CN117729938A - 用于使用利用抗muc16×cd3多特异性抗体和vegf抑制剂的组合疗法治疗妇科癌症的方法 - Google Patents

Abstract

本发明技术提供了用于使用利用抗MUC16×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和VEGF抑制剂的组合疗法治疗妇科癌症的方法，所述免疫球蛋白相关组合物与成熟MUC16的C末端具114个氨基酸的残基(例如，MUC16^c114)和T细胞特异性结合。还提供了用于实践所述方法的试剂盒。

Description

用于使用利用抗MUC16×CD3多特异性抗体和VEGF抑制剂的组 合疗法治疗妇科癌症的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年3月18日提交的美国临时专利申请第63/162,822号的权益和优先权，所述美国临时专利申请的内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明技术涉及用于使用抗MUC16×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和VEGF抑制剂治疗妇科癌症的方法，所述免疫球蛋白相关组合物与成熟MUC16的C末端具114个氨基酸的残基(例如，MUC16^c114)和T细胞特异性结合。还提供了用于实践所述方法的试剂盒。

政府支持声明

本发明是在由美国国立卫生研究院(NIH)授予的授权号CA190174下由政府支持进行的。政府享有本发明中的某些权利。

背景技术

以下对本发明技术的背景的描述仅帮助理解本发明技术而提供，并且不承认描述或构成本发明技术的现有技术。

粘蛋白是细胞稳态和保护上皮表面的重要生物分子。如卵巢癌等癌症中的粘蛋白表达的变化可用作诊断、预后和治疗的生物标志物(Singh AP等人,《柳叶刀肿瘤学(LancetOncol)》2008；9(11):1076-85)。MUC16是在大多数卵巢癌细胞上过度表达的粘蛋白。由于MUC16抗原在其它情况下仅在子宫、子宫内膜、输卵管、卵巢以及腹腔和胸腔的浆膜的正常组织中以低水平表达，因此MUC16是基于免疫的疗法，包含妇科癌症的靶向和治疗的潜在有吸引力的靶点。

MUC16是高度糖基化的粘蛋白，由在切割位点切割并释放的大细胞外结构域区(CA-125)、位于切割位点附近的保留胞外结构域区(MUC16^ecto)、跨膜结构域和具有潜在磷酸化位点的胞质尾组成(图1(a))。如本文所使用的，MUC16^c114是指成熟MUC16的C末端具114个氨基酸的残基(例如，MUC16^c114)并且包括MUC16^ecto、跨膜结构域和胞质尾。释放的细胞外结构域(CA-125)含有156个氨基酸的16-20个串联重复序列，每个串联重复序列具有许多潜在的糖基化位点(O'Brien TJ等人,《肿瘤生物学(Tumor Biol)》22(6):348-66(2001))。因为MUC16的细胞外结构域的显著部分被切割和分泌(即，CA-125)，所以MUC16的该部分作为卵巢癌上的靶抗原的用途受到限制。许多报告的MUC16单克隆抗体与存在于糖蛋白的大分泌CA-125部分上的表位结合，而不与保留的MUC16胞外结构域结合(Bellone S《美国妇产科杂志(Am J Obstet Gynecol)》200(1):75el-10(2009),Berek JS.《生物治疗专家意见(Expert Opin Biol Ther.)》4(7):1159-65(2004)；O'Brien TJ等人,《国际生物标志物杂志(Int J Biol Markers)》13(4):188-95(1998))。

因此，迫切需要有效靶向如卵巢癌等MUC16(+)妇科癌症的治疗方法。

发明内容

一方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的妇科癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的抗MUC16×CD3多特异性(例如，双特异性)抗体或其抗原结合片段和有效量的VEGF抑制剂，其中所述抗MUC16×CD3多特异性(例如，双特异性)抗体或抗原结合片段包括第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点与包括MUC16胞外结构域序列的MUC16多肽特异性结合，其中所述MUC16胞外结构域序列由SEQ ID NO:95组成。在一些实施例中，所述MUC16多肽具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。所述抗MUC16×CD3多特异性(例如，双特异性)抗原结合片段可以是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)。

另外地或可替代地，在本文所公开的方法的一些实施例中，所述第一抗原结合位点包括重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)和轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，其中(a)所述V_H包括SEQ ID NO:4的V_H-CDR1序列、SEQ ID NO:5的V_H-CDR2序列和SEQ ID NO:6的V_H-CDR3序列；并且所述V_L包括SEQ ID NO:7的V_L-CDR1序列、SEQ ID NO:8的V_L-CDR2序列和SEQ ID NO:9的V_L-CDR3序列；或者(b)所述V_H包括SEQ ID NO:10的V_H-CDR1序列、SEQ ID NO:11的V_H-CDR2序列和SEQ ID NO:12的V_H-CDR3序列；并且所述V_L包括SEQ ID NO:13的V_L-CDR1序列、SEQ ID NO:14的V_L-CDR2序列和SEQ ID NO:15的V_L-CDR3序列；或者(c)所述V_H包括SEQ IDNO:16的V_H-CDR1序列、SEQ ID NO:17的V_H-CDR2序列和SEQ ID NO:18的V_H-CDR3序列；并且所述V_L包括SEQ ID NO:19的V_L-CDR1序列、SEQ ID NO:20的V_L-CDR2序列和SEQ ID NO:21的V_L-CDR3序列；或者(d)所述V_H包括SEQ ID NO:22的V_H-CDR1序列、SEQ ID NO:23的V_H-CDR2序列和SEQ ID NO:24的V_H-CDR3序列；并且所述V_L包括SEQ ID NO:25的V_L-CDR1序列、SEQ ID NO:26的V_L-CDR2序列和SEQ ID NO:27的V_L-CDR3序列。

另外地或可替代地，在本文所公开的方法的某些实施例中，所述第一抗原结合位点包括：(a)重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的V_H-CDR1序列、V_H-CDR2序列和V_H-CDR3序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的V_L-CDR1序列、V_L-CDR2序列和V_L-CDR3序列；或者(b)重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的V_H-CDR1序列、V_H-CDR2序列和V_H-CDR3序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35的V_L-CDR1序列、V_L-CDR2序列和V_L-CDR3序列；或者(c)重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ ID NO:36的V_H-CDR1序列、V_H-CDR2序列和V_H-CDR3序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:37的V_L-CDR1序列、V_L-CDR2序列和V_L-CDR3序列；或者(d)重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ ID NO:38的V_H-CDR1序列、V_H-CDR2序列和V_H-CDR3序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ IDNO:39的V_L-CDR1序列、V_L-CDR2序列和V_L-CDR3序列。

在本文所公开的方法的任何前述实施例中，所述第一抗原结合位点包括：(a)重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸序列；或者(b)重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35的氨基酸序列；或者(c)重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:37的氨基酸序列；或者(d)重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列。

另外地或可替代地，在本文所公开的方法的一些实施例中，所述抗MUC16×CD3多特异性(例如，双特异性)抗体或抗原结合片段进一步包括选自由以下组成的组的同种型的Fc结构域：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE。在本文所公开的方法的一些实施例中，所述抗MUC16×CD3多特异性(例如，双特异性)抗体或抗原结合片段是人的或人源化的。另外地或可替代地，在本文所公开的方法的某些实施例中，所述抗MUC16×CD3多特异性(例如，双特异性)抗体或抗原结合片段是串联scFv、双功能抗体(Db)、单链双功能抗体(scDb)、双亲和力再靶向(DART)抗体、F(ab')2、双可变结构域(DVD)抗体、杵臼(KiH)抗体、对接锁定(DNL)抗体、化学交联抗体、异源多聚体抗体、单克隆抗体、全长抗体或异源缀合物抗体。

在本文所公开的方法的任何和所有实施例中，所述抗MUC16×CD3多特异性(例如，双特异性)抗体或抗原结合片段包括与T细胞特异性结合的第二抗原结合位点。在某些实施例，所述第二抗原结合位点包括：重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ ID NO:70的氨基酸序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:71的氨基酸序列。另外地或可替代地，在一些实施例中，所述第二抗原结合位点包括SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在其它实施例中，所述抗MUC16×CD3多特异性(例如，双特异性)抗体或抗原结合片段包括SEQ ID NO:73-92中的任一者的氨基酸序列。

另外地或可替代地，在本文所公开的方法的一些实施例中，所述VEGF抑制剂是小分子抑制剂、siRNA、反义寡核苷酸、shRNA、sgRNA、核酶或抗体或其抗原结合片段。VEGF抑制剂的实例包含单不限于贝伐单抗(bevacizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、凡努西单抗(vanucizumab)、布洛赛珠单抗(brolucizumab)、hPV19、IBI305、VEGF Trap、利尼法尼(linifanib)、AEE-788、阿昔替尼(axitinib)(AG-13736)、AG-028262、血管抑制素(Angiostatin)、康普瑞汀A4(combretastatin A4)、西地尼布(cediranib)、索拉非尼(sorafenib)、沙利度胺(Thalidomide)、瓦他拉尼(vatalanib)、DC-101、SNS-032、苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate)、司马沙尼(semaxanib)、CEP-7055、多韦替尼(dovitinib)、CP-547632、CP-564959、乐伐替尼(lenvatinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、GW-654652、替伏扎尼(tivozanib)、苯甲酰星形孢菌素(benzoylstaurosporine)、奥兰替尼(orantinib)、特西伐替尼(tesevatinib)、XL-999、福林替尼(foretinib)、凡德他尼(vandetanib)和ZK-304709。在一些实施例中，所述妇科癌症是卵巢癌、输卵管癌、子宫癌或子宫内膜癌。

