CN110982780A - 延长细胞的端粒的组合物以及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及延长细胞的端粒的外泌体、包含其的组合物以及其制备方法，其特征在于，包含选自TERT、TERF2、DKC1、TERF2IP、RFC1、RAD50、TERF1、PINX1、TNKS1BP1、ACD、NBN、HSPA1L、PARP1、PTGES3、SMG6、BLM、XRCC5、XRCC6、ERCC4、PRKDC、TEP1及β‑连环蛋白中的基因中的一种以上的基因产物。包含这种外泌体的组合物不仅仅能延长端粒，还可诱导细胞分裂，抗衰老、组织再生、伤口愈合以及疤痕愈合等的效果。并且，与现有的端粒延长用组合物相比，延长本发明的端粒的外泌体的制备方法具有制备简单，收率高，降低环境负荷的效果。

Description

延长细胞的端粒的组合物以及其制备方法
技术领域
本发明涉及延长细胞的端粒(telomeres)的外泌体、包含其的组合物以及其 制备方法，更详细地，涉及包含选自TERT、TERF2、DKC1、TERF2IP、RFC1、 RAD50、TERF1、PINX1、TNKS1BP1、ACD、NBN、HSPA1L、PARP1、PTGES3、 SMG6、BLM、XRCC5、XRCC6、ERCC4、PRKDC、TEP1及β-连环蛋白(β-Catenin) 中的基因的一种以上的RNA或蛋白质的、延长细胞的端粒的外泌体、包含其的 组合物以及直接或间接性地向细胞提供物理刺激以从上述细胞诱导延长端粒的 外泌体的方法。
背景技术
端粒(telomere)为染色体两端的脱氧核糖核酸(DNA)重复结构(人类中 为TTAGGG)。端粒与端粒蛋白(shelterin)复合体相结合形成保护帽，该保护 帽具有调节细胞的扩增能力并防止在细胞分裂时的染色体之间的结合及遗传信 息的丢失的作用。DNA聚合酶无法扩增3'末端，因此每次细胞分裂端粒均缩短 30bp至200bp。端粒缩短至短于阈值，接近编码DNA，且无法保持端粒的环(loop) 结构时，所暴露的端粒通过p53或p16INK4a信号传导体系被识别，从而导致细 胞分裂停止、衰老及死亡。
端粒可通过作为逆转录酶的端粒酶(telomerase)来实现直接延长，其中, 人类的端粒酶复合体由用作端粒合成的模板的RNA分子的TERC、作为催化亚 基的TERT、DKC1以及TEP1等的辅助蛋白构成。正常情况下，体细胞的端粒 酶活性几乎不存在，仅在需要活化分裂能力的干细胞以及祖细胞中才能检测到 高活性。
随着端粒变短，多个细胞的分裂停止时，则有可能发生各种问题，可出现 多种症状，尤其，典型的为衰老(aging)及退化(degeneration)。早期研究表 明，皮肤组织退化的先天性角化不良症(dyskeratosis congenita)以及缺乏血细 胞的再生障碍性贫血(aplastic anemia)等骨髓细胞的再生出现问题的疾病是因 有关保护端粒酶或端粒的端粒蛋白复合体的基因的突变等端粒保持功能异常而 出现。另一方面，最近的研究结果表明，患有高血压、代谢综合症、糖尿病、 痴呆症等有关衰老的疾病的患者的端粒比正常人短等，因此通过延长端粒的长 度可延缓衰老的可能性的研究逐渐获得说服力。并且，研究表明，在通常已知 为几乎不具有端粒酶的活性的体细胞中，通过提高体细胞中的端粒酶的活性可 激活再生活动，特别是，在需要补充因烧伤、负伤、衰老以及疾病引起的心肌、 肝、角膜、皮肤、血管、软骨及骨胳等的各种组织，免疫细胞，血液细胞等的 情况下具有效果。但是，还有研究结果表明，长端粒可成为癌症发病的危险因 素，例如，在持续过度表达可延长端粒的长度的基因的小鼠中产生许多癌细胞。 因此，若端粒仅可在有限的时间内被激活，则可减轻与各种衰老以及衰老相关 的症状，且不具有引发癌症的危险，可预期这种技术不仅可用于因上述的遗传 性缺陷引起的端粒异常的情况，而且还可用于其他再生医学领域方面。
根据如上所述预期的多种用途，已经设计了用于延长端粒的多个组合物。 在美国公开专利第2018-0280413号中公开了包含用于提高端粒酶活性的化合物 的药学组合物，但为此需要合成及提纯化合物的工序。并且，通过化学合成获 得的上述组合物中，合成中所需的起始材料(starting material)应为纯化状态， 而且在合成过程中产生对环境有害的各种副产物，并且，化合物具有在生物体 内代谢过程中产生副产物等的危险性。欧洲公开专利第2959005号中公开了编 码端粒酶的RNA，这不仅需要合成以及提纯工序，而且由于RNA为亲水性， 因此还需要通过递送体来递送至细胞内。因此，要求可更简单地制备且风险较 低、具有良好的效率的端粒延长用组合物。
发明内容
发明所要解决的问题
本发明为了解决上述的问题而提出，根据本发明一实施例的外泌体的特征 在于，包含选自TERT、TERF2、DKC1、TERF2IP、RFC1、RAD50、TERF1、 PINX1、TNKS1BP1、ACD、NBN、HSPA1L、PARP1、PTGES3、SMG6、BLM、XRCC5、XRCC6、ERCC4、PRKDC、TEP1及β-连环蛋白中的基因的一种以上 的核糖核酸(RNA)或蛋白质。
并且，本发明的另一实施例提供包含含有上述外泌体的细胞的端粒延长用 组合物。
并且，根据本发明的另一实施例的延长细胞的端粒的外泌体的制备方法的 特征在于，包括：直接或间接地向细胞提供物理刺激的步骤；将上述细胞及培 养基的混合物培养规定时间的步骤；以及从上述混合物分离外泌体的步骤，上 述直接提供刺激为对包含有细胞的培养基施加物理刺激，上述间接提供刺激为 对未包含细胞的培养基施加物理刺激之后，混合上述培养基和上述细胞。
本发明所要解决的技术问题不限于前述技术问题，本领域技术人员可以根 据以下的记载而明确地了解到未提及的其它技术问题。
用于解决问题的方案
作为用于实现上述的技术问题的技术方案，其特征在于，根据本发明一方 面的延长细胞的端粒的外泌体包含选自TERT、TERF2、DKC1、TERF2IP、RFC1、 RAD50、TERF1、PINX1、TNKS1BP1、ACD、NBN、HSPA1L、PARP1、PTGES3、 SMG6、BLM、XRCC5、XRCC6、ERCC4、PRKDC、TEP1及β-连环蛋白中的 基因的一种以上的RNA或蛋白质。
其中，本发明的特征在于，上述外泌体通过向细胞提供物理刺激来诱导而 成。
上述物理刺激的形式可以为选自超声波、热及光中的任意一种。
上述物理刺激可直接或间接地提供给细胞，上述直接提供刺激可以为对包 含有细胞的培养基施加物理刺激，上述间接提供刺激可以为对未包含细胞的培 养基施加物理刺激之后，混合上述培养基和上述细胞。
本发明的特征在于，提供可诱导上述外泌体的物理刺激的过程通过选自以 下方式中的任一种方式来执行：混合细胞和培养基之后，向上述混合物提供物 理刺激，或向培养基提供物理刺激之后，混合上述培养基和细胞，或向细胞提 供物理刺激之后，混合上述细胞和培养基，或向细胞提供物理刺激之后，混合 上述细胞和培养基之后，向上述混合物提供物理刺激，或向培养基提供物理刺 激之后，混合上述培养基和细胞之后，向上述混合物提供物理刺激，或分别向 细胞和培养基提供物理刺激之后，混合上述细胞及上述培养基，或分别向细胞 和培养基提供物理刺激之后，混合上述细胞及上述培养基之后，向上述混合物 提供物理刺激。
本发明的特征在于，上述物理刺激为超声波刺激，上述直接的超声波刺激 的强度为0.1W/cm2至3W/cm2，频率为20kHz至20MHz，持续时间为0.1秒钟 至20分钟，上述间接的超声波刺激的强度为1W/cm2至20W/cm2，频率为20kHz 至20MHz，持续时间为0.1秒钟至20分钟。
本发明的特征在于，上述物理刺激为热刺激，上述热刺激以将细胞在40℃ 至50℃的温度条件下暴露1分钟至10分钟之后，在0℃至4℃的温度条件下暴 露5秒钟至10秒钟的方式进行施加。
本发明的特征在于，上述光刺激通过照射选自激光或发光二极管 (light-emitting diode)光中的任意一种的、300nm至900nm波段的脉冲光束1 秒钟至10秒钟来进行施加。
本发明的特征在于，上述外泌体为在外泌体1×108个外泌体颗粒内包含 150ng以上的总RNA。
本发明的特征在于，上述外泌体为在外泌体1×108个外泌体颗粒内包含1μg 以上的总蛋白质。
本发明的特征在于，当在细胞中处理上述外泌体时，上述细胞的端粒酶(telomerase)活性增加。
本发明的特征在于，当在细胞中处理上述外泌体时，上述细胞的β-半乳糖 苷酶(β-galactosidase)活性降低。
根据本发明另一方面的细胞的端粒延长用组合物包含上述的外泌体。
其中，上述组合物中上述外泌体的浓度可以为106至1014个/ml。
根据本发明的另一方面的延长细胞的端粒的外泌体的制备方法包括：直接 或间接地为细胞提供物理刺激的步骤；将上述细胞及培养基的混合物培养规定 时间的步骤；以及从上述混合物分离外泌体的步骤，上述直接提供刺激为对包 含有细胞的培养基施加物理刺激，上述间接提供刺激为对未包含细胞的培养基 施加物理刺激之后，混合上述培养基和上述细胞。
