만 개체로부터 얻을 수 있는 줄기세포의 수가 적고 배양이 어려우며 특정 세포로만 분화가 가능한 단점이 연구의 한계로 지적되고 있으며, 이의 극복을 위한 연구가 진행되고 있다.

미국 공개특허 공보 제2011-0129918호는 중간엽줄기세포를 저밀도로 저산소 조건에서 배양하는 방법에 관한 것으로, MSC의 증식능, 노화 및 분화능을 저하시키지 않고 중간엽줄기세포를 배양하는 방법에 대하여 개시하고 있다.

한국 공개특허 공보 제2013-0057682호는 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포 노화유도방법 및 그 억제방법 및 그 억제용 조성물에 관한 것으로 항산화제를 이용하여 노화를 억제하는 방법을 개시하고 있다.

하지만 개체로부터 얻을 수 있는 양이 적어 인비트로에서 인위적인 증폭이 필수적이며, 이 과정에서 세포의 노화로 인해 세포의 활성과 특징을 유지하고 관리하기가 어려운 문제점이 여전히 존재한다. 따라서 동질성을 확보한 세포를 배양하는 과정에서 노화의 조절 및 이의 변화를 관찰할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.

본원은 성체 줄기세포의 배양과정에서 노화 여부를 판별할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 16:0; LPC 18:0; LPC 18:1; LPC 20:4; LPC 22:5; 라이소포스파티딜에탄올아민 (lysophosphatidylethanolamine, LPE) 22:4; LPE 22:5; 및 LPE 22:6 및 그 유도체 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 지질의 검출 물질을 포함하는 성체줄기세포 노화 검출용 조성물을 제공한다.

본원에 따른 조성물은 성체줄기세포는 예를 들면 중간엽 줄기세포의 노화 판별에 사용될 수 있다.

본원에 따른 조성물에 포함될 수 있는 검출용 물질은 항체분석, 화학발광분석, 또는 액체크로마토그래피 질량분광분석방법에 사용되는 물질을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 본원에 따른 조성물에 사용될 수 잇는 검출용 물질은 상기 지질을 특이적으로 인식하는 수용체, 리간드, 기질, 항체, 항체단편, 항체모방체, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 조성물을 포함하는 성체줄기세포 노화 검출용 키트를 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 중간엽 줄기세포에서 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 16:0; LPC 18:0; LPC 18:1; LPC 20:4; LPC 22:5; 라이소포스파티딜에탄올아민 (lysophosphatidylethanolamine, LPE) 22:4; LPE 22:5; 및 LPE 22:6 및 그 유도체 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 지질을 검출하는 단계를 포함하는, 성체줄기세포 노화 판별 방법을 제공한다. 본원에 따른 일 구현예에서 성체줄기세포는 예를 들면 중간엽줄기세포를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 방법에서 검출은 항체분석, 화학발광분석, 또는 액체크로마토그래피 질량분광분석방법 중 하나 이상에 의해 수행될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 본원에 따른 방법에서 본원의 마커로 사용되는 지질 중 하나 이상이 발현량이 대조군과 비교하여 상기 중간엽 줄기세포에서 증가한 경우, 상기 세포를 노화된 세포로 판정하는 단계를 추가로 포함한다.

다른 양태에서 본원은 또한 성체줄기세포 노화억제 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본원에 따른 일 구현예에서 상기 방법은 성체줄기세포를 시험물질과 접촉시키는 단계; 상기 시험물질과 접촉 후, 상기 성체줄기세포에서 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 16:0; LPC 18:0; LPC 18:1; LPC 20:4; LPC 22:5; 라이소포스파티딜에탄올아민 (lysophosphatidylethanolamine, LPE) 22:4; LPE 22:5; 및 LPE 22:6 중 하나 이상의 물질을 정량하는 단계; 및 상기 물질의 양을 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군 세포 또는 상기 시험물질과 접촉 전의 대조군 세포에서 정량된 상기 하나 이상의 물질의 양과 비교하여, 상기 물질의 양이 변동된 경우, 상기 시험물질을 성체줄기세포 노화 억제용 물질로 선별하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 세포 노화 마커로서 사용가능한 라이소포스파티딜콜린 및 라이소포스파티딜에탄올아민은 인비트로 배양을 통한 증폭이 필수적인 줄기세포의 배양에 있어, 세포의 품질관리는 물론 임상 등에 적용 전에 노화여부를 판별할 수 있어 임상적용의 성공률을 높일 수 있다.

