JP6876601B2 - ハンチントン病の予防および／または処置における使用のための物質および方法 - Google Patents

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Description

本発明は、ハンチントン病の処置および予防における使用のための薬剤および方法を提供することに関する。
ハンチントン病は、常染色体優性遺伝形式の稀な単一遺伝子疾患である。それは、ヒト第４染色体上のハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子のコーディング領域内のＣＡＧトリヌクレオチド反復配列の伸長により発症する（Novak ＆ Tabrizi, 2011）。原因となる伸長したＣＡＧ反復配列は、複製過程における遺伝子の不安定性およびＲＮＡスプライシングの変化と関係している。しかしながら、最も重要なのは、コードされたタンパク質が、タンパク質のＮ末端部分の伸長されたポリグルタミン（ｐｏｌｙＱ）配列により構造が変化し、構造的に変化した、かつ変異したハンチンチンタンパク質およびそのタンパク質フラグメントが、時間の経過と共に、脳および他の組織または細胞内に蓄積することである。この過程は、例えばアルツハイマー疾患またはパーキンソン病または多系統萎縮症のような他の神経変性タンパク質症（proteinopathy）と似ており、ここで、共通因子（common denominator）は、タンパク質分解産物を組み合わせた凝集体形成およびタンパク質線維形成である。ハンチントン病において、病理学的特徴は、主に、線条体および大脳皮質における凝集および分解ハンチンチンタンパク質の蓄積を含む、進行性神経変性である。
ハンチントン病の臨床症状は、気分の変化や認知の問題から始まり、続いて不安定な歩行や運動障害へ予測可能に少しずつ進行する。身体能力は、時間とともに、精神的能力の減退と精神および行動上の問題と合わせて、明白な協調運動障害へと悪化する。平均余命は、最初の臨床症状後、約２０年である。症状は、大きく変化し得て、発症年齢は、変異ハンチンチンの原因としての働きを裏付ける変異型ハンチンチン遺伝子中のＣＡＧ反復配列の数と逆相関することが報告されている。
ハンチントン病の処置または予防法はない。症状を制御するために、患者のフルタイムのケアが、疾患の後期ステージで必要とされており、患者と患者の社会環境に対する負担はかなりのものである。薬学的および非薬物治療などの対症療法は、症状のいくつかを緩和することができる。
ハンチントン病の病因および遺伝的原因についての現在の理解では、変異型ハンチンチンは、疾患の改善された標的化戦略のための主な標的と見なされているが、従来法ではそうは見なされていなかった（Yu et al., 2014）。動物モデルからの臨床遺伝学的証拠および機能的証拠に基づいて（Bard et al., 2014）、ハンチンチンを減少させる戦略は、そのような概念に関連する分子暴露にもかかわらず、最も重要な方法と見なされている（Zheng ＆ Diamond, 2012）。現在の戦略は、一般的に、脳内における影響を受けた神経内の標的部位への治療薬の送達方法の欠如によって妨げられている。このことは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡもしくはＺＦＰのウイルス送達を用いる遺伝子治療（遺伝子レベルで標的化する）またはＳｉｒＴ１もしくはｍＴＯＲ阻害などの間接的な小分子に基づく方法を含む、現在開発中のＤＮＡまたはｍＲＮＡを標的とするアプローチにとって重要である（Davidson, 2012）。別のアプローチは、脳内において細胞内ハンチンチンを標的とするウイルスベクターが提供する細胞内発現抗体(イントラボディ)を用いることからなる（Butler et al., 2012）。前臨床モデルで証明されたその機能性にもかかわらず、これらのアプローチのほとんどは、標的部位への主に送達の課題に直面している。加えて、例えばｓｃＦｖベースのイントラボディなどの“外来”大分子構造物（Messer ＆ Joshi, 2013）は、宿主に新しいエピトープを構成する可能性があり、それ故に、治療薬に対する望ましくない体液性免疫応答または“外来”タンパク質を発現および提示する細胞に対する望ましくない自己反応性Ｔ細胞応答を誘導するリスクがある。
ＷＯ２０１２／１４０３７６Ａ１は、治療用ペプチドｐｅｐ４およびｐｅｐ４２を開示しているが、両ペプチドは、ＨＴＴのｃ６切断部位まで伸長されていない。これらのペプチドは、ＨＴＴ凝集阻害剤としての使用が提案され、ワクチン接種または免疫学的適用には何ら関係しない。ＷＯ２０１０／０１５５９２Ａ２は、診断の定量化の目的のためのモノクローナル抗体の作製を開示している。これらのモノクローナル抗体（４Ｃ９）のうち１つは、変異させたポリＱタンパク質の検出／定量アッセイを目的として作製されたが、治療目的ではない。抗体は、ＨＴＴタンパク質配列に由来するアミノ酸６５から８４を有するペプチドを用いて作製された。Koら(Brain Res. Bull. 56 (2001): 319−329）は、ＨＴＴモノクローナル抗体であって、主に、ＨＴＴのポリＱドメインに結合する抗体を開示している。Persichettiら(Mol. Med. 1 (1995): 374−383）は、抗体誘導ペプチドＨＰ１およびＨＰ１２を開示している。Miller et al. (Mol. Ther. 7(2003), 572-579)は、ＧＦＰタンパク質に融合した最初の１７ＡＡと１０３のグルタミン残基をコードするＤＮＡを用いるＤＮＡワクチン接種を開示している。
ＵＳ２００７／００２６０２９Ａ１は、アルツハイマー病を処置および予防するためのアフェレシス装置を開示している。Weissら（Anal. Biochem. 395(2009): 8−15）は、動物およびヒト組織における変異ＨＴＴの検出法を開示している。Butlerら(Prog. Neurobiol. 97(2011): 190−204）は、動物モデルにおけるＨＤのｓｃＦｖベースのイントラボディ療法を開示している。ＵＳ２０１０／０２３３１８０Ａ１は、ＨＴＴのポリＰ領域に結合する抗体を開示している。Chenら(Chem. Biol. 18(2011): 1113−1125）は、ｐｏｌｙＱに直接結合するが、ワクチン接種のためではない、ＨＤ治療のための、伸長ポリＱペプチドを示唆している。
ＷＯ２０１２／１４０３７６Ａ１ 米国特許出願第２００７／００２６０２９号 米国特許出願第２０１０／０２３３１８０号
Bard et al., 2014, Journal of Biomolecular Screening, Volume 19(2), 191−204 Butler et al., 2012, Progress in Neurobiology, Volume 97(2): 190−204 Davidson, 2012, Molecular Therapy, Volume 20(10): 1838 Ellrichmann et al., 2013, Clin Dev Immunol., 2013; 2013: 541259 Graham et al., 2010, J Neurosci., Volume 30(45):15019−29 Ko et al., 2001, Brain Research Bulletin, Volume 56(3/4): 319−329 Liu, 2007, Journal of the American Society for Mass Spectrometry. Volume 18(7):1249−64 Mandler et al.; Acta Neuropathologica 127 (2014): 861−879 Messer ＆ Joshi, 2013, Neurotherapeutics, Volume 10: 447−458 Modregger et al., 2002, Human Molecular Genetics, Volume 11(21):2547−58 Novak ＆ Tabrizi, 2011, International Review of Neurobiology, Volume 98: 297−323 O'Hagan ＆ Valiante, 2003, Nature Reviews Drug Discovery, Volume 2(9): 727−35 Singh ＆ O'Hagan, 1999, Nature Biotechnology, Volume 17(11): 1075−81 Southwell et al., 2011, PloS ONE, Volume 6(1): e16676 Stadler et al.; Angewandte Chemie International Edition England 2008; Vol 47(37):7132−5 Tezel et al., 2012, Investigative Ophthalmology ＆ Visual Science Volume 53(13): 8222−31 Trauger et al., 2014, Brain, Volume 137(3):819−33 Warby et al., 2008, Human Molecular Genetics, Volume 17(15): 2390−2404 Weiss et al., Analytical Biochemistry 2009; Vol 395(1):8−15 Weiss et al., 2012, The Journal of Clinical Investigation, Volume 122(10): 3731−3736 Weiss et al. 2014, 9th Annual Huntington's Disease Therapeutics Conference (CHDI); Palm Springs USA, Abstract. Wong et al. 2014; 9th Annual Huntington's Disease Therapeutics Conference (CHDI); Palm Springs USA, Abstract. Yu et al., 2014, Trends in Pharmacological Sciences, Volume 35(2): 53−62 Zhang et al.; Current Protocols in Immunology 2008; Chapter: Unit-14.1 Zheng ＆ Diamond, 2012, Progress in Molecular Biology and Translational Science, Volume 107: 189−214
ハンチントン病の別の治療法を提供するために、同様の手段でハンチンチンを標的とすることができる能動ワクチンおよび受動ワクチン（例えば、抗原および抗体）を本発明により提供する。ハンチントン病においては、症状が、この疾患の全身的性質を示す、免疫系、末梢組織、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）および代謝系を含む全身的変化を伴うという意識が高まっている。一例として、病理学的なハンチンチン蓄積はＣＮＳに限定されるものではなく、末梢血細胞でも検出され得る（Weissら、2012）。初代ヒトマクロファージ／単球におけるハンチンチンの発現の低下により、自然免疫系の障害は、ハンチンチンを標的とするＲＮＡ干渉により部分的に逆転できる（Traugerら、2014）。
血液細胞内のハンチンチンの検出の他に、可溶性ハンチンチンまたはハンチンチンフラグメントが、偶然、健常ドナーのヒト血漿プロテオームで検出され（Liu et al 2007）、またはこれまでハンチントン病に関連ないとされていた緑内障患者の血漿中でＥＬＩＳＡにより検出された（Tezel et al 2012）。ハンチントン病における免疫系の重要な役割は認識されていたが（Ellrichmann et al., 2013）、細胞外ハンチンチンの可能性のある原因となる働きはほとんど無視されてきた。近年、血漿およびＣＳＦハンチンチンは、単に、疾患の進行をモニタリングするための潜在的バイオマーカーとして示唆された（Weiss et al., 2014）。可能性のある病因の標的化において、疾患を進行させる細胞外ハンチンチンタンパク質は、これまで治療標的とは考えられておらず、能動的に誘導されたまたは受動的に投与された抗体が治療的利益をもたらし得るかどうかは示されていなかった。
本発明は、ハンチントン病の新たな治療戦略、とりわけ症状の単なる制御を超える戦略を提供することを目的とする。ハンチントン病に関連する症状の発症を予防または遅延させるための手段を提供することもまた、別の目的である。
従って、本発明は、ハンチントン病の処置のためまたはその臨床症状の発症を遅延させるためのペプチドベースのワクチンおよび抗体を提供する。従って、本発明は、治療標的としてＨＴＴタンパク質に基づく全く新しい治療概念を提供する。本発明は、ＨＴＴペプチドベースの能動免疫化および／または抗体ベースの受動免疫化のいずれかを単独で、または組み合わせて適用することができる２つの改変型戦略を含む“抗体ベースのＨＴＴ低下戦略”を提供する。両方の戦略は、治療標的であるＨＴＴタンパク質に関して同等であるとみなすことができる。両方の戦略はまた、病原性ＨＴＴに対抗する有効成分が、常に、最終的に、抗体（能動的に作成された抗ＨＴＴ抗体または受動的に投与された抗体のいずれか）であるため、同じ（すなわち、基本的な相違のない）治療原理および作用様式でで起用される。これは、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いる能動免疫化試験および食作用試験により以下の本発明の実施例部分に既に示されており、同じ最終作用様式を明らかに証明している。本発明の両方の治療戦略は、先行技術に開示されていない。ＨＴＴ抗体は、目下、科学的目的およびサンプル中のＨＴＴを検出するためにのみ用いられている。
本発明のワクチン接種および受動的免疫化は、ハンチントン病の治療における全く新しいアプローチであり、本発明により顕著に効果的であることが示されている。本発明で供される免疫血清およびモノクローナル抗体は、タンパク質の機能および病理において異なる役割を有することが以前に示されているハンチンチンタンパク質の部分を特異的に認識する。特に、活性ワクチンは、既報のハンチンチンタンパク質のアミノ酸位置５８６のプロテアーゼ切断部位の周りの所定のエピトープを標的とする抗体を誘導する。以下では、この病因学的／機能的に重要な切断領域は、“カスパーゼ領域５８６”と言う。Graham et al., 2006は、変異型ヒトハンチンチン導入遺伝子を保有するマウスにおける表現型を阻害する遺伝子的手段によってプロテアーゼ切断を阻止することを明らかにした。他のプロテアーゼが、インビボでこの部位での切断に関与し得ることも示されている（Wong et al. 2014）。カスパーゼ切断は細胞内過程であるため、この領域を標的とするワクチン接種戦略は、これまでに考慮されていなかったか、実証されていない。加えて、活性ワクチンは、標的タンパク質のいわゆるプロリンに富む領域内の所定のエピトープを標的とする抗体を誘導する。
本発明で初めて、ハンチントン病を治療するために能動的または受動的ワクチン接種により血漿ハンチンチンを標的とすることが提案された。これまで、（細胞外）血漿ＨＴＴは、この疾患を処置するための標的として考慮されていなかった。さらに、作用機序モードは、インビトロでの食作用アッセイによって、ならびにワクチン接種を受けた動物におけるＨＴＴレベルのインビボでの低下および血漿ＨＴＴ標的化がヒト患者にも有益であることを示す説得力のあるＰ．Ｏ．Ｃ．（概念実証）を提供する動物モデルにおける表現型効果によって、本発明により当然に（ただし、本発明をそのような機序に限定されることなく）提供される。
さらに、標的特異的免疫応答を供する特異的標的化領域およびそれに由来するペプチドは、本発明で提供され、それは、とりわけヒト個体における好適な抗体応答を惹起するための、本発明の免疫応答を惹起する医薬組成物に製剤化される。本発明の過程において、そのような免疫応答を惹起するための最も関連のあるペプチドのコアエピトープが定義されている。これらのコアエピトープ（対応するワクチン接種ペプチドのサブフラグメントに対応する）の使用は、本発明の免疫原性組成物およびワクチンの中心である。従って、特異的免疫応答を惹起するために本発明で（とりわけ、ワクチンとして）用いるペプチドは、これらのコアエピトープから構成されるか、またはそれを含み、インビボで単独または組み合わせて投与され得る。実施例部分において、本発明のそのようなペプチドは、信頼できる、かつ認可されたトランスジェニックマウスモデルにおいて有益であることがすでに示されている。さらに、ＨＴＴのカスパーゼ領域５８６に由来するペプチドもまた提供され、それは、免疫原性組成物として同様に使用され、また例えばカスパーゼ６または他のプロテアーゼなどのプロテアーゼ切断を阻害する抗体（ＡＢ）を提供および誘導するためにも使用される（Wong et al. 2014）。本発明のペプチドはまた、ハンチントン病の診断および治療において、とりわけ受動的ワクチン接種のために（単独で、または能動的ワクチン接種と同様の組み合わせで）、バイオマーカーの評価／発見および（コンパニオン）診断におけるＨＴＴレベルの決定のためのツールとして、カスパーゼ６阻害アッセイ（カスパーゼ領域５８６でカスパーゼ切断を阻害するもの）のためのプローブとしてなどにも有用である、種々のモノクローナル抗体（ｍＡＢ）を作製するためにも使用される。
本明細書で用いる“ハンチンチン”、“ハンチンチンタンパク質”または“ＨＴＴ”は、ハンチンチン遺伝子の発現産物を意味する。タンパク質の詳細は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ データベース（２０１４年５月１４日に最終更新された、バージョン１４８）中のＰ４２８５８（HD＿HUMAN）で利用可能である（本明細書中に援用する）。ＨＴＴのアミノ酸位置１８で始まるポリＱ領域における変化のために、カスパーゼ切断部位は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースエントリーにてアミノ酸５８４と５８５の間であると言われる。科学文献および本明細書では、カスパーゼ切断部位は、アミノ酸残基５８６と５８７の間（すなわち、“ＶＬＤ”の後、“ＧＴＤ”の前、すなわち、ＤとＧの間）であると言われる。従って、本発明の“Ｃ６切断領域”または“Ｃ６切断領域５８６”は、Ｐ４２８５８（ＨＤ＿ヒト）ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースエントリ中の位置５８４のアミノ酸に相当する。
本発明のワクチンは、ＰＲＲドメイン（プロリンに富む領域：Ｐｒｏｌｉｎｅ−Ｒｉｃｈ Ｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれる、ハンチンチンの、第二の機能的に定義された領域をさらに標的とする。この領域は、これまで、例えばＰＡＣＳＩＮ１（Modregger et al., 2002）などとの細胞内タンパク質相互作用に関与することが示され、細胞内環境の還元条件に抵抗性の一本鎖Ｆｖフラグメント（Southwell et al., 2011）を用いて潜在的イントラボディ標的化領域として評価されている。
本発明の一態様において、本発明のペプチドワクチンは、例えば実施例１に示す通り、特定の抗ハンチンチン免疫応答を誘導し、レシピエントにおいて（凝集した）ハンチンチンまたはそのフラグメントの食作用を媒介して、例えば実施例３、図９および実施例８に示すような治療効果を提供することができ、このことは、従来技術における何らかの抗体またはワクチンに関連する方法によるハンチントン病の治療においては示されていなかった。本発明の別の態様において、本発明の抗体は、作製されたモノクローナル抗体が、例えば実施例１、４および５に示す通り、同じペプチドに由来し、同じ標的を認識するという事実に基づいて、能動免疫アプローチと同様に、ハンチンチンタンパク質に対する受動免疫のために使用することができる。
さらに、本発明は、薬物選択のためのその抗体の使用、ならびにハンチントン病の発症を診断およびモニタリングする方法も開示する。
本発明は、ハンチンチン由来ペプチドを含む免疫原性組成物に関し、ここで、該ペプチドは、免疫原性形態、すなわち、組成物が投与されるヒト個体において免疫応答を誘発するような形態（ヒト個体において産生されるペプチドに対する抗体の形態）で提供される。好ましくは、ペプチドは、担体、好ましくはタンパク質担体に結合されているか、または、該ペプチドを免疫原性形態で提供するために、懸濁液中、とりわけ水中油型懸濁液中に提供される。従って、本発明の“ワクチン”組成物は、 “免疫原性組成物” 、すなわち、組成物が適用されるヒト個体において免疫応答を誘発する組成物と見なすこともできる。しかしながら、ヒト個体において免疫応答を誘発する能力は、集団内で顕著に変化し得ることが知られているため、本発明の目的のためには、所定の集団の個体の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、とりわけ少なくとも５０％に、本発明の免疫原性組成物の送達後の免疫反応が検出可能である、例えば、送達されたペプチドに特異的な抗体が、個体の免疫系によって形成される場合、“免疫原性組成物”と言われる。
本発明は、好ましくはハンチントン病による症状に対するワクチン接種における使用、または該疾患の発症を遅延させるための使用のための、ｐ６７７３（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ、配列番号１）、ｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）、ｐ７５４３ａ（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８８）、とりわけ誘導体ｐ９３９４（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＣ；配列番号９１）、ｐ９３９５（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＫＣ；配列番号９２）、ｐ９３９６（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９３）、ｐ９３９７（ＫＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９４）；ｐ７５４３ｂ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８９）、ｐ７５４３ｃ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ；配列番号９０）、ｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、およびｐ８３４６（ＣＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ、配列番号５）を含む、ＨＴＴタンパク質の免疫原性ペプチドを開示する。これらの配列中の“Ｃ”残基は、通常、リンカーとして用いられ（および、導入され）る。Ｎ末端またはＣ末端におけるこのシステインリンカー（任意の他のリンカーとして、例えば−ＧＣ、−ＧＧＣ、−ＫＣ、−ＫＣＣ、−ＫＣＣ、−ＫＫＣ、−ＫＫＧ、−ＫＣＧ、−ＫＧＣ、−ＫＫＧＣ、−ＫＫＣＧなど（およびそれらのＮ末端変異体、例えばＣＧ−、ＣＧＧ−など）または例えばペプチドｐ６７７５もしくはｐ６７６８、ｐ９３９４、ｐ９３９５、ｐ９３９６もしくはｐ９３９７のそれぞれに使用されるようなスペーサーとしての、例えば、ベータ−アラニンまたはリシンなどのアミノ酸とシステインとの同様の組み合わせなど、あるいは免疫学的特性を妨げることなく、リンカーもしくはスペーサー機能または改善されたペプチド溶解度を提供する他の化学的部分として）は、存在するか、存在しないか、またはペプチドのＣ末端もしくはＮ末端のいずれか（すなわち、ペプチド鎖の何れかの末端）に提供されてよい。リンカーペプチドと溶解度向上剤とのかかる組み合わせは、例えばリシン誘導体ｐ９３９４−ｐ９３９７に提供されている。他の態様において、リンカーは、Ｎ末端またはＣ末端以外の他のアミノ酸位置、例えばセリン、リシン、アルギニン、チロシン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミン酸、アスパラギンまたはグルタミン、ヒスチジン、メチオニンなどの官能基を有するアミノ酸に提供されてもよい（とりわけ、実質的に改善された実用的な機能的特性を有する、誘導体ｐ９３９４（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＣ；配列番号９１）、ｐ９３９５（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＫＣ；配列番号９２）、ｐ９３９６（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９３）、ｐ９３９７（ＫＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９４））；しかしながら、かかる態様において、治療は、ペプチドの免疫学的特性がそのような結合によって顕著に妨害されないように注意しなければならない（定義されたサイズ変動の可能性については、例えばＵＳ２０１０／０１５８９３３Ａ１を参照のこと）。
本発明は、ＰＲＲおよびｃ６領域に由来するペプチドを開示している。本発明のペプチドは、以下のいくつかの共通の特徴を反映する顕著に有益な技術的関係を有する：（１）本発明の全てのＰＲＲ−およびＣ６−由来のペプチドは、特定の免疫原性を共有する；それらのエピトープは、特に、アクセス可能である（例えば、実施例１に示す通り、Ｎ末端またはポリＱ領域に由来するペプチドとは対照的に）；特に、それらのエピトープの標的化は、以下の実施例部分に記載のインビボ例での機能に示されるように、ＨＴＴターゲティングにおける治療効果の達成に関連性が高い。（２）本発明のペプチドは、プロテアーゼのアクセシビリティまたはタンパク質−タンパク質相互作用などの構造的／機能的な関係性が実証されている、ＨＴＴの複数領域にマッピングされる。（３）最も重要なことは、これらの２つのエピトープのコンビナトリアル標的化は、（単一のエピトープの使用とは対照的に）効率的な治療効果を提供する。
これに関連して、全てのＨＴＴ由来のペプチドがＨＴＴの処置に使用できるのではないことが特記される。これは、以下の実施例部分にも示されている。実際に、あるペプチドは、他のものよりも免疫原性である。さらに、特定のペプチドの組合せ（例えば、血漿クリアランスおよび運動効果に関して、ＰＲＲ−およびＣ６−領域ペプチドの組み合わせ）は、１つまたは複数のハンチンチンエピトープの特異的認識による増強された食作用に起因する可能性が最も高いより強い有効性を示す。本発明はまた、ＨＴＴの処置のためのペプチドの有利な組み合わせを提供する。既に記載の通り、本発明では、（治療の原則として）細胞外ＨＴＴを標的とする治療用ワクチンが提供される。ＨＴＴは常に細胞内で凝集するタンパク質として公知であるため、このことのみで、既に完全に新規な戦略である。
本発明のペプチドおよび本発明のワクチン標的化領域は、該領域／ペプチドの（１）アクセシビリティ、および（２）免疫原性により、定義されている。加えて、ペプチドの任意の組み合わせ（以下のインビボでの実施例に示す通り）は、増強したＨＴＴクリアランスおよび表現型の（運動および組織学的な）変化を提供する。これらの変化は、実施例に示す通り、抗ハンチンチン抗体およびＦｃ受容体介在性食作用により説明することができる。Ｆｃ受容体介在性の食作用は、２つまたは２以上の単一エピトープに対してＨＴＴを標的化する、より高い有効性を説明する抗原−抗体複合体の多価性を必要とする：複数のＦｃ部分を提示する抗原／抗体複合体は、１つの単一抗体によって結合された単一のＨＴＴ分子よりも食作用によって排除される可能性が高い。
このことは、先行技術には開示も示唆もされていなかった。例えば、ＷＯ２０１２／１４０３７６Ａ１に記載される治療用ペプチドｐｅｐ４およびｐｅｐ４２、またはMillerら (2003)に記載されるＨＴＴのＮ末端に由来するペプチドは、本発明のペプチドとは異なるＨＴＴ領域に由来する。さらにより重要なことには、例えばＷＯ２０１２／１４０３７６Ａ１に記載のこれらのペプチドは、例えばワクチンなどの何らかの治療目的のために（すなわち、生体内でのＢ細胞免疫応答を誘導するために）意図されたり、または使用されてはいない。その代わり、ＷＯ２０１２／１４０３７６Ａ１は、凝集の阻害（すなわち、ＨＴＴまたはそのフラグメントとの直接的な干渉による）に使用することができるペプチドを記載しており、それは、ワクチンに必要とされるような免疫応答の誘導には関与しない。ＷＯ２０１０／０１５５９２Ａ２に記載の抗体は、ＦＲＥＴアッセイまたは他のインビトロの分析手段による、ＨＴＴ（またはその凝集体もしくはフラグメント）の検出のためのプローブとして作製された。これらの抗体を提供する目的は、実験目的／分析目的または診断であって、治療目的ではなかった。一般に、これまで、抗ＨＴＴ抗体をハンチントン病の処置のための治療目的に使用できることは、提案されてもいないし、実証されてもいない。さらに、ＷＯ２０１０／０１５５９２Ａ２に記載の抗体は何れも、本発明のワクチン接種用ペプチドと重複していない。最後に、Persichettiら(1995)に記載のペプチド“ＨＰ１”および“ＨＰ１２”は、ワクチン療法に使用するためではなく、試験条件下でのＨＴＴ検出（例えば、ウェスタンブロットまたはＩＨＣによるＨＴＴ検出など）のための分析的プローブを提供するために、ポリクローナル抗血清の作製のために使用されていた。同じことが、例えば、Ko et al. (2001)に記載のような、ペプチド免疫化によってではなく、ポリＱ−ＨＴＴ−ＧＳＴ融合タンパク質によって製造されたモノクローナル抗体（例えば、ＭＷ１−８）について言える。
従って、本発明のペプチドは、治療用ワクチンの製造に適していることが特記されることが重要であり、一方、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を製造するための先行技術文献記載のペプチドは、分析的使用または診断的使用のためのプローブを提供するように設計されている。
従って、ＰＲＲおよびＣ６領域に由来する本発明のペプチドは、特に有益である。両グループ共、とりわけ配列番号１、４、１６、１９および２８；ならびに、配列番号２、３、６−１８および２０−５０は、高度に免疫原性である；そして、配列番号１−４は、インビボ実験でのそれらの機能的性能のために大いに好ましい。
さらに好ましい免疫原性ペプチドは、好ましくはハンチントン病による症状に対するワクチン接種における使用、または該疾患の発症を遅延させるための使用のための、ｐ８８５５（ＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＣ、配列番号６）、ｐ８８５８（ＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ、配列番号７）、ｐ８８５９（ＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＣ、配列番号８）、ｐ８８６０（ＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＣ、配列番号９）、ｐ８８６１（ＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＣ、配列番号１０）、ｐ８８６２（ＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号１１）、ｐ８８６９（ＣＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱ、配列番号１２）、ｐ８８６８（ＣＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧ、配列番号１３）、ｐ８８７０（ＣＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰ、配列番号１４）、ｐ８８７１（ＣＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱ、配列番号１５）、ｐ６７７２（ＣＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰ、配列番号１６）、ｐ８８６４（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＣ、配列番号１７）、ｐ８８６５（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＣ、配列番号１８）、ｐ６７７５（ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰａＣ、配列番号１９）、ｐ８８５４（ＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＣ、配列番号２０）、ｐ８８５６（ＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＣ、配列番号２１）、ｐ８８５７（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＣ、配列番号２２）、ｐ８８６６（ＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＣ、配列番号２３）、およびｐ８８６７（ＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＤＣ、配列番号２４）からなる群より選択され、ここで、Ｎ末端またはＣ末端システイン残基（Ｃ）は、存在しても、存在しなくてもよく、またはＣ末端もしくはＮ末端の何れかに存在してよい。
