KR102281512B1 - TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 염증성 질환 진단용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 TGFBIp (transforming growth factor β-induced protein)의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 염증성 질환 진단용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 TGFBIp의 676번째 아미노산인 리신(K676)에서의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 염증성 질환 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정함으로써 염증성 질환, 보다 구체적으로는 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 매우 정확하게 진단할 수 있으며, 나아가 TGFBIp의 아세틸화 수준의 분석을 통해 질환의 중증도를 진단할 수 있어 패혈증을 포함하는 염증성 질환의 진단에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 염증성 질환 진단용 조성물{Composition for diagnosing inflammatory diseases comprising agents detecting the level of acetylation of transforming growth factor β-induced protein}

본 발명은 TGFBIp (transforming growth factor β-induced protein)의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 염증성 질환 진단용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 TGFBIp의 676번째 아미노산인 리신(K676)에서의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 염증성 질환 진단용 조성물에 관한 것이다.

패혈증(sepsis)은 감염된 미생물에 대항하는 신체의 비정상적인 방어작용에 의해 발생한다. 대식세포의 활성화와 이에 따른 염증관련 인자들의 과도한 생성이 연관되어 있는데, 이로 인해 전신에 심각한 염증 반응이 나타난다. 체온이 38℃ 이상으로 올라가는 발열 증상, 36℃ 이하로 내려가는 저체온증, 분당 24회 이상의 호흡수(빈호흡), 분당 90회 이상의 심박수(빈맥), 혈액 검사상 백혈구 수의 증가 또는 현저한 감소 중 두 가지 이상의 증상을 보이는 경우, 이를 전신성염증반응증후군(systemic inflammatory response syndrome; SIRS)이라하고, 이러한 전신성염증반응증후군이 미생물의 감염에 의한 것일 때 패혈증이라고 한다. 패혈증은 잠재적으로 패혈증성 쇼크(septic shock)를 유발할 수 있다. 패혈증이 심해지면 신체의 여러 기관(심장, 신장, 간, 뇌, 폐 등)의 기능이 나빠지고 더욱 심해지면 쇼크 상태가 되는 것이다. 다양한 종류의 병원체로 인해 패혈증이 발병할 수 있는데, 가장 발생률이 높은 것은 박테리아에 의한 것이지만 그 외에도 바이러스나 곰팡이에 의해서도 일어날 수 있다. 폐에 감염을 일으키는 폐렴, 방광과 신장에 감염을 일으키는 요도감염, 피부에 일어나는 봉소염, 복부에 일어나는 충수염 또는 뇌에 일어나는 뇌막염 등이 있으며, 예를 들면 폐렴을 앓고 있는 환자가 패혈증에 걸리게 되면 뇌, 심장, 간, 폐 또는 신장에 손상이 일어나며 중증으로 진전되는 경우 환자의 약 20 ~ 50%는 패혈증성 쇼크에 의해 사망한다. 또한, 수술 후 감염에 의해 패혈증이 발생하기도 한다. 감염 또는 수술 후 감염에 의한 초급성 염증반응으로서 패혈증에 걸리게 되면 40 ~ 90%가 사망에 이르게 된다.

한편, TGFBIp은 상피 및 내피 세포, 섬유 아세포, 각질 세포 및 단핵구를 포함한 여러 세포주로부터 분비되며 세포 외 매트릭스에 존재한다. 이 유전자의 변형된 발현은 혈관 신생, 인간 각막 영양 장애 및 다양한 염증 반응을 담당하는 것으로 알려져 있다. 분비된 TGFBIp는 IκBα의 인산화를 통해 NF-κB의 상류 신호 전달 분자로서 기능한다는 것이 또한 알려져 있다. 본 발명자들은 이전 연구를 통하여 TGFBIp와 그것의 수용체 (integrin αvβ5) 사이의 상호 작용이 과투과성, 염증 관련 유전자의 강화된 발현 및 백혈구의 내피 세포로의 부착 및 이동과 같은 중증 패혈성 염증 반응을 유도한다는 것을 확인한 바 있다(Am J Respir Crit Care Med 189(7) (2014) 779-86). TGFBIp 항체는 패혈증 마우스에서 혈관 염증을 억제하고 생존율을 향상시킬 수 있다.

과립 내의 인간 TGFBIp (hTGFBIp)가 HUVEC 및 패혈증의 혈소판으로부터 분비된다는 것이 입증되었지만, 심각한 혈관 염증에서 hTGFBIp의 분비 메커니즘은 불분명 하였다.

따라서, 패혈성 조건 하에서 TGFBIp가 분비되는 기전을 밝히고, 이에 기초하여 패혈증을 정확하게 진단하고, 그 중증도까지도 예측할 수 있는 새로운 마커에 대한 필요성이 대두되고 있다.

이에, 본 발명자는 패혈증을 진단하고 그 중증도까지도 예측할 수 있는 새로운 마커를 탐색하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 패혈성 조건 하에서 TGFBIp가 분비되기 위해서는 TGFBIp의 아세틸화가 유도되어야 하며, 특히 상기 아세틸화는 TGFBIp의 특정 아미노산에서 나타나야 한다는 것을 확인하였고, 이에 기초하여 패혈증을 정확하게 진단하고, 중증도까지도 예측할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 TGFBIp (transforming growth factor β-induced protein)의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 염증성 질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 (a) 염증성 질환이 의심되는 환자로부터 생물학적 시료를 제공받는 단계; (b) 상기 시료에서 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 TGFBIp의 아세틸화 수준이 정상 대조군 시료보다 높을 경우 염증성 질환으로 진단하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 TGFBIp (transforming growth factor β-induced protein)의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 염증성 질환 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 염증성 질환이 의심되는 환자로부터 생물학적 시료를 제공받는 단계; (b) 상기 시료에서 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 TGFBIp의 아세틸화 수준이 정상 대조군 시료보다 높을 경우 염증성 질환으로 진단하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 단편을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 TGFBIp (transforming growth factor β-induced protein)의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 염증성 질환 진단용 조성물을 제공한다.

TGFBIp는 TGF-β가 분비하는 다양한 타입의 단백질 중 하나로, 섬유아세포, 연골세포, 평활근세포 및 각막 상피세포 등에서 분비되는 단백질이다. TGFBI는 연결자(linker) 단백질로서 기능하며, 형태발생, 세포 증식, 부착, 이동(migration), 분화 및 염증 과정에서 중요한 역할을 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 패혈증 환자, 중증 패혈증 환자 및 패혈성 쇼크 환자의 혈액에서 TGFBIp의 아세틸화가 증가되어 있는 것으로 확인이 되었으며, 질환의 중증도에 따라 TGFBIp의 아세틸화 정도가 더 높은 것으로 확인되었다.