도 1a는 인간 골수로부터 분리된 hcMSC의 세포 형태를 관찰한 현미경 사진이다.
도 1b는 줄기세포에서 발현되는 마커를 관찰한 유세포분석 결과이다.
도 1c는 hcMSC의 지방세포, 뼈 및 연골로 분화가능한 다능성을 관찰한 현미경 사진 (x40 및 x100배율).
도 2a는 세포노화 과정의 hcMSC의 특징을 베타-갈락토시다제 염색을 통해 관찰한 결과이다.
도 2b는 세포노화 과정의 hcMSC의 특징을 카베올린-1에 대한 면역형광 염색을 통해 관찰한 결과이다.
도 2c는 세포노화 과정의 hcMSC의 분자 마커의 발현을 역전사 PCR로 관찰한 결과이다.
도 2d는 세포노화 과정의 hcMSC 표면 마커 발현의 변화를 유세포분석으로 관찰한 결과이다.
도 3a 및 3b는 hcMSC 세포에 대한 UPLC-Q-TOF-MS로 관찰한 이온 크로마토그램 결과이다.
도 4는 hcMSC의 대사체를 PCA로 분석한 결과이다.
도 5는 도 4에 따른 대사체 분석 결과의 평균 및 분산을 히스토그램으로 나타낸 결과이다.
도 6은 도 4에 따른 대사체 분석 결과의 평균 및 분산을 스캐터 플롯으로 나타낸 결과이다.
도 7a 및 7b는 LPC 16:0 표준물질의 MS/MS 스펙트럼 결과이며, 충돌에너지는 10-50 eV이다.
도 8a 및 8b는 LPC 18:0 표준물질의 MS/MS 스펙트럼 결과이며, 충돌에너지는 10-50 eV이다.
도 9a 및 9b는 hcMSC의 노화과정에서 발현량에 변화를 나타낸 내인성 LPC 16:0 의 MS/MS 스펙트럼 결과이며, 충돌에너지는 10-50 eV이다.
도 10a 및 10b는 hcMSC의 노화과정에서 발현량에 변화를 나타낸 내인성 LPC 18:0 의 MS/MS 스펙트럼 결과이며, 충돌에너지는 10-50 eV이다.
도 11a 및 11b는 hcMSC의 노화과정에서 발현량에 변화를 나타낸 내인성 LPC 18:1 의 MS/MS 스펙트럼 결과이며, 충돌에너지는 10-50 eV이다.
도 12a 및 12b는 hcMSC의 노화과정에서 발현량에 변화를 나타낸 내인성 LPC 20:4의 MS/MS 스펙트럼 결과이며, 충돌에너지는 10-50 eV이다.
도 13a 및 13b는 hcMSC의 노화과정에서 발현량에 변화를 나타낸 내인성 LPC 22:5 의 MS/MS 스펙트럼 결과이며, 충돌에너지는 10-50 eV이다.
도 14a 및 14b는 LPE 16:0 표준물질의 MS/MS 스펙트럼 결과이며, 충돌에너지는 5-25eV이다.
도 15a 및 15b는 LPE 18:0 표준물질의 MS/MS 스펙트럼 결과이며, 충돌에너지는 5-25 eV이다.
도 16a 및 16b는 hcMSC의 노화과정에서 발현량에 변화를 나타낸 내인성 LPE 22:4의 MS/MS 스펙트럼 결과이며, 충돌에너지는 5-25 eV이다.
도 17a 및 17b는 hcMSC의 노화과정에서 발현량에 변화를 나타낸 내인성 LPE 22:5의 MS/MS 스펙트럼 결과이며, 충돌에너지는 5-25 eV이다.
도 18a 및 18b는 hcMSC의 노화과정에서 발현량에 변화를 나타낸 내인성 LPE 22:6의 MS/MS 스펙트럼 결과이며, 충돌에너지는 5-25 eV이다.
도 19는 세포계대수의 진행에 따른, 선별된 MSC 노화 마커의 발현을 비교한 그래프이다.

본원은 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 및 라이소포스파티딜에탄올아민 (lysophosphatidylethanolamine, LPE)가 성체줄기세포의 배양에 있어, 줄기세포의 노화의 진행을 검출하는 표지자로 작용할 수 있다는 발견에 기초한 것이다.

세포의 노화 또는 세포성 노화(Cellular senescence)란 세포의 계대수 증가에 따라 세포의 복제능과 활성 전반의 변화에 의해 나타나는 표현형으로, DNA와 단백질 그리고 내인성 대사체 발현의 전반에 걸쳐 복잡한 조절을 받게 되며, 궁극적으로는 증식을 멈추게 된다.

성체줄기세포는 개체로부터 얻을 수 있는 양이 적어 인비트로에서 인위적인 증폭이 필수적이며, 분화능력을 잃지 않은 상태에서 증식시키기 위해, 세포 배양과정에서 계대수가 증가에 따라 세포의 활성과 특징을 모니터링 하는 것이 필수적이며, 본원의 표지자는 성체줄기세포 노화검출에 사용될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 중간엽줄기세포 (Mesenchymal Stem Cell)의 노화 검출에 사용된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "중간엽줄기세포"는 골수(bone marrow), 혈액, 진피 및 골막에서 분리되는 줄기세포로서, 다양한 세포 예컨대 지방세포, 연골세포 및 뼈세포 등으로 분화할 수 있는 전능성 또는 다능성 세포를 의미한다. 상기 중간엽줄기세포는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간 유래이다.

본원에서 용어 “마커 또는 표지자”란 노화의 개시 또는 진행 또는 노화된 세포를 노화가 진행되기 전의 세포와 구분하여 판별할 수 있는 물질로, 노화가 개시, 진행 또는 완결된 세포, 조직이나 부위에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 단백질 또는 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본원의 일 구현예에서는 세포의 노화에 따라 그 발현이 증가하는 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 및 라이소포스파티딜에탄올아민 (lysophosphatidylethanolamine, LPE)을 포함한다.

본원에서 “검출 또는 판별”이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 농도 측정을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.

본원에 따른 생체 표지자는 하기 화학식 1의 LPC 또는 화학식 2의 LPE 또는 그 유도체이다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서 R1 및 R2는 C16 내지 C22의 포화 또는 불포화 지방산 또는 H이다. 본원에 따른 일 구현예에서, LPC 또는 그 유도체는 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 16:0; LPC 18:0; LPC 18:1; LPC 20:4; 및 LPC 22:5을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

[화학식 2]

상기 화학식 2에서 R1 및 R2는 C22의 포화 또는 불포화 지방산 또는 H이다. 본원에 따른 일 구현예에서, LPE 또는 그 유도체는 라이소포스파티딜에탄올아민 (lysophosphatidylethanolamine, LPE) 22:4; LPE 22:5; 및 LPE 22:6을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 LPC 또는 LPE 또는 그 유도체는 공지된 다양한 방법을 통해 검출될 수 있으며, 당업자수준에서 적절한 검출방법을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 The Analyst 8th June 2001, Volume 126, Issue 7, pp 1042-1050을 참조할 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서는 LPC 또는 LPE 또는 그 유도체를 특이적으로 인식하는 수용체, 리간드, 기질, 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 이용하여 검출된다. 상기 검출용 물질은 항체분석, 화학발광분석, 또는 액체크로마토그래피질량분광분석방법 등에 사용될 수 있으며, 당연히 상기 방법이 본원에 따른 표지자 검출에 사용될 수 있다.