他の好適な免疫原性ペプチドは、ｐ６７６３（ＣａＭＡＴＬＥＫＬＭＫＡＦＥＳＬＫＳＦＱ、配列番号２５）、ｐ６７６４（ＣａＫＬＭＫＡＦＥＳＬＫＳＦＱ、配列番号２６）、ｐ６７６５（ＣＥＥＱＱＲＱＱＱＱＱＱＱ、配列番号２７）、ｐ６７６８（ＱＱＱＱＱＱＰＰＰＰＰＰＰＰａＫＫＫＣ、配列番号２８）、ｐ７５４１（ＣＳＥＩＶＬＤ、配列番号２９）、ｐ７５５２（ＣＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３０）、ｐ７５６２（ＣＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３１）、ｐ７５６３（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３２）、ｐ７５６７（ＣＥＩＶＬＤ、配列番号３３）、ｐ７５６８（ＣＩＶＬＤ、配列番号３４）、ｐ７６０５（ＣＳＥＩＶＬ、配列番号３５）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、ｐ６７７６ｂ（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ、配列番号３８）、ｐ７７５２（ＣＡＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３９）、ｐ７７５３（ＣＳＡＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４０）、ｐ７７５４（ＣＳＥＡＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４１）、ｐ７７５５（ＣＳＥＩＡＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４２）、ｐ７７５６（ＣＳＥＩＶＡＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４３）、ｐ７７５７（ＣＳＥＩＶＬＡＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４４）、ｐ７７５８（ＣＳＥＩＶＬＤＡＴＤＮＱＹＬ、配列番号４５）、ｐ７７４５（ＣＳＥＩＶＬＤＧＡＤＮＱＹＬ、配列番号４６）、ｐ７７４６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＡＮＱＹＬ、配列番号４７）、ｐ７７４７（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＡＱＹＬ、配列番号４８）、ｐ７７４８（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＡＹＬ、配列番号４９）、ｐ７７４９（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＡＬ、配列番号５０）、およびｐ７７５０（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＡ、配列番号５１）からなる群より選択され、ここで、Ｎ末端またはＣ末端システイン残基（Ｃ）は、存在しても、存在しなくてもよく、またはＣ末端もしくはＮ末端の何れかに存在してよい。
本発明によれば、免疫原性は、免疫応答を引き起こすため、例えば所定のペプチドに対する抗体を誘発するための、抗原またはエピトープなどの特定の物質の能力である。
好ましくは、これらのペプチドは、少なくとも７個のアミノ酸長であり、好ましい長さは、１６個まで、好ましくは１４または２０個のアミノ酸残基までである（例えば、７または８から２０、７または８から１６個など）。配列番号１から５１のペプチドのＮ末端またはＣ末端の“Ｃ”は、リンカーとして提供され、それは、存在しても、存在しなくてもよく、あるいは担体への固定化を可能にする別のアミノ酸または化学的リンカーで置き換えられてよい。さらなる連結アミノ酸は、ペプチドのこの末端の、“Ｃ”（システイン残基）の直前または“Ｃ”の直後の何れかに、提供されてよい。“Ｃ”はまた、カップリングに必要でない場合、および／または免疫原性が、担体に“Ｃ”以外の手段で結合させることにより保持されている場合は、なくてもよい。あるいは、これらのペプチドのフラグメント、好ましくは７アミノ酸残基の最小の長さのフラグメント（システイン残基の前の１つまたはそれ以上のアミノ酸を削除する）もまた、本発明に従って使用することができる。あるいは、免疫原性ペプチドの免疫原性および特異性に影響を与えない極性または荷電アミノ酸を、ペプチドの溶解度を増加させるために使用することができる。従って、本発明のペプチドは、７から３０個、好ましくは７から２０個、より好ましくは７から１６個、最も好ましくは８個のアミノ酸残基を含む。しかしながら、本発明により、より長いペプチドもまた、例えば、実施例１に示すように、抗ＨＴＴ抗体誘導抗原として用いてもよい。
別の態様において、本発明は、ＨＴＴタンパク質の少なくとも１つの免疫原性ペプチドおよび所望により１種または複数のアジュバントも含む、ハンチントン病の治療および／または予防における使用のためのペプチドベースのワクチンを提供する。本発明により、ワクチンは、特定の疾患に対する免疫を改善する生物学的製剤である。本発明により、アジュバントは、他の薬剤の効果を修飾する、例えば供給されたペプチドエピトープに対する免疫応答を増強する薬理学薬剤である。
本発明により、該少なくとも１つの免疫原性ペプチドは、薬学的に許容される担体、好ましくはＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシニアン）に結合されることが好ましい。一般的に、Ｔｈ１応答を促進し、それによりヒトにおいてＩｇＧ１およびＩｇＧ３を優先的に誘導することができる任意の製剤が、本発明により好ましい。免疫原性ペプチドは、単離された（ペプチド）形態でワクチン中に提供されてよいか、または薬学的担体物質またはポリペプチド、脂質または炭水化物構造、とりわけペプチドリンカーまたはタンパク質担体などの他の分子に（共有結合または非共有結合で）結合されるか、もしくはそれらと複合体を形成していてよい。さらに、ペプチドリンカーまたはタンパク質担体は、例えば実施例２および３に示すように、Ｔ細胞ヘルパーエピトープから構成されるか、またはそれを含んでよい。
好ましくは、薬学的に許容される担体である、ＫＬＨ、破傷風トキソイド、アルブミン結合タンパク質、ウシ血清アルブミン、デンドリマー（ＭＡＰ； Biol.Chem. 358:581）は、単独で、またはSingh ＆ O’Hagan, 1999（具体的には、例えば、この文献の表１に記載のもの）およびO’Hagan ＆ Valiante, 2003（具体的には、そこに記載された本来の免疫増強化合物および送達系、またはそれらの混合物、例えば、低溶解性アルミニウム組成物（例えば、水酸化アルミニウム）、ＭＦ５９リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サポニン（例えば、ＱＳ２１）、ＭＤＰ誘導体、ＣｐＧオリゴ、ＩＣ３１、ＬＰＳ、ＭＰＬ、スクアレン、Ｄ，Ｌ−アルファ−トコフェロール（例えば、リン酸緩衝生理食塩水と、水中油系で混合される）、微粒子、エマルジョン（例えば、Freund’s、ＳＡＦ）、リポソーム、ビロソーム、イスコーム、渦巻状物質（cochleate）、ＰＬＧ微粒子、ポロキサマー粒子、ウイルス様粒子、熱不安定エンテロトキシン（ＬＴ）、コレラ毒素（ＣＴ）、変異毒素（例えば、ＬＴＫ６３およびＬＴＲ７２）、微粒子および／または重合リポソームを使用してもよい）に記載のアジュバント物質と組み合わせて使用される。本発明の好ましい態様において、ＨＴＴペプチド−ワクチン組成物は、水酸化アルミニウムを含む。
本発明のペプチドおよび薬学的に許容される担体を含むワクチンは、例えば、静脈内投与（i.v.）、腹腔内投与（i.p.）、筋肉内投与（i.m.）、鼻腔内、経口、皮下などの任意の好適な適用法、および任意の好適案送達装置（O'Hagan ＆ Valiente, 2003）により投与されてよい。
一般的に、ワクチンは、０．１ｎｇから１０ｍｇ、好ましくは１０ｎｇから１ｍｇ、とりわけ１００ｎｇから１００μｇの量で本発明のＨＴＴペプチドを含むか、あるいは、例えば１００ｆｍｏｌｅ（モル）から１０μｍｏｌｅ、好ましくは１０ｐｍｏｌｅから１μｍｏｌｅ、とりわけ１００ｐｍｏｌｅから１００ｎｍｏｌｅの量で本発明のＨＴＴペプチドを含む。
ワクチンは、一般的な補助剤、例えば緩衝液、安定化剤などを含んでもよい。
本発明のハンチントン病の予防は、少なくとも１つのＨＴＴアレル中に反復されるＣＡＧ数の増加に基づくハンチントン病症状を発症しやすい個体における、運動および精神症状または免疫学的変化および代謝変化などのハンチントン病関連症状の突発発生および／または発症を予防または遅延させることと定義される。
本発明のハンチントン病の処置は、変異ＨＴＴを有すると遺伝的に同定された個体（すなわち、少なくとも１つのＨＴＴアレルにおいて２６以上のＣＡＧリピートを有する個体）および例えば、実施例２および３のように、その症状に基づいてハンチントン病陽性と診断され、ハンチントン病の動物モデルにおける表現型の変化を誘導することによって示されるような遺伝子型を有する個体における、舞踏様運動および精神症状を伴った運動などのハンチントン病関連運動症状、または免疫学的変化および代謝変化を改善するように定義される。
本発明の免疫原性ＨＴＴ由来ペプチドによる能動免疫化、すなわち、ワクチン接種は、ＨＴＴタンパク質標的のオプソニン化をもたらし、それによりその特異的食作用を誘導する。オプソニン作用は、抗体がハンチントンなどの抗原に結合し、それにより免疫応答のためにそれを標識する過程である。貪食細胞は、例えば実施例８において抗ハンチンチン抗体ＰＲＲ１３およびＣ６−１７について実証されるとおり、免疫グロブリンのＦｃ部分に結合し、次いで、標識された抗原を内在化する。
本発明でとりわけ好ましいのは、ハンチントン病の予防および／または処置における使用のための、ＨＴＴまたはその天然に存在するフラグメント、とりわけハンチントン病に関連するフラグメントに対する免疫応答を誘発する少なくとも１つの免疫原性ペプチドを含むペプチドベースのワクチンであり、ここで、該ＨＴＴタンパク質の少なくとも１つの免疫原性ペプチドが、ｐ６７７３（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ、配列番号１）、ｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）、ｐ７５４３ａ（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８８）、とりわけ誘導体ｐ９３９４（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＣ；配列番号９１）、ｐ９３９５（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＫＣ；配列番号９２）、ｐ９３９６（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９３）、ｐ９３９７（ＫＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９４）；ｐ７５４３ｂ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８９）、ｐ７５４３ｃ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ；配列番号９０）、ｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）、ｐ８３４６（ＣＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ、配列番号５）、ｐ８８５５（ＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＣ、配列番号６）、ｐ８８５８（ＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ、配列番号７）、ｐ８８５９（ＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＣ、配列番号８）、ｐ８８６０（ＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＣ、配列番号９）、ｐ８８６１（ＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＣ、配列番号１０）、ｐ８８６２（ＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号１１）、ｐ８８６９（ＣＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱ、配列番号１２）、ｐ８８６８（ＣＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧ、配列番号１３）、ｐ８８７０（ＣＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰ、配列番号１４）、ｐ８８７１（ＣＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱ、配列番号１５）、ｐ６７７２（ＣＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰ、配列番号１６）、ｐ８８６４（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＣ、配列番号１７）、ｐ８８６５（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＣ、配列番号１８）、ｐ６７７５（ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰａＣ、配列番号１９）、ｐ８８５４（ＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＣ、配列番号２０）、ｐ８８５６（ＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＣ、配列番号２１）、ｐ８８５７（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＣ、配列番号２２）、ｐ８８６６（ＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＣ、配列番号２３）、ｐ８８６７（ＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＤＣ、配列番号２４）、ｐ６７６３（ＣａＭＡＴＬＥＫＬＭＫＡＦＥＳＬＫＳＦＱ、配列番号２５）、ｐ６７６４（ＣａＫＬＭＫＡＦＥＳＬＫＳＦＱ、配列番号２６）、ｐ６７６５（ＣＥＥＱＱＲＱＱＱＱＱＱＱ、配列番号２７）、ｐ６７６８（ＱＱＱＱＱＱＰＰＰＰＰＰＰＰａＫＫＫＣ、配列番号２８）、ｐ７５４１（ＣＳＥＩＶＬＤ、配列番号２９）、ｐ７５５２（ＣＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３０）、ｐ７５６２（ＣＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３１）、ｐ７５６３（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３２）、ｐ７５６７（ＣＥＩＶＬＤ、配列番号３３）、ｐ７５６８（ＣＩＶＬＤ、配列番号３４）、ｐ７６０５（ＣＳＥＩＶＬ、配列番号３５）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、ｐ６７７６ｂ（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ、配列番号３８）、ｐ７７５２（ＣＡＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３９）、ｐ７７５３（ＣＳＡＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４０）、ｐ７７５４（ＣＳＥＡＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４１）、ｐ７７５５（ＣＳＥＩＡＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４２）、ｐ７７５６（ＣＳＥＩＶＡＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４３）、ｐ７７５７（ＣＳＥＩＶＬＡＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４４）、ｐ７７５８（ＣＳＥＩＶＬＤＡＴＤＮＱＹＬ、配列番号４５）、ｐ７７４５（ＣＳＥＩＶＬＤＧＡＤＮＱＹＬ、配列番号４６）、ｐ７７４６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＡＮＱＹＬ、配列番号４７）、ｐ７７４７（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＡＱＹＬ、配列番号４８）、ｐ７７４８（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＡＹＬ、配列番号４９）、ｐ７７４９（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＡＬ、配列番号５０）、およびｐ７７５０（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＡ、配列番号５１）からなる群より選択され、好ましくはｐ６７７３（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ、配列番号１）、ｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）、ｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、ｐ８３４６（ＣＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ、配列番号５）、ｐ８８５５（ＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＣ、配列番号６）、ｐ８８５８（ＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ、配列番号７）、ｐ８８５９（ＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＣ、配列番号８）、ｐ８８６０（ＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＣ、配列番号９）、ｐ８８６１（ＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＣ、配列番号１０）、ｐ８８６２（ＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号１１）、ｐ８８６９（ＣＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱ、配列番号１２）、ｐ８８６８（ＣＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧ、配列番号１３）、ｐ８８７０（ＣＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰ、配列番号１４）、ｐ８８７１（ＣＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱ、配列番号１５）、ｐ６７７２（ＣＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰ、配列番号１６）、ｐ８８６４（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＣ、配列番号１７）、ｐ８８６５（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＣ、配列番号１８）、ｐ６７７５（ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰａＣ、配列番号１９）、ｐ８８５４（ＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＣ、配列番号２０）、ｐ８８５６（ＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＣ、配列番号２１）、ｐ８８５７（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＣ、配列番号２２）、ｐ８８６６（ＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＣ、配列番号２３）、およびｐ８８６７（ＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＤＣ、配列番号２４）、とりわけｐ６７７３（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ、配列番号１）、ｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）、ｐ７５４３ａ（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８８）、とりわけ誘導体ｐ９３９４（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＣ；配列番号９１）、ｐ９３９５（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＫＣ；配列番号９２）、ｐ９３９６（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９３）、ｐ９３９７（ＫＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９４）；ｐ７５４３ｂ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８９）、ｐ７５４３ｃ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ；配列番号９０）、ｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、およびｐ８３４６（ＣＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ、配列番号５）、またはこれらのペプチドの少なくとも１つを含むペプチドであり、好ましくは最大５０アミノ酸残基長、より好ましくは最大３０アミノ酸残基長、さらに好ましくは、最大２０アミノ酸残基長、とりわけ最大１６アミノ酸残基長である。本発明の特に好ましいペプチドは、６から１０アミノ酸残基長、例えば７、８または９アミノ酸長、とりわけ９アミノ酸長を有し得る。
本発明はまた、コアエピトープを含む配列番号１から５１の免疫原性ペプチドのフラグメントもまた意味する。ペプチドｐ６７７１、ｐ６７７３およびｐ７５４３のコアエピトープは、本発明の実施例部分で同定されている。ペプチドｐ６７７１またはｐ６７７３のコアエピトープは、それぞれ、ＰＰＱＡＱＰＬ（配列番号７８）、ＰＰＱＡＱＰ（配列番号７９）、ＱＰＬＬ（配列番号８０）およびＰＱＡＱＰＬＬ（配列番号８１）であり、とりわけＬＬＰＱＰ（配列番号７７）である。ペプチドｐ７５４３のコアエピトープは、ＱＹＬＧＬＱＩＧ（配列番号８２）、ＹＬＧＬＱＩＧ（配列番号８３）、ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧ（配列番号８４）、ＤＮＱＹＬＧＬ（配列番号８５）およびＹＬＧＬＱＩＧ（配列番号８６）、とりわけＱＹＬＧＬＱＩＧである。従って、本発明の好ましい免疫原性ペプチドは、これらのコアエピトープの少なくとも１つを含み、好ましくは最大３０アミノ酸残基長、好ましくは２０アミノ酸残基長、とりわけ１６アミノ酸残基長を有し、ここで、該ペプチドは、好ましくは特異的ハンチンチンＣ６切断阻害剤の作製または同定において使用され、該特異的ハンチンチンＣ６切断阻害剤は、好ましくは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗血清、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２などのモノクローナル抗体由来フラグメントとして定義されている。
好ましい面により、本発明は、活性ワクチンとして使用することができ、本発明で開示した免疫原性ペプチドの少なくとも２つを含む免疫原性組成物を提供する。好ましくは、組成物は、これらのペプチドの少なくとも３つ、より好ましくは、これらのペプチドの少なくとも４つ、とりわけこれらのペプチドの少なくとも５つを含む。好ましくは、２つまたはそれ以上のペプチドの少なくとも１つは、ｐ６７７３（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ、配列番号１）、ｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）、ｐ７５４３ａ（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８８）、とりわけ誘導体ｐ９３９４（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＣ；配列番号９１）、ｐ９３９５（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＫＣ；配列番号９２）、ｐ９３９６（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９３）、ｐ９３９７（ＫＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９４）；ｐ７５４３ｂ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８９）、ｐ７５４３ｃ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ；配列番号９０）、ｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、およびｐ８３４６（ＣＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ、配列番号５）からなる群より選択される。“Ｃ６”領域からの少なくとも１つのペプチドと“ＰＲＲ”領域からの少なくとも１つのペプチドを組み合わせることもまた好ましい（例えば、表２に記載の通り）。具体的に好ましい組み合わせは、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）と、他のペプチドのいずれか、具体的には配列番号１、２、４および５のいずれかとの組み合わせである。ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）（または、ｐ７５４３ａ（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８８）、とりわけ誘導体ｐ９３９４（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＣ；配列番号９１）、ｐ９３９５（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＫＣ；配列番号９２）、ｐ９３９６（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９３）、ｐ９３９７（ＫＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９４）；ｐ７５４３ｂ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８９）、ｐ７５４３ｃ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ；配列番号９０））とｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）との組み合わせ、およびｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）とｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）との組み合わせが、とりわけ好ましい。
別の面において、本発明は、ハンチントン病の治療および／または予防におけるワクチンとして使用するための、ＨＴＴタンパク質の少なくとも１つのペプチドを特異的に認識するポリクローナル抗体血清を含む薬理学的組成物を提供する。
本発明に関して、用語“医薬品（pharmaceutical preparation）”および“薬理学的組成物”は、互換的に用いられ、ヒト個体への送達を意図され、かつそれに適する組成物を意味する。かかる調製物または組成物は、ＧＭＰ（適正製造規範）に従って製造され、ＥＭＡおよびＦＤＡにより、とりわけＥＭＡにより必要とされる前提条件に適合するように十分に滅菌およびパッケージングされている。
本発明によれば、ポリクローナル抗体血清の抗体は、当業者に公知の技術、例えば、親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。
薬理学的組成物は、ポリクローナル抗体がそれに（共有結合または非共有結合で）結合されるか、またはそれと複合体を形成し得る、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含み得る。ポリクローナル抗体を含む医薬組成物は、少なくとも１つのさらなる治療剤をさらに含み得る。
本発明によれば、ポリクローナル抗体血清の抗体は、例えば実施例８に示すように、ＨＴＴタンパク質、凝集したＨＴＴまたはそのフラグメントのオプソニン化および食作用などの免疫グロブリンが介在するエフェクター機能をもたらすことが好ましい。これは、可溶形態、凝集形態またはフラグメント形態の野生型および変異型ハンチンチンのブロッキング／金属イオン封鎖機能と組み合わされた、オプソニン化、食作用、補体溶解またはＮＫ細胞死滅エフェクター機能を可能にするように、特定の糖残基によりコードされるそのＦｃ部分に適当なプロオプソニン化食作用活性を有する免疫グロブリンを必要とする。ｐ６７７３またはｐ７５４３ワクチンに由来するモノクローナル抗体によって提供される食作用活性を示す実施例を提供する（実施例８）。
