KR102228136B1

KR102228136B1 - 세포의 텔로미어를 신장시키는 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR102228136B1
Application number: KR1020190115381A
Authority: KR
Inventors: 이용승
Original assignee: 주식회사 스템온
Priority date: 2018-10-02
Filing date: 2019-09-19
Publication date: 2021-03-17
Also published as: KR102209234B1; EP3862429A2; EP3862428A4; EP3862428A1; EP3862429B1; KR20200038180A; EP3862428B1; EP3862429A4; KR20200038172A

Abstract

본 발명은 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀, 이를 포함하는 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 TERT, TERF2, DKC1, TERF2IP, RFC1, RAD50, TERF1, PINX1, TNKS1BP1, ACD, NBN, HSPA1L, PARP1, PTGES3, SMG6, BLM, XRCC5, XRCC6, ERCC4, PRKDC, TEP1 및 β-Catenin 중에서 선택된 유전자 하나 이상의 유전자 산물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀, 이를 포함하는 조성물 및 세포에 직간접적으로 물리적 자극을 제공하여 상기 세포로부터 텔로미어를 신장시키는 엑소좀을 유도하는 방법을 개시한다. 이러한 엑소좀을 포함하는 조성물은 기존에 개시된 조성물에 비해 저농도로, 생체에 비침습적인 적용방법으로도 효과를 나타낼 수 있으며, 안전성이 높을 뿐 아니라, 단순히 텔로미어를 신장시키는 데에 그치지 않고, 세포 분열을 유도하고 항노화, 조직재생, 상처치유 및 흉터치유 등의 효과를 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀의 제조방법은 기존의 텔로미어 신장용 조성물에 비해 제조가 간단하고, 수율이 높으며, 환경적인 부담이 줄어들 수 있는 효과를 가진다.

Description

세포의 텔로미어를 신장시키는 조성물 및 그 제조방법 {COMPOSITIONS FOR LENGTHENING TELOMERES IN CELLS AND THE PREPARATION METHODS THEREOF}

본 발명은 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀, 이를 포함하는 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 TERT, TERF2, DKC1, TERF2IP, RFC1, RAD50, TERF1, PINX1, TNKS1BP1, ACD, NBN, HSPA1L, PARP1, PTGES3, SMG6, BLM, XRCC5, XRCC6, ERCC4, PRKDC, TEP1 및 β-Catenin 중에서 선택된 유전자 하나 이상의 RNA또는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀, 이를 포함하는 조성물 및 세포에 직간접적으로 물리적 자극을 제공하여 상기 세포로부터 텔로미어를 신장시키는 엑소좀을 유도하는 방법에 관한 것이다.

텔로미어(telomere)는 염색체 양 끝의 DNA 반복 구조(인간의 경우 TTAGGG)이다. 텔로미어는 쉘터린(shelterin) 복합체와 결합하여 보호 캡을 형성하는데, 이는 세포의 증폭능을 조절하고 세포 분열 시 염색체 간의 결합과 유전 정보의 소실을 방지하는 역할을 한다. DNA 중합효소는 3' 말단을 모두 증폭할 수 없기 때문에 텔로미어는 매 세포분열마다 30 내지 200 bp만큼 짧아지게 된다. 텔로미어가 임계치보다 짧아져 코딩 DNA에 가까워지고 텔로미어의 루프(loop) 구조가 유지될 수 없게 되면, 노출된 텔로미어는 p53 또는 p16INK4a 신호전달체계에 의해 인식되어 세포 분열이 멈추고 노쇠하여 사멸하게 된다.

텔로미어는 역전사효소인 텔로머레이즈(telomerase)에 의해 직접적으로 신장될 수 있는데, 인간의 텔로머레이즈 복합체는 텔로미어 합성의 주형으로 작용하는 RNA 분자인 TERC, 촉매 서브유닛인 TERT와, DKC1 및 TEP1 등의 보조단백질로 구성되어 있다. 정상적인 경우 체세포의 텔로머레이즈 활성은 거의 없으며, 활발한 분열능이 필요한 줄기세포 및 전구세포에서만 높은 활성이 감지된다.

텔로미어가 짧아지면서 다수 세포의 분열이 중단되면 다양한 문제가 나타날 수 있으며, 특히 노화(aging)와 퇴화(degeneration)로 대표되는 다양한 증상이 나타날 수 있다. 피부조직이 퇴화되는 선천성 각하이상증(dyskeratosis congenita) 및 혈액 세포가 부족한 재생불량성 빈혈(aplastic anemia) 등 골수세포의 재생에 문제가 생기는 질병은 텔로머레이즈 또는 텔로미어를 보호하는 쉘터린 복합체 관련 유전자의 돌연변이 등 텔로미어 유지기능 이상으로 인해 나타나는 것으로 일찍이 밝혀졌다. 한편, 최근 고혈압, 대사증후군, 당뇨병, 치매 등 노화와 관련된 질환을 앓고 있는 환자들의 텔로미어가 정상인보다 짧다는 연구결과가 나오는 등 텔로미어의 길이를 늘려 노화를 늦출 수 있는 가능성에 대한 연구가 설득력을 얻고 있다. 또한, 일반적으로 텔로머레이즈의 활성이 거의 없는 것으로 알려진 체세포에서 텔로머레이즈 활성을 높임으로써 재생활동을 활성화할 수 있는 것으로 나타났는데, 특히 화상, 부상, 노화 및 질병에 따른 심근, 간, 각막, 피부, 혈관, 연골 및 뼈 등의 각종 조직, 면역세포, 혈액세포 등을 보충할 필요가 있는 경우 효과가 있는 것으로 보고된 바 있다. 그러나 텔로미어의 길이를 신장시킬 수 있는 유전자를 지속적으로 과발현시킨 쥐에서 암세포가 다수 발생하는 등 긴 텔로미어가 암 발병의 위험요소가 된다는 연구결과도 나오고 있다. 따라서 텔로미어 신장활성을 한시적으로만 활성화시킬 수 있다면, 암 발생의 위험 없이 각종 노화 및 퇴화와 관련된 증상을 완화할 수 있을 것이며, 이러한 기술은 전술한 유전적인 결함에 의한 텔로미어 이상은 물론 그 외 재생의학분야에서 유용할 것으로 예상할 수 있다.

상기와 같이 예상되는 다양한 효용에 따라, 텔로미어를 신장시키기 위한 조성물들이 고안된 바 있다. 미국 공개특허 제2018-0280413호는 텔로머레이즈 활성을 높이기 위한 화합물을 포함하는 약학조성물을 개시하고 있는데, 이를 위해서는 화합물을 합성 및 정제하는 과정이 필요하며, 화학합성을 통해 수득할 수 있는 상기 조성물은 합성에 필요한 시재료(starting material)가 정제된 상태여야 할 뿐 아니라 합성 과정에서 환경에 유해한 다양한 부산물이 생성되며, 화합물은 생체 내 대사 과정에서 부산물을 생산하는 등의 위험성을 가진다. 유럽 공개특허 제2959005호는 텔로머레이즈를 코딩하는 RNA를 개시하고 있는데, 이 또한 합성 및 정제 과정이 필요할 뿐 아니라, RNA는 친수성이므로 세포 내로 전달되기 위해서 전달체가 추가적으로 필요하다. 따라서 좀더 간단하게 제조할 수 있고 유해성이 적으며 효율이 좋은 텔로미어 신장용 조성물에 대한 요구가 존재한다.

본 발명은 전술한 문제를 해결하고자 안출된 것으로서, 본 발명의 일 실시예에 따른 엑소좀은 TERT, TERF2, DKC1, TERF2IP, RFC1, RAD50, TERF1, PINX1, TNKS1BP1, ACD, NBN, HSPA1L, PARP1, PTGES3, SMG6, BLM, XRCC5, XRCC6, ERCC4, PRKDC, TEP1 및 β-Catenin 중에서 선택된 유전자 하나 이상의 RNA 또는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 다른 일 실시예는 상기 엑소좀을 포함하는 세포의 텔로미어 신장용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀의 제조방법은 세포에 직간접적으로 물리적 자극을 제공하는 단계; 상기 세포 및 배지의 혼합물을 일정 시간 배양하는 단계; 및 상기 혼합물로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하고, 상기 직접적으로 자극을 제공하는 것은 세포가 포함된 배지에 물리적 자극을 가하는 것이고, 상기 간접적으로 자극을 제공하는 것은 세포가 포함되지 않은 배지에 물리적 자극을 가한 후 상기 배지와 상기 세포를 혼합하는 것을 특징으로 한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 한정되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

전술한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본 발명의 일 측면에 따른, 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀은 TERT, TERF2, DKC1, TERF2IP, RFC1, RAD50, TERF1, PINX1, TNKS1BP1, ACD, NBN, HSPA1L, PARP1, PTGES3, SMG6, BLM, XRCC5, XRCC6, ERCC4, PRKDC, TEP1 및 β-Catenin 중에서 선택된 유전자 하나 이상의 RNA 또는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다.

여기서, 상기 엑소좀은 세포에 물리적 자극을 제공하여 유도된 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 물리적 자극의 형태는 초음파, 열 및 빛 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 물리적 자극은 세포에 직간접적으로 제공되는 것이고, 상기 직접적으로 자극을 제공하는 것은 세포가 포함된 배지에 물리적 자극을 가하는 것이고, 상기 간접적으로 자극을 제공하는 것은 세포가 포함되지 않은 배지에 물리적 자극을 가한 후 상기 배지와 상기 세포를 혼합하는 것일 수 있다.