본원 일 구현예에 따르면 질량분석법(Mass spectrometry)를 이용하여 표지자를 검출할 수 있으며, 예를 들면 Applied Biochemistry and Biotechnology Jul-Sep 2000, Volume 88, Issue 1-3, pp 33-44을 참조할 수 있다.

또 다른 구현예에서는 항체 분석법이 사용될 수 있다. 항체 분석은 본원에 따른 표지자를 특이적으로 인식하는 물질, 예를 들면 폴리클로날항체, 모노클로날 항체, 수용체, 리간드, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체를 이용하여 분석하는 것으로, 예를 들면, ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay) 등과 같은 샌드위치 방식의 면역분석법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 막, 슬라이드 또는 마이크로타이터플레이트에 결합된 제1 항체에 생물학적 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 ³H 또는 ¹²⁵I와 같은 방사선 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 단백질은 정성 또는 정량적으로 검출 할 수 있다.

다른 구현예에서는 항원 항체 결합을 통해 마커를 간단하게 검출할 수 있는 Ouchterlony 플레이트, 웨스턴블랏, Crossed IE, Rocket IE, Fused Rocket IE, Affinity IE와 같은 면역 전기영동 (Immuno Electrophoresis)이 사용될 수 있다.

이러한 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 항원-항체반응, 상기 표지자에 특이적으로 결합하는 기질, 펩타이드 앱타머, 상기 표지자와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자와의 반응을 통해 검출될 수 있거나, 또는 질량분석기를 이용할 수 있다.

본원의 마커의 검출을 위해 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자와 함께 사용될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, latest edition 등에 기재되어 있다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 노화 전 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 노화여부 또는 노화의 단계를 검출할 수 있다.

본원의 마커의 검출은 질량분석법(Mass spectrometry)를 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들면 (Kim, et al. 2010 J Proteome Res. 9: 689-99; Anderson, L et al. 2006. Mol Cell Proteomics 5: 573-88.)를 참조할 수 있다. 한 구현예에서는 예를 들면 Triple Quadrupole LC-MS/MS 등을 이용한 다중반응모니터링 (Multiple reaction monitoring, MRM) 기술이 사용된다. MRM은 시료 중에 존재하는 미량의 바이오마커와 같은 표지 물질을 정량적으로 정확하게 다중 측정할 수 있는 방법으로 제1 질량필터 (Q1)를 이용하여 이온화원에서 생성된 이온 단편들 중 전구이온 또는 모이온을 선택적으로 충돌관으로 전달한다. 이어 충돌관에 도달한 전구이온은 내부 충돌기체와 충돌하여, 쪼개져 산물이온 또는 딸이온을 생성하여 제2 질량 필터 (Q2)로 보내지고, 여기서 특징적인 이온만이 검출부로 전달된다. 이런 방식으로 목적하는 성분의 정보만을 검출할 수 있는 선택성 및 민감도가 높은 분석방법이다. 예를 들면 Gillette et al., 2013, Nature Methods 10:28-34에 기재된 것을 참조할 수 있다.

본원에 따른 다른 구현예에서는 마커의 검출에 액체크로마토그래피 질량 분석법이 사용된다. 또한 상기 액체크로마토그래피 질량 분석법의 데이터는 단백질이나 펩타이드에 대한 표지 없이 질량분석기의 정확한 분자량 값과 액체크로마토그래피에서 펩타이드들이 분리되는 머무름 시간의 재현성을 기초로 분석하는 Selected Ion Monitoring (SIM) 또는 MRM이 이용될 수 있다.

세포의 노화 여부 또는 노화 단계를 결정은 예를 들면 하기와 같이 수행될 수 있다. 노화 전 대조군에서 해당 마커의 정상범위의 임계값 (cutoff) (증가하는 경우에는 상한치 / 감소하는 경우에는 하한치)을 결정하여, 노화가 의심되거나 또는 노화 여부의 검출이 필요한 세포에서 임계값과 비교하여 변동한 경우, 즉 증가 또는 감소한 경우, 노화로 판별할 수 있다. 예를 들면 생체 표지자의 양이 임계값보다 약 1.5 배이상 증가한 경우 노화가 개시된 것으로 판단할 수 있다. 노화의 단계는 노화 전과 후로 구분할 수 있으며, 이 때의 임계값이 1.5배 이상 증가 또는 감소한 경우 노화가 진행된 것으로 판단할 수 있다.

하지만 임계값 보다 증가 또는 감소여부 및 이를 근거로 한 판단은 다양한 요소, 예를 들면 세포의 유래, 세포의 종류, 세포가 유래된 대상체의 성별, 나이 등의 특성, 배양방법, 분석방법 및/또는 장비 등에 따라 다양할 수 있으며, 당업자라면 이러한 사항을 고려하여 적절한 값을 정할 수 있을 것이다.

본원에 따른 검출 방법은 단독으로 또는 노화를 검출할 수 있는 기타 공지된 방법과 함께 사용될 수 있다.

또한 본원에 따른 마커는 하나 또는 두 개 이상의 조합, 예를 들면 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 여섯 개, 일곱 개 또는 그 이상의 조합으로 사용될 수 있으며, Logistic regression 분석과 같은 방법을 통해 목적하는 민감도 및 특이성을 만족하는 마커의 조합을 선별할 수 있다.

다른 측면에서 본원은 또한 본원에 따른 조성물을 포함하는 노화 검출용 키트를 제공한다. 본원의 키트는 본원에 따른 노화 표지 마커의 정량 및/또는 정성적 분석을 통해, 노화의 개시 또는 진행 정도를 판단할 수 있다.

