CN107074925B - 用于预防和/或治疗亨廷顿氏病的物质和方法 - Google Patents

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Abstract

公开了用于预防和/或治疗亨廷顿氏病的HTT蛋白的免疫原性肽和HTT特异性抗体。

Description

用于预防和/或治疗亨廷顿氏病的物质和方法
本发明涉及提供用于治疗和预防亨廷顿氏病的物质和方法。
亨廷顿氏病是一种具有常染色体显性遗传模式的罕见的单亲疾病(monogeneticdisease)。它是由人染色体4上的亨廷顿蛋白(Huntingtin，HTT)基因的编码区内的CAG三核苷酸重复扩增引起的(Novak&Tabrizi，2011)。成因性CAG重复扩增与复制期间的遗传不稳定性和RNA剪接的变化相关。然而，最重要的是，编码的蛋白质由于在蛋白质的N-末端部分中的扩展的聚谷氨酰胺(polyQ)段而在结构上改变，导致结构改变的且修饰的亨廷顿蛋白和蛋白质片段在脑和其他器官或细胞中随时间而积累。该过程类似于其他神经变性性蛋白病(proteinopathy)，诸如例如阿尔茨海默氏病或帕金森氏病或多系统萎缩，其中共同特征是形成与蛋白质降解产物组合的聚集体或蛋白质原纤维。在亨廷顿氏病中，病理学标志是主要地纹状体和皮层的进行性神经变性，伴有聚集且降解的亨廷顿蛋白的积累。
亨廷顿氏病的临床症状以可预测的方式进展，微妙地开始于情绪变化或认知问题，随后是不稳定的步态和运动问题。随着时间的推移，身体能力恶化，伴有明显的运动协调问题，加上精神能力的下降，以及精神和行为问题。平均预期寿命是第一次临床表现后约二十年。症状可以显著变化，并且已经充分证明，发病年龄与突变亨廷顿蛋白基因中CAG重复的数量反相关，这证实突变亨廷顿蛋白的成因作用。
没有对亨廷顿氏病的治愈或预防。为了控制症状，在疾病的后期需要全时患者护理，并且患者和他的社会环境的负担是相当大的。症状性治疗如药物和非药物治疗可以缓解一些症状。
根据目前对亨廷顿氏病病因和遗传原因的理解，突变体亨廷顿蛋白被认为是疾病缓解靶向策略的主要靶标，尽管不是以常规方式(Yu等人，2014)。基于临床遗传学和来自动物模型的功能证据(Bard等人，2014)，亨廷顿蛋白降低策略被认为是最重要意义的方法，尽管存在与这样的构思相关的分子挑战(Zheng&Diamond，2012)。目前的策略通常受到治疗剂缺乏递送到脑中受影响的神经元内的靶向位点的阻碍。这使目前正在开发的DNA或mRNA靶向方法变得有价值(Davidson，2012)，所述DNA或mRNA靶向方法包括反义寡核苷酸、siRNA、和使用miRNA、shRNA或ZFP的病毒递送(在基因水平靶向)的基因疗法、或间接的基于小分子的方法如SirT1或mTOR抑制。一种替代方法由使用由靶向脑内细胞内亨廷顿蛋白的病毒载体提供的胞内抗体(intrabody)组成(Butler等，2012)。尽管在临床前模型中已证明其功能性，这些方法中的大部分面临针对靶位点的主要递送挑战。此外，“外来”大分子结构例如诸如基于scFv的胞内抗体(Messer&Joshi，2013)带有潜在地构成针对宿主的新表位的风险，从而诱导针对治疗剂的不期望的体液免疫应答或针对表达和呈递“外源”蛋白质的细胞的不期望的自体反应的T细胞应答。
WO 2012/140376 A1公开了治疗性肽pep4和pep42，两种肽都不延伸到HTT的c6切割位点。提示了这些肽用作HTT聚集抑制剂，并且与任何疫苗接种或免疫应用无关。WO2010/015592 A2公开了用于诊断定量目的的单克隆抗体的产生。产生这些单克隆抗体之一(4C9)是为了用于突变的polyQ蛋白的检测/定量测定，但不用于任何治疗应用。使用具有源自HTT蛋白序列的氨基酸65至84的肽产生抗体。Ko等人(Brain Res.Bull.56(2001):319-329)公开了抗HTT单克隆抗体，大多数结合HTT的polyQ结构域。Persichetti等人，(Mol.Med.1(1995)：374-383)公开了抗体引发性肽HP1和HP12。Miller等人，(Mol.Ther.7(2003)，572-579)公开了用编码与GFP蛋白融合的前17个AA加103个谷氨酰胺残基的DNA进行DNA疫苗接种。
US 2007/0026029 A1公开了用于治疗和预防阿尔茨海默氏病的成分输血装置。Weiss等人(Anal.Biochem.395(2009)：8-15)公开了用于动物和人组织中突变体的HTT的检测方法。Butler等人(Prog.Neurobiol.97(2011)：190-204)公开了用于动物模型中的HD的基于scFv的胞内抗体治疗。US 2010/0233180 A1公开了结合HTT的polyP区的抗体。Chen等人(Chem.Biol.18(2011):1113-1125)提示了用于通过直接结合polyQ治疗HD，而不是用于疫苗接种的扩增的polyQ类肽。
为了提供用于亨廷顿氏病的替代治疗方法，本发明提供能够通过更简单的方式靶向亨廷顿蛋白的主动疫苗和被动疫苗(例如抗原和抗体)。在亨廷顿氏病中，越来越意识到，该病症伴随着全身化的变化，包括免疫系统、外周组织、外周血淋巴细胞(PBL)和代谢，强调这种疾病的系统性质。作为实例，病理性亨廷顿蛋白积聚不仅仅限于CNS，而且也可以在外周血细胞中检测到(Weiss等人，2012)。通过降低原代人巨噬细胞/单核细胞中的亨廷顿蛋白表达，先天免疫系统的干扰可以通过亨廷顿蛋白靶向性RNA干扰部分逆转(
Figure BDA0001241913620000031
等人2014)。
除了检测血细胞内的亨廷顿蛋白外，可溶性亨廷顿蛋白或亨廷顿蛋白片段在健康供体的人血浆蛋白质组中偶然检测到(Liu等人2007)或通过ELISA在迄今为止与亨廷顿氏病无关的青光眼患者的血浆中检测到(Tezel等人2012)。尽管免疫系统在亨廷顿氏病中的重要作用已被公认(Ellrichmann等人，2013)，但是胞外亨廷顿蛋白的可能的成因作用已经在很大程度上被忽略。新近，血浆和CSF亨廷顿蛋白仅被建议作为监测疾病进展的潜在生物标志物(Weiss等人，2014)。靶向可能致病的，促进疾病的细胞外亨廷顿蛋白先前不被认为是治疗靶标，也未显示是否主动诱导或被动施用的抗体是否可提供治疗益处。
本发明的一个目的是提供用于亨廷顿氏病的新的治疗策略，特别是超出仅仅控制症状的策略。另一个目的是提供用于预防或延迟与亨廷顿氏病相关症状的发作的方法(means)。
因此，本发明提供了用于治疗亨廷顿氏病或延迟其临床症状发作的基于肽的疫苗和抗体。因此，本发明提供了基于作为治疗靶物的HTT蛋白的全新的治疗概念。本发明给“基于抗体的HTT降低策略”提供了可以单独应用或组合的两种策略性变体：基于HTT肽的主动免疫和/或基于抗体的被动免疫。可以认为两种策略就治疗靶标HTT蛋白而言是等效的。两种策略也应用相同(即没有基本差异)的治疗原理和作用模式，因为抗击病原性HTT的活性成分最终总是抗体(无论是主动产生的抗HTT抗体或被动施用的抗体)。这在根据本发明以下的实施例部分中已经通过主动免疫实验和用单克隆和多克隆抗体进行的吞噬实验显示，清楚证明了相同最终作用模式。在现有技术中没有公开根据本发明的这两种治疗策略。HTT抗体目前仅用于科学目的和检测样品中的HTT。
根据本发明的疫苗接种和被动免疫是治疗亨廷顿氏病的全新方法，并且通过本发明显示是高度有效的。本发明提供的免疫细胞和单克隆抗体特异性识别先前已显示在蛋白质的功能和病理学中具有不同作用的亨廷顿蛋白的部分。特别地，活性疫苗诱导抗体，其靶向在亨廷顿蛋白的氨基酸位置586处的先前描述的蛋白酶切割位点周围的限定表位。在下文中，该病因学/功能重要的切割区域将被称为“胱天蛋白酶区域586”。Graham等，2006显示，通过遗传手段防止蛋白酶切割在携带突变型人亨廷顿蛋白转基因的小鼠中抑制表型。还已经显示，其他蛋白酶可能参与该位点的体内切割(Wong等人2014)。因为胱天蛋白酶切割是细胞内过程，所以还没有考虑或证明靶向该区域的疫苗接种策略。此外，活性疫苗诱导靶向靶蛋白的所谓的富含脯氨酸的区域内的限定表位的抗体。
凭借本发明，第一次提出通过主动或被动疫苗接种靶向血浆亨廷顿蛋白来抵抗亨廷顿氏病。到目前为止，(细胞外)血浆HTT尚未被认为是治疗这种疾病的靶标。此外，本发明通过体外吞噬测定和通过在经疫苗接种的动物中在体内降低HTT水平和动物模型中的表型效应似乎可信地提供了作用模式机制(然而，本发明并不限于这些机制)，提供了令人信服的POC(概念证明)，显示血浆HTT靶向在人患者中也是有益的。
此外，本发明提供了特异性靶向区域和提供靶物特异性免疫应答的特异性靶向区域衍生的肽，其被配制成引发免疫应答的根据本发明的药物组合物，特别是用于在人类个体中引发合适的抗体应答。在本发明的过程中，限定了用于引发这种免疫应答的最相关肽的核心表位。这些核心表位(对应于相应疫苗接种肽的亚片段)的使用处于根据本发明的免疫原性组合物和疫苗的中心。因此，本发明中用于引发特异性免疫应答(特别是作为疫苗)的肽由这些核心表位组成或包含这些核心表位，并且可以在体内单独或组合施用。在实施例部分中，根据本发明的此类肽已经显示出在可靠的和可接受的转基因小鼠模型中是有益的。此外，还提供了衍生自HTT的胱天蛋白酶区域586的肽，其也用作免疫原性组合物，并且还可用于提供和诱导抑制蛋白酶切割(诸如例如通过胱天蛋白酶6或其他蛋白酶(Wong等人2014))的抗体(AB)。根据本发明的肽还用于产生各种单克隆抗体(mAB)，其也可用于诊断和治疗亨廷顿氏病，特别是用于被动疫苗接种(单独或组合，与主动疫苗接种类似)，作为用于在生物标志物评价/发现和(伴随)诊断中测定HTT水平的工具，作为用于胱天蛋白酶6抑制测定的探针(在胱天蛋白酶区域586处抑制胱天蛋白酶切割的那些)等。
如本文中使用，“亨廷顿蛋白”，“蛋白质亨廷顿蛋白”或“HTT”是指亨廷顿蛋白基因的表达产物。在UniProtKB/Swiss-Prot数据库(版本148，最后修改于2014年5月14日)中，在P42858(HD_HUMAN)下可获得蛋白质详情(并且本文依赖于此)。由于从HTT的氨基酸位置18开始polyQ区域的变异，胱天蛋白酶切割位点在UniProt数据库条目中称为在氨基酸584和585之间。在科学文献中以及也在本文中，胱天蛋白酶切割位点称为在氨基酸残基586和587之间(即在“VLD”之后且在“GTD”之前，即在D和G之间)。因此，根据本发明的“C6切割区”或“C6切割区586”对应于P42858(HD_人)UniProtKB/Swiss-Pro数据库条目中的氨基酸584。
本发明的疫苗进一步靶向亨廷顿蛋白的第二个功能定义区域，称为PRR结构域(代表富含脯氨酸的区域)。该区域以前已经显示牵涉在与细胞内蛋白质相互作用，诸如例如与PACSIN1(Modregger等人，2002)，并使用单链Fv片段评估为潜在的体内抗体靶向区域(Southwell等人，2011)。
在本发明的一个实施方案中，例如如实施例1所示，本发明的肽疫苗在能够介导(聚集的)亨廷顿蛋白或其片段的吞噬作用的接受体中诱导特异性抗亨廷顿蛋白免疫应答，从而提供治疗效果。如实施例3，图9和实施例8所示，这在现有技术中通过任何抗体或疫苗相关方法进行亨廷顿氏病的治疗中没有显示。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体可以类似于主动免疫方法用于针对亨廷顿蛋白的被动免疫，这基于所产生的单克隆抗体衍生自相同的肽并识别相同的靶标的实情，例如如实施例1、4和5所示。
此外，本发明还公开了其抗体用于药物选择以及在用于诊断和监测亨廷顿氏病的发展的方法中的用途。
本发明涉及含有亨廷顿蛋白衍生肽的免疫原性组合物，其中所述肽以免疫原性形式提供，即使得在施用所述组合物的人类个体中引发免疫应答(以在人类个体中产生针对该肽的抗体的形式)。优选地，肽与载体，优选蛋白质载体偶联，或者肽在悬浮液，特别是水包油悬浮液中提供，以提供免疫原性形式的肽。因此，根据本发明的“疫苗”组合物也可以被认为是“免疫原性组合物”，即在应用该组合物的人类个体中引发免疫应答的组合物。然而，已知人类个体中引发免疫应答的能力在群体内可能显著变化，因此，对于本发明的目的，如果在至少10％，优选在至少20％，更优选至少30％，特别是至少50％的给定群体的个体中，在递送根据本发明的免疫原性组合物后的免疫反应是可检测的，例如，对所递送的肽具有特异性的抗体由个体的免疫系统形成，那么指的是“免疫原性组合物”。
本发明公开了HTT蛋白的免疫原性肽，其包含p6773(LPQPPPQAQPLLPQPQPC,SEQ IDNo.1),p7564(CPSDSSEIVLD,SEQ ID No.2),p7543(GTDNQYLGLQIGC,SEQ ID No.3),p7543a(DNQYLGLQIC；SEQ ID No.88),尤其衍生物p9394(KTDNQYLGLQIGKC；SEQ ID No.91),p9395(GTDNQYLGLQIGKKC；SEQ ID No.92),p9396(KTDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.93),p9397(KDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.94)；p7543b(TDNQYLGLQIC；SEQ ID No.89),p7543c(TDNQYLGLQIGC；SEQ ID No.90)，p6771(LPQPPPQAQPLLPC,SEQ ID No.4),p6776(CSEIVLDGTDNQYL,SEQ ID No.36),p6777(CSDSSEIVLDGTDN,SEQ ID No.37)和p8346(CGPAVAEEPLHRP，SEQ ID No.5)，优选用于针对由亨廷顿氏病引起的症状的疫苗接种，或用于延迟疾病的发作。这些序列中的“C”残基总是作为接头使用(并且已经引入)；可以存在或不存在或备选在肽的C-或N-末端(即在肽链的备选末端)提供N末端或C末端的此半胱氨酸接头(作为任何其它接头，诸如-GC，-GGC，-KC，-KCC，-KCC，-KKC，-KKG，-KCG，-KGC，-KKGC，-KKCG(及其N-末端变体，诸如CG-，CGG-等)或半胱氨酸与作为间隔区的氨基酸(诸如例如β-丙氨酸或赖氨酸)的类似组合，如例如分别用于肽p6775或p6768，p9394，p9395，p9396或p9397中，或作为提供接头或间隔区功能或改善的肽溶解性而不妨碍免疫学性质的其他化学部分)。例如在赖氨酸衍生物p9394-p9397中提供了接头肽与溶解度改进剂的这种组合。在其它实施方案中，还可以在除N-或C-末端以外的氨基酸位置提供接头，例如，在具有官能团的氨基酸处，如丝氨酸，赖氨酸，精氨酸，酪氨酸，苏氨酸，天冬氨酸或谷氨酸，天冬酰胺或谷氨酰胺，组氨酸，甲硫氨酸等(特别是衍生物p9394(KTDNQYLGLQIGKC；SEQ ID No.91)，p9395(GTDNQYLGLQIGKKC；SEQ ID No.92)，p9396(KTDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.93)，p9397(KDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.94)，具有显著改善的实际功能特性)；然而，在这样的实施方案中，必须注意肽的免疫学性质不被这种连接严重阻碍(对于限定的大小变化的可能性：参见例如US 2010/0158933A1)。
本发明公开了源自PRR和c6区的肽。根据本发明的肽具有显著的有益技术关系，其通过若干共同特征反映：(1)根据本发明的所有PRR-和C6-衍生的肽都共享特定的免疫原性；它们的表位是特别可接近的(与例如来自如实施例1中所示的极其N-末端或polyQ区域的肽形成对比)；特别地，靶向它们的表位对于实现在HTT靶向中的治疗效果是高度相关的，如下文实施例部分中的功能性体内实施例中所示的。(2)将根据本发明的肽定位到HTT的下述区域，其中已经证明了结构/功能相关性，如蛋白酶可接近性或蛋白质-蛋白质相互作用。(3)最重要的是，这两个表位的组合靶向提供了有效的治疗效果(与使用一个单一表位形成对比)。
在此背景中，必须注意，不是任何HTT衍生的肽可以用于治疗HTT。这也在下面的实施例部分中显示。事实上，某些肽比其它肽更具免疫原性。此外，某些肽的组合显示更强的有效性(例如，在HTT血浆清除率和运动效应方面，PRR区域肽和C6-区域肽的组合)，这最有可能是由于一个或多个亨廷顿蛋白表位的特异性识别导致增强的吞噬作用。本发明还提供了用于治疗HTT的肽的有利组合。如已经提到的，凭借本发明，提供了靶向(作为治疗原理)细胞外HTT的治疗性疫苗。这单独已经是一个完全新的策略，因为HTT一直被称为细胞内聚集蛋白。
根据本发明的肽和本疫苗靶向区域根据(1)区域/肽的可接近性和(2)免疫原性来定义。此外，肽的某些组合(如以下体内实施例中所示)提供增强的HTT清除和表型(运动和组织学)变化。这些变化可以通过抗亨廷顿蛋白抗体和Fc受体介导的吞噬作用来解释，也如实施例中所示。Fc-受体介导的吞噬作用需要抗原-抗体复合物的多价性，这解释了在两个或多个而不是一个单一表位上靶向HTT的更高的有效性：呈现多个Fc部分的抗原/抗体复合物比由一种单一抗体结合的单个HTT分子更可能被吞噬作用清除。
这没有被现有技术公开或提示。例如，WO2012/140376A1中公开的治疗性肽pep4和pep42或由Miller等人(2003)报道的源自HTT的N端的肽源自与根据本发明的肽不同的HTT区域。甚至更重要的是，例如在WO2012/140376A1中描述的这些肽从未意图或用于任何治疗目的，诸如例如，疫苗(即用于在活生物体中诱导B细胞免疫应答)。相反，WO2012/140376A1公开了可用于聚集抑制(即通过直接干扰HTT或其片段)的肽，其不涉及诱导如疫苗所需的免疫应答。产生WO2010/015592A2中的抗体作为用于通过FRET测定或其它体外分析手段检测HTT(或其聚集体或片段)的探针。再一次，提供这些抗体的目的是实验/分析或诊断的，但不是治疗的。通常，以前从未提出或证明抗HTT抗体可用于治疗亨廷顿氏病的治疗目的。此外，没有来自WO 2010/015592A2的任何抗体具有与根据本发明的疫苗接种肽的重叠。最后，在Persichetti等人(1995)中引用的肽“HP1”和“HP12”用于产生多克隆抗血清，以便提供分析探针，用于在实验条件下的HTT检测(如通过Western印迹或IHC的HTT检测)，但不用于疫苗治疗。对于单克隆抗体也是如此，诸如例如描述在Ko等人,(2001)(例如MW1-8)，其由polyQ-HTT-GST融合蛋白产生，但不通过肽免疫产生。
因此，重要的是注意到，根据本发明的肽适合于产生治疗性疫苗，而用于产生多克隆或单克隆抗体的现有技术肽被设计为提供用于分析或诊断用途的探针。
因此，源自PRR和C6区的根据本发明的肽是特别有利的。这两组都是高度免疫原性的，特别是SEQ ID No.1、4、16、19和28；和2、3、6-18和20-50；其中SEQ ID No.1-4由于其在体内实验中的功能性能而是高度优选的。
进一步优选的免疫原性肽选自p8855(SDSSEIVLDGTDC，SEQ ID No.6)，p8858(EIVLDGTDNQYLC，SEQ ID No.7)，p8859(IVLDGTDNQYLGC，SEQ ID No.8)，p8860(VLDGTDNQYLGLC，SEQ ID No.9)，p8861(LDGTDNQYLGLQC，SEQ ID No.10)，p8862(DGTDNQYLGLQIGC,SEQ ID No.11)，p8869(CTDNQYLGLQIGQ，SEQ ID No.12)，p8868(CGTDNQYLGLQIG，SEQ ID No.13)，p8870(CDNQYLGLQIGQP，SEQ ID No.14)，p8871(CNQYLGLQIGQPQ，SEQ ID No.15)，p6772(CPQLPQPPPQAQPLLP，SEQ ID No.16)，p8864(TDNQYLGLQIGQC，SEQ ID No.17)，p8865(DNQYLGLQIGQPC，SEQ ID No.18)，p6775(PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC，SEQ ID No.19)，p8854(PSDSSEIVLDGTC，SEQ ID No.20)，p8856(DSSEIVLDGTDNC，SEQ ID No.21)，p8857(SEIVLDGTDNQYC，SEQ ID No.22)，p8866(NQYLGLQIGQPQC，SEQ ID No.23)，和p8867(QYLGLQIGQPQDC，SEQ ID No.24)，其中N-或C-末端半胱氨酸残基(C)可以存在或不存在或备选地在C-或N-末端提供；；优选用于针对由亨廷顿氏病引起的症状的疫苗接种或用于延迟疾病的发作。
其它合适的免疫原性肽选自p6763(CaMATLEKLMKAFESLKSFQ,SEQ ID No.25),p6764(CaKLMKAFESLKSFQ,SEQ ID No.26),p6765(CEEQQRQQQQQQQ,SEQ ID No.27),p6768(QQQQQQPPPPPPPPaKKKC,SEQ ID No.28),p7541(CSEIVLD,SEQ ID No.29),p7552(CSSEIVLD,SEQ ID No.30),p7562(CDSSEIVLD,SEQ ID No.31),p7563(CSDSSEIVLD,SEQ IDNo.32),p7567(CEIVLD,SEQ ID No.33),p7568(CIVLD,SEQ ID No.34),p7605(CSEIVL,SEQID No.35),p6776(CSEIVLDGTDNQYL,SEQ ID No.36),p6777(CSDSSEIVLDGTDN,SEQ IDNo.37),p6776b(SEIVLDGTDNQYLC,SEQ ID No.38),p7752(CAEIVLDGTDNQYL,SEQ IDNo.39),p7753(CSAIVLDGTDNQYL,SEQ ID No.40),p7754(CSEAVLDGTDNQYL,SEQ ID No.41),p7755(CSEIALDGTDNQYL,SEQ ID No.42),p7756(CSEIVADGTDNQYL,SEQ ID No.43),p7757(CSEIVLAGTDNQYL,SEQ ID No.44),p7758(CSEIVLDATDNQYL,SEQ ID No.45),p7745(CSEIVLDGADNQYL,SEQ ID No.46),p7746(CSEIVLDGTANQYL,SEQ ID No.47),p7747(CSEIVLDGTDAQYL,SEQ ID No.48),p7748(CSEIVLDGTDNAYL,SEQ ID No.49),p7749(CSEIVLDGTDNQAL,SEQ ID No.50),和p7750(CSEIVLDGTDNQYA,SEQ ID No.51)，其中N-或C-末端半胱氨酸残基(C)可以存在或不存在或备选地在C-或N-末端提供。
根据本发明，免疫原性是特定物质(例如抗原或表位)刺激免疫应答，例如以引发针对给定肽的抗体的能力。
优选地，这些肽长至少7个氨基酸，优选的长度可以高达16个，优选高达14或20个氨基酸残基(例如7或8至20，7或8至16等)。SEQ ID NO：1至51的肽的N-或C-末端的“C”已经作为接头提供，其可以或可以不存在或被允许固定到载体的另一种氨基酸或化学接头替换。可以在肽的这个末端，紧接在“C”(半胱氨酸残基)之前或紧接在“C”之后提供其它连接氨基酸。如果不需要“C”进行偶联和/或如果通过除了“C”与载体结合外的方式保护免疫原性，则也可以省略“C”。或者，根据本发明，也可以使用这些肽的片段，优选具有最小长度7个氨基酸残基，其中半胱氨酸残基之前的一个或多个氨基酸被省略。或者，可以使用不影响免疫原性肽的免疫原性和特异性的极性或带电荷的氨基酸来增加肽的溶解度。因此，本发明的肽包含7至30个，更优选7至20个，更优选7至16个，最优选8个氨基酸残基。然而，根据本发明，更长的肽也可以非常好地用作抗HTT-抗体诱导抗原，例如如实施例1中所示。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗和/或预防亨廷顿氏病的基于肽的疫苗，其包含HTT蛋白的至少一种免疫原性肽和任选地还有一种或多种佐剂。根据本发明，疫苗是改善针对特定疾病的免疫的生物制剂。根据本发明，佐剂是改变其它药剂例如以增强对所提供的肽表位的免疫应答的作用的药理学药剂。
根据本发明优选所述至少一种免疫原性肽与药学上可接受的载体偶联，所述载体优选为KLH。通常，根据本发明，能够促进Th1应答从而优先地诱导人类中的IgG1和IgG3的任何制剂是优选的。免疫原性肽可以以分离的(肽)形式提供在疫苗中，或者可以(共价或非共价地)偶联或复合于其它分子，例如药物载体物质或多肽，脂质或糖结构，特别是肽接头或蛋白质载体。此外，肽接头或蛋白质载体可以由T细胞辅助表位组成或包含T细胞辅助表位，例如，如实施例2和3所示。
优选地，优选地，药学上可接受的载体是KLH(匙孔血蓝蛋白)，破伤风类毒素，白蛋白结合蛋白，牛血清白蛋白，树枝状大分子(dendrimer)(MAP；Biol.Chem.358：581)单独或与在Singh&O'Hagan,1999(特别是本文表1中的那些)和O'Hagan&Valiante,2003中描述的佐剂物质组合(可以使用特别是其中描述的先天免疫增强化合物和递送系统或其混合物，例如低溶解性铝组合物(例如氢氧化铝)，MF59磷酸铝，磷酸钙，细胞因子(例如IL-2，IL-12，GM-CSF)，皂苷(例如QS21)，MDP衍生物，CpG寡核苷酸，IC31，LPS，MPL，角鲨烯，D，Lα-生育酚(例如在具有磷酸盐缓冲盐水的水包油系统中混合)，聚磷腈，乳剂(例如弗氏佐剂，SAF)，脂质体，病毒体，异形体(iscoms)，耳蜗，PLG微粒，泊洛沙姆颗粒，病毒样颗粒，热不稳定肠毒素(LT)，霍乱毒素(CT)，突变毒素(例如LTK63和LTR72)，微粒和/或聚合脂质体)。在本发明的一个优选实施方案中，HTT肽疫苗组合物含有氢氧化铝。
包含本发明肽和药学上可接受的载体的疫苗可以通过任何合适的施用模式施用，例如i.v.,i.p.,i.m.，鼻内，口服，皮下施用等，并且在任何合适的递送装置中(O’Hagan&Valiente，2003)。
通常，疫苗含有0.1ng至10mg，优选10ng至1mg，特别是100ng至100μg的量的根据本发明的HTT肽，或者，例如，100fmole至10μM，优选10pM至1μM，特别是100pM至100nM。
疫苗还可以包含典型的辅助物质，例如,缓冲剂，稳定剂等。
根据本发明的亨廷顿氏病的预防被定义为预防或延迟个体中亨廷顿氏病相关症状如运动和精神症状的爆发和/或发作或免疫学和代谢变化，所述个体基于他们在至少一个HTT等位基因中CAG重复数的升高具有发展亨廷顿氏病症状的倾向。
根据本发明的亨廷顿氏病的治疗被定义为改善个体中亨廷顿氏病相关的运动症状，如舞蹈症和精神病学或免疫学和代谢变化，所述个体在遗传上鉴定为携带突变的HTT(即在至少一个HTT等位基因中携带多于26个CAG重复的个体)，并且基于他们的症状和基因型(诸如通过在用于亨廷顿氏病的动物模型中诱导表型改变所显示的，例如如在实施例2和3中)被诊断为亨廷顿氏病阳性。
用本发明的免疫原性HTT衍生肽进行主动免疫，即疫苗接种，导致对HTT蛋白靶标的调理作用，从而诱导其特异性吞噬作用。调理是一种过程，通过该过程抗体结合抗原例如亨廷顿蛋白，因此标记它用于免疫应答。吞噬细胞结合免疫球蛋白的Fc部分，然后内化标记的抗原，例如，如实施例8中的抗亨廷顿蛋白抗体PRR13和C6-17所证明的。