본 명세서에서 용어 "폴리펩타이드(polypeptide)", "펩타이드(peptide)" 및 "단백질"은 상호 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다: A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp): 아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글리신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 리신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라진; O(Ply): 피롤리신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르지닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 쓰레오닌; U(Sec):셀레노시스테인, V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 타이로신.

본 발명의 일 양태에서, 상기 아테실화는 TGFBIp에서 676번째 아미노산인 리신(K676)에서의 아세틸화인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 TGFBIp는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

[서열번호 1]

MALFVRLLALALALALGPAATLAGPAKSPYQLVLQHSRLRGRQHGPNVCAVQKVIGTNRK

YFTNCKQWYQRKICGKSTVISYECCPGYEKVPGEKGCPAALPLSNLYETLGVVGSTTTQL

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SRASQRSVRLAPVYQLLERMKH

본 발명의 일 양태에서, 상기 아세틸화를 수준을 측정하는 제제는 아세틸화 TGFBIp에 특이적으로 결합하는 항체, 항체의 단편 또는 압타머일 수 있다.

상기 항체는 항원성 부위에 특이적으로 결합하는 면역글로불린(immunoglobulin)을 의미한다. 본 발명에서의 상기 항체는 아세틸화된 TGFBIp 이외에는 비아세틸화 TGFBIp 및 다른 단백질에는 결합하지 않는다.

바람직하게는, 본 발명에서의 상기 항체는 TGFBIp에서 676번째 아미노산인 리신(K676) 이외에 다른 위치에서의 아미노산이 아세틸화된 TGFBIp에는 결합하지 않는 항체일 수 있다.

상기 항체는 676번째 아미노산인 리신이 아세틸화된 TGFBIp의 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 수득하고, 수득한 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다.

또는, 676번째 아미노산인 리신이 아세틸화된 TGFBIp의 에피토프(epitope) 부위를 포함하는 단백질의 단편을 이용하여 아세틸화된 TGFBIp 단백질 특이적인 항체를 제조할 수도 있다.

본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 다클론항체(polyclonal antibody) 또는 단일클론항체(monoclonal antibody)를 포함한다. 또한 항원-항체 결합성을 갖는 것이면 전체 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되며, 아세틸화된 TGFBIp에 특이적으로 결합하는 모든 종류의 면역글로불린 항체가 포함된다. 예를 들어 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편, 즉, 항원 결합 기능을 갖는 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 나아가 본 발명의 항체에는 아세틸화된 TGFBIp 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 인간화 항체, 키메릭 항체 등의 특수 항체와 재조합 항체도 포함된다.

가장 바람직하게는, 상기 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되는 TGFBIp 단백질에서 676번째 아미노산인 리신(K676)의 아세틸화를 포함하는 펩타이드 단편으로서, 본 발명의 항체는 상기 서열번호 2와 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 85% 이상의 서열 동일성, 더 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 본 발명자는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 즉 서열번호 1로 표시되는 TGFBIp 단백질의 669 내지 682번째 아미노산으로 이루어진 펩타이드로서 676번째 아미노산인 리신(K676)이 아세틸화 되어 있는 펩타이드를 에피토프(epitope)로 인식하는 항체를 제작하여 그 유용성을 검증하였다.

본 발명에서 상기 “압타머(aptamer)”는 특정 물질에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA(ssDNA) 또는 RNA를 말한다. 압타머는 특정 물질에 대한 친화도가 매우 높고 안정하고, 비교적 단순한 방법으로 합성할 수 있으며, 결합력을 높이기 위해 다양한 변형이 가능하고, 세포, 단백질, 및 작은 유기물질까지도 표적물질이 될 수 있기 때문에, 그 특이성 및 안정성이 이미 개발되어 있는 항체에 비해 매우 높은 특징이 있다. 본 발명에서 상기 압타머는 아세틸화된 TGFBIp에 결합할 수 있는 것이라면 그 종류 및 형태가 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 염증성 질환은 패혈증 또는 패혈성 쇼크일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 염증성 질환 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 진단용 키트에는 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하기 위하여 선택적으로 아세틸화된 TGFBIp를 마커로 인식하는 항체, 항체의 단편 또는 압타머 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

보다 구체적으로는, 상기 키트는 웨스턴 블롯, 면역형광염색, ELISA 등을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 이들 키트는 아세틸화된 TGFBIp 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 아세틸화된 TGFBIp 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 이들 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 상기 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(항체와 컨주게이트된 형태로서) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 효소와 발색 반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 단백질 마커 만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 키트는 비-아세틸화 및 아세틸화 TGFBIp 단백질에 모두 결합할 수 있는 항체, 항체의 단편 또는 압타머를 추가로 포함할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 키트는 전체 TGFBIp의 발현수준 대비 아세틸화된 TGFBIp의 수준의 비율을 확인할 수 있도록 하여 퇴행성 신경질환을 보다 정확하게 진단할 수 있다.

본 발명은 또한 (a) 염증성 질환이 의심되는 환자로부터 생물학적 시료를 제공받는 단계; (b) 상기 시료에서 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 TGFBIp의 아세틸화 수준이 정상 대조군 시료보다 높을 경우 염증성 질환으로 진단하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명자는 아세틸화된 TGFBIp가 염증성 질환의 진단 마커로서 기능할 수 있음을 처음 발견하였고, 이에 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하여 염증성 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 (a) 단계에서 생물학적 시료란 전혈, 혈장, 혈구, 혈청, 혈관 내피세포, 신경세포, 뇌척수액, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 분비물, 질 분비물 및 소변으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 (b) 단계에서 TGFBIp의 아세틸화 정도를 측정하는 방법은 방사선자동사진법, 액체섬광계수(liquid scintillation counting)법, 분자량 분석법, 액체 색층 분석 매스 분석법, 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역형광염색법, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 (c) 단계에서는 상기 (b) 단계의 방법으로 측정한 피검체의 TGFBIp의 아세틸화 정도를, 동일한 방법으로 측정한 정상인의 TGFBIp 아세틸화 수준과 비교한다. TGFBIp의 아세틸화 수준이 건강한 정상인에 비하여 감소한 피검체는 염증성 질환에 걸린 것으로 판정할 수 있다.