상기 엑소좀을 유도할 수 있는 물리적 자극을 제공하는 과정은 세포와 배지를 혼합한 후 상기 혼합물에 물리적 자극을 제공하거나, 배지에 물리적 자극을 제공한 후 상기 배지와 세포를 혼합하거나, 세포에 물리적 자극을 제공한 후 상기 세포와 배지를 혼합하거나, 세포에 물리적 자극을 제공한 후 상기 세포와 배지를 혼합한 다음 상기 혼합물에 물리적 자극을 제공하거나, 배지에 물리적 자극을 제공한 후 상기 배지와 세포를 혼합한 다음 상기 혼합물에 물리적 자극을 제공하거나, 세포와 배지에 각각 물리적 자극을 제공한 후 상기 세포 및 상기 배지를 혼합하거나, 세포와 배지에 각각 물리적 자극을 제공한 후 상기 세포 및 상기 배지를 혼합한 다음 상기 혼합물에 물리적 자극을 제공하는 방식 중에서 선택된 어느 하나 이상의 방식으로 진행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 물리적 자극은 초음파 자극이고, 상기 직접적인 초음파 자극은 강도가 0.1 내지 3 W/cm²이며, 주파수가 20 kHz 내지 20 MHz이고, 지속시간이 0.1초 내지 20분인 것을 특징으로 하며, 상기 간접적인 초음파 자극은, 강도가 1 내지 20 W/cm²이고, 주파수가 20 kHz 내지 20 MHz이며, 지속시간이 0.1초 내지 20분인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 물리적 자극은 열 자극이고, 상기 열 자극은 세포를 40 내지 50℃의 온도 조건에 1 내지 10분 노출시킨 후 0 내지 4℃의 온도 조건에 5 내지 10초간 노출하는 방식으로 가해지는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 빛 자극은 레이저 또는 발광 다이오드(light-emitting diode) 빛 중에서 선택된 어느 하나의, 파장 대역 300 내지 900 nm의 펄스형 빔을 1 내지 10초 동안 조사하여 가하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 엑소좀은 엑소좀 1X10⁸ 개 입자 내에 총 RNA가 150 ng 이상 포함된 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 엑소좀은 엑소좀 1X10⁸ 개 입자 내에 총 단백질이 1 μg 이상 포함된 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 엑소좀을 세포에 처리시 상기 세포의 telomerase 활성이 높아지는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 엑소좀을 세포에 처리시 상기 세포의 β-galactosidase활성이 감소되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 일 측면에 따른 세포의 텔로미어 신장용 조성물은 전술한 엑소좀을 포함한다.

여기서, 상기 조성물은 상기 엑소좀이 10⁶ 내지 10¹⁴개/ml농도로 포함된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일측면에 따른 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀의 제조방법은 세포에 직간접적으로 물리적 자극을 제공하는 단계; 상기 세포 및 배지의 혼합물을 일정 시간 배양하는 단계; 및 상기 혼합물로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하고, 상기 직접적으로 자극을 제공하는 것은 세포가 포함된 배지에 물리적 자극을 가하는 것이고, 상기 간접적으로 자극을 제공하는 것은 세포가 포함되지 않은 배지에 물리적 자극을 가한 후 상기 배지와 상기 세포를 혼합하는 것이다.

여기서, 상기 물리적 자극의 형태는 초음파, 열 및 빛 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 세포에 직간접적으로 물리적 자극을 제공하는 과정은 세포와 배지를 혼합한 후 상기 혼합물에 물리적 자극을 제공하거나, 배지에 물리적 자극을 제공한 후 상기 배지와 세포를 혼합하거나, 세포에 물리적 자극을 제공한 후 상기 세포와 배지를 혼합하거나, 세포에 물리적 자극을 제공한 후 상기 세포와 배지를 혼합한 다음 상기 혼합물에 물리적 자극을 제공하거나, 배지에 물리적 자극을 제공한 후 상기 배지와 세포를 혼합한 다음 상기 혼합물에 물리적 자극을 제공하거나, 세포와 배지에 각각 물리적 자극을 제공한 후 상기 세포 및 상기 배지를 혼합하거나, 세포와 배지에 각각 물리적 자극을 제공한 후 상기 세포 및 상기 배지를 혼합한 다음 상기 혼합물에 물리적 자극을 제공하는 방식 중에서 선택된 어느 하나 이상의 방식으로 진행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 물리적 자극은 초음파 자극이고, 상기 직접적인 초음파 자극은 강도가 0.1 내지 3 W/cm²이고, 주파수가 20 kHz 내지 20 MHz이며, 지속시간이 0.1초 내지 20분인 것을 특징으로 하고, 상기 간접적인 초음파 자극은, 강도가 1 내지 20 W/cm²이고, 주파수가 20 kHz 내지 20 MHz이며, 지속시간이 0.1초 내지 20분인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 물리적 자극은 빛 자극이고, 상기 빛 자극은 레이저 또는 발광 다이오드(light-emitting diode) 빛 중에서 선택된 어느 하나의, 파장 대역 300 내지 900 nm의 펄스형 빔을 1 내지 10초 동안 조사하여 가하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 세포는 각각 포유류 유래의 줄기세포, 전구세포, 섬유아세포, 각질세포 또는 기관 내 조직세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 배지는 배양 배지 또는 분화유도 배지 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 혼합물의 배양은 1시간 내지 10일 동안 진행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 엑소좀을 분리하는 단계는 초원심분리, 밀도구배, 여과, 크기 배제 크로마토그래피, 면역친화성분리, 침전, 미세유체에 의한 분리방법 중 하나 이상을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 엑소좀을 분리하는 단계는 상기 배양 후의 혼합물을 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 상기 상층액을 필터로 여과하여 여과액을 수득하는 단계; 및 상기 여과액을 농축하는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 분리된 엑소좀은 상기 제조방법을 거치기 전의 세포에서 분비된 엑소좀에 비해 TERT, TERF2, DKC1, TERF2IP, RFC1, RAD50, TERF1, PINX1, TNKS1BP1, ACD, NBN, HSPA1L, PARP1, PTGES3, SMG6, BLM, XRCC5, XRCC6, ERCC4, PRKDC, TEP1 및 β-catenin중에서 하나 이상의 유전자 발현량이 높은 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 분리된 엑소좀은 세포에 처리시 상기 세포의 telomerase 활성이 높아지는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 분리된 엑소좀을 세포에 처리시 상기 세포의 β-galactosidase활성이 감소되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀의 제조방법은, 상기 분리된 엑소좀을 세포에 처리시 상기 세포의 세포 이동성이 증가되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀의 제조방법은, 상기 분리된 엑소좀을 조직에 처리시 상기 조직의 재생이 촉진되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀의 제조방법은, 상기 분리된 엑소좀을 상처에 처리시 상기 상처의 치유가 촉진되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀의 제조방법은, 상기 분리된 엑소좀을 흉터에 처리시 상기 흉터의 치유가 촉진되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀의 제조방법은, 상기 분리된 엑소좀을 세포에 처리시 상기 세포에 항노화 효과를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 세포의 텔로미어를 신장시키는 조성물은 전술한 텔로미어를 신장시키는 조성물에 비해 제조가 간단하다. 즉, 기존의 조성물 중 화합물은 화학적으로 합성되는데, 이는 특이성이 없고 길고 복잡한 공정을 거쳐야 한다. 이에 반해 본 발명의 일 실시예에 따른 세포의 텔로미어를 신장시키는 방법은 물리적 자극을 세포에 처리하는 것 만으로 텔로미어 신장과 관련된 다양한 인자의 발현 및 상기 인자를 포함하는 엑소좀 생산을 촉진할 수 있으며, 이렇게 분비된 엑소좀을 상기 세포를 배양한 배지로부터 분리하는 과정으로 구성되어 그 공정이 간단하다. 또한, 세포는 이중 지질막으로 둘러싸여 있으므로, 친수성의 핵산은 세포 내로 전달할 수 있는 전달체가 없이는, 효과를 나타내기 이전에 필요한 세포 내 유입이 어려워 전달체에 핵산을 로딩하는 단계가 추가로 필요한데 반해, 본 발명의 엑소좀 제조방법에 따르면 텔로미어 신장 관련 인자가 지질막으로 둘러싸인 형태로 수득되므로 추가적인 로딩을 진행할 필요가 없다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포의 텔로미어를 신장시키는 조성물은 기존에 개시된 조성물에 비해 효율과 적용방법 면에서 우수하다. 즉, 전술한 텔로머레이즈 활성을 높이는 화합물은 충분한 효과를 나타내기 위해서 높은 농도의 화합물을 체내 주입해야 하는 것으로 나타나는 데 반해 본 발명의 일 실시예에 따른 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀은 소량을, 국부도포 등 비침습적인 방법으로 적용하는 것으로 효과를 낼 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀은 텔로미어 신장과 관련된 인자를 다량 함유하는 엑소좀을 다량 분비할 수 있도록 유도하므로, 유용한 물질을 담은 세포의 엑소좀 생산 측면에서 수율이 높다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀은 안전성이 높다. 즉, 화합물은 대사과정에서 독성 등 추가적 위험이 존재할 수 있으며, 특히 전술한 기존 기술은 화합물의 처리량이 대상동물 단위무게(kg)당 mg 수준으로 상당히 높고 화학 합성 과정에서도 환경에 부담이 되는 폐기물 등이 생성되나, 본발명에 따른 방법은 상대적으로 이러한 부담이 적을 것으로 예상된다.