根据本发明特别优选的是基于肽的疫苗，其含有至少一种免疫原性肽，其引发针对HTT或其天然存在的片段，特别是与亨廷顿氏病相关的片段的免疫应答，以用于预防和/或治疗亨廷顿氏病，其中所述HTT蛋白的至少一种免疫原性肽选自：p6773(LPQPPPQAQPLLPQPQPC,SEQ ID No.1),p7564(CPSDSSEIVLD,SEQ ID No.2),p7543(GTDNQYLGLQIGC,SEQ ID No.3),p7543a(DNQYLGLQIC；SEQ ID No.88),尤其衍生物p9394(KTDNQYLGLQIGKC；SEQ ID No.91),p9395(GTDNQYLGLQIGKKC；SEQ ID No.92),p9396(KTDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.93),p9397(KDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.94)；p7543b(TDNQYLGLQIC；SEQ ID No.89),p7543c(TDNQYLGLQIGC；SEQ ID No.90),p6771(LPQPPPQAQPLLPC,SEQ ID No.4),p8346(CGPAVAEEPLHRP,SEQ ID No.5),p8855(SDSSEIVLDGTDC,SEQ ID No.6),p8858(EIVLDGTDNQYLC,SEQ ID No.7),p8859(IVLDGTDNQYLGC,SEQ ID No.8),p8860(VLDGTDNQYLGLC,SEQ ID No.9),p8861(LDGTDNQYLGLQC,SEQ ID No.10),p8862(DGTDNQYLGLQIGC,SEQ ID No.11),p8869(CTDNQYLGLQIGQ,SEQ ID No.12),p8868(CGTDNQYLGLQIG,SEQ ID No.13),p8870(CDNQYLGLQIGQP,SEQ ID No.14),p8871(CNQYLGLQIGQPQ,SEQ ID No.15),p6772(CPQLPQPPPQAQPLLP,SEQ ID No.16),p8864(TDNQYLGLQIGQC,SEQ ID No.17),p8865(DNQYLGLQIGQPC,SEQ ID No.18),p6775(PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC,SEQ ID No.19),p8854(PSDSSEIVLDGTC,SEQ ID No.20),p8856(DSSEIVLDGTDNC,SEQ ID No.21),p8857(SEIVLDGTDNQYC,SEQ ID No.22),p8866(NQYLGLQIGQPQC,SEQ ID No.23),p8867(QYLGLQIGQPQDC,SEQ ID No.24),p6763(CaMATLEKLMKAFESLKSFQ,SEQ ID No.25),p6764(CaKLMKAFESLKSFQ,SEQ ID No.26),p6765(CEEQQRQQQQQQQ,SEQ ID No.27),p6768(QQQQQQPPPPPPPPaKKKC,SEQ ID No.28),p7541(CSEIVLD,SEQ ID No.29),p7552(CSSEIVLD,SEQ ID No.30),p7562(CDSSEIVLD,SEQ ID No.31),p7563(CSDSSEIVLD,SEQ IDNo.32),p7567(CEIVLD,SEQ ID No.33),p7568(CIVLD,SEQ ID No.34),p7605(CSEIVL,SEQID No.35),p6776(CSEIVLDGTDNQYL,SEQ ID No.36),p6777(CSDSSEIVLDGTDN,SEQ IDNo.37),p6776b(SEIVLDGTDNQYLC,SEQ ID No.38),p7752(CAEIVLDGTDNQYL,SEQ IDNo.39),p7753(CSAIVLDGTDNQYL,SEQ ID No.40),p7754(CSEAVLDGTDNQYL,SEQ ID No.41),p7755(CSEIALDGTDNQYL,SEQ ID No.42),p7756(CSEIVADGTDNQYL,SEQ ID No.43),p7757(CSEIVLAGTDNQYL,SEQ ID No.44),p7758(CSEIVLDATDNQYL,SEQ ID No.45),p7745(CSEIVLDGADNQYL,SEQ ID No.46),p7746(CSEIVLDGTANQYL,SEQ ID No.47),p7747(CSEIVLDGTDAQYL,SEQ ID No.48),p7748(CSEIVLDGTDNAYL,SEQ ID No.49),p7749(CSEIVLDGTDNQAL,SEQ ID No.50),and p7750(CSEIVLDGTDNQYA,SEQ ID No.51),优选p6773(LPQPPPQAQPLLPQPQPC,SEQ ID No.1),p7564(CPSDSSEIVLD,SEQ ID No.2),p7543(GTDNQYLGLQIGC,SEQ ID No.3),p6771(LPQPPPQAQPLLPC,SEQ ID No.4),p6776(CSEIVLDGTDNQYL,SEQ ID No.36),p6777(CSDSSEIVLDGTDN,SEQ ID No.37),p8346(CGPAVAEEPLHRP,SEQ ID No.5),p8855(SDSSEIVLDGTDC,SEQ ID No.6),p8858(EIVLDGTDNQYLC,SEQ ID No.7),p8859(IVLDGTDNQYLGC,SEQ ID No.8),p8860(VLDGTDNQYLGLC,SEQ ID No.9),p8861(LDGTDNQYLGLQC,SEQ ID No.10),p8862(DGTDNQYLGLQIGC,SEQ ID No.11),p8869(CTDNQYLGLQIGQ,SEQ ID No.12),p8868(CGTDNQYLGLQIG,SEQ ID No.13),p8870(CDNQYLGLQIGQP,SEQ ID No.14),p8871(CNQYLGLQIGQPQ,SEQ ID No.15),p6772(CPQLPQPPPQAQPLLP,SEQ ID No.16),p8864(TDNQYLGLQIGQC,SEQ ID No.17),p8865(DNQYLGLQIGQPC,SEQ ID No.18),p6775(PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC,SEQ ID No.19),p8854(PSDSSEIVLDGTC,SEQ ID No.20),p8856(DSSEIVLDGTDNC,SEQ ID No.21),p8857(SEIVLDGTDNQYC,SEQ ID No.22),p8866(NQYLGLQIGQPQC,SEQ ID No.23),and p8867(QYLGLQIGQPQDC,SEQ ID No.24),especiallyp6773(LPQPPPQAQPLLPQPQPC,SEQ ID No.1),p7564(CPSDSSEIVLD,SEQ ID No.2),p7543(GTDNQYLGLQIGC,SEQ ID No.3),p7543a(DNQYLGLQIC；SEQ ID No.88),尤其衍生物p9394(KTDNQYLGLQIGKC；SEQ ID No.91),p9395(GTDNQYLGLQIGKKC；SEQ ID No.92),p9396(KTDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.93),p9397(KDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.94)；p7543b(TDNQYLGLQIC；SEQ ID No.89),p7543c(TDNQYLGLQIGC；SEQ ID No.90),p6771(LPQPPPQAQPLLPC,SEQ ID No.4),p6776(CSEIVLDGTDNQYL,SEQ ID No.36),p6777(CSDSSEIVLDGTDN,SEQ ID No.37),和p8346(CGPAVAEEPLHRP,SEQ ID No.5),或包含这些肽中至少一个的肽，优选总长度最多50个氨基酸残基，更优选最多30个氨基酸残基，进一步优选最多20个氨基酸残基，尤其是最多16个氨基酸残基。根据本发明的特别优选的肽可以具有6至10个氨基酸残基的长度，例如7,8或9个氨基酸，特别是9个氨基酸。
本发明还涉及SEQ ID Nos.1至51的免疫原性肽的片段，其含有核心表位。肽p6771，p6773和p7543的核心表位已经在本发明的实施例部分中鉴定。肽p6771或p6773的核心表位分别是PPQAQPL(SEQ ID No.78)，PPQAQP(SEQ ID No.79)，QPLL(SEQ ID No.80)和PQAQPLL(SEQ ID No.81)，并且尤其是LLPQP(SEQ ID No.77)。肽p7543的核心表位是QYLGLQIG(SEQ ID No.82),YLGLQIG(SEQ ID No.83),DNQYLGLQIG(SEQ ID No.84),DNQYLGL(SEQ ID No.85)和YLGLQIG(SEQ ID No.86),尤其是QYLGLQIG。因此，根据本发明的优选的免疫原性肽包含这些核心表位中的至少一个，并且优选具有30个，优选20个，特别是16个氨基酸残基的最大长度，其中所述肽优选用于产生或鉴定特异性亨廷顿蛋白C6-切割抑制剂，并且其中所述特定亨廷顿蛋白C6-切割抑制剂优选限定为单克隆抗体，多克隆抗血清，单克隆抗体衍生的片段如Fv’s，scFv’s，F(ab)，F(ab)2。
根据优选的方面，本发明提供了可以用作活性疫苗并且包含至少两种本发明公开的免疫原性肽的免疫原性组合物。优选地，组合物含有这些肽中的至少三种，更优选这些肽中的至少四种，特别是这些肽中的至少五种。优选地，这样的两种或更多种肽中的至少一种选自下组：p6773(LPQPPPQAQPLLPQPQPC,SEQ ID No.1),p7564(CPSDSSEIVLD,SEQ IDNo.2),p7543(GTDNQYLGLQIGC,SEQ ID No.3),p7543a(DNQYLGLQIC；SEQ ID No.88),尤其衍生物p9394(KTDNQYLGLQIGKC；SEQ ID No.91),p9395(GTDNQYLGLQIGKKC；SEQ ID No.92),p9396(KTDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.93),p9397(KDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.94)；p7543b(TDNQYLGLQIC；SEQ ID No.89),p7543c(TDNQYLGLQIGC；SEQ ID No.90),p6771(LPQPPPQAQPLLPC,SEQ ID No.4),p6776(CSEIVLDGTDNQYL,SEQ ID No.36),p6777(CSDSSEIVLDGTDN,SEQ ID No.37),和p8346(CGPAVAEEPLHRP,SEQ ID No.5)。还优选组合来自“C6”区域的至少一种肽与来自“PRR”区域的至少一种肽(如例如在表2中公开的)。特别优选的组合是p7543(GTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.3)与任何其它肽，特别是与SEQ ID NO：1,2,4和5的组合。特别优选的是组合p7543(GTDNQYLGLQIGC,SEQ ID No.3)(或p7543a(DNQYLGLQIC；SEQ ID No.88),特别是衍生物p9394(KTDNQYLGLQIGKC；SEQ ID No.91),p9395(GTDNQYLGLQIGKKC；SEQ ID No.92),p9396(KTDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.93),p9397(KDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.94)；p7543b(TDNQYLGLQIC；SEQ ID No.89),p7543c(TDNQYLGLQIGC；SEQ ID No.90))与p6771(LPQPPPQAQPLLPC,SEQ ID No.4)以及p7543(GTDNQYLGLQIGC,SEQ ID No.3)与p7564(CPSDSSEIVLD,SEQ ID No.2)。
在另一方面，本发明提供了包含特异性识别HTT蛋白的至少一种肽的多克隆抗体血清的药物组合物，其用作疫苗，用于治疗和/或预防亨廷顿氏病。
对于本发明，术语“药物制剂”和“药物组合物”可互换使用，是指意在并适于递送至人类个体的组合物。这样的制剂或组合物已根据GMP(药品生产和质量管理)制造，并且是充分无菌的并被包装以符合EMA和FDA，特别是EMA所需的必要条件。
根据本发明，多克隆抗体血清的抗体可以根据本领域技术人员已知的技术例如亲和层析纯化。
药物组合物可另外含有药学上可接受的载体或赋形剂，其可被多克隆抗体(共价或非共价)偶联或复合。包含多克隆抗体的药物组合物可另外含有至少一种另外的治疗剂。
根据本发明，优选多克隆抗体血清的抗体导致免疫球蛋白介导的效应子功能，例如，HTT蛋白，聚集的HTT或其片段的调理和吞噬作用，如实施例8所显示的。这需要免疫球蛋白在由特定糖残基编码的其Fc部分中携带适当的调理吞噬活性，以允许调理作用，吞噬作用，补体裂解或NK细胞杀伤效应子功能组合对可溶性，聚集或片段化形式的野生型和突变体亨廷顿蛋白的阻断/隔绝功能。提供了显示由p6773或p7543疫苗衍生的单克隆抗体提供的吞噬活性的实施例(实施例8)。
在本发明的另一个优选实施方案中，包含在所述药理学组合物中的多克隆抗体血清针对选自以下的至少一种肽产生：p6773(LPQPPPQAQPLLPQPQPC,SEQ ID No.1),p7564(CPSDSSEIVLD,SEQ ID No.2),p7543(GTDNQYLGLQIGC,SEQ ID No.3),p7543a(DNQYLGLQIC；SEQ ID No.88),尤其是衍生物p9394(KTDNQYLGLQIGKC；SEQ ID No.91),p9395(GTDNQYLGLQIGKKC；SEQ ID No.92),p9396(KTDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.93),p9397(KDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.94)；p7543b(TDNQYLGLQIC；SEQ ID No.89),p7543c(TDNQYLGLQIGC；SEQ ID No.90),p6771(LPQPPPQAQPLLPC,SEQ ID No.4),p8346(CGPAVAEEPLHRP,SEQ ID No.5),p8855(SDSSEIVLDGTDC,SEQ ID No.6),p8858(EIVLDGTDNQYLC,SEQ ID No.7),p8859(IVLDGTDNQYLGC,SEQ ID No.8),p8860(VLDGTDNQYLGLC,SEQ ID No.9),p8861(LDGTDNQYLGLQC,SEQ ID No.10),p8862(DGTDNQYLGLQIGC,SEQ ID No.11),p8869(CTDNQYLGLQIGQ,SEQ ID No.12),p8868(CGTDNQYLGLQIG,SEQ ID No.13),p8870(CDNQYLGLQIGQP,SEQ ID No.14),p8871(CNQYLGLQIGQPQ,SEQ ID No.15),p6772(CPQLPQPPPQAQPLLP,SEQ ID No.16),p8864(TDNQYLGLQIGQC,SEQ ID No.17),p8865(DNQYLGLQIGQPC,SEQ ID No.18),p6775(PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC,SEQ ID No.19),p8854(PSDSSEIVLDGTC,SEQ ID No.20),p8856(DSSEIVLDGTDNC,SEQ ID No.21),p8857(SEIVLDGTDNQYC,SEQ ID No.22),p8866(NQYLGLQIGQPQC,SEQ ID No.23),p8867(QYLGLQIGQPQDC,SEQ ID No.24),p6763(CaMATLEKLMKAFESLKSFQ,SEQ ID No.25),p6764(CaKLMKAFESLKSFQ,SEQ ID No.26),p6765(CEEQQRQQQQQQQ,SEQ ID No.27),p6768(QQQQQQPPPPPPPPaKKKC,SEQ ID No.28),p7541(CSEIVLD,SEQ ID No.29),p7552(CSSEIVLD,SEQ ID No.30),p7562(CDSSEIVLD,SEQ IDNo.31),p7563(CSDSSEIVLD,SEQ ID No.32),p7567(CEIVLD,SEQ ID No.33),p7568(CIVLD,SEQ ID No.34),p7605(CSEIVL,SEQ ID No.35),p6776(CSEIVLDGTDNQYL,SEQ ID No.36),p6777(CSDSSEIVLDGTDN,SEQ ID No.37),p6776b(SEIVLDGTDNQYLC,SEQ ID No.38),p7752(CAEIVLDGTDNQYL,SEQ ID No.39),p7753(CSAIVLDGTDNQYL,SEQ ID No.40),p7754(CSEAVLDGTDNQYL,SEQ ID No.41),p7755(CSEIALDGTDNQYL,SEQ ID No.42),p7756(CSEIVADGTDNQYL,SEQ ID No.43),p7757(CSEIVLAGTDNQYL,SEQ ID No.44),p7758(CSEIVLDATDNQYL,SEQ ID No.45),p7745(CSEIVLDGADNQYL,SEQ ID No.46),p7746(CSEIVLDGTANQYL,SEQ ID No.47),p7747(CSEIVLDGTDAQYL,SEQ ID No.48),p7748(CSEIVLDGTDNAYL,SEQ ID No.49),p7749(CSEIVLDGTDNQAL,SEQ ID No.50)，和p7750(CSEIVLDGTDNQYA,SEQ ID No.51)，优选p6773(LPQPPPQAQPLLPQPQPC,SEQ ID No.1),p7564(CPSDSSEIVLD,SEQ ID No.2),p7543(GTDNQYLGLQIGC,SEQ ID No.3),p6771(LPQPPPQAQPLLPC,SEQ ID No.4),p6776(CSEIVLDGTDNQYL,SEQ ID No.36),p6777(CSDSSEIVLDGTDN,SEQ ID No.37),p8346(CGPAVAEEPLHRP,SEQ ID No.5),p8855(SDSSEIVLDGTDC,SEQ ID No.6),p8858(EIVLDGTDNQYLC,SEQ ID No.7),p8859(IVLDGTDNQYLGC,SEQ ID No.8),p8860(VLDGTDNQYLGLC,SEQ ID No.9),p8861(LDGTDNQYLGLQC,SEQ ID No.10),p8862(DGTDNQYLGLQIGC,SEQ ID No.11),p8869(CTDNQYLGLQIGQ,SEQ ID No.12),p8868(CGTDNQYLGLQIG,SEQ ID No.13),p8870(CDNQYLGLQIGQP,SEQ ID No.14),p8871(CNQYLGLQIGQPQ,SEQ ID No.15),p6772(CPQLPQPPPQAQPLLP,SEQ ID No.16),p8864(TDNQYLGLQIGQC,SEQ ID No.17),p8865(DNQYLGLQIGQPC,SEQ ID No.18),p6775(PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC,SEQ ID No.19),p8854(PSDSSEIVLDGTC,SEQ ID No.20),p8856(DSSEIVLDGTDNC,SEQ ID No.21),p8857(SEIVLDGTDNQYC,SEQ ID No.22),p8866(NQYLGLQIGQPQC,SEQ ID No.23),和p8867(QYLGLQIGQPQDC,SEQ ID No.24)，尤其是p6773(LPQPPPQAQPLLPQPQPC,SEQ ID No.1),p7564(CPSDSSEIVLD,SEQ ID No.2),p7543(GTDNQYLGLQIGC,SEQ ID No.3),p6771(LPQPPPQAQPLLPC,SEQ ID No.4),p6776(CSEIVLDGTDNQYL,SEQ ID No.36),p6777(CSDSSEIVLDGTDN,SEQ ID No.37),和p8346(CGPAVAEEPLHRP,SEQ ID No.5)。
在本发明的另一个优选实施方案中，针对p6773(SEQ ID No.1)和p6771(SEQ IDNo.4)中的至少一种肽产生的、包含在所述药理学组合物中的多克隆抗体血清覆盖核心表位区域，如通过免疫血清的精细表位分析例示，例如如通过实施例4所示的。基于单氨基酸取代分析，核心表位覆盖下述氨基酸位置，其不能在不失去由测试的抗体的结合的情况下被丙氨酸或大多数其他氨基酸交换，例如，如在实施例4中解释的。
备选地或组合地，包含在所述药理学组合物中的多克隆抗体血清是针对肽p7543(SEQ ID No.3)产生的，所述肽p7543覆盖实施例4中提供的核心表位区，如通过由肽p7543产生的血清的精细表位分析所显示的。基于氨基酸取代分析，肽位置不能在不修饰由相应的抗体进行的表位识别(至少在核心表位区域内)的情况下交换，例如，如实施例4中所解释的。
备选地或组合地，包含在所述药理学组合物中的多克隆抗体血清是针对肽p7564(SEQ ID No.2)产生的，所述肽p7564覆盖p7564衍生的mAB M1D1的核心表位区域，例如如实施例5图17中所提供的。
备选地或组合地，包含在所述药理学组合物中的多克隆抗体血清是针对肽p6776(SEQ ID No.36)产生的，所述肽p6776覆盖核心表位区域，例如，如实施例4图11所提供的。
根据另一方面，本发明涉及针对HTT或其天然存在的片段的单克隆抗体，优选用于治疗亨廷顿氏病或用于延迟该疾病的症状的发作。根据本发明的单克隆(以及多克隆)抗体提供为“分离的抗体”。“分离的”抗体是已经与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)测定的，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。对于单克隆抗体，也可获得编码抗体的核酸；因此，本发明还包括编码这样的抗体的分离的核酸。“分离的”核酸是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常含有核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置。“编码抗HTT抗体的分离的核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单个载体或分开的载体中的这样的核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的这样的核酸分子。
如本文中所用的，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即构成群体的单个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体，例如含有天然发生的突变或在单克隆抗体制剂的生产期间产生，这样的变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群获得的抗体特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA方法，噬菌体，酵母或哺乳动物细胞展示方法，以及使用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
在另一方面，本发明还提供单克隆抗体“PRR13”，其具有能够结合HTT蛋白中具有包含在肽p6773(SEQ ID No.1)内的序列“LLPQP”的表位，特别是核心表位LLPQP(SEQ IDNo.77)的结合结构域。凭借本发明，提供了针对已经给根据本发明的实验提供的最小核心表位的mAB，即针对核心表位LLPQP(SEQ ID No.77)。在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体的特征在于是单克隆抗体(例如优选PRR13)，其包含含有肽序列GYSFTDFY(SEQ IDNo.54)的重链可变区CDR1，包含IDPKNGDT(SEQ ID No.55)的重链可变区CDR2，包含ATYYGYTMDY(SEQ ID No.56)的重链可变区CDR3，包含SSVTSSY(SEQ ID No.57)的轻链可变区CDR1，包含STS(SEQ ID No.58)的轻链可变区CDR2，和包含HQYRRPPRT(SEQ ID No.59)的轻链可变区，如实施例5中所示。
CDR是互补决定区，并且表示抗体藉以与其特异性表位结合的抗体的可变区。重链的类型和数量决定了抗体的类别，即分别地IgA，IgD，IgE，IgG和IgM抗体。抗体还含有两条相同的轻链，其可以是λ或κ型的。
根据本发明，单克隆抗体优选是工程化的抗体，其中非人抗体的CDR转移到人抗体框架中，从而在顺序上改编，使得原始杂交瘤衍生的小鼠抗体的亲和力和特异性至少得到维持，并且使针对人的T细胞和B细胞免疫原性最小化(人源化单克隆抗体)，双特异性或嵌合单克隆抗体，具有涉及Fc受体的增强的效应子或稳定化功能的抗体或携带用于效应子功能或诊断标志物功能的货物(cargo)的抗体。根据本发明的抗体优选是人抗HTT抗体。
“人抗体”是这样的抗体，其拥有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列或衍生自利用人抗体全集或其它人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。“人共有框架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最通常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常，序列亚组是如在Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Bethesda MD(1991),NIH Publication 91-3242,Vols.1-3中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等人，同上中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等人，同上中的亚组III。
