KR20240115191A - 조절 t 세포 표면 항원 및 이에 특이적으로 결합하는 항체 - Google Patents

조절 t 세포 표면 항원 및 이에 특이적으로 결합하는 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조절 T 세포의 표면에 존재하는 항원인 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다.

Description

조절 T 세포 표면 항원 및 이에 특이적으로 결합하는 항체 {Regulatory T cell surface antigen and an antibody specifically binding to the epitope thereof}
본 발명은 조절 T 세포의 표면에 존재하는 항원인 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다.
모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성은, 자기(self)를 구성하고 있는 항원 물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비-자기(non-self) 항원에 대해서는 이를 인식하고 제거할 수 있는 능력을 갖는 것이다. 이처럼 자기 항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라 한다. 자기 관용은 자기 항원의 특이적인 수용체를 가지고 있을지 모르는 림프구를 제거함으로써, 또는 자기 항원에 접한 후 스스로 반응하는 기능이 불활성화됨으로써 발생한다. 자기 관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기 항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 초래되는 질환을 자가면역질환(autoimmune disease)이라 한다.
상기 자가면역질환의 치료를 위하여, 1970년 대 초 Gershon에 의해 고식적 T 세포(conventional T cells)의 효과 기능(effector function)을 제어 및 억제할 수 있는 T 세포의 존재 가능성이 있는 억제 T 세포라는 개념을 도입하여, 처음으로 제시된 이래, 면역학의 많은 분야에서 조절 T 세포의 생물학적 특성 및 기능을 규명하기 위한 연구가 이루어져 왔다.
이에, 상기 조절 T 세포(Treg)는 과다한 염증과 면역반응의 발생을 자연적으로 방지하는 중요한 역할을 하지만, 자가면역질환과 만성염증질환이 발생하는 경우 조절 T 세포의 기능과 숫자가 현저하게 줄어드는 것이 보고되었다. 따라서, 면역 질환과 염증 질환이 있는 환자의 경우, 조절 T 세포가 정상적인 수준으로 생성되는 것이 중요하며, 이는 상기 질환의 치료법 중 하나가 될 수 있다.
현재까지 조절 T 세포에 특이적으로 존재하는 유전자 및 단백질에 대한 연구가 진행되어, CD25, CTLA4, CD62L, CD38, CD103, GITR 및 CD45RB 등의 물질이 표지 물질에 해당할 수 있음이 제시되어 왔지만, 아직 조절 T 세포만을 단독으로 표적화 할 수 있는 유전자 및 단백질은 존재하지 않는다.
한편, 상보성 결정 영역(complementarity determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리는 3개의 다변 가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 항원 결정기(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지칭하고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 발명의 일 목적은 조절 T 세포(regulatory T cell, Treg cell)의 표면에 존재하는 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 골 질환의 진단용 조성물, 진단 키트 또는 진단 기기를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 파골세포 (osteoclast) 또는 조골세포 (osteoblast) 의 표면에 존재하는 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 골 질환의 진단용 조성물, 진단 키트 또는 진단 기기를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프 또는 상기 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 "에피토프"는 서열 내의 아미노산(또는 이의 서브세트)이 항체 또는 결합 단편, 예를 들어 본 명세서에 기술된 항체 또는 결합 단편에 의해 특이적으로 인식되는 항원 내 아미노산의 서열을 의미한다. 에피토프는 하나 이상의 항원 결정기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 형태적 에피토프에 상응하는 분리된 펩티드에 대해 출현된 항체는 상기 에피토프 서열의 일부 또는 전부를 인식한다.
본 발명에서, 상기 "Lrig-1 단백질"은 조절 T 세포의 표면에 존재하는 막관통 단백질로서, 세포 외 혹은 루멘 쪽의 루신 반복 서열(leucine-rich repeat(LRR))과 세개의 면역 체 유사 도메인(immunoglobulin-like domains), 세포막 관통 서열 및 세포질 꼬리부분으로 구성되어 있다. LRIG 유전자 패밀리는 LRIG1, LRIG2와 LRIG3이 존재하며, 각각의 패밀리를 구성하는 아미노산들은 매우 보전적으로 구성되어 있다. 상기 LRIG1 유전자는 정상 피부에서 높게 발현하고 있으며, 기저와 모낭 세포에 발현하여 상피 줄기세포의 증식을 조절할 수 있다. 따라서, 표피의 항상성 유지에 중요한 역할을 하며, 부존재시 건선이나 피부암으로 발전할 수 있다. LRIG1이 위치한 염색체 3p14.3 부분이 잘리는 경우에는 암세포로 발전할 가능성이 있는 것으로 보고된 바 있으며, 실제로 신장암(renal cell carcinoma)과 편평상피암(cutaneous squamous cell carcinoma)에서는 LRIG1의 발현이 매우 감소되어 있는 것으로 확인되었다. 그런데 최근에는 상기 Lrig-1 단백질을 발현하는 암은 20~30% 정도에 불과하다고 밝혀지기도 하였다. 한편, 본 발명의 목적상 상기 Lrig-1 단백질은 포유류 또는 마우스로부터 유래된 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시에서 상기 Lrig-1 단백질은 포유류, 예를 들면, 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등으로부터 유래된 Lrig-1 단백질일 수 있다.
본 발명의 일 예시에서 상기 Lrig-1 단백질은 서열번호 1로 표시되는 인간 유래 Lrig-1 단백질일 수 있고, 이는 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 예시에서 상기 Lrig-1 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 마우스 유래 Lrig-1 단백질일 수 있고, 이는 서열번호 4로 표시되는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 예시에서 상기 Lrig-1 단백질은 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 Lrig-1 세포 외 도메인은 포유류, 예를 들면, 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등으로부터 유래된 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인일 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 Lrig-1 단백질의 세포 외 단백질은 인간 또는 마우스로부터 유래된 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시에서 상기 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인은 인간 유래 Lrig-1 단백질의 35번째 내지 794번째 아미노산 서열에 해당하는 서열번호 5로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 예시에서 상기 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인은 마우스 유래 Lrig-1 단백질의 35번째 내지 794번째 아미노산 서열에 해당하는 서열번호 6으로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명에 대해 보다 자세히 설명한다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 상기 Lrig-1 단백질의 에피토프로서, 상기 서열번호 35 내지 45로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 에피토프를 제공한다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 Lirg-1 단백질의 에피토프는 서열번호 35 내지 40으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 에피토프일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 예시로서, 상기 Lrig-1 단백질의 에피토프는 서열번호 41 내지 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 에피토프일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 Lrig-1 단백질의 에피토프는 Lrig-1 단백질의 62번째에서 101번째, 또는 88번째에서 92번째, 또는 90번째에서 101번째, 또는 111번째에서 134번째, 또는 452번째에서 476번째, 또는 472번째에서 480번째, 또는 542번째에서 553번째 염기서열에 해당하는 부위일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면 상기 Lrig-1 단백질의 에피토프는 Lrig-1 단백질의 95번째에서 101번째, 또는 472번째에서 476번째 염기서열에 해당하는 부위일 수 있다.
본 발명의 상기 에피토프는 입체구조 에피토프(conformational epitope)일 수 있다.
본 발명의 상기 "입체구조 에피토프"는 연속적인 서열로 이루어지는 1차원적인 선형 에피토프와는 달리, 불연속적인 아미노산 배열로 구성된다. 이러한 입체구조 에피토프는 항체 항원결합부위의 3차원적인 구조와 반응한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 상기 "결합 분자"는 항체 또는 항원 결합 단편 중 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "항체"는 전장 항체(full-length antibody) 또는 항체의 일부분으로써 Lrig-1 단백질에 결합할 능력을 가지며 본 발명의 결합 분자와 경쟁적으로 Lrig-1 항원 결정 부위에 결합하는 항체 단편 모두를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로블린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 항원은 조절 T 세포(regulatory T cell)의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질일 수 있다. 바람직하게는 상기 Lrig-1 단백질의 류신 리치 구역(Leucine Rich Region) 또는 면역글로블린 유사 도메인을 특이적으로 인식하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.
본 발명에서 상기 "면역글로불린"은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변 가능한 영역 및 4개의 구조 영역(Framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 항원 결정기(Epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지칭하고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 발명에서, 본 발명에 제공되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본 발명에 제공되는 CDR로부터 선택되는 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR를 포함하거나, 본 발명에 제공되는 CDR의 보존적 변이체(conservative variants)를 포함하는 키메라 항체 또는 단편이다.
본 발명의 목적상, 아미노산 서열의 "변이체"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 부가 변이체, 아미노산 결실 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에서의 결실을 포함하는 아미노산 결실 변이체는 N-말단 및/또는 C-말단 트렁케이션(truncation) 변이체로도 일컬어진다.
아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열에서의 단일 또는 2개 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다. 삽입을 갖는 아미노산 서열 변이체의 경우, 하나 이상의 아미노산 잔기가 아미노산 서열의 특정 부위에 삽입되지만, 생성된 생성물의 적절한 스크리닝을 수반하는 무작위 삽입도 가능하다.
아미노산 부가 변이체는 하나 이상의 아미노산, 예컨대 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개, 또는 그 초과의 아미노산의 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단 융합체를 포함한다.
아미노산 결실 변이체는 서열로부터의 하나 이상의 아미노산의 제거, 예컨대 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개, 또는 그 초과의 아미노산의 제거를 특징으로 한다. 결실은 단백질의 임의의 위치에 있을 수 있다.