추가로, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀은 단순히 텔로미어를 신장시키는 데에 그치지 않고, 세포 분열을 유도하며 항노화 및 조직재생 효과를 가지는 것을 확인하였으며, 따라서 이를 통해 단순히 텔로미어 길이가 짧아져 생기는 문제뿐만 아니라 직접적으로 노화 및 조직재생과 관련된 다양한 질병과 증상까지 개선 및 예방할 수 있을 것으로 기대할 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도1은 본 발명의 실시예1에 따른 직접적 초음파 자극 처리 및 배양 후 세포 종류에 따른 텔로미어 길이 변화 분석 데이터.
도2는 본 발명의 실시예1에 따른 초음파 자극 처리, 실시예2에 따른 열 자극 처리, 실시예 3에 따른 발광 다이오드 빛 자극 처리 및 각 배양 후 각 물리적 자극 처리에 따른 텔로미어 길이 변화 분석 데이터.
도3은 본 발명의 실시예5에 따른 간접적 초음파 자극 처리 및 배양 후 텔로미어 길이 변화 분석 데이터.
도 4는 본 발명의 실시예1에 따른 초음파 자극 처리 및 배양 후 배지 종류에 따른 텔로미어 길이 변화 분석 데이터.
도 5은 본 발명의 실시예1에 따른 초음파 자극 처리 및 배양 후 초음파 자극 처리 횟수에 따른 텔로미어 길이 변화 분석 데이터.
도 6은 본 발명의 실시예1에 따른 초음파 자극 처리 및 배양 후 세포 종류에 따른 TERT 유전자 발현 변화 분석 데이터.
도7는 CB-HDF 및 Adipo-MSC에 대한 본 발명의 실시예1에 따른 초음파 자극 처리 및 배양 후 TERT 유전자 발현 변화 분석 데이터.
도8은 CB-HDF 및 Adipo-MSC에 대한 본 발명의 실시예1에 따른 초음파 자극 처리 및 배양 후 β-Catenin 유전자 발현 변화 분석 데이터.
도9은 CB-HDF 및 Adipo-MSC에 대한 본 발명의 실시예1에 따른 초음파 자극 처리 및 배양 후 텔로머레이즈 활성 변화 분석 데이터.
도10은 CB-HDF 및 Adipo-MSC에 대한 본 발명의 실시예1에 따른 초음파 자극 처리 및 배양 후 telomere FISH 데이터.
도11는 CB-HDF에 대한 본 발명의 실시예1에 따른 초음파 자극 처리 및 배양 후 TERT 및 Ki67의 세포형광염색 데이터.
도12은 CB-HDF에 대한 본 발명의 실시예1에 따른 초음파 자극 처리 및 배양 후 노화관련 β-galactosidase 활성 분석 데이터.
도13은 본 발명의 실시예5에 따라 초음파 처리된 CB-HDF에서의 엑소좀 마커 발현 분석 데이터.
도14는 본 발명의 실시예5에 따라 CB-HDF로부터 분비된 엑소좀의 입자 크기별 Nanosight 분석 데이터.
도15는 본 발명의 실시예5에 따라 CB-HDF로부터 분비된 엑소좀의 총 수에 대한 Nanosight 분석 데이터.
도16은 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀 내 총 RNA 및 총 단백질 양 분석 데이터.
도17은 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀 내 RNA에 대한 Gene ontology 분석 데이터.
도18은 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀 내 RNA에 대한 RNA-seq 분석 데이터.
도19는 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀 내 세포 증식, 텔로미어 증가 및 항노화 관련 일부 RNA에 대한 qPCR 분석 데이터.
도20은 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀 내 TERT 단백질에 대한 면역형광 분석 데이터.
도21은 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀의 세포 처리에 따른 텔로미어 길이 변화 분석 데이터.
도22는 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀의 세포 처리에 따른 세포 종류별 텔로미어 길이 변화 분석 데이터.
도23은 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀의 세포 처리 후 해당 세포 내 텔로미어 qFISH 분석 데이터.
도24는 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀의 세포 처리 후 해당 세포 내 Tel-seq 분석 데이터.
도25는 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀의 세포 처리 후 해당 세포 내 RNA에 대한 Gene ontology 분석 데이터.
도26은 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀의 세포 처리 후 해당 세포 내 RNA에 대한 RNA-seq 분석 데이터.
도27은 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀의 세포 처리 후 해당 세포 내 TERT RNA 및 단백질 발현 분석 데이터.
도28은 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀의 세포 처리 후 해당 세포 내 세포 분열 마커 분석 데이터.
도 29는 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀의 세포 처리 후 해당 세포 내 엑소좀 농도별 세포 분열 마커 분석 데이터.
도 30은 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀의 세포 처리 후 해당 세포 내 β-galactosidase 활성 분석 데이터.
도 31은 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀의 마우스 귀 도포 후 해당 부위의 엑소좀 농도별 텔로미어 길이 및 TERT RNA 발현량 분석 데이터.
도 32는 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀의 마우스 귀 도포 후 해당 부위의 엑소좀 처리 시간별 텔로미어 길이 및 FISH 분석 데이터.
도 33은 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀의 마우스 귀 도포 후 해당 부위의 엑소좀 처리 시간별 세포 증식 관련 유전자의 RNA 및 단백질 발현 분석 데이터.
도 34는 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀의 마우스 귀 도포 후 해당 부위의 엑소좀 처리 시간별 TERT RNA 발현 및 면역형광 분석 데이터.
도 35는 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀의 세포 처리 농도별 wound healing assay 데이터.
도 36은 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀의 in vivo 처리 농도별 wound healing assay 데이터.
도 37은 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀의 마우스 피부 도포 시 조직 침투 및 조직재생 마커 발현 분석 데이터.
도 38은 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀의 조로증 환자 유래 세포 처리 시 텔로미어 관련 분석 데이터.
도 39는 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀의 조로증 환자 유래 세포 처리 시 세포 증식 관련 분석 데이터.
도 40은 본 발명의 실시예5에 따라 제조된 엑소좀의 조로증 환자 유래 세포 처리 시 β-galactosidase 활성 분석 데이터.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 않으며 본 발명은 후술할 청구범위의 의해 정의될 뿐이다.

덧붙여, 본 발명에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 발명의 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 '포함'한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.

또한, 본 발명에서 유전자라는 지칭 하에 사용한 각 유전자의 고유 명칭은 공식적으로 알려진 유전자명, 관용적으로 사용되는 명칭 또는 그 유전자의 산물의 명칭, 예컨대 단백질을 코딩하는 유전자의 경우 그 단백질이다.

본 발명의 발명자들은 대한민국 등록특허 제10-1855967호에서 세포 및 배양 배지의 혼합물에 환경유입을 촉진할 수 있는 물리적 자극을 제공하고, 상기 물리적 자극을 제공받은 혼합물을 일정 시간 배양하여 상기 세포를 리프로그래밍할 수 있으며, 상기 혼합물로부터 수득된 엑소좀을 세포에 처리할 경우 리프로그래밍된 세포를 수득할 수 있다는 것을 개시한 바 있다. 여기서 리프로그래밍의 방향은 물리적 자극을 받는 세포 또는 엑소좀이 처리되는 세포의 종류와는 관계없이 물리적 자극시 배지의 조성에 따라 다르게 나타난다는 것을 밝혔다. 추후 상기 세포 리프로그래밍 방법의 효과를 분석하는 과정에서, 세포에 물리적 자극을 가함으로써 텔로미어 신장과 관련된 유전자군의 발현이 증가된다는 것을 확인하게 되었다. 이에 대한 추가 연구를 통해, 개시된 발명과는 다르게 실험한 세포의 종류뿐만 아니라 배지의 조성에까지 관계없이 물리적 자극에 의해 텔로미어를 신장할 수 있는 것을 확인하여 환경 유입보다도 물리적 자극 자체에 의해서 텔로미어 신장이 유도된다는 결론을 내릴 수 있었다. 이때, 텔로미어 신장과 관련된 인자들의 발현이 증가될 뿐 아니라 이들 인자들을 함유한 엑소좀의 분비 역시 크게 증가한다는 것을 확인하고, 이를 새로운 발명으로 개시하게 되었다.

본 발명의 일 측면에 따른, 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀은 TERT, TERF2, DKC1, TERF2IP, RFC1, RAD50, TERF1, PINX1, TNKS1BP1, ACD, NBN, HSPA1L, PARP1, PTGES3, SMG6, BLM, XRCC5, XRCC6, ERCC4, PRKDC, TEP1 및 β-Catenin 중에서 선택된 유전자 하나 이상의 RNA 또는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다. 가장 바람직하게 상기 엑소좀은 상기 모든 유전자의 RNA 또는 단백질을 포함할 수 있다.

여기서, TERT(Telomerase reverse transcriptase)는 텔로머레이즈의 촉매활성을 가지는 서브유닛이고, TERF1(Telomeric repeat binding factor 1) 및 TERF2(Telomeric repeat binding factor 2)는 텔로미어 서열을 인식한다. DKC1(Dyskerin pseudouridine synthase 1), RFC1(Replication factor C subunit 1), TNKS1BP1(Tankyrase 1 binding protein 1), NBN(Nibrin), HSPA1L(Heat shock protein family A member 1 like), PARP1(Poly ADP-ribose polymerase 1), PTGES3(Prostaglandin E synthase 3), SMG6(Smg6 homolog, Nonsense mediated mRNA decay factor), XRCC5(X-ray repair cross complementing 5), XRCC6(X-ray repair cross complementing 6)는 텔로미어의 안정화와 유지에 필요한 것으로 알려져 있다. TERF2IP(TERF2 interacting protein), RAD50 (RAD50 Homolog, Double strand break repair protein)은 텔로미어 재조합을 억제하며, PINX1(PIN2/TERF1-interacting telomerase inhibitor 1)는 TERF1 및 TERT의 인(nucleolus) 내 축적을 매개하고 TRF1가 텔로머레이즈에 결합하는 것을 도우며 S기에 텔로머레이즈 활성을 저해하는 것으로 보고되었다. ACD(Adrenocortical Dysplasia protein homolog), ERCC4(Excision repair cross-complementation group 4), PRKDC(Protein kinase, DNA-activated, catalytic subunit)는 텔로미어의 길이조절 및 보호를 위해 필요하며, BLM(Bloom syndrome protein) DNA합성시 텔로미어 증폭을 돕고, TEP1(Telomerase associated protein 1)은 텔로머레이즈 복합체의 일부를 형성한다. β-Catenin은 TERT발현을 촉진하는 전사조절인자이다. 상기 인자는 모두 텔로미어의 신장 및 안정화 효과를 가지는 것으로 보고된 바 있다. 상기와 같은 유전자 산물을 포함하는 본 발명의 일측면에 따른 텔로미어를 신장시키는 엑소좀은 후술할 다양한 효과를 위해 이용될 수 있다.

상기 엑소좀은 세포에 물리적 자극을 제공하여 유도된 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 물리적 자극의 형태는 저주파, 초음파, 고주파, 열, 빛, 전기파, 전파, 당김(stretch), 압축(compression) 중에서 선택될 수 있고, 바람직하게 초음파, 열 및 빛 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 엑소좀을 유도할 수 있는 물리적 자극을 제공하는 과정은 세포와 배지를 혼합한 후 상기 혼합물에 물리적 자극을 제공하거나, 배지에 물리적 자극을 제공한 후 상기 배지와 세포를 혼합하거나, 세포에 물리적 자극을 제공한 후 상기 세포와 배지를 혼합하거나, 세포에 물리적 자극을 제공한 후 상기 세포와 배지를 혼합한 다음 상기 혼합물에 물리적 자극을 제공하거나, 배지에 물리적 자극을 제공한 후 상기 배지와 세포를 혼합한 다음 상기 혼합물에 물리적 자극을 제공하거나, 세포와 배지에 각각 물리적 자극을 제공한 후 상기 세포 및 상기 배지를 혼합하거나, 세포와 배지에 각각 물리적 자극을 제공한 후 상기 세포 및 상기 배지를 혼합한 다음 상기 혼합물에 물리적 자극을 제공하는 방식 중에서 선택된 어느 하나 이상의 방식으로 진행되는 것을 특징으로 할 수 있다. 이러한 물리적 자극의 제공은 세포에 직간접적인 방법으로 1회 이상 또는 상기 방식 중에서 하나 이상을 선택한 조합으로 진행될 수 있고, 횟수가 증가함에 따라 엑소좀의 텔로미어 신장 효과가 비례적으로 증가할 수 있다. 이렇게 1회 이상 물리적 자극을 제공할 때에는 각 회차 사이에 세포가 회복할 수 있도록 시간 간격을 두는 것이 바람직하며, 상기 시간 간격은 1일 이상, 좀더 바람직하게 2일 이상으로 둘 수 있다.