상기 (c) 단계에서 TGFBIp의 아세틸화 수준은 (아세틸화 TGFBIp의 발현 수준/전체 TGFBIp의 발현 수준)으로 정량화하여 비교할 수도 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 진단은 염증성 질환의 중증도 진단을 추가로 포함할 수 있다. 즉, 상기 방법에 따라 피검체의 TGFBIp의 아세틸화 정도를 분석한 결과, 아세틸화 정도가 높을수록 질환의 중증도가 심한 것으로 판정할 수 있다.

본 발명은 또한 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 단편을 제공한다.

본 발명에서 용어 에피토프는 어떠한 항체가 특이적으로 결합하는 임의의 대상물에 있어서, 상기 대상물 중에서 항원항체 반응 특이성을 결정하고 있는 특정 부분을 지칭한다. 본 발명에서 에피토프는 서열번호 2의 아미노산 서열을 (필수적으로)포함하는 연속되는 영역이라면 그 구체적 서열이 특별히 제한되지 않으며, 통상 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하여 14 내지 50개, 더욱 바람직하게 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 개의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 항체는 단일클론(monoclonal, 단클론) 항체, 다클론(polyclonal) 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

본 발명의 다른 일 양태에서 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 항체는 인간을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함한 임의의 동물에서 유래한 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간에서 유래한 것이거나, 인간에서 유래한 항체의 부분과 다른 종의 동물에서 유래한 항체의 부분을 포함하는 키메릭(chimeric) 항체일 수 있다. 즉, 본 발명은 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간항체를 모두 포함하며 바람직하게는 인간항체 일 수 있다.

또한 본 발명의 항체는 일례로 IgG로서 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 상기 기능적 단편은 전체 항체의 항원 특이적 결합력을 유지하고 있는 항체의 단편을 의미하며, 바람직하게 상기 단편은 모항체의 결합 친화도의 적어도 50%, 60%. 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상을 보유한다. 구체적으로는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), scFv 등의 형태일 수 있다. Fab(fragment antigen-binding)는 항체의 항원 결합 단편으로, 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변 도메인과 불변 도메인으로 구성되어 있다. F(ab')2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로, 두 개의 Fab가 중쇄 경첩(hinge)에서 이황결합(disulfide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(ab')는 F(ab')2 단편의 이황결합을 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편이다. Fv(variable fragment)는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. scFv(single chain variable fragment)는 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디(diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고, 동일한 형태의 다른 scFv의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태의 단편을 의미한다.

본 발명의 목적상 항체의 기능적 단편은 아세틸화된 TGFBIp에 대한 결합특이성을 유지하고 동일한 생리활성을 나타내는 것이라면 구조나 형태의 제한을 받지 않지만, 바람직하게 scFv일 수 있다. 본 발명에 따른 scFv는 전술한 항체와 실질적으로 동일한 생리활성을 가지는 것이라면 그 서열이 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에서, 상기 항체 또는 그 단편들을 제공하기 위한 폴리뉴클레오타이드 서열은, 전술한 서열구성을 만족하는 한 그 구체적 염기서열 구성이 특별히 제한되지 않는다. 즉, 본 발명에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 것이면 그 서열이 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 일부분 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열 또는 해당 아미노산 서열에 근거하여, 당분야에 잘 알려진 올리고뉴클레오타이드 합성기법, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응 (PCR)법 등을 사용하여 합성할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 벡터를 통해 적절한 숙주세포로 내로 도입된 후, 본원 발명의 항체 단백질을 발현한다. 숙주세포를 상기 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 재조합 발현 벡터로 형질전환하고, 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 숙주세포에 도입된 재조합 발현 벡터로부터 본 발명에 따른 항체의 중쇄, 경쇄 또는 항체 단편의 폴리펩티드가 생산되도록 한 뒤, 이로부터 항체를 분리 수득하는 구체적 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.

먼저 통상적인 방법에 따라 상기 항체를 암호화하는 핵산을 작제한다. 상기 핵산은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다.

상기 용어 '형질전환(transformation)'은 외래성 폴리뉴클레오티드가 도입됨에 의한 숙주 세포의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 외래성 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 내로 도입된 것을 의미한다. 숙주 세포 내로 도입된 외래성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 유지되거나 통합되지 않고 유지될 수 있는데, 본 발명은 양자 모두 포함한다.

본 발명에 따른 아세틸화된 TGFBIp에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 공지의 방법에 의해 항체 또는 그 단편을 생산하기 위한 세포 내부로 도입하여 형질전환할 수 있다. 통상의 기술자는 선택된 숙주세포와 재조합 발현 벡터에 따라 적절한 형질전환 방법을 선택하여 실시할 수 있다.

중쇄와 경쇄의 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터는 동일한 숙주세포에 공동형질전환하여 중쇄와 경쇄가 하나의 세포에서 발현되도록 할 수도 있고, 중쇄와 경쇄의 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 각각 별개의 숙주세포에 형질전환하여 중쇄와 경쇄가 따로 발현되도록 할 수도 있다.

상기 숙주세포를 배양하기 위한 배지 조성과 배양 조건, 배양 시간 등은 당업계에서 통상 사용되는 방법에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 숙주세포에서 생산되는 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 세포 외부 또는 배양 배지로 분비되거나, 페리플라즘 등으로 표적화(targeted)되도록 할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 항체가 아세틸화된 TGFBIp에 대한 결합특이성을 유지하도록 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 단백질 리폴딩(refolding)시키고 기능성 구조(conformation)를 갖도록 하는 것이 바람직하다. 또한 IgG 형태의 항체를 생산하는 경우, 중쇄와 경쇄는 별개의 세포에서 발현시키고 별도의 단계에서 중쇄와 경쇄를 접촉시켜 완전한 항체를 구성하도록 제조할 수도 있고, 중쇄와 경쇄를 동일한 세포에서 발현되도록 하여 세포 내부에서 완전한 항체를 형성하도록 할 수도 있다.

숙주세포에서 생산된 항체 또는 그 단편 폴리펩타이드의 특성, 숙주세포의 특성, 발현 방식 또는 폴리펩티드의 표적화 여부 등을 고려하여 통상의 기술자는 수득 방법을 적절히 선택 및 조절할 수 있다. 예를 들어, 배양 배지로 분비된 항체 또는 그 단편은 숙주세포를 배양한 배지를 수득하고, 원심분리하여 불순물을 제거하는 등의 방법으로 항체를 회수할 수 있다. 필요에 따라 세포 내 특정 소기관이나 세포질에 존재하는 항체를 세포 외부로 방출하여 회수하기 위하여 항체 또는 그 단편의 기능적 구조에 영향을 미치지 않는 범위에서 세포를 용해시킬 수도 있다. 또한 수득한 항체는 크로마토그래피, 필터 등에 의한 여과, 투석 등의 방법을 통해 불순물을 더욱 제거하고 농축하는 과정을 추가로 거칠 수 있다.