本発明の別の好ましい態様において、該薬理学的組成物中に含まれるポリクローナル抗体血清は、ｐ６７７３（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ、配列番号１）、ｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）、ｐ７５４３ａ（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８８）、とりわけ誘導体ｐ９３９４（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＣ；配列番号９１）、ｐ９３９５（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＫＣ；配列番号９２）、ｐ９３９６（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９３）、ｐ９３９７（ＫＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９４）；ｐ７５４３ｂ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８９）、ｐ７５４３ｃ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ；配列番号９０）、ｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）、ｐ８３４６（ＣＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ、配列番号５）、ｐ８８５５（ＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＣ、配列番号６）、ｐ８８５８（ＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ、配列番号７）、ｐ８８５９（ＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＣ、配列番号８）、ｐ８８６０（ＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＣ、配列番号９）、ｐ８８６１（ＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＣ、配列番号１０）、ｐ８８６２（ＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号１１）、ｐ８８６９（ＣＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱ、配列番号１２）、ｐ８８６８（ＣＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧ、配列番号１３）、ｐ８８７０（ＣＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰ、配列番号１４）、ｐ８８７１（ＣＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱ、配列番号１５）、ｐ６７７２（ＣＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰ、配列番号１６）、ｐ８８６４（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＣ、配列番号１７）、ｐ８８６５（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＣ、配列番号１８）、ｐ６７７５（ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰａＣ、配列番号１９）、ｐ８８５４（ＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＣ、配列番号２０）、ｐ８８５６（ＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＣ、配列番号２１）、ｐ８８５７（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＣ、配列番号２２）、ｐ８８６６（ＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＣ、配列番号２３）、ｐ８８６７（ＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＤＣ、配列番号２４）、ｐ６７６３（ＣａＭＡＴＬＥＫＬＭＫＡＦＥＳＬＫＳＦＱ、配列番号２５）、ｐ６７６４（ＣａＫＬＭＫＡＦＥＳＬＫＳＦＱ、配列番号２６）、ｐ６７６５（ＣＥＥＱＱＲＱＱＱＱＱＱＱ、配列番号２７）、ｐ６７６８（ＱＱＱＱＱＱＰＰＰＰＰＰＰＰａＫＫＫＣ、配列番号２８）、ｐ７５４１（ＣＳＥＩＶＬＤ、配列番号２９）、ｐ７５５２（ＣＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３０）、ｐ７５６２（ＣＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３１）、ｐ７５６３（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３２）、ｐ７５６７（ＣＥＩＶＬＤ、配列番号３３）、ｐ７５６８（ＣＩＶＬＤ、配列番号３４）、ｐ７６０５（ＣＳＥＩＶＬ、配列番号３５）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、ｐ６７７６ｂ（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ、配列番号３８）、ｐ７７５２（ＣＡＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３９）、ｐ７７５３（ＣＳＡＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４０）、ｐ７７５４（ＣＳＥＡＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４１）、ｐ７７５５（ＣＳＥＩＡＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４２）、ｐ７７５６（ＣＳＥＩＶＡＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４３）、ｐ７７５７（ＣＳＥＩＶＬＡＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４４）、ｐ７７５８（ＣＳＥＩＶＬＤＡＴＤＮＱＹＬ、配列番号４５）、ｐ７７４５（ＣＳＥＩＶＬＤＧＡＤＮＱＹＬ、配列番号４６）、ｐ７７４６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＡＮＱＹＬ、配列番号４７）、ｐ７７４７（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＡＱＹＬ、配列番号４８）、ｐ７７４８（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＡＹＬ、配列番号４９）、ｐ７７４９（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＡＬ、配列番号５０）およびｐ７７５０（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＡ、配列番号５１）、好ましくはｐ６７７３（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ、配列番号１）、ｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）、ｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、ｐ８３４６（ＣＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ、配列番号５）、ｐ８８５５（ＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＣ、配列番号６）、ｐ８８５８（ＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ、配列番号７）、ｐ８８５９（ＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＣ、配列番号８）、ｐ８８６０（ＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＣ、配列番号９）、ｐ８８６１（ＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＣ、配列番号１０）、ｐ８８６２（ＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号１１）、ｐ８８６９（ＣＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱ、配列番号１２）、ｐ８８６８（ＣＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧ、配列番号１３）、ｐ８８７０（ＣＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰ、配列番号１４）、ｐ８８７１（ＣＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱ、配列番号１５）、ｐ６７７２（ＣＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰ、配列番号１６）、ｐ８８６４（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＣ、配列番号１７）、ｐ８８６５（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＣ、配列番号１８）、ｐ６７７５（ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰａＣ、配列番号１９）、ｐ８８５４（ＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＣ、配列番号２０）、ｐ８８５６（ＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＣ、配列番号２１）、ｐ８８５７（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＣ、配列番号２２）、ｐ８８６６（ＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＣ、配列番号２３）、およびｐ８８６７（ＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＤＣ、配列番号２４）、とりわけｐ６７７３（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ、配列番号１）、ｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）、ｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、およびｐ８３４６（ＣＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ、配列番号５）からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドに対して作られる。
本発明の別の好ましい態様において、ｐ６７７３（配列番号１）およびｐ６７７１（配列番号４）の少なくとも１つのペプチドに対して作製される、該薬理学的組成物中に含まれるポリクローナル抗体血清は、例えば実施例４に示す通り、免疫血清の詳細なエピトープ分析によって例示されるようにコアエピトープ領域を包含する。単一アミノ酸置換分析に基づき、コアエピトープは、例えば実施例４で説明する通り、試験した抗体による結合を失うことなくアラニンまたはほとんどの他のアミノ酸により置換され得ないアミノ酸位置を含む。
あるいは、または組み合わせて、該薬理学的組成物中に含まれるポリクローナル抗体血清は、ペプチドｐ７５４３によって作製された血清の詳細なエピトープ分析によって示されるように、実施例４で提供されるコアエピトープ領域を包含するペプチドｐ７５４３（配列番号３）に対して作製する。アミノ酸置換分析に基づき、ペプチド位置は、例えば実施例４で説明した通り、対応する抗体によるエピトープ認識（少なくともコアエピトープ領域内）を改変することなく置換することができない。
あるいは、または組み合わせて、該薬理学的組成物に含まれるポリクローナル抗体血清は、例えば実施例５、図１７に記載の通り、ｐ７５６４由来のｍＡＢ Ｍ１Ｄ１のコアエピトープ領域を包含するペプチドｐ７５６４（配列番号２）に対して作製され得る。
あるいは、または組み合わせて、該薬理学的組成物に含まれるポリクローナル抗体血清は、例えば実施例４、図１１に記載の通り、コアエピトープ領域を包含するペプチドｐ６７７６（配列番号３６）に対して作製され得る。
別の面によれば、本発明は、好ましくはハンチントン病の処置における使用、または該疾患の症状の発症を遅延させるための使用のための、ＨＴＴまたはその天然に存在するフラグメントに対するモノクローナル抗体に関する。本発明のモノクローナル（ならびに、ポリクローナル）抗体は、“単離された抗体”として提供される。“単離された”抗体は、その天然環境下の成分から分離されたものである。ある態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上または９９％以上の純度である。モノクローナル抗体については、抗体をコードする核酸も利用可能である。従って、本発明は、そのような抗体をコードする単離された核酸も包含する。“単離された”核酸とは、その天然環境の成分から分離された核酸分子を意味する。単離された核酸には、通常、核酸分子を含む細胞に含まれる核酸分子が含まれるが、該核酸分子が、染色体外に存在するか、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在するものも含まれる。“抗ＨＴＴ抗体にコードされる単離された核酸”は、単一ベクターまたは別個のベクター中にかかる核酸分子（複数可）を含む、抗体重鎖および軽鎖（またはそのフラグメント）をコードする１つまたは複数の核酸分子を意味し、そのような核酸分子（複数可）は、宿主細胞中の１つまたは複数の位置に存在する。
本明細書で用いる用語“モノクローナル抗体”とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を意味し、すなわち、該集団に含まれる個々の抗体は、同一であり、かつ／または、例えば、天然に生じる変異を含むか、またはモノクローナル抗体調製物の製造中に生じる、可能性のある変異体抗体（そのような変異体は、一般にわずかに存在する）を除いて、同一のエピトープに結合する。一般的に、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、“モノクローナル”なる修飾語は、抗体の実質的に均一な抗体集団から得られるという該抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の産生を要すると解釈されるべきではない。例えば、本発明で用いるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージ−、酵母−または哺乳動物細胞−ディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法（そのような方法およびモノクローナル抗体を作製するための他の例示的方法は本明細書に記載されている）を含むが、これらに限定されない、種々の技術によって作製できる。
別の面において、本発明はまた、ペプチドｐ６７７３（配列番号１）内に含まれる配列“ＬＬＰＱＰ”を有するＨＴＴタンパク質のエピトープ、とりわけコアエピトープＬＬＰＱＰ（配列番号７７）に結合可能な結合ドメインを有するモノクローナル抗体“ＰＲＲ１３”を提供する。本発明により、本発明の試験で供された、この最小限のコアエピトープ、すなわちコアエピトープＬＬＰＱＰ（配列番号７７）に対するｍＡＢが提供される。好ましい態様において、該モノクローナル抗体は、例えば実施例５に記載の通り、ペプチド配列ＧＹＳＦＴＤＦＹ（配列番号５４）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＩＤＰＫＮＧＤＴ（配列番号５５）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、ＡＴＹＹＧＹＴＭＤＹ（配列番号５６）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、ＳＳＶＴＳＳＹ（配列番号５７）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＳＴＳ（配列番号５８）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２およびＨＱＹＲＲＰＰＲＴ（配列番号５９）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含むモノクローナル抗体（例えば、ＰＲＲ１３）であることを特徴とする。
ＣＤＲは、相補性決定領域であり、抗体の可変領域を表し、それにより抗体はその特異的エピトープに結合する。重鎖の種類と数は、それぞれ、抗体のクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を決定する。抗体は、ラムダまたはカッパ型であり得る２つの同一の軽鎖を含む。
本発明によれば、モノクローナル抗体は、好ましくは、非ヒト抗体のＣＤＲがヒト抗体フレームワークに導入され、それにより元のハイブリドーマに由来するマウス抗体の親和性および特異性が少なくとも維持され、かつヒトに対するＴ細胞およびＢ細胞の免疫原性が最小化されるように適合された改変抗体（ヒト化モノクローナル抗体）、二重特異性もしくはキメラモノクローナル抗体、Ｆｃ受容体を含むエフェクター機能または安定化機能を強化した抗体、またはエフェクター機能のためのカーゴ（ｃａｒｇｏ）もしくは診断マーカーを含む抗体である。本発明の抗体は、好ましくはヒト抗ＨＴＴ抗体である。
“ヒト抗体”は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生される抗体またはヒト抗体のレパートリーもしくは他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、特に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。“ヒトコンセンサスフレームワーク”は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において、最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的に、配列のサブグループは、Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunoglobulin Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91−3242, Vols. 1−3に記載のようなサブグループである。一態様において、ＶＬについて、サブグループは、前出のＫａｂａｔらのサブグループκＩである。一態様において、ＶＨについて、サブグループは、前出のＫａｂａｔらのサブグループＩＩＩである。
“ヒト化”抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基およびヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を意味する。“フレームワーク”または“ＦＲ”は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を意味する。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４で構成されている。従って、ＨＶＲおよびＦＲ配列は一般的に、ＶＨ（または、ＶＬ）において、次の順序で示される：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。任意の態様において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含んでいてよく、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全ては、非ヒト抗体のものに対応し、かつＦＲの全ておよび実質的に全ては、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、必要に応じて、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてよい。抗体の“ヒト化変異体”、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化された抗体を意味する。好ましい一態様では、マウスＨＶＲは、“ヒト化抗体”を調製するために、ヒト抗体のフレームワーク領域に移植される。マウス可変領域のアミノ酸配列は、ヒトの生殖細胞系抗体Ｖ遺伝子のコレクションに合わせて、配列同一性および相同性に基づいて選別される。アクセプター配列は、高い全体的な配列相同性および必要に応じて、アクセプター配列に既に存在する正しい天然の（canonical）残基に基づいて選択される。生殖細胞系のＶ遺伝子は、重鎖のＨＶＲ３の先頭までの領域、さらに軽鎖のＨＶＲ３の真ん中までのみをコードする。従って、生殖細胞系のＶ遺伝子の遺伝子は、Ｖドメイン全体に配置されているわけではない。ヒト化構築物は、ヒトフレームワーク１から３、マウスＨＶＲ、およびヒトＪＫ４に由来するヒトフレームワーク４配列、ならびに軽鎖および重鎖のためのＪＨ４配列をそれぞれ含む。１つの特定のアクセプター配列を選択する前に、ドナー抗体のいわゆる天然（canonical）ループ構造を決定することができる。これらの天然ループ構造は、いわゆる標準的な（canonical）位置に存在する残基の種類によって決定される。これらの位置は、ＨＶＲ領域の外にあり（部分的に）、親（ドナー）抗体のＨＶＲコンホメーションを保持するために、最終的な構築物を機能的に等価に保つ必要がある。ＷＯ２００４／００６９５５Ａ１において、抗体をヒト化するための方法は、非ヒト成熟抗体中のＨＶＲのカノニカル（canonical）ＨＶＲ構造タイプを識別する工程；ヒト抗体可変領域用のペプチド配列ライブラリーを得る工程；該ライブラリーにおける可変領域のカノニカルＨＶＲ構造タイプを決定する工程；ならびに、カノニカルＨＶＲ構造が、非ヒトおよびヒト可変領域内の対応する位置の非ヒト抗体のカノニカルＨＶＲ構造タイプと同じであるヒト配列を選択する工程、を含むことが報告されている。まとめると、可能性のあるアクセプター配列は、全体的に高い相同性に基づいて選択され、要すれば、それに加えて、アクセプター配列に既に存在する正しい天然の残基の存在に基づいて選択される。ある場合に、単一のＨＶＲ移植は、非ヒト抗体の結合特異性の部分的な保持のみをもたらす。少なくとも幾つかの特定の非ヒトフレームワーク残基が、結合特異性を再構成するために必要であり、また、ヒトフレームワーク中にも移植されなければならない、すなわち、いわゆる“逆突然変異（back mutation）”が、非ヒトＨＶＲの導入に加えて行われなければならないことが明らかになっている（例えば、Queen et al., PNAS 86 (1989), 10029−10033を参照のこと)。これらの特定のフレームワークアミノ酸残基は、ＦＲ−ＨＶＲ相互作用に関与し、ＨＶＲの立体構造（ループ）を安定化する。ある場合には、より近似のヒト生殖細胞系配列を選択するために、フォワード変異もまた導入される。従って、“本発明の抗体のヒト化変異体”（それは、例えば、マウス由来のもの）は、ＶＨおよびＶＬが上記の標準的技術によりヒト化されたマウス抗体配列に基づく抗体（ＨＶＲ移植され、ならびに要すればその後に、フレームワーク領域およびＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｌ１またはＨＶＲ−Ｌ２中の任意のアミノ酸が変異され、一方で、ＨＶＲ−Ｈ３およびＨＶＲ−Ｌ３は修飾されていない抗体を含む）を意味する。
一般的に、マウス由来のヒト患者の処置に使用するのに適する抗体または他の厳選されたｍＡＢを開発するための技術は、十分に確立されている（Safdari et al 2013に記載）。従って、本明細書に記載の抗体は、このような検証技術、とりわけＣＤＲ移植に基づく方法（例えば、Kim ＆ Hong Methods Mol Biol. 2012;907:237−45 [PMID: 22907355] または Whitelegg, N. ＆ Rees, AR Antibody variable Regions: Towards a Unified modeling method. In: Methods in Molecular Biology, Biotechnology and Medicine, (Ed. Lo, B), 2004; 248:51−91に記載)、生殖細胞系ヒト化または“超ヒト化”(例えば、Pelat, T. Et al., Mini Rev Med Chem. 2009 Dec;9(14):1633−8を参照）、およびリサーフェイシング（resurfacing）（例えば、Mader and Kunert et al., Prot.Eng.Des.Selec. 2010, 23, 947−954に記載)を適用することにより、改善された抗体を提供するための方法を開発するために用いられる。
本明細書で用いる“超可変領域”または“ＨＶＲ”は、配列において超可変である抗体可変ドメイン領域（“相補性決定領域”または“ＣＤＲ”）および／または構造的に定まったループを形成する領域（“超可変ループ”）および／または抗原接触残基を含む領域（“抗原と接触する領域”）を意味する。一般的に、抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、そしてＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の、６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲの例は、本明細書に記載されている。
本発明により、配列番号６０から６５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％）、９８％）、９９％）、または１００％配列の同一性を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列および／または軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＨＴＴ抗体もまた提供される。任意の態様において、少なくとも９０％＞、９１％＞、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＨ配列は、対照配列に対して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、その配列を含む抗ＨＴＴ抗体は、ＨＴＴに、とりわけ提示されるエピトープに結合する能力を保持している。任意の態様において、配列番号６０から６５において、合計１から１０個のアミノ酸が、置換、挿入および／または欠失されている。任意の態様において、置換、挿入または欠失は、ＨＶＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ）に生じる。
本発明の抗ＨＴＴ抗体の好ましい変異体は、図２７に記載されている（すなわち、変異体ｈＰＲＲ１３−２から−１６およびｈＣ６−１７−２から−１６）。従って、Ｈ／Ｌフレームワーク中にアミノ酸置換を有する抗ＨＴＴ抗体は、本発明に特に好ましい。さらに、これらの変異体の全ての組み合わせも特に好ましい。例えば、ＰＲＲ抗体の重鎖について、１つのｗｔ＋３つの変異体が存在し、軽鎖についても、１つのｗｔ＋３つの変異体が存在する。これは、図２７の表に列記されるように４ｘ４の変異体の可能性のある組み合わせを提供する。ｍＡＢ ｈｕＣ６−１７について、以下の組み合わせが好ましい：軽鎖：１つのｗｔ＋１つの変異体；重鎖：１つのｗｔ＋７つの変異体、合計１６種の変異体。
対照ポリペプチド配列に対する“アミノ酸配列の同一性パーセント（％）”は、配列を整列させ、必要であれば、最大の配列同一性パーセントを達成するために、ギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しないとした場合の、該対照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当技術分野の範囲内の種々の方法、例えば、公的に入手可能なコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮもしくはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアまたはＥＭＢＯＳＳソフトウェアパッケージの“ｎｅｅｄｌｅ”ペアワイズ配列アライメントアプリケーションを使用することにより達成することができる。当業者であれば、配列をアラインするための適切なパラメーター（比較される配列の全長にわたって最大アライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む）を決定することができる。本発明の目的のために、しかしながら、アミノ酸配列の同一性パーセント（％）の値は、ＥＭＢＯＳＳソフトウェアパッケージのコンピュータプログラム“ｎｅｅｄｌｅ”の配列アライメント（European Molecular Biology Laboratory; Rice et al., EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite, Trends Genet. 2000 Jun;16(6):276−7、ＰＭＩＤ：１０８２７４５６から入手可能）を用いて計算される。
ｎｅｅｄｌｅプログラムは、ウェブサイトhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss needle/でアクセスすることができるが、http://emboss.sourceforge.net/からＥＭＢＯＳＳパッケージの一部としてローカルインストール用にダウンロードできる。それは、多くの広く使用されているＬｉｎｕｘなどのＵＮＩＸオペレーティングシステム上で動作する。
２つのタンパク質配列をアラインするために、ｎｅｅｄｌｅプログラムは、好ましくは、以下のパラメーターを使用して実行される：
コマンドライン：needle −auto −stdout −asequence SEQUENCE_FILE_A −bsequence SEQUENCE_FILE_B −datafile EBLOSUM62 −gapopen 10.0 −gapextend 0.5 −endopen 10.0 −endextend 0.5 −aformat3 pair −sprotein1 −sprotein2(Align_format: pair Report_file: stdout)。
所定のアミノ酸配列Ａの、所定のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列の同一性パーセント（％）（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、それとの、またはそれと比較して(to, with, or against)ある特定のアミノ酸配列の同一性パーセント（％）を有するか、または含む所定のアミノ酸配列Ａと表現することもできる）は、以下のように計算される：
分率Ｘ／Ｙ×１００
（式中、Ｘは、配列アライメントプログラムｎｅｅｄｌｅによって、そのプログラムによるＡおよびＢのアライメントにおいて完全な一致として採点されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂのア総ミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列の同一性パーセント（％）は、Ａに対するＢのアミノ酸配列の同一性パーセント（％）と等しくならないことが認識される。特に別段の記載がない限り、本明細書に用いるアミノ酸配列の同一性パーセント（％）の値はすべて、すぐ前の段落に記載したように、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて得られる。
任意の態様において、本発明で提供される抗体はキメラ抗体である。特定のキメラ抗体が、例えば、ＵＳ４，８１６，５６７Ａ；および、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851−6855）に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト哺乳動物、例えばサル由来の可変領域）およびヒト定常領域を含む。さらなる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが、親抗体のものから変更されている“クラススイッチ”抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合フラグメントを含む。
任意の態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。一般的に、非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減するためにヒト化されている。一般的に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその部分）が非ヒト抗体に由来し、そしてＦＲ（またはその部分）がヒト抗体配列に由来する、１つまたは複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、場合によっては、ヒト定常領域の少なくとも一部を含み得る。ある態様において、ヒト化抗体のあるＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換されている。ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は、例えば、ＷＯ２００４／００６９５５Ａ１（カノニカル構造を介したアプローチ）に報告されている。
任意の態様において、本発明で提供する抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の種々の技術を用いて作製することができる。ヒト抗体は、抗原暴露に応答して、ヒト可変領域を有する無傷のヒト抗体または無傷の抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、一般的に、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、または染色体外に存在するか、もしくは該動物の染色体に無作為に挿入されている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法については、Lonberg, Nat. Biotech. 23 (2005) 1117−1125、ＸＥＮＯマウス(商標)技術を記載するＵＳ６，０７５，１８１および６，１５０，５８４；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載するＵＳ５，７７０，４２９Ａ；Ｋ−Ｍマウス（登録商標）技術を記載するＵＳ７，０４１，８７０Ａ、ならびにVelociマウス(登録商標)技術を記載するＵＳ２００７／００６１９００Ａ１を参照のこと。かかる動物によって作製された無傷の抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、さらに修飾されてよい。