본 발명의 키트는 상술한 다양한 검출 방법에 사용될 수 있다. 예를 들면 본 발명에서 키트의 종류의 예로는 질량분석, 면역크로마토그래피 스트립 키트, ELISA키트, 화학발광분석용 키트 및 루미넥스(luminex®)키트 등을 들 수 있다. ELISA 키트는 생체 표지자에 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 생체 표지자에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 생체 표지자에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 모노클론항체, 폴리클론항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

루미넥스 키트는 소량(10-20 ㎕)의 환자 시료를 전 처리하지 않은 상태에서 최대 100종류의 분석물을 동시에 측정할 수 있는 대용량(high-throughput) 정량분석방법으로서 감도가 우수하고(pg 단위), 빠른 시간내에 정량이 가능하여(3-4시간), 기존의 ELISA나 ELISPOT을 대체할 수 있는 분석방법이다. 상기 루미넥스 어세이는 96-웰 플레이트에 있는 각각의 웰에서 100가지 이상의 생물학적 시료를 동시에 분석할 수 있는 멀티플렉스 형광 마이크로플레이트 분석방법으로 두 종류의 레이져 검출기를 이용하여 실시간으로 신호전달을 진행시킴으로 100개 이상의 다른 색깔 군의 폴리스티렌 비드(polystyrene bead)를 구별하여 정량한다. 상기 100개의 비드는 다음과 같은 방법으로 구별되도록 구성된다. 한쪽은 붉은 형광 비드(red fluorescence bead)가 열 단계 이상으로 나뉘어 있고, 다른 한 쪽은 오렌지 형광 비드(orange fluorescence bead)가 열 단계로 나뉘어 강도의 차이를 보이며 그 사이의 비드들은 레드와 오렌지 색의 비율이 각각 다른 비율로 섞여 있어 전체적으로 100개의 색-코드 비드 세트(color-coded bead set)를 구성하고 있다. 또한 각각의 비드에는 분석하고자 하는 물질에 대한 항체가 부착되어 있어 이를 이용한 면역항체반응으로 생체표지자의 정량이 가능하다.

본 발명의 루미넥스(Luminex) 어세이를 수행할 수 있는 루미넥스(Luminex) 키트는 생체 표지자에 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 생체 표지자에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 표지자에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 루미넥스 키트는 대조군 물질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 루미넥스 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 미세입자(micro particle)와 접합된 항체일 수 있으며, 또한 상기 미세입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)일 수 있다.

다른 양태에서 본원은 성체줄기세포의 노화를 억제할 수 있는 물질의 선별방법에 관한 것이다. 본원에 따른 마커는 노화가 개시된 성체줄기세포에서 그 양이 증가하는 것으로, 성체 줄기세포의 노화를 억제하는 물질의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.

본원에 따른 방법은 성체줄기세포를 시험물질과 접촉시키는 단계; 상기 시험물질과 접촉 후, 상기 성체줄기세포에서 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 16:0; LPC 18:0; LPC 18:1; LPC 20:4; LPC 22:5; 라이소포스파티딜에탄올아민 (lysophosphatidylethanolamine, LPE) 22:4; LPE 22:5; 및 LPE 22:6 중 하나 이상의 물질을 정량하는 단계; 및 상기 물질의 양을 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군 세포 또는 상기 시험물질과 접촉 전의 대조군 세포에서 정량된 상기 하나 이상의 물질의 양과 비교하여, 상기 물질의 양이 변동 예를 들면 증가된 경우, 상기 시험물질을 성체줄기세포 노화 억제용 물질로 선별하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 성체줄기세포 및 정량을 위한 검출은 앞서 언급한 바와 같다.

본 방법에서 사용되는 세포의 종류 및 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다. 실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재하에서 본원에 따른 마커의 감소를 가져오는 물질을 후보물질로 선별한다. 대조군과 비교 약 99% 이하 감소, 약 95% 이하 감소, 약 90% 감소, 약 85% 감소, 약 80% 감소, 약 75% 감소, 약 70% 감소, 약 65% 이하 감소, 약 60% 이하 감소, 약 55% 감소, 약 50% 이하 감소, 약 45% 이하 감소, 약 40% 이하 감소, 약 30% 이하 감소, 약 20% 이하 감소를 의미하나, 이를 벋어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.

본원의 "시험물질"은 상술한 바와 같은 성체줄기세포의 노화를 억제할 것으로 기대되는 물질을 의미하여, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물), 또는 바이오의약품(예컨대, 단백질, 항체, 펩타이드, DNA, RNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNAi, 앱타머, RNAzyme 및 DNAzyme), 또는 당 및 지질 등을 포함하나 이로 한정하는 것은 아니다. 상기 시험물질은 2개 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 6개, 10개, 12개, 20개 이하 또는 20개 초과 예컨대 50개 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있으며 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다. 시험 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, “1-비드 1-화합물” 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.

본원에 따른 일 구현예에서 시험물질은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.

또한 예를 들면 바이올로직스가 스크리닝에 사용될 수 있다. 바이올로직스는 세포 또는 바이오분자를 일컫는 것으로, 바이오분자란, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 생체내 및 생체외에서 세포 시스템 등을 이용하여 생산된 물질을 일컫는 것이다. 바이오분자를 단독으로 또는 다른 바이오분자 또는 세포와 조합으로 제공될 수 있다. 바이오분자는 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 항체, 또는 기타 혈장에서 발견되는 단백질 또는 생물학적 유기물질을 포함하는 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

본 실시예에 사용된 실험방법은 하기와 같다.

중간엽줄기세포의 분리 및 배양

중간엽줄기세포 (Human clonal mesenchymal stem cells)를 인간 골수(BM)로부터 채취하여 층분리 배양법 (subfractionation culturing method) 으로 분리하였다 (Song SU, et al . (2008) Stem Cells Dev 17(3):451-461). 상기 실험은 인하대학교의 의학연구윤리심의위원회의 허가된 프로토콜에 따라 수행되었으며, 각 환자로부터 충분한 설명에 근거한 서면동의를 수득하였다. 분리된 중간엽줄기세포는 각각 D103 및 D106으로 명명되었으며 10%의 열로 불활성화된 FBS (fetal bovine serum)와 1% 항생제 및 항진균제를 포함하는 DMEM (Dulbecco’s modified essential medium, Gibco BRL, USA)의 배지에서 5% CO₂ 배양기에 넣어 배양하였다. 각각 7, 15 및 20회까지 계대배양 후, 사용전까지 -80℃에서 냉동보관하였다.