“人源化抗体”指包含来自非人HVR的氨基酸残基及来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。“框架”或“FR”指除了高变区(HVR)残基以外的可变域残基。可变域的FR通常由四个FR域所组成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列在VH(或VL)中通常以下述顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，且通常两个基本上整个可变域，其中全部或基本上全部的HVRs(例如，CDRs)对应于非人抗体的HVRs，且全部或基本上全部的FRs对应于人抗体的FRs。人源化抗体任选地包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少部分。抗体的“人源化变体”，例如非人抗体，指的是已经经历人源化的抗体。在一个优选的实施方案中，将鼠HVR嫁接入人抗体的框架区域中，以制备“人源化抗体”。将鼠可变区的氨基酸序列与人种系抗体V基因的集合对齐，并依据序列同一性及同源性分类。基于高的总体序列同源性和任选地还有已在受体序列中的正确的规范残基的存在选择受体序列。种系V基因仅编码直至重链的HVR3的起始，和直至轻链的HVR3的中间的区域。因此，种系V基因的基因序列并未在整个V结构域里对齐。人源化构建体分别包含该人框架1至3、鼠HVR及衍生自人JK4的人框架4序列，以及轻链及重链的JH4序列。在挑选一个特定的受体序列之前，可以决定供体抗体中所谓的规范环形结构。这些规范环形结构是由出现在所谓的规范位置的残基类型所决定。这些位置(部分)位于HVR区域外，且在最终构建体中应保持功能相等，以维持亲本(供体)抗体的HVR构象。在WO 2004/006955A1中，报告了将抗体人源化的方法，包含以下步骤：辨识非人成熟抗体的HVR的规范HVR结构类型；获取人抗体可变区的肽序列文库；决定文库中可变区的规范HVR结构类型；及选择在非人与人可变区内的对应位置中，规范HVR结构类型与该非人抗体的规范HVR结构类型相同的人序列。归纳上述，基于高的总体同源性和任选地另外已经在受体序列中的正确的规范残基的存在选择潜在的受体序列。在某些情况下，单纯嫁接HVR将导致仅部分保留非人抗体的结合特异性。已发现至少一些特定的非人框架残基对于重建结合特异性是需要的，且也必须嫁接入人框架中，即，在引入非人HVR外，必须做出所谓的“回复突变”(例如，见Queen等人,PNAS 86(1989),10029-10033)。这些特定的框架氨基酸残基参与FR-HVR相互作用，并稳定HVR的构象(环形)。在某些情况下，也会引入正向突变，以更接近采用人种系序列。因此，“根据本发明的抗体的人源化变体”(例如其是小鼠起源的)指下述的抗体，其以小鼠抗体序列为基础，并藉由如上所述的标准技术以人源化该抗体的VH及VL(包含嫁接HVR及任选地框架区域及HVR-H1、HVR-H2、HVR-L1或HVR-L2中的某些氨基酸的后续诱变，而HVR-H3及HVR-L3则维持未修饰)。
一般而言，用于从鼠或其他主要选择的mAB开发适用于治疗人患者的抗体的技术已被完善地建立(在Safdari等人2013中综述)。因此，本文公开的抗体可以经历这样的开发过程，以通过应用此类经验证的技术，特别是基于CDR嫁接的方法(诸如例如由Kim&HongMethods Mol Biol.2012；907:237-45或Whitelegg,N.&Rees,AR Antibody variableRegions:Towards a Unified modeling method.In:Methods in Molecular Biology,Biotechnology and Medicine,(Ed.Lo,B),2004；248:51-91.)中综述)，种系人源化或“超人源化”(例如在Pelat,T.等人,Mini Rev Med Chem.2009Dec；9(14):1633-8.)[PMID:20105119]中综述)和表面重建(如由Mader and Kunert等人,Prot.Eng.Des.Selec.2010,23,947-954所述)。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的每个下述区域，其是在序列上(“互补决定区”或“CDR”)高变的和/或形成结构上定义的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)。通常，抗体包含六个HVR：VH中的三个(H1，H2，H3)，和VL中的三个(L1，L2，L3)。本文公开了示例性HVR。
根据本发明，提供了下述抗HTT抗体，所述抗体包含重链可变域(VH)序列和/或轻链可变域(VL)序列，其具有与SEQ ID NO：60至65的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列包含取代(例如保守取代)，插入或缺失，但包含该序列的抗HTT抗体保留结合HTT，特别是给定的表位的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：60至65中已经取代，插入和/或缺失总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，取代，插入或缺失发生在HVR外部的区域中(即在FR中)。
根据本发明的抗HTT抗体的优选变体公开于图27中(即变体hPRR13-2至-16和hC6-17-2至-16)。因此，根据本发明，在H/L框架中具有氨基酸交换的抗HTT抗体是特别优选的。此外，这些变体的所有组合也是特别优选的。例如，对于PRR抗体的重链，存在1wt±3个突变，对于轻链，也存在1wt±3个突变。这提供了4×4个变体的可能组合空间，如图27的表中所列出的。对于mAB huC6-17，优选以下组合：轻链：1wt±1mut；重：1wt+7个突变，得到总共16个变体。
相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在对其序列并且在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后并且不认为任何保守取代是序列同一性的一部分，与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的候选序列中氨基酸残基的百分比。用于确定百分比氨基酸序列同一性的比对可以以本领域技术内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件或EMBOSS软件包中的“针(needle)”配对序列比对应用。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，对于本文的目的，使用EMBOSS软件包(可从欧洲分子生物学实验室公开获得；Rice等人，EMBOSS：the EuropeanMolecular Biology Open Software Suite，Trends Genet.2000Jun；16(6)：276-7，PMID：10827456)的计算机程序“针”的序列比对计算氨基酸序列同一性％的值。
针程序可以在网站http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/下访问或，从http://emboss.sourceforge.net/，作为EMBOSS包的一部分下载用于本地安装。它在许多广泛使用的UNIX操作系统上，如Linux上运行。
为了比对两种蛋白质序列，针程序优选用以下参数运行：
命令行：needle-auto-stdout-asequence SEQUENCE_FILE_A-bsequenceSEQUENCE_FILE_B-datafile EBLOSUM62-gapopen 10.0-gapextend 0.5-endopen 10.0-endextend 0.5-aformat3pair-sprotein1-sprotein2(Align_format:pair Report_file:stdout)。
给定氨基酸序列A对，与，或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可以备选地表述为具有或包含对，与，或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)计算如下：
分数X/Y的100倍
其中X是在该程序的A和B的比对中通过序列比对程序针评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的％氨基酸序列同一性将不等于B与A的％氨基酸序列同一性。除非另有特别说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值是使用ALIGN-2计算机程序如在紧接的前一段落中所描述的那样获得的。
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如US 4,816,567A；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855)。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠，大鼠，仓鼠，兔或非人灵长类动物如猴的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类别或亚类已经从亲本抗体的类别或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR，(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，衍生HVR残基的抗体)的相应残基取代，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。人源化抗体及其制备方法例如在WO2004/006955A1(通过规范结构的方法)中综述。
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。人抗体可以使用本领域已知的各种技术产生。人抗体可以通过对已经被修饰以响应于抗原攻击产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原来制备。这样的动物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其替代内源免疫球蛋白基因座，或者存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在这样的转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23(2005)1117-1125，描述了XENOMOUSETM技术的US 6,075,181和6,150,584；描述
Figure BDA0001241913620000231
技术的US 5,770,429A；描述K-M
Figure BDA0001241913620000233
技术的US 7,041,870A，和描述
Figure BDA0001241913620000232
技术的US 2007/0061900A1。来自这样的动物产生的完整抗体的人可变区可以进一步修饰，例如通过与不同的人恒定区组合。
人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也在Li等，PNAS 103(2006)3557-3562中描述。其它方法包括例如在US 7,189,826(描述由杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)或由Trioma技术制备的那些。还可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生人抗体。然后可将这种可变结构域序列与所需的人恒定结构域组合。下文描述了从抗体文库中选择人抗体的技术。
也可以通过对组合文库筛选根据本发明的抗体。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并对此类文库筛选具有所需结合特性的抗体。这样的方法进一步描述于例如Fellouse，PNAS(2004)12467-12472中。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的全集并随机重组在噬菌体文库中，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体。噬菌体通常展示作为单链Fv(scFv)片段或Fab片段的抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如从人)克隆未免疫
Figure BDA0001241913620000241
的全集以在不进行任何免疫的情况下提供针对广泛范围的非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源。最后，也可以通过从干细胞克隆非重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外完成重排，来合成性地制备天然文库。描述人抗体噬菌体文库的其它出版物包括例如：US 5,750,373A，US 2005/0079574A1，US 2005/0119455A1，US 2005/0266000A1，US 2007/0117126A1，US 2007/0160598A1，US 2007/0237764A1，US 2007/0292936A1和US 2009/0002360A1。从人抗体文库分离的抗体或抗体片段被认为是本文的人抗体或人抗体片段。
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一是针对HTT，并且另一个针对任何其他抗原。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位于表达HTT的细胞。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(WO 93/08829A，US 5,731,168A)。也可以如下制备多特异性抗体：工程化改造静电转向(electrostatic steering)效应以制备抗体Fc-异二聚体分子的(WO 2009/089004A)；交联两个或更多个抗体或片段(例如US 4,676,980A)；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体；使用用于制备双特异性抗体片段的“双抗体”技术(例如，Holliger等人，PNAS 90(1993)6444-6448)；以及使用单链Fv(sFv)二聚体；和制备三特异性抗体。本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体”(例如US 2006/0025576 A1)。本文中待使用的抗体或片段还包括包含结合HTT以及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用Fab”或“DAF”(例如参见US 2008/0069820A1)。本文的抗体或片段还包括在WO 2009/080251A,WO 2009/080252A,WO 2009/080253A,WO 2009/080254A,WO 2010/112193A,WO2010/115589A,WO 2010/136172A,WO 2010/145792A,和WO 2010/145793A中描述的多特异性抗体。
在某些实施方案中，考虑本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质。抗体的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。这样的修饰包括例如对抗体的氨基酸序列中的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失，插入和取代的任何组合以得到最终构建体，只要最终构建体具有所需的特征，例如抗原结合。
在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。取代诱变的目的位点包括HVR和FR。保守取代显示在下表中“优选取代”标题下。下面提供了关于氨基酸侧链类别的更实质性的改变。可以将氨基酸取代引入目标抗体，并筛选产物的所需活性，例如，保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
Figure BDA0001241913620000251
氨基酸可以根据共同的侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性：Asp，Glu；
(4)碱性：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族：Trp，Tyr，Phe。
非保守取代将需要将这些类别之一的成员交换为另一类别。一种类型的取代变体包括取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体具有某些生物学性质的修饰(例如，改善)(例如，增加的亲和力，降低的免疫原性)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学性质。示例性的取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以方便地例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(例如本文所述的那些)来产生。简言之，使一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体展示在噬菌体上并筛选特定的生物活性(例如结合亲和力)。可以在HVR中进行改变(例如，取代)，例如，以改善抗体亲和力。这种改变可在HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基，和/或SDR(a-CDR)中进行，其中测定所得变体VH或VL的结合亲和力。亲和力成熟通过构建二级文库和从二级文库重新选择实现。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR，链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种将多样性引入选择的用于成熟的可变基因。然后创建二级文库。然后筛选文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向的方法，其中几个HVR残基(例如，每次4-6个残基)被随机化。例如使用丙氨酸扫描诱变或建模，可以特异性鉴定参与抗原结合的HVR残基。特别地，通常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，取代，插入或缺失可发生在一个或多个HVR内，只要此类改变不显著降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中进行不显著降低结合亲和力的保守性改变(例如如本文提供的保守性取代)。这样的改变可以在HVR“热点”或SDR之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或含有不超过一个，两个或三个氨基酸取代。用于鉴定可靶向诱变的抗体的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在该方法中，鉴定残基或目标残基组(例如，带电荷的残基，如Arg，Asp，His，Lys和Glu)，并且用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多聚丙氨酸)替换以确定是否影响抗体与抗原的相互作用。可以在显示对初始取代的功能敏感性的氨基酸位置处引入进一步的取代。或者或另外，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴定抗体和抗原之间的接触点。此类接触残基和邻近残基可以作为取代的候选物来靶向或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的性质。氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基端和/或羧基端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N-或C-末端与酶(例如针对ADEPT)或增加抗体的血清半衰期的多肽融合。
亨廷顿蛋白的PRR(富含脯氨酸的区域)位点位于蛋白质的poly-Q序列附近。从文献中已知PRR区域与亨廷顿蛋白功能相关(Modregger等人2002)。源自靶向细胞内的亨廷顿蛋白的PRR区的重组scFv文库的胞内抗体显示通过选择性地增加突变形式的HTT蛋白的细胞内周转在亨廷顿氏病的动物模型中是有益的(Southwell等人，2011)。识别PRR区域侧翼的聚脯氨酸区段的单克隆抗体先前已经作为探针公布(由Ko等人2001公开的mABMW7)，然而由于由对于在人蛋白质组内的亨廷顿蛋白而言不独特的聚脯氨酸链组成的其表位的低复杂性，尚未考虑或不能证明在亨廷顿氏病中的治疗用途。更一般地，先前没有考虑抗体或疫苗对亨廷顿蛋白的主动或被动靶向，因为亨廷顿蛋白一直被认为是仅适用于细胞内靶向的细胞内靶物。与结合具有多于5个连续脯氨酸的表位的单克隆抗体MW7(Ko等人，2001)相反，来自本发明的mAB PRR13具有复合表位，并且特异性且选择性结合包含在p6773上的其核心表位，例如，如实施例5中证明。
根据本发明，特别优选在用于预防和/或治疗亨廷顿氏病的药物组合物中使用单克隆抗体。根据本发明，包含单克隆抗体的药物组合物可另外含有药学上可接受的载体或赋形剂。此外，包含本发明的单克隆抗体的药物组合物可另外含有治疗剂或可与治疗剂物理结合。这样的药物组合物也可以与佐剂，优选氢氧化铝一起配制。
在另一个实施方案中，本发明提供了单克隆抗体，其具有能够结合具有p7543(SEQID No.3)序列或优选C6-17核心表位的HTT蛋白的肽的结合结构域，例如如在实施例4中所测定的。在优选的实施方案中，所述单克隆抗体的特征在于是单克隆抗体(例如，优选C6-17)，其包含重链可变区CDR1，其包含GYTFTEYT(SEQ ID No.66)；重链可变区CDR2，其包含INPNNGGT(SEQ ID No.67)；重链可变区CDR3，其包含ASLDGRDY(SEQ ID No.68)；轻链可变区CDR1，其包含QSLLNSRTRKNY(SEQ ID No.69)；轻链可变区CDR2，其包含WAS(SEQ IDNo.7β)和包含KQSYNLLT(SEQ ID No.71)的轻链可变区，例如实施例5中所示。
根据本发明，胱天蛋白酶区域586指HTT蛋白上围绕亨廷顿蛋白的位置586上的先前定义的胱天蛋白酶切割位点的区域，其易于被胱天蛋白酶6和其他蛋白酶如胱天蛋白酶2、8或10切割(Wong等人2014)。该区域内蛋白酶切割的病原学作用先前由Graham等人2006确立，并且已经认为预防或减少所得的亨廷顿蛋白片段是有益的。在本发明中，证明衍生自该区域的特定肽可以有效地诱导具有与来自相同区域的邻近肽相比强得意料不到的对亨廷顿蛋白的可接近性的抗体，如实施例1和7所示。由这些肽产生的抗体能够掩蔽尚未鉴定的表位，从而防止蛋白酶切割。因此根据实施例7的胱天蛋白酶区域586衍生的切割抑制抗体也可以被定义为位点特异性蛋白酶切割抑制剂。
在另一个实施方案中，本发明提供单克隆抗体，其具有能够结合具有p7564(SEQID No.2)的序列或优选地M1D1的表位的HTT蛋白的肽的结合结构域肽，例如根据实施例5，图17，优选用于治疗亨廷顿氏病。在一个优选实施方案中，所述单克隆抗体的特征在于是单克隆抗体(例如，优选M1D1)，其包含含有GFTFNTYA(SEQ ID No.72)的重链可变区CDR1，含有IRSKSNNYAT(SEQ ID No.73)的重链可变区CDR2，包含VRHGEYGNPWFAY(SEQ ID No.74)的重链可变区CDR3，包含QSLVHSNGNTY(SEQ ID No.75)的轻链可变区CDR1，包含KVS(SEQ IDNo.76)的轻链可变区CDR2和包含SQSTHVPYT(SEQ ID No.77)的轻链可变区，例如实施例5中所述。
与源自在人蛋白质组内以高频率出现的肽583IVLD586的现有技术的单克隆和多克隆抗体(Warby等人，2008)相反，抗体M1D1识别由包含游离C-末端的天冬氨酸的亨廷顿蛋白衍生序列SSEIVLD组成的核心表位，所述天冬氨酸在人RefSeq蛋白数据库内是独特的，从而对胱天蛋白酶切割的亨廷顿蛋白提供高特异性，例如如实施例4，图12和实施例5，图17所示。与Warby等人的抗体相反，根据本发明的抗体更具特异性。它还具有与“IVLD”不同的核心表位(参见实施例1，图3)。这种更高的特异性还归因于“IVLD”(根据Warby)在人蛋白质组内出现超过几百次，而根据BLAST-RefSeq分析，M1D1表位仅出现一次。如给本发明提供的M1D1是具有独特CDR--同种型IgM的不同克隆。
根据优选的实施方案，根据本发明的抗体包含以下VH和VL氨基酸序列：
>C6-17VH共有氨基酸序列：
MGWSCIMLFLLSGTAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGINPNNGGTRYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCASLDGRDYWGQGTTLTVSSAKTTAPSVFPLA(SEQ ID No.60)
>C6-17VL共有氨基酸序列：
MVLMLLLLWVSGTCGDIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYSCKQSYNLLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPK(SEQ ID No.61)
根据优选的实施方案，根据本发明的抗体包含以下VH和VL氨基酸序列：
>PRR13VH共有氨基酸序列：
MGWSWVMLFLLSGTGGVLSEVQLQQSAPELVKPGASVKMSCKASGYSFTDFYMKWVKQSHGKGLEWIGDIDPKNGDTFYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMQLNSLTTEDSAVYYCATYYGYTMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYF(SEQ ID No.62)
>PRR13VL共有氨基酸序列：
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGQIVLTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVTSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYRRPPRTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPR(SEQ ID No.63)
根据优选的实施方案，根据本发明的抗体包含以下VH和VL氨基酸序列：
>M1D1VH共有氨基酸序列：
MDFGLSWVFFVVFYQGVHCEVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGEYGNPWFAYWGQGTLVTVSAESQSFPNVFPL(SEQ ID No.64)
>M1D1VL共有氨基酸序列：
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPK(SEQ ID No.65).