其中，上述物理刺激的形式可以为选自超声波、热及光中任意一种。
本发明的特征在于，直接或间接性地为上述细胞提供物理刺激的过程通过 选自以下方式中的任一种方式来执行：混合细胞和培养基之后，向上述混合物 提供物理刺激，或向培养基提供物理刺激之后，混合上述培养基和细胞，或向 细胞提供物理刺激之后，混合上述细胞和培养基，或向细胞提供物理刺激之后， 混合上述细胞和培养基之后，向上述混合物提供物理刺激，或向培养基提供物 理刺激之后，混合上述培养基和细胞之后，向上述混合物提供物理刺激，或分 别向细胞和培养基提供物理刺激之后，混合上述细胞及上述培养基，分别向细 胞和培养基提供物理刺激之后，混合上述细胞及上述培养基之后，向上述混合 物提供物理刺激。
本发明的特征在于，上述物理刺激为超声波刺激，上述直接的超声波刺激 的强度为0.1W/cm2至3W/cm2，频率为20kHz至20MHz，持续时间为0.1秒钟 至20分钟，上述间接的超声波刺激的强度为1W/cm2至20W/cm2，频率为20kHz 至20MHz，持续时间为0.1秒钟至20分钟。
本发明的特征在于，上述物理刺激为热刺激，上述热刺激在以将细胞在40℃ 至50℃的温度条件下暴露1分钟至10分钟之后，在0℃至4℃的温度条件下暴 露5秒钟至10秒钟的方式进行施加。
本发明的特征在于，上述物理刺激为光刺激，上述光刺激通过照射激光或 发光二极管(light-emitting diode)光中的任意一种的、300nm至900nm波段的 脉冲光束1秒钟至10秒钟来进行施加。
本发明的特征在于，上述细胞分别选自由哺乳类来源的干细胞、祖细胞、 成纤维细胞、角质形成细胞或器官内组织细胞组成的组。
本发明的特征在于，上述培养基为选自培养基或分化诱导培养基。
本发明的特征在于，上述混合物的培养进行1小时至10天。
本发明的特征在于，分离上述外泌体的步骤可利用超离心分离、密度梯度、 过滤、尺寸排除色谱、免疫亲和分离、沉淀、基于微流体的分离方法中的一种 以上方法。
分离上述外泌体的步骤可包括通过对上述培养后的混合物进行离心分离来 获得上清液的步骤；用过滤器过滤上述上清液来获得滤液的步骤；以及浓缩上 述滤液的步骤。
本发明的特征在于，与从经过上述制备方法之前的细胞分泌的外泌体相比， 上述所分离的外泌体的TERT、TERF2、DKC1、TERF2IP、RFC1、RAD50、TERF1、 PINX1、TNKS1BP1、ACD、NBN、HSPA1L、PARP1、PTGES3、SMG6、BLM、 XRCC5、XRCC6、ERCC4、PRKDC、TEP1及β-连环蛋白中的一种以上的基因 表达量可以更高。
本发明的特征在于，当用上述所分离的外泌体处理细胞时，上述细胞的端 粒酶(telomerase)活性可增加。
本发明的特征在于，当用上述所分离的外泌体处理细胞时，上述细胞的β- 半乳糖苷酶(β-galactosidase)活性可降低。
上述延长细胞的端粒的外泌体的制备方法的特征在于，当用上述所分离的 外泌体处理细胞时，上述细胞的细胞迁移率可增加。
上述延长细胞的端粒的外泌体的制备方法的特征在于，当在组织中处理上 述所分离的外泌体时，可促进上述组织的再生。
上述延长细胞的端粒的外泌体的制备方法的特征在于，当在伤口中处理上 述所分离的外泌体时，可促进上述伤口的愈合。
上述延长细胞的端粒的外泌体的制备方法的特征在于，当在疤痕中处理上 述所分离的外泌体时，可促进上述疤痕的愈合。
上述延长细胞的端粒的外泌体的制备方法的特征在于，当用上述所分离的 外泌体处理细胞时，可对上述细胞具有抗衰老效果。
上述解决问题的手段仅为示例性的，不应解释为用于限制本发明。除了上 述的示例性实施例之外，附图以及发明内容中可存在附加的实施例。
发明效果
根据本发明一实施例的延长细胞的端粒的组合物与上述的延长端粒的组合 物相比制备简单。即现有的组合物中的化合物需要化学合成，但这不具有特异 性且需要经过又长又复杂的工序。与此相反，根据本发明一实施例的延长细胞 的端粒的方法可仅通过物理刺激来对细胞进行处理，就可促进端粒延长相关多 种因子的表达以及包含上述因子的外泌体的生产，且之后仅需要将以这种方式 分泌的外泌体从培养上述细胞的培养基中分离的工序，因此工序简单。并且， 细胞由双层脂质膜包围，因此若没有可向细胞内递送的载体，亲水性的核酸难 以进行在获得效果之前所需的细胞内流入步骤，因此额外需要将核酸负载到载 体上的步骤，与此相反，根据本发明的外泌体制备方法，获得被脂质膜包围的 状态的端粒延长相关因子，因此无需额外进行负载(Loading)。
并且，与以往公开的组合物相比，根据本发明一实施例的延长细胞的端粒 的组合物在效率及应用方法上更优异。即上述的增加端粒酶活性的化合物需要 以高浓度的化合物注入体内以呈现出足够的效果，与此相比，根据本发明一实 施例的延长细胞的端粒的外泌体能够以少量、局部涂布等无创方式适用就能够 呈现出效果。
并且，根据本发明一实施例的延长细胞的端粒的外泌体可诱导大量分泌含 有大量端粒延长相关因子的外泌体，因此在含有有用物质的细胞的外泌体的生 产方面产率更高。
并且，根据本发明一实施例的延长细胞的端粒的外泌体具有高稳定性。即， 化合物可在代谢过程中具有毒性等附加风险，尤其，上述的现有技术中的化合 物的处理量相当高(为每对象动物单位重量(kg)的mg水平)，并且在化学合 成过程中也产生不利于环境的废物等，然而根据本发明的方法的这种负担相对 较小。
另外，根据本发明一实施例的延长细胞的端粒的外泌体不仅能延长端粒， 还具有诱导细胞分裂并抗衰老以及组织再生效果，因此，通过这些可预期不仅 可改善及预防因端粒长度变短而产生的问题，还可改善及预防衰老以及组织再 生相关的多种疾病和症状。
本发明的效果并不限于上述效果，而应当被理解为包括可通过记载的本发 明的详细的说明或者记载于权利要求书的发明的结构来推测的所有效果。
附图说明
图1为本发明的实施例1的直接超声波刺激处理以及培养后的根据细胞种 类的端粒长度变化分析数据。
图2为根据本发明的实施例1的超声波刺激处理，根据实施例2的热刺激 处理，根据实施例3的发光二极管光刺激处理，以及各自培养的后的根据各物 理刺激处理的端粒长度变化分析数据。
图3为本发明的实施例5的间接超声波刺激处理以及培养后的端粒长度变 化分析数据。
图4为本发明的实施例1的超声波刺激处理以及培养后的根据培养基种类 的端粒长度变化分析数据。
图5为本发明的实施例1的超声波刺激处理以及培养后的根据超声波刺激 处理次数的端粒长度变化分析数据。
图6为本发明的实施例1的超声波刺激处理以及培养后的根据细胞种类的 TERT基因表达变化分析数据。
图7为对CB-HDF以及Adipo-MSC的本发明的实施例1的超声波刺激处理 以及培养后的TERT基因表达变化分析数据。
图8为对CB-HDF以及Adipo-MSC的本发明的实施例1的超声波刺激处理 以及培养后的β-连环蛋白基因表达变化分析数据。
图9为对CB-HDF以及Adipo-MSC的本发明的实施例1的超声波刺激处理 以及培养后的端粒酶活性变化分析数据。
图10为对CB-HDF以及Adipo-MSC的本发明的实施例1的超声波刺激处 理以及培养后的端粒荧光原位杂交(telomere FISH)检测数据。
图11为对CB-HDF的本发明的实施例1的超声波刺激处理以及培养后的 TERT以及Ki67的细胞荧光染色数据。
图12为对CB-HDF的本发明的实施例1的超声波刺激处理以及培养后的衰 老相关β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)活性分析数据。
图13为根据本发明的实施例5进行超声波处理的CB-HDF中的外泌体标记 表达分析数据。
图14为根据本发明的实施例5的、从CB-HDF分泌的外泌体按照各个颗粒 大小的纳米颗粒分析仪(Nanosight)分析数据。
图15为根据本发明的实施例5的、从CB-HDF分泌的外泌体的总数的 Nanosight分析数据。
图16为根据本发明的实施例5制备的外泌体内总RNA以及总蛋白质的量 的分析数据。
图17为根据本发明的实施例5制备的外泌体内的RNA的基因本体(Gene ontology)分析数据。
图18为根据本发明的实施例5制备的外泌体内的RNA的转录组测序 (RNA-seq)分析数据。
图19为根据本发明的实施例5制备的外泌体内的细胞增殖、端粒增加以及 抗衰老相关一部分RNA的定量即时聚合酶链锁反应(qPCR)分析数据。
图20为根据本发明的实施例5制备的外泌体内的TERT蛋白质的免疫荧光 分析数据。
图21为根据本发明的实施例5制备的外泌体的细胞处理的端粒长度变化分 析数据。
图22为根据本发明的实施例5制备的外泌体的细胞处理的各个细胞种类的 端粒长度变化分析数据。
图23为根据本发明的实施例5制备的外泌体的细胞处理后相关细胞内的端 粒荧光定量原位杂交(qFISH)检测分析数据。
图24为根据本发明的实施例5制备的外泌体的细胞处理后相关细胞内的 Tel-seq分析数据。
图25为根据本发明的实施例5制备的外泌体的细胞处理后相关细胞内的 RNA的基因本体分析数据。