아미노산 치환 변이체는 서열 내의 적어도 하나의 잔기가 제거되고 또 다른 잔기가 그 자리에 삽입되는 것을 특징으로 한다. 변형이 상동성 단백질들 또는 펩티드들 사이에 보존되지 않는 아미노산 서열의 위치에 존재하는 것 및/또는 아미노산을 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 단백질 변이체에서의 아미노산 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉, 유사하게 하전되거나 하전되지 않은 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 측쇄가 관련된 아미노산 패밀리 중 하나의 치환을 포함한다. 자연 발생 아미노산은 일반적으로 4가지 패밀리, 즉, 산성(아스파르테이트, 글루타메이트), 염기성(라이신, 아르기닌, 히스티딘), 비-극성(알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 및 하전되지 않은 극성(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신) 아미노산으로 나뉜다. 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 함께 분류된다.
바람직하게는, 주어진 아미노산 서열과 상기 주어진 아미노산 서열의 변이체인 아미노산 서열 사이의 유사성, 바람직하게는 동일성 정도는 적어도 약 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%일 것이다. 유사성 또는 동일성 정도는 바람직하게는, 기준 아미노산 서열의 전장의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%인 아미노산 영역에 대해 주어진다. 예를 들어, 기준 아미노산 서열이 200개의 아미노산으로 이루어진 경우, 바람직하게는 유사성 또는 동일성 정도는, 바람직하게는 연속 아미노산인, 적어도 약 20개, 적어도 약 40개, 적어도 약 60개, 적어도 약 80개, 적어도 약 100개, 적어도 약 120개, 적어도 약 140개, 적어도 약 160개, 적어도 약 180개, 또는 약 200개의 아미노산에 대해 주어진다. 바람직한 구현예들에서, 유사성 또는 동일성 정도는 기준 아미노산 서열의 전장에 대해 주어진다. 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 업계에 알려진 도구, 바람직하게는 최상의 서열 정렬을 사용하여, 예를 들어, 표준 설정, 바람직하게는 EMBOSS::니들(needle), 매트릭스(Matrix): Blosum62, 갭 오픈(Gap Open) 10.0, 갭 익스텐드(Gap Extend) 0.5를 사용하는 Align을 사용하여 수행될 수 있다.
"서열 유사성"은 동일하거나 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 백분율을 나타낸다. 두 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"은 서열들 사이의 동일한 아미노산의 백분율을 나타낸다.
용어 "동일성 백분율"은, 최상의 정렬 후에 수득되는, 비교될 두 서열 사이의 동일한 아미노산 잔기의 백분율을 나타내도록 의도되며, 이 백분율은 순전히 통계적이며 두 서열 사이의 차이는 무작위로 및 그들의 전장에 걸쳐 분포된다. 두 아미노산 서열 사이의 서열 비교는, 통상적으로, 이들 서열을 최적으로 정렬한 후 비교함으로써 수행되며, 상기 비교는 서열 유사성의 국소 영역을 확인하고 비교하기 위해 세그먼트에 의해 또는 "비교 윈도우"에 의해 수행된다. 비교를 위한 서열들의 최적 정렬은, 수동에 의한 것 외에도, 국소 상동성 알고리즘에 의해 또는 유사성 검색 방법에 의해, 또는 이들 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 프로그램(미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)의 GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA)에 의해 생성될 수 있다.
동일성 백분율은 비교되는 두 서열 사이의 동일한 위치의 수를 결정하고, 이 수를 비교된 위치의 수로 나누고, 얻어진 결과에 100을 곱하여 이들 두 서열 사이의 동일성 백분율을 얻음으로써 계산된다.
상동성 아미노산 서열은 본 발명에 따르면 아미노산 잔기의 적어도 40%, 특히 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 및 바람직하게는 적어도 95%, 적어도 98 또는 적어도 99% 동일성을 나타낸다.
본원에 기재된 아미노산 서열 변이체는 당업자에 의해, 예를 들어, 재조합 DNA 조작에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 치환, 부가, 삽입 또는 결실을 갖는 단백질 및 펩티드를 제조하기 위한 DNA 서열의 조작은 잘 알려져 있다. 또한, 본원에 기재된 펩티드 및 아미노산 변이체는, 예를 들어, 고상 합성 및 유사한 방법에 의해서와 같은 알려진 펩티드 합성 기법의 도움으로 쉽게 제조될 수 있다.
본 발명에서, 본 발명에 제공되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본 발명에 제공되는 CDR로부터 선택되는 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR를 포함하거나, 본 발명에 제공되는 CDR의 보존적 변이체를 포함하는 인간화 항체 또는 단편이다.
본 발명에서, 본 발명에 제공되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본 발명에 제공되는 서열을 포함하는 경쇄 및/또는 중쇄 또는 이들의 보존적 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 보존적 변이체는 본 발명에 제공되는 참조 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 상동하는 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 보존적 변이체는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함한다.
본 발명에서, 본 발명에 제공되는 Lrig-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 본원에 제공되는 서열 또는 이의 보존적 변이체를 포함한다. 본원에서 사용되는 "보존적 변이체"는 보존적 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함한다. 당업자는 보존적 아미노산 치환은 예를 들어, 유사한 측쇄와 같은 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산과 하나의 아미노산의 치환이며, 참조 서열의 생물학적 활성을 유지한다는 것을 인식할 것이다. 예시적인 보존적 치환은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에서 상기 "전장 항체"는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드(Disulfide) 결합으로 연결되어 있으며, IgA, IgD, IgE, IgM, 및 IgG를 포함한다. 상기 IgG는 그 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
또한, 본 발명에서 상기 "항원 결합 단편"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 항원 결합 단편의 예는 ① 경쇄의 가변영역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변영역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변영역(CH1)으로 이루어진 Fab 단편; ② VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; ③ 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; ④ VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편; ⑤ 분리된 CDR 영역; ⑥ 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; ⑦ VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); ⑧ 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체 및 ⑨ 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) 등을 포함한다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소, 예를 들면 파파인 또는 펩신을 이용하는 경우 Fab 또는 F(ab')2의 단편을 얻을 수 있으며, 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 항체 및 이의 단편은 단일클론항체(monoclonal antibody), 다클론항체(polyclonal antibody), 키메라 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 인간 항체(human antibody), 이가(bivalent), 양특이성 분자, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody), 항체 모방체, 유니바디(unibody), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 또는 이의 단편일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "키메라 항체"는, 생쥐 항체의 가변 영역 및 인간 항체의 불변 영역을 재조합 시킨 항체로서, 생쥐 항체에 비하여 면역 반응이 크게 개선된 항체이다.
또한, 본 발명에서 상기 "인간화 항체"는 인간이 아닌 종에서 유래한 항체의 단백질 서열을 인간에서 자연적으로 생산된 항체 변이체와 유사하도록 변형시킨 항체를 의미한다. 그 예로 상기 인간화 항체는 생쥐 유래의 CDR을 인간 항체 유래의 FR과 재조합시켜 인간화 가변 영역을 제조하고, 이를 바람직한 인간 항체의 불변 영역과 재조합시켜 인간화 항체를 제조할 수 있다.
본 발명에서 상기 결합 분자는 Lrig-1 단백질에 결합할 수 있고, 그 외의 다른 단백질에도 결합할 수 있는 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항원 결합 단편으로도 제공될 수 있다.
본 발명에서 상기 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 본 발명에 따르는 결합 분자를 포함할 수 있다. 본 발명에서 일 예시로, 상기 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 Lrig-1 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서 Lrig-1 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 본 발명에 따르는 결합 분자를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질에 결합할 수 있는 결합 분자인 항원 결합 도메인, 및 다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 포함한다. 여기서, 다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 Lrig-1 단백질 이외의 다른 단백질로, 이에 제한되는 것은 아니지만 예를 들면, PD-1 또는 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따르는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 임의의 적합한 포맷, 예를 들면, 전문이 본원에 참조로 인용된 문헌에 기재된 포맷으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항원 결합 단편은 이중특이적 항체 접합체(예: IgG2, F(ab')2 또는 CovX-바디), 이중특이적 IgG 또는 IgG-형 분자(예: IgG, scFv4-Ig, IgG-scFv, scFv-IgG, DVD-Ig, IgG-sVD, sVD-IgG, 또는 2 인(in) 1-IgG, mAb2, 또는 Tandemab common LC), 비대칭성 이중특이적 IgG 또는 IgG-형 분자(예: kih IgG, kih IgG common LC, CrossMab, kih IgG-scFab, mAb-Fv, 전하쌍 또는 SEED-바디), 소형 이중특이적 항체 분자(예: 디아바디(Db), dsDb, DART, scDb, tandAbs, 탠덤 scFv (taFv), 탠덤 dAb/VHH, 트리플 바디, 트리플 헤드, Fab-scFv, 또는 F(ab')2-scFv2), 이중특이적 Fc 및 CH3 융합 단백질(예: taFv-Fc, 디-디아바디, scDb-CH3, scFv-Fc-scFv, HCAb-VHH, scFv-kih-Fc, 또는 scFv-kih-CH3), 또는 이중특이적 융합 단백질(예: scFv2-알부민, scDb-알부민, taFv-독소, DNL-Fab3, DNL-Fab4-IgG, DNL-Fab4-IgG-사이토카인2)일 수 있다. 당업자는 본 발명에 따르는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편을 설계하고 제조할 수 있다.
본 발명에서 상기 이중특이적 항체를 생산하는 방법은, 환원성 디설파이드 또는 비환원성 티오에테르 결합과 항체 또는 항체 단편의 화학적 가교결합을 포함한다. 예를 들면, N-석신이미딜-3-(-2-피리딜디티오)-프로피오네이트(SPDP)는 디설파이드 연결된 이중특이적 F(ab)2 헤테로다이머를 생성하기 위해, 예를 들면, 힌지 영역 SH- 그룹을 통해 Fab 단편을 화학적으로 가교결합시키는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 이중특이적 항체를 생산하기 위한 다른 방법은 이중특이적 항체를 분비할 수 있는 쿼드로마 세포를 생성하기 위해 항체-생산 하이브리도마를, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜과 융합시킴을 포함한다.