중간엽줄기세포의 특성 분석

중간엽줄기세포의 특성은 세포 표면 마커의 발현과 분화능으로 확인하였다. 세포의 표면 마커들은 anti-CD14, anti-CD34, anti-CD44, anti-CD73, anti-CD90, anti-CD105, anti-HLA Class I, anti-HLA-DR, and anti-PODXL 항체 (상기 모든 항체는 BD Biosciences Pharmingen, USA로부터 구입)를 사용하여 6회 계대배양된 hsMSC에서 유세포 분석기 (FACSCalibur flow cytometer, BD Bioscience)를 이용하여 확인하였다.

분화능을 확인하기 위하여 세 종류의 세포 유형으로 각각 분화를 유도하였다. 비만세포 (adipocytes)로 분화시키기 위하여 4웰 플레이트에 6x10⁴ cells/well 의 밀도로 분주한 후 10% calf serum, 10^-7M dexamethasone (DEX;Sigma,USA), 10mg/mL insulin, 0.5mM 1-methyl-3-isobutylxanthine (IBMX; Sigma), 및 50 mg/mL indomethacine (Sigma)을 포함하는 DMEM에서 배양하여 4-5일 후에 비만세포로의 분화를 확인하였다. 이어 세포를 4% 포름알데히드로 고정한 후 오일레드 O 로 30분간 염색한 후 헤마톡실린으로 10분간 염색하여 확인하였다. 골세포로 분화시키기 위하여 같은 방식으로 세포를 분주한 후, 골세포 분화 배지 (10% FBS, 50μg/mL 아스코르브산 (Sigma), 10^-8M DEX, 및 10mM ß-glycerophosphate을 포함하는 α-MEM)에서 3일간격으로 배지를 교환하면서 3주동안 배양하였다. 이어 세포를 4% 포름알데히드로 고정한 후 알리자린 레드 S 로 30분간 염색하여 확인하였다. 연골조직으로 분화시키기 위하여 펠렛 배양법을 사용하였다. 15mL 시험관에 2.0x10⁵ hcMSC를 넣고, 세포를 침강시켰다. 이어 세포를 500μl의 혈청이 포함되지 않은 연골분화배지 (10 ng/mL TGF-ß1 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), 10 ng/mL TGF-b3 (R&D Systems), 및 1% insulin-transferrin-selenious acid premix (BD Biosciences)를 포함하는 α-MEM)에서 3일간격으로 배지를 교환하면서 3주동안 배양하였다. 세포 펠렛을 OCT 화합물 (Sakura Finetek, USA)에 포매하고 냉동한 후 8 mm 절편을 제작한 후 사프라닌 O로 염색하였다.

β-Gal 염색 및 면역형광염색 분석

노화에 따라 증가하는 SA-β-gal(senescence-associated β-galactosidase) 활성을 조사하기 위하여 SA-β-gal 염색키트 (Cell Biolabs, USA)를 제조자의 방법대로 이용하여 줄기세포를 염색한 후 광학현미경을 이용하여 염색 결과를 확인하여 세포의 노화 여부를 확인하였으며, 파란색의 세포가 노화된 세포를 나타낸다.

면역형광 염색을 위해, hcMSC 세포를 슬라이드 글라스에 분주 한 후 4% 파라포름알데하이드로 고정한 후 0.1% triton X-100로 투과성 처리하였다. 이어 세포를 5% 정상 염소 혈청으로 실온에서 30분간 차단한 후 항-카베올린-1 항체 (Cell signaling Technology, USA)로 4℃에서 밤새 배양하였다. 이어 세포를 0.1% Tween 20을 포함하는 TBS으로 세척한 후 FITC-conjugated secondary antibody (Molecular Probes, USA)로 실온에서 1시간 배양하였다. F-actin의 경우 세포를 AlexaFluor 597-conjugated phalloidin (Molecular Probes)로 실온에서 30분간 배양하였다. 핵은 4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Molecular Probes)로 염색하였다. 세척 후 세포를 마운트한 후 콘포칼현미경 (Olympus FluoView FV1000, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.

면역블랏의 경우, 상이한 계대수의 hcMSC 세포를 융해완충액 (10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0), 1% triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM PMSF, 및 protease inhibitor cocktail solution)에서 융해한 후, 전기영동 (SDS-PAGE) 후 PVDF 막으로 전달하였다. 이어 막을 5% 무지방우유로 차단한 후 각 항체와 배양한 후 Chemical luminescence 키트로 발색한 후 LAS4000 mini (Fuji PhotoFilm, Japan)에서 가시화하였다.

RT-PCR (Reverse transcription-polymerase chain reaction)

hcMSC에서 easy-Blue RNA 추출시약 (Intron Biotechnology, Korea)을 제조자의 방법대로 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 이어 1mg의 총 RNA를 주형으로 하여 AccuPower cDNA synthesis kit (Bioneer, Korea)를 제조자의 방법대로 사용하여 cDNA를 합성한 후 PCR을 수행하였다. PCR은 AccuPower cDNA synthesis kit (Bioneer)을 사용하였으며 PCR에 사용된 프라이머와 조건은 표 1과 같다. 증폭산물은 SyberSafe를 포함하는 1% 아가로스 젤에서 전기영동 후 LAS4000 mini로 가시화 하였다.