ヒト抗体はまた、ハイブリドーマベースの方法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株が記載されているヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により作製されたヒト抗体はまた、Li et al, PNAS 103(2006) 3557−3562に記載されている。さらなる方法は、例えば、ＵＳ７，１８９，８２６（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載する）に記載のもの、またはトリオーマ技術によって作製されたものを含む。ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することにより作製され得る。その後、かかる可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからのヒト抗体の選択のための技術を以下に記載する。
本発明の抗体はまた、１つまたは複数の所望の活性を有する抗体のためのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、種々の方法が、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特性を有する抗体についてかかるライブラリーをスクリーニングするために、当技術分野において知られている。このような方法は、例えばFellouse, PNAS(2004) 12467−12472にさらに記載されている。
特定のファージディスプレイ法では、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローニングし、ファージライブラリー中に無作為に組み込み、その後、それを抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントまたはＦａｂフラグメントのいずれかのような抗体フラグメントを提示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要がなく、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、天然のレパートリー（例えば、ヒト由来）は、免疫化することなく、非自己およびまた自己抗原の広範囲に抗体の単一の供給源を提供するためにクローン化することができる。最後に、天然ライブラリーはまた、幹細胞から非再配列Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、高度に可変のＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再編成を達成するためにコードされるランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用いて、合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載するさらなる文献には、例えば、ＵＳ５，７５０，３７３Ａ、ＵＳ２００５／００７９５７４Ａ１、ＵＳ２００５／０１１９４５５Ａ１、ＵＳ２００５／０２６６０００Ａ１、ＵＳ２００７／０１１７１２６Ａ１、ＵＳ２００７／０１６０５９８Ａ１、ＵＳ２００７／０２３７７６４Ａ１、ＵＳ２００７／０２９２９３６Ａ１、およびＵＳ２００９／０００２３６０Ａ１が含まれる。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体フラグメントは、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体フラグメントとみなされる。
任意の態様において、本明細書に記載の抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性は、少なくとも２つの異なる部位に結合特異的を有するモノクローナル抗体である。任意の態様において、結合特異性の１つは、ＨＴＴに対してであり、他方は、例えば、任意の他の抗原に対するものである。二重特異性抗体はまた、ＨＴＴを発現する細胞に細胞傷害剤を局在化するのに使用され得る。二重特異性抗体は完全長抗体または抗体フラグメントとして調製することができる。多重特異性抗体を作製するための技術としては、限定されるものではないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（ＷＯ９３／０８８２９Ａ、ＵＳ５，７３１，１６８Ａ）を含む。多重特異性抗体はまた、抗体のＦｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作することにより（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ）；２つまたはそれ以上の抗体またはフラグメントを架橋することにより（例えば、ＵＳ４，６７６，９８０Ａ）；ロイシンジッパーを用いて、二重特異性抗体を作製することにより；二重特異性抗体フラグメントを産生するための“二重特異性抗体”技術を用いることにより（例えば、Holliger et al, PNAS 90(1993) 6444−6448）；および、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を用いて；および、三重特異性抗体を作製することによっても、作製することができる。“オクトパス抗体”を含む３つ以上の機能的抗原結合部位を有するように操作された抗体もまた、本発明に包含される（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１）。本明細書で用いる抗体またはフラグメントにはまた、ＨＴＴに結合し、ならびに別の異なる抗原に結合する、抗原結合部位を含む“２重作用(Dual Acting）Ｆａｂ”または“ＤＡＦ”も含まれる（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０Ａ１を参照のこと）。本発明の抗体またはフラグメントにはまた、ＷＯ２００９／０８０２５１Ａ、ＷＯ２００９／０８０２５２Ａ、ＷＯ２００９／０８０２５３Ａ、ＷＯ２００９／０８０２５４Ａ、ＷＯ２０１０／１１２１９３Ａ、ＷＯ２０１０／１１５５８９Ａ、ＷＯ２０１０／１３６１７２Ａ、ＷＯ２０１０／１４５７９２Ａ、およびＷＯ２０１０／１４５７９３Ａに記載の多重特異性抗体も含まれる。
任意の態様において、本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列変異体が意図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適当な修飾を導入すること、またはペプチド合成により、製造することができる。かかる修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、および／または挿入および／または置換が含まれる。欠失、挿入および置換の任意の組み合わせにより、最終構築物に到達することができ、最終的な構築物は、所望の特徴、例えば抗原結合特性を有する。
任意の態様において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発のための目的の部位には、ＨＶＲおよびＦＲが含まれる。保存的置換は、“好ましい置換”の見出しを付した、以下の表に示される。より実質的な変化は、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下に提供される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入されてよく、製品は、所望の活性、例えば保持された／改善された抗原結合性、低減された免疫原性、または改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣついてスクリーニングされた。
Figure 0006876601
アミノ酸は、共通の側鎖特性に応じてグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスに交換することを必要とする。置換変異体の一種は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を含む。一般的には、さらなる試験のために得られた変異体(複数可)は、親抗体と比較し、特定の生物学的特性（例えば、増大した親和性、免疫原性の低下）における修飾（例えば、改善）を有しており、および／または実質的に親抗体の特定の生物学的特性を保持しているであろう。例示的な置換変異体は、例えば、本明細書に記載のものなどのファージディスプレイベースの親和性成熟技術を用いて、都合よく作製され得る、親和性成熟抗体である。簡潔には、１つ以上のＨＶＲ残基を変異させ、変異体抗体は、ファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングされる。改変（例えば、置換）は、例えば、抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲにおいて行われてもよい。このような改変は、ＨＶＲ“ホットスポット”中、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で突然変異を受けるコドンによってコードされた残基、および／またはＳＤＲ（−ＣＤＲ）に行われ得て、結果として生じた変異体ＶＨまたはＶＬの結合親和性が試験される。親和性成熟は、二次ライブラリーから構築し、再選択することによって行われる。親和性成熟のいくつかの態様では、多様性は、種々の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発）のいずれかによって成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。その後、二次ライブラリーが作成される。ライブラリーは、その後、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基が（例えば、一度に４−６残基）が無作為化されたＨＶＲ指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発またはモデリングを用いて、特に同定することができる。特に、ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ３は、標的とされることが多い。
任意の態様において、置換、挿入または欠失は、そのような改変が、実質的に抗原に結合する抗体の能力を低下させない限り、１つまたは複数のＨＶＲ内に存在してよい。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば、本明細書で提供される、保存的置換）が、ＨＶＲに存在してよい。このような改変は、ＨＶＲの“ホットスポット”またはＳＤＲ外であり得る。上記の変異体ＶＨおよびＶＬ配列の特定の態様では、各ＨＶＲのいずれかは改変されていないか、または１個、２個もしくは３個以下のアミノ酸置換を含む。突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基または領域の同定のための有用な方法は、“アラニンスキャニング突然変異”と呼ばれる。この方法では、標的残基（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの荷電残基）の残基または群を同定し、中性アミノ酸または負荷電アミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置換して、抗原と抗体の相互作用が影響を受けるかどうかを決定する。さらなる置換は、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入することができる。あるいは、またはさらに、抗原−抗体複合体の結晶構造は、抗体と抗原との間の接触点を同定する。このような接触残基および隣接残基は、置換の候補として標的化または除去することができる。変異体は、それらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。アミノ酸配列挿入には、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲の融合体、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）またはポリペプチドに対する抗体のＮ末端またはＣ末端への融合が含まれる。
ハンチンチンのＰＲＲ（プロリンに富む領域）部位は、タンパク質のポリＱ配列の近隣に位置している。ＰＲＲ領域がハンチンチンタンパク質と機能的に関連することが文献から公知である（Modregger et al 2002）。細胞内ハンチンチンのＰＲＲ領域を標的とする組み換えｓｃＦｖライブラリーに由来する細胞内抗体（intrabody）は、ＨＴＴタンパク質の変異型の細胞内ターンオーバーを選択的に増加させることにより、ハンチントン病の動物モデルにおいて有益であることが示されている（Southwell et al., 2011）。ＰＲＲ領域に隣接するポリプロリンストレッチを認識するモノクローナル抗体は、プローブとして既報である（Ko et al. 2001による、ｍＡＢ ＭＷ７）が、ヒトプロテオーム内のハンチンチンに対してユニークではなく、ポリプロリンストレッチからなるそのエピトープの低複雑度（low complexity）であるため、ハンチントン病における治療上の使用は検討されておらず、また実証されてもいない。より一般的には、抗体またはワクチンによるハンチンチンの能動的または受動的標的化は、ハンチンチンが細胞内標的にのみ適した細胞内標的と見なされていたため、これまでは考慮されてこなかった。５以上の連続するプロリンを有するエピトープに結合するモノクローナル抗体ＭＷ７（Ko et al., 2001）とは対照的に、本発明のｍＡＢ ＰＲＲ１３は、複雑なエピトープを有し、例えば実施例５に示す通り、ｐ６７７３上に含まれるそのコアエピトープに特異的かつ選択的に結合する。
本発明によれば、ハンチントン病の予防および／または処置に用いる医薬組成物におけるモノクローナル抗体の使用がとりわけ好ましい。本発明によれば、モノクローナル抗体を含む医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含んでいてよい。さらに、本発明のモノクローナル抗体を含む医薬組成物は、治療剤をさらに含んでいてよいか、または治療剤と物理的に結合されていてよい。このような医薬組成物はまた、アジュバント、好ましくは水酸化アルミニウム共に製剤化されてもよい。
別の態様において、本発明は、例えば実施例４に示す通り、ｐ７５４３の配列（配列番号３）または好ましくはＣ６−１７のコアエピトープを有するＨＴＴタンパク質ンペプチドに結合可能な結合ドメインを有するモノクローナル抗体を提供する。好ましい態様において、該モノクローナル抗体は、例えば実施例５に示す通り、ＧＹＴＦＴＥＹＴ（配列番号６６）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＩＮＰＮＮＧＧＴ（配列番号６７）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、ＡＳＬＤＧＲＤＹ（配列番号６８）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、ＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹ（配列番号６９）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＷＡＳ（配列番号７０）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２およびＫＱＳＹＮＬＬＴ（配列番号７１）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含むモノクローナル抗体（例えば、Ｃ６−１７）であることを特徴とする。
本発明により、カスパーゼ領域５８６は、カスパーゼ６およびカスパーゼ２、８または１０などの他のプロテアーゼによるプロテアーゼ切断に感受性であるハンチンチンタンパク質の位置５８６で、これまでに定義されたカスパーゼ切断部位の周囲のＨＴＴタンパク質上の領域と称される（Wong et al. 2014）。この領域内のプロテアーゼ切断の病因的役割は、Ｇｒａｈａｍら（２００６年）により既報であり、結果として生じたハンチンチンフラグメントの予防または低減が有益であると認識されている。本発明において、例えば実施例１および７に示す通り、この領域に由来する特定のペプチドが、同じ領域に由来する隣接ペプチドよりもハンチンチンに対して予想外に強力にアクセス可能な抗体を誘導できることが実証されている。これらのペプチドにより作製された抗体は、まだ同定されていないエピトープをマスキンし、それによってプロテアーゼ切断を防止することができる。従って、実施例７によるカスパーゼ領域５８６由来の切断阻害抗体は、部位特異的プロテアーゼ切断阻害剤としても定義される。
さらに別の態様において、本発明は、好ましくはハンチントン病の処置における使用のための、例えば実施例５、図１７に示す通り、ｐ７５６４の配列（配列番号２）または好ましくはＭ１Ｄ１のエピトープを有するＨＴＴタンパク質のペプチドに結合可能な結合ドメインを有するモノクローナル抗体を提供する。好ましい態様において、該モノクローナル抗体は、例えば実施例５に記載の、モノクローナル抗体（例えば、Ｍ１Ｄ１）であることを特徴とし、それは、ＧＦＴＦＮＴＹＡ（配列番号７２）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号７３）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、ＶＲＨＧＥＹＧＮＰＷＦＡＹ（配列番号７４）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、ＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号７５）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＫＶＳ（配列番号７６）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２およびＳＱＳＴＨＶＰＹＴ（配列番号７７）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む。
ヒトプロテオーム内に高頻度で発生するペプチド５８３ＩＶＬＤ５８６に由来する従来技術のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体（Warby et al., 2008）とは対照的に、抗体Ｍ１Ｄ１は、例えば実施例４、図１２および実施例５、図１７に示す通り、カスパーゼにより切断されたハンチンチンタンパク質に対して高い特異性を提供することにより、ヒトＲｅｆＳｅｑタンパク質データベース内でユニークである、遊離Ｃ末端アスパラギン酸を含むハンチンチン由来配列ＳＳＥＩＶＬＤからなるコアエピトープを認識する。Ｗａｒｂｙらの抗体とは対照的に、本発明の抗体はより特異的である。それはまた、“ＩＶＬＤ”とは異なるコアエピトープを有する（実施例１、図３参照）。この高い特異性はまた、“ＩＶＬＤ”（Ｗａｒｂｙによる）が、ヒトプロテオーム内で数１００回生じるが、一方、Ｍ１Ｄ１エピトープは、ＢＬＡＳＴ−ＲｅｆＳｅｑ分析によりたった１回のみであるという事実による。本発明で提供されるＭ１Ｄ１は、ユニークなＣＤＲのアイソタイプＩｇＭとは異なるクローンである。
好ましい態様により、本発明の抗体は、以下のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む：
＞Ｃ６−１７ ＶＨコンセンサス アミノ酸配列：
ＭＧＷＳＣＩＭＬＦＬＬＳＧＴＡＧＶＬＳＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＥＹＴＭＨＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＧＩＮＰＮＮＧＧＴＲＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＲＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＳＬＤＧＲＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＫＴＴＡＰＳＶＦＰＬＡ（配列番号６０）
＞ Ｃ６−１７ ＶＬコンセンサス アミノ酸配列：
ＭＶＬＭＬＬＬＬＷＶＳＧＴＣＧＤＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＡＶＳＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＳＣＫＱＳＹＮＬＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫ（配列番号６１）。
好ましい態様により、本発明の抗体は、以下のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む：
＞ＰＲＲ１３ ＶＨコンセンサス アミノ酸配列：
ＭＧＷＳＷＶＭＬＦＬＬＳＧＴＧＧＶＬＳＥＶＱＬＱＱＳＡＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＦＹＭＫＷＶＫＱＳＨＧＫＧＬＥＷＩＧＤＩＤＰＫＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＴＥＤＳＡＶＹＹＣＡＴＹＹＧＹＴＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶＣＧＤＴＴＧＳＳＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦ（配列番号６２）
＞ＰＲＲ１３ ＶＬコンセンサス アミノ酸配列：
ＭＤＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＩＭＳＲＧＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＬＧＥＲＶＴＭＴＣＴＡＳＳＳＶＴＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＨＱＹＲＲＰＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＲ（配列番号６３）。
好ましい態様により、本発明の抗体は、以下のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む：
＞Ｍ１Ｄ１ ＶＨコンセンサス アミノ酸配列：
ＭＤＦＧＬＳＷＶＦＦＶＶＦＹＱＧＶＨＣＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＫＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＱＳＭＬＹＬＱＭＮＮＬＫＴＥＤＴＡＭＹＹＣＶＲＨＧＥＹＧＮＰＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＥＳＱＳＦＰＮＶＦＰＬ（配列番号６４）
＞Ｍ１Ｄ１ ＶＬコンセンサス アミノ酸配列：
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＳＳＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫ（配列番号６５）。
好ましい態様により、本発明の抗体は、ヒト化抗体、とりわけ以下のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む抗体である：
＞ ｈＰＲＲ１３ ＶＬ（重鎖可変領域）：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＴＡＳＳＳＶＴＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＨＱＹＲＲＰＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号９５）
＞ ｈＰＲＲ１３ ＶＨ（重鎖可変領域）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＰＥＶＫＫＰＧＡＴＶＫＩＳＣＫＶＳＧＹＴＦＴＤＦＹＭＫＷＶＱＱＡＰＧＲＧＬＥＷＭＧＤＩＤＰＫＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＭＴＡＤＴＳＴＧＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＳＹＹＧＹＴＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＡＳ（配列番号９６）
＞ ｈＣ６−１７ ＶＬ（軽鎖可変領域）：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＮＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号９７）
＞ ｈＣ６−１７ ＶＨ（重鎖可変領域）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＥＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＭＧＧＩＮＰＮＮＧＧＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＲＴＡＹＶＥＬＳＲＬＴＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＬＤＧＲＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ］（配列番号９８）。
本発明の抗体はまた、例えばグリコシル化の修飾または他の修飾などにより、例えば改善されたオプソニン食作用活性を提供するのに適している、抗体薬物複合体（すなわち、例えばｍＡＢの食作用特性を増強する活性を提供する分子に結合された複合体）として提供されてよい。従って、本明細書で用いる用語“抗体”は、ＨＴＴ、とりわけＨＴＴの特定のエピトープ（または、その天然に存在するフラグメント）に特異的な抗体を意味する。本発明はまた、本明細書に記載されるＨＴＴまたはＨＴＴエピトープに対する結合能を有するＨＴＴ結合タンパク質、例えば足場（scaffold）抗原結合タンパク質にも関する。足場抗原結合タンパク質は、当技術分野で公知であり、例えば、フィブロネクチンであり、設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、抗原結合ドメインのための代替的足場として使用されている。一態様において、足場ＨＴＴ結合タンパク質は、ＣＴＬＡ−４（Evibody）；リポカリン；プロテインＡのＺドメインのようなプロテインＡに由来する分子（Affibody, SpA）、Ａ−ドメイン（Avimer／Maxibody）；ＧｒｏＥＩおよびＧｒｏＥＳなどのヒートショックプロテイン；トランスフェリン（トランスボディー）；アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；ヒトγ−クリスタリンおよびヒトユビキチン（アフィリン）；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコーピオントキシンクニッツ型ドメイン（scorpion toxinkunitz type domain）；ならびに、フィブロネクチン（アドネクチン）からなる群より選択され；それらは、天然リガンド以外のリガンドへの結合を可能にするために、タンパク質工学に付されている。
本発明の抗体は、他のｍＡＢ投薬レジメンから公知であるか、または所与の個体について具体的に評価され最適化された、任意の好適な投与量で投与され得る。例えば、本発明のｍＡＢは、１ｍｇから１０ｇ、好ましくは５０ｍｇから２ｇ、特に１００ｍｇから１ｇの量で投与量形態として提供され得る（または、その投与量で適用される）。通常の投与量はまた、患者の体重１ｋｇ当たりに基づいて決定することができ、例えば、好ましい投与量は、体重１ｋｇ当たり、０．１ｍｇから１００ｍｇ、とりわけ１から１０ｍｇ（投与期間あたり）の範囲である。
特に好ましい二重特異性抗体は、本明細書で定義されるように、２以上のＨＴＴエピトープ、とりわけＰＲＲドメインおよびカスパーゼ領域５８６ドメインの両方に対する結合領域を含む。
別の面において、本発明は、切断されたハンチンチンまたはそのフラグメントまたはそれに由来するペプチド 対 切断されていないハンチンチンまたはそのフラグメントまたはそれに由来するペプチドの検出に基づく薬物スクリーニング用プローブとしての使用のためのモノクローナル抗体を提供する。原則として、Ｍ１Ｄ１は、ｐ７６０５とは対照的にペプチドｐ７５６４を検出することができ（それぞれ、実施例５、図１６および１７に示す通り）、それ故に、ハンチンチンタンパク質のこの領域の関連アスパラギン酸部位５８６でプロテアーゼ活性を定量する手段を提供する。
切断されたＨＴＴ 対 切断されていないＨＴＴの分別検出を可能にする薬剤スクリーニングのためのプローブとして本発明により開示されるｍＡＢ Ｍ１Ｄ１を用いることが、とりわけ好ましい。本発明による、例えば実施例１０で提供されるカスパーゼ６切断アッセイに基づき、ハンチンチンのカスパーゼ領域５８６に特異的に結合するＡＢまたは他の阻害分子をスクリーニングすることが可能であり（図１８に例示されるように）、それにより、一般的にこの部位に対するプロテアーゼ（すなわち、この位置（ａａ５８６）にアクセス可能なプロテアーゼ、すなわち、この位置（かつ、ＨＴＴタンパク質の他の部位ではない）を標的とするプロテアーゼ）のアクセスを阻害する。このアッセイにおいて、Ｍ１Ｄ１は、アスパラギン酸（位置５８６）で酵素的に切断されたか、または実施例のように切断阻害剤によって切断から保護された、ハンチンチンとそのフラグメントとを区別するためのプローブとして用いられる。例えば、本発明の実施例に記載のカスパーゼ切断阻害アッセイにおいて、Ｃ６−１７（およびいくつかのポリクローナル抗体−図１９に示す通り）は、プロトタイプの阻害剤である。かかるアッセイまたはスクリーニング法におけるＣ６−１７（または、その誘導体、とりわけ細胞内誘導体）のこの機能的阻害活性の使用は、本発明の対象である。例えば、カスパーゼ６阻害剤のスクリーニングにおいて、Ｍ１Ｄ１は、プローブであってよく、Ｃ６−１７は、プロトタイプの阻害剤であり得る。
ハンチンチンタンパク質のこの領域でのカスパーゼ切断阻害のためのプロトタイプの阻害剤として、すなわち、実施例７に示す通り、阻害剤スクリーニングアッセイのベンチマーク目的のための陽性対照阻害剤として、または例えば実施例７に示す通り、ハンチンチンのカスパーゼ切断５８６領域に特異的な、抗体誘導型の形態における切断阻害剤の誘導体化のための基礎として、ｍＡＢ Ｃ６−１７を使用することがとりわけ好ましい。
さらに別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、哺乳動物におけるハンチントン病のインビトロでの診断法を提供する：ハンチントン病を診断するため、疾患の進行をモニターするため、あるいは、該サンプル中のＨＴＴレベルまたは酵素的に切断されたＨＴＴが、健常個体またはハンチントン病により遺伝的な影響を受けない個体の対照サンプルと比較して増加する場合、バイオマーカーとしてＨＴＴを使用するために、本発明の抗体、とりわけ抗体ＰＲＲ１３、Ｍ１Ｄ１およびＣ６−１７を用いて、哺乳動物のサンプル中の遊離の、凝集した、複合体化したまたはフラグメント化したＨＴＴのレベルを決定する工程。本発明の過程においては、ハンチントン病の病変もまた、血漿および他の体液および組織材料中に存在するＨＴＴの(低い)量と相関することが示された。このような（低い）ＨＴＴレベルの変化の決定は、本発明の抗体を用いて可能であることが判明したが、もちろん、ＨＴＴレベルの変化を疾患および疾患状態に相関させることは、本発明の開示後の他の技術においても可能となっている。従って、本発明のツールを用いて疾患の診断が可能となったたけでなく、疾患の処置をモニターすることも可能となった。
従って、本発明は、以下の工程を含む、哺乳動物におけるハンチントン病のインビトロでの診断のための方法を提供する：
− 抗体ＰＲＲ１３、Ｍ１Ｄ１またはＣ６−１７を単独で、または組み合わせて用いて、哺乳動物のサンプル中の野生型または変異型ハンチンチンまたはそのフラグメントのレベルを決定する工程；
− 該サンプル中の野生型または変異型ハンチンチンのレベルが、ハンチントン病に遺伝的に影響を受けない健康な個体の対照サンプルと比較して増加する場合、ハンチントン病と診断する工程；