본 발명에 따르는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 예를 들면, 항원 결합 분자를 위한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 작제물로부터 발현에 의해 재조합으로 생산될 수 있다.
예를 들면, 2개의 항원 결합 도메인(즉, PD-1 등에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 위한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인, 및 다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 위한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인)을 위한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하고, 항원 결합 도메인 사이의 적합한 링커 또는 이량체화 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 작제물은 분자 클로닝 기술에 의해 제조될 수 있다. 재조합 이중특이적 항체는 이후 적합한 숙주 세포(예: 포유류 숙주 세포) 중에서 작제물의 발현(예: 시험관 내)에 의해 생산될 수 있고, 이어서 발현된 재조합 이중특이적 항체는 임의로 정제될 수 있다.
항체는, 비변형된 부모 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화도가 개선된 변형된 항체가 생성되는 친화도 성숙 공정에 의해 생성될 수 있다. 친화도 성숙 항체는 당해 기술 분야에 공지된 절차로 생산될 수 있다.
아울러, 본 발명에서 제공하는 결합 분자는, Lrig-1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 한, 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘; 알라닌, 글라이신 및 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5). 단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 수행할 수 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Gln/Glu 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 결합 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다.
본 발명에서 용어 "실질적인 동일성"이란, 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 병렬하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 병렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 이 주소에서 접속 가능하다(ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 온라인(ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ blast_help.html)을 통해 확인할 있다.
본 발명에서 상기 결합 분자, 바람직하게 상기 항체는, 항체를 생산하는 통상의 방법에 의해 생성될 수 있지만, 친화도 성숙(Affinity maturation)에 의해 생성될 수 있다.
본 발명에서 상기 "친화도 성숙(Affinity maturation)"은, 활성화된 B 세포가 면역 반응 과정에서 항원에 대한 친화도가 증가된 항체를 생산하는 과정을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 친화도 성숙은 자연에서 일어나는 과정과 동일하게, 돌연변이와 선택의 원리에 기초하여 친화도 성숙으로 인해 생성된 항체 또는 항체 단편을 생성할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 "단일클론항체"는, 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 일컫는 말로, 특정 항원 결정기(Epitope)에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
본 발명에서 상기 "결합" 또는 "특이적 결합"은 본원 항체 또는 항체 조성물의 항원에 대한 친화도를 나타내는 것이다. 항원 항체 결합에서 "특이적 결합"은 전형적으로 해리상수(dissociation constant, Kd)가 1x10-5M 미만 또는 1x10-6M 미만 또는 1x10-7M 미만인 경우 비특이적인 배경 결합과 구분될 수 있다. 특이적 결합은 당업계의 공지된 방법, 예를 들면 ELISA, SPR(Surface plasmon resonance), 면역침전(immunoprecipitation), 공침전(coprecipitation) 등의 방법으로 검출될 수 있으며, 비특이적 결합과 특이적 결합을 구분할 수 있는 적절한 대조군을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 단량체의 항원 결합능의 적어도 일부를 포함하는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 등의 다량체로 존재할 수 있다. 이러한 다량체는 또한 동종다량체, 또는 이종다량체를 포함하는 것이다. 항체 다량체는 다수의 항원 결합 부위를 포함하기 때문에 단량체와 비교하여 항원에 대한 결합능이 우수하다. 항체의 다량체는 또한 다기능성(bifunctional, trifunctional, tetrafunctional) 항체 제작에도 용이하다.
본 발명에서 상기 "다기능성"이란, 두 가지 이상의 활성 또는 기능 (예를 들면 항원결합능, 효소 활성, 리간드 또는 수용체 결합능)을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편을 일컫는 것으로, 예를 들면 본 발명의 항체는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드 예를 들면 루시퍼라제, 아세틸트랜스퍼라제, 갈락토시다제 등과 결합될 수 있다. 다기능성 항체는 또한 다가성(multivalent) 또는 다특이성(bispecific, trispecific, 등) 형태의 항체를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 조절 T 세포 상에 존재하는 서열번호 35 내지 45 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하여 다양한 질환, 예를 들면 골 질환을 진단할 수 있다.
본 발명에서 상기 '골 질환'은 골절, 골다공증, 치주염, 파제트병, 골연화증, 골감소증, 골위축 또는 무혈성대퇴골괴사, 골결손, 골절 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증성 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환, 부정교합, 골 유합장애, 가관절증, 골 괴사, 골종양, 골암 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, Treg의 Foxp3, T 세포 수용체(TCR)의 강도, 결합 및 발현, 인터루킨-10(IL-10) 및 IL-35와 같은 항염증성 사이토카인을 생산하는 능력, 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA-4), 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1), CD39 및 CD73이 면역 조절에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.
한편, 본 발명에서, "예방"은 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 질환의 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서, "치료"는 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 질환의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항 응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서 상기 "비경구"란, 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
본 발명에서 상기 "개체"는 골 질환의 발병이 의심되는 개체로서, 상기 골 질환 의 발병의 의심 개체는 해당 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물을 의미하나, 본 발명의 항체, 항원 결합 단편 또는 항체-약물 결합체로 진단 가능한 개체는 제한 없이 포함된다.
본 발명의 방법은 항체 또는 항체-약물 결합체를 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
한편, 이에 제한되지 않으나, 상기 질환의 진단 방법은 하나 이상의 질환에 대한 치료적 활성을 가지는 화합물 또는 물질을 투여하는 것을 더 포함하는 병용 요법일 수 있다.
본 발명에서 상기 "병용"은 동시, 개별 또는 순차 투여를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 상기 투여가 순차 또는 개별적인 경우, 2차 성분 투여의 간격은 상기 병용의 이로운 효과를 잃지 않도록 하는 것이어야 한다.
본 발명에서 상기 항체 또는 항체-약물 결합체의 투여 용량은 환자 체중 1 kg당 약 0.0001 ㎍ 내지 500 mg일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 상기 결합 분자를 이용하여 T 세포의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질 또는 이의 세포 외 도메인; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 면역 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 T 세포는 조절 T 세포일 수 있다.
본 발명의 상기 진단용 조성물은 조절 T 세포는 예를 들면, 활성화된 조절 T 세포 즉, 이펙터 T 세포의 억제능이 활성화된 조절 T 세포의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질 또는 이의 세포 외 도메인; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 진단용 조성물은 파골세포 또는 조골세포 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질 또는 이의 세포 외 도메인; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 진단용 조성물은 T 세포의 표면에 존재하는 CD25, TIGIT, LAG3, CTLA-4, GITR, OX40, ICOS, PD-1, TIM-3, CCR4, FR4, CD15s, PI-16 및 Lrig-1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다. 이와 같이, T 세포의 표면에 존재하는 다양한 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 더 측정하는 경우에는 상기 Lrig-1 단백질 또는 이의 세포 외 도메인; 또는 이를 코딩하는 유전자를 단독으로 측정한 경우와 비교하여 목적하는 질환을 진단하는데 현저한 시너지 효과가 발휘되도록 할 수 있다.
본 발명의 상기 Lrig-1 단백질 또는 이의 세포 외 도메인의 발현 수준과, CD25, TIGIT, LAG3, CTLA-4, GITR, OX40, ICOS, PD-1, TIM-3, CCR4, FR4, CD15s, PI-16 및 Lrig-1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254 (5037): 1497-1500]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명에서 상기 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명의 상기 Lrig-1 단백질을 코딩하는 유전자(즉, LAIR1) 또는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인을 코딩하는 유전자와, CCD25, TIGIT, LAG3, CTLA-4, GITR, OX40, ICOS, PD-1, TIM-3, CCR4, FR4, CD15s, PI-16 및 Lrig-1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, LNA 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명의 상기 "프로브"는, 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다 [J Weiler, J Hunziker and J Hall Gene Therapy (2006) 13, 496.502]. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다.
본 발명에서 상기 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 Lrig1 단백질이나, 이를 암호화하는 유전자(LRIG1)의 정보는 알려져 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 골 질환의 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 예를 들면, 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머 쌍은 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 예를 들면 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 또는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일 클론 항체, 다 클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 상기 결합 분자를 이용하여 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 T 세포의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질 또는 이의 세포 외 도메인; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 골 질환을 진단하기 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 T 세포는 조절 T 세포일 수 있다.
본 발명의 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 T 세포의 표면에 존재하는 CD25, TIGIT, LAG3, CTLA-4, GITR, OX40, ICOS, PD-1, TIM-3, CCR4, FR4, CD15s, PI-16 및 Lrig-1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 더 측정하는 것일 수 있다. 이와 같이, T 세포의 표면에 존재하는 다양한 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 더 측정하는 경우에는 상기 Lrig-1 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자를 단독으로 측정한 경우와 비교하여 목적하는 질환을 진단하는데 현저한 시너지 효과가 발휘되도록 할 수 있다.
본 발명의 상기 "목적하는 개체"는, 해당 질환의 발병 여부가 불확실한 개체로, 질환의 발병 가능성이 높은 개체를 의미한다.