图26为根据本发明的实施例5制备的外泌体的细胞处理后相关细胞内的RNA的转录组测序分析数据。
图27为根据本发明的实施例5制备的外泌体的细胞处理后相关细胞内的 TERTRNA以及蛋白质表达分析数据。
图28为根据本发明的实施例5制备的外泌体的细胞处理后相关细胞内的细 胞分裂标记分析数据。
图29为根据本发明的实施例5制备的外泌体的细胞处理后相关细胞内的、 根据外泌体各浓度的细胞分裂标记分析数据。
图30为根据本发明的实施例5制备的外泌体的细胞处理后相关细胞内的β- 半乳糖苷酶(β-galactosidase)活性分析数据。
图31为根据本发明的实施例5制备的外泌体涂布于小鼠耳部后相关部位 的、根据外泌体各浓度的端粒长度以及TERT RNA表达量分析数据。
图32为根据本发明的实施例5制备的外泌体涂布于小鼠耳部后相关部位 的、根据外泌体各处理时间的端粒FISH分析数据。
图33为根据本发明的实施例5制备的外泌体涂布于小鼠耳部后相关部位 的、根据外泌体各处理时间的细胞增殖相关基因的RNA以及蛋白质表达分析数 据。
图34为根据本发明的实施例5制备的外泌体涂布于小鼠耳部后相关部位 的、根据外泌体各处理时间的TERT免疫荧光分析数据。
图35为根据本发明的实施例5制备的外泌体的、根据各细胞处理浓度的伤 口愈合试验(wound healing assay)数据。
图36为根据本发明的实施例5制备的外泌体的、根据各生物体内(in vivo) 处理浓度的伤口愈合试验数据。
图37为根据本发明的实施例5制备的外泌体的小鼠皮肤涂布时组织渗透分 析数据。
图38为根据本发明的实施例5制备的外泌体处理早老症患者来源细胞时的 端粒相关分析数据。
图39为根据本发明的实施例5制备的外泌体处理早老症患者来源细胞时的 细胞增殖相关分析数据。
图40为根据本发明的实施例5制备的外泌体处理早老症患者来源细胞时的 β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)活性分析数据。
具体实施方式
以下，进一步详细说明本发明。但是，本发明可由多种不同形态实现，本 发明并不限定于在此说明的实施例，本发明仅由下文中所述的发明要求保护范 围来进行定义。
另外，本发明中使用的术语仅用于说明特定实施例，并且无意于限定本发 明。除非上下文另外明确指出，否则单数形式包括复数形式。除非有相反的记 载，在本发明的说明书全文中，“包括”一种构成要素意味着还可包括其他构 成要素，而不是排除其他构成要素。
并且，在本发明中，以基因名称使用的每个基因的固有名称为正式已知的 基因名称、常规使用的名称或其基因的产物的名称，例如，编码蛋白质的基因 的情况下为其蛋白质。
本发明的发明人曾在韩国授权专利第10-1855967号中公开了：一种可向细 胞以及培养基的混合物促进环境流入的物理刺激，接收上述物理刺激的混合物 可通过培养规定时间来对上述细胞进行重新编程，当利用从上述混合物获得的 外泌体处理细胞时，可获得重新编程的细胞。并且，表明其中重新编程的方向 与接收物理刺激的细胞或处理外泌体的细胞的种类无关，而是根据物理刺激时 的培养基的组成而表现不同。在随后分析上述细胞重新编程方法的效果的过程 中，证实了向细胞施加物理刺激，使得端粒延长相关基因簇的表达增加。通过 对此的进一步研究，与所公开的发明不同地，证实了可通过物理刺激来延长端 粒(不仅无关于实验的细胞的种类，还无关于培养基的组成)，由此得出的结 论为端粒延长由物理刺激本身诱导，而不是环境流入。此时，证实了不仅多个 端粒延长相关因子的表达增加，而包含这些因子的外泌体的分泌也大大增加， 并以此公开了新的发明。
本发明的特征在于，根据本发明一方面的延长细胞的端粒的外泌体包含选 自TERT、TERF2、DKC1、TERF2IP、RFC1、RAD50、TERF1、PINX1、TNKS1BP1、 ACD、NBN、HSPA1L、PARP1、PTGES3、SMG6、BLM、XRCC5、XRCC6、 ERCC4、PRKDC、TEP1及β-连环蛋白中的基因的一种以上的RNA或蛋白质。 最优选地，上述外泌体可包含上述所有基因的RNA或蛋白质。
其中，端粒酶逆转录酶(TERT，Telomerase reverse transcriptase)为具有端 粒酶的催化活性的亚基(subunit)，端粒重复结合因子1(TERF1，Telomeric repeat bindingfactor 1)以及端粒重复结合因子2(TERF2，Telomeric repeat binding factor 2)识别端粒序列。已知角化不良素假尿苷合酶1(DKC1，Dyskerin pseudouridine synthase 1)、复制因子C亚基1(RFC1，Replication factor C subunit 1)、端锚 聚合酶1结合蛋白1(TNKS1BP1，Tankyrase 1binding protein 1)、NBN(Nibrin)、 热休克蛋白1样蛋白(HSPA1L，Heat shock protein family A member 1like)、 聚ADP核糖聚合酶1(PARP1，Poly ADP-ribose polymerase 1)、前列腺素E合 成酶3(PTGES3，Prostaglandin Esynthase 3)、SMG6(Smg6同源物(Smg6 homolog)，无义介导的mRNA衰减因子(Nonsensemediated mRNA decay factor))、X射线修复交叉互补蛋白5(XRCC5，X-ray repair crosscomplementing 5)及X射线修复交叉互补蛋白6(XRCC6，X-ray repair crosscomplementing 6) 为在端粒的稳定化和保持方面是所需的。据报道，TERF2相互作用蛋白(TERF2IP，TERF2interacting protein)、RAD50(RAD50同源物(RAD50 Homolog)，双链断裂修复蛋白(Double strand break repair protein))为抑制端 粒重组，PIN2/TERF1相互作用端粒酶抑制剂1(PINX1，PIN2/TERF1-interacting telomerase inhibitor 1)介导TERF1以及TERT的核(nucleolus)内蓄积，帮助 TRF1结合于端粒酶，并在S基上抑制端粒酶活性。肾上腺皮质发育不良蛋白同 源物(ACD，Adrenocortical Dysplasia protein homolog)、切除修复交叉互补组 4(ERCC4，Excision repair cross-complementation group 4)、DNA激活蛋白激 酶催化亚基肽(PRKDC，Protein kinase，DNA-activated，catalytic subunit)为在 端粒的长度调节以及保护方面所需的，布卢姆综合征蛋白(BLM，Bloom syndromeprotein)在DNA合成时帮助端粒扩增，端粒酶相关蛋白1(TEP1， Telomerase associatedprotein 1)形成端粒酶复合体的一部分。β-连环蛋白为促进 TERT表达的转录调节因子。据报道，上述因子均具有端粒的延长以及稳定化效 果。包含如上所述的基因产物的、根据本发明的一方面的延长端粒的外泌体可 用于下文中所述的多种效果。
本发明的特征在于，上述外泌体可通过向细胞提供物理刺激来诱导而成。
上述物理刺激的形式可选自低频率、超声波、高频率、热、光、电磁波、 电波、拉伸(stretch)、压缩(compression)，优选地，可选自超声波、热及光 中的任意一种。
上述物理刺激可直接或间接地提供给细胞，上述直接提供刺激可为对包含 有细胞的培养基施加物理刺激，上述间接提供刺激可为对未包含细胞的培养基 施加物理刺激之后，混合上述培养基和上述细胞。
提供可诱导上述外泌体的物理刺激的过程为通过选自以下方式中的任一种 方式来执行：混合细胞和培养基之后，向上述混合物提供物理刺激，或向培养 基提供物理刺激之后，混合上述培养基和细胞，或向细胞提供物理刺激之后， 混合上述细胞和培养基，或向细胞提供物理刺激之后，混合上述细胞和培养基 之后，再向上述混合物提供物理刺激，或向培养基提供物理刺激之后，混合上 述培养基和细胞之后，再向上述混合物提供物理刺激，或分别向细胞和培养基 提供物理刺激之后，混合上述细胞及上述培养基，或分别向细胞和培养基提供 物理刺激之后，混合上述细胞及上述培养基之后，再向上述混合物提供物理刺 激。如上所述的物理刺激可以是对细胞通过直接/间接的方法执行一次以上，或 以上述方式中选择一种以上的组合来进行，随着次数的增加，外泌体的端粒延 长效果可以成比例的增加。在提供一次以上的物理刺激时，优选在每次的物理 刺激之间隔开时间间隔，以能使细胞能恢复。上述时间间隔为一日以上，更优 选为两日以上。