− そして、必要に応じて、とりわけハンチンチンを低下する療法の過程において、好ましくは能動的または受動的ワクチン接種から選択される、顕在化前および顕性のハンチントン病患者のサンプル中のハンチンチンを低減する治療戦略の効果をモニタリングする工程。
本発明により、サンプル中の変異型ＨＴＴレベルの決定は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫アッセイ（ＥＩＡ）、樹脂およびビーズなどの他の表面および担体上の免疫沈降法、質量分析、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)ベースのアッセイ、ウェスタンブロット、またはＦＲＥＴベースのアッセイもしくは好適な造影法（例えば、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ）などの免疫組織化学分析および免疫蛍光ベースの分析ならびにフローサイトメトリーまたは当業者に公知の任意の他の技術などの免疫沈降アッセイまたは捕捉ベースのアッセイを主に伴う。本発明のｍＡｂに加えて、他のＨＴＴ抗体（例えば、先行技術において既に報告されているもの）もまた、そのような診断アッセイに組み込むことができる。
本発明により、サンプルは、好ましくは、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、血漿、血清、尿、唾液、汗もしくは涙液、または他の体液もしくは組織抽出物および細胞抽出物、とりわけ、そこで（変異型）ハンチンチン発現および構造が変化する、脳組織、筋肉組織および血液由来細胞から得られる。
本発明により、哺乳動物としては、ヒトが特に好ましい。
さらに、本発明は、以下の工程を含む、哺乳動物における能動的または受動的ワクチン接種を表すような、ハンチントン病のステージまたはハンチンチンを標的とする新しい治療の効果をインビトロで決定するための方法を提供する：
− 抗体ＰＲＲ１３、Ｍ１Ｄ１またはＣ６−１７を単独で、または組み合わせて用いて、哺乳動物のサンプル中の野生型または変異型ハンチンチンまたはそのフラグメントのレベルを決定する工程（これらの抗体は、ハンチンチンタンパク質またはそのフラグメントを捕捉し、検出するために、次いで、生化学的手段、質量分析または他の分析法による検出のために、単独で、または組み合わせて用いられ得る）；そして
−ハンチントン病のステージを決定する工程。
かかる決定は、所定の患者におけるＨＴＴレベルによっても可能である：これは、所定の患者のＨＴＴレベル（の変化）を経時的に比較すること（同じ個体における相対的決定）により疾患の進行をモニターするために使用することができるだけでなく、疾患ステージの初期診断（患者のコホートと既知の疾患状態を有する患者のコホートとの相関の絶対的決定）にも使用できる。“ＨＴＴレベルの変化”は、−少なくとも長期に亘る処置における−例えば、本発明により処置された患者の血漿ＨＴＴレベルが下がる（例えば、図９に示す通り）ような、ＨＴＴレベルの低下であり得る。しかしながら、一部の患者またはある疾患ステージにおいて、処置の開始時での、ＨＴＴレベルの増加が生じ得る可能性もある。それにもかかわらず、これは、例えば抗体が、血漿中のタンパク質を逆説的に安定化させることができるが、同時にその病理学的活性を阻止するため、処置の成功の指標でもある。この場合、ＨＴＴに対するＡＢが投与されているが、標的化血漿ＨＴＴの逆説的な初期増加が観察され得る。この現象は、例えば、抗ＩｇＥ処置後の逆説的なＩｇＥの増加に見られた。別の例は、安定化によって予想外の増加またはその成長促進作用をもたらす成長ホルモンに対する抗体である。
さらに、本発明は、以下の工程を含む、哺乳動物において、ハンチントン病の進行をモニターするため、またはハンチントン病の治療の有効性をモニターするための方法を提供する：
− 本発明のＰＲＲ１３、Ｍ１Ｄ１およびＣ６−１７を用いて、哺乳動物のサンプルにおける変異型ＨＴＴレベルを決定する工程、および
− 変異型ＨＴＴの得られたレベルを、変異型ＨＴＴレベルの最初の測定で、好ましくは疾患関連症状の診断時の測定で得られた変異型ＨＴＴのレベルと比較することにより、ハンチントン病の進行またはハンチントン病の処置の効果を決定する工程であって、ここで、ＨＴＴレベルの変化（“変化”とは、通常、上記で説明する通り、少なくとも長期的なＨＴＴレベルの低下である。）は、治療の成功の指標であり、好ましくは治療の予後目標および調整のために使用される指標である。
また、この方法は、本発明において抗ＨＴＴワクチンの効果が初めて示されたため、本発明により可能になっている。これらのインビトロスタッギング／モニタリング法においてもまた、本発明のｍＡｂに加えて、他のＨＴＴ抗体（例えば、先行技術において既に報告されているもの）もまた、そのようなアッセイに組み込むことができる。
本発明のこれらの方法において、“健常”と“病的”ＨＴＴ（すなわち、“野生型”または“変異型”ＨＴＴ）とを区別することは重要ではない。これは、これらの２つの形態を区別できない（また、両形態に結合する）抗体は、ＨＴＴレベルを決定するために使用することができ、一般的にこれらの方法において好ましいことを意味する。
別の態様において、本発明は、ハンチントン病の予防または処置のための医薬の製造のための、ｐ６７７３（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ、配列番号１）、ｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）、ｐ７５４３ａ（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８８）、とりわけ誘導体ｐ９３９４（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＣ；配列番号９１）、ｐ９３９５（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＫＣ；配列番号９２）、ｐ９３９６（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９３）、ｐ９３９７（ＫＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９４）；ｐ７５４３ｂ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８９）、ｐ７５４３ｃ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ；配列番号９０）、ｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）、ｐ８３４６（ＣＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ、配列番号５）、ｐ８８５５（ＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＣ、配列番号６）、ｐ８８５８（ＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ、配列番号７）、ｐ８８５９（ＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＣ、配列番号８）、ｐ８８６０（ＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＣ、配列番号９）、ｐ８８６１（ＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＣ、配列番号１０）、ｐ８８６２（ＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号１１）、ｐ８８６９（ＣＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱ、配列番号１２）、ｐ８８６８（ＣＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧ、配列番号１３）、ｐ８８７０（ＣＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰ、配列番号１４）、ｐ８８７１（ＣＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱ、配列番号１５）、ｐ６７７２（ＣＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰ、配列番号１６）、ｐ８８６４（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＣ、配列番号１７）、ｐ８８６５（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＣ、配列番号１８）、ｐ６７７５（ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰａＣ、配列番号１９）、ｐ８８５４（ＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＣ、配列番号２０）、ｐ８８５６（ＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＣ、配列番号２１）、ｐ８８５７（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＣ、配列番号２２）、ｐ８８６６（ＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＣ、配列番号２３）、ｐ８８６７（ＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＤＣ、配列番号２４）、ｐ６７６３（ＣａＭＡＴＬＥＫＬＭＫＡＦＥＳＬＫＳＦＱ、配列番号２５）、ｐ６７６４（ＣａＫＬＭＫＡＦＥＳＬＫＳＦＱ、配列番号２６）、ｐ６７６５（ＣＥＥＱＱＲＱＱＱＱＱＱＱ、配列番号２７）、ｐ６７６８（ＱＱＱＱＱＱＰＰＰＰＰＰＰＰａＫＫＫＣ、配列番号２８）、ｐ７５４１（ＣＳＥＩＶＬＤ、配列番号２９）、ｐ７５５２（ＣＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３０）、ｐ７５６２（ＣＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３１）、ｐ７５６３（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３２）、ｐ７５６７（ＣＥＩＶＬＤ、配列番号３３）、ｐ７５６８（ＣＩＶＬＤ、配列番号３４）、ｐ７６０５（ＣＳＥＩＶＬ、配列番号３５）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、ｐ６７７６ｂ（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ、配列番号３８）、ｐ７７５２（ＣＡＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３９）、ｐ７７５３（ＣＳＡＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４０）、ｐ７７５４（ＣＳＥＡＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４１）、ｐ７７５５（ＣＳＥＩＡＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４２）、ｐ７７５６（ＣＳＥＩＶＡＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４３）、ｐ７７５７（ＣＳＥＩＶＬＡＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４４）、ｐ７７５８（ＣＳＥＩＶＬＤＡＴＤＮＱＹＬ、配列番号４５）、ｐ７７４５（ＣＳＥＩＶＬＤＧＡＤＮＱＹＬ、配列番号４６）、ｐ７７４６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＡＮＱＹＬ、配列番号４７）、ｐ７７４７（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＡＱＹＬ、配列番号４８）、ｐ７７４８（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＡＹＬ、配列番号４９）、ｐ７７４９（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＡＬ、配列番号５０）、ｐ７７５０（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＡ、配列番号５１）、好ましくはｐ６７７３（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ、配列番号１）、ｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）、ｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）、ｐ８３４６（ＣＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ、配列番号５）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、ｐ８８５５（ＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＣ、配列番号６）、ｐ８８５８（ＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ、配列番号７）、ｐ８８５９（ＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＣ、配列番号８）、ｐ８８６０（ＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＣ、配列番号９）、ｐ８８６１（ＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＣ、配列番号１０）、ｐ８８６２（ＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号１１）、ｐ８８６９（ＣＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱ、配列番号１２）、ｐ８８６８（ＣＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧ、配列番号１３）、ｐ８８７０（ＣＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰ、配列番号１４）、ｐ８８７１（ＣＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱ、配列番号１５）、ｐ６７７２（ＣＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰ、配列番号１６）、ｐ８８６４（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＣ、配列番号１７）、ｐ８８６５（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＣ、配列番号１８）、ｐ６７７５（ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰａＣ、配列番号１９）、ｐ８８５４（ＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＣ、配列番号２０）、ｐ８８５６（ＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＣ、配列番号２１）、ｐ８８５７（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＣ、配列番号２２）、ｐ８８６６（ＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＣ、配列番号２３）、およびｐ８８６７（ＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＤＣ、配列番号２４）、とりわけｐ６７７３（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ、配列番号１）、ｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）、ｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、およびｐ８３４６（ＣＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ、配列番号５）からなる群より選択されるハンチンチンのカスパーゼ領域５８６または別のＨＴＴ領域の少なくとも１つの免疫原性ペプチドの使用を提供する。
好ましくは、これらのペプチドは、少なくとも７アミノ酸長であり、好ましい長さは、１６アミノ酸残基まで、好ましくは１４アミノ酸残基まで、または２０アミノ酸残基（例えば、７または８から２０、７または８から１６など）であり得る。従って、本発明のペプチドは、７から３０個のアミノ酸残基、好ましくは７から２０個のアミノ酸残基、より好ましくは７から１６個のアミノ酸残基、最も好ましくは８個のアミノ酸残基を含む。しかしながら、本発明により、より長いペプチドもまた、抗ＨＴＴ抗体により誘導される抗原として用いられてもよい。
好ましい態様において、本発明は、上記で定義したハンチンチンのカスパーゼ領域５８６の少なくとも１つの免疫原性ペプチドを含む、ハンチントン病の予防および／または処置における使用のためのペプチドベースのワクチンに関する。
免疫原性ペプチドは、単離された（ペプチド）形態でワクチン中に提供され得るか、または医薬担体物質またはポリペプチド、脂質または炭水化物構造、とりわけペプチドリンカーまたはタンパク質担体などの他の分子に（共有結合または非共有結合で）結合されているか、もしくはそれと複合体を形成し得る。さらに、ペプチドリンカーまたはタンパク質担体は、Ｔ細胞ヘルパーエピトープから構成されるか、またはそれを含み得る。
別の面において、本発明は、上記で特定されたハンチンチンのカスパーゼ領域５８６の免疫原性ペプチドに関し、ここで、該ペプチドは、例えば実施例７に示される通り、特定のハンチンチンカスパーゼ領域５８６切断阻害剤の作製または同定のために使用される。本発明により、かかる特定のハンチンチンカスパーゼ領域５８６切断阻害剤は、抗体および抗血清およびｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦＡＢ、細胞内抗体（イントラボディー）またはＦｖ、または任意の他の形態、とりわけ本明細書に記載の好ましい形態のいずれかなどのそれらに由来する構造体と定義される。
本発明の特に好ましい態様において、ハンチンチン（ＨＴＴ）のカスパーゼ領域５８６を標的とする抗体または抗原結合分子は、例えば実施例２および３に示される通り、上記のハンチンチンのカスパーゼ領域５８６の少なくとも１つの免疫原性ペプチドまたは組合せを含む上記の特定のペプチドベースのワクチンを用いる免疫化により作製される。
本発明により、かかる抗体または抗原結合分子は、ハンチントン病の予防および／または処置において使用される薬理学的組成物に主に使用される。
本発明は、以下の実施例および図面にさらに開示されているが、それらに限定されることはない。
図１は、ヒトハンチンチンのＰＲＲ領域およびカスパーゼ領域５８６（それぞれ、ＰＲＲおよびＣ６と示す）に由来するペプチドの、ＥＬＩＳＡによる、ハンチンチンの低免疫原性Ｎ末端およびポリＱ領域と比較した免疫力価分析を示す。
図２は、結合性および特異性を示す、一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞の抽出物から捕捉された組み換え６１０アミノ酸Ｎ末端ハンチンチンフラグメントに対するタンパク質捕捉ＥＬＩＳＡによりスクリーニングされた、ヒトハンチンチンのＰＲＲおよびカスパーゼ領域５８６に由来する候補ペプチドワクチンからのマウス免疫血清を示す。
図３は、免疫ペプチドｐ６７７６に対して惹起された個々の免疫血清が、該免疫ペプチド（ｌｏｇＥＣ５０として示される）に対して同等の抗ペプチドＥＬＩＳＡ力価を供することを示す。
図４は、図３の同じ抗血清が、対照的に、タンパク質捕捉ＥＬＩＳＡ（ＯＤ；抗ｒｅｃＨＴＴ６１０）により測定された抗組み換えハンチンチンシグナルにおいて相違を示し、それ故に、同じ免疫原を使用しているにもかかわらず、免疫応答の個々の差が実証されることを示す。可能な治療適用のために、抗rｒｅｃＨＴＴ６１０シグナル強度および特異性は、抗ペプチド力価よりも重要である。
図５は、ＫＬＨ−担体もしくはＰＢＳで処理したＲ６／１マウスまたはＫＬＨ−担体で処理した野生型マウスと比較したとき、ペプチドワクチン（ｐ６７７１、ｐ６７７３）で処理したＲ６／１マウスにおけるハンチンチンシグナル（ＥＭ４８）が変化しないことを示す（数字は、ハンチンチン特異的ｍＡＢ ＥＭ４８を用いる修正した光学濃度［ＣＯＤ］を示す；エラーバー＝標準偏差；ｎ＝１０）。
図６は、図５の結果とは対照的に、変異型ヒトＨＴＴ（ＥＭ４８により標識）を含むシナプトフィジンで標識したシナプス（ｍＡＢ ＳＹ３８を用いて）の数が、ワクチンペプチドの有益な効果を示唆するＫＬＨで処理したＲ６／１マウスと比較した時、ペプチドワクチンで処理したＲ６／１マウス（ｐ６７７１、ｐ６７７３）において顕著に減少することを示す（ｐ＝０，００１）。
図７は、ニューロン特異的なマーカーのＮｅｕＮ、Ｒ６／１マウスを用いて、ＫＬＨまたはＰＢＳで処理した対照群と比較したとき、ペプチドワクチンで処理した群（ｐ６７７１、ｐ６７７３）において、大脳基底核での有意な神経保護効果を示すことを示している。
図８は、大脳基底核のＧＦＡＰ染色が、ＫＬＨおよびＰＢＳ対照それぞれと比較したとき、ペプチドワクチンで処理したＲ６／１動物（ｐ６７７１、ｐ６７７３）において、アストログリア活性化の有意でない減少を示すことを示している。
図９は、単一ワクチン、組み合わせワクチンまたは担体対照（ＫＬＨ）で処理後１２カ月の時点での、それぞれｗｔおよびＹＡＣ１２８をトランスフェクトした動物におけるＦＲＥＴ分析による血漿ハンチンチン決定を示す。
図１０は、種々の示される単一および組み合わせペプチドワクチンで処理されたトランスジェニックＹＡＣ１２８マウスにおける、４、６、８、１０月および１２か月で行われた（“平均Ｍ４”〜“平均Ｍ１２”として示される）、落下までの時間（秒平均値として示される；一群当たりの動物、ｎ＝２５）を測定する処置および対照ＹＡＣ１２８マウスのロータロッド試験を示す。
図１１は、単一アミノ酸のアラニン置換を含む所定のペプチドを用いたペプチドＥＬＩＳＡによるアラニン置換スキャニングによって決定された５種のｐ６７７６ワクチンにより誘導された抗血清のコアエピトープを示す。
図１２は、ｍＡＢ Ｍ１Ｄ１が、ｒｅｃＨＴＴ６１０よりも強く、Ｃ末端に遊離アスパラギン酸５８６を有する組み換えハンチンチンフラグメントを特異的に認識することを示す。
図１３は、ペプチドｐ６７７３で免疫化したマウス由来のハイブリドーマからの上清が、ペプチドＥＬＩＳＡにより試験したとき、９つの予めスクリーニングした候補クローンのうち７つにおいて、免疫ペプチドの強力な認識を提供することを示す。
図１４は、９つのｍＡＢ候補のうち２つのみ、図１３に示すＰＲＲ１３およびＰＲＲ１８が、ｒｅｃＨＴＴ６１０捕捉ＥＬＩＳＡにより試験したとき、組み換えハンチンチンを特異的に認識することを示す。
図１５は、ペプチドｐ７５４３免疫化マウス由来の４つの予め選択した抗ハンチンチンｍＡＢの特異性分析を示す。
図１６は、ペプチドＥＬＩＳＡによる、“切断された”ペプチドｐ７５６４に対する特異性の決定によって予め選択されたｍＡＢのスクリーニングを示す。
図１７は、ｍＡＢ Ｍ１Ｄ１が、遊離Ｃ末端アスパラギン酸を含む少なくとも７ＡＡの長さのカスパーゼ領域５８６切断領域由来のハンチンチンペプチドを認識することを示す。
図１８は、カスパーゼ領域５８６にわたるハンチンチン配列特異的プロテアーゼ阻害剤をスクリーニングする目的でのインビトロカスパーゼ６切断阻害アッセイを示す。
図１９は、最も効率的なカスパーゼ部位阻害剤をスクリーニングする目的での、１８種のポリクローナル血清および対照としてのｍＡＢ Ｃ６−１７のインビトロカスパーゼ６切断阻害アッセイを示す。
図２０は、ヒトハンチンチンを認識する、それぞれＰＲＲ領域およびカスパーゼ切断５８６領域に由来するモノクローナル抗体ＰＲＲ１３およびＣ６−１７の食作用活性を示すインビトロ食作用アッセイを示す。
図２１−２６は、本発明のペプチドの修飾体の能力を示す。
図２７−２９は、抗体免疫化の例を示す。
実施例
実施例１：ハンチンチンのＮ末端を標的とする候補ワクチンペプチドの同定
ワクチンおよび動物の免疫化
ワクチンペプチドを、システインを介したペプチドカップリングのための標準的な推奨手順に従って、アミン−スルフヒドリル架橋リンカーとしてＧＭＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２２３０９）を用いてＫＬＨ担体に結合させた。結合ペプチドを、注射当たり、２００μｌ容量中に３０μｇの結合したペプチドを用いて、水酸化アルミニウムゲルアジュバント（１μｇ／ｍｌの終濃度；アルヒドロゲル；Ｂｒｅｎｎｔａｇ、カタログ番号２１６４５−５１−２）を用いて製剤した。免疫化は、一般的に、メスのＢＡＬＢ／ｃマウスに上記の製剤を用いて行った（一般的に、１群当たり５匹のマウス、１０週齢）。対照群は、非結合ＫＬＨおよび／またはＰＢＳおよびアジュバントのみを用いて免疫化した。動物を、２週間の一定の間隔で３〜６回ワクチン接種し、血漿または血清を、各接種（boost）の一日前および最後の採血にて採取した。
ペプチドＥＬＩＳＡ．
マウスにおけるワクチンにより誘発される免疫応答を、抗凝固剤としてヘパリンを用いてＥＬＩＳＡにより決定した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂ）を、システイン含有ペプチドが安定なチオエーテル結合により結合された担体としてマレイミド活性化されたＢＳＡでコーティングした。滴定のために、血漿希釈液を添加し、ペプチド特異的抗体を、ストレプトアビジン−ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１０８９１５３）と組み合わせた検出抗体としてビオチン化抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１０３４−０８）によって定量化し、次いで、ＡＢＴＳを用いて色素反応させた。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて４パラメータロジスティック曲線近似を用いて決定した。
Ｎ末端ハンチンチンフラグメントｒｅｃＨＴＴ６１０を含む細胞抽出物の作製
２つのＣ末端Ｖ５タグにより伸長されたヒトハンチンチンタンパク質のＮ末端６１０アミノ酸のコーディング領域を含むＤＮＡを合成し、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ制限部位により真核発現ベクターｐＣＤＨ−ＥＦ１−ＭＣＳ ＩＲＥＳ Ｐｕｒｏ（ＳＢＩ；カタログ番号ＣＤ５３２Ａ１）中にクローニングして、プラスミドｐｒｅｃＨＴＴ６１０を得た。クローニング法は、制限消化およびライゲーション反応（ＮＥＢクイックリガーゼキット；カタログ番号Ｍ２２００Ｌ）、細菌の形質転換、その後のクローン選択および分析を含んで、製造者により示される通り、本質的に、標準的な分子生物学的手順に従って行った。アガロースゲルからのＤＮＡフラグメント調製物を、標準的なＤＮＡ精製キット（Quiagen；カタログ番号２７１０６）を用いて行った。ＨＥＫ２９３フリースタイル細胞（Invitrogen；カタログ番号Ｒ７９０−０７）を、製造者により示される通りに培地中で培養し、ｐｒｅｃＨＴＴ６１０（または、対照として空のベクター）をＭＡＸｒｅａｇｅｎｔ（Invitrogen；カタログ番号１６４４７−１００）およびＯｐｔｉｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ；カタログ番号３１９８５）を用いて一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４−４８時間後に、ＮＰ−４０抽出バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８）を用いて細胞溶解して、ＨＥＫ細胞溶解物を得て、アリコートに分け、−８０℃で貯蔵した。タンパク質濃度を、Ｑｕｂｉｔ（Invitrogen；カタログ番号Ｑ３２８６６）を製造業者の指示書に従って用いて測定した。
タンパク質捕捉ＥＬＩＳＡによるハンチンチンの検出
Ｎ末端フラグメントＨＴＴ６１０への抗体の結合を、５０μｌの１：５０００希釈したウサギ抗Ｖ５ ｍＡＢ（Sigma、カタログ番号Ｖ８１３７）でコーティングしたＭａｘｉｓｏｒｂ(商標)ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ；カタログ番号４３９４５４）を用いて、、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）でブロッキングし、マウス抗ＨＴＴ血清のいくつかの希釈液（１：１００；１：３００および１：９００）または対照としてｍＡＢ２１６６（１：２０００希釈；Millipore、カタログ番号ＭＡＢ２１６６）と共に室温にて１時間インキュベート後に、ＨＥＫ細胞抽出物からの組み換えハンチンチン（１００ｎｇ／μｌ総タンパク質）を捕捉して、標準的タンパク質捕捉ＥＬＩＳＡ法により決定した。ＥＬＩＳＡインキュベーション、洗浄および検出法を、標準的な手順に従って行った。
血漿からの抗体の親和的精製
ヨードアセチル活性化磁気ビーズ（ＢｃＭａｇ(商標)；Biocloneカタログ番号ＦＧ−１０２）を、製造業者のプロトコルに従ってシステイン含有ペプチドと結合させた。室温で２時間血漿／ｍＡＢをインキュベーション後、ビーズを高塩緩衝液（３５０ｍＭの最終ＮａＣｌ濃度に添加された、ＰＢＳ、０，２％ トライトンＸ−１００）で洗浄し、結合抗体を酸溶出により回収した（１００ｍＭ グリシン；ｐＨ２，８で、４溶出工程）。７５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８の終濃度で中和したのち、抗体を、１００μｌ容量のＳｐｉｎ−Ｘ ＵＦ５００チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号ＣＬＳ４３１４７８）に濃縮し、タンパク質濃度を、タンパク質抽出物について記載の通りに測定した。
結果：
ハンチンチンペプチドでワクチン接種したマウスからの免疫血清は、ハンチンチンタンパク質のポリプロリンに富む領域（ＰＲＲ）およびカスパーゼ領域５８６（Ｃ６）に由来するペプチドワクチンが、一般的に、それぞれタンパク質のポリグルタミン（ポリＱ）またはＮ末端領域（最初の１７アミノ酸を含む）に由来する相当するペプチドよりもペプチドＥＬＩＳＡ分析（図１）においてより高い力価を提供することを示す。タンパク質ＥＬＩＳＡ（図２）により分析するとき、ＰＲＲ由来免疫血清およびカスパーゼ領域５８６由来免疫血清は、特異的かつ免疫原性のワクチンペプチド候補の定義を可能とする免疫ペプチドのペプチド配列に応じて、抗ハンチンチンタンパク質シグナル強度（図４）およびタンパク質特異性（図２）に違いを示す。ペプチドｐ７５６４は、Ｃ末端にアスパラギン酸を含むハンチンチン配列を特異的に認識する免疫血清を誘導し（図３）、それにより、位置５８６にてハンチンチンのカスパーゼ切断により生成された疾患特異的なハンチンチンのネオエピトープに対する手段を提供する。図１：ＥＬＩＳＡによる免疫力価分析は、ヒトハンチンチンのＰＲＲ領域およびカスパーゼ領域５８６に由来する候補ペプチド（それぞれ、ＰＲＲおよびＣ６として示される）が、平均力価が１：１００００未満であるポリグルタミン領域またはＮ末端由来ペプチド（それぞれ、ｐｏｌｙＱおよびＮｔｅｒとして示される）で免疫化した動物とは対照的に、ペプチドワクチンにより免疫化したマウスにおいて１：１００００以上の平均力価を提供することを明らかにする。力価は、５つの個々の血清からの平均ＥＣ５０を表す；エラーバーは、標準偏差を示す。
図２：ヒトハンチンチンのＰＲＲおよびカスパーゼ領域５８６に由来する候補ペプチドワクチンからのマウス免疫血清を、一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ細胞の抽出物から捕捉された組み換え６１０アミノ酸Ｎ末端ハンチンチンフラグメントに対するタンパク質捕捉ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。抗ハンチンチン（“ｒｅｃＨＴＴ６１０”）およびバックグラウンドシグナル（“ＣＴＲＬ”）は、ペプチドＥＬＩＳＡ（図１に表示）に見られるように、均一な抗ペプチドシグナル分布にも関わらず異なるペプチド間で異なる。棒グラフは、１：１００の血清希釈で、それぞれ組み換えハンチンチン（ＯＤ［ｒｅｃＨＴＴ６１０抽出物］；薄い灰色の棒グラフ）または対照抽出物（ＯＤ［モックをトランスフェクトした対照（ｃｔｒｌ）抽出物］；濃い灰色の棒グラフ）の何れかに対して試験した、５つの集められた免疫血清それぞれのシグナルを表す。