본 발명의 상기 "생물학적 시료"는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 Lrig-1 단백질; 또는 이의 세포 외 도메인은 T 세포에서도 특히 조절 T 세포, 예를 들면, 활성화된 조절 T 세포 즉, 이펙터 T 세포의 억제능이 활성화된 조절 T 세포의 세포 표면에서 발현되는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 Lrig-1 단백질 또는 이의 세포 외 도메인과, CD25, TIGIT, LAG3, CTLA-4, GITR, OX40, ICOS, PD-1, TIM-3, CCR4, FR4, CD15s, PI-16 및 Lrig-1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질의 발현 수준의 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(Liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(Liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅(Western blotting) 또는 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 Lrig-1 단백질 또는 이의 세포 외 도메인을 코딩하는 유전자와, CD25, TIGIT, LAG3, CTLA-4, GITR, OX40, ICOS, PD-1, TIM-3, CCR4, FR4, CD15s, PI-16 및 Lrig-1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질을 코딩하는 유전자의 존재 여부와 발현 정도를 확인하기 위하여, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 분석 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 Lrig-1 단백질 또는 이의 세포 외 도메인; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 변화된 경우, 골 질환의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "대조군"은 정상 대조군일 수 있으며, 보다 구체적으로 골 관련 질환이 없는 것으로 확인된 환자의 혈청 샘플로부터 수득된 것일 수 있고, 골 밀도 검사, 초음파 및 CT를 실시하고 골 관련 질환이 없는 것으로 최종적으로 확인된 환자의 TregL1의 발현 수준의 평균 내지 중간 값일 수 있다. 대조군에서의 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현량과 분석 대상이 되는 골 관련 질환 발병 환자 유래의 생물학적 시료에서의 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현량을 비교할 수 있으며, 상기 발현량의 유의한 변화 여부를 판단하여 골 관련 질환을 진단할 수 있다.
본 발명에서 "높은 수준"이란 정상 대조군에 비하여 측정 가능할 정도로 유의하게 고발현되는 것을 의미하며, 구체적으로는 예를 들어 정상 대조군에 비하여 20% 이상 발현되는 경우를 의미하고, 보다 구체적으로는 30%, 보다 더 구체적으로는 40%, 가장 구체적으로는 50% 이상 발현되는 경우를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 T 세포의 표면에 존재하는 CD25, TIGIT, LAG3, CTLA-4, GITR, OX40, ICOS, PD-1, TIM-3, CCR4, FR4, CD15s, PI-16 및 Lrig-1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 발현이 변화(증가 또는 감소)된 경우, 골 질환의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체 예에서, 상기 Lrig-1 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 감소된 경우, 골 질환의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는 단계를 포함할 수 있다.
더 나아가, 본 발명에서 상기와 같이 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 Lrig-1 단백질 또는 이의 세포 외 도메인; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 골 질환의 발병 가능성이 높은 것으로 예측 또는 진단하는 경우, 상기 목적하는 개체에 대하여 그 질환에 대한 약제 투여를 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 보다 상세하게는 골 관련 질환, 특히는 골관절염을 판정하는 것으로서, 특히는 연골 세포의 비대 조절 이상으로 발생하는 질환을 판정하는 것을 말한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 골 관련 진단을 위한 진단기기에 관한 것이다.
본 발명의 상기 진단기기의 측정부는 목적하는 개체로부터 얻어진 생물학적 시료에 대하여 TregL1의 발현 수준을 측정하는 제제를 이용하여 TregL1의 발현 수준을 측정할 수 있다.
본 발명에서 상기 목적하는 개체는, 인간, 래트, 마우스, 모르모트, 햄스터, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 구체적으로 인간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 생물학적 시료는 전혈 (whole blood), 백혈구 (leukocytes), 말초혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층 (buffy coat), 혈장 (plasma), 혈청 (serum), 객담 (sputum), 눈물 (tears), 점액 (mucus), 세비액 (nasal washes), 비강 흡인물 (nasal aspirate), 호흡 (breath), 소변 (urine), 정액 (semen), 침 (saliva), 복강 세척액 (peritoneal washings), 복수 (ascites), 낭종액 (cystic fluid), 뇌척수막 액 (meningeal fluid), 양수 (amniotic fluid), 선액 (glandular fluid), 췌장액 (pancreatic fluid), 림프액 (lymph fluid), 흉수 (pleural fluid), 유두 흡인물 (nipple aspirate), 기관지 흡인물 (bronchial aspirate), 활액 (synovial fluid), 관절 흡인물 (joint aspirate), 기관 분비물 (organ secretions), 세포 (cell), 세포 추출물 (cell extract) 및 조직 등으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 진단기기의 측정부에서 이용하는 제제는 TregL1의 발현 수준을 측정하는 제제일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 진단기기의 측정부에서 상기 제제를 이용하여 상기 유전자의 발현 정도를 확인함으로써 골 관련 질환, 보다 구체적으로는 연골 세포에서 비대 조절에 이상이 생겨 발생한 골 관련 질환, 특히는 골관절염 유무를 예측할 수 있다.
본 발명의 골 관련 질환의 진단기기는, 상기 측정부에서 얻어진 상기 유전자의 발현 정도로부터 상기 목적하는 개체의 골 관련 질환, 특히는 골관절염 유무를 예측하여 출력하는 검출부를 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 검출부는, 상기 측정부에서 얻어진 상기 유전자의 발현 정도가 대조군에서 측정된 TregL1의 발현 수준보다 높은 경우 연골 세포의 비대 조절 이상으로 인한 골 관련 질환이 발병하였거나 발병할 가능성이 높은 것으로 정보를 생성하여 분류함으로써 골 관련 질환, 특히는 골관절염을 진단할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 검출부는, 상기 측정부에서 얻어진 상기 유전자의 발현 정도가 대조군에서 측정된 TregL1의 발현 수준보다 높은 경우 연골 세포의 비대로 인한 골 관련 질환, 특히는 골관절염이 발병하였거나 발병할 가능성이 높은 것으로 정보를 생성하여 분류함으로써 골 관련 질환을 진단할 수 있다.
본 발명의 진단기기에서 진단의 대상이 되는 골 관련 질환은 골관절염(osteoarthritis), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골화석증(osteopetrosis), 골위축(bone atrophy), 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 페이젯병(Paget's disease), 고칼슘혈증(hypercalcemia), 거대세포종 (giant cell tumor), 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 암(cancer) 관련 골재흡수 질병, 골절(fracture), 골용해(osteolysis) 및 연골석회화증(chondrocalcinosis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서는 Lrig-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 골 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예에서는 상기 Lrig-1 단백질은 조골세포 (osteoblast) 또는 파골세포 (osteoclast)의 표면에 존재하는 것인, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는 상기 Lrig-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함하는, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는 상기 Lrig-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 Lrig-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편인, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는 상기 항체 또는 항원 결합 단편은, 서열번호 35 내지 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는 상기 항체는 키메라 항체, 인간화 항체(humanized antibody), 이가(bivalent), 양특이성 분자, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody), 항체 모방체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 또는 이의 단편인, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는 상기 골 질환은 골절, 골다공증, 치주염, 파제트병, 골연화증, 골감소증, 골위축 또는 무혈성대퇴골괴사, 골결손, 골절 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증성 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환, 부정교합, 골 유합장애, 가관절증, 골 괴사, 골종양 및 골암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는 상기 조성물을 포함하는 골 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는 상기 골 질환은 골절, 골다공증, 치주염, 파제트병, 골연화증, 골감소증, 골위축 또는 무혈성대퇴골괴사, 골결손, 골절 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증성 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환, 부정교합, 골 유합장애, 가관절증, 골 괴사, 골종양 및 골암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 Lrig-1 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 골 질환을 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는 상기 Lrig-1 단백질은 조골세포 (osteoblast) 또는 파골세포 (osteoclast)의 표면에 존재하는 것인, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는 상기 생물학적 시료에서 측정된 Lrig-1 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 높거나 낮을 경우, 상기 목적하는 개체에게 골 질환이 있는 것으로 예측하는 것인, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는 상기 골 질환은 골절, 골다공증, 치주염, 파제트병, 골연화증, 골감소증, 골위축 또는 무혈성대퇴골괴사, 골결손, 골절 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증성 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환, 부정교합, 골 유합장애, 가관절증, 골 괴사, 골종양 및 골암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는 (a) 목적하는 개체로부터 얻어진 생물학적 시료에 대하여 Lrig-1의 발현 수준을 측정하는 측정부; 및 (b) 상기 측정부에서 측정된 Lrig-1의 발현 수준으로부터 상기 목적하는 개체의 골 질환의 발병 또는 발병 가능성 여부를 출력하는 검출부;를 포함하는 골 질환의 진단 기기를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는 상기 골 질환은 골절, 골다공증, 치주염, 파제트병, 골연화증, 골감소증, 골위축 또는 무혈성대퇴골괴사, 골결손, 골절 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증성 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환, 부정교합, 골 유합장애, 가관절증, 골 괴사, 골종양 및 골암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 진단 기기를 제공한다.
본 발명에서 제공하는 조절 T 세포(regulatory T cell, Treg cell)의 표면에 존재하는 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 골 질환을 정확히 진단할 수 있다,
또한, 본 발명에서 제공하는 파골세포 (osteoclast) 또는 조골세포 (osteoblast) 의 표면에 존재하는 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제 또한 골 질환을 정확히 진단할 수 있다,
또한, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 조절 T 세포, 파골세포 또는 조골세포 표면상에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하여 골 질환을 매우 효율적으로 진단할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1, Lrig-2 및 Lrig-3 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 조절 T 세포와 비 조절 T 세포 내 Lrig-1 단백질의 발현량 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 조절 T 세포의 표면에 Lrig-1 단백질의 발현을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 항체(GTC210-01, GTC210-02, GTC210-03, GTC210-04, GTC110-01, GTC110-02, GTC110-03 및 GTC110-04)와 Lrig-1 단백질에 대한 결합력을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에서 Lrig-1 단백질에 특이적인 단일클론항체(GTC210-01, GTC210-02, GTC210-03, GTC210-04, GTC110-01, GTC110-02, GTC110-03 및 GTC110-04)와 조절 T 세포 내에서 Lrig-1 단백질 유도 Stat3 인산화 조절 기작을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11 내지 도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 프로테아제(키모트립신(도 11), 트립신(도 12) 및 Asp-N/Lys-C(도 13))를 처리하여 분해시킨 펩타이드를 코발란트 라벨링 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14 및 도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 각각의 프로테아제에 의해 분해된 펩타이드를 코발란트 라벨링 분석에 의해 확인한 서열을 기준으로 정렬하여 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 16 및 도 17는 본 발명의 일 실시예에 따른 프로테아제(키모트립신(도 16) 및 트립신(도 17))를 처리하여 분해시킨 펩타이드를 크로스 링킹 분석 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 18 및 19은 본 발명의 일 실시예에 따른 각각의 프로테아제에 의해 분해된 펩타이드를 크로스 링킹 분석에 의해 확인한 서열을 기준으로 정렬하여 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 20는 본 발명의 일 실시예에 따른 코발란트 라벨링 및 크로스 링킹 분석에 의해 확인된 에피토프를 정렬하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 조골세포에서 Lrig1-Fc로 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 22은 파골세포에서 Lrig1-Fc로 염색한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[준비예 1] T 세포 아형 세포 배양
조절 T 세포(Treg)에서만 Lrig-1 단백질이 발현되는지 확인하기 위하여, T 세포의 아형(subset)인 Th0, Th1, Th2, Th17 및 iTreg을 준비하였다. 상기 iTreg은 자연적으로 분리한 nTreg과는 달리 하기 조성을 포함하는 배지에서 분화를 인공적으로 유도한 세포를 의미한다.