根据优选的实施方案，根据本发明的抗体是人源化抗体，特别是包含以下VH和VL氨基酸序列的抗体：
>hPRR13VL(重链可变区)：
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCTASSSVTSSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCHQYRRPPRTFGGGTKLEIKR(SEQ ID No.95)
>hPRR13VH(重链可变区):
EVQLVESGPEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDFYMKWVQQAPGRGLEWMGDIDPKNGDTFYNQKFKGRVTMTADTSTGTAYMQLSSLTSEDTAVYFCASYYGYTMDYWGQGTTVTVAS(SEQ ID No.96)
>hC6-17VL(轻链可变区):
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLLTFGGGTKLEIK(SEQ ID No.97)
>hC6-17VH(重链可变区):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYTMHWVRQAPGRGLEWMGGINPNNGGTRYNQKFKGRVTMTRDTSIRTAYVELSRLTSDDTAVYYCASLDGRDYWGQGTLVTVSS](SEQ ID No.98)。
根据本发明的抗体还可以提供为抗体药物缀合物(即与提供活性的分子偶联，例如所述分子增强mAB的吞噬性质)，例如适合于提供改善的调理吞噬活性，诸如例如通过糖基化修饰或其它修饰等。因此，如本文所用，术语“抗体”是指对HTT，特别是HTT的特定表位(或其天然存在的片段)特异性的抗体。本发明还涉及对HTT或本文公开的HTT表位具有结合能力的HTT结合蛋白，例如涉及支架抗原结合蛋白。支架抗原结合蛋白是本领域已知的，例如，纤连蛋白和设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)已经用作用于抗原结合结构域的替代支架。在一个实施方案中，支架HTT结合蛋白选自CTLA-4(Evibody)；脂笼蛋白；蛋白A衍生的分子，如蛋白A的Z-结构域(Affibody，SpA)，A-结构域(Avimer/Maxibody)；热休克蛋白，如GroEI和GroES；转铁蛋白(trans-body)；锚蛋白重复蛋白(DARPin)；肽适体；C型凝集素结构域(Tetranectin)；人γ-晶体蛋白和人泛素(affilins)；PDZ结构域；人类蛋白酶抑制剂的全蝎毒素kunitz型结构域；和纤连蛋白(adnectin)；其已经经历蛋白质工程化以获得与除天然配体之外的配体的结合。
根据本发明的抗体可以以任何合适的剂量施用，所述剂量从其它mAB剂量方案已知或针对给定个体具体评价和优化。例如，根据本发明的mAB可以作为剂型提供(或作为剂量应用)，其量为1mg至10g，优选50mg至2g，特别是100mg至1g。通常的剂量也可以基于患者的kg体重来确定，例如优选的剂量的范围是0.1mg至100mg/kg体重，特别是1至10mg/体重(每个施用期)。
特别优选的双特异性抗体包含结合区，针对多于一个HTT表位，特别是两个，如本文定义的PRR-和胱天蛋白酶区域586结构域。
在另一方面，本发明提供了用作药物筛选的探针的单克隆抗体，其基于切割的与未切割的亨廷顿蛋白或其衍生的片段或肽的检测。原则上，与p7605(分别如实施例5图16和17所示)相反，M1D1能够检测肽p7564，从而提供用于定量在亨廷顿蛋白的该区域的相关天冬氨酸位点586处的蛋白酶活性的手段(means)。
特别优选使用如本发明所公开的mAB M1D1作为药物筛选的探针，从而允许差异检测切割的与未切割的HTT。基于根据本发明并例如在实施例10中提供的胱天蛋白酶6切割测定，有可能筛选AB或其他抑制性分子，其特异性结合亨廷顿蛋白的胱天蛋白酶区域586(如图18所例示)，并从而通常抑制蛋白酶接近该位点(即，在该位置(aa 586)周围的蛋白酶接近，即针对该位点(而不是HTT蛋白的其他位点)的蛋白酶。在该测定中，M1D1用作探针，以区分亨廷顿蛋白及其片段，其在天冬氨酸(位置586)处被酶促切割或被如所例示的切割抑制剂保护以免受切割。例如，在根据本发明实施例的胱天蛋白酶切割抑制测定中，C6-17(和几种多克隆抗体-如图19所示)是原型抑制剂。在这种测定或筛选方法中使用C6-17(或其衍生物，特别是细胞内衍生物)的功能抑制活性是本发明的主题。例如，在胱天蛋白酶6抑制剂筛选中，M1D1可以是探针，且C6-17可以是原型抑制剂。
特别优选使用mAB C6-17作为原型抑制剂用于在亨廷顿蛋白的该区域中的胱天蛋白酶切割的抑制，即作为阳性对照抑制剂用于如实施例7中所示的抑制剂筛选测定的基准标记目的或作为以抗体衍生的形式衍生化切割抑制剂的基础，所述切割抑制剂对亨廷顿蛋白的胱天蛋白酶切割586区域是特异性的，例如如实施例7所示。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于体外诊断哺乳动物中的亨廷顿氏病的方法，其包括以下步骤：使用根据本发明的抗体特别是抗体PRR13，M1D1和C6-17，测定哺乳动物样品中游离的，聚集的，复合的或片段化的HTT的水平，以便诊断亨廷顿氏病，监测疾病进展或以其他方式使用HTT作为生物标志物(如果所述样品中的HTT或经酶促切割的HTT水平与健康者或在遗传学上未受亨廷顿氏病影响的个体的参考样品相比升高)。在本发明的过程中，显示亨廷顿氏病的病理学也与血浆，其他体液和组织材料中存在的HTT的(低)量相关。证明使用根据本发明的抗体测量这样的(低)HTT水平改变是可能的，但是当然在本发明公开HTT水平的变化与疾病和疾病状态相关之后，对于其他技术也能实现。
因此，本发明提供了一种体外诊断哺乳动物中的亨廷顿氏病的方法，其包括以下步骤：
-使用单独或组合的抗体PRR13，M1D1或C6-17测定哺乳动物样品中野生型或突变的亨廷顿蛋白或其片段的水平；
-如果所述样品中的wt或突变的亨廷顿蛋白的水平与遗传上未受亨廷顿氏病影响的健康个体的参考样品相比升高，则诊断亨廷顿氏病；
-和任选地监测亨廷顿蛋白降低治疗策略在预明显(pre-manifest)或明显亨廷顿氏病患者样品中的效果，其中所述治疗策略优选选自主动或被动疫苗接种，尤其是在Huntington降低疗法的过程中。。
根据本发明，样品中突变HTT水平的测定涉及优先地基于免疫沉淀或基于捕获的测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)，酶联免疫测定(EIA)，在其它表面和载体例如树脂和珠上的免疫沉淀，质谱，基于荧光共振能量转移(FRET)的测定，western印迹或免疫组织化学和基于免疫荧光的分析，例如基于FRET的测定或合适的成像方法(例如PET，SPECT)和流式细胞术或本领域技术人员已知的任何其它技术。；除了根据本发明的mAb之外，也可以将其它HTT抗体(例如在现有技术中已经报道的那些)可以整合到这样的诊断测定中。
根据本发明，样品优选获自脑脊液(CSF)，血液，血浆，血清，尿液，唾液，汗液或泪液，或其它体液或组织和细胞提取物，特别是脑组织，肌肉组织和血液衍生的细胞，其中(突变体)亨廷顿蛋白的表达和结构是变化的。
根据本发明，哺乳动物优选是人。
此外，本发明提供了一种在哺乳动物中在体外确定亨廷顿氏病的阶段或新的亨廷顿蛋白靶向治疗(例如代表主动或被动疫苗接种方法)的作用的方法，其包括以下步骤：
-使用单独或组合的抗体PRR13，M1D1或C6-17在哺乳动物的样品中测定野生型或突变亨廷顿蛋白或其片段的水平(这些抗体可单独或组合用于捕获和检测亨廷顿蛋白或其片段，随后通过生化手段，质谱或其他分析方法检测)；和
-确定亨廷顿氏病的阶段。
这种测定通过给定患者中的HTT水平也是有可能的：这可以通过比较给定患者随着时间的HTT水平(的变化)(相同个体中的相对测定)来监测疾病的发展，而且还用于疾病阶段的初始诊断(与具有已知疾病状态的患者群组相关的绝对测定)。“HTT水平的变化”至少在较长治疗运行中将是HTT水平降低，从而例如根据本发明治疗的患者中的血浆HTT水平将下降(如例如图9所示)。然而，也可能的是，在一些患者中或在疾病的某个阶段，在治疗开始时可能发生HTT水平的升高。然而，这也指示成功的治疗，因为例如，抗体可以反常地稳定血浆中的蛋白质，但同时它阻断其病理活性。在这种情况下，可以观察到靶向的血浆HTT的反常的初始增加，尽管已经施用针对HTT的AB。这种现象是例如，见于在抗IgE治疗后反常的IgE增加。另一个实例是针对生长激素的抗体，其由于稳定化而导致出于意料的增加或其生长促进作用。
另外，本发明提供了在哺乳动物中监测亨廷顿氏病的进展或监测亨廷顿氏病治疗有效性的方法，其包括以下步骤：
-使用根据本发明的PRR13，M1D1和C6-17测定哺乳动物样品中突变的HTT的水平，和
-通过将突变HTT的获得水平与第一次测量突变HTT水平中(优选在诊断疾病相关的症状时的测量中)获得的突变HTT水平进行比较，确定亨廷顿氏病的进展或亨廷顿氏病的治疗有效性，其中HTT水平的改变(所述“改变”通常是HTT水平的降低，至少在较长的运行中，如上文解释)指示成功的治疗，并且优选用于预后目的和调节治疗。
再一次，此方法由本发明实现，因为在本发明中已经首次显示了抗HTT疫苗的有效性。在这些体外分期/监测方法中，除了根据本发明的mAb之外，还将其他HTT抗体(例如现有技术中已经报道的那些)可以整合到这样的测定中。
在根据本发明的这些方法中，区分“健康”和“病理”HTT(即“野生型”或“突变的”HTT)不是关键的。这意味着不能区分这两种形式(但结合两种形式)的抗体可用于测定HTT水平，并且在这些方法中通常是优选的。
在另一个实施方案中，本发明提供了亨廷顿蛋白的胱天蛋白酶区域586或另一个HTT区的至少一种免疫原性肽用于制备用于预防或治疗亨廷顿氏病的药物的用途，所述肽选自：p6773(LPQPPPQAQPLLPQPQPC,SEQ ID No.1),p7564(CPSDSSEIVLD,SEQ ID No.2),p7543(GTDNQYLGLQIGC,SEQ ID No.3),p7543a(DNQYLGLQIC；SEQ ID No.88),尤其衍生物p9394(KTDNQYLGLQIGKC；SEQ ID No.91),p9395(GTDNQYLGLQIGKKC；SEQ ID No.92),p9396(KTDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.93),p9397(KDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.94)；p7543b(TDNQYLGLQIC；SEQ ID No.89),p7543c(TDNQYLGLQIGC；SEQ ID No.90),p6771(LPQPPPQAQPLLPC,SEQ ID No.4),p8346(CGPAVAEEPLHRP,SEQ ID No.5),p8855(SDSSEIVLDGTDC,SEQ ID No.6),p8858(EIVLDGTDNQYLC,SEQ ID No.7),p8859(IVLDGTDNQYLGC,SEQ ID No.8),p8860(VLDGTDNQYLGLC,SEQ ID No.9),p8861(LDGTDNQYLGLQC,SEQ ID No.10),p8862(DGTDNQYLGLQIGC,SEQ ID No.11),p8869(CTDNQYLGLQIGQ,SEQ ID No.12),p8868(CGTDNQYLGLQIG,SEQ ID No.13),p8870(CDNQYLGLQIGQP,SEQ ID No.14),p8871(CNQYLGLQIGQPQ,SEQ ID No.15),p6772(CPQLPQPPPQAQPLLP,SEQ ID No.16),p8864(TDNQYLGLQIGQC,SEQ ID No.17),p8865(DNQYLGLQIGQPC,SEQ ID No.18),p6775(PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC,SEQ ID No.19),p8854(PSDSSEIVLDGTC,SEQ ID No.20),p8856(DSSEIVLDGTDNC,SEQ ID No.21),p8857(SEIVLDGTDNQYC,SEQ ID No.22),p8866(NQYLGLQIGQPQC,SEQ ID No.23),p8867(QYLGLQIGQPQDC,SEQ ID No.24),p6763(CaMATLEKLMKAFESLKSFQ,SEQ ID No.25),p6764(CaKLMKAFESLKSFQ,SEQ ID No.26),p6765(CEEQQRQQQQQQQ,SEQ ID No.27),p6768(QQQQQQPPPPPPPPaKKKC,SEQ ID No.28),p7541(CSEIVLD,SEQ ID No.29),p7552(CSSEIVLD,SEQ ID No.30),p7562(CDSSEIVLD,SEQ ID No.31),p7563(CSDSSEIVLD,SEQ IDNo.32),p7567(CEIVLD,SEQ ID No.33),p7568(CIVLD,SEQ ID No.34),p7605(CSEIVL,SEQID No.35),p6776(CSEIVLDGTDNQYL,SEQ ID No.36),p6777(CSDSSEIVLDGTDN,SEQ IDNo.37),p6776b(SEIVLDGTDNQYLC,SEQ ID No.38),p7752(CAEIVLDGTDNQYL,SEQ IDNo.39),p7753(CSAIVLDGTDNQYL,SEQ ID No.40),p7754(CSEAVLDGTDNQYL,SEQ ID No.41),p7755(CSEIALDGTDNQYL,SEQ ID No.42),p7756(CSEIVADGTDNQYL,SEQ ID No.43),p7757(CSEIVLAGTDNQYL,SEQ ID No.44),p7758(CSEIVLDATDNQYL,SEQ ID No.45),p7745(CSEIVLDGADNQYL,SEQ ID No.46),p7746(CSEIVLDGTANQYL,SEQ ID No.47),p7747(CSEIVLDGTDAQYL,SEQ ID No.48),p7748(CSEIVLDGTDNAYL,SEQ ID No.49),p7749(CSEIVLDGTDNQAL,SEQ ID No.50),p7750(CSEIVLDGTDNQYA,SEQ ID No.51),优选地p6773(LPQPPPQAQPLLPQPQPC,SEQ ID No.1),p7564(CPSDSSEIVLD,SEQ ID No.2),p7543(GTDNQYLGLQIGC,SEQ ID No.3),p6771(LPQPPPQAQPLLPC,SEQ ID No.4),p8346(CGPAVAEEPLHRP,SEQ ID No.5),p6776(CSEIVLDGTDNQYL,SEQ ID No.36),p6777(CSDSSEIVLDGTDN,SEQ ID No.37),p8855(SDSSEIVLDGTDC,SEQ ID No.6),p8858(EIVLDGTDNQYLC,SEQ ID No.7),p8859(IVLDGTDNQYLGC,SEQ ID No.8),p8860(VLDGTDNQYLGLC,SEQ ID No.9),p8861(LDGTDNQYLGLQC,SEQ ID No.10),p8862(DGTDNQYLGLQIGC,SEQ ID No.11),p8869(CTDNQYLGLQIGQ,SEQ ID No.12),p8868(CGTDNQYLGLQIG,SEQ ID No.13),p8870(CDNQYLGLQIGQP,SEQ ID No.14),p8871(CNQYLGLQIGQPQ,SEQ ID No.15),p6772(CPQLPQPPPQAQPLLP,SEQ ID No.16),p8864(TDNQYLGLQIGQC,SEQ ID No.17),p8865(DNQYLGLQIGQPC,SEQ ID No.18),p6775(PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC,SEQ ID No.19),p8854(PSDSSEIVLDGTC,SEQ ID No.20),p8856(DSSEIVLDGTDNC,SEQ ID No.21),p8857(SEIVLDGTDNQYC,SEQ ID No.22),p8866(NQYLGLQIGQPQC,SEQ ID No.23),和p8867(QYLGLQIGQPQDC,SEQ ID No.24),尤其p6773(LPQPPPQAQPLLPQPQPC,SEQ ID No.1),p7564(CPSDSSEIVLD,SEQ ID No.2),p7543(GTDNQYLGLQIGC,SEQ ID No.3),p6771(LPQPPPQAQPLLPC,SEQ ID No.4),p6776(CSEIVLDGTDNQYL,SEQ ID No.36),p6777(CSDSSEIVLDGTDN,SEQ ID No.37),和p8346(CGPAVAEEPLHRP,SEQ ID No.5)。
优选地，这些肽是长至少7个氨基酸，优选的长度可以高达16个，优选高达14或20个氨基酸残基(例如7或8至20，7或8至16等)。因此，本发明的肽包含7至30个，优选7至20个，更优选7至16个，最优选8个氨基酸残基。根据本发明，然而，更长的肽也可以非常好地用作抗HTT-抗体诱导抗原。
在优选的实施方案中，本发明涉及用于预防和/或治疗亨廷顿氏病的基于肽的疫苗，其包含至少一种如上所定义的亨廷顿蛋白的胱天蛋白酶区域586的免疫原性肽。
免疫原性肽可以以分离的(肽)形式提供在疫苗中，或者可以偶联或复合(共价或非共价)至其它分子如药物载体物质或多肽，脂质或碳水化合物结构，特别是肽接头或蛋白质载体。此外，肽接头或蛋白质载体可以由T辅助细胞表位组成或包含T辅助细胞表位。
在另一方面，本发明涉及如上所指定的亨廷顿蛋白的胱天蛋白酶区域586的免疫原性肽，其中所述肽用于产生或鉴定特异性亨廷顿蛋白胱天蛋白酶区域586-切割抑制剂，例如如实施例7所示的。根据本发明，此种特异性亨廷顿蛋白胱天蛋白酶区域586-切割抑制剂被限定为抗体和抗血清及其衍生结构，例如scFv，Fab，Fd，Fab’，F(ab’)2，scFAB，胞内抗体或Fv或任何其他形式，特别是本文公开的任何优选形式。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，通过用上述指定的基于肽的疫苗免疫产生靶向亨廷顿蛋白(HITT)的胱天蛋白酶区域586的抗体或抗原结合分子，所述疫苗包含如上指定的亨廷顿蛋白的胱天蛋白酶区域586的至少一种免疫原性肽或组合，例如如实施例2和3所证明的。
根据本发明，这样的抗体或抗原结合分子优先用于药理学组合物，其用于预防和/或治疗亨廷顿氏病。
本发明通过以下实施例和附图进一步公开，但不限于此。
附图简述
图1显示与亨廷顿蛋白的免疫原性较低的N末端和poly-Q区域相比源自人亨廷顿蛋白的PRR区和胱天蛋白酶区586(分别指示为PRR和C6)的候选肽的通过ELISA进行的免疫滴度分析。
图2显示通过蛋白质捕获ELISA筛选来自候选肽疫苗的小鼠免疫血清，所述候选肽疫苗源自人亨廷顿蛋白的PRR和胱天蛋白酶区域586，所述ELISA筛选针对重组的610个氨基酸N-末端亨廷顿蛋白片段，其从显示结合和特异性的瞬时转染的HEK细胞的提取物捕获。
图3显示针对免疫肽p6776产生的单独免疫血清提供了针对免疫肽的可比的抗肽ELISA滴度(指示为logEC50)。
图4显示相反，与图3相同的免疫血清，根据蛋白质捕获ELISA(OD；抗recHTT610)测量显示抗重组亨廷顿蛋白信号的差异，从而证明免疫应答的个体变化，即使使用相同的免疫原。对于可能的治疗应用，抗recHTT610信号强度和特异性比抗肽滴度更相关。
图5显示当与经KLH-载体或PBS处理的R6/1小鼠或经KLH-载体处理的野生型小鼠相比时，经肽疫苗(p6771，p6773)处理的R6/1小鼠中亨廷顿蛋白信号(EM48)无变化(数字指示使用亨廷顿蛋白特异性mAB EM48校正的光密度[COD]；误差条＝标准偏差；n＝10)。
图6显示与来自图5的结果相反，当与经KLH处理的R6/1小鼠相比时，含有突变的人HTT(由EM48标记)的突触囊泡蛋白标记的突触(使用mABSY38)的数量在经肽疫苗处理的R6/1小鼠(p6771，p6773)中显著减少(p＝0,001)，表明疫苗肽治疗的有益效果。
图7显示当与用KLH或PBS处理的对照组相比时，使用神经元特异性标记物NeuN，R6/1小鼠在用肽疫苗处理的组(p6771，p6773)中展示基底神经节中的显著的神经保护作用。
图8显示当分别与KLH和PBS对照相比时，基底神经节的GFAP染色在用肽疫苗处理的R6/1动物(p6771，p6773)中显示星形胶质细胞活化的非显著减少。
图9分别显示在单一疫苗，组合疫苗或载体对照(KLH)处理后12个月时，在wt和YAC128转基因动物中通过FRET分析进行的血清亨廷顿蛋白的测定。
图10显示在经处理的YAC128小鼠和对照YAC128小鼠中的旋转杆(rotarod)测试，测量下落的等待时间(latency to fall)(以秒表示为平均值；n＝25只动物/组)，在用如指定的各种单一和组合肽疫苗处理的转基因YAC128小鼠中，在4、6、8、10和12个月进行(指示为“平均M4”-“平均M12”)。
图11显示了通过肽ELISA进行的丙氨酸取代扫描测定的5种p6776疫苗诱导的免疫血清的核心表位，所述肽ELISA使用指示的含有单氨基酸丙氨酸取代的肽进行。
图12显示mAB M1D1特异性识别在C-末端具有游离天冬氨酸586的重组亨廷顿蛋白片段，强于recHTT610。
图13显示当通过肽ELISA测试时，来自源自用肽p6773免疫的小鼠的杂交瘤的上清液在9个预筛选的候选克隆中的7个中提供免疫肽的强识别。
图14显示当通过recHTT610捕获ELISA测试时，图13中所示的9个候选mAB中仅有2个，即PRR13和PRR18，特异性识别重组亨廷顿蛋白。
图15显示源自用肽p7543免疫的小鼠的4种预选择的抗亨廷顿蛋白mAB的特异性分析。
图16显示通过肽ELISA测定针对“切割的”肽p7564的特异性筛选预选的mAB。
图17显示mAB M1D1识别来自至少7AA长度的含有游离C末端天冬氨酸的胱天蛋白酶区域586的亨廷顿蛋白肽。
图18显示了体外胱天蛋白酶6切割抑制测定，其为了筛选跨越胱天蛋白酶区域586的亨廷顿蛋白序列特异性蛋白酶抑制剂的目的。
图19显示了18种多克隆血清和作为参考的mAB C6-17的体外胱天蛋白酶6切割抑制测定，其为了筛选最有效的胱天蛋白酶位点抑制剂的目的。
图20显示体外吞噬测定，其显示识别人亨廷顿蛋白的PRR和胱天蛋白酶切割586区分别衍生的单克隆抗体PRR13和C6-17的吞噬活性。
图21-26显示了根据本发明的肽的经修饰形式的性能。
图27-29显示了抗体免疫的实例。
实施例
实施例1：-鉴定靶向亨廷顿蛋白N末端的候选疫苗肽。
疫苗和动物免疫
使用GMBS作为胺-巯基交联剂(Thermo/Pierce，CatNr.22309)，根据用于经由半胱氨酸(Cystein)的肽偶联的标准推荐程序，将疫苗肽偶联至KLH载体。缀合的肽与氢氧化铝凝胶佐剂(1μg/ml终浓度；Alhydrogel；Brenntag，CatNr.21645-51-2)一起配制，每次注射使用在200μl体积中的30μg偶联肽。使用上述制剂通常在雌性BALB/c小鼠(通常每组5只小鼠，10周龄)中进行免疫。仅用未缀合的KLH和/或PBS和佐剂免疫对照组。动物以2周的定期间隔疫苗接种3-6次，并且在每次加强前一天和最后取血时收集血浆或血清。
肽ELISA
通过ELISA使用肝素作为抗凝血剂来测定小鼠中疫苗诱导的免疫应答。ELISA板(Nunc Maxisorb)用作为载体的马来酰亚胺活化的BSA包被，所述载体通过稳定的硫醚键与含有半胱氨酸的肽偶联。对于滴定，加入血浆稀释液，并且通过作为检测抗体的生物素化的抗小鼠IgG(Southern Biotech，CatNr.1034-08)，组合链霉亲合素-POD(Roche，CatNr.1089153)和使用ABTS进行的随后的颜色反应定量肽特异性抗体。使用GraphPadPrism(GraphPad Software)，使用具有4参数逻辑(logistic)的曲线拟合来确定EC 50值。
产生含有N-末端亨廷顿蛋白片段recHTT610的细胞提取物
合成覆盖通过两个C端V5标签延伸的人亨廷顿蛋白的N-末端610个氨基酸的编码区的DNA，并通过XbaI和BamHI限制性位点克隆到真核表达载体pCDH-EF1-MCS IRES Puro(SBI；CatNr.CD532A1)中，产生质粒precHTT610。基本上按照制造商指示根据标准分子生物学程序进行克隆程序，包括限制性消化和连接反应(NEB Quick连接酶试剂盒；CatNr.M2200L)，细菌转化，随后进行克隆选择和分析。使用标准DNA纯化试剂盒(Quiagen；CatNr.27106)从琼脂糖凝胶中进行DNA片段制备。使用MAXreagent(Invitrogen；CatNr.16447-100)和Optimem(Gibco；CatNr.31985)，将HEK293freestyle细胞(Invitrogen；CatNr.R790-07)培养在如制造商指示的培养基中并用precHTT610(或作为对照的空载体)瞬时转染。在转染后24-48小时，通过用NP-40提取缓冲液(150mM NaCl，1％NP-40,50mM Tris pH8)进行细胞裂解获得HEK细胞裂解物，等分取样并保存在-80℃。使用Qubit(Invitrogen；CatNr.Q32866)根据制造商的说明书测定蛋白质浓度。
通过蛋白质捕获ELISA检测亨廷顿蛋白
如下通过标准蛋白质捕获ELISA程序测定抗体与N-末端片段HTT610的结合：使用包被有50μl 1:5000兔抗V5mAB(Sigma，CatNr.V8137)的MaxisorbTM ELISA板(Thermo；CatNr.439454)，用封闭缓冲液(PBS，1％BSA，0.1％Tween 20)封闭，从HEK细胞提取物中捕获重组亨廷顿蛋白(100ng/μl总蛋白)，然后与几种小鼠抗HTT血清稀释物(1:100；1:300和1:900)或与作为参考的mAB2166(稀释1:2000；Millipore，Cat Nr.MAB2166)在室温下温育1小时。根据标准程序进行ELISA温育，洗涤和检测程序。
从血浆亲和纯化抗体
根据制造商的方案，将碘乙酰活化的磁珠(BcMagTM；Bioclone CatNr.FG-102)与含半胱氨酸的肽缀合。在室温下用血浆/mAB温育2小时后，用高盐缓冲液(PBS，0.2％TritonX-100，补充至350mM的最终NaCl浓度)洗涤珠子，通过酸洗脱回收结合的抗体(用100mM甘氨酸；pH 2,8进行4个洗脱步骤)。在用终浓度为75mM HEPES pH8中和后，使用Spin-X UF500管(Corning，CatNr.CLS431478)将抗体浓缩至100μl的体积，如针对蛋白质提取物所述测量蛋白质浓度。
结果：
来自经亨廷顿蛋白肽疫苗接种的的小鼠的免疫血清显示，从亨廷顿蛋白的富含聚脯氨酸的区域(PRR)和胱天蛋白酶区域586(C6)衍生的肽通常比分别从蛋白质的聚谷氨酰胺(polyQ)或N末端区域(包括前17个氨基酸)衍生的相当的肽疫苗提供在肽ELISA分析中的更高滴度(图1)。当通过蛋白质ELISA(图2)分析时，PRR衍生的和胱天蛋白酶区域586衍生的免疫血清随免疫肽的肽序列在抗亨廷顿蛋白信号强度上(图4)和蛋白质的特异性(图2)上显示差异，允许特异性和免疫原性疫苗肽候选物的限定。肽p7564诱导特异性识别含有在C末端天门冬氨酸的亨廷顿蛋白序列的免疫血清(图3)，从而提供用于解决通过胱天蛋白酶在位置586处切割亨廷顿蛋白产生的疾病特异性亨廷顿蛋白新表位的手段。图1：通过ELISA进行的免疫滴度分析揭示了从人亨廷顿蛋白的PRR区域和胱天蛋白酶586区域(分别指示为PRR和C6)衍生的候选肽，在经肽疫苗免疫的小鼠中在平均上提供高于1：10000的滴度，这与用聚谷氨酰胺区域衍生的或N-末端衍生的肽(分别表示为polyQ和NTER)相反，其中平均滴度低于1：10000。滴度表示为来自5个个体血清的平均EC 50；误差棒显示标准偏差。
图2：通过蛋白质捕获ELISA针对从瞬时转染的HEK细胞的提取物捕获的重组610个氨基酸的N-末端亨廷顿蛋白片段筛选来自源自人亨廷顿蛋白的PRR和胱天蛋白酶区域586的候选肽疫苗的小鼠免疫血清。尽管如肽ELISA中看到，同质的抗肽信号分布(图1所示)，抗亨廷顿蛋白(“recHTT610”)和背景信号(“CTRL”)在不同肽之间不同。条表示以1:100的血清稀释度，分别针对重组亨廷顿蛋白(OD[recHTT610提取物]；浅灰色柱)或对照提取物(OD[假转染的对照提取物]；深灰色柱)测试的5个合并的免疫血清的信号。
图3：针对免疫肽p6776产生的个体免疫血清提供了相当的针对免疫肽的抗肽ELISA滴度(指示为logEC50)。
图4：与抗肽滴度(图3所示)相反，如通过蛋白质捕获ELISA(OD；抗recHTT610)测量，相同的免疫血清显示抗重组亨廷顿蛋白信号中的差异，从而证明就靶蛋白而非肽而言免疫应答的个体变化。这强调了对于治疗性疫苗肽的选择，抗重组HTT信号比抗肽滴度更相关。
实施例2：过表达突变型人亨廷顿蛋白的第一外显子的转基因R6/1小鼠的肽免疫提供了由基底神经节中的神经病理标志物反映的有益变化。
在相对强的启动子下表达人突变亨廷顿蛋白外显子1的R6/1小鼠(参见Bard等人2014和其中的引文)在第8、10、14和24周时进行如实施例1配制的疫苗注射。为了监测滴度，在第8、16、28和32周收集血浆。
免疫组织化学
通过免疫组织化学进行的分析基本上如Mandler等人，2014[PMID：24525765]所述进行，使用用于标志物蛋白质检测基底神经节的抗体EM48，SY38，GFAP和NeuN(分别为Millipore，CatNr.MAB5374，MAB5258，AB5804和MAB377)。
结果：
用肽疫苗免疫的6个月龄的转基因R6/1小鼠进行基底神经节的免疫组织化学分析，所述小鼠过表达突变型人亨廷顿蛋白的第一外显子。通过用肽p6771和p6773免疫的组与对照组(KLH，PBS)的组织病理学比较来比较肽疫苗接种的效果。在用PRR衍生的疫苗进行疫苗接种后观察到突触中的明显的神经保护和亨廷顿蛋白减少作用。
图5：当与经KLH-载体或PBS处理的R6/1小鼠或经KLH-载体处理的野生型小鼠(数字指示使用亨廷顿蛋白特异性mAB EM48校正的光密度[COD]；误差条＝标准偏差；n＝10))比较时，经肽疫苗(p6771，p6773)处理的R6/1小鼠中亨廷顿蛋白信号(EM48)无变化。
图6：相比之下，当与经KLH处理的R6/1小鼠相比时，含有突变的人HTT(由EM48标记)的经突触囊泡蛋白标记的突触(使用mAB SY38)的数目在用肽疫苗处理的R6/1小鼠(p6771，p6773)中显著减少(p＝0,001)(‘学生t检验；每个处理组n＝10只动物)。数字表示与EM48信号共定位的SY38阳性突触的比率(以％计)(误差条＝标准偏差；COD＝校正的光密度)。
图7：在与用KLH或PBS处理的对照组相比时，使用神经元特异性标记物NeuN，R6/1小鼠在肽疫苗处理组(p6771，p6773)中显示出在基底神经节中显著的神经保护作用(分别为p＝0.002和p＝0.01，学生t检验；n＝10)。Wt KLH＝野生型对照；数字表示校正光密度(COD)；误差棒＝标准偏差。
图8：基底神经节的GFAP染色显示当与KLH和PBS对照分别相比时，肽疫苗处理的R6/1动物(p6771，p6773)中星形胶质细胞活化的非显著性减少(COD＝校正的光密度；wtKLH＝野生型对照；误差条＝标准偏差)。
实施例3：组合疫苗处理导致YAC128转基因小鼠中血浆亨廷顿蛋白水平降低组合运动改善。
YAC128小鼠免疫
聚集了表达全长突变体人亨廷顿蛋白的YAC128小鼠(参见Bard等人2014和其中的引文)和WT对照同胞仔畜的5个分组，其由总共150个YAC128和总共25个WT组成。WT小鼠用KLH对照处理。将YAC128小鼠分成6个处理组，包括5个实验性肽处理和KLH对照组。小鼠在1、2、3、6和9个月龄时通过s.c.注射接受处理，如实施例1中。对于组合疫苗，通过组合每200μl体积剂量各15μg+15μg的两种肽来保持每剂量30μg的总肽量。
经疫苗处理的YAC128小鼠中血浆亨廷顿蛋白水平的测定
如先前Weiss等人2009[PMID：19664996]描述的，通过基于FRET(