図３：免疫ペプチドｐ６７７６に対して惹起された５つの個々の免疫血清は、免疫ペプチドに対して同等の抗ペプチドＥＬＩＳＡ力価を提供する（ｌｏｇＥＣ５０として示される）。
図４：抗ペプチド力価（図３に示す）とは対照的に、同じ免疫血清は、タンパク質捕捉ＥＬＩＳＡ（ＯＤ；抗ｒｅｃＨＴＴ６１０）により測定される抗組み換えハンチンチンシグナルにおいて相違を示し、標的タンパク質に関して免疫応答の個人差が実証されるが、ペプチドに対しては変動しないことが実証される。このことは、治療用ワクチンペプチド選択のために、抗ペプチド力価よりも抗組み換えＨＴＴシグナルが重要であることを強調する。
実施例２：変異体ヒトハンチンチンの第一エクソンを過剰発現するトランスジェニックＲ６／１マウスのペプチド免疫は、大脳基底核内の神経病理学的マーカーに反映された有益な変化を提供する。
比較的強力なプロモーターの下でのヒト変異ハンチンチンのエクソン１を発現するＲ６／１マウス（Bard et al. 2014およびそこに引用される文献）は、実施例１に記載の通りに、８、１０、１４および２４週でワクチン接種を受けた。力価をモニターするために、血漿を、８、１６、２８および３２週目に採取した。
免疫組織化学
免疫組織化学による分析は、本質的に、大脳基底核のタンパク質検出マーカーとして抗体ＥＭ４８、ＳＹ３８、ＧＦＡＰおよびＮｅｕＮ（Millipore、それぞれカタログ番号ＭＡＢ５３７４、ＭＡＢ５２５８、ＡＢ５８０４およびＭＡＢ３７７）を用いて、Mandler et al. 2014 [PMID: 24525765]に記載の通りに行った。
結果：
ペプチドワクチンで免疫化した６月齢のトランスジェニックＲ６／１マウスの大脳基底核の免疫組織化学的分析は、変異ヒトハンチンチンの第一エクソンの過剰発現を示した。ペプチドワクチン接種の効果は、ペプチドｐ６７７１およびｐ６７７３で免疫化ものと、対照群（ＫＬＨ、ＰＢＳ）とを組織病理学的に比較した。明確な神経保護およびおよびシナプスでのハンチンチン減少効果は、ＰＲＲ由来ワクチンでのワクチン接種に際して観察された。
図５：ＫＬＨ担体もしくはＰＢＳで処理したＲ６／１マウスまたはＫＬＨ担体で処理した野生型マウスと比較したとき、ペプチドワクチン（ｐ６７７１、ｐ６７７３）で処理したＲ６／１マウスにおいてハンチンチンシグナル（ＥＭ４８）の変化はなかった（数字は、ハンチンチン特異的ｍＡＢ ＥＭ４８を用いて修正した光学密度［ＣＯＤ］である；エラーバー＝標準偏差；ｎ＝１０）。
図６：対照的に、変異型ヒトＨＴＴ（ＥＭ４８でマーク）を含むシナプトフィジンでマークされたシナプス（ｍＡＢ ＳＹ３８を用いて）は、ＫＬＨで処理したＲ６／１マウスと比較したとき、ペプチドワクチンで処理したＲ６／１マウス（ｐ６７７１、ｐ６７７３）において顕著に減少した（ｐ＝０，００１）（スチューデントのｔ検定；処理群あたり、ｎ＝１０匹の動物）。数字は、ＥＭ４８シグナルと共局在するＳＹ３８陽性シナプスの比率（％）を示す（エラーバー＝標準偏差；ＣＯＤ＝修正光学密度）。
図７：ニューロン特異的なマーカーＮｅｕＮを用いて、Ｒ６／１マウスは、ＫＬＨまたはＰＢＳで処理した対照群と比較したとき、ペプチドワクチン処理群（ｐ６７７１、ｐ６７７３）において大脳基底核に有意な神経保護効果を表す（それぞれ、ｐ＝０，００２およびｐ＝０，０１。スチューデントのｔ検定；ｎ＝１０）．Ｗｔ ＫＬＨ＝野生型対照；数字は、修正光学密度（ＣＯＤ）を示す；エラーバー＝標準偏差。
図８：大脳基底核のＧＦＡＰ染色は、ｔそれぞれＫＬＨおよびＰＢＳ対照と比較したとき、ペプチドワクチン処理したＲ６／１動物（ｐ６７７１、ｐ６７７３）におけるアストログリア活性化の有意でない減少を示す（ＣＯＤ＝修正光学密度；ｗｔ ＫＬＨ＝野生型対照；エラーバー＝標準偏差）。
実施例３：組合せワクチン処置は、４−１２月齢の動物におけるロータロッド試験によって測定されるように運動の改善と合わて、ＹＡＣ１２８トランスジェニックマウスにおける減少した血漿ハンチンチンレベルをもたらす。
ＹＡＣ１２８マウスの免疫化
全長の変異型ヒトハンチンチンを発現するＹＡＣ１２８マウス（Bard et al. 2014およびそこに引用される文献を参照のこと）およびＷＴ対照同腹子の５つのコホートは、合計１５０匹のＹＡＣ１２８および合計２５匹のＷＴから構成した。ＷＴマウスを、ＫＬＨ対照で処理した。ＹＡＣ１２８マウスを、５つの実験ペプチド処理群およびＫＬＨ対照群を含む６つの処理群に分けた。マウスを、実施例１に記載の通りに、１、２、３、６および９月齢で皮下注射によって処理した。組み合わせワクチンについては、１用量当たり３０μｇの総ペプチド量を、２００μｌの用量当たり各１５μｇ＋１５μｇの２つのペプチドを組み合わせることによって維持した。
ワクチン処理したＹＡＣ１２８マウスにおける血漿ハンチンチンレベルの決定
血漿ハンチンチンレベルは、Ｗｅｉｓｓら（２００９）によって既報の２つの検出抗体間の比をもたらすＦＲＥＴ（フェルスター共鳴エネルギー転移）ベースの検出アッセイによって決定した［ＰＭＩＤ：１９６６４９９６］。
ロータロッド試験
２月齢のＹＡＣ１２８マウスを、毎分１８回転の一定のスピード（ＲＰＭ）で回転棒（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｌｅ）上にて３日連続して訓練した。マウスは、１時間の試行間間隔（inter−trial interval；ITI）で１日当たり３ｘ１２０秒の訓練試行を受けた。ロッドから落ちたマウスは、試行中に直ちに交換した。各訓練試行についての最初の落下までの時間と落下数を記録した。各マウスについて３回の試行の平均値を記録した。２から１２月齢の２月間隔での縦ロータロッド試験のために、５ＲＰＭから４０ＲＰＭで３００秒以上の加速プログラムを使用した。マウスは、１時間のＩＴＩで３回の試験を受け、最初の落下までの時間記録した。３回の試験の平均値を記録した。
結果：
図９：それぞれｗｔおよびＹＡＣ１２８トランスジェニック動物における、単回ワクチン処理、組合せワクチン処理または担体対照（ＫＬＨ）処理の１２月後での、ＦＲＥＴ分析による血漿ハンチンチン決定。ＰＲＲおよびカスパーゼ領域５８６領域からのペプチドワクチンを用いた（それぞれ、ｐ６７７１およびｐ７５６４＆ｐ７５４３）。血漿ハンチンチンの有意な減少は、担体対照処理（ＫＬＨ）の血漿ハンチンチンレベルと比較したとき、ペプチドの組合せｐ７５４３＋ｐ７５６４またはｐ７５４３＋ｐ６７７１を用いる併用処理により達成され得る（それぞれ、ｐ＜０，００１およびｐ＜０，０１；スチューデントのｔ検定；処理群あたりｎ＝２５匹の動物）。数字は、相対単位（ＦＲＥＴ）を示す；エラーバーは標準偏差を示す。
図１０：落下までの時間（秒単位の平均値として示す；一群あたりｎ＝２５匹の動物）を測定する、処理および対照ＹＡＣ１２８マウスにおけるロータロッド試験を、記載される通り、種々の単一および組合せペプチドワクチンで処置されたトランスジェニックＹＡＣ１２８マウスにおいて、４、６、８、１０および１２月（“平均Ｍ４”−“平均Ｍ１２”と示される）に行った。特に、組み合わせワクチン群“ｐ７５４３＋７５６４”および“ｐ７５４３＋ｐ６７７１”は、それぞれ単一のペプチドで処理された群ｐ７５４３、ｐ６７７１および７５６４と比較したとき、この試験において全体的に優れた性能を示した。運動の改善は、担体対照群と比較したとき、組み合わせワクチン群ｐ７５４３＋７５６４においてＭ４−Ｍ１０で有意に改善された（それぞれ、ｐ＜０，０３、０，０２、０，０１；スチューデントのｔ検定、ｎ＝２５）。この知見は、図９に記載の、血漿ハンチンチン低下と一致する。
実施例４：ペプチドｐ６７７３、ｐ７５６４およびｐ７５４３での免疫化によって得られたモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のエピトープマッピング
コアエピトープの決定
ペプチドエピトープマッピングを、実施例１に記載の通りにＥＬＩＳＡにより、あるいはStadler et al. 2008に記載のペプチドマイクロアレイおよびペプチドマイクロアレイと組み合わせた単一アミノ酸置換スキャニングを適用することにより、力価値（ＯＤ［ＥＣ５０］）の決定によってアラニン置換スキャニングを用いて行った。簡潔には、ペプチドの各位置での単一アラニン置換を含むペプチドをアレイ上にスポットし、単一の位置での置換によるシグナルの欠失を、蛍光標識された二次抗体とＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社によるＯｄｙｓｓｅｙイメージングシステムとの組み合わせによって決定した。これは、エピトープへのペプチドの各個々のアミノ酸の寄与の評価を可能にした。この方法を用いて、元の免疫化ペプチドのマッピングに加えて、各個々の位置についての単一のアラニン置換変異体もマッピングするか、またはペプチドをマイクロアレイ上にスポットし、それぞれモノクローナル抗体または免疫血清をハイブリダイズさせて試験した。アラニン置換されたペプチドから得られたシグナルが、元の免疫ペプチドからのシグナルの７０％未満まで低下したとき、それぞれのアラニン置換されたアミノ酸位置を、コアエピトープの一部として定義した。個々の血清またはｍＡＢから得られたコアエピトープ配列を以下に記載する。
結果：
ポリクローナル、アフィニティー精製された抗体およびモノクローナル抗体を、ＰＲＲ領域由来のペプチド（ｐ６７７１およびｐ６７７３を含む）およびカスパーゼ領域５８６由来のペプチド（ｐ７５４３およびｐ６７７６を含む）で免疫した個々のマウスから誘導した。エピトープを、アラニンスキャニングを用いてマッピングした。簡潔には、個々の血清およびモノクローナル抗体のエピトープを、ペプチドマイクロアレイまたは常套のペプチドＥＬＩＳＡの何れかを用いて各位置についての単一アミノ酸置換を有するペプチドに対する抗体を試験することにより決定した（図１１に例示の通り）。
単一アミノ酸置換スキャニングによって決定されるような、ＰＲＲ領域由来のペプチドｐ６７７１およびｐ６７７３についてのペプチドおよびエピトープアライメント：
ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ．．．．．．免疫ペプチドｐ６７７１
ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ．．免疫ペプチドｐ６７７３
．．．．．．．．．．ＬＬＰＱＰ．．．．．ｍＡＢ ＰＲＲ１３についてマッピングされたエピトープ
．．．．ＰＰＱＡＱＰＬ．．．．．．．．．ポリクローナルｐ６７７３血清１についてマッピングされたエピトープ
．．．．ＰＰＱＡＱＰ．．．．．．．．．．ポリクローナルｐ６７７３血清２についてマッピングされたエピトープ
．．．．．．．．ＱＰＬＬ．．．．．．．．ポリクローナルｐ６７７３血清３についてマッピングされたエピトープ
．．．．．ＰＱＡＱＰＬＬ．．．．．．．．ポリクローナルｐ６７７３血清４についてマッピングされたエピトープ
（配列番号１、４および７７−８１）。
ｐ７５４３ワクチンのペプチドおよびエピトープアライメントは、単一アミノ酸置換スキャニングによって決定されるように、ポリクローナル免疫血清およびｍＡＢ Ｃ６−１７を誘導した。
ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ 免疫ペプチドｐ７５４３
ＱＹＬＧＬＱＩＧ モノクローナルＡＢ Ｃ６−１７についてマッピングされたエピトープ
ＹＬＧＬＱＩＧ ポリクローナルｐ７５４３血清１についてマッピングされたエピトープ
ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧ ポリクローナルｐ７５４３血清２についてマッピングされたエピトープ
ＤＮＱＹＬＧＬ ポリクローナルｐ７５４３血清３についてマッピングされたエピトープ
ＹＬＧＬＱＩＧ ポリクローナルｐ７５４３血清４についてマッピングされたエピトープ
（配列番号３および８２−８６）。
アスパラギン酸５８６にわたるカスパーゼ領域５８６に由来するペプチドについてのペプチドアライメントおよびエピトープアライメント：
図１１：５つのｐ６７７６ワクチンにより誘導された免疫血清のコアエピトープを、単一アミノ酸のアラニン置換を含む記載されるペプチドを用いるペプチドＥＬＩＳＡによりアラニン置換スキャニングによって決定した。５つの血清（濃色から淡色の棒グラフで示される）を、記載の通り、アラニン置換ペプチドにハイブリダイズさせた（ペプチド配列について、表１参照）。その結果、５匹の動物のうち２匹が、それぞれアラニン置換ペプチドｐ７７５４、ｐ７７５６、ｐ７７５７およびｐ７７５８によりシグナルの減少を示し、それによって、ポリクローナル抗血清についてのアミノ酸配列ＩＶＬＤを有するコアエピトープを示す。数字は、力価ＯＤ（ｌｏｇＥＣ５０）の比率を示している［Ａｌａ置換ペプチド：ｗｔ−ペプチド］。
ｐ７５６４により誘導された抗血清およびｍＡＢ Ｍ１Ｄ１のエピトープマッピングは、実施例５、図１７に提供される。
図１２：ｍＡＢ Ｍ１Ｄ１は、切断されていないｒｅｃＨＴＴ６１０よりも強力に、Ｃ末端に遊離アスパラギン酸５８６を有する組み換えハンチンチンフラグメントを特異的に認識する。タンパク質ＥＬＩＳＡを、６１０および５８６アミノ酸長の組み換えハンチンチン（それぞれ、ＨＴＴ６１０およびＨＴＴ５８６）を用いて行った（実施例１に記載の通りに）。値は、ｍＡＢ Ｍ１Ｄ１シグナル（ＯＤ；実施例１で説明した通りの、タンパク質捕捉ＥＬＩＳＡ）と、ｍＡＢ ２１６６対照抗体シグナルとの比を示す。値は、タンパク質ローディング対照として両フラグメント中に存在する内部エピトープを認識する対照ｍＡＢ ２１６６に対して正規化した。
実施例５：モノクローナル抗体ＰＲＲ１３、Ｃ６−１７およびＭ１Ｄ１の生成および特性化
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体の製造および単離のために、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹハイブリドーマクローニングキット（STEMCELL technologies、カタログ番号２８４１１）を製造業者の指示書に従って用いた。簡潔には、ハイブリドーマの融合を、ＨＡＴ選択下で骨髄腫細胞株ＳＰ２−０を用いて実施し、最初に、上清を、それぞれ免疫ペプチドおよびバックグラウンド決定のための無関係の対照ペプチドを用いてペプチドＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。Ｍ１Ｄ１の場合に、遊離Ｃ末端アスパラギン酸を含むペプチドｐ６７７６に対するＥＬＩＳＡを、実施例５に記載の通り、遊離Ｃ末端アスパラギン酸を含む切断されたペプチドに対する特異性を決定するために用いた。候補ｍＡＢを、記載の通りに親和的に精製し、実施例に記載の通りにタンパク質ＥＬＩＳＡによりｒｅｃＨＴＴ６１０に対して試験した。スクリーニングした融合クローンの数は、一般的に、各融合についてそれぞれ５００個であった。ＶＬおよびＶＨ領域のスクリーニングについて、融合クローンからｍＲＮＡを抽出し、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて逆転写し、そして可変ドメインプライマーを用いてＰＣＲ増幅して、ＶＨおよびＶＬ領域の両方を増幅させた。ＶＨおよびＶＬ生成物を、標準的なＰＣＲクローニング法（Invitrogen、カタログ番号Ｋ４５６０−０１）を用いてクローニングし、ＴＯＰ１０細胞中に形質転換し、ＰＣＲにより陽性の形質転換体をスクリーニングした。選択したコロニーを採取し、ＡＢＩ３１３０ｘｌ遺伝子分析器でのＤＮＡ配列決定により分析した。
抗体のアフィニティー精製
ｍＡＢおよびポリクローナル抗体を、ハイブリドーマ上清（ＳＮ）および血漿のそれぞれから、製造業者のプロトコルに従ってシステイン含有ペプチドが結合されているＢｃＭａｇ(商標)ヨードアセチルにより活性化した磁気ビーズ（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ、ＦＧ−１０２）を用いて単離した。室温で２時間、血漿／ＳＮのインキュベーション後、ビーズを高塩緩衝液（ＰＢＳ、０．２％ トライトンＸ−１００、３５０ｍＭの終濃度までＮａＣｌを添加）で洗浄し、結合した抗体を酸性溶出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号２１００４）で４回溶出した。ＨＥＰＥＳ ｐＨ８（７５ｍＭの終濃度）で中和後、溶出された抗体を濃縮し、緩衝液を、Ｓｐｉｎ−Ｘ ＵＦ５００チューブ（Corning、ＣＬＳ４３１４７８）を用いて１００μｌ容量のＰＢＳに交換した。抗体濃度を、Ｑｕｂｉｔシステム（Invitrogen、ＣａｔＮｒ．Ｑ３２８６６）を製造業者の指示書に従って用いて測定した。
結果：
抗体ＰＲＲ１３は、ペプチドｐ６７７３を免疫原として用いるハイブリドーマ技術によって生成された。ペプチドｐ６７７３は、実施例２に示す通りＲ６／１トランスジェニック動物の能動免疫において有益な神経保護効果を示し、ｐ６７７１と重複するワクチン候補の１つである。ＰＲＲ１３を、図１１に示す通り、ＰＲＲに由来するペプチドを認識する候補ｍＡＢを予め選択された９つから選択した。図１３に列記した候補ｍＡＢのうち、ＰＲＲ１３を、図１２に示す通り、組み換えＨＴＴ６１０にハイブリダイズしたとき、その好ましいシグナル／ノイズ比に基づいて選択した。
図１３：ペプチドｐ６７７３で免疫化したマウスに由来するハイブリドーマからの上清は、ペプチドＥＬＩＳＡによって試験したとき、９つの予めスクリーニングした候補クローンのうち７つで、免疫ペプチドの強力な認識を提供する。
図１４：特異的抗ペプチドシグナル（図１１）とは対照的に、９つのｍＡＢ候補のうち２つのみ、すなわちＰＲＲ１３およびＰＲＲ１８のみが、ｒｅｃＨＴＴ６１０捕捉ＥＬＩＳＡ（実施例１で説明した通り）により試験したとき、組み換えハンチンチンを特異的に認識する。これらの２つの候補は、優れたシグナル対ノイズ比（すなわち、＞＝４；計算されたｒｅＨＴＴ６１０特異的シグナル：ＨＥＫ対照抽出物）を提供し、ＰＲＲ１３を、エピトープの特徴付け（実施例４を参照）および可変鎖配列決定（以下参照）のために選択した。ＰＲＲ１３を、ＩｇＧサブタイプマウスＩｇＧ２ａとして決定した。
＞ＰＲＲ１３ ＶＨ コンセンサス アミノ酸配列（配列番号６２）：
ＭＧＷＳＷＶＭＬＦＬＬＳＧＴＧＧＶＬＳＥＶＱＬＱＱＳＡＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＦＹＭＫＷＶＫＱＳＨＧＫＧＬＥＷＩＧＤＩＤＰＫＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＴＥＤＳＡＶＹＹＣＡＴＹＹＧＹＴＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶＣＧＤＴＴＧＳＳＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦ
＞ＰＲＲ１３ ＶＬ コンセンサス アミノ酸配列（配列番号６３）：
ＭＤＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＩＭＳＲＧＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＬＧＥＲＶＴＭＴＣＴＡＳＳＳＶＴＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＨＱＹＲＲＰＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＲ。
抗体Ｃ６−１７を、免疫原としてペプチドｐ７５４３を用いてハイブリドーマ技術によって作製した。ペプチドｐ７５４３は、実施例３に示されているように、ＹＡＣ１２８トランスジェニック動物において有益な治療効果を示した。抗ｒｅｃＨＴＴ６１０シグナルは、図１３に示すように、このスクリーニングからの４つの予め選択されたｍＡＢ間で同等であったが、シグナル対ノイズ比は、ｒｅｃＨＴＴ６１０捕捉ＥＬＩＳＡ（実施例１に記載の通りに行う）を示す図１４に示す通り、これらの候補間で有意に異なった。その特異性およびＩｇＧサブタイプ（マウスＩｇＧ２ａとして決定される）に基づいて、Ｃ６−１７を、エピトープの特徴付け（実施例４を参照）および可変鎖配列決定のために選択した。
図１５：ペプチドｐ７５４３で免疫化したマウスに由来する４つの予め選択された抗ハンチンチンｍＡＢの特異性分析。４つのｍＡＢ候補体の値は、対照抽出物に対する組み換えハンチンチン特異的ＯＤ−シグナル（実施例１に記載の通りタンパク質捕捉ＥＬＩＳＡにより決定される）のシグナル対ノイズ比を示す。ｍＡＢ Ｃ６−１７は、最良のシグナル対ノイズ比を提供する。
＞Ｃ６−１７ ＶＨ コンセンサス アミノ酸配列（配列番号６０）：
ＭＧＷＳＣＩＭＬＦＬＬＳＧＴＡＧＶＬＳＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＥＹＴＭＨＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＧＩＮＰＮＮＧＧＴＲＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＲＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＳＬＤＧＲＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＫＴＴＡＰＳＶＦＰＬＡ
＞ Ｃ６−１７ ＶＬ コンセンサス アミノ酸配列（配列番号６１）：
ＭＶＬＭＬＬＬＬＷＶＳＧＴＣＧＤＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＡＶＳＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＳＣＫＱＳＹＮＬＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫ。
抗体Ｍ１Ｄ１を、免疫原としてペプチドｐ７５６４を用いてハイブリドーマ技術によって作製した。ペプチドｐ７５６４は、実施例３に記載の通り、ＹＡＣ１２８トランスジェニック動物において有益な治療効果を示すワクチン候補の一部である。モノクローナル抗体Ｍ１Ｄ１を、実施例１、図３に示す通り、例えばｐ６７７６などの配列に包含されるこのアスパラギン酸残基を含むペプチドに対する、Ｃ末端に遊離アスパラギン酸を含むペプチドへの結合のディファレンシャルスクリーニングによって選択した。“切断された”配列に対するその特異性に基づいて、モノクローナル抗体Ｍ１Ｄ１を、さらなるエピトープの特徴付けおよび可変鎖配列決定のために選択した。それをマウスＩｇＭと表記し、それは、カスパーゼ６またはアミノ酸位置Ｄ５８６を切断する任意の他のプロテアーゼによるタンパク質または対応するペプチド配列の切断の際に生成されるヒトハンチンチンフラグメントのネオエピトープに結合する。
図１６：ペプチドＥＬＩＳＡ（実施例１で説明した通り）による“切断された”ペプチドｐ７５６４に対する特異性の決定による、予め選択されたｍＡＢのスクリーニング。例えば、Ｍ１−Ｃ２とは対照的に、ｍＡＢ Ｍ１Ｄ１は、最も好ましいｐ７５６４対ｐ６７７６のＯＤシグナル比を示す。従って、Ｍ１Ｄ１は、位置５８６でのタンパク質分解的切断によって生成されるネオエピトープに特異的である。ｐ７５６４のＣ末端アスパラギン酸は、カスパーゼ６および可能性のある他のカスパーゼにより生成されたＣ末端切断点に対応する。従って、実施例３に示すように、治療的に有益なペプチドｐ７５６４を用いて作製されたポリクローナル抗血清と同様にこの部位での特異的切断を検出するための手段が提供される。
図１７：ｍＡＢ Ｍ１Ｄ１は、遊離Ｃ末端アスパラギン酸を含む少なくとも７ＡＡ長のカスパーゼ６切断領域からのハンチンチンペプチドを認識する。これとは対照的に、より短いペプチドまたは遊離Ｃ末端アスパラギン酸を有さないペプチドは、Ｍ１Ｄ１によって認識されないか、またはごく弱い認識であり、これにより、切断されたヒトハンチンチンタンパク質の遊離アミノ酸位置５８６などの遊離ＣＯＯＨ末端アスパラギン酸を有する切断された配列に対するこのモノクローナル抗体の特異性が実証される（棒グラフは、１ｎｇ／μｌのｍＡＢ濃度でのペプチドＥＬＩＳＡからのＯＤを示す；ペプチドの名称は左から右へ、以下の通りである：ｐ７５６４、ｐ７５６２、ｐ７５５２、ｐ７５４１、ｐ７５６７、ｐ７５６８、ｐ７６０５、ｐ６７７７）。
＞Ｍ１Ｄ１ ＶＨ コンセンサス アミノ酸配列（配列番号６４）：
ＭＤＦＧＬＳＷＶＦＦＶＶＦＹＱＧＶＨＣＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＫＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＱＳＭＬＹＬＱＭＮＮＬＫＴＥＤＴＡＭＹＹＣＶＲＨＧＥＹＧＮＰＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＥＳＱＳＦＰＮＶＦＰＬ
＞Ｍ１Ｄ１ ＶＬ コンセンサス アミノ酸配列（配列番号６５）：
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＳＳＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫ。
実施例６：カスパーゼ切断部位阻害剤
インビトロカスパーゼ切断阻害アッセイ
カスパーゼ６阻害アッセイを、Ｍａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレート（Thermo; 439454）を用いて、そこに５０μｌの２０ｎＭ ＢＳＡ結合ペプチド（図１８に示す）を室温で１時間コーティングし、次いで１５０μｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）で１時間処理して、室温にて１時間、示す通りそれぞれ、アフィニティー精製したポリクローナル血清（３ｎｇ／μｌ）またはアフィニティー精製したｍＡＢ（１０ｎｇ／μｌ）と共にインキュベートして行った。洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）で数回洗浄後、１ｘカスパーゼ６緩衝液（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ； １０６８−８０）で希釈した５Ｕカスパーゼ６酵素（Ｅｎｚｏ；ＢＭＬ ＳＥ１７０−５０００）を各ウェルに添加し、３７℃にて３０分間インキュベートした。カスパーゼアクセス可能性の程度を反映するカスパーゼ６ペプチド切断により生成された新たに曝露されたエピトープの定量化を、遊離Ｃ末端アスパラギン酸含有エピトープの検出のためにペプチドｐ７５６４により誘導される抗体を用いて、実施例１に記載の通りにＥＬＩＳＡにより行った。
結果：
ヒトハンチンチンのカスパーゼ領域５８６を標的とするポリクローナル抗血清を、図１９に示すペプチドを含むペプチドワクチンにより産生した。カスパーゼ領域５８６に由来する全ての候補ペプチドが同等の抗ペプチド力価を誘導する（実施例１に例示されるように）としても、相対的なカスパーゼ６阻害は、ペプチド配列およびエピトープ依存的様式において変化し、それによって、この領域由来のペプチド誘発抗体間のエピトープアクセス可能性および結合特性の違いを実証する。特に、カスパーゼ切断部位５８６にわたるペプチド、特にｐ６７７６およびｐ６７７７（図１８に示す）、およびカスパーゼ切断部位５８６のＣ末端にわたるペプチド、例えばそれぞれｐ８８５５、ｐ８８６２＆ｐ７５４３およびｐ８８６９（図１９に示す）などは、カスパーゼ切断阻害アッセイによって決定されるような有効なカスパーゼ６阻害剤を提供する。ペプチドｐ８８６８、ｐ８８６９、ｐ８８７０およびｐ８８７１によって誘導された抗体の阻害効果と、それぞれペプチドｐ７５４３、ｐ８８６４、ｐ８８６５およびｐ８８６６によって誘導された抗体の阻害効果を比較するとき、得られた抗体の阻害活性は、システインのＮ末端またはＣ末端位置に実質的に影響を受けず、それ故に、固定化リンカー位置に関して柔軟性を示唆することが実証され得る。実施例３にて実証されたインビボ効果および実施例１１にて実証されたインビトロ食作用活性を組み合わせたこれらのインビトロ機能活性に基づき、これらのペプチドは、受動的または能動的免疫化、血漿アフェレシスおよびこの領域に結合する競合的切断阻害剤を含む、本特許出願で開示された抗体ベースの戦略の機能的に関連する標的化ドメインを表す。
図１８：カスパーゼ領域５８６にわたるハンチンチン配列特異的プロテアーゼ阻害剤をスクリーニングための、インビトロカスパーゼ６切断阻害アッセイ。カスパーゼ領域５８６にわたるプレート固定化標的ペプチドを、陰性対照としてアフィニティー精製したポリクローナル抗体ｐ６７７６、ｐ６７７７およびｐ７５６５（それぞれ３ｎｇ／μｌの濃度で）と共に、またはｐ７５４３によるペプチド免疫化に由来するモノクローナル抗体Ｃ６−１７と共に、インキュベートした。ｍＡＢ Ｃ６−１７を、プロトタイプの対照阻害剤として１０ｎｇ／μｌの濃度で用いた。抗体−保護された標的ペプチドを、カスパーゼ６酵素と共にインキュベートし、次いで、標的ペプチドのタンパク質切断効率を検出した。切断されたペプチドを、実施例５、図１８に記載されるように記載されたハンチンチン配列を切断されていないハンチンチン配列と区別することができるプローブとしてｍＡＢ Ｍ１Ｄ１を用いて検出した。左の数図は、％切断を示し、保護しなければ１００％切断されるが、ｍＡＢ Ｃ６−１７およびポリクローナル抗体ｐ６７７６およびｐ６７７７は、標的ペプチドをカスパーゼのアクセスから保護することにより、示される通り切断を低減することを示唆する。
図１９：最も効率的なカスパーゼ部位阻害剤のスクリーニングのための１８種のポリクローナル血清および対照としてのｍＡＢ Ｃ６−１７のインビトロカスパーゼ６切断阻害アッセイ。アッセイを図１８に示す通りに正確に行ったが、相対カスパーゼ切断活性は、試験した各個々の抗体の標的結合シグナルに関して示した。従って、値は、相対カスパーゼ部位阻害（図１０に記載のような％切断）と、ペプチドＥＬＩＳＡによって決定された標的ペプチド結合（ＯＤ；図１に記載の通り）との比を示す。このスクリーニングは、それらのシステイン位置に関してのみでなく同等の活性および免疫原性に関しても、それぞれペプチドｐ７５４３、ｐ８８６４、ｐ８８６５およびｐ８８６６とは異なる、ペプチドｐ８８６８、ｐ８８６９、ｐ８８７０およびｐ８８７１によって実証される通り、末端システインの位置にかかわらず、カスパーゼ部位５８６切断を阻害することができるポリクローナル抗体を作製可能ないくつかのペプチドを同定した。ペプチド基質に対する抗体の比較的均一な結合にもかかわらず（実施例１、図１に示す通り）、ペプチドの免疫原に依存的な様式で誘導された抗体間では、切断阻害が異なった。
実施例７：実施例２（図６）および３（図９）のそれぞれで試験したような、ヒトＨＴＴに由来する免疫原性ペプチドに対して特異的なワクチン誘導抗体のインビボ作用機序を裏付ける、ｍＡＢ ＰＲＲ１３およびＣ６−１７のそれぞれについてのインビトロ食作用活性を示すインビトロ食作用アッセイ
インビトロ食作用アッセイ：
マクロファージの単離およびインビトロでの分化を、本質的に、例えばZhang et al. 2008 [PMID: 19016445]に記載の通りに行った。簡潔には、８から１２週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスからの大腿骨および脛骨に由来する骨髄細胞を、２−３個の直径１０ｃｍの細胞培養皿に一皿当たり２０−３０ｘ１０６細胞の密度で分け、２０ｎｇ／ｍｌ Ｍ−ＣＳＦ（ＲＤ−Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：４１６−ＭＬ−０１０）の存在するＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ＋Ｐ／Ｓ中で４日間分化させ、５日目に２４ウェル組織培養プレートに１５０．０００細胞／ウェルの密度で再分配して９日目まで置いた。食作用の２４時間前に、細胞を、５００μｌのＭ−ＣＳＦ不含有のＲＰＭＩ培地＋１０％ＦＣＳ＋Ｐ／Ｓ中で飢餓状態にした。食作用を、製造業者の指示書に従い、Ｃ末端ビオチニル化ペプチドｐ９３０４およびｐ９３０５（ｐ９３０４（Ｃ６）：ｂ−ＧＧＧＤＹＫＤＤＤＤＫＧＡＶＴＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＤＧ（配列番号５２）；ｐ９３０５（ＰＲＲ）：ｂ−ＧＧＧＤＹＫＤＤＤＤＫＧＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＧ（配列番号５３））のそれぞれを用いてコーティングした、ストレプトアビジンでコートした常磁性ミクロスフェア（Bang Laboratories、カタログ番号：ＣＰ０１Ｆ）を用いて行い、希釈緩衝液中の１０ｎｇ／μｌの抗体と共に室温で１時間インキュベートし、次いで、３５０ｍＭの最終塩濃度までＮａＣｌを添加したＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳで洗浄し、最後に、ＲＰＭＩ培地中に再懸濁液した。その後、抗体でコーティングした蛍光ペプチドビーズを、３７℃で１時間、分化したマクロファージに添加して（０，５ｕｇビーズ／ウェルを含む２００ｕｌの容量）、食作用によるインビトロでの取り込みを可能にした。氷冷したＰＢＳで細胞を洗浄し、掻き集めた後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１ｘＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）で洗浄し、蛍光シグナルを標準ＦＡＣＳ法により分析した。細胞の分化効率を、製造業者によって提案されたプロトコルに基づいて、抗Ｆ４／８０（Biolegend、カタログ番号：Ｂ１２３１０９）および抗ＣＤ１１ｂ（Biolegend、カタログ番号：Ｂ１０１２１９）マーカー抗体を用いて並行してモニターした。