T 세포의 아형은 우선, 쥐의 비장으로부터 얻은 나이브(naive) T 세포를 분리한 뒤, 우태아혈청(FBS; hyclone, logan, UT) 10%를 포함하는 RPMI1640(Invitrogen Gibco, Grand Island, NY) 영양배지에 하기 표 1의 성분을 각각 더 포함하도록 하여, 37℃, 5 % CO2 배양기 내에서 72시간 배양을 통해 각각의 세포로 분화 유도하였다.
분화 세포 조성
Th0 anti-CD3, anti-CD28
Th1 IL-12, anti-IL-4 항체
Th2 IL-4, anti-IFNβ
Th17 IL-6, TGFβ, anti-IFNβ, anti-IL-4
iTreg IL-2, TGFβ
[실시예 1] Lrig-1 구조 분석
조절 T 세포의 표면 단백질인 Lrig-1 단백질에 특이적인 항체를 제작하기 위하여 Lrig-1 단백질의 세포외 도메인의 3차원 입체 구조를 예측하였다.
우선, 항원 결정기(Epitope) 염기서열 예측을 위해 Lrig-1 단백질의 세포외 도메인(Extracellular domain; ECD)의 구조를 확인하기 위하여 Uniprot(www.uniprot.org)과 RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org/pdb) 툴을 이용하여 3차원 입체 구조를 예측한 뒤, 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.
도 1에서 보는 바와 같이, Lrig-1 단백질의 세포외 도메인 중 Lrig-LRR 도메인(아미노산 서열 41 ~ 494번) 내에는 LRR1 내지 LRR15의 총 15개의 류신 리치 부위(Leucine rich region)가 존재하였다. 상기 LRR 도메인 각각은 23 내지 27개의 아미노산으로 구성되고, 류신은 3 내지 5개가 존재하였다.
또한, 도 2에서 보는 바와 같이, Lrig-1 단백질의 세포외 도메인 중 Lrig-1 단백질의 아미노산 서열 494 내지 781번에는 면역글로블린 유사 도메인(Immunoglobulin-like domain)이 3개 존재하였다.
[실시예 2] Lrig-1 mRNA의 조절 T 세포에서의 특이적 발현 확인
Lrig-1 단백질이 조절 T 세포에 특이적인 바이오마커(biomarker)로 작용할 수 있는지 검증하였다.
상기 검증을 위하여, 쥐의 비장으로부터 CD4 비드를 통해 자석 활성 세포 분류기(magnet-activated cell sorting; MACS)를 이용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다. 이후, CD25 항체를 이용하여 형광 활성 세포 분류기(FACS)를 이용해 조절 T (CD4+CD25+ T) 세포 및 비 조절 T (CD4+CD25- T) 세포를 분리하였다. 각각의 세포 및 상기 준비예 1에서 분화된 세포는 트리졸(Trizol)을 이용하여 mRNA를 추출한 뒤, 게노믹 RNA는 gDNA 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 업체에서 제공한 프로토콜에 의해 gDNA를 제거하였다. gDNA가 제거된 mRNA는 BDsprint cDNA 합성 키트 (Clonetech)를 통해 cDNA로 합성하였다.
상기 cDNA에서 Lrig-1 mRNA의 발현량을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 수행하였다.
상기 실시간 중합효소연쇄반응은 SYBR Green (Molecular Probes)을 이용하여 업체에서 제공한 프로토콜에 의해 95℃에서 3분, 61℃에서 15초, 72℃에서 30초씩 40 사이클의 조건으로, 하기 표 2의 프라이머를 이용하여 수행하였고, 상대적인 유전자 발현량은 △CT 방법을 이용하여 계산하였으며, HPRT를 이용하여 일반화(normalization) 하여, 그 결과를 도 3 내지 6에 나타내었다.
프라이머 방향 서열번호
마우스 Lrig-1 Forward 서열번호 7
Reverse 서열번호 8
마우스 Lrig-2 Forward 서열번호 9
Reverse 서열번호 10
마우스 Lrig-3 Forward 서열번호 11
Reverse 서열번호 12
마우스 FOXP3 Forward 서열번호 13
Reverse 서열번호 14
ACTG1 Forward 서열번호 15
reverse 서열번호 16
도 3에서 보는 바와 같이, 비 조절 T (CD4+CD25- T) 세포에 비하여 조절 T (CD4+CD25+ T) 세포에서 Lrig-1의 발현이 18.1배 높은 것을 알 수 있다. 이는, 기존에 알려져 있는 조절 T 세포의 마커인 Lag3 및 Ikzf4와 비교하였을 때 약 10배 정도 발현양이 높은 수준이었다.또한, 도 4 및 5에서 보는 바와 같이, 다른 종류의 면역세포에 비하여 조절 T 세포, 특히 유도된 조절 T 세포(iTreg)에 비해 자연적으로 분리한 조절 T 세포(nTreg)에서 Lrig-1 mRNA의 발현이 현저하게 높았다.
또한, 도 6에서 보는 바와 같이, Lrig 패밀리에 해당하는 Lrig-1, Lrig-2 및 Lrig-3 중에서 Lrig-1의 발현이 가장 높았다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포, 특히 자연적으로 존재하는 조절 T 세포에서 특이적으로 발현하는 것을 알 수 있다.
[실시예 3] Lrig-1 단백질의 조절 T 세포에서의 특이적 발현 확인
Lrig-1 mRNA로부터 발현된 Lrig-1 단백질이 조절 T 세포에서만 특이적으로 발현되는지 확인하였다.
조절 T 세포 특이적인 전사 인자인 FOXP3 프로모터에 RFP(Red fluorescence protein)이 결합된 FOXP3-RFP 주입(Knock-in) 쥐를 이용하여, 상기 쥐의 비장으로부터 CD4 비드로 자석 활성 세포 분류기(magnet-activated cell sorting; MACS)를 이용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다. 이후, RFP 단백질을 이용하여, 형광 활성 세포 분류기(FACS)를 통해 조절 T (CD4+RFP+ T) 세포 및 비 조절 T(CD4+RFP- T) 세포를 분리하여 얻었다. 각각의 상기 세포는 구입한 Lrig-1 항체 및 음성 대조군은 아이소타입(isotype)을 통해 염색하여 형광 활성 세포 분류기로 Lrig-1의 발현량을 측정하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 보는 바와 같이, 점선으로 표시되는 비 조절 T 세포의 경우 음성 대조군과 거의 동일한 Lrig-1의 발현 수준을 보였지만, 조절 T 세포의 경우 Lrig-1의 발현 수준이 높은 세포가 다수 존재하였다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포에서 특이적으로 발현하는 것을 알 수 있다.
[실시예 4] 조절 T 세포 표면에서의 Lrig-1 단백질 특이적 발현 확인
Lrig-1 단백질이 세포 치료의 타겟이 되기 위해서는 조절 T 세포의 표면에 발현되어야 더욱 효과적으로 타겟 치료를 할 수 있으므로, Lrig-1 단백질이 표면에서의 발현 여부를 확인하였다.
상기 준비예 1의 각각의 분화된 T 세포 아형을 항-CD4-APC 및 항 Lrig-1-PE 항체로 염색하고, 형광 이용 세포 분류기(Fluorescence-Activated Cell Sorter; FACS)를 이용하여 각각의 세포 표면에서 Lrig-1의 발현량을 측정하여, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 보는 바와 같이, 활성화된 T 세포(activated T cell), Th1 세포, Th2 세포, Th17 세포 및 나이브(Naive) T 세포에서는 Lrig-1의 발현이 0.77 내지 15.3의 양으로 발현되는 반면, 분화가 유도된 T 세포(iTreg)에서는 83.9로 높게 발현되었다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포(Treg) 세포에서 특이적으로 발현될 뿐만 아니라, 특히 조절 T 세포의 표면에서 더욱 높게 발현되는 것을 알 수 있다.
[제조예 1 내지 8] Lrig-1 단백질에 특이적인 단일클론항체의 제작
본 발명에 따른 Lrig-1 단백질에 특이적인 항체를 제작하였다. 본 항체는 특정 항원 결정기를 정하여 생산하지 않고, Lrig-1 단백질에 어느 부위든지 결합할 수 있는 항체를 생산하였다.
상기 항체를 제작하기 위하여 Lrig-1 단백질이 발현되는 세포를 제작하였다. 보다 상세하게는, 서열번호 2에 해당하는 DNA 단편 및 pcDNA(hygro)를 절단 효소로 절단한 뒤, 37 ℃에서 배양하여 라이게이션(Lrigation) 하여, Lrig-1 단백질의 DNA 서열이 삽입(insert) 되어 있는 pcDNA를 제작하였다. 상기 제작된 서열번호 2가 삽입된 pcDNA는 L세포에 형질주입(transfection)을 통해 도입되어 L 세포의 표면에 Lrig-1 단백질이 발현될 수 있도록 하였다.