Figure BDA0001241913620000431
共振能量转移)的检测测定法测定血浆亨廷顿蛋白水平，产生两种检测抗体之间的比率。
旋转杆测试
将2个月龄的YAC128小鼠在旋转杆(Ugo Basille)上以18转/分钟(RPM)的固定速度在连续3天里训练。小鼠每天接受3次120秒的训练试验，试验间隔(ITI)为1小时。为了试验的持续，立即更换从杆跌倒的小鼠。记录每次训练试验的第一次跌倒的等待时间和跌倒次数。对每只小鼠的3次试验的平均值进行评分。对于2-12个月龄的2个月间隔的纵向旋转杆测试，使用在300s内从5RPM至40RPM的加速程序。小鼠以1小时ITI接受3次试验，并且记录第一次下落的等待时间。对3个测试试验的平均值进行评分。
结果：
图9：在单个疫苗，组合疫苗或载体对照(KLH)处理后12个月，分别在wt和YAC128转基因动物中通过FRET分析进行血浆亨廷顿蛋白测定。使用来自PRR和胱天蛋白酶区域586区域的肽疫苗(分别为p6771和p7564&p7543)。当将血浆亨廷顿蛋白水平与载体对照处理(KLH)进行比较时，血浆亨廷顿蛋白的显著减少可通过使用肽组合p7543+p7564或p7543+p6771的组合处理来实现(分别为p<0,001和p<0,01；学生t检验；n＝每个处理组25只动物)。数字指示相对单位(FRET)；误差条表示标准偏差。
图10：在经处理的YAC128小鼠和对照YAC128小鼠中的旋转杆测试，测量下落的等待时间(latency to fall)(以秒表示为平均值；n＝25只动物/组)，在用如指定的各种单一和组合肽疫苗处理的转基因YAC128小鼠中，在4、6、8、10和12个月进行(指示为“平均M4”-“平均M12”)。值得注意的是，当与单一肽处理组p7543，p6771和7564相比时，组合疫苗组“p7543+7564”和“p7543+p6771”在该测试中显示总体上更好的表现。当与载体对照组相比，运动改善在组合疫苗组p7543+7564中在M4-M10上显著改善(分别为p<0,03、0,02、0,01；学生t检验，n＝25)。该发现与如图9所述的血浆亨廷顿蛋白降低平行。
实施例4：通过用肽p6773，p7564和p7543免疫获得的单克隆和多克隆抗体的表位作图(mapping)
核心表位的确定
通过如实施例1解释的ELISA或者备选通过应用如Stadler等人，2008描述的肽微阵列测定滴度值(OD[EC50])，通过丙氨酸取代扫描或用肽微阵列进行的单氨基酸取代扫描进行肽表位作图。简而言之，将肽的每个位置包含单个丙氨酸取代的肽点样在阵列上，并且通过荧光标记的二抗结合LI-COR Biosciences的Odyssey成像系统测定由于单个位置处的取代导致的信号的丢失。这允许评估肽的每个单独的氨基酸对表位的贡献。使用该方法，将待作图的原始免疫肽加上每个单独位置的单一丙氨酸取代的变体或肽点样到微阵列上，并通过待测试的相应的单克隆抗体或免疫血清杂交。当来自丙氨酸取代肽的所得信号减少至来自原始免疫肽的信号的小于70％时，相应的丙氨酸取代的氨基酸位置被定义为核心表位的一部分。以下从个体血清或mAB提供所得核心表位序列。
结果：
多克隆，亲和纯化的抗体和单克隆抗体源自用PRR区衍生肽(包括p6771和p6773)和胱天蛋白酶区586衍生肽(包括p7543和p6776)免疫的单个小鼠。使用丙氨酸扫描定位表位。简而言之，通过使用肽微阵列或常规肽ELISA(如图11中例示)通过针对对于每个位置具有单个氨基酸取代的肽的抗体，来测定个体血清和单克隆抗体的表位。
如通过单氨基酸取代测定，PRR区衍生肽p6771和p6773的肽和表位比对：
LPQPPPQAQPLLPC......免疫肽p6771
LPQPPPQAQPLLPQPQPC..免疫肽p6773
..........LLPQP.....对mABPRR13定位的表位
....PPQAQPL.........对多克隆p6773血清1定位的表位
....PPQAQP..........对多克隆p6773血清2定位的表位
........QPLL........对多克隆p6773血清3定位的表位
.....PQAQPLL........对多克隆p6773血清4定位的表位
(SEQ ID Nos.1，4和77-81)
通过单氨基酸取代扫描测定的p7543疫苗诱导的多克隆免疫血清和mAB C6-17的肽和表位比对：
Figure BDA0001241913620000451
跨越天冬氨酸586的胱天蛋白酶区域586衍生的肽的肽和表位比对：
图11：通过使用指定的含有单氨基酸丙氨酸取代的肽进行的肽ELISA，通过丙氨酸取代扫描来测定5种p6776肽诱导的免疫血清的核心表位。5个血清(由暗到亮条表示)与如指定的丙氨酸取代肽杂交(对于肽序列，参见表1)。结果，5个动物中的2个分别在经丙氨酸取代的肽p7754，p7756，p7757和p7758上显示出信号减少，从而描绘出针对多克隆抗血清的具有氨基酸序列IVLD的核心表位。数字指示滴度OD(logEC 50)比率(ration)[Ala取代肽：wt-肽]。
p7564诱导的抗血清和mAB M1D1的表位作图在实施例5，图17中提供。
图12：mAB M1D1特异性识别在C-末端具的游离天冬氨酸586的重组亨廷顿蛋白片段，强于未切割的recHTT610。使用具有610和586个氨基酸长度的重组亨廷顿蛋白(分别为HTT610和HTT586)进行蛋白质ELISA(如实施例1中所述)。值表示mAB M1D1信号(OD；如实施例1中解释的蛋白质捕获ELISA)与mAB 2166对照抗体信号的比率。将值相对于参考mAB2166标准化，mAB 2166识别两个片段中都的内部表位作为蛋白质上样对照。
实施例5：单克隆抗体PRR13，C6-17和M1D1的产生和表征。
单克隆抗体
对于单克隆抗体的生产和分离，根据制造商的说明书使用ClonaCell-HY杂交瘤克隆试剂盒(STEMCELL technologies，CatNr.28411)。简言之，在HAT选择下用骨髓瘤细胞系SP2-0进行杂交瘤融合，并且最初分别使用免疫肽和用于背景测定的不相关对照肽通过肽ELISA筛选上清液。在M1D1的情况下，使用针对含有游离C末端天冬氨酸的肽p6776的ELISA，以便测定对具有游离C末端天冬氨酸的经切割肽的特异性，如实施例5中指示。如所述的那样亲和纯化候选mAB，并如实施例1中指示通过蛋白ELISA针对recHTT610进行测试。分别对于每个融合物，筛选的融合克隆的数目通常为500。对于VL和VH区测序，提取来自融合克隆的mRNA，使用Oligo(dT)引物逆转录并使用可变结构域引物进行PCR扩增以扩增VH和VL区两者。使用标准PCR克隆程序(Invitrogen，CatNr.K4560-01)克隆VH和VL产物，转化到TOP10细胞中，并通过PCR筛选阳性转化体。挑取选择的菌落并通过在ABI3130xl遗传分析仪上的DNA测序进行分析。
抗体的亲和纯化
根据制造商的方案分别使用与含有半胱氨酸的肽连接的BcMagTM碘乙酰活化磁珠(Bioclone，FG-102)从杂交瘤上清液(SN)和血浆中分离mAB和多克隆抗体。在室温下温育血浆/SN达2小时后，用高盐缓冲液(PBS，0.2％Triton X-100，补充NaCl至终浓度为350mM)洗涤珠，并用酸性洗脱缓冲液(Thermo，CatNr.21004)洗涤结合的抗体4次。在HEPES pH8(75mM终浓度)中中和后，浓缩洗脱的抗体，并使用Spin-X UF500管(Corning，CLS431478)将缓冲液更换为PBS至体积100μl。使用Qubit系统(Invitrogen，CatNr.Q32866)根据制造商的方案测定抗体浓度。
结果：
通过杂交瘤技术使用肽p6773作为免疫原产生抗体PRR13。如实施例2所示，疫苗候选物之一的肽p6773在R6/1转基因动物的主动免疫中显示出有益的神经保护作用，并与p6771重叠。如图11所示的，从识别PRR衍生肽的9个预选的候选mAB中选择PRR13。在图13中列出的候选mAB中，如图12所示的，PRR13基于当与重组HTT610杂交时其有利的信号/噪音比选择。
图13：来自源自用肽p6773免疫的小鼠的杂交瘤的上清液当通过肽ELISA测试时在9种预筛选的候选克隆中的7种中提供免疫肽的强烈识别。
图14：与特异性抗肽信号形成对比(图11)，当通过recHTT610捕获ELISA(如实施例1中解释的)测试时，9个mAB候选物中仅2个，即PRR13和PRR18特异性识别重组亨廷顿蛋白。这两个候选物提供了显著的信噪比(即>＝4；计算的reHTT610特异性信号：HEK对照提取物)，并且选择PRR13用于表位表征(参见实施例4)和可变链测序(参见下文)。将PRR13确定为IgG亚型小鼠IgG2a。
>PRR13VH共有氨基酸序列(SEQ ID No.62):
MGWSWVMLFLLSGTGGVLSEVQLQQSAPELVKPGASVKMSCKASGYSFTDFYMKWVKQSHGKGLEWIGDIDPKNGDTFYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMQLNSLTTEDSAVYYCATYYGYTMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYF
>PRR13VL共有氨基酸序列(SEQ ID No.63):
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGQIVLTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVTSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYRRPPRTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPR
使用肽p7543作为免疫原，通过杂交瘤技术产生抗体C6-17。如实施例3中证明，肽p7543在YAC128转基因动物中显示出有益的治疗效果。尽管抗recHTT610信号在来自该筛选的4个预选的mAB之间是可比较的。如图13所示，信噪比在这些候选物中显著不同。如图14所示，其中显示recHTT610捕获ELISA(如实施例1中所述进行)。C6-17基于其特异性和IgG亚型(测定为小鼠IgG2a)而选择，用于表位表征(参见实施例4)和可变链测序：
图15：来自肽p7543免疫小鼠的4种预选的抗亨廷顿蛋白mAb的特异性分析。4个mAB候选物的值表示针对对照提取物的重组亨廷顿蛋白特异性OD-信号的信噪比(通过如实施例1中解释的蛋白质捕获ELISA确定)。mAB C6-17提供最佳的信噪比。
>C6-17VH共有氨基酸序列(SEQ ID No.60):
MGWSCIMLFLLSGTAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGINPNNGGTRYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCASLDGRDYWGQGTTLTVSSAKTTAPSVFPLA
>C6-17VL共有氨基酸序列(SEQ ID No.61):
MVLMLLLLWVSGTCGDIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYSCKQSYNLLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPK
通过杂交瘤技术使用肽p7564作为免疫原产生抗体M1D1。肽p7564是疫苗候选物的部分，其在YAC128转基因动物中显示出有益的处理效果，如实施例3中证明。单克隆抗体M1D1通过相对于含有在序列内包埋的此天冬氨酸残基的肽诸如例如p6776对C-末端包含游离天冬氨酸的肽的结合的差异筛选来选择，如实施例1，图3所示。单克隆抗体M1D1基于其对“切割”序列的特异性选择，用于进一步的表位表征和可变链测序。将其分型为小鼠IgM，并且它结合至人亨廷顿蛋白片段的新表位，所述新表位通过胱天蛋白酶6或任何其它蛋白酶在氨基酸位置D586处切割对蛋白质或相应肽序列切割时产生。
图16：通过肽ELISA(如实施例1中所解释)测定针对“切割”肽p7564的特异性筛选预选的mAB。与例如M1-C2相反，mAB M1D1显示最有利的p7564与p6776OD信号比。M1D1因此对于通过在位置586处的蛋白水解切割产生的新表位是特异性的。p7564的C-末端天冬氨酸对应于由胱天蛋白酶6和可能的其它胱天蛋白酶产生的C-末端切割点。从而，它提供了在该位点的特异性切割检测的手段，类似于用治疗有益的肽p7564产生的多克隆抗血清，如实施例3所示。
图17：mAB M1D1识别来自至少7AA长度的胱天蛋白酶6切割区的含有游离C末端天冬氨酸的亨廷顿蛋白肽。相反，更短的肽或没有游离C末端天冬氨酸的肽没有被M1D1识别或仅被M1D1弱识别，从而证明该单克隆抗体对具有游离COOH末端天冬氨酸的切割序列的特异性，例如经切割的人亨廷顿蛋白的游离氨基酸位置586(柱表示来自肽ELISA的OD，其中mAB浓度为1ng/μl；肽名称从左到右如下：p7564，p7562，p7552，p7541，p7567，p7568，p7605，p6777)。
>M1D1VH共有氨基酸序列(SEQ ID No.64):
MDFGLSWVFFVVFYQGVHCEVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGEYGNPWFAYWGQGTLVTVSAESQSFPNVFPL
>M1D1VL共有氨基酸序列(SEQ ID No.65):
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPK
实施例6-胱天蛋白酶切割位点抑制剂
体外胱天蛋白酶切割抑制测定
使用Maxisorb ELISA板(Thermo；439454)进行胱天蛋白酶6抑制测定，其中在RT下包被50μl 20nM BSA偶联肽(如图18所示)1小时，然后用150μl封闭缓冲液(PBS，1％BSA，0.1％Tween 20)处理1小时，在室温下分别用所指示的亲和纯化的多克隆血清(3ng/μl)或亲和纯化的mAB(10ng/μl)温育1小时。用洗涤缓冲液(PBS，0.1％BSA，0.1％Tween 20)洗涤几次后，向每孔中加入用1x胱天蛋白酶6缓冲液(BioVision；1068-80)稀释的5U胱天蛋白酶6酶(Enzo；BML SE170-5000)并且在37℃温育30分钟。通过ELISA如实施例1中所述进行通过胱天蛋白酶6肽切割产生的新暴露的表位的定量，其反应胱天蛋白酶可接近性程度，其中使用肽p7564诱导的抗体检测含有游离C末端天冬氨酸的表位。
结果：
通过包含图19所示肽的肽疫苗产生靶向人亨廷顿蛋白的胱天蛋白酶区域586的多克隆抗血清。即使源自胱天蛋白酶区域586的所有候选肽诱导相当的抗肽滴度(如实施例1所证实)，相对的胱天蛋白酶6抑制以肽序列和表位依赖性方式变化，从而证明了来自该区域的肽诱导的抗体之间的表位可接近性和结合性质的差异。特别地，分别跨越胱天蛋白酶切割位点586的肽，特别是p6776和p6777(如图18所示)和胱天蛋白酶切割位点586的C-末端定位的肽，诸如例如p8855，p8862和p7543和p8869(如图19所示)，提供有效的胱天蛋白酶6抑制剂，例如通过胱天蛋白酶切割抑制测定法所测定的。当分别比较肽p8868，p8869，p8870和p8871与肽p7543，p8864，p8865和p8866诱导的抗体的抑制效果时，可以证明所得抗体的抑制活性基本上不受半胱氨酸的N-或C-末端位置影响，从而表明就固定接头位置而言的灵活性。基于这些体外功能活性组合实施例3中证明的体内效应和实施例11中所证实的体外吞噬活性，这些肽描述了用于本专利申请中提出的基于抗体的策略的功能相关的靶向结构域，所述策略包括主动或被动免疫，血浆成分输血和与该区域结合的竞争性切割抑制剂。
图18：为了筛选跨越胱天蛋白酶区域586的亨廷顿蛋白序列特异性蛋白酶抑制剂的体外胱天蛋白酶6切割抑制测定。将板固定的跨越胱天蛋白酶区域586的靶肽与亲和纯化的多克隆抗体p6776，p6777和作为阴性对照的p7565(各自浓度为3ng/μl)或与来源于用p7543进行的肽免疫的单克隆抗体C6-17温育。mAB C6-17用作原型参照抑制剂，浓度为10ng/μl。抗体保护的靶肽与胱天蛋白酶6酶温育，随后检测靶肽的蛋白水解切割效率。使用mAB M1D1作为能够区分切割的和未切割的亨廷顿蛋白序列的探针来检测经切割的肽，如实施例5，图18中所述。左边的数字表示％切割，表明无保护，以100％切割，而mAB C6-17和多克隆抗体p6776和p6777减少切割，如通过保护靶肽免于胱天蛋白酶接近所指示的。
图19：为了筛选最有效的胱天蛋白酶位点抑制剂的目的，对18种多克隆血清和作为参考的mAB C6-17进行体外胱天蛋白酶6切割抑制测定。该测定完全如图18所示进行，然而相对的胱天蛋白酶切割活性与测试的每个单独抗体的靶物结合信号相关。因此，该值表示相对胱天蛋白酶位点抑制(如图10中的切割％)与通过肽ELISA(OD；如图1所述)测定的靶肽结合的比率。该筛选鉴定了能够产生多克隆抗体的几种肽，所述多克隆抗体能够抑制胱天蛋白酶位点586切割，而无需考虑末端半胱氨酸的位置，如由肽p8868，p8869，p8870和p8871分别所证明的，所述肽p8868，p8869，p8870和p8871仅关于其半胱氨酸位置分别不同于肽p7543，p8864，p8865和p8866，但具有等同的活性和免疫原性。尽管抗体与肽底物相对同质的结合(如实施例1，图1所示)，但是在诱导的抗体之间的切割抑制以肽免疫原依赖性方式不同。
实施例7：体外吞噬测定，分别显示mAB PRR13和C6-17的体外吞噬活性，证实了疫苗诱导的抗体的体内作用机制，所述抗体特异性针对源自人HTT的免疫原性肽，如分别在实施例2(图6)和3(图9)中测试。
体外吞噬测定：
巨噬细胞的分离和体外分化基本上如例如Zhang等人2008[PMID:19016445]所述进行。简言之，将来自8至12周龄的BALB/c小鼠的胫骨和股骨来源的骨髓细胞以20-30x106个细胞/皿的密度分入2-3个10cm细胞培养皿上，在RPMI/10％FCS+P/S中在20ng/ml M-CSF(RD-Systems，Cat-No：416-ML-010)的存在下分化4天，在第5天重新分布到24-孔组织培养板中，密度为150.000细胞/孔，直至第9天。在吞噬作用前24小时，在不存在M-CSF的情况下，将细胞在500μl RPMI培养基+10％FCS+P/S中饥饿。使用经链霉亲合素包被的顺磁微球(Bang Laboratories，Cat-No：CP01F)进行吞噬作用，根据制造商的说明分别使用C-末端生物素化的肽p9304和p9305(p9304(C6):b-GGGDYKDDDDKGAVTPSDSSEIVLDGTDNQYLGLQIGQPQDG(SEQ ID No.52)；p9305(PRR):b-GGGDYKDDDDKGPPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPG(SEQ ID No.53))包被，并在室温下用在稀释缓冲液中的10ng/μl抗体温育1小时，随后用补充有NaCl至最终盐浓度350mM的PBS洗涤，用PBS洗涤并最终重悬浮于RPMI培养基中。随后，将抗体包被的荧光肽-珠加入到分化的巨噬细胞(在含有0.5ug珠/孔的200ul体积中)在37℃持续1小时，允许通过吞噬作用体外摄取。在冰冷的PBS中洗涤和刮下细胞后，在FACS缓冲液(1xPBS+1％BSA)中洗涤细胞，并通过标准FACS程序分析荧光信号。基于制造商建议的方案，使用抗F4/80(Biolegend，Cat-No：B123109)和抗CD11b(Biolegend，Cat-No：B101219)标记抗体平行地监测细胞分化的效力。
结果：
图20：体外吞噬测定，其显示识别人亨廷顿蛋白的分别从PRR-和胱天蛋白酶切割586区域衍生的单克隆抗体PRR13和C6-17的吞噬活性。如方法中所指示的，将肽p9304(衍生自胱天蛋白酶切割586区；右图)和p9305(衍生自PRR区；左图)固定在荧光链霉亲合素珠上，与5ng/μl抗体一起温育，并转移到体外MCSF-分化的骨髓衍生的原代小鼠巨噬细胞(持续7天)。与珠温育1小时后，通过FACS分析测量细胞的特异性珠吸收。当与同种型对照抗体(即小鼠IgG2a)相比时，mAB PRR13(左图)和C6-17(右图)显示增加的珠吞噬作用。
表1：优选的肽的使用(肽名称/肽区域/肽序列(C用于偶联到载体蛋白；可以在肽的N-或C-端提供)，除了p7564，p7541，p7552，p7562，p7563，p7567或p7568之外，其中表位需要游离C末端天冬氨酸)；肽表，指示名称命名，作图到蛋白质区域(区域：Nter＝N-末端，polyQ＝多聚谷氨酰胺段，PRR＝富含多脯氨酸的区域，Ex1＝作图到外显子1，C6＝胱天蛋白酶切割586区域)和氨基酸序列(单字母代码；Nter>Cter；a＝β-丙氨酸；b＝生物素)；；；。
实施例8：-根据本发明的肽的修饰变异。
以下实施例提供了证据：肽的结构或化学修饰可以改善肽的溶解性，从而促进对于疫苗制备和质量控制所必需的合成，纯化，偶联或分析而不负面地影响对于疫苗应用的免疫原性，表位性质或免疫应答的质量。
作为实例，将C-或N-末端赖氨酸添加至原型候选肽p7543中，这改善了溶解性。如本文所述，例如在肽p9394(KTDNQYLGLQIGKC)，p9395(GTDNQYLGLQIGKKC)，p9396(KTDNQYLGLQIKKGC)或p9397(KDNQYLGLQIKKGC)中添加一个或几个末端赖氨酸，提供改善的水溶性。通过检查将肽溶解度分为“不溶”，“中等”(即在RT下以14krpm离心5分钟后可见的沉淀)和“清澈”(即在离心后没有可见的沉淀)。虽然肽p7543具有中等水溶性，但肽p9394，p9395，p9396和p9397是清澈的并显示出良好的水溶性。使用通常用于改善水溶性的其它肽修饰，诸如例如添加其它带电荷的氨基酸(例如精氨酸)或向肽添加PEG修饰而不影响肽表位和免疫原性，可以实现相似的水溶性的改善。
本实施例显示了根据本发明的肽的经赖氨酸修饰变体的表征。实验测定的具有改善的溶解性的赖氨酸变体包括例如p9394(KTDNQYLGLQIGKC)，p9395(GTDNQYLGLQIGKKC)，p9396(KTDNQYLGLQIKKGC)或p9397(KDNQYLGLQIKKGC)，它们含有一个或多个N-或C-末端添加的赖氨酸以改善水溶性。
图21：
a)：来自用C末端修饰的肽p9395(作为实例)免疫的5只动物(M1-M5)的免疫血清当与其与免疫肽(p9395)的结合相比时显示出甚至更强的与原始wt序列肽(p7543)的结合。结果示于图21中。Y轴显示如实施例1中进行的肽ELISA的EC 50值。
图22：
b)：如所指示的，由各种末端修饰的肽疫苗(诸如例如p9397，p9395，p9396)产生的免疫血清以与p7543免疫血清或对照mAB 2166(1:2000)相同的信号强度识别重组HTT蛋白。结果描述于于图22中。Y轴显示如通过实施例1中的ELISA分析获得的针对recHTT610蛋白的抗体信号(OD)。
图23：
c)：通过肽ELISA(在x轴上指示肽序列；肽ELISA如上所述进行)，使用12mer单步肽步行(single step peptide walk)对来自经p7543和p9395免疫的小鼠的免疫血清的表位分析分别证实在肽p7543及其含有赖氨酸的变体p9395之间的表位一致性。结果描述于图23中。y轴显示从标准肽ELISA获得的EC 50值。
图24：
d)：比较来源于用p7543及其变体p9395免疫的血清针对生物素/链霉亲合素固定的重组Htt蛋白(如在蛋白质ELISA中的recHtt610)的解离速率(x轴表示根据标准程序[参见以下]由无标记表面等离子体共振[SPR]测定的解离速率；各5只动物，分别称作-1至-5，如指示)。结果描述于图24中。总之，肽p9353衍生的免疫血清显示比p7543衍生的免疫血清(平均5,97E-04)更慢的解离速率(平均1,66E-04)。y轴指示计算的解离速率值。
方法(对于图24)：使用BiaCore 2000装置进行SPR。根据推荐的程序固定C-末端生物素标记的肽；为了避免芯片表面上的非特异性结合，注入2×100μl的1μM游离D-生物素用于封闭。使用pH7,4的HBS-缓冲液作为运行缓冲液，使用30μl/min的流速在25℃的分析温度下进行分析物注射。注射80μl的每个hu AB-SN样品，未稀释并且经无菌过滤(0.22μm)；以2μg/ml的浓度注射鼠对照mAB，解离时间为500s。使用15μl的10mM甘氨酸pH2,1的注射，然后中和，以再生芯片表面。传感图是减去参考的，因为自肽固定化流动池的信号减去来自参考流动池1的信号。来自空SN的曲线用于背景减去。将BiaEvaluation软件的Langmuir 1:1解离模型用于解离速率测定。
图25：
e)：使用如实施例7中所解释的体外胱天蛋白酶6抑制测定法比较经修饰的肽免疫血清(p9395)与p7543免疫血清的体外功能性。IgG同种型对照测定背景抑制活性；mAB C6-17用作阳性对照。结果描述于图25中。总之，p9395免疫血清比p7543血清(来自5只动物的平均31.8％)更有效地抑制(通过来自5只动物的免疫血清得到的平均14.2％抑制，显示在y轴上)。这些体外抑制活性与如通过通过SPR测定的上述解离速率和通过ELISA测定的重组HTT蛋白结合数据一致。
图26：
f)：使用如下所述的体外吞噬测定法比较经修饰的肽免疫血清(p9395)与p7543免疫血清的体外功能性。结果描述于图26中。当与源自5种非特异性免疫的动物的血清的混合物相比时，来自经p9395免疫的动物的5种血清的混合物显示吞噬活性(表示为MFI；显示在y轴上)，证实由末端修饰的肽产生的免疫血清的吞噬活性。
实施例9-抗体人源化
a)原始抗体PRR13和hC6-17的抗体人源化优选地如下进行：重链和轻链可变区的原型框架分别用于产生hPRR13-1至-16系列和hC6-17-1至-16系列。系列包括在重链(称为框架H)和/或轻链(称为框架L)的一个或几个氨基酸位置含有修饰的原型变体，如图27所示。数字反映下文对人源化抗体指定的框架区内的氨基酸位置。
hPRR13系列轻链可变区
[EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCTASSSVTSSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCHQYRRPPRTFGGGTKLEIKR]；
hPRR13重链可变区
[EVQLVESGPEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDFYMKWVQQAPGRGLEWMGDIDPKNGDTFYNQKFKGRVTMTADTSTGTAYMQLSSLTSEDTAVYFCASYYGYTMDYWGQGTTVTVAS]；
hC6-17轻链可变区
[DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLLTFGGGTKLEIK]；
hC6-17重链可变区
[QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYTMHWVRQAPGRGLEWMGGINPNNGGTRYNQKFKGRVTMTRDTSIRTAYVELSRLTSDDTAVYYCASLDGRDYWGQGTLVTVSS]
方法：合成人vLC和vHC序列并克隆到表达载体pFUSE2ss CLg-hk(EcoRI/NheI)和pFUSEss CHIg-hG1(EcoRI/BsiWI)中。基本上如制造商所示根据标准分子生物学程序进行克隆程序，包括限制性消化和连接反应(NEB Quick连接酶试剂盒；CatNr.M2200L)，细菌转化，然后是克隆选择和分析。使用标准DNA纯化试剂盒(Quiagen；CatNr.27106)从琼脂糖凝胶中进行DNA片段制备。如制造商指示，将HEK293freestyle细胞(Invitrogen；CatNr.R790-07)培养在培养基中，并用表中所示的hu AB重链和轻链载体的不同组合瞬时共转染。在转染后24-48小时收集细胞培养SN，并以1:30浓缩，随后使用Spin-X UF500管(Corning，CLS431478)进行缓冲液交换(PBS)。使用ELISA(如实施例1)通过体外肽和蛋白质结合测试浓缩的人抗体-SN。贯穿本实施例9指示进行进一步表征。
图28
b)作为实例，与对照提取物(深灰色柱)相比，所指示的含有框架突变的人源化mABPRR13衍生物hPRR13-10，hPRR13-12和hPRR13-14对recHTT610蛋白的识别可以通过蛋白质ELISA证明(如实施例1中所述进行；参见图28，y轴反映了rec Htt610结合活性[OD])。
图29
c)：作为实例，来自如a)中提出的那样修饰的hC6-17系列的人源化抗体维持体外吞噬活性。如上所述进行体外吞噬测定，并显示(参见图29)，与未温育的珠(无AB)或不相关的同种型对照珠(IgG)形成对比，经mABhC6-17-6温育的珠在体外被有效地吞噬，从而提供基于抗体的HTT识别来维持抗HTT特异性功能性的实例。
Figure BDA0001241913620000551
Figure BDA0001241913620000561
特别优选用于主动疫苗接种(“++活性疫苗接种”)
优选用于主动疫苗接种(“+活性疫苗接种”)
优选用于mAB产生(“mAB产生”)
优选用于C6切割抑制(“C6抑制”)
文献
Bard et al.,2014,Journal of Biomolecular Screening,Volume 19(2),191-204
Butler et al.,2012,Progress in Neurobiology,Volume 97(2):190-204
Davidson,2012,Molecular Therapy,Volume 20(10):1838
Ellrichmann et al.,2013,ClinDevImmunol.,2013；2013:541259
Graham et al.,2010,J Neurosci.,Volume 30(45):15019-29
Ko et al.,2001,Brain Research Bulletin,Volume 56(3/4):319-329
Liu,2007,Journal of the American Society for Mass Spectrometry.Volume18(7):1249-64
Mandler et al.；ActaNeuropathologica 127(2014):861-879
Messer&Joshi,2013,Neurotherapeutics,Volume 10:447-458
Modreggeret al.,2002,Human Molecular Genetics,Volume 11(21):2547-58
Novak&Tabrizi,2011,International Review of Neurobiology,Volume 98:297-323
O'Hagan&Valiante,2003,Nature Reviews Drug Discovery,Volume 2(9):727-35 Singh&O'Hagan,1999,Nature Biotechnology,Volume 17(11):1075-81
Southwell et al.,2011,PloS ONE,Volume 6(1):e16676
Stadler et al.；AngewandteChemie International Edition England 2008；Vol 47(37):7132-5Tezel et al.,2012,Investigative Ophthalmology&Visual ScienceVolume 53(13):8222-31
Figure BDA0001241913620000562
et al.,2014,Brain,Volume 137(3):819-33
Warby et al.,2008,Human Molecular Genetics,Volume 17(15):2390-2404
Weiss et al.,Analytical Biochemistry 2009；Vol 395(1):8-15
Weiss et al.,2012,The Journal of Clinical Investigation,Volume 122(10):3731-3736
Weiss et al.2014,9th Annual Huntington's Disease TherapeuticsConference(CHDI)；Palm Springs USA,Abstract.