상기 물리적 자극은 초음파 자극이고, 상기 직접적인 초음파 자극은 강도가 0.1 내지 3 W/cm²이며, 주파수가 20 kHz 내지 20 MHz이고, 지속시간이 0.1초 내지 20분인 것을 특징으로 하며, 상기 간접적인 초음파 자극은, 강도가 1 내지 20 W/cm²이고, 주파수가 20 kHz 내지 20 MHz이며, 지속시간이 0.1초 내지 20분인 것을 특징으로 할 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 직접적인 초음파 자극은 강도가 0.5 내지 2 W/cm²이며, 주파수가 20 kHz 내지 2 MHz이고, 지속시간이 0.1초 내지 10분인 것을 특징으로 하며, 상기 간접적인 초음파 자극은, 강도가 2내지 10 W/cm²이고, 주파수가 20 kHz 내지 2 MHz이며, 지속시간이 1초 내지 15분인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 빛 자극은 레이저 또는 발광 다이오드(light-emitting diode) 빛 중에서 선택된 어느 하나의, 파장 대역 300 내지 900 nm의 펄스형 빔을 1 내지 10초 동안, 보다 바람직하게 3 내지 7초 동안 조사하여 가하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 엑소좀은 엑소좀 1X10⁸ 개 입자 내에 총 RNA가 100 ng 이상, 바람직하게 150 ng 이상, 더 바람직하게 180 ng 이상 포함된 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 엑소좀은 엑소좀 1X10⁸ 개 입자 내에 총 단백질이 0.5 μg 이상, 바람직하게 1 μg 이상, 더 바람직하게 1.2 μg 이상 포함된 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 엑소좀을 세포에 처리시 상기 세포의 telomerase 활성이 높아지는 것을 특징으로 할 수 있다. 이러한 텔로머레이즈 활성의 증가는 세포에 처리 후 텔로미어 길이 신장 및 세포 분열 촉진으로 연결될 수 있다.

상기 엑소좀을 세포에 처리시 상기 세포의 β-galactosidase활성이 감소되는 것을 특징으로 할 수 있다. β-galactosidase는 베타갈락토사이드(β-galactoside)의 단당류로의 가수분해를 촉매하는 효소인데, 리소좀 β-galactosidase는 노화된 세포(senescent cell)에서 과발현되어 축적된다. 그 결과 노화된 세포에서는 β-galactosidase의 활성이 높게 나타나는 것으로 보고된 바 있는데, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀을 세포에 처리하면 상기 효소의 활성이 낮아지는 것으로 나타나, 상기 엑소좀은 항노화 효과를 가지는 것으로 판단할 수 있다.

상기 엑소좀은 전술한 텔로미어 신장 및 안정화 기능을 하는 각종 인자의 유전자 산물을 포함하고 있고, 엑소좀은 혈류를 따라 이동하여 세포에 직접 상기 인자들을 전달하여 치료효과를 나타낼 수 있으므로, 이러한 엑소좀을 포함하는 조성물은 이러한 유전자의 활성이 필요한 개체에 치료 목적으로 사용될 수 있다. 예컨대, 우선 선천성 각하이상증, 재생불량성 빈혈, 베르너증후군(Werner syndrome), 블룸증후군(Bloom syndrome), 모세혈관확장성운동실조(Ataxia-telangiectasia), NBS(Nijmegen breakage syndrome), 모세혈관확장성 운동실조유사증후군(Ataxia-telangiectasia-like syndrome), 폐섬유증(Pulmonary fibrosis) 등 텔로미어 유지 이상으로 발생하는 것으로 알려진 질병의 치료 또는 개선을 위해 사용될 수 있다. 그 외에도 세포의 노화와 소실로 나타나는 각종 질병과 증상, 예컨대 치매, 운동실조, 연골 및 뼈의 퇴화 등의 각종 퇴행성 질환, 크론병, 만성폐색성폐질환 등을 포함하는 자가면역질환, 고혈압, 대사증후군, 당뇨병, 피부노화, 색소이상, 탈모, 피부노화 등의 치료 또는 개선에 사용될 수 있다. 추가적으로, 화상, 상처, 부상, 장기부전(organ failure), 장기소실, 궤양 등 각종 손상에 대한 빠른 재생을 위해 사용될 수 있다.

여기서, 상기 조성물은 상기 엑소좀이 최소한 10²개/ml농도, 바람직하게 10⁶ 내지 10¹⁴개/ml농도로 포함된 것일 수 있다.

상기 조성물은 경구, 정맥, 근육, 피부, 경막, 경피 투여 중에서 선택된 어느 한 방법으로 투여될 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게, 상기 조성물은 피부 또는 경피 투여될 수 있다. 상기 조성물은 전술한 바와 같은 유효투여량의 엑소좀 외에도 약학적으로 포함될 수 있는 희석제, 방부제, 용해제, 유화제, 어쥬반트(adjuvant), 완충제 및 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 성분으로는 중성완충식염수, 인산완충식염수 등의 완충액, 글루코스, 만노스, 수크로즈, 덱스트란, 만니톨 등의 탄수화물, 폴리펩티드, 글리신 등의 아미노산, 항산화제, EDTA, 글루타티온 등의 킬레이트 시약, 알루미늄 하이드록시드 등의 어쥬반트 및 보존제 등이 있다.

상기 투여경로의 선택 및 각 투여경로에 따른 추가성분 및 그 조성은 본 발명의 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있는 바이므로, 이에 대한 자세한 설명은 생략한다.

여기서, 상기 물리적 자극의 형태는 저주파, 초음파, 고주파, 열, 빛, 전기파, 전파, 당김(stretch), 압축(compression) 중에서 선택될 수 있고, 바람직하게 초음파, 열 및 빛 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 세포에 직간접적으로 물리적 자극을 제공하는 과정은 세포와 배지를 혼합한 후 상기 혼합물에 물리적 자극을 제공하거나, 배지에 물리적 자극을 제공한 후 상기 배지와 세포를 혼합하거나, 세포에 물리적 자극을 제공한 후 상기 세포와 배지를 혼합하거나, 세포에 물리적 자극을 제공한 후 상기 세포와 배지를 혼합한 다음 상기 혼합물에 물리적 자극을 제공하거나, 배지에 물리적 자극을 제공한 후 상기 배지와 세포를 혼합한 다음 상기 혼합물에 물리적 자극을 제공하거나, 세포와 배지에 각각 물리적 자극을 제공한 후 상기 세포 및 상기 배지를 혼합하거나, 세포와 배지에 각각 물리적 자극을 제공한 후 상기 세포 및 상기 배지를 혼합한 다음 상기 혼합물에 물리적 자극을 제공하는 방식 중에서 선택된 어느 하나 이상의 방식으로 진행되는 것을 특징으로 할 수 있다. 이러한 물리적 자극의 제공은 세포에 직간접적인 방법으로 1회 이상 또는 상기 방식 중에서 하나 이상을 선택한 조합으로 진행될 수 있고, 횟수가 증가함에 따라 엑소좀의 텔로미어 신장 효과가 비례적으로 증가할 수 있다. 이렇게 1회 이상 물리적 자극을 제공할 때에는 각 회차 사이에 세포가 회복할 수 있도록 시간 간격을 두는 것이 바람직하며, 상기 시간 간격은 1일 이상, 좀더 바람직하게 2일 이상으로 둘 수 있다.

상기 물리적 자극은 초음파 자극이고, 상기 직접적인 초음파 자극은 강도가 0.1 내지 3 W/cm²이고, 주파수가 20 kHz 내지 20 MHz이며, 지속시간이 0.1초 내지 20분인 것을 특징으로 하고, 상기 간접적인 초음파 자극은, 강도가 1 내지 20 W/cm²이고, 주파수가 20 kHz 내지 20 MHz이며, 지속시간이 0.1초 내지 20분인 것을 특징으로 할 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 직접적인 초음파 자극은 강도가 0.5 내지 2 W/cm²이며, 주파수가 20 kHz 내지 2 MHz이고, 지속시간이 0.1초 내지 10분인 것을 특징으로 하며, 상기 간접적인 초음파 자극은, 강도가 2내지 10 W/cm²이고, 주파수가 20 kHz 내지 2 MHz이며, 지속시간이 1초 내지 15분인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 물리적 자극은 빛 자극이고, 상기 빛 자극은 레이저 또는 발광 다이오드(light-emitting diode) 빛 중에서 선택된 어느 하나의, 파장 대역 300 내지 900 nm의 펄스형 빔을 1 내지 10초 동안, 보다 바람직하게 3 내지 7초 동안 조사하여 가하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀의 제조방법은 다양한 세포에 적용했을 때 모두 각 세포의 텔로미어를 신장시킬 수 있는 엑소좀 분비를 유도하는 것으로 나타났다. 상기 세포는 포유류 유래의 줄기세포, 전구세포, 섬유아세포, 각질세포 또는 기관 내 조직세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 텔로미어를 신장시키는 엑소좀을 생체 적용 목적으로 사용할 경우, 상기 세포는 자가유래(autologous), 동종유래(allogeneic) 또는 이종유래(heterologous) 중 어느 하나일 수 있고, 이종유래인 경우 바람직하게 포유류로부터 얻어진 것일 수 있다. 면역거부반응에 대한 가능성을 줄이기 위해, 바람직하게는 동종유래, 가장 바람직하게는 자가유래의 것을 사용할 수 있다. 상기 세포는 각각 포유류 유래의 줄기세포, 전구세포, 섬유아세포, 각질세포 또는 기관 내 조직세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 배지는 배양 배지 또는 분화유도 배지 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 여기서, '배양 배지'는 특정 세포의 균일성을 유지하면서 그 세포의 생존에 최적화되어 있는 배지로, 균일한 세포의 증식을 위해 사용되는 배지이다. 반면, '분화유도 배지'는 특정 세포를 다른 분화능을 가지는 세포로 유도하기 위한 배지를 말한다.

상기 혼합물의 배양은 1시간 내지 10일 동안 진행되는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게 1일 내지 5일 동안 진행될 수 있다. 이렇게 배양하는 시간이 필요한 것은, 전술한 물리적 자극을 세포에 가하면 후술할 다양한 유전자의 발현이 증가되는데, '유전자 발현'은 전사와 단백질 합성 등 생활성 물질의 합성과 접힘(folding), 상기 물질의 세포 내 필요한 위치로의 이동을 포함하며, 따라서 실제로 텔로미어의 신장 효과를 가지는 생활성 물질이 로딩된 엑소좀이 생성되기까지는 시간이 소요되기 때문이다. 또한, 초음파 처리 후 시간이 지남에 따라 엑소좀의 생성이 감소하는 것으로 나타나 지나치게 긴 배양시간은 엑소좀 제조 효율에 도움이 되지 않을 수 있다.