本发明的特征在于，上述物理刺激为超声波刺激，对于直接的上述超声波 刺激而言，强度为0.1至3W/cm2，频率为20kHz至20MHz，持续时间为0.1秒 至20分钟，对于间接的上述超声波刺激而言，强度为1至20W/cm2，频率为20kHz 至20MHz，持续时间为0.1秒至20分钟。更优选地，对于直接的上述超声波刺 激而言，强度为0.5至2W/cm2，频率为20kHz至2MHz，持续时间为0.1秒至 10分钟，对于间接的上述超声波刺激而言，强度为2至10W/cm2，频率为20kHz 至2MHz，持续时间为1秒至15分钟。
本发明的特征在于，上述物理刺激为热刺激，上述热刺激以将细胞在40℃ 至50℃的温度条件下暴露1分钟至10分钟之后，在0℃至4℃的温度条件下暴 露5秒钟至10秒钟的方式进行施加。
本发明的特征在于，上述光刺激是通过照射选自激光或发光二极管 (light-emitting diode)光中的任意一种的300nm至900nm波段的脉冲光束，且 照射1秒钟至10秒钟而执行，更优选地，照射3秒钟至7秒钟而执行。
本发明的特征在于，对于上述外泌体而言，在1×108个外泌体颗粒内包含 100ng以上的总RNA，优选地，包含150ng以上，更优选地，包含180ng以上。
本发明的特征在于，对于上述外泌体而言，在1×108个外泌体颗粒内包含 0.5μg以上总蛋白质，优选地，包含1μg以上，更优选地，包含1.2μg以上。
本发明的特征在于，当在细胞中处理上述外泌体时，上述细胞的端粒酶活 性增加。这种端粒酶活性的增加可导致在处理于细胞后端粒长度延长以及促进 细胞分裂。
本发明的特征在于，当在细胞中处理上述外泌体时，上述细胞的β-半乳糖 苷酶(β-galactosidase)活性降低。β-半乳糖苷酶是催化β半乳糖苷(β-galactoside) 水解为单糖的酶，溶酶体β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)在衰老的细胞(senescent cell)中过度表达并积累。其结果，在衰老的细胞中，β-半乳糖苷酶的活性高， 但是将根据本发明一实施例的延长细胞的端粒的外泌体处理于细胞时，上述酶 的活性减少，可判断为上述外泌体具有抗衰老效果。
根据本发明的另一方面的细胞的端粒延长用组合物包含上述的外泌体。
上述外泌体包含具有上述的端粒延长以及稳定化功能的各种因子的基因产 物，外泌体能随着血流移动，因此能将上述因子直接递送至细胞，从而可表现 出治疗效果，包含这种外泌体的组合物可用于需要这种基因的活性的个体的治 疗目的。例如，首先，可用于治疗或改善先天性角化不良症、再生障碍性贫血、 维尔纳综合征(Werner syndrome)、布卢姆综合征(Bloom syndrome)、共济 失调毛细血管扩张症(Ataxia–telangiectasia)、奈梅亨破裂综合征(NBS，Nijmegen breakage syndrome)、共济失调毛细血管扩张样综合征(Ataxia–telangiectasia-like syndrome)、肺纤维化(Pulmonary fibrosis)等已知的因端粒维持异常而发生的 疾病。除此之外，可用于治疗或改善因细胞的衰老及损失而出现的各种疾病及 症状，如痴呆症、共济失调、软骨以及骨骼的退化等的各种退行性疾病，包括如克罗恩病、慢性阻塞性肺疾病等的自身免疫性疾病，高血压、代谢综合症、 糖尿病、皮肤衰老、色素异常、脱发、皮肤衰老等。另外，可用于烧伤、伤口、 负伤、器官衰竭(organfailure)、器官损失、溃疡等各种损伤的快速再生。
其中，在上述组合物中，上述外泌体浓度可以为至少102个/ml，优选地， 可以为106至1014个/ml浓度。
本发明的特征在于，上述组合物可通过选自口服、静脉、肌肉、皮肤、硬 膜、透皮给药中的任意一种方法进行给药。优选地，上述组合物可进行皮肤或 透皮给药。上述组合物除了包含如上所述的有效给药量的外泌体之外，还可包 含药学上可包含的稀释剂、防腐剂、溶剂、乳化剂、佐剂(adjuvant)、缓冲剂 以及载体。可包含在上述组合物中的成分具有缓冲液(如中性缓冲盐水、磷酸 盐缓冲盐水等)；碳水化合物(如葡萄糖，甘露糖，蔗糖、右旋糖酐、甘露醇 等)；氨基酸(多肽、甘氨酸等)；螯合剂(抗氧化剂、乙二胺四乙酸(EDTA)、 谷胱甘肽等)；佐剂(氢氧化铝等)；以及防腐剂等。
本发明所属领域的普通技术人员已知上述给药途径的选择以及根据各个给 药途径的附加成分以及其组成，因此省略对其的详细说明。
根据本发明的另一方面的延长细胞的端粒的外泌体的制备方法包括：直接 或间接地向细胞提供物理刺激的步骤；将上述细胞及培养基的混合物培养规定 时间的步骤；以及从上述混合物分离外泌体的步骤，上述直接提供刺激为对包 含有细胞的培养基施加物理刺激，上述间接提供刺激为对未包含细胞的培养基 施加物理刺激之后，混合上述培养基和上述细胞。
其中，上述物理刺激的形式可选自低频率、超声波、高频率、热、光、电 磁波、电波、拉伸(stretch)、压缩(compression)中，优选地，可选自超声波、 热及光中任意一种。
本发明的特征在于，直接或间接性地向上述细胞提供物理刺激的过程通过 选自以下方式中的任一种方式来执行：混合细胞和培养基之后，向上述混合物 提供物理刺激，或向培养基提供物理刺激之后，混合上述培养基和细胞，或向 细胞提供物理刺激之后，混合上述细胞和培养基，或向细胞提供物理刺激之后， 混合上述细胞和培养基之后，再向上述混合物提供物理刺激，或向培养基提供 物理刺激之后，混合上述培养基和细胞之后，再向上述混合物提供物理刺激， 或分别向细胞和培养基提供物理刺激之后，混合上述细胞及上述培养基，或分 别向细胞和培养基提供物理刺激之后，混合上述细胞及上述培养基之后，再向 上述混合物提供物理刺激。这种物理刺激可以是对细胞通过直接/间接的方法执行一次以上，或以上述方式中选择一种以上的组合来进行，随着次数的增加， 外泌体的端粒延长效果可以成比例的增加。在提供一次以上的物理刺激时，优 选在每次的物理刺激之间隔开时间间隔，以能使细胞能恢复。上述时间间隔为 一日以上，更优选为两日以上。
本发明的特征在于，上述物理刺激为超声波刺激，对于直接的上述超声波 刺激而言，强度为0.1至3W/cm2，频率为20kHz至20MHz，持续时间为0.1秒 至20分钟，对于间接的上述超声波刺激而言，强度为1至20W/cm2，频率为20kHz 至20MHz，持续时间为0.1秒至20分钟。更优选地，对于直接的上述超声波刺 激而言，强度为0.5至2W/cm2，频率为20kHz至2MHz，持续时间为0.1秒至 10分钟，对于间接的上述超声波刺激而言，强度为2至10W/cm2，频率为20kHz 至2MHz，持续时间为1秒至15分钟。
本发明的特征在于，上述物理刺激为热刺激，上述热刺激以将细胞在40℃ 至50℃的温度条件下暴露1分钟至10分钟之后，在0℃至4℃的温度条件下暴 露5秒钟至10秒钟的方式进行施加。
本发明的特征在于，上述物理刺激为光刺激，上述光刺激通过照射选自激 光或发光二极管(light-emitting diode)光中的任意一种的300nm至900nm波段 的脉冲光束，且照射1秒钟至10秒钟而执行，更优选地，照射3秒钟至7秒钟 而执行。
本发明的特征在于，在根据本发明一实施例的延长细胞的端粒的外泌体的 制备方法，表现出能够诱导当适用于多种细胞时均能延长各个细胞的端粒的外 泌体的分泌。上述细胞选自由源自哺乳动物的干细胞、祖细胞(progenitor cell)、 成纤维细胞、角质形成细胞或器官内组织细胞组成的组。当以适用生物体为目 的使用上述延长端粒的外泌体时，上述细胞可以为自体(autologous)来源的细 胞、同种异体(allogeneic)来源的细胞或异种(heterologous)来源的细胞中的 一种，当为异种来源的细胞时，优选地，可以来源于哺乳动物。为了减少免疫 排斥反应的可能性，优选地，可使用同种来源的细胞，最优选地，可使用自体 来源的细胞。上述细胞分别选自由源自哺乳动物的干细胞、祖细胞、成纤维细胞、角质形成细胞或器官内组织细胞组成的组中。
本发明的特征在于，上述培养基选自培养基
Figure BDA0002225663480000171
或
Figure BDA0002225663480000172
Figure BDA0002225663480000173
分化诱导培养基中。其中，“培养基”为维持特定细胞的均匀性的同时， 适合于细胞的生存的培养基，是用于均匀细胞的增殖的培养基。反之，“分化 诱导培养基”是指将特定细胞诱导为具有其他分化能力的细胞的培养基。
本发明的特征在于，上述混合物的培养可进行1小时至10天，优选地，可 进行1天至5天。需要这样的培养时间的原因在于，当向细胞施加上述的物理 刺激时，下文中所述的多种基因的表达增加，“基因表达”包括转录和蛋白质 合成等生物活性物质的合成和折叠(folding)以及向上述物质的细胞内所需位置 的移动，因此实际上直到生成使负载有具有端粒的延长效果的生物活性物质的 外泌体是需要规定时间的。并且，超声波处理后，随着时间推移，外泌体的生 成减少，因此过长的培养时间有可能反而不利于外泌体制备效率。
本发明的特征在于，分离上述外泌体的步骤可利用超离心分离、密度梯度、 过滤、尺寸排除色谱、免疫亲和分离、沉淀、基于微流体的分离方法中的一种 以上。