另外地或可替代地，在一些实施例中，在施用VEGF抑制剂和抗MUC16×CD3多特异性(例如，双特异性)抗体或抗原结合片段之后，受试者表现出肿瘤生长减少、肿瘤增殖减少、肿瘤负荷降低或存活率增加。另外地或可替代地，在本文所公开的组合疗法方法的一些实施例中，相对于用VEGF抑制剂单一疗法或用抗MUC16×CD3多特异性(例如，双特异性)抗体或抗原结合片段的单一疗法观察到的，应答时间和/或应答持续时间得到改善。

在本文所公开的方法的任何和所有实施例中，所述VEGF抑制剂和所述抗MUC16×CD3多特异性(例如，双特异性)抗体或抗原结合片段是单独、依序或同时施用的。抗MUC16×CD3多特异性(例如，双特异性)抗体或抗原结合片段和/或VEGF抑制剂可以口服、鼻内、肠胃外、静脉内、肌内、腹膜内、肌内、动脉内、皮下、鞘内、囊内、眶内、肿瘤内、皮内、经气管、脑室内、局部或通过植入的储库施用。

附图说明

图1(a)-1(d)描述了人MUC16^ecto特异性抗体的筛选和鉴定。图1(a)：用作抗体靶标的MUC16抗原和c114保留胞外结构域(MUC16^ecto)的示意性表示。图1(b)：通过FACS的噬菌体展示结合分析。只选择与MUC16^ecto(蓝色)而非突变型MUC16(橙色)结合的靶标进行测序和进一步开发。示出了阴性对照(左上)和非特异性结合(右上)的实例。图1(c)：通过SDS-PAGE验证CD3ε-缀合的MUC16^ecto特异性双特异性T细胞接合性双功能抗体(BiTED)的纯度。预期条带大小为50-55KDa。图1(d)：进行动力学分析以确定MUC16^ecto-BiTED与高度保守的55merMUC16胞外结构域的解离常数。

图2(a)-2(c)示出了与MUC16胞外结构域结合的MUC16^ecto-BITED的验证和可溶性CA-125的潜在干扰的评估。

图2(a)：将BTM蛋白与MUC16^ecto-BiTED一起进行免疫沉淀(IP)(第4行)。对照条件；单独的蛋白G琼脂珠粒(第1行)，含有BTM蛋白(第2行)或含有MUC16^ecto-BiTED(第3行)的蛋白G珠粒没有示出表示MUC16^ecto-BiTED的预期的55Kda条带。在流通中检测到未结合的MUC16^ecto-BiTED而非BTM蛋白(第5-7行)。图2(b)：ELISA示出了在存在BTM的情况下浓度增加的MUC16^ecto-BiTED的结合。图2(c)：ELISA示出了在存在浓度增加的重组CA-125的情况下稀释剂和MUC16^ecto-BiTED的结合。来自图2(b)和图2(c)的结果从3个独立的实验汇集。数据绘制为平均值±SEM。

图3(a)-3(f)表明，MUC16^ecto-BITED在体外表现出针对Muc16阳性卵巢癌细胞系组的细胞毒性。

图3(a)：通过SKOV3、OVCAR3和激活的T细胞与指示的BiTED的1:1E:T共培养来评估细胞毒性。图3(b)：以指示的E:T比率共培养MUC16^ecto-BITED和激活的T细胞以及SKOV3-MUC16^ecto；图3(c)：以指示的E:T比率共培养MUC16^ecto-BITED和激活的T细胞以及OVCAR3，以及图3(d)：以指示的E:T比率共培养MUC16^ecto-BITED和激活的T细胞以及SKOV3肿瘤细胞。数据绘制为平均值±SEM。示出的数据是从3个独立实验汇集的结果。每个实验使用至少4个独立的供体。使用非配对双侧T测试进行统计。图3(e)：颗粒酶B阳性CD4和CD8 T细胞在存在或不存在MUC16^ecto-BITED的情况下与SKOV3-MUC16^ecto细胞共培养的百分比。图3(f)：从单独的SKOV3-MUC16^ecto细胞获得的上清液的体外细胞因子分析，以及SKOV3-MUC16^ecto细胞在存在或不存在MUC16^ecto-BITED的情况下与T细胞的共培养。对于图3(e)和图3(f)，示出的数据是从至少4个独立供体的5个独立实验汇集的结果。数据绘制为平均值±SEM。^*p<0.05。

图4(a)-4(c)证明了MUC16^ecto特异性BiTED延迟体内卵巢癌进展。

图4(a)：对雌性NSG小鼠i.p.接种SKOV3-MUC16^ecto-GFP-LUC肿瘤细胞，并且随后用单独的T细胞或T细胞和MUC16^ecto-BiTED处理，并随时间对肿瘤负荷进行成像。图4(b)：来自图4(a)的生物发光的定量。图4(c)：用单独的T细胞或T细胞和MUC16^ecto-BiTED处理雌性NSG荷瘤小鼠。在处理之后7天评估血清细胞因子。示出的数据是从至少3个独立供体的2个独立实验汇集的结果。数据绘制为平均值±SEM。*p<0.01，**p<0.05。

图5(a)-5(c)表明，作为单一疗法以及与PD-1免疫检查点阻断组合，MUC16^ecto-BiTED提高了荷瘤小鼠的总存活率。

图5(a)：对NSG荷瘤小鼠i.p.接种SKOV3-MUC16^ecto肿瘤细胞，并用单独的T细胞或T细胞和MUC16^ecto-BiTED处理。示出的数据是从至少4个独立供体的3个独立实验汇集的结果。数据绘制为平均值±SEM。**p<0.05。图5(b)：人T细胞的免疫分型来自用BiTED处理的雌性NSG SKOV3-MUC16^ecto荷瘤小鼠的脾脏，所述小鼠死于疾病(非应答者)，或者来自那些活得更长的小鼠(应答者)。**p<0.05。图5(c)：用单独的T细胞和αPD-1、T细胞和BiTED或T细胞、αPD-1和BiTED处理SKOV3-MUC16^ecto荷瘤小鼠。示出的数据是从至少4个独立供体的3个独立实验汇集的结果。数据绘制为平均值±SEM。*p<0.05T细胞+αPD-1对T细胞+BiTED，**p<0.05T细胞+BiTED对T细胞+BiTED+αPD-1。

图6(a)-6(f)表明，MUC16^ecto-BiTED与VEGF抑制组合显著改善了腹水和腹膜肿瘤细胞以及总存活率。

图6(a)：对雌性NSG小鼠i.p.接种OVCAR3肿瘤细胞，并用单独的T细胞或T细胞和MUC16^ecto-BiTED处理。示出的数据是从至少4个独立白细胞供体的2个独立实验汇集的结果。数据绘制为平均值±SEM。**p<0.05。图6(b)：通过流式细胞术确定的OVCAR3细胞中的VEGF的表达水平。图6(c)：评估从T细胞和OVCAR3收集的上清液中的VEGF。T细胞对OVCAR3(*p<0.05)。图6(d)：用T细胞+αVEGF、T细胞+BiTED或T细胞+BiTED+αVEGF处理的OVCAR3荷瘤小鼠。数据绘制为平均值±SEM。T细胞+αVEGF对T细胞+BiTED(*p<0.005)。T细胞+BiTED对T细胞+BiTED+αVEGF(**p<0.005)。使用对数秩(Mantel-Cox)测试对图6(a)和图6(d)进行统计分析。图6(e)：从用单独的T细胞、T细胞+αPD-1、T细胞+αVEGF、T细胞+BiTED、T细胞+αPD-1+BiTED或T细胞+αVEGF+BiTED处理的OVCAR3荷瘤小鼠收集的腹水的体积。示出的数据是从至少2个独立白细胞供体的2个独立实验汇集的结果。数据绘制为平均值±SEM。**p<0.05。图6(f)：与和图6(e)中的相同的条件相对应的腹膜肿瘤细胞的数量。数据绘制为平均值±SEM。**p<0.05。

具体实施方式

应了解，本发明技术的某些方面、模式、实施例、变型、和特征在以各种水平的细节下文描述，以便提供本发明技术的基本理解。应理解，本公开不限于当然可以变化的特定用途、方法、试剂、化合物、组合物或生物系统。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不旨在是限制性的。