상기 분리된 엑소좀은 상기 제조방법을 거치기 전의 세포에서 분비된 엑소좀에 비해 TERT, TERF2, DKC1, TERF2IP, RFC1, RAD50, TERF1, PINX1, TNKS1BP1, ACD, NBN, HSPA1L, PARP1, PTGES3, SMG6, BLM, XRCC5, XRCC6, ERCC4, PRKDC, TEP1 및 β-Catenin중에서 하나 이상의 유전자 발현량이 높은 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 유전자들은 텔로미어 신장, 안정화, 보호 등과 같은 기능을 하는 것으로 알려져 있으며, 상기 제조방법에 의해 제조된 엑소좀은 세포에 처리시 텔로미어 신장뿐만 아니라 세포 성장을 촉진하고 항노화 효과를 가지는 것으로 나타났다.

상기 분리된 엑소좀은 세포에 처리시 상기 세포의 telomerase 활성이 높아지는 것을 특징으로 할 수 있다. 이러한 텔로머레이즈 활성의 증가는 세포에 처리 후 텔로미어 길이 신장 및 세포 분열 촉진으로 연결될 수 있다.

상기 분리된 엑소좀을 세포에 처리시 상기 세포의 β-galactosidase 활성이 감소되는 것을 특징으로 할 수 있다. 전술한 바와 같이 상기 효소는 노화된 세포에서 과발현되어 리소좀에 축적되어 활성이 높게 나타나는데, 본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법에 따라 제조된 엑소좀을 세포에 처리시 상기 효소의 활성이 낮아지는 것으로 나타났다.

상기 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀의 제조방법은, 상기 분리된 엑소좀을 조직에 처리시 상기 조직의 재생이 촉진되는 것을 특징으로 할 수 있다. 후술할 바와 같이, 상기 엑소좀은 세포의 이동성 및 세포의 증식을 증가시킬 수 있으며, 텔로미어 관련 유전자 외에도 다수의 세포 주기, 증식, 대사 관련 유전자 발현을 증가시킬 수 있다. 이러한 재생은 물리적인 손상 뿐만 아니라 화학적인 손상까지 모두 대상으로 할 수 있다.

상기 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀의 제조방법은, 상기 분리된 엑소좀을 세포에 처리시 상기 세포에 항노화 효과를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법에 따라 제조된 엑소좀을 세포에 처리시 세포의 β-galactosidase 활성이 감소시킬 수 있었을 뿐 아니라 세포의 이동성 및 증식 역시 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 효과는 정상세포 뿐 아니라 텔로미어 신장에 문제가 있는 조로증 환자의 세포에서도 나타났으므로, 상기와 같은 엑소좀은 노화를 지연 및 방지하거나 조로증 등과 같이 가속화된 노화를 치료하는 데에 이용될 수 있다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

본 발명의 모든 실시예 및 실험예 상의 모든 세포 배양은 37℃, 5% CO₂ 조건에서 이루어졌다.

실시예1. 직접적인 초음파 자극에 의한 세포의 텔로미어 신장 유도

1 ml의 배지 내 1x10⁶ 개 세포에 직접적으로 1 W/cm², 5초간 (20KHz) 초음파 자극을 가한 세포를 culture dish에서 동일한 종류의 배지와 함께 1일 이상 배양하였다.

실시예2. 직접적인 열 자극에 의한 세포의 텔로미어 신장 유도

1 ml의 hES 배지 내 1x10⁶ 개 세포를 1.5 ml tube에 넣어 50℃에 5초간 노출 후 0℃에 10초간 노출시키고, culture dish에서 동일한 종류의 배지와 함께 1일 이상 배양하였다.

실시예3. 직접적인 발광 다이오드 빛 자극에 의한 세포의 텔로미어 신장 유도

1 ml의 hES 배지 내 1x10⁶ 개 세포에 직접적으로 808 nm의 발광 다이오드 레이저 빛 자극(1 W, 500 Hz/sec)을 5초간 가한 세포를 culture dish에서 동일한 종류의 배지와 함께 1일 이상 배양하였다.

실시예4. 간접적인 초음파 자극에 의한 세포의 텔로미어 신장 유도

hES 배지에 0, 3, 5, 10 W/cm²의 초음파를 10분간 처리한 후, 이를 초음파 처리되지 않은 세포와 혼합하여 culture dish에서 1일 이상 배양하였다.

실시예5. 초음파 자극을 이용한, 세포의 텔로미어 신장을 유도할 수 있는 엑소좀의 제조

1 ml의 배지 내 1x10⁶ 개 세포에 직접적으로 1W, 5초간 (20KHz) 초음파 자극을 가한 세포를 culture dish에서 동일한 종류의 배지와 함께 1-2일 배양하였다. 다음으로, 배양액을 회수하여 3000 rpm으로 5분간 원심분리하여 세포나 세포 사멸체 등을 제거하고 상층액만을 회수하여 0.2 μm 필터로 여과하여 0.2 μm 크기 이하 성분만 포함된 여과액을 모으고, 100 kDa 필터에 상기 여과액을 넣고 10000xg로 30분간 원심분리하여 분자량 100 kDa 이하의 성분을 제거하여 농축된 엑소좀을 수득하였다. 상기 농축된 엑소좀이 포함된 100 kDa 필터에 PBS를 넣고 10000xg로 5분간 washing하는 과정을 2회 반복하여 상기 엑소좀 농축액 내 배지 성분을 제거하여 엑소좀을 수득하였다.

실시예6. 세포의 텔로미어 신장을 유도할 수 있는 엑소좀을 이용한 세포의 텔로미어 신장

실시예 5에 따라 제조된 엑소좀(reprosome)을 1X10⁹ particle(개)/ml로 배지에 첨가하여 세포를 배양하였다.

실험예1. 세포 종류에 따른 텔로미어 신장 효과 분석

세포 종류에 따른 실시예1의 효과를 비교하기 위해 1 ml의 DMEM 배지(섬유아세포 배양배지) 내 1x10⁶ 개의 CB-HDF(세포바이오), Adipo-MSC(황동연 교수 실험실), HDFa(Invitrogen), HFF(차의과학대학), Hef(차의과학대학), GFP-HDF(GFP-HNDF, Angio-proteomie), Skin Fibroblast(60세 뇌졸중 환자샘플, IRB를 통해), HDP(세포바이오), L132(ATCC), h-PreAdipo(ATCC), CB-HDF x/Entr 및 MSC x/Entr 각각에 대하여 실시예1에 따라 초음파 자극을 가한 후 0, 1 및 2일간 배양하고, 텔로미어 길이를 분석하였다(여기서 CB-HDF x/Entr 및 MSC x/Entr는 본 발명의 발명자에 의한 연구(Lee et al., An ultra-effective method of generating extramultipotent cells from human fibroblasts by ultrasound, Biomaterials, 2017.)의 초음파 처리를 통한 다능성 세포 유도 방법을 적용하여 각각 CB-HDF 및 MSC로부터 인간배아줄기세포 배양배지에서 유도된 다능성 세포이다). 이때, 텔로미어의 길이는 키트를 사용하여 qPCR 방법에 따라 분석하였다(Absolute Human Telomere Length Quantification qPCR Assay Kit, Cat No. 8918, ScienCell^TM). 그 결과, 도1 및 표1과 같이 세포의 종류에 관계없이 모두 텔로미어가 신장된 것으로 나타났다.

세포 종류	대조군 대비 텔로미어 길이 변화량
세포 종류	절대값(kb)	상대값(배)
CB-HDF	12.04	4.47
MSC	1.65	2.28
HDFa	2.36	1.79
HFF	2.00	2.14
Hef	3.22	3.80
GFP-HDF	2.36	1.79
Skin Fibroblast	0.57	1.34
HDP	4.05	2.40
L132	1.30	1.54
h-PreAdipo	3.15	2.44
CB-HDF x/Entr	0.85	1.26
MSC x/Entr	1.82	2.93

실험예2. 물리적 자극의 종류에 따른 텔로미어 신장 효과 분석

물리적 자극의 종류에 따른 텔로미어의 신장 효과를 분석하기 위해, 인간배아줄기세포 배양배지와 CB-HDF를 이용하여 실시예 1 내지 3에 따라 각 물리적 자극을 가한 후 0, 1 및 2일간 배양하고, 텔로미어 길이를 qPCR 방법에 따라 분석하였다. 그 결과 도2와 같이, 초음파, 열 및 빛 자극 모두 텔로미어를 신장시키는 것으로 나타났다.

실험예3. 간접적 초음파 자극에 의한 텔로미어 신장 효과 분석

직접적 물리적 자극이 아니라 간접적 물리적 자극에 의해서도 텔로미어가 신장되는지 확인하기 위해, 실시예2에 따라 CB-HDF에 간접적 초음파 자극을 가한 후 1일간 배양하고 텔로미어 길이를 qPCR 방법에 따라 분석하였다. 그 결과 도3과 같이, 간접적 초음파의 경우 사용된 초음파의 강도에 비례적으로 텔로미어 신장 효과가 큰 것으로 나타났다.

실험예4. 배지조성에 따른 초음파 처리 후 텔로미어 신장 효과 분석

배지조성에 따른 실시예1의 효과를 비교하기 위해, 1 ml의 인간배아줄기세포 배양배지, 신경줄기세포 배양배지, 1차 생식세포 배양배지, DMEM 배지 각각 내 1x10⁶ 개 CB-HDF에 실시예1에 따라 초음파 자극을 가한 후 0, 1 및 2일간 배양하고, 텔로미어 길이를 qPCR 방법에 따라 분석하였다. 그 결과, 도4와 같이 배지조성과 관계없이 모두 텔로미어가 신장된 것으로 나타났다.

실험예5. 초음파 처리 횟수에 따른 텔로미어 신장 효과 분석

실시예1에 따른 초음파 처리를 반복시에 차이가 나타나는지 확인하기 위해, 1 ml의 DMEM배지 내 1x10⁶ 개 CB-HDF에 실시예1에 따라 초음파 자극을 가하고 1, 3 및 6일 배양하였는데, 이때 초음파 자극은 최초 1회 가하거나 2일 간격으로 가하였고, 텔로미어 길이를 qPCR 방법에 따라 분석하였다. 그 결과, 도5와 같이 초음파 처리 횟수에 관계없이 모두 텔로미어 길이가 증가하였으며, 초음파 처리 횟수가 높을수록 초음파를 처리하지 않은 대조군 대비 텔로미어 길이의 증가폭이 큰 것으로 나타났다.