Wong et al.2014；9th Annual Huntington's Disease TherapeuticsConference(CHDI)；Palm Springs USA,Abstract.
Yu et al.,2014,Trends in Pharmacological Sciences,Volume 35(2):53-62
Zhang et al.；Current Protocols in Immunology 2008；Chapter:Unit–14.1
Zheng&Diamond,2012,Progress in Molecular Biology and TranslationalScience,Volume 107:189-214
因此，以下实施方案可以被限定为本发明的优选实施方案：
1.HTT蛋白的免疫原性肽，优选地选自：p6773(LPQPPPQAQPLLPQPQPC，SEQ IDNo.1)，p7564(CPSDSSEIVLD，SEQ ID No.2)，p7543(GTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.3),p7543a(DNQYLGLQIC；SEQ ID No.88)，尤其衍生物p9394(KTDNQYLGLQIGKC；SEQ ID No.91)，p9395(GTDNQYLGLQIGKKC；SEQ ID No.92)，p9396(KTDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.93)，p9397(KDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.94)；p7543b(TDNQYLGLQIC；SEQ ID No.89)，p7543c(TDNQYLGLQIGC；SEQ ID No.90)，p6771(LPQPPPQAQPLLPC，SEQ ID No.4)，p8346(CGPAVAEEPLHRP，SEQ ID No.5),p8855(SDSSEIVLDGTDC，SEQ ID No.6)，p8858(EIVLDGTDNQYLC，SEQ ID No.7)，p8859(IVLDGTDNQYLGC，SEQ ID No.8)，p8860(VLDGTDNQYLGLC，SEQ ID No.9)，p8861(LDGTDNQYLGLQC，SEQ ID No.10)，p8862(DGTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.11)，p8869(CTDNQYLGLQIGQ，SEQ ID No.12)，p8868(CGTDNQYLGLQIG，SEQ ID No.13)，p8870(CDNQYLGLQIGQP，SEQ ID No.14)，p8871(CNQYLGLQIGQPQ，SEQ ID No.15)，p6772(CPQLPQPPPQAQPLLP，SEQ ID No.16)，p8864(TDNQYLGLQIGQC，SEQ ID No.17)，p8865(DNQYLGLQIGQPC，SEQ ID No.18)，p6775(PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC，SEQ ID No.19)，p8854(PSDSSEIVLDGTC，SEQ ID No.20)，p8856(DSSEIVLDGTDNC，SEQ ID No.21)，p8857(SEIVLDGTDNQYC，SEQ ID No.22)，p8866(NQYLGLQIGQPQC，SEQ ID No.23)，p8867(QYLGLQIGQPQDC，SEQ ID No.24)，p6763(CaMATLEKLMKAFESLKSFQ，SEQ ID No.25)，p6764(CaKLMKAFESLKSFQ，SEQ ID No.26)，p6765(CEEQQRQQQQQQQ，SEQ ID No.27)，p6768(QQQQQQPPPPPPPPaKKKC，SEQ ID No.28)，p7541(CSEIVLD，SEQ ID No.29)，p7552(CSSEIVLD，SEQ ID No.30)，p7562(CDSSEIVLD，SEQ IDNo.31)，p7563(CSDSSEIVLD，SEQ ID No.32)，p7567(CEIVLD，SEQ ID No.33)，p7568(CIVLD，SEQ ID No.34)，p7605(CSEIVL，SEQ ID No.35)，p6776(CSEIVLDGTDNQYL，SEQ ID No.36)，p6777(CSDSSEIVLDGTDN，SEQ ID No.37),p6776b(SEIVLDGTDNQYLC，SEQ ID No.38)，p7752(CAEIVLDGTDNQYL，SEQ ID No.39)，p7753(CSAIVLDGTDNQYL，SEQ ID No.40)，p7754(CSEAVLDGTDNQYL，SEQ ID No.41)，p7755(CSEIALDGTDNQYL，SEQ ID No.42)，p7756(CSEIVADGTDNQYL，SEQ ID No.43)，p7757(CSEIVLAGTDNQYL，SEQ ID No.44)，p7758(CSEIVLDATDNQYL，SEQ ID No.45)，p7745(CSEIVLDGADNQYL，SEQ ID No.46)，p7746(CSEIVLDGTANQYL，SEQ ID No.47)，p7747(CSEIVLDGTDAQYL，SEQ ID No.48)，p7748(CSEIVLDGTDNAYL，SEQ ID No.49)，p7749(CSEIVLDGTDNQAL，SEQ ID No.50)，和p7750(CSEIVLDGTDNQYA，SEQ ID No.51)，更优选p6773(LPQPPPQAQPLLPQPQPC，SEQ ID No.1)，p7564(CPSDSSEIVLD，SEQ ID No.2)，p7543(GTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.3)，p6771(LPQPPPQAQPLLPC，SEQ ID No.4)，p8346(CGPAVAEEPLHRP，SEQ ID No.5),p8855(SDSSEIVLDGTDC，SEQ ID No.6)，p8858(EIVLDGTDNQYLC，SEQ ID No.7)，p8859(IVLDGTDNQYLGC，SEQ ID No.8)，p8860(VLDGTDNQYLGLC，SEQ ID No.9)，p8861(LDGTDNQYLGLQC，SEQ ID No.10)，p8862(DGTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.11)，p8869(CTDNQYLGLQIGQ，SEQ ID No.12)，p8868(CGTDNQYLGLQIG，SEQ ID No.13)，p8870(CDNQYLGLQIGQP，SEQ ID No.14)，p8871(CNQYLGLQIGQPQ，SEQ ID No.15)，p6772(CPQLPQPPPQAQPLLP，SEQ ID No.16)，p8864(TDNQYLGLQIGQC，SEQ ID No.17)，p8865(DNQYLGLQIGQPC，SEQ ID No.18)，p6775(PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC，SEQ ID No.19)，p6776(CSEIVLDGTDNQYL，SEQ ID No.36)，p6777(CSDSSEIVLDGTDN，SEQ ID No.37)，p8854(PSDSSEIVLDGTC，SEQ ID No.20)，p8856(DSSEIVLDGTDNC，SEQ ID No.21)，p8857(SEIVLDGTDNQYC，SEQ ID No.22)，p8866(NQYLGLQIGQPQC，SEQ ID No.23)，和p8867(QYLGLQIGQPQDC，SEQ ID No.24)，尤其p6773(LPQPPPQAQPLLPQPQPC，SEQ ID No.1)，p7564(CPSDSSEIVLD，SEQ ID No.2)，p7543(GTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.3)，p6771(LPQPPPQAQPLLPC，SEQ ID No.4)，p6776(CSEIVLDGTDNQYL，SEQ ID No.36)，p6777(CSDSSEIVLDGTDN，SEQ ID No.37)，和p8346(CGPAVAEEPLHRP，SEQ ID No.5)；其中N-或C-末端半胱氨酸残基(C)可以存在或不存在或备选地提供在C-或N-末端；或包含具有SEQ IDNO：1至51的这些肽中的至少一种的肽，优选总长度最多50个氨基酸残基，更优选最多30个氨基酸残基，进一步优选最多20个氨基酸残基，尤其最多16个氨基酸残基。
2.用于治疗和/或预防亨廷顿氏病的基于肽的疫苗，其包含亨廷顿蛋白(HTT)蛋白的至少一种免疫原性肽，优选选自实施方案1的肽的至少一种肽，和还任选地一种或多种佐剂。
3.根据实施方案2使用的基于肽的疫苗，其特征在于所述至少一种免疫原性肽偶联至药学上可接受的载体，优选KLH。
4.根据实施方案2或3使用的基于肽的疫苗，其特征在于所述疫苗被配制为静脉内，皮下，皮内或肌内施用。
5.根据实施方案2至4中任一项使用的基于肽的疫苗，其特征在于所述疫苗与佐剂，优选氢氧化铝一起配制。
6.根据实施方案2至5中任一项的基于肽的疫苗，其特征在于疫苗中以0.1ng至10mg，优选10ng至1mg，特别是100ng至100μg的量包含所述至少一种肽。
7.根据实施方案2或6使用的基于肽的疫苗，其中所述HTT蛋白的所述至少一种免疫原性肽选自根据实施方案1的组，优选其中所述组合是p7543(GTDNQYLGLQIGC，SEQ IDNo.3)(或p7543a(DNQYLGLQIC；SEQ ID No.88)，尤其衍生物p9394(KTDNQYLGLQIGKC；SEQ IDNo.91)，p9395(GTDNQYLGLQIGKKC；SEQ ID No.92)，p9396(KTDNQYLGLQIKKGC；SEQ IDNo.93)，p9397(KDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.94)；p7543b(TDNQYLGLQIC；SEQ ID No.89)，p7543c(TDNQYLGLQIGC；SEQ ID No.90))与选自SEQ ID NO：1，2，4和5的至少一种肽的组合，尤其是其中所述组合包含p7543(GTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.3)和p6771(LPQPPPQAQPLLPC，SEQ ID No.4)，或p7543(GTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.3)和p7564(CPSDSSEIVLD，SEQ IDNo.2)或由p7543(GTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.3)和p6771(LPQPPPQAQPLLPC，SEQ ID No.4)，或p7543(GTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.3)和p7564(CPSDSSEIVLD，SEQ ID No.2)组成，其中N-或C-末端半胱氨酸残基(C)可以存在或不存在或备选地提供在C-或N-末端。
8.根据实施方案2至7中任一项的基于肽的疫苗，其特征在于其包含来自HTT的“C6”区域的至少一种肽和来自HTT的“PRR”区域的至少一种肽，优选其中所述至少一种肽各自选自表2的组。
9.药物制剂，其包含根据实施方案1的免疫原性肽，或包含选自下组的核心表位或由选自下组的核心表位组成的免疫原性肽：LLPQP(SEQ ID No.77)，PPQAQPL(SEQ IDNo.78)，PPQAQP(SEQ ID No.79)，QPLL(SEQ ID No.80)和PQAQPLL(SEQ ID No.81)，尤其LLPQP，和QYLGLQIG(SEQ ID No.82)，YLGLQIG(SEQ ID No.83)，DNQYLGLQIG(SEQ IDNo.84)，DNQYLGL(SEQ ID No.85)和YLGLQIG(SEQ ID No.86)，尤其QYLGLQIG；优选具有30个，优选20个，更优选16个氨基酸残基的最大长度，尤其具有6至10个氨基酸的长度。
10.根据实施方案9的药物制剂，其特征在于其用于在个体，尤其患有亨廷顿氏病的个体中引发免疫应答。
11.根据实施方案9或10的药物制剂，其特征在于其包含根据实施方案2至8中任一项的基于肽的疫苗。
12.根据实施方案9至11中任一项的药物制剂，其特征在于其用于在个体中，尤其具有亨廷顿氏病的个体中引发抗HTT抗体。
13.根据实施方案9至12中任一项的药物制剂，其特征在于其与抗HTT抗体的药物制剂组合，并优选在单独的施用程序中施用于个体。
14.药物组合物，其包含特异性识别HTT蛋白的至少一种免疫原性肽的多克隆抗体，所述药物组合物在亨廷顿氏病的治疗和/或预防中用作疫苗。
16.单克隆抗体，其具有能够结合具有p6773(SEQ ID No.1)序列的HTT蛋白的肽，尤其核心表位LLPQP(SEQ ID No.77)的结合结构域。
17.根据实施方案16的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体包含含有GYSFTDFY(SEQ ID No.54)的重链可变区CDR1，包含IDPKNGDT(SEQ ID No.55)的重链可变区CDR2，包含ATYYGYTMDY(SEQ ID No.56)的重链可变区CDR3，包含SSVTSSY(SEQ ID No.57)的轻链可变区CDR1，包含STS(SEQ ID No.58)的轻链可变区CDR2，包含HQYRRPPRT(SEQ IDNo.59)的轻链可变区，所述抗体优选是单克隆抗体PRR13。
18.根据实施方案16或17的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是人单克隆抗体，人源化单克隆抗体，双特异性单克隆抗体或嵌合单克隆抗体。
19.根据实施方案16至18中任一项所述的单克隆抗体，其用于药物组合物中，所述药物组合物用于预防和/或治疗亨廷顿氏病。
20.根据实施方案19使用的单克隆抗体，其特征在于所述组合物另外含有药学上可接受的载体或赋形剂。
21.根据实施方案19或20使用的单克隆抗体，其特征在于所述组合物还含有至少一种另外的治疗剂。
22.根据实施方案19至21中任一项使用的单克隆抗体，其特征在于所述组合物配制为静脉内，皮下，皮内或肌内施用。
23.根据实施方案19至22中任一项使用的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体偶联至增强吞噬性质的分子。
24.根据实施方案19至23中任一项使用的单克隆抗体，其特征在于在所述组合物中以1mg至10g，优选50mg至2g，尤其100mg至1g的量包含所述单克隆抗体。
25.单克隆抗体，其具有能够结合至HTT蛋白的肽的结合结构域，所述肽具有p7543(SEQ ID No.3)的序列。
26.根据实施方案25的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体包含含有GYTFTEYT(SEQ ID No.66)的重链可变区CDR1，包含INPNNGGT(SEQ ID No.67)的重链可变区CDR2，包含ASLDGRDY(SEQ ID No.68)的轻链可变区CDR3，包含QSLLNSRTRKNY SEQ ID No.69的轻链可变区CDR1，包含WAS(SEQ ID No.70)的轻链可变区CDR2和包含KQSYNLLT(SEQ IDNo.71)的轻链可变区，所述抗体优选是单克隆抗体C6-17。
27.根据实施方案25或26的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是人单克隆抗体，人源化单克隆抗体，双特异性单克隆抗体或嵌合单克隆抗体，优选是对HTT的PRR区具有特异性的双特异性抗体，尤其含有根据实施方案16至24的抗体。
28.根据实施方案25至27中任一项的单克隆抗体，其用于药物组合物中，所述药物组合物用于亨廷顿氏病的预防和/或治疗。
29.根据实施方案28中使用的单克隆抗体，其特征在于所述组合物另外含有药学上可接受的载体或赋形剂。
30.根据实施方案28至29中使用的单克隆抗体，其特征在于所述组合物还含有至少一种另外的治疗剂。
31.根据实施方案28至30中使用的单克隆抗体，其特征在于所述组合物配制为静脉内，皮下，皮内或肌内施用。
32.根据实施方案28至31中使用的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体偶联至增强吞噬性质的分子。
33.根据实施方案28至32中使用的单克隆抗体，其特征在于所述组合物中以1mg至10g，优选50mg至2g，尤其100mg至1g的量含有所述单克隆抗体。
34.单克隆抗体，其具有能够结合HTT蛋白的肽的结合结构域，所述肽具有p7564(SEQ ID No.2)的序列，所述单克隆抗体优选用于治疗亨廷顿氏病。
35.根据实施方案34的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体包含含有GFTFNTYA(SEQ ID No.72)的重链可变区CDR1，包含IRSKSNNYAT(SEQ ID No.73)的重链可变区CDR2，包含VRHGEYGNPWFAY(SEQ ID No.74)的轻链可变区CDR3，包含QSLVHSNGNTY(SEQ IDNo.75)的轻链可变区CDR1，包含KVS(SEQ ID No.76)的轻链可变区CDR2和包含SQSTHVPYT(SEQ ID No.77)的轻链可变区，所述抗体优选是单克隆抗体M1D1。
36.根据实施方案34或35的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是人单克隆抗体，人源化单克隆抗体，双特异性单克隆抗体或嵌合单克隆抗体。
37.根据实施方案34至36中任一项的单克隆抗体，其用于药物组合物中，所述药物组合物用于亨廷顿氏病的预防和/或治疗。
38.根据实施方案37使用的单克隆抗体，其特征在于所述组合物另外含有药学上可接受的载体或赋形剂。
39.根据实施方案37或38使用的单克隆抗体，其特征在于所述组合物还含有至少一种另外的治疗剂。
40.根据实施方案37至39中任一项使用的单克隆抗体，其特征在于所述组合物配制为静脉内，皮下，皮内或肌内施用。
41.根据实施方案37至40中使用的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体偶联至增强吞噬性质的分子。
42.根据实施方案37至41中任一项中使用的单克隆抗体，其特征在于在所述组合物中以1mg至10g的量包含所述单克隆抗体。
43.根据实施方案42使用的单克隆抗体，其中在所述组合物中以50mg至2g，尤其100mg至1g的量包含所述单克隆抗体。
44.根据实施方案42使用的单克隆抗体，其中在所述组合物中以100mg至1g的量包含所述单克隆抗体。
45.根据实施方案42使用的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是多克隆抗体。
46.根据实施方案42使用的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是单克隆抗体。
47.根据实施方案42使用的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是人单克隆抗体。
48.根据实施方案42使用的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是人源化单克隆抗体。
49.根据实施方案42使用的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是双特异性单克隆抗体。
50.根据实施方案42使用的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是具有针对HTT的两种特异性的双特异性单克隆抗体。
51.根据实施方案50使用的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是具有针对PRR或C6的结合区的双特异性单克隆抗体。
52.根据实施方案50使用的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是具有针对PRR和C6的结合区的双特异性单克隆抗体。
53.单克隆抗体M1D1，其用作药物筛选中的探针。
54.根据实施方案53使用的单克隆抗体M1D1，其中筛选抑制蛋白酶接近HTT的胱天蛋白酶切割区域氨基酸位置586的分子。
55.一种体外诊断哺乳动物中的亨廷顿氏病的方法，其包括以下步骤：
-使用单独或组合的抗体PRR13，M1D1或C6-17测定哺乳动物样品中野生型或突变的亨廷顿蛋白或其片段的水平；
-如果所述样品中的wt或突变的亨廷顿蛋白的水平与遗传上未受亨廷顿氏病影响的健康个体的参考样品相比变化，则诊断亨廷顿氏病；
-和任选地监测亨廷顿氏病降低治疗策略在预表现或表现亨廷顿氏病患者样品中的效果，其中所述治疗策略优选选自主动或被动疫苗接种，尤其在亨廷顿蛋白降低疗法的过程中。
56.根据实施方案55的方法，其中所述样品中野生型或突变亨廷顿蛋白或其片段的水平的测定涉及基于免疫沉淀或基于捕获的测定法，优选酶联免疫吸附测定(ELISA)，酶联免疫测定(EIA)，基于荧光共振能量转移(FRET)的测定，蛋白质印迹或免疫组织化学和免疫荧光分析或成像方法，优选PET或SPECT和流式细胞术。。
57.根据实施方案55至56的方法，其中所述样品是脑脊液(CSF)，血液，血浆，血清，尿液，唾液，汗液或泪液或组织和细胞提取物。
58.根据实施方案55至57的方法，其中所述哺乳动物是人。
59.一种在体外测定哺乳动物中的亨廷顿氏病的阶段的方法，其包括以下步骤：
-使用单独或组合的抗体PRR13，M1D1或C6-17测定哺乳动物样品中野
生型或突变的亨廷顿蛋白或其片段的水平；
-测定亨廷顿氏病的阶段；
-测定对亨廷顿蛋白降低疗法的HTT水平的影响。
60.根据实施方案59的方法，其中所述样品中野生型或突变亨廷顿蛋白或其片段的水平的测定涉及基于免疫沉淀或基于捕获的测定法，优选酶联免疫吸附测定(ELISA)，酶联免疫测定(EIA)，基于荧光共振能量转移(FRET)的测定，Western印迹或免疫组织化学和免疫荧光分析或成像方法，优选PET或SPECT和流式细胞术。
61.根据实施方案59至60的方法，其中所述样品是脑脊液(CSF)，血液，血浆，血清，尿液，唾液，汗液或泪液或组织和细胞提取物。
62.根据实施方案59至61的方法，其中所述哺乳动物是人。
63.一种监测亨廷顿氏病的进展或监测哺乳动物中亨廷顿氏病治疗有效性的方法，其包括以下步骤：
-使用单独或组合的抗体PRR13，M1D1和C6-17测定哺乳动物样品中突变的HTT的水平，和
-通过将突变亨廷顿蛋白或其片段的获得的水平与第一次测量中获得的突变亨廷顿蛋白或其片段水平，优选在诊断疾病相关的症状时的测量中的水平进行比较，测定亨廷顿氏病的进展或亨廷顿氏病的治疗有效性，其中HTT水平的降低指示成功的治疗。
64.根据实施方案63的方法，其中所述样品中突变HTT的水平的测定涉及基于免疫沉淀或基于捕获的测定法，优选酶联免疫吸附测定(ELISA)，酶联免疫测定(EIA)，基于荧光共振能量转移(FRET)的测定，Western印迹或免疫组织化学和免疫荧光分析或成像方法，优选PET或SPECT和流式细胞术。
65.根据实施方案63至64的方法，其中所述样品是脑脊液(CSF)，血液，血浆，血清，唾液，汗液或泪液或脑或组织提取物。
66.根据实施方案63至65的方法，其中所述哺乳动物是人。
67.选自下组的至少一种免疫原性肽在制备用于预防或治疗亨廷顿氏病的药物中的用途，所述免疫原性肽选自下组：p6773(LPQPPPQAQPLLPQPQPC，SEQ ID No.1)，p7564(CPSDSSEIVLD，SEQ ID No.2)，p7543(GTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.3)，p7543a(DNQYLGLQIC；SEQ ID No.88)，尤其衍生物p9394(KTDNQYLGLQIGKC；SEQ ID No.91)，p9395(GTDNQYLGLQIGKKC；SEQ ID No.92)，p9396(KTDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.93)，p9397(KDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.94)；p7543b(TDNQYLGLQIC；SEQ ID No.89)，p7543c(TDNQYLGLQIGC；SEQ ID No.90)，p6771(LPQPPPQAQPLLPC，SEQ ID No.4)，p8346(CGPAVAEEPLHRP，SEQ ID No.5)，p8855(SDSSEIVLDGTDC，SEQ ID No.6)，p8858(EIVLDGTDNQYLC，SEQ ID No.7)，p8859(IVLDGTDNQYLGC，SEQ ID No.8)，p8860(VLDGTDNQYLGLC，SEQ ID No.9)，p8861(LDGTDNQYLGLQC，SEQ ID No.10)，p8862(DGTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.11)，p8869(CTDNQYLGLQIGQ，SEQ ID No.12)，p8868(CGTDNQYLGLQIG，SEQ ID No.13)，p8870(CDNQYLGLQIGQP，SEQ ID No.14)，p8871(CNQYLGLQIGQPQ，SEQ ID No.15)，p6772(CPQLPQPPPQAQPLLP，SEQ ID No.16)，p8864(TDNQYLGLQIGQC，SEQ ID No.17)，p8865(DNQYLGLQIGQPC，SEQ ID No.18)，p6775(PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC，SEQ ID No.19)，p8854(PSDSSEIVLDGTC，SEQ ID No.20)，p8856(DSSEIVLDGTDNC，SEQ ID No.21)，p8857(SEIVLDGTDNQYC，SEQ ID No.22)，p8866(NQYLGLQIGQPQC，SEQ ID No.23)，p8867(QYLGLQIGQPQDC，SEQ ID No.24)，p6763(CaMATLEKLMKAFESLKSFQ，SEQ ID No.25)，p6764(CaKLMKAFESLKSFQ，SEQ ID No.26)，p6765(CEEQQRQQQQQQQ，SEQ ID No.27)，p6768(QQQQQQPPPPPPPPaKKKC，SEQ ID No.28)，p7541(CSEIVLD，SEQ ID No.29)，p7552(CSSEIVLD，SEQ ID No.30)，p7562(CDSSEIVLD，SEQ IDNo.31)，p7563(CSDSSEIVLD，SEQ ID No.32)，p7567(CEIVLD，SEQ ID No.33)，p7568(CIVLD，SEQ ID No.34)，p7605(CSEIVL，SEQ ID No.35)，p6776(CSEIVLDGTDNQYL，SEQ ID No.36)，p6777(CSDSSEIVLDGTDN，SEQ ID No.37),p6776b(SEIVLDGTDNQYLC，SEQ ID No.38)，p7752(CAEIVLDGTDNQYL，SEQ ID No.39)，p7753(CSAIVLDGTDNQYL，SEQ ID No.40)，p7754(CSEAVLDGTDNQYL，SEQ ID No.41),p7755(CSEIALDGTDNQYL，SEQ ID No.42)，p7756(CSEIVADGTDNQYL，SEQ ID No.43)，p7757(CSEIVLAGTDNQYL，SEQ ID No.44)，p7758(CSEIVLDATDNQYL，SEQ ID No.45)，p7745(CSEIVLDGADNQYL，SEQ ID No.46)，p7746(CSEIVLDGTANQYL，SEQ ID No.47)，p7747(CSEIVLDGTDAQYL，SEQ ID No.48)，p7748(CSEIVLDGTDNAYL，SEQ ID No.49)，p7749(CSEIVLDGTDNQAL，SEQ ID No.50)，和p7750(CSEIVLDGTDNQYA，SEQ ID No.51)，preferably p6773(LPQPPPQAQPLLPQPQPC，SEQ IDNo.1)，p7564(CPSDSSEIVLD，SEQ ID No.2)，p7543(GTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.3)，p6771(LPQPPPQAQPLLPC，SEQ ID No.4),p6776(CSEIVLDGTDNQYL，SEQ ID No.36)，p6777(CSDSSEIVLDGTDN，SEQ ID No.37)，p8346(CGPAVAEEPLHRP，SEQ ID No.5),p8855(SDSSEIVLDGTDC，SEQ ID No.6)，p8858(EIVLDGTDNQYLC，SEQ ID No.7)，p8859(IVLDGTDNQYLGC，SEQ ID No.8)，p8860(VLDGTDNQYLGLC，SEQ ID No.9)，p8861(LDGTDNQYLGLQC，SEQ ID No.10)，p8862(DGTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.11)，p8869(CTDNQYLGLQIGQ，SEQ ID No.12)，p8868(CGTDNQYLGLQIG，SEQ ID No.13)，p8870(CDNQYLGLQIGQP，SEQ ID No.14)，p8871(CNQYLGLQIGQPQ，SEQ ID No.15)，p6772(CPQLPQPPPQAQPLLP，SEQ ID No.16)，p8864(TDNQYLGLQIGQC，SEQ ID No.17)，p8865(DNQYLGLQIGQPC，SEQ ID No.18)，p6775(PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC，SEQ ID No.19)，p8854(PSDSSEIVLDGTC，SEQ ID No.20)，p8856(DSSEIVLDGTDNC，SEQ ID No.21)，p8857(SEIVLDGTDNQYC，SEQ ID No.22)，p8866(NQYLGLQIGQPQC，SEQ ID No.23)，和p8867(QYLGLQIGQPQDC，SEQ ID No.24)，尤其p6773(LPQPPPQAQPLLPQPQPC，SEQ ID No.1)，p7564(CPSDSSEIVLD，SEQ ID No.2)，p7543(GTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.3)，p6771(LPQPPPQAQPLLPC，SEQ ID No.4),p6776(CSEIVLDGTDNQYL，SEQ ID No.36)，p6777(CSDSSEIVLDGTDN，SEQ ID No.37)，和p8346(CGPAVAEEPLHRP，SEQ ID No.5)，其中N-或C-末端半胱氨酸残基(C)可以存在或不存在或备选地提供在C-或N-末端。
68.用于预防和/或治疗亨廷顿氏病的基于肽的疫苗，其包含根据实施方案67的HTT蛋白的至少一种免疫原性肽。
69.根据实施方案68使用的基于肽的疫苗，其特征在于所述至少一种免疫原性肽偶联至药学上可接受的载体，优选KLH。
70.根据实施方案68至69使用的基于肽的疫苗，其特征在于所述疫苗被配制为静脉内，皮下，皮内或肌内施用。
71.根据实施方案68至70使用的基于肽的疫苗，其特征在于所述疫苗与佐剂，优选氢氧化铝一起配制。
72.根据实施方案68至70中任一项中使用的基于肽的疫苗，其特征在于所述疫苗中以0.1ng至10mg，优选10ng至1mg，特别是100ng至100μg的量包含所述至少一种肽。
73.根据实施方案67的免疫原性肽，其中所述肽用于产生或鉴定特异性亨廷顿蛋白C6-切割抑制剂。
74.根据实施方案73的免疫原性肽，其中所述特异性亨廷顿蛋白C6-切割抑制剂被限定为单克隆抗体，多克隆抗血清，单克隆抗体衍生的片段如Fv、scFv、F(ab)、F(ab)2。
75.抗体或抗原结合分子，其靶向HTT的胱天蛋白酶区域586C6区域，所述抗体或抗原结合分子通过用根据实施方案68的基于肽的疫苗免疫产生，所述肽尤其是选自下组的肽：p7564(CPSDSSEIVLD)，p7543(GTDNQYLGLQIGC)，p8855(SDSSEIVLDGTDC)，p8858(EIVLDGTDNQYLC)，p8859(IVLDGTDNQYLGC)，p8860(VLDGTDNQYLGLC)，p8861(LDGTDNQYLGLQC)，p8862(DGTDNQYLGLQIGC)，p8869(CTDNQYLGLQIGQ)，p8868(CGTDNQYLGLQIG)，p8870(CDNQYLGLQIGQP)，p8871(CNQYLGLQIGQPQ)，p8864(TDNQYLGLQIGQC)，p8865(DNQYLGLQIGQPC)，p8854(PSDSSEIVLDGTC)，p8856(DSSEIVLDGTDNC)，p8857(SEIVLDGTDNQYC)，p8866(NQYLGLQIGQPQC)，和p8867(QYLGLQIGQPQDC)，其中N-或C-末端半胱氨酸残基(C)可以存在或不存在或备选地提供在C-或N-末端。