본 발명 제조(생산) 방법의 폴리펩타이드는 본 발명의 항체 또는 그 단편 그 자체일 수 있으며, 본 발명의 항체 또는 그 단편 외 다른 아미노산 서열이 추가로 결합된 것일 수 있다. 이 경우 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 본 발명의 항체 또는 그 단편으로부터 제거할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie ＆ Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.

본 발명의 일 양태에서 상기 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드; 이와 면역학적으로 동등한 펩타이드; 또는 상기 펩타이드를 발현하는 핵산 또는 숙주 세포로 동물을 면역화하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다.

본 발명의 조성물은 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정함으로써 염증성 질환, 보다 구체적으로는 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 매우 정확하게 진단할 수 있으며, 나아가 TGFBIp의 아세틸화 수준의 분석을 통해 질환의 중증도를 진단할 수 있어 패혈증을 포함하는 염증성 질환의 진단에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

도 1A는 중앙값(median) 및 패혈증 환자로부터 얻은 혈청 샘플에서 아세틸화된 인간 TGFBIp K676를 검출한 결과, 도 1B는 항-hTGFBIp 항체로 면역 침전된 LPS-자극된 HUVEC 상청액(Sup) 또는 세포 용해물(Lysate)의 면역 블로팅 분석 결과, 및 도 1C는 HUVEC 에서 LPS 처리 시간에 따른 TGFBIp mRNA 발현 변화 분석 결과.
도 2는 2개의 트립신 펩티드 LAPVYQK(ac)LLER 또는 LAPVYQKLLER의 질량 스펙트럼을 나타낸 결과이다 (K(ac)는 아세틸화된 리신(lysine) 잔기를 나타냄).
도 3A는 항-아세틸-K676 항체를 이용한 중앙값(median) (n = 21), 패혈증 (n = 70), 심한 패혈증 (n = 40) 및 패혈성 쇼크 (n = 45) 환자의 혈청에서 acK676 hTGFBIp의 ELISA 분석 결과, 도 3B는 LPS-활성화된 HUVEC의 상청액 (백색) 및 세포 용해물(검정)에서의 acK676 hTGFBIp의 ELISA 분석 결과, 도 3C는 12 또는 24 시간 동안 LPS 처리된 HUVEC의 상등액 또는 세포 용해물에서 hTGFBIp와 아세틸화된 hTGFBIp K676의 공동-면역침전(Co-immunoprecipitation) 분석 결과이다.
도 4A는 중앙값 (n = 21), 패혈증 (n = 70), 중증 패혈증 (n = 40) 및 패 혈성 쇼크 (n = 45) 환자의 혈청 샘플에서 acK676 hTGFBIp의 PRM 분석 결과, 및 도 4B는 LPS (100ng/mL)와 함께 또는 LPS 없이 배양된 HUVEC에서 acK676 hTGFBIp의 PRM 분석 결과이다.
도 5A는 상이한 종의 K676 TGFBIp 주위의 서열을 비교하여 나타낸 도면, 도 5B는 역전사 PCR 분석 결과로서 TGFBIp shRNA가 HUVEC에 형질 감염된 후 특정 인간 TGFBIp를 사용한 역전사 PCR 분석 결과(GAPDH를 대조군으로 사용), 도 5C는 hTGFBIp KO HUVEC의 세포 용해물과 WT 또는 K676A 돌연변이 hTGFBIp-발현 HUVEC 에서 면역 블로팅을 수행한 결과, 도 5D는 pEGFP-c1 벡터-형질 감염된 HUVEC에서 WT 또는 K676A 돌연변이 hTGFBIp의 면역 형광 분석 결과 (스케일 바(Scale bar), 20 μm), 및 도 5E는 WT 또는 12시간 동안 LPS 처리한 후 K676A 돌연변이된 hTGFBIp KI HUVEC의 상등액 또는 세포 용해물에서 표시된(indicated) 항체를 사용한 면역 블로팅 분석 결과이다.
도 6A는 hTGFBIp 또는 K676A 돌연변이된 hTGFBIp KI 마우스의 폐, 간, 신장 또는 MLEC 의 면역 블로팅 결과(n = 5), 및 도 5B는 CLP-유도된 TGFBIp KO, WT, 또는 K676A 돌연변이 hTGFBIp KI 마우스의 생존율 (n = 20) 분석 결과이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실험 재료 및 방법

1. 세포 배양

일차 HUVEC는 Cambrex Bio Science (Charles City, IA)로부터 입수 하였다. 세포를 37℃, 5% CO₂에서 성장 보충제 (Cambrex Bio Science)를 함유하는 EBM-2 기본 배지에서 융합(confluency)되도록 배양 하였다. 모든 실험은 3회 또는 5회 계대된(passaged) HUVEC 세포를 사용하여 수행되었다. THP-1 세포(인간 단핵구 세포주)는 L-글루타민, 2-mercaptoethanol(55μM) 및 항생제(페니실린 G 및 스트렙토마이신)가 보충된 10% 열-불활성화된 소 태아 혈청(fetal bovine serum)을 함유하는 RPMI 1640에서 2×10⁵ 내지 1×10⁵ 세포/mL로 유지되었다. MLEC는 제조사의 프로토콜에 따라 TGFBIp에 대한 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 및 스크램블(scrambled) 된 대조군 shRNA (Santa Cruz Biotechnology, Inc.)를 함유하는 렌티 바이러스 입자(lentiviral particles)로 감염되었다. 간략하게, MLEC는 감염 당일 ~50% confluence로 성장되었다. 렌티 바이러스 입자로 감염시키기 전에 배지는 제거되었고 MLEC는 폴리브렌(polybrene) (10mg/mL)과 함께 배양되었다. 감염 2일 후에, 스크램블(scrambled) 된 대조군 shRNA 및 TGFBIp shRNA를 발현하는 클론이 puromycin (2 mg/mL)에 의해 5일 동안 선별되었고; 안정한 클론들이 모든 기능 연구에 사용되었다.