실험예6. 세포 종류에 따른 초음파 처리 후 TERT 유전자 발현 분석

세포 종류에 따라 실시예1에 따른 TERT 유전자 발현량 변화에 차이가 나타나는지 확인하기 위해, 1 ml의 DMEM배지 내 1x10⁶ 개 CB-HDF, Adipo-MSC, HDFa HFF Hef, GFP-HDF, Skin Fibroblast, HDP, L132, h-PreAdipo, CB-HDF x/Entr 및 MSC x/Entr에 각각 실시예1에 따라 초음파 자극을 가하고 0, 1 및 2일 배양하고, TERT 유전자 발현 변화를 qPCR 방법에 따라 분석하였다. 그 결과, 도6 및 표2와 같이 세포 종류에 관계없이 모두 TERT 발현량이 증가한 것으로 나타났다. 또한, 도7과 같이 CB-HDF 및 Adipo-MSC를 이용한 경우, TERT의 발현량이 초음파 처리 후 배양 1일차에 크게 증가했다가 2일차에는 다시 감소한 것으로 나타났는데, TERT의 지속적인 발현은 암 등의 발생 위험을 가지고 있는 바, 한시적인 TERT 발현을 통해 이러한 위험을 낮추면서 짧아진 텔로미어에 의해 일어나는 노화 관련 증상에 대한 개선을 기대할 수 있다.

세포 종류	대조군 대비 TERT 유전자 발현 변화량(배)
CB-HDF	5.4
MSC	19.46
HDFa	21.61
HFF	16.81
Hef	3.50
GFP-HDF	3.05
Skin Fibroblast	1.53
HDP	2.66
L132	6.88
h-PreAdipo	11.92
CB-HDF x/Entr	3.08
MSC x/Entr	22.20

실험예7. 초음파 처리에 의한 세포 내 β-Catenin 유전자 발현 변화 분석

실시예1에 따른 텔로미어 신장 방법이 TERT의 전사활성인자인 β-Catenin 유전자에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해, 1 ml의 DMEM배지 내 1x10⁶ 개 CB-HDF 및 Adipo-MSC에 실시예1에 따라 초음파 자극을 가하고 0, 1 및 2일간 배양하고, β-Catenin 유전자 발현 변화를 qPCR 방법에 따라 분석하였다. 그 결과, 도8과 같이 실험한 두 세포 종류 모두 β-Catenin 발현량이 증가한 것으로 나타났다.

실험예8. 초음파 처리에 의한 세포 내 텔로머레이즈 활성 변화 분석

실시예1에 따른 텔로미어 신장 방법이 텔로머레이즈 활성에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해, 1 ml의 DMEM배지 내 1x10⁶ 개 CB-HDF 및 Adipo-MSC에 실시예1에 따라 초음파 자극을 가하고 0, 1 및 2일간 배양한 후, 텔로머레이즈 활성을 Sciencell의 Telomerase Activity Quantification qPCR kit(TAQ)으로 분석하였다. 그 결과, 도9와 같이 실험한 두 세포 종류 모두 텔로머레이즈 활성이 증가한 것으로 나타났다.

실험예9. 초음파 처리된 세포의 텔로미어 FISH

실시예1에 따른 텔로미어 신장 방법에 의한 텔로미어의 증가를 또 다른 방법으로 확인하기 위해, 1 ml의 DMEM배지 내 1x10⁶ 개 CB-HDF 및 Adipo-MSC에 실시예1에 따라 초음파 자극을 가하고 1일간 배양한 후, TelG telomere probe(TTAGGGTTAGGGTTAGGG)를 이용하여 FISH를 수행하고, 형광시그널을 공초점현미경으로 분석하였다. 이때, Hoechst 33342로 대조염색하였다. 그 결과, 도10과 같이 실험한 두 세포 종류 모두 텔로미어 양이 증가한 것으로 나타났다.

실험예10. 초음파 처리된 세포의 Ki67 및 TERT 세포면역형광염색

실시예1에 따른 텔로미어 신장 방법에 의한 TERT 유전자 발현이 단백질 발현 증가로 이어지는지 확인하기 위해, 1 ml의 DMEM배지 내 1x10⁶ 개 CB-HDF에 실시예1에 따라 초음파 자극을 가하고 1일간 배양한 후, 항 Ki67 및 항TERT항체를 이용하여 형광염색하고, 이를 공초점현미경으로 분석하였다. 이때, 동 세포는DAPI로 대조염색하였다. 그 결과, 도11과 같이 초음파 처리시 TERT 단백질 모두 텔로미어가 증가하였을 뿐 아니라, 추가적으로 세포 분열 마커인 Ki67 단백질의 발현 또한 증가한 것으로 나타났다.

실험예11. 초음파 처리된 세포의 노화 관련 β-galactosidase 활성 분석

실시예1에 따른 텔로미어 신장 방법에 의한 전술한 변화가 세포 노화에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해, 1 ml의 DMEM배지 내 1x10⁶ 개 CB-HDF에 실시예1에 따라 초음파 자극을 가하고 1일 및 3일간 배양한 후, 세포 내 노화와 상관관계가 있는 것으로 알려진 β-galactosidase의 활성에 대한 시험을 X-gal을 이용하여 수행하고, 이를 위상차현미경으로 분석하였다. 이때, 초음파 처리는 최초 1회 또는 매 2일마다 진행하였다. 그 결과, 도12와 같이 β-galactosidase 활성이 낮아진 것을 확인할 수 있었으며, 따라서 본 발명에 따른 텔로미어 신장 방법은 항노화효과가 있는 것으로 나타났다.

실험예12. 초음파 처리를 이용한 제조방법에 따른 엑소좀 생산효율 및 상기 엑소좀 내 성분 분석

실시예 5에 따라 엑소좀을 제조하고, 엑소좀 생산 효율을 분석해보았다. 우선 초음파 처리 24시간 후 HDF의 엑소좀 마커(CD63) 발현을 면역형광염색으로 분석한 결과(이때, 대조염색은 DAPI를 이용하였다), 엑소좀을 처리하지 않은 군에 비해 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다(도13). 상기 마커의 발현이 실제 엑소좀 분비로 연결되었는지 알아보기 위해 Nanosight LM10 현미경을 이용하여 분석하였으며, 그 결과 초음파 처리군에서 특히 30-200 nm 직경을 가지는 엑소좀이 다량 분비되었고, 특히 총 엑소좀 수가 9.02±0.47X10⁸개/ml로 초음파를 처리하지 않은 군(1.5±0.43X10⁸개/ml)에 비해 5배 이상 증가한 것을 확인할 수 있었다(도14 및 15).

다음으로, 실시예 5와 같이 초음파를 처리하여 분비 유도된 엑소좀 내 RNA 및 단백질의 총량에 변화가 있는지 분석해보았다. 총 RNA는 엑소좀으로부터 총 RNA를 TRIzol (RNAi, Takara, Otsu, Japan)을 이용하여 추출 후 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA, USA)로 정량한 결과, 1x10⁶개 세포로부터 분비된 엑소좀 내 총 RNA 양은 실시예 5와 같이 초음파를 처리하여 제조한 경우 1003.5±167.6 ng으로, 초음파 처리하지 않은 경우(186.3±17.3 ng)에 비해 5배 이상 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이때, 같은 엑소좀 수(1x10⁸ 개 엑소좀) 대비 총 RNA 양은 222.4±37.1 ng으로, 초음파 처리하지 않은 경우(241.5±22.5 ng)와 유사한 수준을 나타내었다(도16 및 표3). BCA 방법으로 총 단백질을 정량한 결과, 1x10⁶개 세포로부터 분비된 엑소좀 내 총 단백질 양은 실시예 5와 같이 초음파를 처리하여 제조한 경우 6.11±0.058 μg으로, 초음파 처리하지 않은 경우(0.15±0.009 μg)에 비해 약 40배 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이때, 같은 엑소좀 수(1x10⁸ 개 엑소좀) 대비 총 단백질 양은 1.35±0.013 μg으로, 초음파 처리하지 않은 경우(0.20±0.012 μg)에 비해 6배 이상 증가된 것으로 나타났다(도16 및 표3).

	Total RNA (ng)		Total protein (ug)
Sample name	HDF-exo	Reprosome	HDF-exo	Reprosome
Average	241.5356	222.4102	0.197332	1.354832
SEM	22.4809	37.14242	0.011881	0.012999

실험예13. 초음파 처리에 의해 세포로부터 분비 유도된 엑소좀 내 RNA 및 단백질 분석

실시예 5에 따라 제조된 엑소좀 내 RNA를 동정하기 위해 RNA-seq을 진행하고, Gene ontology 분석을 수행하였다. 그 결과, 텔로미어 유지 및 조성, 세포 주기 및 증식, DNA 수리 및 증폭과 관련된 유전자가 다수 존재하였으며(도 17-18), 특히 표4와 같이 실험군 세포에서 분비된 엑소좀에서는 텔로머레이즈 활성 관련 유전자와 텔로미어 유지 및 보호와 관련된 유전자의 발현이 증가한 것으로 나타났다.

분류	유전자	Read count
분류	유전자	HDF.Exo	x.Exo
텔로머레이즈 활성 관련 유전자	TNKS1BP1	0	17
	PINX1	0	15
	TERF1	0	7
	RAD50	0	6
	RFC1	0	5
	TERF2IP	0	5
	DKC1	0	3
	TERF2	0	3
	TERT	0	3
텔로미어 유지 및 보호 관련 유전자	TEP1	0	94
	PRKDC	0	33
	ERCC4	0	23
	XRCC5	0	19
	XRCC6	0	18
	TNKS1BP1	0	17
	PINX1	0	15
	BLM	0	11
	SMG6	0	11
	PTGES3	0	10
	PARP1	0	7
	TERF1	0	7
	RAD50	0	6
	RFC1	0	5
	TERF2IP	0	5
	HSPA1L	0	4
	NBN	0	4
	ACD	0	3
	DKC1	0	3
	TERF2	0	3
	TERT	0	3

또한, 엑소좀 내 세포 증식, 텔로미어 증가 및 항노화 관련 RNA를 qPCR로 분석한 결과, 세포 증식과 관련된 Cyclin-D1 및 PCNA, 텔로미어 증가와 관련된 Ctnnb1, TERT 및 STAT3, 항노화와 관련된 TEP1, MMP1, MMP2, MMP9, Elastin, Keratin, HYAL1, Laminin, Filaggrin, Invducrin 등의 RNA가 검출하기 힘든 수준인 대조군에 비해 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다(도19).

초음파 자극에 의해 분비된 엑소좀 내 TERT 단백질을 확인하기 위해 엑소좀 마커와 TERT 단백질에 대한 면역형광염색을 진행한 결과, 두 시그널이 겹치는 부분을 다수 확인할 수 있었다(도20). 이를 상기 엑소좀 내 RNA 분석결과와 종합해 볼 때, 실시예 5에 따라 제조된 엑소좀에는 다량의 텔로미어 증가, 세포 증식 및 항노화 등과 관련된 RNA 및 단백질이 포함되어 있는 것으로 보인다.