76.根据实施方案75的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体。
77.根据实施方案75的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
78.根据实施方案75或77的抗体或抗原结合分子，其特征在于所述抗体偶联至增强吞噬性质的分子。
79.根据实施方案75至78中任一项的抗体或抗原结合分子，其用于药理学组合物中，所述药理学组合物用于预防和/或治疗亨廷顿氏病。
80.根据实施方案79使用的抗体或抗原结合分子，其特征在于所述组合物另外含有药学上可接受的载体或赋形剂。
81.根据实施方案79或80使用的抗体或抗原结合分子，其特征在于所述组合物还含有至少一种另外的治疗剂。
82.根据实施方案79至81中任一项使用的抗体或抗原结合分子，其特征在于所述疫苗被配制为静脉内，皮下，皮内或肌内施用。
83.根据实施方案79至82中任一项使用的抗体或抗原结合分子，其特征在于在所述疫苗中以0.1mg至100mg，优选0.5mg至20mg，特别是1mg至10mg的量包含所述多克隆抗体。
序列表
<110> 阿费里斯股份公司
<120> 用于预防和/或治疗亨廷顿氏病的物质和方法
<130> R 67858
<150> EP 14176531.3
<151> 2014-07-10
<160> 98
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亨廷顿蛋白肽
<400> 1
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Pro Cys
<210> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亨廷顿蛋白肽
<400> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亨廷顿蛋白肽
<400> 3
Gly Thr Asp Asn Gln Tyr Leu Gly Leu Gln Ile Gly Cys
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 亨廷顿蛋白肽
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Leu Pro Gln Pro Pro Pro Gln Ala Gln Pro Leu Leu Pro Cys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 亨廷顿蛋白肽
<400> 5
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<213> 人工序列
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<223> 亨廷顿蛋白肽
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Ser Asp Ser Ser Glu Ile Val Leu Asp Gly Thr Asp Cys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 亨廷顿蛋白肽
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Glu Ile Val Leu Asp Gly Thr Asp Asn Gln Tyr Leu Cys
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<223> 亨廷顿蛋白肽
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Ile Val Leu Asp Gly Thr Asp Asn Gln Tyr Leu Gly Cys
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Val Leu Asp Gly Thr Asp Asn Gln Tyr Leu Gly Leu Cys
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Leu Asp Gly Thr Asp Asn Gln Tyr Leu Gly Leu Gln Cys
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<220>
<223> 亨廷顿蛋白肽
<400> 11
Asp Gly Thr Asp Asn Gln Tyr Leu Gly Leu Gln Ile Gly Cys
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<213> 人工序列
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<223> 亨廷顿蛋白肽
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Cys Thr Asp Asn Gln Tyr Leu Gly Leu Gln Ile Gly Gln
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<223> 亨廷顿蛋白肽
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Cys Gly Thr Asp Asn Gln Tyr Leu Gly Leu Gln Ile Gly
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<220>
<223> 亨廷顿蛋白肽
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Cys Pro Gln Leu Pro Gln Pro Pro Pro Gln Ala Gln Pro Leu Leu Pro
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<220>
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Thr Asp Asn Gln Tyr Leu Gly Leu Gln Ile Gly Gln Cys
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<223> 亨廷顿蛋白肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 19
Pro Pro Pro Gln Leu Pro Gln Pro Pro Pro Gln Ala Gln Pro Leu Leu
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Pro Gln Pro Gln Pro Xaa Cys
20
<210> 20
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<223> 亨廷顿蛋白肽
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Pro Ser Asp Ser Ser Glu Ile Val Leu Asp Gly Thr Cys
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<220>
<223> 亨廷顿蛋白肽
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Ser Glu Ile Val Leu Asp Gly Thr Asp Asn Gln Tyr Cys
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<223> 亨廷顿蛋白肽
<400> 24
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<223> 亨廷顿蛋白肽
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<221> misc_feature
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<223> 亨廷顿蛋白肽
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<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 26
Cys Xaa Lys Leu Met Lys Ala Phe Glu Ser Leu Lys Ser Phe Gln
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<212> PRT
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<213> 人工序列
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<223> 亨廷顿蛋白肽
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<223> 亨廷顿蛋白肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 亨廷顿蛋白肽
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Cys Ser Ala Ile Val Leu Asp Gly Thr Asp Asn Gln Tyr Leu
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<213> 人工序列
<220>
<223> 亨廷顿蛋白肽
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<220>
<223> 亨廷顿蛋白肽
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Cys Ser Glu Ile Val Ala Asp Gly Thr Asp Asn Gln Tyr Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亨廷顿蛋白肽
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<213> 人工序列
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<223> 亨廷顿蛋白肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 亨廷顿蛋白肽
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Cys Ser Glu Ile Val Leu Asp Gly Ala Asp Asn Gln Tyr Leu
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<213> 人工序列
<220>
<223> 亨廷顿蛋白肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 亨廷顿蛋白肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 亨廷顿蛋白肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 亨廷顿蛋白肽
<400> 50
Cys Ser Glu Ile Val Leu Asp Gly Thr Asp Asn Gln Ala Leu
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<211> 14
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<213> 人工序列
<220>
<223> 亨廷顿蛋白肽
<400> 51
Cys Ser Glu Ile Val Leu Asp Gly Thr Asp Asn Gln Tyr Ala
1 5 10
<210> 52
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亨廷顿蛋白肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 52
Xaa Gly Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ala Val Thr
1 5 10 15
Pro Ser Asp Ser Ser Glu Ile Val Leu Asp Gly Thr Asp Asn Gln Tyr
20 25 30
Leu Gly Leu Gln Ile Gly Gln Pro Gln Asp Gly
35 40
<210> 53
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亨廷顿蛋白肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 53
Xaa Gly Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Pro Pro
1 5 10 15
Gln Leu Pro Gln Pro Pro Pro Gln Ala Gln Pro Leu Leu Pro Gln Pro
20 25 30
Gln Pro Gly
35
<210> 54
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 54
Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Phe Tyr
1 5
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 55
Ile Asp Pro Lys Asn Gly Asp Thr
1 5
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 56
Ala Thr Tyr Tyr Gly Tyr Thr Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 57
Ser Ser Val Thr Ser Ser Tyr
1 5
<210> 58
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<400> 58
Ser Thr Ser Xaa
1
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 59
His Gln Tyr Arg Arg Pro Pro Arg Thr
1 5
<210> 60
<211> 146
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 60
Met Gly Trp Ser Cys Ile Met Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Glu Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Arg Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Asp Gly Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro
130 135 140
Leu Ala
145
<210> 61
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 61
Met Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser Gly Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu
20 25 30
Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg
35 40 45
Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Ser Cys Lys Gln Ser
100 105 110
Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
115 120 125
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
130 135 140
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Lys
<210> 62
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 62
Met Gly Trp Ser Trp Val Met Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Gly Gly
1 5 10 15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Ala Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
35 40 45
Thr Asp Phe Tyr Met Lys Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Asp Ile Asp Pro Lys Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Tyr Gly Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val
130 135 140
Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr
145 150 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe
165
<210> 63
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 63
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
20 25 30
Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser
35 40 45
Ser Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His
100 105 110
Gln Tyr Arg Arg Pro Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
115 120 125
Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser
130 135 140
Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn
145 150 155 160
Asn Phe Tyr Pro Arg
165
<210> 64
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 64
Met Asp Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Phe Val Val Phe Tyr Gln Gly
1 5 10 15
Val His Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
85 90 95
Gln Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Glu Tyr Gly Asn Pro Trp Phe
115 120 125
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Glu Ser Gln
130 135 140
Ser Phe Pro Asn Val Phe Pro Leu
145 150
<210> 65
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 65
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Lys
165
<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 66
Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr
1 5
<210> 67
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 67
Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr
1 5
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 68
Ala Ser Leu Asp Gly Arg Asp Tyr
1 5
<210> 69
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 69
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 70
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 70
Trp Ala Ser Xaa
1
<210> 71
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 71
Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Leu Thr
1 5
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 72
Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala
1 5
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 73
Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr
1 5 10
<210> 74
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 74
Val Arg His Gly Glu Tyr Gly Asn Pro Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 75
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 75
Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 76
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 76
Lys Val Ser Xaa
1
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 77
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 78
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核心表位
<400> 78
Leu Leu Pro Gln Pro
1 5
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核心表位
<400> 79
Pro Pro Gln Ala Gln Pro Leu
1 5
<210> 80
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核心表位
<400> 80
Pro Pro Gln Ala Gln Pro
1 5
<210> 81
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核心表位
<400> 81
Gln Pro Leu Leu
1
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核心表位
<400> 82
Pro Gln Ala Gln Pro Leu Leu
1 5
<210> 83
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核心表位
<400> 83
Gln Tyr Leu Gly Leu Gln Ile Gly
1 5
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核心表位
<400> 84
Tyr Leu Gly Leu Gln Ile Gly
1 5
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核心表位
<400> 85
Asp Asn Gln Tyr Leu Gly Leu Gln Ile Gly
1 5 10
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核心表位
<400> 86
Asp Asn Gln Tyr Leu Gly Leu
1 5
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核心表位
<400> 87
Tyr Leu Gly Leu Gln Ile Gly
1 5
<210> 88
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 免疫原性肽
<400> 88
Asp Asn Gln Tyr Leu Gly Leu Gln Ile Cys
1 5 10
<210> 89
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 免疫原性肽
<400> 89
Thr Asp Asn Gln Tyr Leu Gly Leu Gln Ile Cys
1 5 10
<210> 90
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 免疫原性肽
<400> 90
Thr Asp Asn Gln Tyr Leu Gly Leu Gln Ile Gly Cys
1 5 10
<210> 91
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 免疫原性肽
<400> 91
Lys Thr Asp Asn Gln Tyr Leu Gly Leu Gln Ile Gly Lys Cys
1 5 10
<210> 92
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 免疫原性肽
<400> 92
Gly Thr Asp Asn Gln Tyr Leu Gly Leu Gln Ile Gly Lys Lys Cys
1 5 10 15
<210> 93
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 免疫原性肽
<400> 93
Lys Thr Asp Asn Gln Tyr Leu Gly Leu Gln Ile Lys Lys Gly Cys
1 5 10 15
<210> 94
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 免疫原性肽
<400> 94
Lys Asp Asn Gln Tyr Leu Gly Leu Gln Ile Lys Lys Gly Cys
1 5 10
<210> 95
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 95
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Arg Arg Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 96
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 96
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Tyr Met Lys Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Asp Pro Lys Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Gly Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Tyr Tyr Gly Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ala Ser
115
<210> 97
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 97
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 98
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗体序列
<400> 98
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Arg Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Asp Gly Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115

Claims (49)

1.基于HTT肽的疫苗中的HTT蛋白的免疫原性肽，其用于治疗亨廷顿氏病或延迟其临床症状的发作,其中所述免疫原性肽选自：p7564(CPSDSSEIVLD，SEQ ID No.2)、p7543(GTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.3)、p7543a(DNQYLGLQIC；SEQ ID No.88)、衍生物p9394(KTDNQYLGLQIGKC；SEQ ID No.91)、p9395(GTDNQYLGLQIGKKC；SEQ ID No.92)、p9396(KTDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.93)、p9397(KDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.94)；p7543b(TDNQYLGLQIC；SEQ ID No.89)、p7543c(TDNQYLGLQIGC；SEQ ID No.90)、p8855(SDSSEIVLDGTDC，SEQ ID No.6)、p8858(EIVLDGTDNQYLC，SEQ ID No.7)、p8859(IVLDGTDNQYLGC，SEQ ID No.8)、p8860(VLDGTDNQYLGLC，SEQ ID No.9)、p8861(LDGTDNQYLGLQC，SEQ ID No.10)、p8862(DGTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.11)、p8869(CTDNQYLGLQIGQ，SEQ ID No.12)、p8868(CGTDNQYLGLQIG，SEQ ID No.13)、p8870(CDNQYLGLQIGQP，SEQ ID No.14)、p8871(CNQYLGLQIGQPQ，SEQ ID No.15)、p8864(TDNQYLGLQIGQC，SEQ ID No.17)、p8865(DNQYLGLQIGQPC，SEQ ID No.18)、p8854(PSDSSEIVLDGTC，SEQ ID No.20)、p8856(DSSEIVLDGTDNC，SEQ ID No.21)、p8857(SEIVLDGTDNQYC，SEQ ID No.22)、p8866(NQYLGLQIGQPQC，SEQ ID No.23)、p8867(QYLGLQIGQPQDC，SEQ ID No.24)、p7541(CSEIVLD，SEQ ID No.29)、p7552(CSSEIVLD，SEQID No.30)、p7562(CDSSEIVLD，SEQ ID No.31)、p7563(CSDSSEIVLD，SEQ ID No.32)、p7567(CEIVLD，SEQ ID No.33)、p7568(CIVLD，SEQ ID No.34)、p7605(CSEIVL，SEQ ID No.35)、p6776(CSEIVLDGTDNQYL，SEQ ID No.36)、p6777(CSDSSEIVLDGTDN，SEQ ID No.37)、p6776b(SEIVLDGTDNQYLC，SEQ ID No.38)、p7752(CAEIVLDGTDNQYL，SEQ ID No.39)、p7753(CSAIVLDGTDNQYL，SEQ ID No.40)、p7754(CSEAVLDGTDNQYL，SEQ ID No.41)、p7755(CSEIALDGTDNQYL，SEQ ID No.42)、p7756(CSEIVADGTDNQYL，SEQ ID No.43)、p7757(CSEIVLAGTDNQYL，SEQ ID No.44)、p7758(CSEIVLDATDNQYL，SEQ ID No.45)、p7745(CSEIVLDGADNQYL，SEQ ID No.46)、p7746(CSEIVLDGTANQYL，SEQ ID No.47)、p7747(CSEIVLDGTDAQYL，SEQ ID No.48)、p7748(CSEIVLDGTDNAYL，SEQ ID No.49)、p7749(CSEIVLDGTDNQAL，SEQ ID No.50)、和p7750(CSEIVLDGTDNQYA，SEQ ID No.51)，其中N-或C-末端半胱氨酸残基(C)可以存在或不存在或备选地提供在C-或N-末端。