在实践本发明的方法时，使用了分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组DNA中的许多常规技术。参见例如Sambrook和Russell编辑(2001)《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第3版；丛书Ausubel等人编辑(2007)《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》；丛书《酶学方法(Methods in Enzymology)》(纽约学术出版社公司(Academic Press,Inc.,N.Y.))；MacPherson等人(1991)《PCR 1：实用方法(PCR 1:A Practical Approach)》(牛津大学出版社的IRL出版社(IRL Press at Oxford University Press))；MacPherson等人(1995)《PCR 2：实用方法(PCR 2:A Practical Approach)》；Harlow和Lane编辑(1999)《抗体实验室手册(Antibodies,A Laboratory Manual)》；Freshney(2005)《动物细胞培养：基础技术手册(Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique)》,第5版；Gait编辑(1984)《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》；美国专利第4,683,195号；Hames和Higgins编辑(1984)《核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)》；Anderson(1999)《核酸杂交》；Hames和Higgins编辑(1984)《转录和翻译(Transcription and Translation)》；《固定化细胞和酶(Immobilized Cells and Enzymes)》(IRL出版社(1986))；Perbal(1984)《分子克隆实用性指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)》；Miller和Calos编辑(1987)《哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory))；Makrides编辑(2003)《基因转移和在哺乳动物细胞中的表达(Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells)》；Mayer和Walker编辑(1987)《细胞和分子生物学中的免疫化学方法(ImmunochemicalMethods in Cell and Molecular Biology)》(伦敦学术出版社(Academic Press,London))；以及Herzenberg等人编辑(1996)《实验免疫学韦尔手册(Weir's Handbook ofExperimental Immunology)》。用于检测和测量多肽基因表达产物水平(即，基因翻译水平)的方法在本领域是众所周知的，并且包含使用如抗体检测和定量技术等多肽检测方法。(还参见Strachan和Read,《人类分子遗传学(Human Molecular Genetics)》,第二版(纽约约翰·威利父子公司(John Wiley and Sons,Inc.,NY),1999))。

MUC16蛋白是粘蛋白家族中高度糖基化的成员，具有正常的苗勒管氏组织表达，并在高级别浆液性上皮性卵巢癌细胞(HGSOC)中过度表达。MUC16在翻译后被切割成串联重复区的可溶性抗原片段(检测为CA-125)和称为具有独立的促致癌基因性质的MUC16^ecto的保留的细胞外片段(O'Brien TJ等人,《肿瘤生物学(Tumour Biol.)》2001；22(6):348-66)。大多数基于抗体的抗MUC16临床疗法靶向MUC16的脱落部分(Bellone S等人,《美国妇产科杂志》2009；200(1):75e1-10)，这可能限制了其作为靶向免疫疗法的特异性。

本公开证明了利用抗MUC16×CD3多特异性(例如双特异性)免疫球蛋白相关组合物和VEGF抑制剂的组合疗法产生对妇科癌症的协同治疗，所述免疫球蛋白相关组合物与成熟MUC16的C末端具114个氨基酸的残基(例如，MUC16^c114)和T细胞特异性结合。不希望受理论的束缚，据信所观察到的协同抗肿瘤应答可能至少部分归因于T细胞上如PD-1等耗竭标志物的表达的减少。参见de Almeida PE等人,《癌症免疫学研究(Cancer Immunol Res)》8:806-18(2020)。用本发明技术的组合疗法方法处理的动物的存活率提高的另一可能机制可能是由于腹水减少(这有助于免疫抑制肿瘤微环境(参见Yeku OO等人,《科学报告(SciRep)》7:10541(2017))，以及T细胞功能障碍减少，导致T细胞的肿瘤减灭术增加。预计随着腹膜肿瘤负荷的减少，腹水的量进一步减少，使得T细胞功能和妇科癌症的治疗进一步改善。

定义

如本说明书中所用的某些术语的定义提供在下文中。除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语通常具有与此本发明技术所属领域的一般技术人员通常所了解相同的含义。

如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非内容另外明确指出，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包含复数指代物。例如，提及“细胞”包含两种或更多种细胞的组合等等。通常，本文所使用的命名法以及下文所描述的细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学以及核酸化学与杂交中的实验室程序是本领域中众所周知并且通常采用的那些。

如本文所使用的，提及数字的术语“约”是指通常包含在所述数字的任一方向上(大于或小于)在1％、5％或10％范围内的数字，除非另有说明或以其它方式从上下文中显而易见(除非此类数字小于可能值的0％或超过可能值的100％)。

如本文中所使用的，向受试者“施用”药剂或药物包含向受试者引入或递送化合物以发挥其预期功能的任何途径。可以通过任何合适的途径来进行施用，包含但不限于口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌内、腹膜内或皮下)、直肠、鞘内、瘤内或局部施用。施用包含自我施用和由另一个人施用。

术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒半胱氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构的药剂，即与氢、羧基、氨基和R基结合的α碳，如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物具有经过修饰的R基(如正亮氨酸)或经过修饰的肽主链，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。在一些实施例中，形成多肽的氨基酸为D型。在一些实施例中，形成多肽的氨基酸为L型。在一些实施例中，形成多肽的第一多个氨基酸为D型，并且第二多个氨基酸为L型。

氨基酸在本文通过其通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来表示。同样，核苷酸通过其普遍接受的单字母代码来表示。

如本文所使用的，术语“抗体”统称为免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，包含例如且不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、其组合以及在任何脊椎动物中，例如在如人、山羊、兔子和小鼠等哺乳动物以及非哺乳动物物种中的免疫应答期间产生的类似分子，如鲨鱼免疫球蛋白。如本文所使用的，“抗体”(包含完整的免疫球蛋白)和“抗原结合片段”与所关注的分子(或一组高度类似的所关注的分子)特异性结合，以基本上排除与其它分子的结合(例如，对所关注的分子的结合常数比对生物样品中的其它分子的结合常数大至少10³M^-1、大至少10⁴M^-1或大至少10⁵M^-1的抗体和抗体片段)。术语“抗体”还包含天然抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、Fab、Fab'、单链V区片段(scFv)、单结构域抗体(例如，纳米抗体和单结构域骆驼抗体)、VNAR片段、双特异性T细胞接合子抗体、微型抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)和抗独特型(anti-id)抗体、内抗体、融合多肽、非常规抗体和上述任何抗体的抗原结合片段。还参见《皮尔斯目录与手册(PierceCatalog and Handbook)》,1994-1995(伊利诺伊州罗克福德市皮尔斯化学公司(PierceChemical Co.,Rockford,Ill.))；Kuby,J.,《免疫学(Immunology)》,第3版,纽约W.H.纽约弗里曼公司(W.H.Freeman&Co.,New York),1997。

更具体地，抗体是指包括特异性识别抗原的表位并与其结合的至少一个轻链免疫球蛋白可变区或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体。抗体由重链和轻链构成，所述重链和所述轻链中的每一个具有可变区，所述可变区被称为可变重(V_H)区和可变轻(V_L)区。V_H区和V_L区一起负责与由抗体识别的抗原结合。通常，免疫球蛋白具有由二硫键互连的重(H)链和轻(L)链。有两种类型的轻链，λ(lambda)和κ(κ)。有五个决定抗体分子的功能活性的主要的重链类别(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条重链和轻链含有恒定区和可变区(所述区也被称为“结构域”)。总而言之，重链可变区和轻链可变区与抗原特异性结合。轻链可变区和重链可变区含有被三个也被称为“互补决定区”或“CDR”的高变区中断的“框架”区。已经定义框架区和CDR的范围(参见Kabat等人,《免疫学关注的蛋白的序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest)》,美国卫生和人类服务部(U.S.Department ofHealth and Human Services),1991，所述文献通过引用并入本文)。Kabat数据库现在在线维护。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内相对保守。抗体的框架区，即组成轻链和重链的组合框架区，主要采用β-折叠构象，并且CDR形成连接β折叠结构并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分的环。因此，框架区用于形成支架，所述支架通过链间非共价相互作用将CDR定位在正确的朝向上。

CDR主要负责与抗原的表位结合。每个链的CDR通常被称为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始按顺序编号，并且通常还由特定CDR所在的链鉴别。因此，V_H CDR3位于发现其的抗体的重链的可变结构域中，而V_L CDR1是来自发现其的抗体的轻链的可变结构域的CDR1。与靶蛋白(例如，MUC16)结合的抗体将具有特定的V_H区和V_L区序列，并且从而具有特定的CDR序列。具有不同特异性的抗体(即针对不同抗原具有不同组合位点)具有不同的CDR。尽管正是CDR因抗体的不同而有所不同，但是CDR内仅有限数量的氨基酸位置直接涉及抗原结合。CDR内的这些位置被称为特异性决定残基(SDR)。如本文所使用的，“免疫球蛋白相关组合物”是指抗体(包含单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、多特异性抗体、双特异性抗体等)以及抗体片段。抗体或其抗原结合片段与抗原特异性结合。

如本文所使用的，术语“抗体相关多肽”是指包含单链抗体在内的抗原结合抗体片段，所述抗原结合抗体片段可以包括单独的或与以下多肽元件的全部或部分组合的可变区：抗体分子的铰链区、CH₁、CH₂和CH₃结构域。所述技术中还包含可变区和铰链区、CH₁、CH₂和CH₃结构域的任何组合。可用于本发明方法的抗体相关分子，例如但不限于Fab、Fab'和F(ab')₂、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)和包括V_L或V_H结构域的片段。实例包含：(i)Fab片段，即由V_L、V_H、C_L和CH₁结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')₂片段，即包括在铰链区处由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段(“F(ab')₂”片段可以被分成两个单独的Fab'片段。)；(iii)由V_H和CH₁结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段；(v)由V_H结构域组成的dAb片段(Ward等人,《自然(Nature)》341:544-546,1989)；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。因此，“抗体片段”或“抗原结合片段”可以包括全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段或抗原结合片段的实例包含：Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双功能抗体(dscFv)；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