실험예14. 초음파 처리에 의해 분비 유도된 엑소좀 처리된 세포의 텔로미어 분석

실시예 5에 따라 제조된 엑소좀으로 세포의 텔로미어 신장에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해 세포를 상기 엑소좀을 포함한 배양액에서 배양하고, 2일 후 텔로미어 길이를 qPCR 방법에 따라 분석하였다. 그 결과, 엑소좀을 처리하기 전(con) 세포 및 엑소좀을 처리하지 않고 2일 배양한 군(non)에 비해 엑소좀 처리 농도가 높아짐에 따라 유의미하게 텔로미어 길이가 길어진 것으로 나타났다(도21).

다음으로, 상기 엑소좀의 텔로미어 신장 효과가 세포에 따라 다르게 나타나는지 확인하기 위해 HDF, HEK, HDP 및 Adipo-MSC을 실시예 6에 따라 상기 엑소좀을 1X10⁹ 개/ml 농도로 포함한 배양액에서 각각 0, 1, 2일간 배양하고 텔로미어 길이 및 텔로머레이즈 활성을 분석하였다. 그 결과, 실험한 4종류의 세포에서 모두 유의미하게 텔로미어가 신장되고 텔로머레이즈 활성 또한 높은 것으로 나타났으며(도22), 종합해보면 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 엑소좀은 세포에 처리시 세포 종류에 상관없이 텔로미어 신장 효과를 가질 수 있음을 확인할 수 있었다.

텔로미어 신장을 추가적으로 검증하기 위해 텔로미어의 반복서열인 TTAGGG sequence에 상보적이며 Cy3로 label된 PNA telomere probe 및 Hoechst33342로 염색하였다. 이때, 실험전 전처리로 Colcemid 를 배지에 48시간 동안 처리하여 세포 핵내 chromosome이 생성되는 분열 중기 상태로 고정하고, 저삼투압 배지와 고정액 등을 이용하여 세포 핵내 chromosome을 슬라이드 글라스에 붙여준 다음, hybridizstion buffer와 PNA probe 가 섞인 용액(미리 90도로 가온)을 chromosome에 첨가하여 85도에서 10분간 배양후 RT에서 서서히 1시간동안 냉각 후 2xSSC buffer로 washing하여 핵 염색 시약인 Hoechst 33342로 염색후 mounting 하여 Confocal laser 현미경으로 1000배 이상의 배율로 chromosome 대비 Telomere 형광 발현을 분석하였다. 그 결과, 도23a와 같이 상기 엑소좀을 1X10⁹ 개/ml 농도로 포함한 배양액에서 2일간 배양한 세포군에서 엑소좀을 처리하지 않은 대조군에 비해 Cy3 형광이 좀더 강하게 나타나는 빈도가 높다는 것을 알 수 있었다. 다음으로, 실험군과 대조군에서 염색체(Hoechst33342) 대비 텔로미어 형광강도 차이를 비교한 결과(도23b) 및 이렇게 분석된 수치의 평균으로부터 텔로미어 길이를 분석한 텔로미어 qFISH 결과(도23c), 텔로미어가 유의미하게 신장되었음을 확인할 수 있었다.

다음으로, whole genome sequencing을 통해 텔로미어 말단의 반복적인 서열의 빈도를 분석해보았다. 우선 TTAGGG 서열 빈도를 분석한 결과, 상기 엑소좀을 1X10⁹ 개/ml 농도로 포함한 배양액에서 2일간 배양한 세포군에서 엑소좀을 처리하지 않은 대조군에 비해 TTAGGG 서열이 더 자주 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도24a). 복잡한 구조를 띄고 있는 텔로미어는 시퀀싱 시 다양한 서열로 나타날 수 있는데, 그 가능 반복 서열들의 빈도를 추가로 분석한 결과, 모든 가능 서열이 실험군에서 높게 나타났다(도24b 및 표5).

Sample	Repeat sequence	Total Repeat Counts
Non-Treated	GTATGG	28595288
	GTGTAG	31109759
	AGTGGT	56157875
	GTGGAT	53677254
	GATGGT	50041670
	TTAGGG	36690395
	TGTGAG	76312707
	GTTGGA	47035230
	AGGTTG	61574758
	GGGATT	79803631
Reprosome	GTATGG	36398934
	GTGTAG	40032083
	AGTGGT	72108868
	GTGGAT	68187857
	GATGGT	66658272
	TTAGGG	45160936
	TGTGAG	91292791
	GTTGGA	63576514
	AGGTTG	76579716
	GGGATT	95902062

실험예15. 초음파 처리에 의해 분비 유도된 엑소좀 처리된 세포의 유전자 발현 분석

실시예 6에 따라 엑소좀 처리된 세포 내 RNA를 동정하기 위해 RNA-seq을 진행하고, Gene ontology 분석을 수행하였다. 그 결과, 텔로미어 신장, 텔로머레이즈 활성, 세포 주기 및 증식, 대사 등과 관련된 유전자가 다수 존재하는 것을 확인할 수 있었다(도 25-26). 특히 표3과 같이 실험군 세포에서 분비된 엑소좀에서는 텔로머레이즈 활성 관련 유전자와 텔로미어 유지 및 보호와 관련된 유전자의 발현이 증가한 것으로 나타났다.

다음으로, 실시예 6에 따라 엑소좀 처리된 세포 내 TERT 발현을 확인하기 위해 엑소좀 처리 0, 1, 2일 후 각각 qPCR 및 면역형광염색을 진행한 결과, TERT RNA 및 단백질 양이 엑소좀 처리 시간이 오래 될수록 증가하는 것으로 나타났다(도27).

실험예16. 초음파 유도 엑소좀이 처리된 세포의 Ki67 세포면역형광염색

초음파 유도된 엑소좀이 처리된 세포의 유전자 발현 변화가 세포 증식에는 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해, 실시예 6에 따라 엑소좀을 포함한 배지에서 HDF를 0, 1, 2일간 배양한 후, 항 Ki67 항체를 이용하여 형광염색하고, 이를 공초점현미경으로 분석하였다(이때, 동 세포는 Hoechst로 대조염색하였다). 그 결과, 도 28과 같이 엑소좀 공배양 기간이 증가함에 따라 세포 분열 마커인 Ki67 단백질의 발현이 증가한 것으로 나타났다.

추가로, 상기 엑소좀의 농도가 세포 증식에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해, 각각 0, 1, 2, 4(X10⁹ 개/ml)의 엑소좀이 포함된 배지에서 HDF를 2일간 배양한 후, 항 Ki67 항체를 이용하여 형광염색하고, 이를 공초점현미경으로 분석하였다(이때, 동 세포는 Hoechst로 대조염색하였다). 그 결과, 도 29 및 표6과 같이 실험한 엑소좀 범위 모두에서 대조군에 비해 세포 분열 마커인 Ki67 단백질을 발현하는 세포 수가 유의미하게 증가한 것으로 나타났다.

% Ki67-positive cells	Concentration of exosomes (X10⁹ particles/ml)
% Ki67-positive cells	0	1	2	4
Mean	11.76	51.38	51.35	43.48
SEM	1.436	0.768	0.9572	1.232

실험예17. 초음파 유도 엑소좀이 처리된 세포의 노화 관련 β-galactosidase 활성 분석

초음파 유도된 엑소좀이 처리된 세포의 유전자 발현 변화가 세포 노화에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해, 실시예 6에 따라 엑소좀을 포함한 배지에서 HDF를 0, 1, 2일간 배양한 후, 세포 내 노화와 상관관계가 있는 것으로 알려진 β-galactosidase의 활성에 대한 시험을 X-gal을 이용하여 수행하고, 이를 위상차현미경으로 분석하였다. 그 결과, 도30과 같이 β-galactosidase 활성이 낮아진 것으로 나타났으며, 따라서 본 발명에 따라 제조된 엑소좀은 항노화효과를 가질 수 있음을 확인할 수 있었다.

실험예18. 초음파 유도된 엑소좀의 생체 적용에 의한 텔로미어 신장 효과 및 TERT 유전자 발현 변화 분석

초음파 유도된 엑소좀을 동물에 도포하였을 때 텔로미어 길이에 어떤 효과를 나타내는지 알아보기 위하여, 10주령 ICR mouse에 한쪽 귀에 실시예 5에 따라 제조된 엑소좀1x10⁹개 및 1x10¹⁰개를 주 3회 바르고 각각 1주일과 2주일째 귀 샘플을 회수하여 텔로미어 길이, TERT RNA 발현량을 분석하였다. 이때, 대조군으로는 상기 엑소좀을 희석한 D-PBS를 도포한 반대편 귀를 이용하였으며, 이를 도31에서 0으로 표시하였다. 실험 결과, 시간이 지남에 따라 엑소좀을 바른 귀의 텔로미어 길이가 증가하고, 특히, 엑소좀 도포량이 높을수록 텔로미어 길이의 증가폭이 컸으며, 엑소좀을 처리한 군에서는 TERT의 발현이 상대적으로 증가한 것으로 나타났다(도31). 실시예 5에 따라 제조된 엑소좀 1x10⁹개를 처리한 귀 조직에 텔로미어 FISH와 TERT에 대한 면역형광염색을 실시한 결과 역시 시간이 감에 따라 각각에 대한 형광신호강도 및 빈도가 높아졌음을 확인할 수 있었다(도32 및 34). 추가적으로 세포 증식과 관련된 유전자인 PCNA, Cyclin D1 및 N-cadherin의 RNA 발현을 qPCR로 확인해 본 결과, 상기 세 유전자의 RNA 발현량이 증가한 것으로 나타났고, Ki67에 대한 면역형광염색 결과 역시 시간이 감에 따라 형광신호강도 및 빈도가 높아졌음을 확인할 수 있었다(도33).