分离上述外泌体的步骤可包括：通过对上述培养后的混合物进行离心分离 来获得上清液的步骤；用过滤器过滤上述上清液来获得滤液的步骤；以及浓缩 上述滤液的步骤。
本发明的特征在于，从经上述制备方法之前的细胞分泌的外泌体相比，上 述所分离的外泌体的TERT、TERF2、DKC1、TERF2IP、RFC1、RAD50、TERF1、 PINX1、TNKS1BP1、ACD、NBN、HSPA1L、PARP1、PTGES3、SMG6、BLM、 XRCC5、XRCC6、ERCC4、PRKDC、TEP1及β-连环蛋白中的一种以上的基因 表达量更高。已知上述基因具有端粒的延长、稳定化、保护等功能，将通过上述制备方法制备的外泌体处理于细胞时不仅延长端粒，还表现出促进细胞生长 及抗衰老效果。
本发明的特征在于，当用上述所分离的外泌体处理细胞时，上述细胞的端 粒酶活性增加。这种端粒酶活性的增加可导致在处理细胞之后端粒长度延长以 及促进细胞分裂。
本发明的特征在于，当用上述所分离的外泌体处理细胞时，上述细胞的β- 半乳糖苷酶活性降低降低。如上所述，上述酶在衰老的细胞中过度表达并积累 于溶酶体中以呈现出高活性，在细胞中处理根据本发明一实施例的制备方法制 备的外泌体时，上述酶的活性降低。
上述延长细胞的端粒的外泌体的制备方法的特征在于，当用上述所分离的 外泌体处理细胞时，上述细胞的细胞迁移率增加。
上述延长细胞的端粒的外泌体的制备方法的特征在于，当在组织中处理上 述所分离的外泌体时，促进上述组织的再生。如在下文中所述，上述外泌体可 增加细胞的迁移率以及细胞的增殖，并且除了可增加端粒相关基因之外，还可 增加多个细胞周期、增殖、代谢相关基因的表达。这种再生不仅以物理损伤作 为对象，还能以化学损伤作为对象实现再生。
上述延长细胞的端粒的外泌体的制备方法的特征在于，当在伤口中处理上 述所分离的外泌体时，可促进上述伤口的愈合。
上述延长细胞的端粒的外泌体的制备方法的特征在于，当在疤痕中处理上 述所分离的外泌体时，可促进上述疤痕的愈合。
上述延长细胞的端粒的外泌体的制备方法的特征在于，当用上述所分离的 外泌体处理细胞时，可对上述细胞具有抗衰老效果。如上所述，在细胞中处理 根据本发明一实施例的制备方法制备的外泌体时，不仅可使细胞的β-半乳糖苷 酶活性减少，细胞的迁移率以及增殖也能增加。这种效果不仅出现在正常细胞 中，还出现在端粒延长上存在问题的早老症患者的细胞中，因此，如上所述的 外泌体可用于延缓及防止衰老，还可用于治疗如早老症等加速的衰老。
以下，详细说明本发明的实施例，以使本发明所属技术领域的普通技术人 员容易实施。但是，本发明能够以多种不同形态实现，并不限定于在此说明的 实施例。
本发明的所有实施例以及实验例中的所有细胞培养均是在37℃、5％的CO2条件下进行。
实施例1.通过直接的超声波刺激的细胞的端粒延长的诱导
在1ml的培养基中，将向1×106个细胞直接施加1W/cm2的超声波刺激5秒 钟(20KHz)的细胞与相同种类的培养基一同在培养皿(culture dish)进行培养， 且培养1天以上。
实施例2.通过直接性热刺激的细胞的端粒延长的诱导
在1ml的hES培养基中，将1×106个细胞放入1.5ml的试验管(tube)中， 在50℃条件下暴露5秒钟之后，在0℃条件下暴露10秒钟，并在培养皿中与相 同种类的培养基一同培养1天以上。
实施例3.通过直接性发光二极管光刺激的细胞的端粒延长的诱导
在1ml的hES培养基中，向1×106个细胞直接施加808nm的发光二极管激 光的光刺激(1W，500Hz/sec)5秒钟，将该细胞在培养皿中与相同种类的培养 基一同培养1天以上。
实施例4.通过间接的超声波刺激的细胞的端粒延长的诱导
对hES培养基以0、3、5、10W/cm2的超声波处理10分钟之后，将其与未 进行超声波处理的细胞混合并在培养皿中培养1天以上。
实施例5.利用超声波刺激的、可诱导细胞的端粒延长的外泌体的制备
在1ml的培养基中，向1×106个细胞直接施加1W、5秒钟(20KHz)的超 声波刺激，将此细胞在培养皿中与相同种类的培养基一同培养1-2天。接着，回 收培养液，以3000rpm离心分离5分钟来除去细胞或细胞凋亡小体等，仅回收 上清液之后，以0.2μm的过滤器过滤，收集仅包含0.2μm尺寸以下的成分的滤 液，之后将上述滤液放入100kDa过滤器中，以10000×g离心分离30分钟以除 去分子量100kDa以下的成分，并获得了浓缩的外泌体。向包含上述浓缩的外泌 体的100kDa过滤器中加入PBS，并且重复两次以10000×g清洗(washing)5分钟的过程来除去上述外泌体浓缩液内的培养基成分，由此获得了外泌体。
实施例6.利用可诱导细胞的端粒延长的外泌体的细胞的端粒延长
将根据实施例5制备的外泌体(reprosome)以1×109颗粒(particle，个)/ml 添加至培养基中，并培养细胞。
实验例1.根据细胞种类的端粒延长效果分析
为了比较根据细胞种类的实施例1的效果，在1ml的DMEM培养基(成纤 维细胞培养基)中，根据实施例1分别对1×106个的CB-HDF(Cell bio)、 Adipo-MSC(黄东颜教授实验室(dong-yeon Hwang Professor Lab))、HDFa (Invitrogen)、HFF(车医科学大学校(CHAUniversity))、Hef(CHA University)、 GFP-HDF(GFP-HNDF，Angio-proteomie)、皮肤成纤维细胞(Skin Fibroblast) (60岁的中风患者样本，通过IRB)、HDP(Cell bio)、L132(ATCC)、h-PreAdipo (ATCC)、CB-HDF×/Entr以及MSC×/Entr施加超声波刺激之后，培养了0、1、 2天，并分析了端粒长度(其中，CB-HDF×/Entr以及MSC×/Entr为通过本发明 的发明人的研究(Lee et al.，An ultra-effective method of generating extramultipotentcells from human fibroblasts by ultrasound，Biomaterials，2017.) 的超声波处理的多能细胞诱导方法来分别从CB-HDF以及MSC在人胚胎干细胞 培养基中诱导的多能细胞)。此时，利用试剂盒根据qPCR方法来分析了端粒的 长度(Absolute Human Telomere LengthQuantification qPCR Assay Kit，Cat No. 8918，ScienCellTM)。其结果，如图1以及表1所示，无关于细胞的种类，端 粒均发生延长。
表1
Figure BDA0002225663480000201
Figure BDA0002225663480000211
实验例2.根据物理刺激的种类的端粒延长效果分析
为了分析根据物理刺激的种类的端粒的延长效果，利用人胚胎干细胞培养 基和CB-HDF，并根据实施例1至实施例3来施加各物理刺激之后，培养了0、 1、2天，根据qPCR方法分析了端粒长度。其结果，如图2所示，显示出超声 波、热及光刺激均可使端粒延长。
实验例3.通过间接超声波刺激的端粒延长效果分析
为了确认不是直接物理刺激的间接物理刺激是否也延长端粒，根据实施例4 对CB-HDF施加了间接超声波刺激之后，培养1天，并且根据qPCR方法分析 了端粒长度。其结果，如图3所示，在使用间接超声波的情况下，显示出了与 所使用的超声波的强度成比例增长的端粒延长效果。
实验例4.根据培养基组成的超声波处理之后的端粒延长效果分析
为了比较根据培养基组成的实施例1的效果，根据实施例1来分别向1ml 的人胚胎干细胞培养基、神经干细胞培养基、原代生殖细胞培养基、DMEM培 养基中的1×106个CB-HDF施加超声波刺激之后，培养了0、1、2天，根据qPCR 方法分析了端粒长度。其结果，如图4所示，显示出了无关于培养基组成，而 均能使端粒延长的结果。
实验例5.根据超声波处理次数的端粒延长效果分析
为了确认重复根据实施例1的超声波处理时是否出现差异，根据实施例1 向1ml的DMEM培养基中的1×106个CB-HDF施加超声波刺激之后，培养1、3、 6天，此时，超声波刺激第一次施加1次或每隔2天施加1次，并根据qPCR方 法分析了端粒长度。其结果，如图5所示，显示出无关于超声波处理次数，端 粒长度均能增加的结果，且超声波处理次数越多，相比于未处理超声波的对照 组的端粒长度的增加幅度越大。
实验例6.根据细胞种类的超声波处理后TERT基因表达分析
为了确认根据细胞种类，实施例1的TERT基因表达量变化是否存在差异， 根据实施例1来分别向1ml的DMEM培养基中的1×106个CB-HDF、Adipo-MSC、 HDFa、HFF、Hef、GFP-HDF、皮肤成纤维细胞、HDP、L132、h-PreAdipo、 CB-HDF×/Entr以及MSC×/Entr施加超声波刺激，并培养了0、1、2天，根据qPCR 方法分析了TERT基因表达变化。其结果，如图6及表2所示，无关于细胞种 类，均呈现出TERT表达量增加。并且，如图7所示，当利用CB-HDF以及Adipo-MSC时，TERT的表达量在超声波处理后培养第一天时大大增加，之后 在第二天重新降低，TERT的持续性表达存在发生癌症等风险，由此，可预期通 过暂时的TERT表达来降低这种风险，使得改善因变短的端粒而引起的衰老相 关症状。