[표 1]

중간엽줄기세포로부터 내인성 대사체 추출

실험은 Yanes O, et al. (2010) Nat Chem Biol 6(6):411-417에 기재된 방법대로 수행하였다. 요약하면 약 삼백만개의 배양한 중간엽줄기세포에 차가운 아세톤 600 μL를 넣고 섞은 후 액체 질소에 1분간 넣어 얼렸다가 실온에서 녹인 후 10분간 초음파 처리를 총 번 반복하였다. 이어 -20℃에 1시간 보관 후 원심 분리하여 상층액을 취하였다. 남은 잔여물에 메탄올/물/포름산 (86.5/12.5/1.0) 혼합액을 400 μL 넣고 섞은 후 초음파 추출을 수행한다. -20℃에 1시간 보관 후 원심 분리하여 상층액을 이미 얻은 상층액과 합하여 건조하였다. 잔여물에 100 μL의 95% 아세토니트릴/물을 넣어 섞은 후 13,000rpm에서 원심분리하여 상층액을 분석에 사용하였다. 시료 자동 분주기에서 시료는 4℃에서 보관되었으며, 시료별로 각 3회 반복 실험을 수행하였다 (n=3).

액체크로마토그래피 (Liquid Chromatography-MS (LC-MS)

UPLC system (Waters) Acquity™ UPLC column (BEH C18, 1.7 μm, 2.1 mm x 100 mm) 및 micrOTOF-QII mass spectrometer (Bruker Daltonics, Germany)를 사용하여 분석을 수행하였다. 이동상으로 0.1 % 포름산을 포함한 물과 0.1 % 포름산을 포함한 아세토니트릴을 각각 사용하며 유속 0.2 mL/min, 컬럼 온도 40℃에서 분석하였다. 분석 과정에서 기기적인 편차를 보정하기 위하여 시료를 임의의 순서로 분석하였으며 전체 시료의 18개 혼합물을 QC (quality control) 시료로 만들어 반복 분석하여 재현성을 확인하였다. 질량분석기의 분석 범위는 50 ~ 1000 m/z로 하였으며 모세관 전압 (capillary voltage) 4.5 kV, 분무기 압력 (nebulizer pressure) 1.2 Bar 로 조절하였다. 200℃ 건조 가스 유속은 8.0 L/min 이며 쿼드로폴(quadrupole)과 충돌셀을 최적화하여 쿼드로폴 이온 에너지를 15.0 eV, 충돌 에너지를 10.0 eV로 하였다. 충돌가스로는 고순도 질소 가스를 사용하였으며 정확성을 확보하기 위하여 리튬 포름산을 시료 주입 전에 주입하여 보정하였다.

측정된 결과는 MZmine 소프트웨어를 이용하여 보정하였다. 각 변수에 대하여 상대표준편차 (Relative standard deviation) % (RSD%)를 계산하였다 (Hu C, et al.(2011) PLoS One 6(5):e19423; 및 Dunn WB, et al. (2011) Nat Protoc 6(7):1060-1083).

데이터 처리

원자료는 MZmine 소프트웨어를 이용하여 분석하였다 (Pluskal T, et al. (2010) BMC Bioinformatics 11:395). 질량분석 과정에서 MS 스펙트럼은 m/z and intensity 수치 쌍으로 계산하였다 (noise level set at 10³, Centroid algorithm). 크로마토그램 구축을 위한 조건은 다음과 같다: minimum height; 1.5 × 10³ 및 m/z tolerance; 0.05. 피크 디콘볼루션은“Savitzky-Golay” function (minimum peak height ; 1.5 x 10³, derivative threshold level; 80%)을 사용하였으며, 피크 배열은“RANdom SAmple Consensus (RANSAC) aligner” 방법 (m/z tolerance ; 0.05, absolute retention time (RT) tolerance; 0.1 min, RANSAC iterations ; 10000)을 사용하였다. PCA (principal component analysis)는 계산된 피크 데이터를 사용하여 수행하였으며, 이를 csv file로 전환하여 사용하였다.

LPC 및 LPE에 대한 LC-Multiple reaction monitoring (MRM) 질량 분석

UPLC system (Waters) 및 micrOTOF-QII mass spectrometer (Bruker Daltonics)( positive ion mode)를 이용하여 MRM 방식으로 데이터를 수집하였다. 1-palmitoyl (C16:0) lysophosphatidylcholine (LPC), 1-stearoyl (C18:0) LPC, 1-palmitoyl (C16:0) lysophosphatidylethanolamine (LPE) 및 1-stearoyl (C18:0) LPE 는 Advanti Polar Lipids (Alabaster, USA)에서 입수하였다. 지질은 chloroform/methanol/water (65:35:8)에 용해하였다. 각 표준물질은 사용직전 메탄올 (1-> 10)에 용해하였다. MS/MS 분석에서 표적분자의 딸 이온들은 MRM을 이용하여 규명되었다. 전구이온 [M+H]은 다음과 같은 조건으로 선별되었다: LPC 16:0 : 496.3397, LPC 18:0 : 524.3710, LPE 16:0 : 454.2928 및 LPE 18:0 : 482.3241.

LPC의 경우 충돌에너지 (10, 20, 30, 40, 50 eV)를 점진적으로 적용하였다. 반면 LPE의 경우 다소 약한 충돌에너지 (5, 10, 15, 20, 25 eV)를 적용하였다. 분리 너비 (Isolation width)는 10.0 이었다. 모든 MS 및 MS/MS 베이스 피크 크로마토그램 (BPC), 스펙트럼 및 m/z 에러는 5 ppm 미만으로 칼리브레이션되었으며, DataAnalysis 4.0 (Bruker Daltonics)을 이용하여 수집하였다. 기타 크로마토그래피 조건은 상술한 바와 같다.

대사체 분석

모든 표적은 m/z 184 및 141 Da의 중성 손실을 갖는 lysophosphatidylcholine (LPC) 또는 lysophosphatidylethanolamine (LPE)에 대하여 규명되었다. 측정된 결과를 데이터베이스와 표준품을 이용하여 대사체로 변환하였다. 측정된 m/z 값 중 노화에 따라 발현이 변화한 것으로 나타난 값만을 선별하여 MS/MS 스펙트럼을 통해 구조를 예측하였다. 이후 예측된 결과를 바탕으로 표준품을 구매하여 분석하고 스펙트럼 결과를 비교하여 일치 여부를 확인하였다. LIPID MAPS (http://www.lipidmaps.org) 데이터베이스를 사용하였다.