2. 환자 및 정상 혈청 샘플

환자는 1992년 패혈증 합의 회의위원회(Sepsis Consensus Conference Committee)에서 제공한 기준에 따라 분류되었다. 건강한 지원자를 대조군으로 사용하였고 모든 환자의 임상 데이터를 수집 하였다. 전혈(whole blood) 채취 후 48 시간 이내에 2000 × g 에서 5 분 동안 원심 분리하여 혈청 샘플을 생성 하였다. 연구 프로토콜 (KNUH 2012-01-010)은 한국의 대구에 있는 경북 대학교 병원 임상 시험 심사위원회의 승인을 받았다.

3. 동물사육(Animals and husbandry)

C57BL/6 수컷 마우스 (생후 6-7주, 체중 18-20g)를 오리엔트 바이오 (한국 성남)에서 제공받았고 12일 순응 기간 후에 사용 하였다. 케이지 당 5 마리의 동물을 12:12 시간 명/암 주기로 20-25℃의 온도 및 40-45%의 습도로 제어된 곳에 수용하였다. 마우스에 정상적인 설치류 펠렛 식사를 공급하고 물을 자유롭게 먹도록 공급 하였다. 모든 동물은 경북 대학교에서 발행 한 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 지침 (IRB No. KNU 2017-88)에 따라 처리되었다.

4. 마우스에서 내피 세포의 분리

내피 세포(Endothelial cells)는 항-CD31 항체 및 Dynal 자기 홀더(Dynal Magnetic holder)에 결합된 Dynalbeads를 사용하여 제조사의 지시 (Dynal Biotec, Lake Success, NY)에 따라 분리되었다. 간략하게, 내피 세포 단리를 위해, 4 내지 6 마리의 마우스 (생후 6-10주)를 마취시키고 그들의 복강을 노출시켰다. 절제된 폐 및 심장을 RPMI 배지에 넣고 과량의 조직을 세척한 다음 PBS에서 한 번 헹구었다. 이어서, 폐 및 심장을 5 분마다 부드럽게 교반(agitation)하면서, 요동(rocking) 플랫폼상에서 37 ℃에서 1시간 동안 50mL 튜브에서 1.0 mg/mL collagenase A에서 배양 하였다. 이어서, 생성된 현탁액을 70-μm 조직체 (BD falcon)를 통해 여과하고 새로운 50-mL 튜브에 모았다(collected). 여과된 세포 현탁액을 1000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하였다. 상청액(supernatant)을 제거한 후, 세포 펠렛(cell pellet)을 차가운 PBS로 1회 세척하고 새로운 15mL 튜브로 옮겼다. 항-마우스 CD31 항체에 커플링 된 Dynalbead를 제조하기 위해, 60-μL Dynalbead를 자기(magnetic) 홀더 (Invitrogen)에서 MACS 완충액 (PBS, 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA), 2mM EDTA)으로 세척하였다. Dynalbead는 600μL MACS 완충액에 재현탁(resuspended)되었고 10μL의 비드마다 5μg anti-mouse CD31을 첨가하였다. 이어서, 비드-항체 혼합물(The bead-antibody mixture)을 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션 하였다. 이어서, 세포 현탁액을 결합 된 비드-항체 혼합물에 첨가하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고, 자기 홀더를 사용하여 수집 하였다. 세포 펠렛을 차가운 PBS에서 3회 세척하고, EBM-2 성장 배지에 재현탁(resuspended)시킨 후, 콜라겐-코팅 된 플레이트 상에 플레이팅 하였다.

5. 웨스턴 블로팅

HUVEC에서 TGFBIp, 아세틸화 된 리신(K) 및 아세틸화 된 K676 TGFBIp는 매일 CLP 수술 후 lipopolysaccharide (LPS) 및 마우스 혈장을 처리 한 후 면역 블로팅에 의해 검출되었다. SDS-PAGE 후, 각각의 항체로 면역 블로팅 분석을 수행 하였다. 로딩 대조군(loading control)으로서, β-액틴이 사용되었다. 내피 세포를 정상 CLP-유발 패혈증 마우스 또는 9rDT-주입된 패혈증 마우스로부터 단리하고, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM 염화나트륨, 10mM 플루오르화 나트륨, 10mM 피로인산 나트륨, 1mM sodium orthovanadate, 1 % Triton X-100 및 프로테아제 억제제. 이어서, 용해물을 12,000 × g에서 10 분 동안 원심 분리 한 후, 항-TGFBIp 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 면역 침전물을 단백질 A/G-S 자성입자(magnetic beads)를 사용하여 회수하고, IP 완충액으로 4 회 세척하고, SDS-PAGE의 샘플 완충액에 재현탁(resuspended)시킨 후 10분 동안 비등(boiling)시켰다. 이어서 결합된 단백질을 항-아세틸화 된 K 또는 항-아세틸화 된 K676 TGFBIp 항체를 사용한 면역 블로팅에 의해 분석 하였다.

6. TGFBIp 용 ELISA

세포 배양 배지 또는 패혈증 환자 혈청에서 아세틸화 된 K676 TGFBIp 농도는 종래 공지된 바와 같이 경쟁 ELISA(competitive ELISA)에 의해 결정되었다.

7. CLP (cecal ligation and puncture)

맹장 결찰(ligation) 및 천공(puncture) (CLP)에 의한 패혈증 마우스 모델은 이전에 설명한대로 준비되었다. 간략하게, 맹장과 인접한 장을 노출시키기 위해 2 cm의 정중선(midline) 절개가 이루어졌다. 그런 다음 맹장을 맹장 끝에서 5.0 mm의 3.0-실크 봉합사로 단단히 결찰하고, 22-게이지의 바늘로 천공한 다음, 천공 부위에서 대변을 압출하기 위해 부드럽게 압착하여 복강으로 복귀시켰다(returned to). 그리고 개복술 부위는 4.0-실크로 봉합되었다. 모의 수술 동물에서, 맹장은 노출되었지만 결찰 또는 천공되지 않은 다음 복강으로 되돌아갔다. 수술을 수행하기 전에 이 프로토콜은 경북 대학교 동물 관리위원회 (IRB No. KNU 2017-88)의 승인을 받았다.