如本文所使用的“双特异性抗体”或“BsAb”是指可以同时与具有不同结构的两个靶标结合的抗体例如，两种不同的靶抗原、同一靶抗原上的两个不同表位、或半抗原和靶抗原或靶抗原上的表位。多种不同的双特异性抗体结构是本领域众所周知的。在一些实施例中，双特异性抗体中的每个抗原结合部分包含V_H和/或V_L区；在一些此类实施例中，V_H和/或V_L区是可见于特定单克隆抗体中的那些区。在一些实施例中，双特异性抗体含有两个抗原结合部分，每个抗原结合部分包含来自不同单克隆抗体的V_H和/或V_L区。在一些实施例中，双特异性抗体包括两个抗原结合部分，其中两个抗原结合部分之一包含抗体片段(例如，Fab、F(ab')、F(ab')₂、Fd、Fv、dAB、scFv等)，所述抗体片段具有含有来自第一单克隆抗体的CDR的V_H区和/或V_L区，并且其它抗原结合部分包含抗体片段(例如，Fab、F(ab')、F(ab')₂、Fd、Fv、dAB、scFv等)，所述抗体片段具有含有来自第二单克隆抗体的CDR的V_H区和/或V_L区。在一些实施例中，双特异性抗体含有两个抗原结合部分，其中两个抗原结合部分之一包含免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子具有含有来自第一单克隆抗体的CDR的V_H区和/或V_L区，并且其它抗原结合部分包含抗体片段(例如，Fab、F(ab')、F(ab')₂、Fd、Fv、dAB、scFv等)，所述抗体片段具有含有来自第二单克隆抗体的CDR的V_H区和/或V_L区。

如本文所使用的，“抗原”是指抗体(或其抗原结合片段)可以选择性结合的分子。靶抗原可以是蛋白质、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在或合成的化合物。在一些实施例中，靶抗原可以是多肽。还可以将抗原施用于动物以在动物中产生免疫应答。

术语“抗原结合片段”是指整个免疫球蛋白结构的片段，所述片段具有负责与抗原结合的多肽的一部分。可用于本发明技术的抗原结合片段的实例包含scFv、(scFv)₂、scFvFc、Fab、Fab'和F(ab')₂，但不限于此。使用本领域技术人员已知的常规技术获得任何上述抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式针对结合特异性和中和活性对片段进行筛选。

如本文所使用的，“结合亲和力”意指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原或抗原肽)之间的总非共价相互作用的强度。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(K_D)表示。亲和力可以通过本领域中已知的标准方法来测量，包含本文所描述的那些。低亲和力复合物含有通常倾向于容易从抗原解离的抗体，而高亲和力复合物含有通常倾向于保持与抗原结合更长时间的抗体。

不受理论的束缚，亲和力取决于抗体组合位点与抗原决定簇之间的立体化学配合的紧密程度、取决于其之间接触面积的大小以及取决于带电基团和疏水基团的分布。亲和力还包含术语“亲合力”，其是指在可逆复合物(例如，单价或多价)形成之后的抗原-抗体键的强度。用于计算抗体对抗原的亲和力的方法是本领域已知的，包括使用结合实验来计算亲和力。功能测定(例如，流式细胞术测定)中的抗体活性也反映了抗体亲和力。抗体和亲和力可以使用功能测定(例如，流式细胞术测定)进行表型表征和比较。

如本文所使用的，术语“CDR移植”意指通过来自具有期望抗原特异性的“供体”抗体的CDR“移植物”替代“受体”抗体的至少一个CDR。如本文所使用的，术语“CDR移植的抗体”意指其中“受体”抗体的至少一个CDR被来自具有期望抗原特异性的“供体”抗体的CDR“移植物”替代的抗体。

如本文所使用的，术语“缀合”是指通过本领域技术人员已知的任何方法将两个分子缔合。合适的缔合类型包含化学键和物理键。化学键包含例如共价键和配位键。物理键包含例如氢键、偶极相互作用、范德华力、静电相互作用、疏水相互作用以及芳香族堆积。

如本文所使用的，术语“共有FR”意指共有免疫球蛋白序列中的框架(FR)抗体区。抗体的FR区不接触抗原。

如本文所使用的，术语“恒定区”或“恒定结构域”可互换并且在本领域中具有其常见含义。恒定区是抗体部分，例如，轻链和/或重链的羧基末端部分，所述抗体部分不直接涉及抗体与抗原的结合，但是可以表现出各种效应子功能，如与Fc受体的相互作用。相对于免疫球蛋白可变结构域，免疫球蛋白分子的恒定区通常具有更保守的氨基酸序列。

如本文所使用的，“对照”是出于比较目的在实验中使用的替代样品。对照可以是“阳性的”或“阴性的”。例如，当实验的目的是确定治疗剂对特定类型疾病的治疗功效的相关性时，通常采用阳性对照(表现出期望的治疗效果的已知化合物或组合物)和阴性对照(未接受疗法或接受安慰剂的受试者或样品)。

如本文所使用的，术语“双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包括与同一条多肽链(V_H V_L)中的轻链可变结构域(V_L)连接的重链可变结构域(V_H)。通过使用太短以至于不允许在同一条链上的两个结构域之间配对的连接子，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点。双功能抗体更全面地描述于例如以下中：EP 404,097；WO 93/11161；以及Hollinger等人,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》,90:6444-6448(1993)。

如本文所使用的，术语“有效量”是指足以实现期望的治疗和/或预防效果的量，例如，使本文所描述的疾病或病状或与本文所述疾病或病状相关联的一种或多种体征或症状得到预防或减轻的量。在治疗或预防应用的上下文中，向受试者施用的组合物的量将根据组合物、疾病的程度、类型和严重性以及个体的特性，如一般健康状况、年龄、性别、体重和药物耐受性而变化。熟练的技术人员将能够根据这些和其它因素确定适当的剂量。组合物还可以与一种或多种另外的治疗化合物组合施用。在本文所描述的方法中，可以向具有本文所描述的疾病或病状的一种或多种体征或症状的受试者施用治疗组合物。如本文所使用的，组合物的“治疗有效量”是指改善或消除疾病或病状的生理作用的组合物水平。可以通过一次或多次施用来给出治疗有效量。

如本文所使用的，术语“效应子细胞”意指涉及与免疫应答的认知和激活阶段相反的免疫应答的效应子阶段的免疫细胞。示例性免疫细胞包含骨髓或淋巴来源的细胞，例如淋巴细胞(例如，B细胞和T细胞，包含溶细胞性T细胞(CTL))、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、多形核细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。效应子细胞表达特定的Fc受体并且执行特定的免疫功能。效应子细胞可以诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)例如，能够诱导ADCC的嗜中性粒细胞。例如，表达FcαR的单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞涉及特异性杀伤靶细胞并且将抗原呈递给免疫系统的其它组分或与呈递抗原的细胞结合。

如本文所使用的，术语“表位”意指能够与抗体特异性结合的蛋白决定簇。表位通常由如氨基酸或糖侧链等分子的化学活性表面基团组成，并且通常具有特异性三维结构特性以及特异性电荷特性。构象表位与非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在的情况下，与前者而非后者的结合丧失。在一些实施例中，MUC16蛋白的“表位”是与本发明技术的抗MUC16抗体特异性结合的蛋白的区(例如，MUC16^ecto)。在一些实施例中，所述表位是构象表位或非构象表位。为了筛选与表位结合的抗MUC16抗体，可以执行常规交叉阻断测定，如在《抗体实验室手册》,冷泉港实验室,Ed Harlow和David Lane(1988)中所描述的。此测定可以用于确定抗MUC16抗体是否与本发明技术的抗MUC16抗体结合相同的位点或表位。可替代地或另外地，表位作图可以通过本领域已知的方法执行。例如，可以如通过丙氨酸扫描对抗体序列进行诱变，以鉴定接触残基。在不同的方法中，与MUC16蛋白的不同区相对应的肽可以用于与所述测试抗体或具有经表征或已知的表位的测试抗体和抗体的竞争测定中。表位可以是例如多肽的连续氨基酸(线性或连续表位)，或者表位可以是例如来自一个或多个多肽的两个或更多个非连续区聚集在一起(构象、非线性、间断或非连续表位)。