結果：
図２０：ヒトハンチンチンを認識する、ＰＲＲ領域およびカスパーゼ切断５８６領域に由来するモノクローナル抗体ＰＲＲ１３およびＣ６−１７のそれぞれの食作用活性を示すインビトロ食作用アッセイ。ペプチドｐ９３０４（カスパーゼ切断５８６領域由来；右パネル）およびｐ９３０５（ＰＲＲ領域由来；左パネル）を、方法に示されるように、蛍光ストレプトアビジンビーズ上に固定し、５ｎｇ／μｌの抗体と共にインキュベートし、そしてインビトロでＭＣＳＦにより分化させた骨髄由来初代マウスマクロファージにトランスファーした（７日間）。ビーズと共に１時間インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ分析により特異的ビーズ取り込みについて測定した。ｍＡＢ ＰＲＲ１３（左パネル）およびＣ６−１７（右パネル）は、アイソタイプコントロール抗体（すなわち、マウスＩｇＧ２ａ）と比較したとき、ビーズの食作用の増加を示す。
表１：使用に好ましいペプチド（ペプチド名／ペプチド領域／ペプチド配列（Ｃは、担体タンパク質にカップリングするためのものであり；ペプチドのＮ末端またはＣ末端に提供され得る）、遊離Ｃ末端アスパラギン酸がエピトープに必要とされるｐ７５６４、ｐ７５４１、ｐ７５５２、ｐ７５６２、ｐ７５６３、ｐ７５６７またはｐ７５６８を除く）；ペプチドリストは、名称、タンパク質領域へのマッピング（領域：Ｎｔｅｒ＝Ｎ末端、ポリＱ＝ポリグルタミンストレッチ、ＰＲＲ＝ポリプロリンに富む領域、Ｅｘ１＝エクソン１へのマッピング、Ｃ６＝カスパーゼ切断５８６領域）およびアミノ酸配列（一文字コード；Ｎｔｅｒ＞Ｃｔｅｒ；ａ＝ベータ−アラニン；ｂ＝ビオチン）を示す。
実施例８：本発明のペプチドの改変された変異体
以下の実施例は、ペプチドの構造的または化学的修飾が、ペプチドの溶解性を改善し、それによりワクチン適用のための免疫原性、エピトープ特性または免疫応答の質に負の影響を与えることなく、ワクチン製造および品質管理に必要な合成、精製、カップリングまたは分析を容易にすることができるという証拠を提供する。
一例として、Ｃ末端またはＮ末端リシンを、溶解性が改善したプロトタイプの候補ペプチドｐ７５４３に付加した。本明細書に記載の通り、例えばペプチドｐ９３９４（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＣ）、ｐ９３９５（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＫＣ）、ｐ９３９６（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ）またはｐ９３９７（ＫＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ）における、１つまたは複数の末端リシンの付加は、水溶性を改善させる。ペプチドの溶解性を、検査により、“不溶”、“中間”（すなわち、１４ｋｒｐｍでＲＴにて５分間遠心後にペレットが観察される）および“透明”（すなわち、遠心分離後にペレットは観察されない）に分類した。ペプチドｐ７５４３は、中間の水溶性を有したが、ペプチドｐ９３９４、ｐ９３９５、ｐ９３９６およびｐ９３９７は、透明であり、良好な水溶性を示した。同様の溶解性の改善が、ペプチドエピトープおよび免疫原性に影響を及ぼすことなく、例えばペプチドへの他の荷電アミノ酸（例えば、アルギニン）の付加またはＰＥＧ修飾の付加などの、水溶性を改善するために一般に使用される他のペプチド修飾を用いて達成され得る。
本実施例は、本発明のペプチドのリシン修飾変異体の特徴付けを示す。改善された溶解性を有する実験的に決定されたリシン変異体には、例えば水溶性を改善するために１つまたは複数のＮ末端またはＣ末端付加リシンを含む、ｐ９３９４（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＣ）、ｐ９３９５（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＫＣ）、ｐ９３９６（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ）またはｐ９３９７（ＫＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ）が含まれる。
図２１：
ａ）：Ｃ末端修飾ペプチドｐ９３９５（実施例の通り）で免疫化された５匹の動物（Ｍ１−Ｍ５）からの免疫血清は、免疫化ペプチド（ｐ９３９５）へのそれらの結合と比較した場合、元の野生型配列ペプチド（ｐ７５４３）よりも強い結合を示す。結果を図２１に示す。Ｙ軸は、実施例１で行ったペプチドＥＬＩＳＡのＥＣ５０値を示す。
図２２：
ｂ）：種々の末端修飾されたペプチドワクチン（例えば、ｐ９３９７、ｐ９３９５、ｐ９３９６など）により作製された免疫血清は、示す通り、ｐ７５４３免疫血清または対照ｍＡＢ ２１６６（１：２０００）と同じシグナル強度で組み換えＨＴＴタンパク質を認識する。結果を図２２に示す。Ｙ軸は、実施例１に記載の様にＥＬＩＳＡ分析によるｒｅｃＨＴＴ６１０タンパク質に対する抗体シグナル（ＯＤ）を示す。
図２３：
ｃ）：ペプチドＥＬＩＳＡ（ｘ軸上に示されたペプチド配列；上記のペプチドＥＬＩＳＡ）による１２ｍｅｒシングルステップペプチドウォークを用いるｐ７５４３およびｐ９３９５免疫化マウスからの免疫血清のエピトープ分析は、ペプチドｐ７５４３とそのリシン含有変異体ｐ９３９５とのエピトープの一致を確認する。結果を図２３に示す。ｙ軸は、標準ペプチドＥＬＩＳＡから得られたＥＣ５０値を示す。
図２４：
ｄ）：ｐ７５４３およびその変異体ｐ９３９５での免疫化から誘導された血清のビオチン／ストレプトアビジン固定化組み換えＨｔｔタンパク質（タンパク質ＥＬＩＳＡにおけるｒｅｃＨｔｔ６１０）に対するオフレートの比較（ｘ軸は、標準法［以下参照］に従って、ラベルフリー表面プラズモン共鳴［ＳＰＲ］により決定されたオフレートを示す；それぞれ５匹の動物、それぞれ−１から−５と記載される）。結果を図２４に示す。結論として、ペプチドｐ９３５３に由来する免疫血清は、ｐ７５４３に由来する免疫血清（平均５，９７Ｅ−０４）よりも遅いオフレート値（平均１，６６Ｅ−０４）を示す。ｙ軸は、計算したオフレート値を示す。
方法（図２４について）：ＳＰＲを、ＢｉａＣｏｒｅ ２０００装置を用いて行った。Ｃ末端ビオチン標識ペプチドを推奨される方法に従って固定化した；チップ表面上の非特異的結合を避けるために、２ｘ１００μｌの１μＭの遊離Ｄ−ビオチンを添加してブロッキングした。分析物の添加を、ランニングバッファーとしてＨＢＳ緩衝液（ｐＨ７，４）を用いて、２５℃の分析温度にて３０μｌ／分の流速を用いて行った。８０μｌの各ｈｕ ＡＢ−ＳＮサンプルを希釈せずに添加して、滅菌濾過した（０，２２μｍ）；マウス対照ｍＡＢを２μｇ／ｍｌの濃度で添加したとき、解離時間は５００秒であった。チップ表面を、１５μｌの１０ｍＭグリシン（ｐＨ２，１）を添加し、その後中和して再形成させた。センサーグラムは、対照フローセル（flow cell）１からのシグナルがペプチド固定化フローセルのシグナルから差し引かれるという点で、対照を差し引かれた。空のＳＮからの曲線を、バックグラウンド減算に使用した。ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアのＬａｎｇｍｕｉｒ １：１解離モデルを、オフレート決定のために使用した。
図２５：
ｅ）：実施例７に記載のインビトロカスパーゼ６阻害アッセイを用いた、修飾ペプチド免疫血清（ｐ９３９５）とｐ７５４３免疫血清とのインビトロ機能性の比較。ＩｇＧアイソタイプ対照は、バックグラウンド阻害活性を決定する；ｍＡＢ Ｃ６−１７を陽性対照として用いた。結果を図２５に示す。結論として、ｐ９３９５免疫血清は、ｐ７５４３血清（５匹の動物からの平均３１，８％）より効果的に阻害する（５匹の動物からの免疫血清により平均１４，２％阻害、ｙ軸上に表示）。これらのインビトロ阻害活性は、ＥＬＩＳＡによって決定されたＳＰＲおよび組み換えＨＴＴタンパク質結合データにより決定された上記オフレートと一致する。
図２６：
ｆ）：下記のインビトロ食作用アッセイを用いた、修飾ペプチド免疫血清（ｐ９３９５）とｐ７５４３免疫血清とのインビトロ機能性の比較。結果を図２６に示す。ｐ９３９５で免疫化した動物からの５つの血清の混合物は、食作用活性を示し（ＭＦＩとして表示；ｙ軸上に表示）、５匹の非特異的に免疫化された動物に由来する血清の混合物と比較したとき、末端を修飾されたペプチドにより産生された免疫血清の食作用活性を確認する。
実施例９：抗体のヒト化
ａ）元の抗体ＰＲＲ１３およびｈＣ６−１７それぞれの抗体のヒト化を、以下のように行った：重鎖および軽鎖可変領域のプロトタイプのフレームワークを、ｈＰＲＲ１３−１から−１６のシリーズおよびｈＣ６−１７−１から−１６のシリーズそれぞれの作製に使用した。該シリーズは、図２７に示す通り、重鎖（指定されたフレームワークＨ）および／または軽鎖（指定されたフレームワークＬ）中に１つまたは複数のアミノ酸位置に修飾を含むプロトタイプの変異体を含む。数字は、以下のヒト化抗体に示される、フレームワーク領域内のアミノ酸の位置を反映している。
ｈＰＲＲ１３シリーズ軽鎖可変領域
［ＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＴＡＳＳＳＶＴＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＨＱＹＲＲＰＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ］；
ｈＰＲＲ１３重鎖可変領域
［ＥＶＱＬＶＥＳＧＰＥＶＫＫＰＧＡＴＶＫＩＳＣＫＶＳＧＹＴＦＴＤＦＹＭＫＷＶＱＱＡＰＧＲＧＬＥＷＭＧＤＩＤＰＫＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＭＴＡＤＴＳＴＧＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＳＹＹＧＹＴＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＡＳ］；
ｈＣ６−１７軽鎖可変領域
［ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＮＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ］；
ｈＣ６−１７重鎖可変領域
［ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＥＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＭＧＧＩＮＰＮＮＧＧＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＲＴＡＹＶＥＬＳＲＬＴＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＬＤＧＲＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ］。
方法：ヒトｖＬＣおよびｖＨＣ配列を合成し、発現ベクターｐＦＵＳＥ２ｓｓ ＣＬｇ−ｈｋ（ＥｃｏＲＩ／ＮｈｅＩ）およびｐＦＵＳＥｓｓ ＣＨＩｇ−ｈＧ１（ＥｃｏＲＩ／ＢｓｉＷＩ）中にクローニングした。クローニング法は、制限消化およびライゲーション反応（ＮＥＢ Ｑｕｉｃｋ ｌｉｇａｓｅ ｋｉｔ；カタログ番号Ｍ２２００Ｌ）、細菌の形質転換、その後のクローン選択および分析を含む、製造者によって示されるような、本質的に標準的な分子生物学的手順に従って行った。アガロースゲルからのＤＮＡフラグメントの調製を、標準的なＤＮＡ精製キット（Quiagen；カタログ番号２７１０６）を用いて行った。ＨＥＫ２９３フリースタイル細胞（Invitrogen；カタログ番号Ｒ７９０−０７）を製造者によって示されル通りに培地中で増殖させ、表に示すようなｈｕ ＡＢ重鎖および軽鎖ベクターの異なる組み合わせで一過的に同時トランスフェクトした。細胞培養ＳＮを、トランスフェクションの２４から４８時間後に集め、１：３０に濃縮し、その後、Ｓｐｉｎ−Ｘ ＵＦ５００チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＬＳ４３１４７８）を用いて緩衝液を交換した（ＰＢＳ）。濃縮ヒト抗体−ＳＮを、インビトロにおいてＥＬＩＳＡを用いてペプチドおよびタンパク質結合について試験した（実施例１の通り）。さらなる特徴付けを、本実施例９を通して示される通りに行った。
図２８：
ｂ）例としては、示されるフレームワーク変異体を含むヒト化ｍＡＢ ＰＲＲ１３誘導体ｈＰＲＲ１３−１０、ｈＰＲＲ１３−１２およびｈＰＲＲ１３−１４によるｒｅｃＨＴＴ６１０タンパク質の認識を、タンパク質ＥＬＩＳＡ（実施例１と同様に行った；図２８参照。Ｙ軸は、ｒｅｃ Ｈｔｔ６１０結合活性を示す［ＯＤ］）により実証することができる。
図２９
ｃ）：一例として、ａ）に記載の通りに修飾されたｈＣ６−１７シリーズからのヒト化抗体は、インビトロで食作用活性を維持する。インビトロ食作用アッセイを上記の通りに行い、インキュベートしないビーズ（ＡＢなし）または無関係のアイソタイプ対照ビーズ（ＩｇＧ）とは対照的に、ｍＡＢ ｈＣ６−１７−６−インキュベートしたビーズは、インビトロで効率的に貪食され、それ故に、抗体によるＨＴＴ認識に基づいてＨＴＴ特異的機能性を維持する実施例を提供することを示す（図２９）。
Figure 0006876601
Figure 0006876601
能動的ワクチン接種にとりわけ好ましい（“++ active vacc.”）
能動的ワクチン接種に好ましい（“+ active vacc.”）
ｍＡＢ作製に好ましい（“mAB generation”）
Ｃ６切断阻害に好ましい（“C6阻害”）。
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従って、以下の態様は、本発明の好ましい態様と定義され得る：
１．好ましくは、ｐ６７７３（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ、配列番号１）、ｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）、ｐ７５４３ａ（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８８）、とりわけ誘導体ｐ９３９４（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＣ；配列番号９１）、ｐ９３９５（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＫＣ；配列番号９２）、ｐ９３９６（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９３）、ｐ９３９７（ＫＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９４）；ｐ７５４３ｂ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８９）、ｐ７５４３ｃ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ；配列番号９０）、ｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）、ｐ８３４６（ＣＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ、配列番号５）、ｐ８８５５（ＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＣ、配列番号６）、ｐ８８５８（ＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ、配列番号７）、ｐ８８５９（ＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＣ、配列番号８）、ｐ８８６０（ＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＣ、配列番号９）、ｐ８８６１（ＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＣ、配列番号１０）、ｐ８８６２（ＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号１１）、ｐ８８６９（ＣＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱ、配列番号１２）、ｐ８８６８（ＣＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧ、配列番号１３）、ｐ８８７０（ＣＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰ、配列番号１４）、ｐ８８７１（ＣＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱ、配列番号１５）、ｐ６７７２（ＣＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰ、配列番号１６）、ｐ８８６４（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＣ、配列番号１７）、ｐ８８６５（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＣ、配列番号１８）、ｐ６７７５（ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰａＣ、配列番号１９）、ｐ８８５４（ＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＣ、配列番号２０）、ｐ８８５６（ＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＣ、配列番号２１）、ｐ８８５７（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＣ、配列番号２２）、ｐ８８６６（ＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＣ、配列番号２３）、ｐ８８６７（ＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＤＣ、配列番号２４）、ｐ６７６３（ＣａＭＡＴＬＥＫＬＭＫＡＦＥＳＬＫＳＦＱ、配列番号２５）、ｐ６７６４（ＣａＫＬＭＫＡＦＥＳＬＫＳＦＱ、配列番号２６）、ｐ６７６５（ＣＥＥＱＱＲＱＱＱＱＱＱＱ、配列番号２７）、ｐ６７６８（ＱＱＱＱＱＱＰＰＰＰＰＰＰＰａＫＫＫＣ、配列番号２８）、ｐ７５４１（ＣＳＥＩＶＬＤ、配列番号２９）、ｐ７５５２（ＣＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３０）、ｐ７５６２（ＣＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３１）、ｐ７５６３（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３２）、ｐ７５６７（ＣＥＩＶＬＤ、配列番号３３）、ｐ７５６８（ＣＩＶＬＤ、配列番号３４）、ｐ７６０５（ＣＳＥＩＶＬ、配列番号３５）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、ｐ６７７６ｂ（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ、配列番号３８）、ｐ７７５２（ＣＡＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３９）、ｐ７７５３（ＣＳＡＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４０）、ｐ７７５４（ＣＳＥＡＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４１）、ｐ７７５５（ＣＳＥＩＡＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４２）、ｐ７７５６（ＣＳＥＩＶＡＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４３）、ｐ７７５７（ＣＳＥＩＶＬＡＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４４）、ｐ７７５８（ＣＳＥＩＶＬＤＡＴＤＮＱＹＬ、配列番号４５）、ｐ７７４５（ＣＳＥＩＶＬＤＧＡＤＮＱＹＬ、配列番号４６）、ｐ７７４６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＡＮＱＹＬ、配列番号４７）、ｐ７７４７（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＡＱＹＬ、配列番号４８）、ｐ７７４８（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＡＹＬ、配列番号４９）、ｐ７７４９（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＡＬ、配列番号５０）、およびｐ７７５０（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＡ、配列番号５１）からなる群より選択される、より好ましくは、ｐ６７７３（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ、配列番号１）、ｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）、ｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）、ｐ８３４６（ＣＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ、配列番号５）、ｐ８８５５（ＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＣ、配列番号６）、ｐ８８５８（ＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ、配列番号７）、ｐ８８５９（ＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＣ、配列番号８）、ｐ８８６０（ＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＣ、配列番号９）、ｐ８８６１（ＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＣ、配列番号１０）、ｐ８８６２（ＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号１１）、ｐ８８６９（ＣＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱ、配列番号１２）、ｐ８８６８（ＣＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧ、配列番号１３）、ｐ８８７０（ＣＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰ、配列番号１４）、ｐ８８７１（ＣＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱ、配列番号１５）、ｐ６７７２（ＣＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰ、配列番号１６）、ｐ８８６４（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＣ、配列番号１７）、ｐ８８６５（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＣ、配列番号１８）、ｐ６７７５（ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰａＣ、配列番号１９）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、ｐ８８５４（ＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＣ、配列番号２０）、ｐ８８５６（ＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＣ、配列番号２１）、ｐ８８５７（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＣ、配列番号２２）、ｐ８８６６（ＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＣ、配列番号２３）、およびｐ８８６７（ＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＤＣ、配列番号２４）からなる群より選択される、とりわけｐ６７７３（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ、配列番号１）、ｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）、ｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、およびｐ８３４６（ＣＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ、配列番号５）からなる群より選択される、ＨＴＴタンパク質の免疫原性ペプチドであって、ここで、Ｎ末端またはＣ末端のシステイン残基（Ｃ）は、存在しても、存在しなくてもよく、またはＣ末端もしくはＮ末端のいずれかに提供されてよいか；または、該ペプチドは、これらのペプチドの少なくとも１つと配列番号１から５１とを含み、好ましくは最大５０アミノ酸残基の長さ、より好ましくは、最大３０アミノ酸残基の長さ、さらに好ましくは最大２０アミノ酸残基の長さ、とりわけ最大１６アミノ酸残基の長さである、ＨＴＴタンパク質の免疫原性ペプチド。
２．ハンチンチン（ＨＴＴ）タンパク質の少なくとも１つの免疫原性ペプチド、好ましくは態様１に記載のペプチドから選択される少なくとも１つのペプチド、および要すれば、１個または複数のアジュバントを含む、ハンチントン病の治療および／または予防における使用のためのペプチドベースのワクチン。
３．少なくとも１つの免疫原性ペプチドが、薬学的に許容される担体、好ましくはＫＬＨに結合されていることを特徴とする、態様２に記載の使用のためのペプチドベースのワクチン。
４．ワクチンが、静脈内投与、皮下投与、皮内投与または筋肉内投与のために製剤化されることを特徴とする、態様２または３に記載の使用のためのペプチドベースのワクチン。
５．ワクチンが、アジュバント、好ましくは水酸化アルミニウムを用いて製剤化されることを特徴とする、態様２から４のいずれかに記載の使用のためのペプチドベースのワクチン。
６．少なくとも１つのペプチドが、ワクチン中に、０．１ｎｇから１０ｍｇ、好ましくは１０ｎｇから１ｍｇ、特に１００ｎｇから１００μｇの量で含まれていることを特徴とする、態様２から５のいずれかに記載のペプチドベースのワクチン。
７．ＨＴＴタンパク質の少なくとも１つの免疫原性ペプチドが、態様１に記載の群から選択され、好ましくは、組み合わせが、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）（または、ｐ７５４３ａ（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８８）、とりわけ誘導体ｐ９３９４（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＣ；配列番号９１）、ｐ９３９５（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＫＣ；配列番号９２）、ｐ９３９６（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９３）、ｐ９３９７（ＫＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９４）；ｐ７５４３ｂ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８９）、ｐ７５４３ｃ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ；配列番号９０））と、配列番号１、２、４および５から選択される少なくとも１つのペプチドとの組み合わせであり、とりわけ、組み合わせが、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）およびｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）またはｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）およびｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）を含むか、またはそれからなり、ここで、Ｎ末端またはＣ末端システイン残基（Ｃ）が、存在しても、存在しなくてもよく、またはＣ末端もしくはＮ末端のいずれかに提供されてよい、態様２または６に記載の使用のためのペプチドベースのワクチン。
８．ＨＴＴの“Ｃ６”領域由来の少なくとも１つのペプチドおよびＨＴＴの“ＰＲＲ”領域由来の少なくとも１つのペプチドを含むことを特徴とし、好ましくは該少なくとも１つのペプチドが、表２に記載される群からそれぞれ選択される、態様２から７のいずれかに記載のペプチドベースのワクチン。
９．態様１に記載の免疫原性ペプチド、またはＬＬＰＱＰ（配列番号７７）、ＰＰＱＡＱＰＬ（配列番号７８）、ＰＰＱＡＱＰ（配列番号７９）、ＱＰＬＬ（配列番号８０）およびＰＱＡＱＰＬＬ（配列番号８１）、とりわけＬＬＰＱＰ、およびＱＹＬＧＬＱＩＧ（配列番号８２）、ＹＬＧＬＱＩＧ（配列番号８３）、ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧ（配列番号８４）、ＤＮＱＹＬＧＬ（配列番号８５）およびＹＬＧＬＱＩＧ（配列番号８６）、とりわけＱＹＬＧＬＱＩＧであって、好ましくは最大３０アミノ酸残基の長さ、好ましくは２０アミノ酸残基の長さ、より好ましくは１６アミノ酸残基の長さ、とりわけ６から１０アミノ酸長であるものからなる群より選択されるコアペプチドを含むか、またはそれからなる免疫原性ペプチドを含む製剤。
１０．個体、とりわけハンチントン病を有する個体において免疫応答を誘発するのに使用するためものであることを特徴とする、態様９に記載の製剤。
１１．態様２から８のいずれかに記載のペプチドベースのワクチンを含むことを特徴とする、態様９または１０に記載の製剤。
１２．個体、とりわけハンチントン病を有する個体において抗ＨＴＴ抗体を誘発するのに使用ためのものであることを特徴とする、態様９から１１のいずれかに記載の製剤。
１３．抗ＨＴＴ抗体の製剤と組み合わせて、好ましくは別個の投与法で個体に投与されることを特徴とする、態様９から１２のいずれかに記載の製剤。
１４．ハンチントン病の治療および／または予防においてワクチンとして使用するための、ＨＴＴタンパク質の少なくとも１つの免疫原性ペプチドを特異的に認識するポリクローナル抗体を含む薬理学的組成物。
１６．ｐ６７７３の配列（配列番号１）を有するＨＴＴタンパク質のペプチド、とりわけコアエピトープＬＬＰＱＰ（配列番号７７）に結合することができる結合ドメインを有するモノクローナル抗体。
１７．該モノクローナル抗体が、ＧＹＳＦＴＤＦＹ（配列番号５４）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＩＤＰＫＮＧＤＴ（配列番号５５）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、ＡＴＹＹＧＹＴＭＤＹ（配列番号５６）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、ＳＳＶＴＳＳＹ（配列番号５７）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＳＴＳ（配列番号５８）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、およびＨＱＹＲＲＰＰＲＴ（配列番号５９）を含む鎖可変領域ＣＤＲ３を含むことを特徴とし、好ましくはモノクローナル抗体ＰＲＲ１３である、態様１６に記載のモノクローナル抗体
１８．該モノクローナル抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体またはキメラモノクローナル抗体である、態様１６または１７に記載のモノクローナル抗体。
１９．ハンチントン病の予防および／または処置において使用される医薬組成物における使用のための、態様１６から１８のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
２０．該組成物が薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含むことを特徴とする、態様１９に記載の使用のためのモノクローナル抗体。