8. 실시간 PCR

세포 배양 샘플로부터 cDNA를 생성하기 위해, 확장(expand) 역전사 중합 효소 (Roche)를 사용하여 총 1㎍의 RNA를 랜덤 6량체(random hexamers)로 역전사시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 Roche Diagnostics GmbH의 LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I을 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 다음의 LightCycler 조건이 사용되었다: 95 ℃에서 10분 동안 초기 변성에 이어 95 ℃에서 10분 동안 변성, 60 ℃에서 5분 동안 어닐링 및 72 ℃에서 15분 동안의 신장으로 45회 사이클. 샘플에서 특이적 mRNA의 양은 상응하는 유전자-특이적 표준 곡선에 따라 측정되었다.

9. 용액 내 트립신 소화 및 탈염

트립신을 1:50 (w/w)의 비율로 단백질에 첨가하고 혼합물을 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 이어서, 25mM 탄화수소암모늄 100μL 15mM dithiothreitol(100μL 15mM dithiothreitol in 25mM ammonium bicarbonate )을 혼합물에 첨가하고, 트립신 분해 펩티드(tryptic peptide)에서 이황화 결합을 감소시키기 위해 56 ℃에서 30분 동안 인큐베이션 하였다. 이어서, 25mM 탄화수소암모늄(ammonium bicarbonate)에 100μL의 60mM 요오드아세트아미드(iodoacetamide)를 첨가하여 환원된 펩티드를 알킬화하고, 혼합물을 어두운 곳에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션 하였다. 이어서, 펩티드 혼합물에 75mM 시스테인 (100μL)을 첨가하고 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양하였다. 이어서, 트립신을 1 : 100 (w/w)의 비율로 펩티드에 첨가하고, 혼합물을 37 ℃에서 4시간 동안 인큐베이션 한 다음, 5 % 트리플로로초산(trifluoroacetic acid)에서 50% 아세토나이트릴(acetonitrile)로 반응을 종결시켰다. 최종적으로, 생성된 펩티드를 SpeedVac 농축기에서 건조시켰다. 분석 전에, 제조사의 지시에 따라 Pierce C18 Tips (미국 텍사스 주 록포드(Rockford) 소재의 Thermo Scientific)를 사용하여 트립신 펩티드를 탈염시켰다.

10. 질량 분석

상기에서 수득된 친화성 농축 Kac 펩티드를 0.1% 포름산 수용액에 용해시키고(dissolved in 0.1% formic acid in water), Reprosil 100 C18 수지(resin)(3μm 입자 크기, Maisch GmbH, 독일 Beim Bruckle 박사)로 상 HPLC 컬럼에 직접 로딩하였다. 로딩된 샘플을 EASY nLC 1000 UHPLC (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에 의해 60분에 걸쳐 200nL/분의 유속으로 용매 A(물 중 0.1 % 포름산, v/v) 중의 5-80 % 용매 B(90% acetonitrile 중 0.1 % 포름산, v/v)의 구배로 용리시켰다. 샘플은 Q Exactive 질량 분석기 (Thermo Fisher Scientific)로 분석되었다. 하나의 전체 질량 스캔과 상위 15 개의 가장 강한 전구체 이온이 번갈아 나타나는 데이터 종속 절차는 25 초 동적 제외와 함께 적용되었다. 온전한 펩티드는 70,000의 해상도로 검출되었고, tandem 질량 스펙트럼은 27% 정규화된 충돌 에너지에서 17,500의 질량 해상도로 획득되었다(acquired).

11. 단백질 식별 및 정량

펩티드 및 단백질은 Mascot (버전 2.3; Matrix Science, London, UK)에 연결된 Proteome Discoverer (버전 1.3; Thermo Scientific)를 사용하여 확인하였다. 우리는 국제 단백질 지수 (IPI) 인간 데이터베이스 (버전 3.87, 91,464 단백질 서열을 포함)를 사용하여 다음과 같은 검색 매개 변수로 단백질을 검색하였다. 50 ppm의 전구체 질량 오류, 단일 동위 원소 질량 선택(mass-selected) 및 0.8 Da의 단편 이온 질량 오류. 분해 효소는 2개의 누락된 분열(missed cleavages)을 갖는 트립신이었다. 단백질 비는 TGFBIp에서 비아세틸화된 K 대 아세틸화된 K TGFBIp의 비로 계산되었다.

12. PRM 분석

Easy nLC-1000 펌프 및 오토 샘플러(autosampler) 시스템 (ThermoFisher Scientific, Bremen, Germany)이 장착된 Q-Exactive 질량 분석기에서 PRM 분석을 수행하였다. 각각의 분석에 대해, 2μL의 각 샘플을 ReproSil-Pur C18 AQ 3μm 수지 및 액체 규산염(silicate) Kasil 1으로 생성된 프릿(frit)으로 패킹(packed)된 일직선(in-line) 고체상 추출 컬럼(100 μm × 6 cm) 상에 주입하고, 100 % 용매 A로 2μL/분의 유속으로 세척하였다. 총 7μL 부피의 세척 후, 프리컬럼(precolumn)을 동일한 수지로 포장된 11cm × 75μm PicoFrit 모세관 컬럼 (New Objective, Woburn, MA)과 함께(in line with) 놓았다. 펩티드를 40분에 걸쳐 300nL/분의 유속으로 2 내지 35% 용매 B (acetonitrile 중 0.1% 포름산)의 선형 구배를 사용하여 분리한 후, 4분에 걸쳐 90% B로 증가시킨 후 유지시켰다. 펩티드 이온화를 위해, 1800V를 적용하고 250 ℃ 모세관 온도를 사용하였다. 모든 샘플을 TGFBIp 및 TGFBIp 표준 펩티드를 나타내는 676 표적 전구체 이온을 함유하는 예정된 포함 목록(scheduled inclusion list)에 기초하여 다중화 된 PRM 방법을 사용하여 분석하였다. 전체 스캔 이벤트는 m/z 380-1500 질량 선택(mass selection), 17,500의 Orbitrap 분해능 (m/z 200에서), 목표 자동 이득 제어(automatic gain control) (AGC) 값 3 × 10⁶, 최대 주입 시간(maximum injection time) 30ms를 사용하여 수집되었습니다. PRM 스캔 이벤트는 17,500의 Orbitrap 분해능, 1 × 10⁶의 AGC 값 및 2m/z의 분리 폭으로 최대 충전 시간 80ms를 사용했습니다. 27의 정규화된(normalized) 충돌 에너지로 단편화를 수행하고 m/z 150의 시작 질량으로 MS/MS 스캔을 획득하였습니다. 전이당(per transition) LC 피크당(per LC peak) 6-10 포인트의 측정을 보장하기 위해 최종 PRM 방법에서 각 펩티드에 대해 스캔 윈도우를 4 분으로 설정하였다.