如本文所使用的，术语“表达”是指将多核苷酸转录成mRNA的过程和/或将转录的mRNA后续被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸源自基因组DNA，则表达可以包含在真核细胞中剪接mRNA。可以通过测量细胞或组织样品中mRNA或蛋白质的量来确定基因的表达水平。一方面，可以将来自一个样品的基因的表达水平与来自对照样品或参照样品的那个基因的表达水平直接进行比较。另一方面，可以将来自一个样品的基因的表达水平与来自施用本文公开的组合物之后的相同样品的那个基因的表达水平直接进行比较。术语“表达”还指以下事件中的一或多个事件：(1)从细胞内的DNA序列(例如，通过转录)产生RNA模板；(2)在细胞内处理RNA转录物(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'端形成)；(3)在细胞内将RNA序列翻译成多肽或蛋白质；(4)在细胞内对多肽或蛋白质进行翻译后的修饰；(5)在细胞表面上呈递多肽或蛋白质；以及(6)从细胞中分泌或呈递或释放多肽或蛋白质。

如本文所使用的，术语“基因”意指含有关于RNA产物的调控的生物合成的所有信息的DNA区段，包含启动子、外显子、内含子以及控制表达的其它非翻译区。

如本文所使用的，术语“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较可以出于比较目的比对的每个序列中的位置来确定同源性。当比较序列中的位置被相同碱基或氨基酸占据时，则分子在所述位置处是同源的。序列之间的同源性程度是序列共享的匹配或同源位置的数量的函数。多核苷酸或多核苷酸区(或多肽或多肽区)与另一个序列具有一定百分比(例如，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”意味着，当比对时，在两个序列的比较中，所述百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。可以使用本领域已知的软件程序来确定该比对和百分比同源性或序列同一性。在一些实施例中，默认参数用于比对。一种比对程序是使用默认参数的BLAST。具体地，程序是使用以下默认参数的BLASTN和BLASTP：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序＝高评分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白质+SPupdate+PIR。这些程序的详细信息可以在国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)找到。生物学等效的多核苷酸是那些具有指定百分比同源性并编码具有相同或类似生物活性的多肽的多核苷酸。如果两个序列彼此共享低于40％同一性或低于25％同一性，则所述两个序列被视为“不相关”或“非同源”。

如本文所使用的，非人(例如，鼠类)抗体的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中受体的高变区残基被来自如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物等具有所期望的特异性、亲和力以及能力的非人物种(供体抗体)的高变区残基替代。在一些实施例中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被对应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包括在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能，如结合亲和力。通常，人源化抗体将包括至少一个并且通常两个可变结构域(例如，Fab、Fab'、F(ab')₂或Fv)中的基本上所有可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些环，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有FR序列的那些区，尽管FR区可以包含一个或多个改善结合亲和力的氨基酸取代。FR中这些氨基酸取代的数量通常在H链中不超过6个，并且在L链中不超过3个。人源化抗体任选地还可以包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。另外的细节参见Jones等人,《自然》,321:522-525(1986)；Verhoeyen等人,《自然》332:323-329(1988)和Presta,《结构生物学的当代观点(Curr.Op.Struct.Biol.》2:593-596(1992)。参见例如Ahmed和Cheung,《欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)》588(2):288-297(2014)。例如，针对给定抗原的鼠类抗体的人源化版本在其重链和轻链两者上具有：(1)人抗体的恒定区；(2)来自人抗体的可变结构域的框架区；以及(3)来自鼠类抗体的CDR。必要时，人框架区中的一个或多个残基可以被改变成鼠类抗体中的对应位置处的残基，以保持人源化抗体对抗原的结合亲和力。这种变化有时被称为“回复突变”。类似地，由于期望的原因，例如稳定性或对抗原的亲和力，可以使正向突变回复到鼠类序列。

如本文所使用的，术语“高变区”是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包括来自“互补性决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，V_L中的约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及V_H中的约31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat等人,《免疫学关注的蛋白的序列》,第5版马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院的公共卫生署(PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.)(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如，V_L中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及V_H中的26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917(1987))。

如本文所使用的，当在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中使用时，术语“相同”或“同一性”百分比是指当在比较窗口或指定区之上针对最大对应性进行比较和比对时，如使用利用以下所描述的默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动比对和视觉检查(例如，NCBI网站)测量的，相同的或具有指定百分比的氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列或相同的核苷酸(即，在指定区(例如，编码本文所描述的抗体的核苷酸序列或本文所描述的抗体的氨基酸序列)之上的约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)。此类序列然后被称为“基本上相同”。该术语还指或可以应用于测试序列的补体。所述术语还包含具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。在一些实施例中，同一性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸或长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区内。

如本文所使用的，术语“免疫特异性结合”、“免疫特异性识别”、“特异性结合”和“特异性识别”是抗体上下文中的类似术语并且是指通过抗原结合位点与抗原(例如，表位或免疫复合物)结合的抗体和其抗原结合片段，如本领域技术人员所理解的，并且不排除抗体或抗原结合片段与其它抗原的交叉反应性。

如本文所使用的，术语“完整抗体”或“完整免疫球蛋白”意指具有通过二硫键互连的至少两个重(H)链多肽和两个轻(L)链多肽的抗体。每条重链包括重链可变区(本文缩写为HCVR或V_H)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域CH₁、CH₂和CH₃。每条轻链包括轻链可变区(本文缩写为LCVR或V_L)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域C_L。V_H区和V_L区可以被进一步细分成被称作互补决定区(CDR)的高变区，其间散布着更保守的被称作框架区(FR)的区。每个V_H和V_L由按以下顺序从氨基末端到羧基末端布置的三个CDR和四个FR构成：FR₁、CDR₁、FR₂、CDR₂、FR₃、CDR₃、FR₄。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包含免疫系统的不同细胞(例如，效应子细胞)以及经典补体系统的第一组分(Clq)。

如本文所使用的，术语“配体”是指与受体结合的分子。具体地，配体与另一个细胞上的受体结合，允许细胞到细胞识别和/或相互作用。

如本文所使用的，术语“连接子”是指与两个或更多个多肽或核酸共价连接以使其相互连接的官能团(例如，化学物质或多肽)。如本文所使用的，“肽连接子”是指用于将两种蛋白质偶联在一起(例如，与V_H和V_L结构域偶联)的一个或多个氨基酸。在某些实施例中，连接子包括具有序列(GGGGS)_n的氨基酸，其中n是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、12、14或15。

如本文所使用的，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质抗体群体中获得的抗体，即包括所述群体的单独抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突变之外。例如，单克隆抗体可以是源自单克隆，包含任何真核、原核或噬菌体克隆的抗体，并且不是产生抗体的方法。单克隆抗体组合物对特定表位显示出单一结合特异性和亲和力。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”指示抗体的特性是从基本上同质的抗体群体中获得的，并且不应被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。单克隆抗体可以使用本领域中已知的各种技术制备，包含例如但不限于杂交瘤、重组和噬菌体展示技术。例如，根据本发明方法使用的单克隆抗体可以通过由Kohler等人,《自然》256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法(参见例如美国专利第4,816,567号)制备。例如，单克隆抗体也可以使用在Clackson等人,《自然》352:624-628(1991)和Marks等人,《分子生物学杂志》222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体库中分离。

如本文所使用的，术语“MUC16”或“MUC16多肽”或“MUC16肽”是指如Yin BW和LloydKO,2001,《生物化学杂志(J Biol Chem.)》276(29):27371-5中所描述的MUC16束缚粘蛋白。GenBank^TM登录号NP 078966.2(SEQ ID NO:1)提供了示例性人MUC16氨基酸序列。