실험예19. 초음파 유도된 엑소좀의 적용에 따른 피부재생, 상처 및 흉터 치유 효과 분석

본 발명의 제조방법에 따라 제조된 엑소좀은 텔로미어 신장 및 세포 증식 등의 효과를 내는 것으로 전술한 바와 같이 밝혔으며, 이러한 효과는 세포의 재생과 연관성이 높으므로, 이러한 엑소좀이 피부재생, 상처 및 흉터의 치유에 어떤 영향을 미치는지 확인해보았다. 우선, 세포의 이동에는 어떤 영향을 끼치는지 알아보기 위해, 실시예 5의 엑소좀 제조방법에 따라 제조한 엑소좀을 배지에 추가하여 HDF를 플레이트에 가득 차도록 배양한 다음, 20

l yellow tip으로 선을 그어 세포 간 거리를 떨어뜨린 후 0, 5, 10, 20(X10⁹) 개/ml의 농도로 엑소좀을 처리하여 배양하는 wound healing assay를 진행하였다. 그 결과, 엑소좀 농도가 높을수록 빈 공간이 상대적으로 빠르게 채워지는 것으로 나타나(도 35), 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 엑소좀은 세포의 이동을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

다음으로, 상기 엑소좀의 효과를 in vivo에서 확인하기 위해 6주된 C57 마우스의 피부에 punch로 6 mm의 상처를 내고, 상기 엑소좀을 각각 0, 5, 10, 20 (X10⁹) 개/ml 농도로 PBS에 희석하여 상처 부위에 주2회 발라주었다. 그 결과, 1주 후 엑소좀 처리 마우스의 경우 외부로 드러난 상처(opening)의 크기가 처리하지 않은 마우스에 비해 확연히 줄어든 것으로 나타났다. 또한 1주 및 2주 후 각각 상처부위 조직 단면을 H&E 염색으로 확인한 결과, 엑소좀을 처리하지 않은 마우스에 비해 처리한 경우 상처의 크기가 작아 빠르게 피부 재생, 상처 및 흉터 치유가 일어난 것을 확인할 수 있었는데, 특히 상처 부위에 10 및 20 (X10⁹) 개/ml 농도의 엑소좀을 처리한 경우 2주차에 피부 조직이 완전히 회복되어 피부조직을 구성하는 표피와 진피층, 지방층, 근육층이 명확하게 구분할 수 있도록 재생되었고, 진피층과 지방층에 상처 부위와 주변 부위 간 차이 없이 피부 부속조직인 모낭이 자리잡은 것으로 나타났다(도 36).

추가로, 상기 엑소좀을 VybrantDiD Cell-Labeling Solution을 이용하여 염색하여 피부에 처리하고 2주 후 상기 염색된 엑소좀이 처리된 부위를 형광현미경으로 분석한 결과, 상기 엑소좀이 상처 부위 전반에 침투되었고, 이러한 전반적인 침투에 의해 상기와 같은 효과가 나타날 수 있었음을 유추해볼 수 있다(도37). 다음으로, 0, 5, 10, 20(X10⁹) 개/ml의 농도로 엑소좀을 처리한 상처 부위에서 조직 재생 및 상처 치유 관련 유전자인 Col1α1, Col3α1, ELN, N-cadherin 및 Cyclin-D1의 발현을 qRT-PCR로 분석하였고, 그 결과 실험군의 경우 대조군에 비해 상기 유전자 중 하나 이상의 발현이 대체로 높게 나타났다(도 37). 이때, 각 농도별로 증가량이 가장 많은 유전자는 달랐고, 농도와 발현 증감의 상관관계는 확인하기 어려웠다.

종합해보면, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 엑소좀은 in vitro에서뿐만 아니라 in vivo에서도 피부 재생, 상처 및 흉터 치유 효과를 가질 수 있음을 확인해볼 수 있었다.

실험예20. 초음파 유도된 엑소좀의 조로증 환자 유래 세포 적용에 따른 효과 분석

전술한 바와 같이 본 발명의 제조방법에 따른 엑소좀은 항노화와 관련된 다양한 유전자 발현을 유도하는 것으로 나타났는데, 이러한 엑소좀이 노화가 가속화된 세포에서도 효과를 가질 수 있는지 확인해보기 위해 상기 엑소좀을 조로증 환자 유래의 섬유아세포에 처리한 후 텔로미어 길이, 텔로머레이즈 활성, TERT 발현, 세포 증식, Ki67 발현 및 노화 관련 β-galactosidase 활성을 확인해보았다. 여기서 사용된 세포는 허친슨-길포드 조로증후군(Hutchinson-Gilford progeria syndrome) 환자(백인/8세/남)의 허벅지 피부로부터 채취된 세포이다(AG06297, Coriell Institute, Camden, USA). 엑소좀은 1x10⁹ 개/ml로 처리하고 최초 처리 14일 후에 세포를 분석하였으며, 최초 1회 처리한 실험군(ReprosomeX1), 배지 교환시마다 지속적으로 상기 농도의 엑소좀을 넣은 배지를 사용한 실험군(ReprosomeX∞, 14일동안 4회 처리)으로 나누어 실험하였다.

그 결과, 엑소좀을 최초 1회 처리한 실험군 및 지속적으로 처리한 실험군 모두에서 텔로미어가 신장되고 텔로머레이즈 활성이 증가하였으며 TERT 유전자 발현이 증가하고(도38), 세포 증식이 높아지고 Ki67 단백질 발현이 증가하였으며(도39), β-galactosidase 활성이 낮아져(도40), 조로증 환자 세포에서 가속화된 노화에 대하여 1회 처리만으로도 전반적인 항노화 효과를 가진다는 것을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명에 대한 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
세포에 직간접적으로 물리적 자극을 제공하는 단계;
상기 세포 및 배지의 혼합물을 일정 시간 배양하는 단계; 및
상기 혼합물로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하고,
상기 직접적으로 자극을 제공하는 것은 세포가 포함된 배지에 물리적 자극을 가하는 것이고, 상기 간접적으로 자극을 제공하는 것은 세포가 포함되지 않은 배지에 물리적 자극을 가한 후 상기 배지와 상기 세포를 혼합하는 것인, 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀의 제조방법.
제15항에 있어서,
상기 물리적 자극의 형태는 초음파, 열 및 빛 중에서 선택되는 어느 하나인, 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀의 제조방법.
제15항에 있어서,
상기 세포에 직간접적으로 물리적 자극을 제공하는 과정은
세포와 배지를 혼합한 후 상기 혼합물에 물리적 자극을 제공하거나,
배지에 물리적 자극을 제공한 후 상기 배지와 세포를 혼합하거나,
세포에 물리적 자극을 제공한 후 상기 세포와 배지를 혼합하거나,
세포에 물리적 자극을 제공한 후 상기 세포와 배지를 혼합한 다음 상기 혼합물에 물리적 자극을 제공하거나,
배지에 물리적 자극을 제공한 후 상기 배지와 세포를 혼합한 다음 상기 혼합물에 물리적 자극을 제공하거나,
세포와 배지에 각각 물리적 자극을 제공한 후 상기 세포 및 상기 배지를 혼합하거나,
세포와 배지에 각각 물리적 자극을 제공한 후 상기 세포 및 상기 배지를 혼합한 다음 상기 혼합물에 물리적 자극을 제공하는 방식
중에서 선택된 어느 하나의 방식으로 진행되는 것을 특징으로 하는, 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀의 제조방법.
제15항에 있어서,
상기 물리적 자극은 초음파 자극이고,
상기 직접적인 초음파 자극은 강도가 0.1 내지 3 W/cm²이고, 주파수가 20 kHz 내지 20 MHz이며, 지속시간이 0.1초 내지 20분인 것을 특징으로 하고,
상기 간접적인 초음파 자극은, 강도가 1 내지 20 W/cm²이고, 주파수가 20 kHz 내지 20 MHz이며, 지속시간이 0.1초 내지 20분인 것을 특징으로 하는, 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀의 제조방법.
제15항에 있어서,
상기 물리적 자극은 열 자극이고,
상기 열 자극은 세포를 40 내지 50℃의 온도 조건에 1 내지 10분 노출시킨 후 0 내지 4℃의 온도 조건에 5 내지 10초간 노출하는 방식으로 가해지는 것을 특징으로 하는, 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀의 제조방법.
제15항에 있어서,
상기 물리적 자극은 빛 자극이고,
상기 빛 자극은 레이저 또는 발광 다이오드(light-emitting diode) 빛 중에서 선택된 어느 하나의, 파장 대역 300 내지 900 nm의 펄스형 빔을 1 내지 10초 동안 조사하여 가하는 것을 특징으로 하는, 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀의 제조방법.
제15항에 있어서,
상기 세포는 각각 포유류 유래의 줄기세포, 전구세포, 섬유아세포, 각질세포 또는 기관 내 조직세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀의 제조방법.
제15항에 있어서,
상기 배지는 배양 배지 또는 분화유도 배지 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀의 제조방법.
제15항에 있어서,
상기 혼합물의 배양은 1시간 내지 10일 동안 진행되는 것을 특징으로 하는, 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀의 제조방법.
제15항에 있어서,
상기 엑소좀을 분리하는 단계는 초원심분리, 밀도구배, 여과, 크기 배제 크로마토그래피, 면역친화성분리, 침전, 미세유체에 의한 분리방법 중 하나 이상을 이용하는 것을 특징으로 하는, 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀의 제조방법.
제15항에 있어서,
상기 엑소좀을 분리하는 단계는
상기 배양 후의 혼합물을 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;
상기 상층액을 필터로 여과하여 여과액을 수득하는 단계; 및
상기 여과액을 농축하는 단계;
를 포함하는, 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀의 제조방법.
제15항 내지 제25항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조되고, 상기 제조방법을 거치기 전의 세포에서 분비된 엑소좀에 비해 TERT, TERF2, DKC1, TERF2IP, RFC1, RAD50, TERF1, PINX1, TNKS1BP1, ACD, NBN, HSPA1L, PARP1, PTGES3, SMG6, BLM, XRCC5, XRCC6, ERCC4, PRKDC, TEP1 및 β-Catenin 중에서 하나 이상의 유전자 발현량이 높은 것을 특징으로 하는, 세포의 텔로미어를 신장시키는 엑소좀.
제26항에 있어서,
상기 엑소좀은 세포에 처리시 상기 세포의 telomerase 활성이 높아지는 것을 특징으로 하는 엑소좀.
제26항에 있어서,
상기 엑소좀은 세포에 처리시 상기 세포의 β-galactosidase 활성이 감소되는 것을 특징으로 하는 엑소좀.
제26항에 있어서,
상기 엑소좀은 세포에 처리시 상기 세포의 세포 이동성이 증가되는 것을 특징으로 하는 엑소좀.
제26항에 있어서,
상기 엑소좀은 조직에 처리시 상기 조직의 재생이 촉진되는 것을 특징으로 하는 엑소좀.
제26항에 있어서,
상기 엑소좀은 상처에 처리시 상기 상처의 치유가 촉진되는 것을 특징으로 하는 엑소좀.
제26항에 있어서,
상기 엑소좀은 흉터에 처리시 상기 흉터의 치유가 촉진되는 것을 특징으로 하는 엑소좀.
제26항에 있어서,
상기 엑소좀은 세포에 처리시 상기 세포가 항노화 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 엑소좀.