13. K676 아세틸화된 TGFBIp에 특이적인 항체의 제작

합성한 C-RLAPVYQK(Ac)LLERMK또는 C-RLAPVYQLLERMK 서열의 펩타이드를 항원으로 사용하였다. 항원을 토끼(New Zealand white)에 주사하기 전에 pre-immune serum을 채취하여 negative control로 사용했다. Primary immunization은 항원을 complete Freund's adjuvant(Sigma)와 혼합하여 복강(IP)주사하고 4주 후 incomplete Freund's adjuvant와 혼합한 항원으로 1차 boosting을 진행했다. 1주 후 1차 blood를 채취하여 ELISA test를 진행하고, 매주마다 boosting과 bleeding을 번갈아 진행했다. 3차 boosting 후 rabbit 심장으로부터 채혈하고 final serum을 분리하여 ELISA test로 항체를 확인했다. 항체의 분리 정제는 Affi-gel에 conjugation 하여 분비한 Column에 항체를 binding 시킨 후 PBS로 washing했다. pH 3.0 인 0.1M glycine buffer 로 항체를 elution한 뒤 pH 8.8 Tris buffer 로 중성화 하고, 정제된 항체를 알맞은 농도로 농축 및 투석했다.

　실험결과

단백질이 아세틸화(ac)에 의해 분비된다는 점을 주목하면서, 패혈증 환자의 혈청에서 분비된 hTGFBIp의 아세틸화는 패혈증의 중증도에 따라 결정되었다(도 1A). LPS-활성화된 HUVEC의 상청액 (Sup) 및 세포 용해물을 분리하고, 항-hTGFBIp 항체를 사용한 면역 침전 (IP) 및 항-리신(lysine) 아세틸화 항체를 사용한 면역 블로팅 (IB)을 사용하여 분석하였다.

도 1B에 도시된 바와 같이, LPS의 시간 의존적 처리는 HUVEC에서 hTGFBIp의 발현 및 리신 아세틸화를 상향 조절하였다. HUVEC이 LPS로 활성화된 후, hTGFBIp mRNA의 발현 (도 1C) 및 단백질 강도(intensity) (도 1B)가 현저하게 증가하였다.

hTGFBIp의 특이적 아세틸화 부위를 밝히기 위해, 정제된 hTGFBIp를 트립신으로 분해하고, 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 분석에 의해 분해물을 분석하였다. 다수의 확인된 아세틸화된 펩티드 중에서, 서열번호 1의 hTGFBIp 단백질의 676번째 아미노산인 리신(K676)이 아세틸화된 펩티드 LAPVYQK(ac)LLER는 패혈증 환자의 혈청 및 LPS-활성화된 HUVEC의 상청액에서 뚜렷하게 확인되었다(도 2).

패혈증 환자에서 acK676 hTGFBIp의 수준을 측정하기 위해, 서열번호 1의 hTGFBIp의 669-682번째 아미노산으로 이루어진 펩타이드로서 676번째 리신이 아세틸화된 펩타이드(RLAPVYQK(Ac)LLERMK, 서열번호 2)를 에피토프(epitope)로서 인식하는 항체를 제조하였다. ELISA 분석에서, 21명의 건강한 지원자에서 hTGFBIp 의 중간값은 247.4ng/mL였다. acK676 hTGFBIp는 패혈증, 중증 패혈증 및 패혈성 쇼크 환자에서 각각 397.1 ng/mL (n = 70), 634.9ng/mL (n = 40) 및 693.7ng/mL (n = 45)로 증가하였다(도 3A). 그룹 간의 차이는 p < 0.0001에서 통계적으로 유의미하였으며, 이는 acK676 hTGFBIp가 패혈증 진단 및 중증도에 잠재적으로 유용한 마커임을 나타낸다.

IP (anti-hTGFBIp 항체) 후 ELISA (도 3B) 및 면역 블로팅 (anti-acK676 hTGFBIp 항체)을 통해 LPS (100ng / mL, 12-24 시간)에 의해 활성화된 HUVEC에서 acK676 hTGFBIp의 유도성 분비를 확인하였다 (도 3C). 패혈증의 중증도에 따른 hTGFBIp의 acK676의 증가는 LC-MS / MS를 사용한 병렬 반응 모니터링 (PRM) MS 분석에 의해 평가되었다. 심각한 혈관 염증은 hTGFBIp K676의 아세틸화를 상향 조절하였다(도 4A 및 4B).

hTGFBIp가 K676 아세틸화에 의해 분비되는지 여부를 확인하기 위해, LPS-활성화된 K676A knock-in (KI) HUVEC의 상청액에서 분비된 acK676 hTGFBIp 수준을 측정하였다. 인간 hTGFBIp의 K676이 다른 종에 비해 보존되지 않기 때문에, 설치류 hTGFBIp의 위치 676의 아미노산을 아르기닌으로 치환시켰다 (도 5A). 야생형 (WT) 또는 돌연변이된(K676A) hTGFBIp를 TGFBIp 녹아웃(knockout) (KO) HUVEC에 형질 감염시켰다(도 5B 내지 5D). LPS는 WT에서 hTGFBIp의 분비를 향상시켰지만, K676 hTGFBIp의 비아세틸화로 인해 K676A 돌연변이 세포에서는 hTGFBIp의 분비가 증가하지 않았다 (도 5E).

CLP-유도 패혈증 마우스 모델은 인간 패혈증을 모방하기 위해 널리 사용된다. WT 또는 K676A hTGFBIp가 TGFBIp KO 마우스에 형질 감염되었을 때, K676A hTGFBIp KI 마우스는 TGFBIp KO 마우스와 유사하게 CLP 수술에 의해 패혈증 사망으로부터 구제되었다 (도 6B). 따라서, 이들 결과는 K676 아세틸화에 의한 TGFBIp 분비를 억제하는 것이 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 치료 전략이 될 수 있음을 시사한다.