未成熟MUC16，NP 078966.2(SEQ ID NO:1)MLKPSGLPGSSSPTRSLMTGSRSTKATPEMDSGLTGATLSPKTSTGAIVVTEHTLPFTSPDKTLASPTSSVVGRTTQSLGVMSSALPESTSRGMTHSEQRTSPSLSPQVNGTPSRNYPATSMVSGLSSPRTRTSSTEGNFTKEASTYTLTVETTSGPVTEKYTVPTETSTTEGDSTETPWDTRYIPVKITSPMKTFADSTASKENAPVSMTPAETTVTDSHTPGRTNPSFGTLYSSFLDLSPKGTPNSRGETSLELILSTTGYPFSSPEPGSAGHSRISTSAPLSSSASVLDNKISETSIFSGQSLTSPLSPGVPEARASTMPNSAIPFSMTLSNAETSAERVRSTISSLGTPSISTKQTAETILTFHAFAETMDIPSTHIAKTLASEWLGSPGTLGGTSTSALTTTSPSTTLVSEETNTHHSTSGKETEGTLNTSMTPLETSAPGEESEMTATLVPTLGFTTLDSKIRSPSQVSSSHPTRELRTTGSTSGRQSSSTAAHGSSDILRATTSSTSKASSWTSESTAQQFSEPQHTQWVETSPSMKTERPPASTSVAAPITTSVPSVVSGFTTLKTSSTKGIWLEETSADTLIGESTAGPTTHQFAVPTGISMTGGSSTRGSQGTTHLLTRATASSETSADLTLATNGVPVSVSPAVSKTAAGSSPPGGTKPSYTMVSSVIPETSSLQSSAFREGTSLGLTPLNTRHPFSSPEPDSAGHTKISTSIPLLSSASVLEDKVSATSTFSHHKATSSITTGTPEISTKTKPSSAVLSSMTLSNAATSPERVRNATSPLTHPSPSGEETAGSVLTLSTSAETTDSPNIHPTGTLTSESSESPSTLSLPSVSGVKTTFSSSTPSTHLFTSGEETEETSNPSVSQPETSVSRVRTTLASTSVPTPVFPTMDTWPTRSAQFSSSHLVSELRATSSTSVTNSTGSALPKISHLTGTATMSQTNRDTFNDSAAPQSTTWPETSPRFKTGLPSATTTVSTSATSLSATVMVSKFTSPATSSMEATSIREPSTTILTTETTNGPGSMAVASTNIPIGKGYITEGRLDTSHLPIGTTASSETSMDFTMAKESVSMSVSPSQSMDAAGSSTPGRTSQFVDTFSDDVYHLTSREITIPRDGTSSALTPQMTATHPPSPDPGSARSTWLGILSSSPSSPTPKVTMSSTFSTQRVTTSMIMDTVETSRWNMPNLPSTTSLTPSNIPTSGAIGKSTLVPLDTPSPATSLEASEGGLPTLSTYPESTNTPSIHLGAHASSESPSTIKLTMASVVKPGSYTPLTFPSIETHIHVSTARMAYSSGSSPEMTAPGETNTGSTWDPTTYITTTDPKDTSSAQVSTPHSVRTLRTTENHPKTESATPAAYSGSPKISSSPNLTSPATKAWTITDTTEHSTQLHYTKLAEKSSGFETQSAPGPVSVVIPTSPTIGSSTLELTSDVPGEPLVLAPSEQTTITLPMATWLSTSLTEEMASTDLDISSPSSPMSTFAIFPPMSTPSHELSKSEADTSAIRNTDSTTLDQHLGIRSLGRTGDLTTVPITPLTTTWTSVIEHSTQAQDTLSATMSPTHVTQSLKDQTSIPASASPSHLTEVYPELGTQGRSSSEATTFWKPSTDTLSREIETGPTNIQSTPPMDNTTTGSSSSGVTLGIAHLPIGTSSPAETSTNMALERRSSTATVSMAGTMGLLVTSAPGRSISQSLGRVSSVLSESTTEGVTDSSKGSSPRLNTQGNTALSSSLEPSYAEGSQMSTSIPLTSSPTTPDVEFIGGSTFWTKEVTTVMTSDISKSSARTESSSATLMSTALGSTENTGKEKLRTASMDLPSPTPSMEVTPWISLTLSNAPNTTDSLDLSHGVHTSSAGTLATDRSLNTGVTRASRLENGSDTSSKSLSMGNSTHTSMTYTEKSEVSSSIHPRPETSAPGAETTLTSTPGNRAISLTLPFSSIPVEEVISTGITSGPDINSAPMTHSPITPPTIVWTSTGTIEQSTQPLHAVSSEKVSVQTQSTPYVNSVAVSASPTHENSVSSGSSTSSPYSSASLESLDSTISRRNAITSWLWDLTTSLPTTTWPSTSLSEALSSGHSGVSNPSSTTTEFPLFSAASTSAAKQRNPETETHGPQNTAASTLNTDASSVTGLSETPVGASISSEVPLPMAITSRSDVSGLTSESTANPSLGTASSAGTKLTRTISLPTSESLVSFRMNKDPWTVSIPLGSHPTTNTETSIPVNSAGPPGLSTVASDVIDTPSDGAESIPTVSFSPSPDTEVTTISHFPEKTTHSFRTISSLTHELTSRVTPIPGDWMSSAMSTKPTGASPSITLGERRTITSAAPTTSPIVLTASFTETSTVSLDNETTVKTSDILDARKTNELPSDSSSSSDLINTSIASSTMDVTKTASISPTSISGMTASSSPSLFSSDRPQVPTSTTETNTATSPSVSSNTYSLDGGSNVGGTPSTLPPFTITHPVETSSALLAWSRPVRTFSTMVSTDTASGENPTSSNSVVTSVPAPGTWTSVGSTTDLPAMGFLKTSPAGEAHSLLASTIEPATAFTPHLSAAVVTGSSATSEASLLTTSESKAIHSSPQTPTTPTSGANWETSATPESLLVVTETSDTTLTSKILVTDTILFSTVSTPPSKFPSTGTLSGASFPTLLPDTPAIPLTATEPTSSLATSFDSTPLVTIASDSLGTVPETTLTMSETSNGDALVLKTVSNPDRSIPGITIQGVTESPLHPSSTSPSKIVAPRNTTYEGSITVALSTLPAGTTGSLVFSQSSENSETTALVDSSAGLERASVMPLTTGSQGMASSGGIRSGSTHSTGTKTFSSLPLTMNPGEVTAMSEITTNRLTATQSTAPKGIPVKPTSAESGLLTPVSASSSPSKAFASLTTAPPTWGIPQSTLTFEFSEVPSLDTKSASLPTPGQSLNTIPDSDASTASSSLSKSPEKNPRARMMTSTKAISASSFQSTGFTETPEGSASPSMAGHEPRVPTSGTGDPRYASESMSYPDPSKASSAMTSTSLASKLTTLFSTGQAARSGSSSSPISLSTEKETSFLSPTASTSRKTSLFLGPSMARQPNILVHLQTSALTLSPTSTLNMSQEEPPELTSSQTIAEEEGTTAETQTLTFTPSETPTSLLPVSSPTEPTARRKSSPETWASSISVPAKTSLVETTDGTLVTTIKMSSQAAQGNSTWPAPAEETGSSPAGTSPGSPEMSTTLKIMSSKEPSISPEIRSTVRNSPWKTPETTVPMETTVEPVTLQSTALGSGSTSISHLPTGTTSPTKSPTENMLATERVSLSPSPPEAWTNLYSGTPGGTRQSLATMSSVSLESPTARSITGTGQQSSPELVSKTTGMEFSMWHGSTGGTTGDTHVSLSTSSNILEDPVTSPNSVSSLTDKSKHKTETWVSTTAIPSTVLNNKIMAAEQQTSRSVDEAYSSTSSWSDQTSGSDITLGASPDVTNTLYITSTAQTTSLVSLPSGDQGITSLTNPSGGKTSSASSVTSPSIGLETLRANVSAVKSDIAPTAGHLSQTSSPAEVSILDVTTAPTPGISTTITTMGTNSISTTTPNPEVGMSTMDSTPATERRTTSTEHPSTWSSTAASDSWTVTDMTSNLKVARSPGTISTMHTTSFLASSTELDSMSTPHGRITVIGTSLVTPSSDASAVKTETSTSERTLSPSDTTASTPISTFSRVQRMSISVPDILSTSWTPSSTEAEDVPVSMVSTDHASTKTDPNTPLSTFLFDSLSTLDWDTGRSLSSATATTSAPQGATTPQELTLETMISPATSQLPFSIGHITSAVTPAAMARSSGVTFSRPDPTSKKAEQTSTQLPTTTSAHPGQVPRSAATTLDVIPHTAKTPDATFQRQGQTALTTEARATSDSWNEKEKSTPSAPWITEMMNSVSEDTIKEVTSSSSVLRTLNTLDINLESGTTSSPSWKSSPYERIAPSESTTDKEAIHPSTNTVETTGWVTSSEHASHSTIPAHSASSKLTSPVVTTSTREQAIVSMSTTTWPESTRARTEPNSFLTIELRDVSPYMDTSSTTQTSIISSPGSTAITKGPRTEITSSKRISSSFLAQSMRSSDSPSEAITRLSNFPAMTESGGMILAMQTSPPGATSLSAPTLDTSATASWTGTPLATTQRFTYSEKTTLFSKGPEDTSQPSPPSVEETSSSSSLVPIHATTSPSNILLTSQGHSPSSTPPVTSVFLSETSGLGKTTDMSRISLEPGTSLPPNLSSTAGEALSTYEASRDTKAIHHSADTAVTNMEATSSEYSPIPGHTKPSKATSPLVTSHIMGDITSSTSVFGSSETTEIETVSSVNQGLQERSTSQVASSATETSTVITHVSSGDATTHVTKTQATFSSGTSISSPHQFITSTNTFTDVSTNPSTSLIMTESSGVTITTQTGPTGAATQGPYLLDTSTMPYLTETPLAVTPDFMQSEKTTLISKGPKDVSWTSPPSVAETSYPSSLTPFLVTTIPPATSTLQGQHTSSPVSATSVLTSGLVKTTDMLNTSMEPVTNSPQNLNNPSNEILATLAATTDIETIHPSINKAVTNMGTASSAHVLHSTLPVSSEPSTATSPMVPASSMGDALASISIPGSETTDIEGEPTSSLTAGRKENSTLQEMNSTTESNIILSNVSVGAITEATKMEVPSFDATFIPTPAQSTKFPDIFSVASSRLSNSPPMTISTHMTTTQTGSSGATSKIPLALDTSTLETSAGTPSVVTEGFAHSKITTAMNNDVKDVSQTNPPFQDEASSPSSQAPVLVTTLPSSVAFTPQWHSTSSPVSMSSVLTSSLVKTAGKVDTSLETVTSSPQSMSNTLDDISVTSAATTDIETTHPSINTVVTNVGTTGSAFESHSTVSAYPEPSKVTSPNVTTSTMEDTTISRSIPKSSKTTRTETETTSSLTPKLRETSISQEITSSTETSTVPYKELTGATTEVSRTDVTSSSSTSFPGPDQSTVSLDISTETNTRLSTSPIMTESAEITITTQTGPHGATSQDTFTMDPSN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MTTLMSRSPENPSWKSSLFVEKTSSSSSLLSLPVTTSPSVSSTLPQSIPSSSFSVTSLLTPGMVKTTDTSTEPGTSLSPNLSGTSVEILAASEVTTDTEKIHPSSSMAVTNVGTTSSGHELYSSVSIHSEPSKATYPVGTPSSMAETSISTSMPANFETTGFEAEPFSHLTSGFRKTNMSLDTSSVTPTNTPSSPGSTHLLQSSKTDFTSSAKTSSPDWPPASQYTEIPVDIITPFNASPSITESTGITSFPESRFTMSVTESTHHLSTDLLPSAETISTGTVMPSLSEAMTSFATTGVPRAISGSGSPFSRTESGPGDATLSTIAESLPSSTPVPFSSSTFTTTDSSTIPALHEITSSSATPYRVDTSLGTESSTTEGRLVMVSTLDTSSQPGRTSSSPILDTRMTESVELGTVTSAYQVPSLSTRLTRTDGIMEHITKIPNEAAHRGTIRPVKGPQTSTSPASPKGLHTGGTKRMETTTTALKTTTTALKTTSRATLTTSVYTPTLGTLTPLNASMQMASTIPTEMMITTPYVFPDVPETTSSLATSLGAETSTALPRTTPSVFNRESETTASLVSRSGAERSPVIQTLDVSSSEPDTTASWVIHPAETIPTVSKTTPNFFHSELDTVSSTATSHGADVSSAIPTNISPSELDALTPLVTISGTDTSTTFPTLTKSPHETETRTTWLTHPAETSSTIPRTIPNFSHHESDATPSIATSPGAETSSAIPIMTVSPGAEDLVTSQVTSSGTDRNMTIPTLTLSPGEPKTIASLVTHPEAQTSSAIPTSTISPAVSRLVTSMVTSLAAKTSTTNRALTNSPGEPATTVSLVTHPAQTSPTVPWTTSIFFHSKSDTTPSMTTSHGAESSSAVPTPTVSTEVPGVVTPLVTSSRAVISTTIPILTLSPGEPETTPSMATSHGEEASSAIPTPTVSPGVPGVVTSLVTSSRAVTSTTIPILTFSLGEPETTPSMATSHGTEAGSAVPTVLPEVPGMVTSLVASSRAVTSTTLPTLTLSPGEPETTPSMATSHGAEASSTVPTVSPEVPGVVTSLVTSSSGVNSTSIPTLILSPGELETTPSMATSHGAEASSAVPTPTVSPGVSGVVTPLVTSSRAVTSTTIPILTLSSSEPETTPSMATSHGVEASSAVLTVSPEVPGMVTSLVTSSRAVTSTTIPTLTISSDEPETTTSLVTHSEAKMISAIPTLAVSPTVQGLVTSLVTSSGSETSAFSNLTVASSQPETIDSWVAHPGTEASSVVPTLTVSTGEPFTNISLVTHPAESSSTLPRTTSRFSHSELDTMPSTVTSPEAESSSAISTTISPGIPGVLTSLVTSSGRDISATFPTVPESPHESEATASWVTHPAVTSTTVPRTTPNYSHSEPDTTPSIATSPGAEATSDFPTITVSPDVPDMVTSQVTSSGTDTSITIPTLTLSSGEPETTTSFITYSETHTSSAIPTLPVSPGASKMLTSLVISSGTDSTTTFPTLTETPYEPETTAIQLIHPAETNTMVPRTTPKFSHSKSDTTLPVAITSPGPEASSAVSTTTISPDMSDLVTSLVPSSGTDTSTTFPTLSETPYEPETTATWLTHPAETSTTVSGTIPNFSHRGSDTAPSMVTSPGVDTRSGVPTTTIPPSIPGVVTSQVTSSATDTSTAIPTLTPSPGEPETTASSATHPGTQTGFTVPIRTVPSSEPDTMASWVTHPPQTSTPVSRTTSSFSHSSPDATPVMATSPRTEASSAVLTTISPGAPEMVTSQITSSGAATSTTVPTLTHSPGMPETTALLSTHPRTETSKTFPASTVFPQVSETTASLTIRPGAETSTALPTQTTSSLFTLLVTGTSRVDLSPTASPGVSAKTAPLSTHPGTETSTMIPTSTLSLGLLETTGLLATSSSAETSTSTLTLTVSPAVSGLSSASITTDKPQTVTSWNTETSPSVTSVGPPEFSRTVTGTTMTLIPSEMPTPPKTSHGEGVSPTTILRTTMVEATNLATTGSSPTVAKTTTTFNTLAGSLFTPLTTPGMSTLASESVTSRTSYNHRSWISTTSSYNRRYWTPATSTPVTSTFSPGISTSSIPSSTAATVPFMVPFTLNFTITNLQYEEDMRHPGSRKFNATERELQGLLKPLFRNSSLEYLYSGCRLASLRPEKDSSATAVDAICTHRPDPEDLGLDRERLYWELSNLTNGIQELGPYTLDRNSLYVNGFTHRSSMPTTSTPGTSTVDVGTSGTPSSSPSPTTAGPLLMPFTLNFTITNLQYEEDMRRTGSRKFNTMESVLQGLLKPLFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGLNREQLYWELSKLTNDIEELGPYTLDRNSLYVNGFTHQSSVSTTSTPGTSTVDLRTSGTPSSLSSPTIMAAGPLLVPFTLNFTITNLQYGEDMGHPGSRKFNTTERVLQGLLGPIFKNTSVGPLYSGCRLTSLRSEKDGAATGVDAICIHHLDPKSPGLNRERLYWELSQLTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHRTSVPTSSTPGTSTVDLGTSGTPFSLPSPATAGPLLVLFTLNFTITNLKYEEDMHRPGSRKFNTTERVLQTLLGPMFKNTSVGLLYSGCRLTLLRSEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGVDREQLYWELSQLTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHWIPVPTSSTPGTSTVDLGSGTPSSLPSPTTAGPLLVPFTLNFTITNLKYEEDMHCPGSRKFNTTERVLQSLLGPMFKNTSVGPLYSGCRLTLLRSEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGVDREQLYWELSQLTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHQTSAPNTSTPGTSTVDLGTSGTPSSLPSPTSAGPLLVPFTLNFTITNLQYEEDMHHPGSRKFNTTERVLQGLLGPMFKNTSVGLLYSGCRLTLLRPEKNGAATGMDAICSHRLDPKSPGLNREQLYWELSQLTHGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHRSSVAPTSTPGTSTVDLGTSGTPSSLPSPTTAVPLLVPFTLNFTITNLQYGEDMRHPGSRKFNTTERVLQGLLGPLFKNSSVGPLYSGCRLISLRSEKDGAATGVDAICTHHLNPQSPGLDREQLYWQLSQMTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHRSSGLTTSTPWTSTVDLGTSGTPSPVPSPTTTGPLLVPFTLNFTITNLQYEENMGHPGSRKFNITESVLQGLLKPLFKSTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGVATRVDAICTHRPDPKIPGLDRQQLYWELSQLTHSITELGPYTLDRDSLYVNGFTQRSSVPTTSTPGTFTVQPETSETPSSLPGPTATGPVLLPFTLNFTITNLQYEEDMRRPGSRKFNTTERVLQGLLMPLFKNTSVSSLYSGCRLTLLRPEKDGAATRVDAVCTHRPDPKSPGLDRERLYWKLSQLTHGITELGPYTLDRHSLYVNGFTHQSSMTTTRTPDTSTMHLATSRTPASLSGPMTASPLLVLFTINFTITNLRYEENMHHPGSRKFNTTERVLQGLLRPVFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPKKDGAATKVDAICTYRPDPKSPGLDREQLYWELSQLTHSITELGPYTLDRDSLYVNGFTQRSSVPTTSIPGTPTVDLGTSGTPVSKPGPSAASPLLVLFTLNFTITNLRYEENMQHPGSRKFNTTERVLQGLLRSLFKSTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGTATGVDAICTHHPDPKSPRLDREQLYWELSQLTHNITELGPYALDNDSLFVNGFTHRSSVSTTSTPGTPTVYLGASKTPASIFGPSAASHLLILFTLNFTITNLRYEENMWPGSRKFNTTERVLQGLLRPLFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGEATGVDAICTHRPDPTGPGLDREQLYLELSQLTHSITELGPYTLDRDSLYVNGFTHRSSVPTTSTGVVSEEPFTLNFTINNLRYMADMGQPGSLKFNITDNVMQHLLSPLFQRSSLGARYTGCRVIALRSVKNGAETRVDLLCTYLQPLSGPGLPIKQVFHELSQQTHGITRLGPYSLDKDSLYLNGYNEPGPDEPPTTPKPATTFLPPLSEATTAMGYHLKTLTLNFTISNLQYSPDMGKGSATFNSTEGVLQHLLRPLFQKSSMGPFYLGCQLISLRPEKDGAATGVDTTCTYHPDPVGPGLDIQQLYWELSQLTHGVTQLGFYVLDRDSLFINGYAPQNLSIRGEYQINFHIVNWNLSNPDPTSSEYITLLRDIQDKVTTLYKGSQLHDTFRFCLVTNLTMDSVLVTVKALFSSNLDPSLVEQVFLDKTLNASFHWLGSTYQLVDIHVTEMESSVYQPTSSSSTQHFYLNFTITNLPYSQDKAQPGTTNYQRNKRNIEDALNQLFRNSSIKSYFSDCQVSTFRSVPNRHHTGVDSLCNFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLPFWAVILIGLAGLLGVITCLICGVLVTTRRRKKEGEYNVQQQCPGYYQSHLDLEDLQ