상기 세포 표면에 발현되는 Lrig-1에 결합할 수 있는 경쇄(Light chain) 및 중쇄(heavy chain) 아미노산의 서열을 Human scFv library에서 선별하여, 총 8개의 중쇄 및 경쇄를 선별하였다.
상기 선별된 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 mlgG2a Fc 영역 또는 인간 IgG1 Fc 영역과 융합하여 단일클론항체(monoclonal antibody)를 제작하였다. 상기 단일클론항체의 서열은 하기 표 3과 같다.
구분 클론 위치 서열정보
제조예 1 GTC210-01 clone 중쇄 서열번호 17
중쇄 CDR1 서열번호 46
중쇄 CDR2 서열번호 47
중쇄 CDR3 서열번호 48
경쇄 서열번호 18
경쇄 CDR1 서열번호 49
경쇄 CDR2 서열번호 50
경쇄 CDR3 서열번호 51
제조예 2 GTC210-02 clone 중쇄 서열번호 19
중쇄 CDR1 서열번호 52
중쇄 CDR2 서열번호 53
중쇄 CDR3 서열번호 54
경쇄 서열번호 20
경쇄 CDR1 서열번호 55
경쇄 CDR2 서열번호 56
경쇄 CDR3 서열번호 57
제조예 3 GTC210-03 clone 중쇄 서열번호 21
중쇄 CDR1 서열번호 58
중쇄 CDR2 서열번호 59
중쇄 CDR3 서열번호 60
경쇄 서열번호 22
경쇄 CDR1 서열번호 61
경쇄 CDR2 서열번호 62
경쇄 CDR3 서열번호 63
제조예 4 GTC210-04 clone 중쇄 서열번호 23
중쇄 CDR1 서열번호 64
중쇄 CDR2 서열번호 65
중쇄 CDR3 서열번호 66
경쇄 서열번호 24
경쇄 CDR1 서열번호 67
경쇄 CDR2 서열번호 68
경쇄 CDR3 서열번호 69
제조예 5 GTC110-01 clone 중쇄 서열번호 25
중쇄 CDR1 서열번호 70
중쇄 CDR2 서열번호 71
중쇄 CDR3 서열번호 72
경쇄 서열번호 26
경쇄 CDR1 서열번호 73
경쇄 CDR2 서열번호 74
경쇄 CDR3 서열번호 75
제조예 6 GTC110-02 clone 중쇄 서열번호 27
중쇄 CDR1 서열번호 76
중쇄 CDR2 서열번호 77
중쇄 CDR3 서열번호 78
경쇄 서열번호 28
경쇄 CDR1 서열번호 79
경쇄 CDR2 서열번호 80
경쇄 CDR3 서열번호 81
제조예 7 GTC110-03 clone 중쇄 서열번호 29
중쇄 CDR1 서열번호 82
중쇄 CDR2 서열번호 83
중쇄 CDR3 서열번호 84
경쇄 서열번호 30
경쇄 CDR1 서열번호 85
경쇄 CDR2 서열번호 86
경쇄 CDR3 서열번호 87
제조예 8 GTC110-04 마우스 항체 중쇄 서열번호 31
중쇄 CDR1 서열번호 88
중쇄 CDR2 서열번호 89
중쇄 CDR3 서열번호 90
경쇄 서열번호 32
경쇄 CDR1 서열번호 91
경쇄 CDR2 서열번호 92
경쇄 CDR3 서열번호 93
제조예 9 GTC110-04
인간화 항체		 중쇄 서열번호 33
중쇄 CDR1 서열번호 88
중쇄 CDR2 서열번호 89
중쇄 CDR3 서열번호 90
경쇄 서열번호 34
경쇄 CDR1 서열번호 91
경쇄 CDR2 서열번호 92
경쇄 CDR3 서열번호 93
[실시예 5] 본 발명에 따른 항체의 Lrig-1 단백질에 대한 결합능 평가
본 발명에 따른 단일클론항체인 제조예 1 내지 제조예 9이 Lrig-1을 잘 인식하는 지를 확인하기 위하여, Lrig-1을 안정하게 발현하는 L 세포에 상기 제조예 1 내지 9의 항체 각각을 결합시킨 뒤 마우스 항체를 인식할 수 있으면서 eFlour 670이 컨쥬게이션(conjugation)된 2차 항체(secondary antibody)를 넣은 후 FACS를 이용하여 상기 제조예들의 Lrig-1 단백질에 대한 결합력을 분석하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체 모두 L 세포의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질을 효과적으로 인식하여 결합한 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 6] 본 발명에 따른 항체의 허용가능한 CDR의 변화
각 CDR에서 각각의 아미노산 위치의 역할을 조사하기 위해서, 제조예 1 내지 9의 Lrig-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 CDR을 GTC210-03을 기준으로 나열하여 분석하였다.
허용가능한 항체의 CDR 변화를 분석한 결과, 대조군과 비교하여 Lrig-1의 에피토프에 특이적으로 결합하고 조절 T 세포 내 신호전달경로를 조절하며 골 질환 에 효과가 있는 항체의 허용가능한 CDR의 변화를 표 4에 요약하였고 그 구체적인 서열을 표 5에 나타내었다.
허용가능한 CDR의 변화 요약
CDR 위치 허용 변경
VH CDR1 S1 G, N, D
D3 Y, A
VH CDR2 G1 L, S, W, A, V
S3 Y
P4 H
D5 G, S
G6 S, D,
S7 G
N8 S
I9 K, T
VH CDR3 V1 G, D
G2 L, I
L3 G, S
R4 L, P, N
R6 K, P, H
Y7 T, W, L
E8 G
A9 L, R, V
S11 Y
A12 Y, D, S
Y13 D, N
G14 A
VL CDR1 S1 T
G2 D
S9 N
Y11 N, S, T, D
S13 T, N, Y
VL CDR2 S1 D, A
D2 N
S3 N
H4 Q, N
VL CDR3 A1 G
T2 S, A
S5 Y, D
N8 S
G9 A
허용가능한 CDR의 서열
CDR 서열 바뀐 서열 서열번호
VH CDR1 SYDMS - 58
GYDMS S1→G 46
NYYMS S1→N, D3→Y 52
NYDMS S1→N 64
DYDMS S1→D 70
DYYMS S1→D 76
NYAMS S1→N, D3→A 82
NYAMS S1→N, D3→A 88
VH CDR2 GISPDGSNIYYADSVKG - 59
LIYPDSGNKYYADSVKG G1→L, S3→Y, G6→S, S7→G, I9→K 47
GISPGDSSTYYADSVKG D5→G, G6→D, N8→S, I9→T 53
SISPSSGSIYYADSVKG G1→S, D5→S, G6→S, S7→G, N8→S 65
WISHGGGSIYYADSVKG G1→W, P4→H, D5→G, S7→G, N8→S 71
GISHDSGSKYYADSVKG P4→H, G6→S, S7→G, N8→S, I9→K 77
AIYPGGGSIYYADSVKG G1→A, S3→Y, D5→G, S7→G, N8→S 83
VISHGGGSTYYADSVKG G1→V, P4→H, D5→G, S7→G, N8→S, I9→T 89
VH CDR3 VGLRCRYEACSYAYGMDV - 60
GLGLCKTGLCYYYDAMDV V1→G, G2→L, L3→G, R4→L, R6→K, Y7→T, E8→G, A9→L, S11→Y, A13→Y, Y14→D, G15→A 72
DILPCPWGRCYYDYAMDV V1→D, G2→I, R4→P, Y7→W, E8→G, A9→R, S11→Y, A13→D, G15→A 84
VISNCHLGVCYYSNGMDV G2→I, L3→S, R4→N, R6→H, Y7→L, E8→G, A9→V, S11→Y, A13→S, Y14→N 90
HWTTFDY - 78
DAGLSWAGAFDY - 48
GLYSNPNEPFDY D1→G, A2→L, G3→Y, L4→S, S5→N, W6→P, A7→N, G8→E, A9→P 54
DLDAFWRPSFDY A2→L, G3→D, L4→A, S5→F, A7→R, G8→P, A9→S 66
VL CDR1 SGSSSNIGSNYVS - 61
SGSSSNIGSNYVT S13→T 49
TGSSSNIGSNYVS S1→T 55
TGSSSNIGNNNVN S1→T, S9→N, Y11→N, S13→N 67
TGSSSNIGNNSVT S1→T, S9→N, Y11→S, S13→T 73
SGSSSNIGSNNVT Y11→N, S13→T 79
SDSSSNIGSNTVS G2→D, Y11→T 85
SGSSSNIGNNDVY S9→N, Y11→D, S13→Y 91
VL CDR2 SDSHRPS - 62
SDSHRPS - 50
DDSQRPS S1→D, H4→Q 56
SDSHRPS - 68
ADNNRPS S1→A, S3→N, H4→N 74
ANSNRPS S1→A, D2→N, H4→N 80
ADNNRPS S1→A, S3→N, H4→N 86
SDSQRPS H4→Q 92
VL CDR3 ATWDSSLNGYV - 63
GSWDYSLSAYV A1→G, T2→S, S5→Y, N8→S, G9→A 51
GTWDYSLNGYV A1→G, S5→Y 57
GSWDDSLSAYV A1→G, T2→S, S5→D, N8→S, G9→A 69
AAWDSSLSAYV T2→A, N8→S, G9→A 75
GAWDYSLSAYV A1→G, T2→A, S5→Y, N8→S, G9→A 81
GTWDYSLSGYV A1→G, S5→Y, N8→S 87
GTWDYSLSGYV A1→G, S5→Y, N8→S 93
[실시예 7] 항체의 조절 T 세포 내 신호전달경로의 조절
본 발명에 따른 단일클론항체인 제조예 1 내지 제조예 9이 Lrig-1 단백질을 통하여 조절 T 세포 내의 신호전달경로에 어떠한 영향을 미치는 지를 분석하기 위하여, 상기 제조예 1 내지 9에 해당하는 단일클론항체를 조절 T 세포에 처리하여 상기 조절 T 세포의 표면에 존재하는 Lrig-1를 자극한 뒤, 포스포티로신 면역 블롯(phosphotyrosine immunoblot)을 통하여 자극받은 조절 T 세포 내에 존재하는 Stat3 단백질의 티로신 인산화(tyrosine phosphorylation) 정도를 분석하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체(GTC210-01, GTC210-02, GTC210-03 및 GTC210-04)는 Stat3의 인산화(phosphorylation)를 Th17 세포와 같은 수준으로 증가를 시키는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체(GTC110-01, GTC110-02, GTC110-03 및 GTC110-04)는 Stat3의 인산화(phosphorylation)를 iTreg 세포와 같은 수준으로 계속하여 유지 및 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 8] Lrig-1 단백질의 에피토프 확인
Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인에서 상기 제조예 3의 GTC210-03 항체가 결합할 수 있는 부위인 구조 에피토프를 발굴하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
[8-1] 시약 및 재료
CNBr 활성화 세파로스 4B(CNBr-activated sepharose?? 4B) (GE, 17-0430-01)
디에틸피로카보네트(Diehtylpyrocarbonate) (DEPC, Sigma, 159220)
이미다졸(Imidazole) (Acros, 301870010)
시퀀싱 등급 수정 트립신(Sequencing grade modified trypsin) (promega, V5117)
카이모트립신(Chymotrypsin), Sequencing grade (Promega, V1062)
Asp-N, Sequencing grade (Promega, V1621)
rLyc-C, Mass spec grade (Promega, V1671)
disuccinimidyl dibutyric urea (DSBU; Thermo, A35459)
다이메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide) (DMSO, Sigma, D5879)
탄산수소나트륨(Sodium bicarbonate) (NaHCO3, Sigma, 792519)
염화나트륨(Sodium chloride) (NaCl, Sigma, S3014)
아세트산 나트륨(Sodium acetate) (NaOAc, Sigma, S2889)
트리스(Tris) (GE, 17-1321-01), 글라이신(Glycine) (GE, 17-1323-01)
ProteaseMAX?? Surfactant, Trypsin Enhancer (Promega, V207A)
아세톤(Acetone) (Merck, 1.07021.2521)
디티오트레이톨(Dithiothreitol) (DTT; GE, 17-1318-02)
요오드아세트아마이드(Iodoacetamide) (IAA; sigma, I-6125)
Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4, Sigma, 71505)
Sodium phosphate dibasic hepta-hydrate (Na2HPO4, Sigma, S9390)
시린지 필터(Syringe filter) 0.2um (Sartorius stedim, 16534)
아세토니트릴(Acetonitrile), 메탄올(Methanol), 물 (HPLC grade, J.T baker)
포름산(Formic acid) (Sigma, 33015)
[8-2] 실험 방법
[8-2-1] 코발란트 라벨링 MS(Covalent Labelling MS; CL-MS)
항원 및 항체의 비율이 2:1이 되도록 하고, 항원 샘플을 준비하였다. 그런 다음, DEPC가 1%가 넘지 않도록 첨가한 뒤에 37℃에서 1분 동안 반응시키고, 이미다졸을 첨가하여 반응이 종료되도록 하였다. 이후에 아세톤을 첨가하여 침전 반응을 수행한 뒤에 원심분리를 통해 상등액을 제거하고, 0.1%의 PM을 이용하여 침전물을 잘 풀어주었다. 이렇게 풀어진 침전물에 트립신, 키모트립신 또는 Asp-N/Lys-C를 넣어 분해하는 과정을 거친 뒤, PNGase-F를 이용하여 단백질에 붙은 당사슬 제거하였다. 마지막으로 DTT 및 IAA를 이용하여 단백질의 시스테인 간에 존재하는 이황화 결합을 절단하고 LC-MS, MS2 분석을 수행하였다.
[8-2-2] 크로스-링킹 MS(Cross-linking MS, XL-MS)
항원 및 항체의 비율이 2:1이 되도록 하고, 항원 샘플을 2개 준비하였다. 그런 다음, 크로스 링커(CSBU)를 DMSO를 통해 충분히 녹였다. 이후, 샘플 및 DSG의 비율이 1:100이 되도록 첨가하고, 다른 하나에는 DMSO만을 첨가한 뒤에 25 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 뒤, 트립신 또는 키모트립신을 이용하여 분해하는 과정을 거친 뒤, PNGase-F를 이용하여 단백질에 붙은 당사슬 제거하였다. 마지막으로 DTT 및 IAA를 이용하여 단백질의 시스테인 간에 존재하는 이황화 결합을 절단하고 LC-MS, MS2 분석을 수행하였다.
[8-2-3] LC-MS, MS 분석 조건
1. 액체 크로마토크래피(Liquid chromatography, LC) 조건
컬럼(Column): Hypersil GOLD?? (1.9 ㎛, 1 X 100 ㎜)
유속(Flow rate): 100 ㎕/min
이동상 A(Mobile phase A): D.W / 0.2% Formic acid
이동상 B(Mobile phase B): ACN / 0.2% Formic acid
온도(Temperature): 30 ℃
LC condition (gradient)
단계(Step) 전체 시간(min) 유속(㎕/min) A(%) B(%)
0 0.00 100.00 95.0 5.0
1 5.00 100.00 95.0 5.0
8 7.00 100.00 90.0 10.0
3 48.00 100.00 70.0 30.0
4 55.00 100.00 5.0 95.0
5 65.00 100.00 5.0 95.0
6 66.00 100.00 95.00 5.0
7 71.00 100.00 95.00 5.0
2. MS, MS2 condition
HESI Source
시스가스 유량(Sheath gas flow rate) 35
보조가스 유량(Aux gas flow rate) 10
스윕가스 유량(Sweep gas flow rate) 1
스프레이 전압(Spray voltage)(kV) 3.5
스프레이 전류(Spray current)(μA) -
모세관 온도(Capillary temp.)(℃) 250
S-lens RF level 50
보조가스 히터온도(Aux gas heater temp.)(℃) 200
General
실행시간(Runtime) 0에서 71분
극성(Polarity) 양성
기본충전상태(Default charge state) 2
Full MS
해상도(Resolution) 70,000
AGC target 3.00E+06
Maximum IT 100 ms
스캔 범위(Scan range) 200 to 2,000 m/z
dd-MS2 / dd-SIM
해상도(Resolution) 17,500
AGC targe 1.00E+05
Maximum IT 54 ms
반복 횟수(Loop count) 10
TopN 10
Isolation window 1.6 m/z
(N)CE / stepped (N)CE nce: 27
dd Settings
Minimum AGC target 8.00E+04
강도 임계값(Intensity threshold) 1.50E+05
Charge exclusion Unassigned, 7, 8, >8
Peptide match Preferred
동위원소 제외(Exclude isotopes) On
Dynamic exclusion 5.0 s
[8-3] 코발란트 라벨링 MS(Covalent labeling MS; CL-MS)
대조군인 huTregL1-his (Ag, Control)과 시험군인 huTregL1-his/E7-mlgG2a (Ag+Ab, Test) 샘플에 DEPC 처리 후 트립신, 키모티립신 또는 Asp-N/Lys-C를 처리하여 분해시킨 시료를 각각 3회 반복하여 분석하였다 (도 11 내지 도 13 참고). 상기 분석 결과에 나와 있는 대조군(Control 1) 및 시험군(Test 1)의 MS 분석결과를 BioPhama finder 프로그램을 이용하여 대조군(huTregL1-his)의 서열과 매치하고, 표지된 펩타이드(labeling peptides)를 비교하였다. 또한, 키모트립신, 트립신 또는 Asp-N/Lys-C를 처리한 대조군 및 시험군 시료에서 비 표지된 펩타이드 및 표지된 펩타이드를 확인하는 과정을 수행하였다. 반복 시험 결과를 종합하여 대조군 및 시험군의 라벨링(%)을 비교(decrease ≥ 5%)한 결과를 아미노산 서열을 기준(Res#)으로 정리하여, 도 11 및 도 12에 나타내었다. 이렇게 정리된 결과를 바탕으로 huTregL1-his 서열에 대입한 뒤, 그 중 2개의 프로테아제 시험 결과에서 일치되는 서열을 찾아내었다.
결과 상에서, Labeling decrease (%)가 5% 이상인 서열들 중 서열 E62-L101, D111-L134, Q542-Y553이 각각 13.2%, 15.3%, 14.7%로 10% 이상의 labeling decrease (%)로 확인되었다. E62-L101 서열에서 E62-K92 부분(AL)이 65.9%, L65-F87 부분(Y)이 48.7%, L88-L101 부분이 88.6%의 labeling (%)을 나타냈다. 이 결과를 통해 E62-L101 서열 중 labeling (%)이 50% 이상인 L88-L101 부분이 외부로 노출되어 있다고 생각할 수 있다. D111-L134 서열의 경우, 키모트립신 처리군에서 15.3% labeling decrease (%)를 나타내었으나 Control의 RSD가 62.4%임을 확인하였다. Q542-Y553 서열도 키모트립신 처리군에서 14.7% labeling decrease (%)를 나타내었으며, 대조군인 항원의 labeling (%)이 50% 이상으로 단백질 구조상 외부로 노출된 부분으로 판단되었다.