表2
细胞种类 相比对照组的TERT基因表达变化量(倍)
CB-HDF 5.4
MSC 19.46
HDFa 21.61
HFF 16.81
Hef 3.50
GFP-HDF 3.05
Skin Fibroblast 1.53
HDP 2.66
L132 6.88
h-PreAdipo 11.92
CB-HDF×/Entr 3.08
MSC×/Entr 22.20
实验例7.通过超声波处理的细胞内的β-连环蛋白基因表达变化分析
为了确认根据实施例1的端粒延长方法如何影响作为TERT的转录活性因 子的β-连环蛋白基因，根据实施例1向1ml的DMEM培养基中的1×106个 CB-HDF以及Adipo-MSC施加超声波刺激之后，培养了0、1、2天，并根据qPCR 方法分析了β-连环蛋白基因表达变化。其结果，如图8所示，实验的两个细胞 种类的β-连环蛋白表达量均增加。
实验例8.通过超声波处理的细胞内端粒酶活性变化分析
为了确认根据实施例1的端粒延长方法如何影响端粒酶活性，根据实施例1 向1ml的DMEM培养基中的1×106个CB-HDF以及Adipo-MSC施加超声波刺 激，培养了培养了0、1、2天后，利用美国Sciencell公司的端粒酶活性定量qPCR 试剂盒(TAQ，Telomerase ActivityQuantification qPCR kit)分析端粒酶活性。 其结果，如图9所示，实验的两个细胞种类的端粒酶活性均增加。
实验例9.进行超声波处理的细胞的端粒荧光原位杂交(FISH)
为了用其他方法确认通过根据实施例1的端粒延长方法的端粒的增加，根 据实施例1向1ml的DMEM培养基中的1×106个CB-HDF以及Adipo-MSC施 加超声波刺激之后，培养1天，并且利用TelG端粒探针(TelG telomere probe) (TTAGGGTTAGGGTTAGGG)执行了荧光原位杂交，然后利用共聚焦显微镜 分析了荧光信号。此时，利用Hoechst 33342进行了复染。其结果，如图10所 示，实验的两个细胞种类的端粒量均增加。
实验例10.进行超声波处理的细胞的Ki67以及TERT细胞免疫荧光染色
为了确认通过根据实施例1的端粒延长方法的TERT基因表达是否发展为 蛋白质表达增加，根据实施例1向1ml的DMEM培养基中的1×106个CB-HDF 施加超声波刺激，培养1天之后，利用抗Ki67以及抗TERT抗体进行荧光染色， 并利用共聚焦显微镜对其进行了分析。此时，相同细胞利用DAPI进行了复染。 其结果，如图11所示，超声波处理时TERT蛋白质和端粒均增加，不仅如此， 附加地，作为细胞分裂标记的Ki67蛋白质的表达也增加。
实验例11.进行超声波处理的细胞的衰老相关β-半乳糖苷酶活性分析
为了确认通过实施例1的端粒延长方法的上述的变化如何影响细胞衰老， 根据实施例1向1ml的DMEM培养基中的1×106个CB-HDF施加超声波刺激， 培养1天及3天之后，利用X-gal对已知与细胞内衰老具有相关关系的β-半乳糖 苷酶的活性进行了试验，并且利用相差显微镜来对其进行了分析。此时，超声 波处理第一次施加1次或每2天施加1次。其结果，如图12所示，可确认β- 半乳糖苷酶活性降低，因此，表示本发明的端粒延长方法具有抗衰老效果。
实验例12.利用超声波处理的制备方法的外泌体生产效率以及上述外泌体 内成分分析
根据实施例5来制备外泌体，并分析了外泌体生产效率。首先，超声波处 理24小时之后，利用免疫荧光染色分析了HDF的外泌体标记(CD63)的表达 (此时，复染利用了DAPI)，结果可确认与未处理超声波的组相比，大大增加 (图13)。为了考察上述标记的表达是否与实际外泌体分泌相关联，利用纳米 颗粒分析仪LM10(Nanosight LM10)显微镜进行了分析，其结果，确认在超声 波处理组中，尤其直径为30-200nm的外泌体大量分泌，尤其，外泌体总数为 9.02±0.47×108个/ml，这与未处理超声波的组(1.5±0.43×108个/ml)相比，增加了5倍以上(图14以及图15)。
接着，分析了如实施例5进行超声波处理后分泌诱导的外泌体内RNA以及 蛋白质的总量是否有变化。在总RNA中，利用TRIzol(RNAi，Takara，大津(Otsu)， 日本(Japan))从外泌体提取总RNA之后，利用Agilent 2100生物分析仪(Agilent 2100 Bioanalyzer，Agilent，Santa Clara，CA，USA)进行定量，其结果，确认 从1×106个细胞分泌的外泌体内总RNA量在以如实施例5进行了超声波处理的 方式制备的情况下为1003.5±167.6ng，与未进行超声波处理的情况相比 (186.3±17.3ng)增加了5倍以上。此时，以相同的外泌体数(1×108个外泌体) 对比，总RNA量为222.4±37.1ng，表现出了与未进行超声波处理的情况(241.5±22.5ng)相似的水平(图16以及表3)。以蛋白质定量方法(BCA方 法)定量总蛋白质，其结果，确认从1×106个细胞分泌的外泌体内总蛋白质量在 以如实施例5进行超声波处理的方式制备的情况下为6.11±0.058μg，与未进行超 声波处理的情况(0.15±0.009μg)相比，增加了约40倍。此时，以相同的外泌 体数(1×108个外泌体)对比，总蛋白质量为1.35±0.013μg，与未进行超声波处 理的情况(0.20±0.012μg)相比增加了6倍以上(图16以及表3)。
表3
Figure BDA0002225663480000251
实验例13.通过超声波处理从细胞分泌诱导的外泌体内RNA以及蛋白质 分析
为了鉴定根据实施例5制备的外泌体内RNA，进行了转录组测序 (RNA-seq)，并执行了基因本体(Gene ontology)分析。其结果，存在许多与 端粒维持及构成、细胞周期以及增殖、DNA修复以及扩增相关的基因(图17～ 图18)，尤其，如表4所示，表现了从实验组细胞分泌的外泌体中端粒酶活性 相关基因和端粒维持以及保护相关的基因的表达增加。
表4
Figure BDA0002225663480000252
Figure BDA0002225663480000261
并且，利用qPCR分析外泌体内的细胞增殖、端粒增加以及抗衰老相关RNA， 其结果，与难以检测的水平的对照组相比，可确认与细胞增殖相关的Cyclin-D1 以及PCNA，与端粒增加相关的Ctnnb1、TERT以及STAT3，与抗衰老相关的 TEP1、MMP1、MMP2、MMP9、弹性蛋白(Elastin)、角蛋白(Keratin)、HYAL1、 层粘连蛋白(Laminin)、丝聚蛋白(Filaggrin)、外皮蛋白(Involucrin)等RNA 大大增加(图19)。
为了确认通过超声波刺激分泌的外泌体内的TERT蛋白质，进行了对外泌 体标记和TERT蛋白质的免疫荧光染色，其结果，可确认许多两个信号相重叠 的部分(图20)。当将此与上述外泌体内RNA分析结果综合来分析时，认为根 据实施例5制备的外泌体中包含大量的与端粒增加、细胞增殖以及抗衰老等相 关的RNA以及蛋白质。
实验例14.通过超声波处理分泌诱导的外泌体进行处理的细胞的端粒分析
为了确认利用根据实施例5制备的外泌体如何影响细胞的端粒延长，使细 胞在包含上述外泌体的培养液中培养2天后，根据qPCR方法分析了端粒长度。 其结果，与处理外泌体之前(con)的细胞以及未处理外泌体而培养2天的组(non) 相比，随着外泌体处理浓度的增加，端粒长度显著性变长(图21)。
接着，为了确认上述外泌体的端粒延长效果是否根据细胞而不同，将HDF、 HEK、HDP以及Adipo-MSC在以1×109个/ml浓度包含根据实施例6的外泌体 的培养液中分别培养0、1、2天，并分析了端粒长度以及端粒酶活性。其结果， 进行实验的4种种类的细胞中端粒均显著性延长，端粒酶活性也高(图22)， 综上所述，可确认将根据本发明的制备方法制备的外泌体处理于细胞时，具有 端粒延长效果，其无关于细胞种类。
为了进一步检验端粒延长，通过与作为端粒的重复序列的TTAGGG序列(sequence)互补且用Cy3标记(label)的PNA端粒探针(PNA telomere probe) 以及Hoechst33342进行了染色。此时，作为实验前预处理，用秋水仙碱(Colcemid) 对培养基处理48小时，固定在细胞核内生成染色体(chromosome)的分裂中期 状态，利用低渗透压培养基和固定液等将细胞核内染色体附着到载玻片上之后， 将混合了杂交缓冲液(hybridizstion buffer)和PNA探针(PNA probe)的溶液 (预先加温至90℃)添加至染色体中，在85℃下培养10分钟之后，在室温(RT) 下缓慢冷却1小时，用2×SSC缓冲液(buffer)清洗(washing)，利用作为核 染色试剂的Hoechst 33342染色之后，固定(mounting)并用共聚焦激光(Confocal laser)显微镜以1000倍以上的倍率对相比于染色体的端粒(Telomere)荧光表 达进行了分析。其结果，如图23所示，在以1×109个/ml浓度包含上述外泌体的 培养液中培养了2天之后的细胞组，与未处理外泌体的对照组相比，发现Cy3 荧光的频率更强。接着，在实验组与对照组中，比较相比于染色体(Hoechst33342) 的端粒荧光强度之差的结果(图23)，以及基于这种分析数值的平均所分析出 的端粒长度的端粒荧光定量原位杂交(qFISH)结果(图23)，可确认端粒显著 延长。