2.根据权利要求1的免疫原性肽，其中所述免疫原性肽选自下组：p7564(CPSDSSEIVLD，SEQ ID No.2)、p7543(GTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.3)、p8855(SDSSEIVLDGTDC，SEQ IDNo.6)、p8858(EIVLDGTDNQYLC，SEQ ID No.7)、p8859(IVLDGTDNQYLGC，SEQ ID No.8)、p8860(VLDGTDNQYLGLC，SEQ ID No.9)、p8861(LDGTDNQYLGLQC，SEQ ID No.10)、p8862(DGTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.11)、p8869(CTDNQYLGLQIGQ，SEQ ID No.12)、p8868(CGTDNQYLGLQIG，SEQ ID No.13)、p8870(CDNQYLGLQIGQP，SEQ ID No.14)、p8871(CNQYLGLQIGQPQ，SEQ ID No.15)、p6772(CPQLPQPPPQAQPLLP，SEQ ID No.16)、p8864(TDNQYLGLQIGQC，SEQ ID No.17)、p8865(DNQYLGLQIGQPC，SEQ ID No.18)、p6776(CSEIVLDGTDNQYL，SEQ ID No.36)、和p6777(CSDSSEIVLDGTDN，SEQ ID No.37)、p8854(PSDSSEIVLDGTC，SEQ ID No.20)、p8856(DSSEIVLDGTDNC，SEQ ID No.21)、p8857(SEIVLDGTDNQYC，SEQ ID No.22)、p8866(NQYLGLQIGQPQC，SEQ ID No.23)、和p8867(QYLGLQIGQPQDC，SEQ ID No.24)，其中N-或C-末端半胱氨酸残基(C)可以存在或不存在或备选地提供在C-或N-末端。
3.根据权利要求2的免疫原性肽，其中所述免疫原性肽选自下组：p7564(CPSDSSEIVLD，SEQ ID No.2)、p7543(GTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.3)、p6776(CSEIVLDGTDNQYL，SEQ IDNo.36)、p6777(CSDSSEIVLDGTDN，SEQ ID No.37)；其中N-或C-末端半胱氨酸残基(C)可以存在或不存在或备选地提供在C-或N-末端。
4.用于治疗和/或预防亨廷顿氏病的基于肽的疫苗，其包含至少一种权利要求1的亨廷顿蛋白(HTT)蛋白的免疫原性肽。
5.根据权利要求4中的基于肽的疫苗，其进一步包括一种或多种佐剂。
6.根据权利要求5中的基于肽的疫苗，其特征在于所述至少一种免疫原性肽偶联至药学上可接受的载体。
7.根据权利要求6中的基于肽的疫苗，其中所述药学上可接受的载体是匙孔血蓝蛋白(keyhole Limpet Hemocyanin)(KLH)。
8.根据权利要求4或6中的基于肽的疫苗，其特征在于所述疫苗被配制用于静脉内、皮下、皮内或肌内施用。
9.根据权利要求4或6中的基于肽的疫苗，其特征在于所述疫苗与佐剂一起配制。
10.根据权利要求9中的基于肽的疫苗，其特征在于所述佐剂是氢氧化铝。
11.根据权利要求4或6中的基于肽的疫苗，其特征在于在所述疫苗中以0.1ng至10mg的量含有所述至少一种肽。
12.根据权利要求11的基于肽的疫苗，其特征在于在所述疫苗中以10ng至1mg的量含有所述至少一种肽。
13.根据权利要求11的基于肽的疫苗，其特征在于在所述疫苗中以100ng至100μg的量含有所述至少一种肽。
14.根据权利要求4或6中的基于肽的疫苗，其中所述HTT蛋白的所述至少一种免疫原性肽选自下组：p7543(GTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.3)，p7543a(DNQYLGLQIC；SEQ ID No.88)，p9394(KTDNQYLGLQIGKC；SEQ ID No.91)、p9395(GTDNQYLGLQIGKKC；SEQ ID No.92)、p9396(KTDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.93)、p9397(KDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.94)；p7543b(TDNQYLGLQIC；SEQ ID No.89)、p7543c(TDNQYLGLQIGC；SEQ ID No.90)，和p7564(CPSDSSEIVLD，SEQ ID No.2)，其中N-或C-末端半胱氨酸残基(C)可以存在或不存在或备选地提供在C-或N-末端。
15.根据权利要求4或6中的基于肽的疫苗，其特征在于其包含至少一种权利要求1的免疫原性肽。
16.药物制剂，其包含根据权利要求1的免疫原性肽。
17.根据权利要求16的药物制剂，其特征在于其用于在个体中引发免疫应答。
18.根据权利要求17的药物制剂，其特征在于所述个体是患有亨廷顿氏病的个体。
19.单克隆抗体，其具有能够结合p7543(SEQ ID No.3)序列中显示的HTT蛋白的肽的结合结构域，其特征在于所述单克隆抗体包含由GYTFTEYT(SEQ ID No.66)组成的重链可变区CDR1、由INPNNGGT(SEQ ID No.67)组成的重链可变区CDR2、由ASLDGRDY(SEQ ID No.68)组成的重链可变区CDR3、由QSLLNSRTRKNY(SEQ ID No.69)组成的轻链可变区CDR1、由WAS(SEQID No.70)组成的轻链可变区CDR2和由KQSYNLLT(SEQ ID No.71)组成的轻链可变区CDR3。
20.单克隆抗体，其具有能够结合p7564(SEQ ID No.2)序列中显示的HTT蛋白的肽的结合结构域，其特征在于所述单克隆抗体包含由GFTFNTYA(SEQ ID No.72)组成的重链可变区CDR1、由IRSKSNNYAT(SEQ ID No.73)组成的重链可变区CDR2、由VRHGEYGNPWFAY(SEQ IDNo.74)组成的重链可变区CDR3、由QSLVHSNGNTY(SEQ ID No.75)组成的轻链可变区CDR1、由KVS(SEQ ID No.76)组成的轻链可变区CDR2和由SQSTHVPYT(SEQ ID No.77)组成的轻链可变区CDR3。
21.根据权利要求19或20的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是人单克隆抗体、人源化单克隆抗体、双特异性单克隆抗体或嵌合单克隆抗体。
22.根据权利要求21的单克隆抗体，其用于药物组合物中，所述药物组合物用于亨廷顿氏病的预防和/或治疗。
23.基于HTT肽的疫苗中的HTT蛋白的免疫原性肽在制备用于治疗亨廷顿氏病或延迟其临床症状的发作的组合物中的用途，其中所述免疫原性肽选自下组：p7564(CPSDSSEIVLD，SEQ ID No.2)、p7543(GTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.3)、p7543a(DNQYLGLQIC；SEQ IDNo.88)、衍生物p9394(KTDNQYLGLQIGKC；SEQ ID No.91)、p9395(GTDNQYLGLQIGKKC；SEQ IDNo.92)、p9396(KTDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.93)、p9397(KDNQYLGLQIKKGC；SEQ IDNo.94)；p7543b(TDNQYLGLQIC；SEQ ID No.89)、p7543c(TDNQYLGLQIGC；SEQ ID No.90)、p8855(SDSSEIVLDGTDC，SEQ ID No.6)、p8858(EIVLDGTDNQYLC，SEQ ID No.7)、p8859(IVLDGTDNQYLGC，SEQ ID No.8)、p8860(VLDGTDNQYLGLC，SEQ ID No.9)、p8861(LDGTDNQYLGLQC，SEQ ID No.10)、p8862(DGTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.11)、p8869(CTDNQYLGLQIGQ，SEQ ID No.12)、p8868(CGTDNQYLGLQIG，SEQ ID No.13)、p8870(CDNQYLGLQIGQP，SEQ ID No.14)、p8871(CNQYLGLQIGQPQ，SEQ ID No.15)、p8864(TDNQYLGLQIGQC，SEQ ID No.17)、p8865(DNQYLGLQIGQPC，SEQ ID No.18)、p8854(PSDSSEIVLDGTC，SEQ ID No.20)、p8856(DSSEIVLDGTDNC，SEQ ID No.21)、p8857(SEIVLDGTDNQYC，SEQ ID No.22)、p8866(NQYLGLQIGQPQC，SEQ ID No.23)、p8867(QYLGLQIGQPQDC，SEQ ID No.24)、p7541(CSEIVLD，SEQ ID No.29)、p7552(CSSEIVLD，SEQID No.30)、p7562(CDSSEIVLD，SEQ ID No.31)、p7563(CSDSSEIVLD，SEQ ID No.32)、p7567(CEIVLD，SEQ ID No.33)、p7568(CIVLD，SEQ ID No.34)、p7605(CSEIVL，SEQ ID No.35)、p6776(CSEIVLDGTDNQYL，SEQ ID No.36)、p6777(CSDSSEIVLDGTDN，SEQ ID No.37)、p6776b(SEIVLDGTDNQYLC，SEQ ID No.38)、p7752(CAEIVLDGTDNQYL，SEQ ID No.39)、p7753(CSAIVLDGTDNQYL，SEQ ID No.40)、p7754(CSEAVLDGTDNQYL，SEQ ID No.41)、p7755(CSEIALDGTDNQYL，SEQ ID No.42)、p7756(CSEIVADGTDNQYL，SEQ ID No.43)、p7757(CSEIVLAGTDNQYL，SEQ ID No.44)、p7758(CSEIVLDATDNQYL，SEQ ID No.45)、p7745(CSEIVLDGADNQYL，SEQ ID No.46)、p7746(CSEIVLDGTANQYL，SEQ ID No.47)、p7747(CSEIVLDGTDAQYL，SEQ ID No.48)、p7748(CSEIVLDGTDNAYL，SEQ ID No.49)、p7749(CSEIVLDGTDNQAL，SEQ ID No.50)、和p7750(CSEIVLDGTDNQYA，SEQ ID No.51)；其中N-或C-末端半胱氨酸残基(C)可以存在或不存在或备选地提供在C-或N-末端。
24.基于HTT肽的疫苗中的HTT蛋白的免疫原性肽在制备用于治疗亨廷顿氏病或延迟其临床症状的发作的组合物中的用途，其中所述免疫原性肽选自下组：p7564(CPSDSSEIVLD，SEQ ID No.2)、p7543(GTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.3)、p8855(SDSSEIVLDGTDC，SEQ IDNo.6)、p8858(EIVLDGTDNQYLC，SEQ ID No.7)、p8859(IVLDGTDNQYLGC，SEQ ID No.8)、p8860(VLDGTDNQYLGLC，SEQ ID No.9)、p8861(LDGTDNQYLGLQC，SEQ ID No.10)、p8862(DGTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.11)、p8869(CTDNQYLGLQIGQ，SEQ ID No.12)、p8868(CGTDNQYLGLQIG，SEQ ID No.13)、p8870(CDNQYLGLQIGQP，SEQ ID No.14)、p8871(CNQYLGLQIGQPQ，SEQ ID No.15)、p6772(CPQLPQPPPQAQPLLP，SEQ ID No.16)、p8864(TDNQYLGLQIGQC，SEQ ID No.17)、p8865(DNQYLGLQIGQPC，SEQ ID No.18)、p6776(CSEIVLDGTDNQYL，SEQ ID No.36)、p6777(CSDSSEIVLDGTDN，SEQ ID No.37)、p8854(PSDSSEIVLDGTC，SEQ ID No.20)、p8856(DSSEIVLDGTDNC，SEQ ID No.21)、p8857(SEIVLDGTDNQYC，SEQ ID No.22)、p8866(NQYLGLQIGQPQC，SEQ ID No.23)、和p8867(QYLGLQIGQPQDC，SEQ ID No.24)；其中N-或C-末端半胱氨酸残基(C)可以存在或不存在或备选地提供在C-或N-末端。
25.基于HTT肽的疫苗中的HTT蛋白的免疫原性肽在制备用于治疗亨廷顿氏病或延迟其临床症状的发作的组合物中的用途，其中所述免疫原性肽选自下组：p7564(CPSDSSEIVLD，SEQ ID No.2)、p7543(GTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.3)、p6776(CSEIVLDGTDNQYL，SEQ IDNo.36)和p6777(CSDSSEIVLDGTDN，SEQ ID No.37)；其中N-或C-末端半胱氨酸残基(C)可以存在或不存在或备选地提供在C-或N-末端。
26.基于肽的疫苗在制备用于治疗和/或预防亨廷顿氏病的组合物中的用途，其中所述基于肽的疫苗包含至少一种权利要求1的亨廷顿蛋白(HTT)蛋白的免疫原性肽。
27.根据权利要求26的用途，其中所述基于肽的疫苗进一步包括一种或多种佐剂。
28.根据权利要求26的用途，其特征在于所述至少一种免疫原性肽偶联至药学上可接受的载体。
29.根据权利要求28的用途，其特征在于所述药学上可接受的载体是KLH。
30.根据权利要求26或28的用途，其特征在于所述疫苗被配制用于静脉内、皮下、皮内或肌内施用。
31.根据权利要求26或28的用途，其特征在于所述疫苗与佐剂一起配制。
32.根据权利要求31的用途，其特征在于所述佐剂是氢氧化铝。
33.根据权利要求26或28的用途，其特征在于在所述疫苗中以0.1ng至10mg的量含有所述至少一种肽。
34.根据权利要求33的用途，其特征在于在所述疫苗中以10ng至1mg的量含有所述至少一种肽。
35.根据权利要求33的用途，其特征在于在所述疫苗中以100ng至100μg的量含有所述至少一种肽。
36.根据权利要求26或28的用途，其中所述HTT蛋白的所述至少一种免疫原性肽选自下组：p7543(GTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.3)、p7543a(DNQYLGLQIC；SEQ ID No.88)，p9394(KTDNQYLGLQIGKC；SEQ ID No.91)、p9395(GTDNQYLGLQIGKKC；SEQ ID No.92)、p9396(KTDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.93)、p9397(KDNQYLGLQIKKGC；SEQ ID No.94)；p7543b(TDNQYLGLQIC；SEQ ID No.89)、p7543c(TDNQYLGLQIGC；SEQ ID No.90)，p7543(GTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.3)、p7543(GTDNQYLGLQIGC，SEQ ID No.3)和p7564(CPSDSSEIVLD，SEQ ID No.2)，其中N-或C-末端半胱氨酸残基(C)可以存在或不存在或备选地提供在C-或N-末端。
37.根据权利要求26或28的用途，其特征在于所述疫苗包含至少一种权利要求1的免疫原性肽。
38.药物制剂在制备用于在个体中引发免疫应答的组合物中的用途，其中所述药物制剂包含根据权利要求1的免疫原性肽。
39.根据权利要求38的用途，其中所述个体是患有亨廷顿氏病的个体。
40.单克隆抗体在制备用于治疗和/或预防亨廷顿氏病或延迟其临床症状的发作的药物组合物中的用途，其中所述单克隆抗体具有能够结合p7543(SEQ ID No.3)序列中显示的HTT蛋白的肽的结合结构域，其特征在于所述单克隆抗体包含由GYTFTEYT(SEQ ID No.66)组成的重链可变区CDR1、由INPNNGGT(SEQ ID No.67)组成的重链可变区CDR2、由ASLDGRDY(SEQ ID No.68)组成的重链可变区CDR3、由QSLLNSRTRKNY(SEQ ID No.69)组成的轻链可变区CDR1、由WAS(SEQ ID No.70)组成的轻链可变区CDR2和由KQSYNLLT(SEQ ID No.71)组成的轻链可变区CDR3。
41.单克隆抗体在制备用于治疗和/或预防亨廷顿氏病或延迟其临床症状的发作的药物组合物中的用途，其中所述单克隆抗体具有能够结合具有p7564(SEQ ID No.2)序列的HTT蛋白的肽的结合结构域，其特征在于所述单克隆抗体包含由GFTFNTYA(SEQ ID No.72)组成的重链可变区CDR1、由IRSKSNNYAT(SEQ ID No.73)组成的重链可变区CDR2、由VRHGEYGNPWFAY(SEQ ID No.74)组成的重链可变区CDR3、由QSLVHSNGNTY(SEQ ID No.75)组成的轻链可变区CDR1、由KVS(SEQ ID No.76)组成的轻链可变区CDR2和由SQSTHVPYT(SEQID No.77)组成的轻链可变区CDR3。
42.根据权利要求40或41中任一项的用途，其中所述单克隆抗体是人单克隆抗体、人源化单克隆抗体、双特异性单克隆抗体或嵌合单克隆抗体。
43.单独或组合的抗体M1D1或C6-17在制备组合物中的用途，所述组合物用于体外诊断哺乳动物中的亨廷顿氏病的方法，其中所述方法包括以下步骤：
-使用单独或组合的抗体M1D1或C6-17测定哺乳动物样品中野生型或突变的亨廷顿蛋白或其片段的水平；
-如果所述样品中的野生型或突变的亨廷顿蛋白的水平与遗传上未受亨廷顿氏病影响的健康个体的参考样品相比变化，则诊断亨廷顿氏病；
-其中所述抗体M1D1包含由GFTFNTYA(SEQ ID No.72)组成的重链可变区CDR1、由IRSKSNNYAT(SEQ ID No.73)组成的重链可变区CDR2、由VRHGEYGNPWFAY(SEQ ID No.74)组成的重链可变区CDR3、由QSLVHSNGNTY(SEQ ID No.75)组成的轻链可变区CDR1、由KVS(SEQID No.76)组成的轻链可变区CDR2和由SQSTHVPYT(SEQ ID No.77)组成的轻链可变区CDR3；
其中所述抗体C6-17包含由GYTFTEYT(SEQ ID No.66)组成的重链可变区CDR1、由INPNNGGT(SEQ ID No.67)组成的重链可变区CDR2、由ASLDGRDY(SEQ ID No.68)组成的重链可变区CDR3、由QSLLNSRTRKNY(SEQ ID No.69)组成的轻链可变区CDR1、由WAS(SEQ IDNo.70)组成的轻链可变区CDR2和由KQSYNLLT(SEQ ID No.71)组成的轻链可变区CDR3。
44.根据权利要求43的用途，其中所述方法进一步包括监测亨廷顿蛋白降低治疗策略在预表现或表现亨廷顿氏病患者样品中的效果。
45.根据权利要求44的用途，其中所述治疗策略选自主动或被动疫苗接种。
46.根据权利要求44或45的用途，其中所述治疗策略是亨廷顿蛋白降低疗法。
47.单独或组合的抗体M1D1或C6-17在制备组合物中的用途，所述组合物用于在体外测定哺乳动物中的亨廷顿氏病的阶段的方法，其中所述方法包括以下步骤：
-使用单独或组合的抗体M1D1或C6-17测定哺乳动物样品中野生型或突变的亨廷顿蛋白或其片段的水平；
-测定亨廷顿氏病的阶段；
-测定亨廷顿蛋白降低疗法对HTT水平的影响；
其中所述抗体M1D1包含由GFTFNTYA(SEQ ID No.72)组成的重链可变区CDR1、由IRSKSNNYAT(SEQ ID No.73)组成的重链可变区CDR2、由VRHGEYGNPWFAY(SEQ ID No.74)组成的重链可变区CDR3、由QSLVHSNGNTY(SEQ ID No.75)组成的轻链可变区CDR1、由KVS(SEQID No.76)组成的轻链可变区CDR2和由SQSTHVPYT(SEQ ID No.77)组成的轻链可变区CDR3；
其中所述抗体C6-17包含由GYTFTEYT(SEQ ID No.66)组成的重链可变区CDR1、由INPNNGGT(SEQ ID No.67)组成的重链可变区CDR2、由ASLDGRDY(SEQ ID No.68)组成的重链可变区CDR3、由QSLLNSRTRKNY(SEQ ID No.69)组成的轻链可变区CDR1、由WAS(SEQ IDNo.70)组成的轻链可变区CDR2和由KQSYNLLT(SEQ ID No.71)组成的轻链可变区CDR3。
48.单独或组合的抗体M1D1或C6-17在制备组合物中的用途，所述组合物用于监测亨廷顿氏病的进展或监测哺乳动物中亨廷顿氏病治疗有效性的方法，其中所述方法包括以下步骤：
-单独或组合使用抗体M1D1和C6-17测定哺乳动物样品中突变的HTT的水平，和
-通过将突变的亨廷顿蛋白或其片段的获得的水平与第一次测量中获得的突变的亨廷顿蛋白或其片段的水平比较，测定亨廷顿氏病的进展或亨廷顿氏病的治疗有效性，其中HTT水平的降低指示成功的治疗；
其中所述抗体M1D1包含由GFTFNTYA(SEQ ID No.72)组成的重链可变区CDR1、由IRSKSNNYAT(SEQ ID No.73)组成的重链可变区CDR2、由VRHGEYGNPWFAY(SEQ ID No.74)组成的重链可变区CDR3、由QSLVHSNGNTY(SEQ ID No.75)组成的轻链可变区CDR1、由KVS(SEQID No.76)组成的轻链可变区CDR2和由SQSTHVPYT(SEQ ID No.77)组成的轻链可变区CDR3；
其中所述抗体C6-17包含由GYTFTEYT(SEQ ID No.66)组成的重链可变区CDR1、由INPNNGGT(SEQ ID No.67)组成的重链可变区CDR2、由ASLDGRDY(SEQ ID No.68)组成的重链可变区CDR3、由QSLLNSRTRKNY(SEQ ID No.69)组成的轻链可变区CDR1、由WAS(SEQ IDNo.70)组成的轻链可变区CDR2和由KQSYNLLT(SEQ ID No.71)组成的轻链可变区CDR3。
49.根据权利要求48的用途，其中所述第一次测量在诊断疾病相关的症状时进行。
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CA (1) CA2954687A1 (zh)
NZ (1) NZ728041A (zh)
RU (2) RU2742493C2 (zh)
WO (1) WO2016005545A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017522886A (ja) * 2014-07-29 2017-08-17 ニューリミューン ホールディング エイジー ヒト由来抗ハンチンチン（ｈｔｔ）抗体及びその使用
CN110156890B (zh) * 2019-04-09 2021-02-02 苏州大学 Semaphorin7A单克隆抗体及其在制备用于治疗炎症疾病药物方面的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102171573A (zh) * 2008-08-04 2011-08-31 诺瓦提斯公司 用于polyq蛋白的生物测定试验

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992009690A2 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
EP1204674A4 (en) * 1999-07-27 2005-06-01 Abgenix Inc METHODS AND COMPOUNDS FOR PREVENTING POLYPEPTIDE COLLECTIONS ASSOCIATED WITH NEUROLOGICAL DISORDERS
WO2001044463A1 (en) 1999-12-15 2001-06-21 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
ES2637801T3 (es) 2000-04-11 2017-10-17 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
ES2295228T3 (es) 2000-11-30 2008-04-16 Medarex, Inc. Roedores transcromosomicos transgenicos para la preparacion de anticuerpos humanos.
WO2004006955A1 (en) 2001-07-12 2004-01-22 Jefferson Foote Super humanized antibodies
WO2003045128A2 (en) * 2001-11-21 2003-06-05 New York University SYNTHETIC IMMUNOGENIC BUT NON-DEPOSIT-FORMING POLYPEPTIDES AND PEPTIDES HOMOLOGOUS TO AMYLOID β, PRION PROTEIN, AMYLIN, α-SYNUCLEIN, OR POLYGLUTAMINE REPEATS FOR INDUCTION OF AN IMMUNE RESPONSE THERETO
US7375194B2 (en) * 2002-01-28 2008-05-20 California Institute Of Technology Antibodies that bind to an epitope on the Huntington's disease protein
AU2003239966B9 (en) 2002-06-03 2010-08-26 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
AT413336B (de) 2003-09-12 2006-02-15 Mattner Frank Dr Apherese-vorrichtung
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
WO2007056441A2 (en) 2005-11-07 2007-05-18 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
AU2007249408A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US9284366B2 (en) * 2006-11-02 2016-03-15 The General Hospital Corporation Anti-acetylated huntingtin antibodies and uses therof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
AT506535B1 (de) * 2008-02-22 2010-04-15 Affiris Forschungs & Entwicklungs Gmbh Vaccine enthaltend alpha-synuclein-mimotope auf basis von peptiden
CA2759118A1 (en) * 2008-04-17 2009-10-22 Declion Pharmaceuticals, Inc. Design and synthesis of directed sequence polymer compositions and antibodies thereof for the treatment of protein conformational disorders
US8518942B2 (en) * 2008-08-06 2013-08-27 Buck Institute For Research On Aging Caspase inhibitors and uses thereof
AU2009325950B2 (en) 2008-12-09 2013-03-07 Pfizer Vaccines Llc IgE CH3 peptide vaccine
EP2414391B1 (en) 2009-04-02 2018-11-28 Roche Glycart AG Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
WO2010115589A1 (en) 2009-04-07 2010-10-14 Roche Glycart Ag Trivalent, bispecific antibodies
US20110045603A1 (en) 2009-04-21 2011-02-24 Cell Signaling Technology, Inc. Serine, Threonine, and Tyrosine Phosphorylation Sites
AU2010252284A1 (en) 2009-05-27 2011-11-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
WO2012020124A1 (en) * 2010-08-12 2012-02-16 Ac Immune S.A. Vaccine engineering
EP2468295A1 (en) * 2010-12-21 2012-06-27 Affiris AG Vaccines based on peptides of the complement protein C5a
WO2012140376A1 (fr) * 2011-04-12 2012-10-18 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Peptides therapeutiques et leur utilisation contre la choree de huntington
EP2666785A1 (en) * 2012-05-23 2013-11-27 Affiris AG Complement component C5a-based vaccine
US9598478B2 (en) * 2012-10-09 2017-03-21 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Peptides for the treatment of neurodegenerative diseases
CN105531287B (zh) 2013-05-29 2020-01-21 维拜昂公司 改变亨廷顿蛋白突变体降解的单链胞内抗体

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102171573A (zh) * 2008-08-04 2011-08-31 诺瓦提斯公司 用于polyq蛋白的生物测定试验

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Jan Ko,et al..New anti-huntingtin monoclonal antibodies:Implications for huntingtin conformation and its binding proteins.《Brain Research Bulletin》.2001,第56卷(第3/4期),319–329. *
New anti-huntingtin monoclonal antibodies:Implications for huntingtin conformation and its binding proteins;Jan Ko,et al.;《Brain Research Bulletin》;20011101;第56卷(第3/4期);第319–329页全部 *

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