시험군(huTregL1-his/E7-mlgG2a)의 CL-MS 분석 결과들을 통해 도출된 본 서열들 중 2개 이상의 프로테아제 처리군에서 5% 이상의 labeling decrease (%)가 나왔을 뿐만 아니라 외부로 노출되어 있는 것으로 판단되는 서열인 E62-L101 서열이 에피토프 사이트에 해당하는 것을 최종적으로 파악하였다.
[8-4] 크로스 링킹 MS(XL-MS)
시험군(huTregL1-his/E7-mlgG2a) 혼합물 샘플을 준비하고, 시험군 시료에 크로스-링커(cross-linker)인 DSBU(disuccinimidyl dibutyric urea)를 처리하고 프로테아제(키모트립신 또는 트립신)으로 상기 시험군 시료를 분해시켰다(도 17 및 도 18). 그런 다음, 키모트립신 및 트립신으로 분해된 펩타이드가 대조군과 대비하여 시험관에서 검출되지 않은(2% 이하 포함) 펩타이드 서열을 확인하였다. 또한, 해당 펩타이드에서 크로스-링커만 결합되는 형태(mono)를 조사하여 재확인한(M%) 뒤, 최종적으로 시험군 샘플에서는 검출되지 않은 펩타이드 서열을 종합하여 에피토프 사이트로 결정하였다. L88-K92, S90-L101, N211-W222 등 3개의 서열의 경우, 키모트립신 또는 트립신 모두에서 대조군과 비교하여 시험군 샘플에서 검출된 동일한 서열의 펩타이드 비율 (T%)이 2% 이하로 확인되었다. T158-F174, G442-K476은 Chymotrypsin (Y)과 Trypsin (T)에서 각각 감소되었다. T%가 미검출(0%)된 서열은 Trypsin (T) 처리군의 S362-K365가 유일했다. Cross-linking 분석을 통해 두 개의 protease 처리군에서 유의미하게 중복으로 감소된 L88-K92, S90-L101 및 N211-W222인 3개의 서열이 에피토프 사이트로 결정되었다.
[8-5] 결론
도 19 및 도 20에서 보는 바와 같이, 앞선 결과를 종합하여 에피토프를 예측하였다. 구체적으로, huTregL1-his (Ag)의 E62-L101, G452-K476 등 2개의 서열들이 CL-MS, XL-MS 분석 결과에서 일치하는 위치로 확인되었다. L62-L101 중에서 L88-K92 부분은 CL-MS 결과 2개의 프로테아제 처리군(Chymotrypsin, Asp-N/Lys-C)에서 labeling decrease (%)가 확인되고, XL-MS 분석에서도 2개의 프로테아제 처리군(Chymotrypsin, Trypsin)에서 유의미하게 감소되었다. S95-L101 부분의 경우, XL-MS에서 키모트립신 및 트립신에서 중복적으로 확인되는 에피토프였다. 또한, CL-MS의 결과에서 라벨링(%)이 50% 이상인 L88-L101 부분이 외부로 노출되어 있었다. 특히, L88-L101의 경우, 서열 내 아미노산 서열이 친수성 아미노산(Q89-S95)으로 연속적으로 구성되어 있었다.
또한, G452-K476의 경우 CL-MS 분석을 통해 확인한 결과 A472-F480 부분이 외부로 노출되어 있었고, 그 중 A472-K476 부분이 에피토프에 해당한다고 판단하였다. N211-W222의 경우, XL-MS에서는 에피토프 사이트로 선정되었으나, CL-MS 분석에서와 중복되지 않았으며, 나아가 해당 서열의 부분의 labeling (%)이 50% 이하로 구조상 내부에 위치하여 에피토프에서 제외하였다.
[실시예 9] Lrig-1에 특이적으로 결합하는 결합 분자의 진단 효과 확인
[9-1] 골 질환의 진단 효과 확인
[9-1-1] 조골세포 (osteoblast)에서의 TregL1 발현 확인
섬유아세포 (fibroblast)를 조골세포 (osteoblast)로 분화시키기 위하여 조골세포의 전구세포인 MC3T3-E1 세포주를 준비하고 MC3T3-E1 배양 배지인 αMEM (1% P/S, 10% FBS)에 덱사메타손 (Dexamethasone) 10uM 및 조골세포의 분화에 영향을 미치는 물질로 알려진 아스코르브산 (Ascorbic acid) 5mM을 포함하여 10일간 배양하였다. 10일 이후에는 αMEM (1% P/S, 10% FBS)에 덱사메타손 (Dexamethasone) 10uM, 아스코르브산 (Ascorbic acid) 5mM 및 β-glycerophosphate 200mM 하에서 배양을 진행하였다.
이후, PE-conjugated αTregL1 항체를 각각 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10㎕ 만큼, L1-Fc는 1차로 L1-Fc, 2차로 αMs IgG-PE를 각각 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10㎍ 만큼 투여하여 배양 후 13일, 19일에 각각 유세포 분석을 진행하였다.
그 결과, 도 21에서 볼 수 있는 것과 같이 배양 후 13일 보다 배양 후 19일에 TregL1-Fc로 염색이 더 많이 진행되었는 바, TregL1 ligand가 더 많이 발현된다는 것을 발견할 수 있었다. 그러므로 골분화 세포에 TregL1의 ligand가 발현되어 있음을 알 수 있으며, 이는 앞서 제조예 1 내지 8에서 생산한 TregL1에 특이적으로 결합하는 결합분자를 통하여 골 질환을 진단할 수 있음을 시사한다.
[9-1-2] 파골세포 (osteoclast)에서의 TregL1 발현 확인
대식세포 (macrophage)를 파골세포 (osteoclast)로 분화시키기 위하여 파골세포의 전구세포인 RAW264.7 세포주를 준비하고 RAW264.7 배양 배지인 DMEM (1% P/S, 5% FBS)에 RANKL 50ng/ml을 포함하여 배양하였다.
이후, PE-conjugated αTregL1 항체를 각각 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5㎕ 만큼, L1-Fc는 1차로 L1-Fc, 2차로 αMs IgG-PE를 각각 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5㎍ 만큼 투여하여 배양 후 7일에 각각 유세포 분석을 진행하였다.
그 결과, 도 22에서 볼 수 있는 것과 같이 TregL1-Fc로 염색이 많이 진행되었는 바, TregL1 ligand가 많이 발현된다는 것을 발견할 수 있었다. 그러므로 골분화 세포에 TregL1의 ligand가 발현되어 있음을 알 수 있으며, 이는 앞서 제조예 1 내지 8에서 생산한 TregL1 에 특이적으로 결합하는 결합분자를 통하여 골 질환을 진단할 수 있음을 시사한다.
[9-1-3] 결론
도 21 및 22에서 볼 수 있는 것과 같이 TregL1-Fc로 염색이 많이 진행되었는 바, TregL1 ligand가 많이 발현된다는 것을 발견할 수 있었다. 그러므로 골분화 세포에 TregL1의 ligand가 발현되어 있음을 알 수 있으며, 이는 앞서 제조예 1 내지 8에서 생산한 TregL1에 특이적으로 결합하는 항체 등을 통하여 골 질환을 진단할 수 있음을 시사한다.
이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (15)

  1. Lrig-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 골 질환의 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 Lrig-1 단백질은 조골세포 (osteoblast) 또는 파골세포 (osteoclast)의 표면에 존재하는 것인, 진단용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 Lrig-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함하는, 진단용 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 Lrig-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 Lrig-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편인, 진단용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원 결합 단편은, 서열번호 35 내지 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인, 진단용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 항체는 키메라 항체, 인간화 항체(humanized antibody), 이가(bivalent), 양특이성 분자, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody), 항체 모방체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 또는 이의 단편인, 진단용 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 골 질환은 골절, 골다공증, 치주염, 파제트병, 골연화증, 골감소증, 골위축 또는 무혈성대퇴골괴사, 골결손, 골절 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증성 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환, 부정교합, 골 유합장애, 가관절증, 골 괴사, 골종양 및 골암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 진단용 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항의 조성물을 포함하는 골 질환 진단용 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 골 질환은 골절, 골다공증, 치주염, 파제트병, 골연화증, 골감소증, 골위축 또는 무혈성대퇴골괴사, 골결손, 골절 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증성 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환, 부정교합, 골 유합장애, 가관절증, 골 괴사, 골종양 및 골암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 진단용 키트.
  10. 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 Lrig-1 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 골 질환을 진단하기 위한 정보 제공 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 Lrig-1 단백질은 조골세포 (osteoblast) 또는 파골세포 (osteoclast)의 표면에 존재하는 것인, 정보 제공 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 생물학적 시료에서 측정된 Lrig-1 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 높거나 낮을 경우, 상기 목적하는 개체에게 골 질환이 있는 것으로 예측하는 것인, 정보 제공 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 골 질환은 골절, 골다공증, 치주염, 파제트병, 골연화증, 골감소증, 골위축 또는 무혈성대퇴골괴사, 골결손, 골절 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증성 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환, 부정교합, 골 유합장애, 가관절증, 골 괴사, 골종양 및 골암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 정보 제공 방법.
  14. (a) 목적하는 개체로부터 얻어진 생물학적 시료에 대하여 Lrig-1의 발현 수준을 측정하는 측정부; 및
    (b) 상기 측정부에서 측정된 Lrig-1의 발현 수준으로부터 상기 목적하는 개체의 골 질환의 발병 또는 발병 가능성 여부를 출력하는 검출부;를 포함하는 골 질환의 진단 기기.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 골 질환은 골절, 골다공증, 치주염, 파제트병, 골연화증, 골감소증, 골위축 또는 무혈성대퇴골괴사, 골결손, 골절 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증성 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환, 부정교합, 골 유합장애, 가관절증, 골 괴사, 골종양 및 골암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 진단 기기.
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