실시예 1 hcMSC의 특징 규명

실험방법에 기재된 바와 같이 두 명의 기증자로부터 분리된 hsMSC 세포의 형태를 분석한 결과 도 1a와 같은 섬유모세포의 형태를 나타냈다. 또한 MSC의 표면마커인 CD44, CD73, CD90, CD105, HLA Class I, PODXL는 높은 수준의 발현이 확인되었으며 내피세포 또는 조혈세포의 마커인 CD14, CD34, CD45, HLA-DR 는 음성으로 나타났다 (도 1b). 분화능을 확인하기 위하여 분리된 세포를 비만세포, 골세포, 연골세포로 분화시키는 배지를 적용하여 분화를 시도한 결과 도 1c에 나타난 바와 같이, 각 비만세포 (오일레드 O), 골세포 (알리자린 레드 S), 연골세포 (톨루이다인 블루)로 성공적으로 분화하였다. 이러한 결과는 분리된 hcMSC가 MSC의 특성을 가지고 있음을 나타내는 것이다.

실시예 2 중간엽줄기세포의 노화 확인

분리된 두 갱의 중간엽줄기세포 주를 계대배양하며 노화를 유도하였다. 노화의 과정에서 발생하는 대사체의 발현을 확인하기 위하여 각각 계대횟수 7 (초기 단계; 높은 증식능), 15 (중간 단계; 노화전 낮은 증식능), 및 20 (후기단계; 노화 상태)에서 시료를 수집하여 저장하였으며 이 과정에서 노화 여부를 확인하기 위한 β-Gal 염색을 수행하였다. 도 2a에 나타난 바와 같이 β-Gal 염색이 되지 않은 계대 번호 7과 15에서는 노화가 크게 진행되지 않은 것을 확인하였으며 계대 번호 20의 세포는 강하게 염색이 되어 노화가 상당히 진행된 것으로 나타났다. 노화는 노화의 다른 마커인 카베올린-1 염색을 통하여도 확인하였다 (도 2b 참조).

또한 노화의 다른 증거로서 RT-PCR을 수행한 결과 계대 번호가 증가함에 따라 PCNA의 발현은 감소하였으며 p16^INK4a 와 p19^ARF 의 발현은 증가한 것으로 나타났다 (도 2c참조).

다음으로 세포의 노화에 따른 세포 마커의 변화를 유세포분석으로 관찰한 결과, 조혈모 줄기세포의 마커인 CD13, CD34, 및 CD45는 세포 노화에 영향을 받지 않는 것으로 나타났다 (도 2d 참조). 반면 MSC 마커는 노화에 따라 영향을 받는 것으로 나타났으며, D106에서 CD73 및 CD105의 발현은 계대횟수 15까지는 영향을 받지 않았으며, 20회에서 CD73의 평균 형광 강도 (MFI)는 유의적으로 감사하였으며 CD105는 검출되지 않았다. D103의 경우 계대횟수 15에서 CD73 and CD105는 검출되지 않았으며, 반면 20회에서 발현이 회복되었다. 이러한 결과는 표면마커의 발현 양상이 세포 노화과정 동안 다소 변동적인 것을 나타낸다.

실시예 3 내인성 대사체의 분석

노화와 관련된 내인성 대사체의 발현 변화를 조사하기 위하여, 계대횟수 7, 15 및 20의 세포를 이용하여 실험방법에서 기술한 바와 같이 대사체를 분석하였다. 실험은 각 시료에 대하여 3회 반복되었으며, 세포가 유래된 개인별 차이를 보정하기 위하여 각 공여자에서 유래된 두 개의 세포주를 이용하여 동일한 실험을 2회 수행하였다. 도 3에 나타난 바와 같이 양에 있어서 두 시료 간의 차이는 있지만, 주 피크 및 경향성은 일치하는 것으로 나타났다. 계대횟수 20에서 7 및 15와 비교하여 주 피크의 강도 및 표준 편차가 증가하는 것으로 나타났다.

이러한 결과는 검증하기 위해 세포 노화 전 및 후의 내인성 대사체를 PCA로 분석하였다. PCA는 분산을 최대로 하는 변량을 찾아 이로부터 데이터를 축약하여 데이터 개개의 정보를 보다 용이하게 표현해주는 분석방법으로, 원변수에의해 주성분변수를 구하고 주성분에의해 원변수의 변동을 조사하는 것이다.

PCA 분석에서 각 시료는 상이한 색의 점으로 표시되며, PCA 주성분 축인 PC1 및 2 상에 플랏팅하였다. 일부 시료는 클러스터를 형성하여 내인성 대사체의 조성이 유사한 것으로 나타났다. 계대횟수 7에서 15 및 20으로 노화가 진행되면서 방향성 있는 이동이 검출되었다. 또한 노화가 진행되면서 편차도 커지도 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본원에 사용된 hsMSC가 균질한 세포이기 때문에, 편차는 노화과정에서 나타난 것임을 제시하는 것이다.

즉 UPLC Q-TOF MS를 통해 얻은 데이터는 MZmine을 기반으로 한 보정을 거쳐 통계분석을 통하여 해석되었다. 데이터의 전체적인 경향을 파악하기 위하여 주성분 분석을 수행하였으며 이를 통하여 중간엽줄기세포가 노화되는 과정에서 같은 세포 간에 동질성이 변질되는 것을 확인하였다. 층분리 배양법을 통하여 배양되는 중간엽줄기세포는 단일세포로부터 시작된 클론 세포로서 배양 과정에서 고유의 특성을 균질하게 유지하는 장점이 있다. 그럼에도 불구하고 노화가 발생한 계대횟수 20의 시료가 세포 간 균질성을 상실한 것은 노화가 내인성 대사체 발현의 항상성을 유지하지 못하게 하면서 진행되는 과정임을 나타내는 것이다. 이를 근거로 분산검정을 수행하여 항상성이 크게 변화한 대사체를 마커로 선별하였다.