接着，通过全基因组测序(whole genome sequencing)，分析了端粒末端的 重复序列的频率。首先，分析TTAGGG序列频率，其结果，可确认与未处理外 泌体的对照组相比，在以1×109个/ml浓度包含上述外泌体的培养液中培养了2 天的细胞组中TTAGGG序列更频繁出现(图24)。呈现复杂结构的端粒在测序 时能够以多种序列表现，进一步分析其可能的重复序列的频率，其结果，在实 验组中所有可能的序列频率均增高(图24以及表5)。
表5
Figure BDA0002225663480000281
Figure BDA0002225663480000291
实验例15.通过超声波处理分泌诱导的外泌体进行处理的细胞的基因表达 分析
为了鉴定根据实施例6而实现外泌体处理的细胞内RNA，进行转录组测序， 并执行了基因本体分析。其结果，可确认存在许多与端粒延长、端粒酶活性、 细胞周期以及增殖，代谢等相关基因(图25～图26)。尤其，如表3所示，从 实验组细胞分泌的外泌体中的与端粒酶活性相关基因和端粒维持以及保护相关 的基因的表达增加。
接着，为了确认根据实施例6而实现外泌体处理的细胞内的TERT表达， 外泌体处理0、1、2天后分别进行qPCR以及免疫荧光染色，其结果，TERT RNA 以及蛋白质量随着外泌体处理时间的增加而增加(图27)。
实验例16.超声波诱导外泌体处理的细胞的Ki67细胞免疫荧光染色
为了确认超声波诱导的外泌体处理的细胞的基因表达变化如何影响细胞增 殖，根据实施例6而包含外泌体的培养基中对HDF培养0、1、2天之后，利用 抗Ki67抗体荧光染色，并利用共聚焦显微镜对其进行了分析(此时，相同细胞 用Hoechst复染)。其结果，如图28所示，随着外泌体共培养的时间的增加， 作为细胞分裂标记的Ki67蛋白质的表达增加。
另外，为了确认上述外泌体的浓度如何影响细胞增殖，在分别包含0、1×109个/ml、2×109个/ml、4×109个/ml外泌体的培养基中对HDF培养2天后，利用抗 Ki67抗体荧光染色，并利用共聚焦显微镜对其进行了分析(此时，相同细胞用 Hoechst复染)。其结果，如图29以及表6所示，与对照组相比，在进行了实 验的外泌体所有范围中表达作为细胞分裂标记的Ki67蛋白质的细胞数显著增 加。
表6
Figure BDA0002225663480000292
Figure BDA0002225663480000301
实验例17.超声波诱导外泌体处理的细胞的衰老相关β-半乳糖苷酶活性分 析
为了确认超声波诱导的外泌体处理的细胞的基因表达变化如何影响细胞衰 老，根据实施例6而包含外泌体的培养基中对HDF培养0、1、2天之后，利用 X-gal，进行对已知与细胞内衰老具有相关关系的β-半乳糖苷酶的活性的试验， 并利用相差显微镜对其进行了分析。其结果，如图30所示，β-半乳糖苷酶活性 减少，因此，可确认根据本发明制备的外泌体可具有抗衰老效果。
实验例18.根据适用超声波诱导的外泌体的生物体的端粒延长效果以及 TERT基因表达变化分析
为了考察将超声波诱导的外泌体涂布在动物上时对端粒长度呈现出何种效 果，在10周龄ICR小鼠的一侧耳部分别涂布根据实施例5制备的外泌体1×109个以及1×1010个，每周3次，且各在第一周和第二周时回收耳部样品，并且分 析了端粒长度、TERT RNA表达量。此时，在相反侧耳部涂布用于稀释上述外 泌体的D-PBS作为对照组，将其在图31中表示为0。实验结果，随着时间推移， 涂布外泌体的耳部的端粒长度增加，尤其，外泌体涂布量越多，端粒长度的增 加幅度越大，处理了外泌体的组中TERT的表达也相对增加(图31)。以1×109个处理根据实施例5制备的外泌体的耳部组织中进行了端粒FISH及TERT的免 疫荧光染色，其结果，可确认也随着时间推移，各个的荧光信号强度以及频率 变高(图32以及图34)。另外，利用qPCR来确认作为与细胞增殖相关的基因 的PCNA、Cyclin D1以及N-钙粘蛋白(N-cadherin)的RNA表达，其结果，上 述三种基因的RNA表达量增加，通过对Ki67的免疫荧光染色结果也可确认随 着时间推移，荧光信号强度以及频率变高(图33)。
实验例19.根据适用超声波诱导的外泌体的皮肤再生、伤口以及疤痕愈合 效果分析
如上所述，根据本发明的制备方法制备的外泌体具有端粒延长以及细胞增 殖等的效果，这种效果与细胞的再生高度相关，因此确认了这种外泌体如何影 响皮肤再生、伤口以及疤痕的愈合。首先，为了考察如何影响细胞的迁移，进 行了如下的伤口愈合试验，即将根据实施例5的外泌体制备方法制备的外泌体 加入培养基中，将HDF培养至填满平板的程度之后，利用20μl的黄色枪头 (yellow tip)划线，使细胞间形成间距之后，以0、5×109、10×109、20×109个/ml 的浓度处理外泌体并进行培养。其结果，外泌体浓度越高，可相对较快地填充 空的空间(图35)，由此可确认根据本发明的制备方法制备的外泌体可使细胞 的迁移增加。
接着，为了在生物体内确认上述外泌体的效果，6周龄的C57小鼠的皮肤上 用打孔器(punch)打出6mm的伤口，将上述外泌体分别以0、5×109、10×109、 20×109个/ml浓度稀释在PBS中，并每周2次涂布在伤口部位。其结果，在1 周后，与未处理外泌体的小鼠相比，外泌体处理小鼠的暴露在外部的伤口 (opening)的大小明显变小。并且，1周以及2周后，分别将伤口部位组织切 面用H&E染色进行了确认，其结果，与未处理外泌体的小鼠相比，处理外泌体 的小鼠的伤口的大小小，由此可确认发生了皮肤再生、伤口以及疤痕愈合，尤 其，在伤口部位处理10×109以及20×109个/ml浓度的外泌体的情况下，在第二 周皮肤组织完全恢复，并且以可明确区分构成皮肤组织的表皮和真皮、脂肪层、 肌肉层的程度实现了再生，并且在真皮层和脂肪层中形成了作为皮肤附属组织 的毛囊，且伤口部位和周围部位之间无明显差异(图36)。
另外，利用VybrantTMDiD细胞标记溶液(Cell-Labeling Solution)对上述外 泌体进行染色，并将其处理在皮肤上，2周之后，用荧光显微镜分析上述染色的 外泌体处理的部位，其结果，上述外泌体渗透到伤口部位的整体，可以推断， 通过这种整体性渗透而呈现了如上所述的效果(图37)。接着，在以0、5×109、 10×109、20×109个/ml的浓度处理了外泌体的伤口部位上，利用qRT-PCR分析 了作为组织再生以及伤口愈合相关基因的Ⅰ型胶原α1(Col1α1)、III型胶原α1 (Col3α1)、弹性蛋白(Elastin，ELN)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)以及Cyclin-D1 的表达，其结果，实验组与对照组相比，整体上上述基因中的一种以上的表达会更高(图37)。但此时，按照各个不同浓度，增加量最多的基因不同，浓度 与表达增减的相关关系暂时难以证实。
综上所述，通过本发明的制备方法制备的外泌体不仅在生物体外(in vitro)， 在生物体内也可具有皮肤再生、伤口以及疤痕愈合效果。
实验例20.将超声波诱导的外泌体适用于早老症患者来源的细胞的效果分 析
如上所述，根据本发明的制备方法的外泌体呈现出了诱导与抗衰老相关的 各种基因表达，为了确认这种外泌体是否在加速衰老的细胞中也具有效果，用 上述外泌体对来源于早老症患者的成纤维细胞中进行处理之后，确认了端粒长 度、端粒酶活性、TERT表达、细胞增殖、Ki67表达以及衰老相关β-半乳糖苷 酶活性。在这里使用的细胞为从患有早年衰老综合症(Hutchinson-Gilford progeria syndrome)患者(白种人/8岁/男)的大腿皮肤采取的细胞(AG06297， Coriell Institute，Camden，USA)。用1×109个/ml的外泌体进行处理，第一次 处理14天之后，对细胞进行了分析，并且分为第一次处理了1次的实验组(Reprosome×1)、以及每次替换培养基时持续使用加入上述浓度的外泌体的培 养基的实验组(Reprosome×∞，14天处理4次)来进行实验。
其结果，确认第一次处理外泌体1次的实验组以及持续处理的实验组中的 端粒均延长，端粒酶活性增加，TERT基因表达增加(图38)，细胞增殖增加， Ki67蛋白质表达增加(图39)，β-半乳糖苷酶活性减少(图40)，并且仅处理 1次就对早老症患者细胞的加快衰老具有整体性的抗衰老的效果。