２１．該組成物が、少なくとも１つのさらなる治療剤をさらに含むことを特徴とする、態様１９または２０に記載の使用のためのモノクローナル抗体。
２２．該組成物が、静脈内投与、皮下投与、皮内投与または筋肉内投与のために製剤化されることを特徴とする、態様１９から２１のいずれかに記載の使用のためのモノクローナル抗体。
２３．モノクローナル抗体が、食作用を増強する分子に結合されていることを特徴とする、態様１９から２２のいずれかに記載の使用のためのモノクローナル抗体。
２４．モノクローナル抗体が、該組成物中に、１ｍｇから１０ｇ、好ましくは５０ｍｇから２ｇ、特に１００ｍｇから１ｇの量で含まれることを特徴とする、態様１９から２３のいずれかに記載の使用のためのモノクローナル抗体。
２５．ｐ７５４３の配列（配列番号３）を有するＨＴＴタンパク質のペプチドに結合することができる結合ドメインを有する、モノクローナル抗体。
２６．該モノクローナル抗体が、ＧＹＴＦＴＥＹＴ（配列番号６６）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＩＮＰＮＮＧＧＴ（配列番号６７）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、ＡＳＬＤＧＲＤＹ（配列番号６８）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、ＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹ（配列番号６９）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＷＡＳ（配列番号７０）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、およびＫＱＳＹＮＬＬＴ（配列番号７１）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含むことを特徴とし、該抗体が好ましくはモノクローナル抗体Ｃ６−１７である、態様２５に記載のモノクローナル抗体。
２７．該モノクローナル抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体またはキメラモノクローナル抗体であり、好ましくはＨＴＴのＰＲＲ領域に対して特異性を有する二重特異性抗体であり、とりわけ態様１６から２４のいずれかに記載の抗体が含まれる、態様２５または２６に記載のモノクローナル抗体。
２８．ハンチントン病の予防および／または処置において使用される医薬組成物に使用するための、態様２５から２７のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
２９．該組成物が、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含むことを特徴とする、態様２８に記載の使用のためのモノクローナル抗体。
３０．該組成物が、少なくとも１つのさらなる治療剤をさらに含むことを特徴とする、態様２８または２９に記載の使用のためのモノクローナル抗体。
３１．該組成物が、静脈内投与、皮下投与、皮内投与または筋肉内投与のために製剤化されることを特徴とする、態様２８から３０のいずれかに記載の使用のためのモノクローナル抗体。
３２．モノクローナル抗体が、食作用を増強する分子に結合されていることを特徴とする、態様２８から３１のいずれかに記載の使用のためのモノクローナル抗体。
３３．モノクローナル抗体が、該組成物中に、１ｍｇから１０ｇ、好ましくは５０ｍｇから２ｇ、特に１００ｍｇから１ｇの量で含まれることを特徴とする、態様２８から３２のいずれかに記載の使用のためのモノクローナル抗体。
３４．好ましくはハンチントン病の処置における使用のための、ｐ７５６４の配列（配列番号２）を有するＨＴＴタンパク質のペプチドに結合することができる結合ドメインを有する、モノクローナル抗体。
３５．該モノクローナル抗体が、ＧＦＴＦＮＴＹＡ（配列番号７２）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号７３）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、ＶＲＨＧＥＹＧＮＰＷＦＡＹ（配列番号７４）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、ＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号７５）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＫＶＳ（配列番号７６）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、およびＳＱＳＴＨＶＰＹＴ（配列番号７７）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含むことを特徴とし、該抗体が好ましくはモノクローナル抗体Ｍ１Ｄ１である、態様３４に記載のモノクローナル抗体。
３６．該モノクローナル抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体またはキメラモノクローナル抗体である、態様３４または３５に記載のモノクローナル抗体。
３７．ハンチントン病の予防および／または処置において使用される医薬組成物に使用するための、態様３４から３６のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
３８．該組成物が、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含むことを特徴とする、態様３７に記載の使用のためのモノクローナル抗体。
３９．該組成物が、少なくとも１つのさらなる治療剤をさらに含むことを特徴とする、態様３７または３８に記載の使用のためのモノクローナル抗体。
４０．該組成物が、静脈内投与、皮下投与、皮内投与または筋肉内投与のために製剤化されることを特徴とする、態様３７から３９のいずれかに記載の使用のためのモノクローナル抗体。
４１．モノクローナル抗体が、食作用を増強する分子と結合されていることを特徴とする、態様３７から４０のいずれかに記載の使用のためのモノクローナル抗体。
４２．モノクローナル抗体が、該組成物中に、１ｍｇから１０ｇの量で含まれることを特徴とする、態様３７から４１のいずれかに記載の使用のためのモノクローナル抗体。
４３．モノクローナル抗体が、該組成物中に、５０ｍｇから２ｇ、特に１００ｍｇから１ｇの量で含まれることを特徴とする、態様４２に記載の使用のためのモノクローナル抗体。
４４．モノクローナル抗体が、該組成物中に、１００ｍｇから１ｇの量で含まれる、態様４２に記載の使用のためのモノクローナル抗体。
４５．モノクローナル抗体がポリクローナル抗体である、態様４２に記載の使用のためのモノクローナル抗体。
４６．モノクローナル抗体がモノクローナル抗体である、態様４２に記載の使用のためのモノクローナル抗体。
４７．モノクローナル抗体がヒトモノクローナル抗体である、態様４２に記載の使用のためのモノクローナル抗体。
４８．モノクローナル抗体が、ヒト化モノクローナル抗体である、態様４２に記載の使用のためのモノクローナル抗体。
４９．モノクローナル抗体が、二重特異性モノクローナル抗体である、態様４２に記載の使用のためのモノクローナル抗体。
５０．モノクローナル抗体が、ＨＴＴに対して二重特異性を有する、二重特異性のモノクローナル抗体である、態様４２に記載の使用のためのモノクローナル抗体。
５１．モノクローナル抗体が、ＰＲＲに対する結合領域またはＣ６に対する結合領域を有する二重特異性モノクローナル抗体である、態様５０に記載の使用のためのモノクローナル抗体。
５２．モノクローナル抗体が、ＰＲＲに対する結合領域およびＣ６に対する結合領域を有する二重特異性モノクローナル抗体である、態様５０に記載の使用のためのモノクローナル抗体。
５３．薬剤巣クローニングにおいてプローブとして使用するための、モノクローナル抗体Ｍ１Ｄ１。
５４．ＨＴＴのカスパーゼ切断領域アミノ酸位置５８６に対するプロテアーゼのアクセスを阻害する分子をスクリーニングするための、態様５３に記載の使用のためのモノクローナル抗体Ｍ１Ｄ１。
５５．哺乳動物のハンチントン病のインビトロ診断法であって、
− 抗体ＰＲＲ１３、Ｍ１Ｄ１またはＣ６−１７を単独で、または組み合わせて用いて、哺乳動物のサンプル中の野生型（ｗｔ）または変異ハンチンチンまたはそれらのフラグメントのレベルを決定する工程；
− 該サンプル中の野生型または変異ハンチンチンのレベルが、ハンチントン病の遺伝的影響がない健康な個体の対照サンプルと比較して、変化している場合、ハンチントン病と診断する工程；
− そして、必要に応じて、事前マニフェストまたはマニフェストハンチントン病患者サンプルにおけるハンチンチン低下治療戦略の効果をモニタリングする工程（ここで、該治療戦略は、好ましくは、とりわけハンチンチン低下治療の過程で、能動または受動ワクチン接種から選択される）
を含む、診断法。
５６．サンプル中の野生型または変異ハンチンチンまたはそのフラグメントのレベルの決定が、免疫沈降または捕捉ベースのアッセイ、好ましくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースのアッセイ、ウェスタンブロット、または免疫組織化学分析および免疫蛍光分析またはイメージング法、好ましくはＰＥＴまたはＳＰＥＣＴおよびフローサイトメトリーを伴う、態様５５に記載の方法。
５７．該サンプルが、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、血漿、血清、尿、唾液、汗、または涙液、または組織抽出物もしくは細胞抽出物である、態様５５または５６に記載の方法。
５８．該哺乳動物がヒトである、態様５５から５７のいずれかに記載の方法。
５９．哺乳動物におけるハンチントン病のステージのインビトロ決定法であって、
− 抗体ＰＲＲ１３、Ｍ１Ｄ１またはＣ６−１７を単独で、または組み合わせて用いて、哺乳動物のサンプル中の野生型または変異ハンチンチンまたはそれらのフラグメントのレベルを決定する工程；
− ハンチントン病のステージを決定する工程；および
− ハンチンチン低下治療のＨＴＴレベルへの影響を決定する工程
を含む、方法。
６０．サンプル中の野生型または変異ハンチンチンまたはそれらのフラグメントのレベルの決定が、免疫沈降または捕捉ベースのアッセイ、好ましくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースのアッセイ、ウェスタンブロット、または免疫組織化学分析および免疫蛍光分析またはイメージング法、好ましくはＰＥＴまたはＳＰＥＣＴおよびフローサイトメトリーを伴う、態様５９に記載の方法。
６１．該サンプルが、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、血漿、血清、尿、唾液、汗、または涙液、または組織抽出物もしくは細胞抽出物である、態様５９または６０に記載の方法。
６２．該哺乳動物がヒトである、態様５９から６１のいずれかに記載の方法。
６３． ハンチントン病の進行のモニター法または哺乳動物におけるハンチントン病の処置の有効性のモニター法であって、
− 抗体ＰＲＲ１３、Ｍ１Ｄ１およびＣ６−１７を単独で、または組み合わせて用いて、哺乳動物のサンプル中の変異ＨＴＴのレベルを決定する工程：および
− 変異ハンチンチンまたはそのフラグメントの得られたレベルを、最初の測定で、好ましくは疾患関連症状の診断時点で得られた変異ハンチンチンまたはそのフラグメントのレベルと比較することにより、ハンチントン病の進行またはハンチントン病の処置の有効性を決定する工程（ここで、ＨＴＴレベルの低下は、処置の成功の指標である。）
を含む、モニター法。
６４．サンプル中の変異ＨＴＴのレベルの決定が、免疫沈降または捕捉ベースのアッセイ、好ましくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースのアッセイ、ウェスタンブロット、または免疫組織化学分析および免疫蛍光分析またはイメージング法、好ましくはＰＥＴまたはＳＰＥＣＴおよびフローサイトメトリーを伴う、態様６３に記載の方法。
６５．該サンプルが、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、血漿、血清、尿、唾液、汗、または涙液、または組織抽出物もしくは細胞抽出物である、態様６３または６４に記載の方法。
６６．該哺乳動物がヒトである、態様６３から６５のいずれかに記載の方法。
６７．ハンチントン病の予防または処置のための医薬の製造を目的とする、ｐ６７７３（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ、配列番号１）、ｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）、ｐ７５４３ａ（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８８）、とりわけ誘導体ｐ９３９４（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＣ；配列番号９１）、ｐ９３９５（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＫＣ；配列番号９２）、ｐ９３９６（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９３）、ｐ９３９７（ＫＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９４）；ｐ７５４３ｂ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８９）、ｐ７５４３ｃ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ；配列番号９０）、ｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）、ｐ８３４６（ＣＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ、配列番号５）、ｐ８８５５（ＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＣ、配列番号６）、ｐ８８５８（ＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ、配列番号７）、ｐ８８５９（ＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＣ、配列番号８）、ｐ８８６０（ＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＣ、配列番号９）、ｐ８８６１（ＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＣ、配列番号１０）、ｐ８８６２（ＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号１１）、ｐ８８６９（ＣＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱ、配列番号１２）、ｐ８８６８（ＣＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧ、配列番号１３）、ｐ８８７０（ＣＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰ、配列番号１４）、ｐ８８７１（ＣＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱ、配列番号１５）、ｐ６７７２（ＣＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰ、配列番号１６）、ｐ８８６４（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＣ、配列番号１７）、ｐ８８６５（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＣ、配列番号１８）、ｐ６７７５（ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰａＣ、配列番号１９）、ｐ８８５４（ＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＣ、配列番号２０）、ｐ８８５６（ＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＣ、配列番号２１）、ｐ８８５７（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＣ、配列番号２２）、ｐ８８６６（ＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＣ、配列番号２３）、ｐ８８６７（ＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＤＣ、配列番号２４）、ｐ６７６３（ＣａＭＡＴＬＥＫＬＭＫＡＦＥＳＬＫＳＦＱ、配列番号２５）、ｐ６７６４（ＣａＫＬＭＫＡＦＥＳＬＫＳＦＱ、配列番号２６）、ｐ６７６５（ＣＥＥＱＱＲＱＱＱＱＱＱＱ、配列番号２７）、ｐ６７６８（ＱＱＱＱＱＱＰＰＰＰＰＰＰＰａＫＫＫＣ、配列番号２８）、ｐ７５４１（ＣＳＥＩＶＬＤ、配列番号２９）、ｐ７５５２（ＣＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３０）、ｐ７５６２（ＣＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３１）、ｐ７５６３（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３２）、ｐ７５６７（ＣＥＩＶＬＤ、配列番号３３）、ｐ７５６８（ＣＩＶＬＤ、配列番号３４）、ｐ７６０５（ＣＳＥＩＶＬ、配列番号３５）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、ｐ６７７６ｂ（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ、配列番号３８）、ｐ７７５２（ＣＡＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３９）、ｐ７７５３（ＣＳＡＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４０）、ｐ７７５４（ＣＳＥＡＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４１）、ｐ７７５５（ＣＳＥＩＡＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４２）、ｐ７７５６（ＣＳＥＩＶＡＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４３）、ｐ７７５７（ＣＳＥＩＶＬＡＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４４）、ｐ７７５８（ＣＳＥＩＶＬＤＡＴＤＮＱＹＬ、配列番号４５）、ｐ７７４５（ＣＳＥＩＶＬＤＧＡＤＮＱＹＬ、配列番号４６）、ｐ７７４６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＡＮＱＹＬ、配列番号４７）、ｐ７７４７（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＡＱＹＬ、配列番号４８）、ｐ７７４８（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＡＹＬ、配列番号４９）、ｐ７７４９（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＡＬ、配列番号５０）、およびｐ７７５０（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＡ、配列番号５１）、好ましくはｐ６７７３（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ、配列番号１）、ｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）、ｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、ｐ８３４６（ＣＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ、配列番号５）、ｐ８８５５（ＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＣ、配列番号６）、ｐ８８５８（ＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ、配列番号７）、ｐ８８５９（ＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＣ、配列番号８）、ｐ８８６０（ＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＣ、配列番号９）、ｐ８８６１（ＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＣ、配列番号１０）、ｐ８８６２（ＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号１１）、ｐ８８６９（ＣＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱ、配列番号１２）、ｐ８８６８（ＣＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧ、配列番号１３）、ｐ８８７０（ＣＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰ、配列番号１４）、ｐ８８７１（ＣＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱ、配列番号１５）、ｐ６７７２（ＣＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰ、配列番号１６）、ｐ８８６４（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＣ、配列番号１７）、ｐ８８６５（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＣ、配列番号１８）、ｐ６７７５（ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰａＣ、配列番号１９）、ｐ８８５４（ＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＣ、配列番号２０）、ｐ８８５６（ＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＣ、配列番号２１）、ｐ８８５７（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＣ、配列番号２２）、ｐ８８６６（ＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＣ、配列番号２３）、およびｐ８８６７（ＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＤＣ、配列番号２４）、とりわけｐ６７７３（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ、配列番号１）、ｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）、ｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、およびｐ８３４６（ＣＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ、配列番号５）からなる群より選択される少なくとも１つの免疫原性ペプチド（ここで、Ｎ末端またはＣ末端システイン残基（Ｃ）は、存在しても、存在しなくてもよく、またはＣ末端もしくはＮ末端のいずれかに提供されてよい。）の使用。
６８．態様６７に記載のＨＴＴタンパク質の少なくとも１つの免疫原性ペプチドを含む、ハンチントン病の予防および／または処置における使用のためのペプチドベースのワクチン。
６９．少なくとも１つの免疫原性ペプチドが、薬学的に許容される担体、好ましくはＫＬＨに結合されていることを特徴とする、態様６８に記載の使用のためのペプチドベースのワクチン。
７０．ワクチンが、静脈内投与、皮下投与、皮内投与または筋肉内投与用に製剤化されることを特徴とする、態様６８または６９に記載の使用のためのペプチドベースのワクチン。
７１．ワクチンが、アジュバント、好ましくは水酸化アルミニウムを用いて製剤化されることを特徴とする、態様６８から７０のいずれかに記載の使用のためのペプチドベースのワクチン。
７２．少なくとも１つのペプチドが、ワクチン中に、０．１ｎｇから１０ｍｇ、好ましくは１０ｎｇから１ｍｇ、特に１００ｎｇから１００μｇの量で含まれていることを特徴とする、態様６８から７０のいずれかに記載のペプチドベースのワクチン。
７３．該ペプチドが、特異的ハンチンチンＣ６切断阻害剤の作製または同定のために使用される、態様６７に記載の免疫原性ペプチド。
７４．該特異的ハンチンチンＣ６切断阻害剤が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗血清、Ｆｖ’、ｓｃＦｖ’、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２などのモノクローナル抗体由来のフラグメントとして定義される、態様７３に記載の免疫原性ペプチド。
７５．態様６８に記載のペプチドベースのワクチンを用いる免疫化により産生されたＨＴＴのカスパーゼ領域５８６ Ｃ６領域を標的とする抗体または抗原結合分子、とりわけｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ）、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ）、ｐ８８５５（ＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＣ）、ｐ８８５８（ＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ）、ｐ８８５９（ＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＣ）、ｐ８８６０（ＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＣ）、ｐ８８６１（ＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＣ）、ｐ８８６２（ＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ）、ｐ８８６９（ＣＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱ）、ｐ８８６８（ＣＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧ）、ｐ８８７０（ＣＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰ）、ｐ８８７１（ＣＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱ）、ｐ８８６４（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＣ）、ｐ８８６５（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＣ）、ｐ８８５４（ＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＣ）、ｐ８８５６（ＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＣ）、ｐ８８５７（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＣ）、ｐ８８６６（ＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＣ）、およびｐ８８６７（ＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＤＣ）からなる群より選択されるペプチド（ここで、Ｎ末端またはＣ末端システイン残基（Ｃ）は、存在しても、存在しなくてもよく、またはＣ末端もしくはＮ末端のいずれかに提供されてよい。）。
７６．該抗体がポリクローナル抗体である、態様７５に記載の抗体。
７７．該抗体がモノクローナル抗体である、態様７５に記載の抗体。
７８．抗体が、食作用特性を増強する分子に結合されていることを特徴とする、態様７５または７７に記載の抗体または抗原結合分子。
７９．ハンチントン病の予防および／または処置において使用される薬理学的組成物に使用するための、態様７５から７８のいずれかに記載の抗体または抗原結合分子。
８０．組成物がさらに、薬学的に許容される担体または賦形剤を含むことを特徴とする、態様７９に記載の使用のための抗体または抗原結合分子。
８１．組成物が、少なくとも１つのさらなる治療剤をさらに含むことを特徴とする、態様７９または８０に記載の使用のための抗体または抗原結合分子。
８２．ワクチンが、静脈内投与、皮下投与、皮内投与または筋肉内投与用に製剤化されることを特徴とする、態様７９から８１のいずれかに記載の使用のための抗体または抗原結合分子。
８３．ポリクローナル抗体が、ワクチン中に、０．１ｍｇから１００ｍｇ、好ましくは０．５ｍｇから２０ｍｇ、特に１ｍｇから１０ｍｇの量で含まれていることを特徴とする、態様７９から８２のいずれかに記載の使用のための抗体または抗原結合分子。

Claims (5)

  1. ｐ７５４３（配列番号３）の配列からなるハンチンチン（ＨＴＴ）タンパク質のペプチドに結合可能な結合ドメインを有するモノクローナル抗体。
  2. ｐ７５４３（配列番号３）の配列を有するハンチンチン（ＨＴＴ）タンパク質のペプチドに結合可能な結合ドメインを有するモノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体が、ＧＹＴＦＴＥＹＴ（配列番号６６）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＩＮＰＮＮＧＧＴ（配列番号６７）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、ＡＳＬＤＧＲＤＹ（配列番号６８）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、ＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹ（配列番号６９）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＷＡＳ（配列番号７０）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２およびＫＱＳＹＮＬＬＴ（配列番号７１）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、モノクローナル抗体。
  3. ハンチントン病の処置またはその臨床症状の発症を遅延させるために使用するための、ｐ７５６４（配列番号２）の配列からなるハンチンチン（ＨＴＴ）タンパク質のペプチドに結合可能な結合ドメインを有するモノクローナル抗体を含む組成物。
  4. ハンチントン病の処置またはその臨床症状の発症を遅延させるために使用するための、ｐ７５６４（配列番号２）の配列を有するハンチンチン（ＨＴＴ）タンパク質のペプチドに結合可能な結合ドメインを有するモノクローナル抗体を含む組成物であって、該モノクローナル抗体が、ＧＦＴＦＮＴＹＡ（配列番号７２）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号７３）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、ＶＲＨＧＥＹＧＮＰＷＦＡＹ（配列番号７４）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、ＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号７５）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＫＶＳ（配列番号７６）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２およびＳＱＳＴＨＶＰＹＴ（配列番号７７）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、組成物。
  5. ハンチントン病の処置において使用するための、請求項３または４に記載の組成物。
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