실시예 4 세포의 노화 지표 내인성 대사체의 동정

상기에서 선별한 대사체를 중심으로 동정을 수행하였다. 결과의 신뢰도 확보를 위하여 QC(quality control) 시료에서 재현성이 있는 것으로 측정된 대사체만을 대상으로 스펙트럼을 기반으로 한 구조분석을 수행하였다. 선별된 대사체 중 일부는 스펙트럼 상에서 m/z 184의 값을 갖는 피크를 보여 대사체 중 지방(lipid)계열 특히 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 계열임을 확인하였다. 이에 따라 분자량을 기준으로 표준품을 확보하여 동정을 수행하였다. 또한 나머지 대사체의 경우 스펙트럼 상에 '전구체 이온 -141 Da'의 특성을 갖는 피크를 보여 지방 계열 중 특히 라이소포스파티딜에탄올아민 (lysophosphatidylethanolamine, LPE) 임을 확인하고 분자량을 기준으로 표준품을 확보하여 동정하였다. 이때에 LPC와 LPE에 각각 10, 20, 30, 40, 50 eV의 충돌에너지와 5, 10, 15, 20, 25 eV의 충돌에너지를 주어 스펙트럼의 변화를 확인하였다. 결과는 도 7 내지 18과 하기 표 2에 기재되어 있다.

동정을 거쳐 검증된 내인성 대사체는 라이소포스파티딜콜린 ( lysophosphatidylcholine, LPC) 16:0, LPC 18:0, LPC 18:1, LPC 20:4, LPC 22:5, 라이소포스파티딜에탄올아민 (lysophosphatidylethanolamine, LPE) 22:4, LPE 22:5, LPE 22:6의 8개 물질로 이는 중간엽줄기세포의 노화과정에 따라 발현의 항상성이 깨지는 대사체인 것으로 확인되었다. 각 화합물의 명칭에서 숫자는 앞의 숫자는 탄소수, 뒤의 숫자는 이중결합의 수를 나타내며, 이중결합의 숫자가 0은 포화지방산을 나타낸다.

8개의 대사체는 기전적으로 세포가 산화적 스트레스 등의 손상을 받을 때에 발현이 변화되는 물질로 세포가 노화함에 따라 받는 손상으로 인한 발현의 변화로 해석되었다. 또한 본 지표 물질의 발현이 변화하는 경우 세포 주기 등에 영향을 미쳐 결과적으로 분화능 등의 표현형의 변화를 가져오는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명에서는 상기 8개 대사체를 중간엽줄기세포의 노화를 확인할 수 있는 지표물질로 개발하였으며 이를 토대로 향후 중간엽줄기세포의 노화 정도를 확인하여 배양을 조절하고 연구, 임상단계에서 양질의 성체 줄기세포를 사용할 수 있도록 하였다.

이러한 8개 마커의 발현량을 계대횟수 20과 비교하여 계대횟수 7 및 15에서의 퍼센트로 나타냈다. 결과는 도 19에 있으며, 모든 대사체가 노화 진행에 따라 발현량이 감소하는 것으로 나타났으며, 분산 (variance)을 에러바로 나타낸 결과, 노화에 따라 분산도 증가하는 것으로 나타났다.

[표 2]

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (10)

1. 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 16:0; LPC 18:0; LPC 18:1; LPC 20:4; LPC 22:5; 라이소포스파티딜에탄올아민 (lysophosphatidylethanolamine, LPE) 22:4; LPE 22:5; 및 LPE 22:6 및 그 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 지질의 검출 물질을 포함하는, 성체줄기세포 노화 검출용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포인, 성체줄기세포 노화 검출용 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 검출용 물질은 항체분석, 화학발광분석, 또는 액체크로마토그래피 질량분광분석방법에 사용되는 물질인, 성체줄기세포 노화 검출용 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 검출용 물질은 상기 지질을 특이적으로 인식하는 수용체, 리간드, 기질, 항체, 항체단편, 항체모방체, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함하는, 성체줄기세포 노화 검출용 조성물.
   
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 성체줄기세포 노화 검출용 키트.
   
6. 중간엽 줄기세포에서 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 16:0; LPC 18:0; LPC 18:1; LPC 20:4; LPC 22:5; 라이소포스파티딜에탄올아민 (lysophosphatidylethanolamine, LPE) 22:4; LPE 22:5; 및 LPE 22:6 및 그 유도체 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 지질을 검출하는 단계를 포함하는, 성체줄기세포 노화 판별 방법.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 성체줄기세포는 중간엽줄기세포인, 성체줄기세포 노화 판별 방법.
   
8. 제 6 항에 있어서, 상기 검출은 항체분석, 화학발광분석, 또는 액체크로마토그래피 질량분광분석방법 중 하나 이상에 의해 수행되는 것인, 성체줄기세포 노화 판별 방법.
   
9. 제 6 항에 있어서, 상기 방법은 상기 지질 중 하나 이상이 양이 대조군과 비교하여 상기 중간엽 줄기세포에서 증가한 경우, 상기 세포를 노화된 세포로 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 성체줄기세포 노화 판별 방법.
   
10. 성체줄기세포를 시험물질과 접촉시키는 단계;
    상기 시험물질과 접촉 후, 상기 성체줄기세포에서 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 16:0; LPC 18:0; LPC 18:1; LPC 20:4; LPC 22:5; 라이소포스파티딜에탄올아민 (lysophosphatidylethanolamine, LPE) 22:4; LPE 22:5; 및 LPE 22:6 중 하나 이상의 물질을 정량하는 단계; 및
    상기 물질의 양을 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군 세포 또는 상기 시험물질과 접촉 전의 대조군 세포에서 정량된 상기 하나 이상의 물질의 양과 비교하여, 상기 물질의 양이 변동된 경우, 상기 시험물질을 성체줄기세포 노화 억제용 물질로 선별하는 단계를 포함하는, 성체줄기세포 노화 억제 물질의 스크리닝 방법.

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