上述的本发明的说明为用于示例性的，本发明所属技术领域的普通技术人 员应理解，在不改变本发明的技术精神或必要特征的情况下，可容易变形为其 他具体形态。因此，应当理解，以上所述的多个实施例在所有方面上均为示例 性的，而不是限定性的。例如，以单一形式说明的各个结构要素能够以分布式 实施，同样地，以分布式说明的多个结构要素也能够以组合形式实施。
本发明的范围由后述的发明要求保护范围来表示，并且应该理解，从发明 要求保护范围的含义及范围以及其等同概念到处的所有变更或变形的形态包括 在本发明的范围之内。

Claims (33)

1.一种延长细胞的端粒的外泌体，其特征在于，
包含选自TERT、TERF2、DKC1、TERF2IP、RFC1、RAD50、TERF1、PINX1、TNKS1BP1、ACD、NBN、HSPA1L、PARP1、PTGES3、SMG6、BLM、XRCC5、XRCC6、ERCC4、PRKDC、TEP1及β-连环蛋白中的基因的一种以上的RNA或蛋白质。
2.根据权利要求1所述的延长细胞的端粒的外泌体，其特征在于，
上述外泌体通过向细胞提供物理刺激来诱导而成。
3.根据权利要求2所述的延长细胞的端粒的外泌体，其特征在于，
上述物理刺激的形式为选自超声波、热及光中的任意一种。
4.根据权利要求2所述的延长细胞的端粒的外泌体，其特征在于，
上述物理刺激直接或间接地提供给细胞，
上述直接提供刺激为对包含有细胞的培养基施加物理刺激，上述间接提供刺激为对未包含细胞的培养基施加物理刺激之后，混合上述培养基和上述细胞。
5.根据权利要求2所述的延长细胞的端粒的外泌体，其特征在于，
提供能够诱导上述外泌体的物理刺激的过程通过选自以下方式中的任一种方式来执行：
混合细胞和培养基之后，向上述混合物提供物理刺激；或者
向培养基提供物理刺激之后，混合上述培养基和细胞；或者
向细胞提供物理刺激之后，混合上述细胞和培养基；或者
向细胞提供物理刺激之后，混合上述细胞和培养基之后，再向上述混合物提供物理刺激；或者
向培养基提供物理刺激之后，混合上述培养基和细胞之后，再向上述混合物提供物理刺激；或者
分别向细胞和培养基提供物理刺激之后，混合上述细胞及上述培养基；或者
分别向细胞和培养基提供物理刺激之后，混合上述细胞及上述培养基之后，再向上述混合物提供物理刺激。
6.根据权利要求2所述的延长细胞的端粒的外泌体，其特征在于，
上述物理刺激为超声波刺激，
上述直接的超声波刺激的强度为0.1W/cm2至3W/cm2，频率为20kHz至20MHz，持续时间为0.1秒钟至20分钟，
上述间接的超声波刺激的强度为1W/cm2至20W/cm2，频率为20kHz至20MHz，持续时间为0.1秒钟至20分钟。
7.根据权利要求2所述的延长细胞的端粒的外泌体，其特征在于，
上述物理刺激为热刺激，
上述热刺激以将细胞在40℃至50℃的温度条件下暴露1分钟至10分钟之后，在0℃至4℃的温度条件下暴露5秒钟至10秒钟的方式进行施加。
8.根据权利要求2所述的延长细胞的端粒的外泌体，其特征在于，
上述物理刺激为光刺激，
上述光刺激通过照射选自激光或发光二极管光中的任意一种的、300nm至900nm波段的脉冲光束1秒钟至10秒钟来进行施加。
9.根据权利要求1所述的延长细胞的端粒的外泌体，其特征在于，
上述外泌体为在1×108个外泌体颗粒内包含150ng以上的总RNA。
10.根据权利要求1所述的延长细胞的端粒的外泌体，其特征在于，
上述外泌体为在1×108个外泌体颗粒内包含1μg以上的总蛋白质。
11.根据权利要求1所述的延长细胞的端粒的外泌体，其特征在于，
利用上述外泌体处理细胞时，上述细胞的端粒酶活性增加。
12.根据权利要求1所述的延长细胞的端粒的外泌体，其特征在于，
利用上述外泌体处理细胞时，上述细胞的β-半乳糖苷酶活性减少。
13.一种细胞的端粒延长用组合物，其特征在于，
包含权利要求1的外泌体。
14.根据权利要求13所述的细胞的端粒延长用组合物，其特征在于，
上述组合物中上述外泌体的浓度为106至1014个/ml。
15.一种延长细胞的端粒的外泌体的制备方法，其特征在于，包括：
直接或间接地向细胞提供物理刺激的步骤；
将上述细胞及培养基的混合物培养规定时间的步骤；以及
从上述混合物分离外泌体的步骤，
上述直接提供刺激为对包含有细胞的培养基施加物理刺激，上述间接提供刺激为对未包含细胞的培养基施加物理刺激之后，混合上述培养基和上述细胞。
16.根据权利要求15所述的延长细胞的端粒的外泌体的制备方法，其特征在于，
上述物理刺激的形式为选自超声波、热及光中的任意一种。
17.根据权利要求15所述的延长细胞的端粒的外泌体的制备方法，其特征在于，
直接或间接性地为上述细胞提供物理刺激的过程通过选自以下方式中的任一种方式来执行：
混合细胞和培养基之后，向上述混合物提供物理刺激；或者
向培养基提供物理刺激之后，混合上述培养基和细胞；或者
向细胞提供物理刺激之后，混合上述细胞和培养基；或者
向细胞提供物理刺激之后，混合上述细胞和培养基之后，再向上述混合物提供物理刺激；或者
向培养基提供物理刺激之后，混合上述培养基和细胞之后，再向上述混合物提供物理刺激；或者
分别向细胞和培养基提供物理刺激之后，混合上述细胞及上述培养基；或者
分别向细胞和培养基提供物理刺激之后，混合上述细胞及上述培养基之后，再向上述混合物提供物理刺激。
18.根据权利要求15所述的延长细胞的端粒的外泌体的制备方法，其特征在于，
上述物理刺激为超声波刺激，
上述直接的超声波刺激的强度为0.1W/cm2至3W/cm2，频率为20kHz至20MHz，持续时间为0.1秒钟至20分钟，
上述间接的超声波刺激的强度为1W/cm2至20W/cm2，频率为20kHz至20MHz，持续时间为0.1秒钟至20分钟。
19.根据权利要求15所述的延长细胞的端粒的外泌体的制备方法，其特征在于，
上述物理刺激为热刺激，
上述热刺激以将细胞在40℃至50℃的温度条件下暴露1分钟至10分钟之后，在0℃至4℃的温度条件下暴露5秒钟至10秒钟的方式进行施加。
20.根据权利要求15所述的延长细胞的端粒的外泌体的制备方法，其特征在于，
上述物理刺激为光刺激，
上述光刺激通过照射选自激光或发光二极管光中的任意一种的、300nm至900nm波段的脉冲光束1秒钟至10秒钟来进行施加。
21.根据权利要求15所述的延长细胞的端粒的外泌体的制备方法，其特征在于，
上述细胞分别选自由哺乳类来源的干细胞、祖细胞、成纤维细胞、角质形成细胞或器官内组织细胞组成的组。
22.根据权利要求15所述的延长细胞的端粒的外泌体的制备方法，其特征在于，
上述培养基为选自培养基或分化诱导培养基。
23.根据权利要求15所述的延长细胞的端粒的外泌体的制备方法，其特征在于，
上述混合物的培养进行1小时至10天。
24.根据权利要求15所述的延长细胞的端粒的外泌体的制备方法，其特征在于，
分离上述外泌体的步骤利用超离心分离、密度梯度、过滤、尺寸排除色谱、免疫亲和分离、沉淀、基于微流体的分离方法中的一种以上方法。
25.根据权利要求15所述的延长细胞的端粒的外泌体的制备方法，其特征在于，
分离上述外泌体的步骤包括：
通过对上述培养后的混合物进行离心分离来获得上清液的步骤；
用过滤器过滤上述上清液来获得滤液的步骤；以及
浓缩上述滤液的步骤。
26.根据权利要求15所述的延长细胞的端粒的外泌体的制备方法，其特征在于，
与经过上述制备方法之前的细胞所分泌的外泌体相比，上述分离出的外泌体的TERT、TERF2、DKC1、TERF2IP、RFC1、RAD50、TERF1、PINX1、TNKS1BP1、ACD、NBN、HSPA1L、PARP1、PTGES3、SMG6、BLM、XRCC5、XRCC6、ERCC4、PRKDC、TEP1及β-连环蛋白中的一种以上的基因表达量更高。
27.根据权利要求15所述的延长细胞的端粒的外泌体的制备方法，其特征在于，
利用上述分离的外泌体处理细胞时，上述细胞的端粒酶活性增加。
28.根据权利要求15所述的延长细胞的端粒的外泌体的制备方法，其特征在于，
利用上述分离的外泌体处理细胞时，上述细胞的β-半乳糖苷酶活性降低。
29.根据权利要求15所述的延长细胞的端粒的外泌体的制备方法，其特征在于，
利用上述分离的外泌体处理细胞时，上述细胞的细胞迁移率增加。
30.根据权利要求15所述的延长细胞的端粒的外泌体的制备方法，其特征在于，
利用上述分离的外泌体处理组织时，促进上述组织的再生。
31.根据权利要求15所述的延长细胞的端粒的外泌体的制备方法，其特征在于，
利用上述分离的外泌体处理伤口时，促进上述伤口的愈合。
32.根据权利要求15所述的延长细胞的端粒的外泌体的制备方法，其特征在于，
利用上述分离的外泌体处理疤痕时，促进上述疤痕的愈合。
33.根据权利要求15所述的延长细胞的端粒的外泌体的制备方法，其特征在于，
利用上述分离的外泌体处理细胞时，对上述细胞具有抗衰老效果。
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