본 발명의 조성물은 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정함으로써 염증성 질환, 보다 구체적으로는 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 매우 정확하게 진단할 수 있으며, 나아가 TGFBIp의 아세틸화 수준의 분석을 통해 질환의 중증도를 진단할 수 있어 패혈증을 포함하는 염증성 질환의 진단에 매우 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Composition for diagnosing inflammatory diseases comprising agents detecting the level of acetylation of transforming growth factor beta induced protein <130> NP20-0024 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 682 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> transforming growth factor beta induced protein <400> 1 Met Ala Leu Phe Val Arg Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Gly Pro Ala Ala Thr Leu Ala Gly Pro Ala Lys Ser Pro Tyr Gln Leu 20 25 30 Val Leu Gln His Ser Arg Leu Arg Gly Arg Gln His Gly Pro Asn Val 35 40 45 Cys Ala Val Gln Lys Val Ile Gly Thr Asn Arg Lys Tyr Phe Thr Asn 50 55 60 Cys Lys Gln Trp Tyr Gln Arg Lys Ile Cys Gly Lys Ser Thr Val Ile 65 70 75 80 Ser Tyr Glu Cys Cys Pro Gly Tyr Glu Lys Val Pro Gly Glu Lys Gly 85 90 95 Cys Pro Ala Ala Leu Pro Leu Ser Asn Leu Tyr Glu Thr Leu Gly Val 100 105 110 Val Gly Ser Thr Thr Thr Gln Leu Tyr Thr Asp Arg Thr Glu Lys Leu 115 120 125 Arg Pro Glu Met Glu Gly Pro Gly Ser Phe Thr Ile Phe Ala Pro Ser 130 135 140 Asn Glu Ala Trp Ala Ser Leu Pro Ala Glu Val Leu Asp Ser Leu Val 145 150 155 160 Ser Asn Val Asn Ile Glu Leu Leu Asn Ala Leu Arg Tyr His Met Val 165 170 175 Gly Arg Arg Val Leu Thr Asp Glu Leu Lys His Gly Met Thr Leu Thr 180 185 190 Ser Met Tyr Gln Asn Ser Asn Ile Gln Ile His His Tyr Pro Asn Gly 195 200 205 Ile Val Thr Val Asn Cys Ala Arg Leu Leu Lys Ala Asp His His Ala 210 215 220 Thr Asn Gly Val Val His Leu Ile Asp Lys Val Ile Ser Thr Ile Thr 225 230 235 240 Asn Asn Ile Gln Gln Ile Ile Glu Ile Glu Asp Thr Phe Glu Thr Leu 245 250 255 Arg Ala Ala Val Ala Ala Ser Gly Leu Asn Thr Met Leu Glu Gly Asn 260 265 270 Gly Gln Tyr Thr Leu Leu Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Ile 275 280 285 Pro Ser Glu Thr Leu Asn Arg Ile Leu Gly Asp Pro Glu Ala Leu Arg 290 295 300 Asp Leu Leu Asn Asn His Ile Leu Lys Ser Ala Met Cys Ala Glu Ala 305 310 315 320 Ile Val Ala Gly Leu Ser Val Glu Thr Leu Glu Gly Thr Thr Leu Glu 325 330 335 Val Gly Cys Ser Gly Asp Met Leu Thr Ile Asn Gly Lys Ala Ile Ile 340 345 350 Ser Asn Lys Asp Ile Leu Ala Thr Asn Gly Val Ile His Tyr Ile Asp 355 360 365 Glu Leu Leu Ile Pro Asp Ser Ala Lys Thr Leu Phe Glu Leu Ala Ala 370 375 380 Glu Ser Asp Val Ser Thr Ala Ile Asp Leu Phe Arg Gln Ala Gly Leu 385 390 395 400 Gly Asn His Leu Ser Gly Ser Glu Arg Leu Thr Leu Leu Ala Pro Leu 405 410 415 Asn Ser Val Phe Lys Asp Gly Thr Pro Pro Ile Asp Ala His Thr Arg 420 425 430 Asn Leu Leu Arg Asn His Ile Ile Lys Asp Gln Leu Ala Ser Lys Tyr 435 440 445 Leu Tyr His Gly Gln Thr Leu Glu Thr Leu Gly Gly Lys Lys Leu Arg 450 455 460 Val Phe Val Tyr Arg Asn Ser Leu Cys Ile Glu Asn Ser Cys Ile Ala 465 470 475 480 Ala His Asp Lys Arg Gly Arg Tyr Gly Thr Leu Phe Thr Met Asp Arg 485 490 495 Val Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp 500 505 510 Asn Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr 515 520 525 Glu Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn 530 535 540 Glu Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly 545 550 555 560 Asp Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu 565 570 575 Ile Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu 580 585 590 Gln Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val 595 600 605 Asn Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val 610 615 620 Val His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Arg Pro Gln 625 630 635 640 Glu Arg Gly Asp Glu Leu Ala Asp Ser Ala Leu Glu Ile Phe Lys Gln 645 650 655 Ala Ser Ala Phe Ser Arg Ala Ser Gln Arg Ser Val Arg Leu Ala Pro 660 665 670 Val Tyr Gln Leu Leu Glu Arg Met Lys His 675 680 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope of K676 acetylated TGFBIp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> The X at position 8 is an acetylated lysine <400> 2 Arg Leu Ala Pro Val Tyr Gln Xaa Leu Leu Glu Arg Met Lys 1 5 10

Claims (14)

1. TGFBIp (transforming growth factor β-induced protein)의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크 진단용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 아세틸화는 TGFBIp에서 676번째 아미노산인 리신(K676)에서의 아세틸화인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 TGFBIp는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 제제는 아세틸화 TGFBIp에 특이적으로 결합하는 항체, 항체의 단편 또는 압타머인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 항체 또는 항체의 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 삭제
7. (a) 패혈증 또는 패혈성 쇼크가 의심되는 환자로부터 생물학적 시료를 제공받는 단계;
   (b) 상기 시료에서 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 단계; 및
   (c) 상기 TGFBIp의 아세틸화 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는,
   패혈증 또는 패혈성 쇼크 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 방법은 방사선자동사진법, 액체섬광계수(liquid scintillation counting)법, 분자량 분석법, 액체 색층 분석 매스 분석법, 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역형광염색법, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
   
9. 제7항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 전혈, 혈장, 혈구, 혈청, 혈관 내피세포, 신경세포, 뇌척수액, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 분비물, 질 분비물 및 소변으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
10. 제7항에 있어서, 상기 진단은 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 중증도 진단인 것을 특징으로 하는 방법.
    
11. 삭제
12. 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 단편.
    
13. 제12항에 있어서, 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 단편은 디아바디, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv 및 scFv로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체의 단편.
    
14. 제12항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드; 이와 면역학적으로 동등한 펩타이드; 또는 상기 펩타이드를 발현하는 핵산 또는 숙주 세포로 동물을 면역화하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체의 단편.

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