天然MUC16包括细胞内结构域、跨膜结构域、接近推定切割位点的胞外结构域和12-20个重复序列的大的高度糖基化区，每个区的长度为156个氨基酸(图1(a))。“未成熟”MUC16是指SEQ ID NO:1，其包括MUC16信号序列(SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-60)。“成熟MUC16”是指在细胞表面上表达的天然MUC16，即，其中信号序列已通过细胞加工去除，例如SEQ ID NO:2，其中SEQ ID NO:1的前60个氨基酸残基已被去除(即，SEQ ID NO:1是MUC16的“未成熟”形式)。

“成熟MUC16”(SEQ ID NO:2)

DKTLASPTSSVVGRTTQSLGVMSSALPESTSRGMTHSEQRTSPSLSPQVNGTPSRNYPATSMVSGLSSPRTRTSSTEGNFTKEASTYTLTVETTSGPVTEKYTVPTETSTTEGDSTETPWDTRYIPVKITSPMKTFADSTASKENAPVSMTPAETTVTDSHTPGRTNPSFGTLYSSFLDLSPKGTPNSRGETSLELILSTTGYPFSSPEPGSAGHSRISTSAPLSSSASVLDNKISETSIFSGQSLTSPLSPGVPEARASTMPNSAIPFSMTLSNAETSAERVRSTISSLGTPSISTKQTAETILTFHAFAETMDIPSTHIAKTLASEWLGSPGTLGGTSTSALTTTSPSTTLVSEETNTHHSTSGKETEGTLNTSMTPLETSAPGEESEMTATLVPTLGFTTLDSKIRSPSQVSSSHPTRELRTTGSTSGRQSSSTAAHGSSDILRATTSSTSKASSWTSESTAQQFSEPQHTQWVETSPSMKTERPPASTSVAAPITTSVPSVVSGFTTLKTSSTKGIWLEETSADTLIGESTAGPTTHQFAVPTGISMTGGSSTRGSQGTTHLLTRATASSETSADLTLATNGVPVSVSPAVSKTAAGSSPPGGTKPSYTMVSSVIPETSSLQSSAFREGTSLGLTPLNTRHPFSSPEPDSAGHTKISTSIPLLSSASVLEDKVSATSTFSHHKATSSITTGTPEISTKTKPSSAVLSSMTLSNAATSPERVRNATSPLTHPSPSGEETAGSVLTLSTSAETTDSPNIHPTGTLTSESSESPSTLSLPSVSGVKTTFSSSTPSTHLFTSGEETEETSNPSVSQPETSVSRVRTTLASTSVPTPVFPTMDTWPTRSAQFSSSHLVSELRATSSTSVTNSTGSALPKISHLTGTATMSQTNRDTFNDSAAPQSTTWPETSPRFKTGLPSATTTVSTSATSLSATVMVSKFTSPATSSMEATSIREPSTTILTTETTNGPGSMAVASTNIPIGKGYITEGRLDTSHLPIGTTASSETSMDFTMAKESVSMSVSPSQSMDAAGSSTPGRTSQFVDTFSDDVYHLTSREITIPRDGTSSALTPQMTATHPPSPDPGSARSTWLGILSSSPSSPTPKVTMSSTFSTQRVTTSMIMDTVETSRWNMPNLPSTTSLTPSNIPTSGAIGKSTLVPLDTPSPATSLEASEGGLPTLSTYPESTNTPSIHLGAHASSESPSTIKLTMASVVKPGSYTPLTFPSIETHIHVSTARMAYSSGSSPEMTAPGETNTGSTWDPTTYITTTDPKDTSSAQVSTPHSVRTLRTTENHPKTESATPAAYSGSPKISSSPNLTSPATKAWTITDTTEHSTQLHYTKLAEKSSGFETQSAPGPVSVVIPTSPTIGSSTLELTSDVPGEPLVLAPSEQTTITLPMATWLSTSLTEEMASTDLDISSPSSPMSTFAIFPPMSTPSHELSKSEADTSAIRNTDSTTLDQHLGIRSLGRTGDLTTVPITPLTTTWTSVIEHSTQAQDTLSATMSPTHVTQSLKDQTSIPASASPSHLTEVYPELGTQGRSSSEATTFWKPSTDTLSREIETGPTNIQSTPPMDNTTTGSSSSGVTLGIAHLPIGTSSPAETSTNMALERRSSTATVSMAGTMGLLVTSAPGRSISQSLGRVSSVLSESTTEGVTDSSKGSSPRLNTQGNTALSSSLEPSYAEGSQMSTSIPLTSSPTTPDVEFIGGSTFWTKEVTTVMTSDISKSSARTESSSATLMSTALGSTENTGKEKLRTASMDLPSPTPSMEVTPWISLTLSNAPNTTDSLDLSHGVHTSSAGTLATDRSLNTGVTRASRLENGSDTSSKSLSMGNSTHTSMTYTEKSEVSSSIHPRPETSAPGAETTLTSTPGNRAISLTLPFSSIPVEEVISTGITSGPDINSAPMTHSPITPPTIVWTSTGTIEQSTQPLHAVSSEKVSVQTQSTPYVNSVAVSASPTHENSVSSGSSTSSPYSSASLESLDSTISRRNAITSWLWDLTTSLPTTTWPSTSLSEALSSGHSGVSNPSSTTTEFPLFSAASTSAAKQRNPETETHGPQNTAASTLNTDASSVTGLSETPVGASISSEVPLPMAITSRSDVSGLTSESTANPSLGTASSAGTKLTRTISLPTSESLVSFRMNKDPWTVSIPLGSHPTTNTETSIPVNSAGPPGLSTVASDVIDTPSDGAESIPTVSFSPSPDTEVTTISHFPEKTTHSFRTISSLTHELTSRVTPIPGDWMSSAMSTKPTGASPSITLGERRTITSAAPTTSPIVLTASFTETSTVSLDNETTVKTSDILDARKTNELPSDSSSSSDLINTSIASSTMDVTKTASISPTSISGMTASSSPSLFSSDRPQVPTSTTETNTATSPSVSSNTYSLDGGSNVGGTPSTLPPFTITHPVETSSALLAWSRPVRTFSTMVSTDTASGENPTSSNSVVTSVPAPGTWTSVGSTTDLPAMGFLKTSPAGEAHSLLASTIEPATAFTPHLSAAVVTGSSATSEASLLTTSESKAIHSSPQTPTTPTSGANWETSATPESLLVVTETSDTTLTSKILVTDTILFSTVSTPPSKFPSTGTLSGASFPTLLPDTPAIPLTATEPTSSLATSFDSTPLVTIASDSLGTVPETTLTMSETSNGDALVLKTVSNPDRSIPGITIQGVTESPLHPSSTSPSKIVAPRNTTYEGSITVALSTLPAGTTGSLVFSQSSENSETTALVDSSAGLERASVMPLTTGSQGMASSGGIRSGSTHSTGTKTFSSLPLTMNPGEVTAMSEITTNRLTATQSTAPKGIPVKPTSAESGLLTPVSASSSPSKAFASLTTAPPTWGIPQSTLTFEFSEVPSLDTKSASLPTPGQSLNTIPDSDASTASSSLSKSPEKNPRARMMTSTKAISASSFQSTGFTETPEGSASPSMAGHEPRVPTSGTGDPRYASESMSYPDPSKASSAMTSTSLASKLTTLFSTGQAARSGSSSSPISLSTEKETSFLSPTASTSRKTSLFLGPSMARQPNILVHLQTSALTLSPTSTLNMSQEEPPELTSSQTIAEEEGTTAETQTLTFTPSETPTSLLPVSSPTEPTARRKSSPETWASSISVPAKTSLVETTDGTLVTTIKMSSQAAQGNSTWPAPAEETGSSPAGTSPGSPEMSTTLKIMSSKEPSISPEIRSTVRNSPWKTPETTVPMETTVEPVTLQSTALGSGSTSISHLPTGTTSPTKSPTENMLATERVSLSPSPPEAWTNLYSGTPGGTRQSLATMSSVSLESPTARSITGTGQQSSPELVSKTTGMEFSMWHGSTGGTTGDTHVSLSTSSNILEDPVTSPNSVSSLTDKSKHKTETWVSTTAIPSTVLNNKIMAAEQQTSRSVDEAYSSTSSWSDQTSGSDITLGASPDVTNTLYITSTAQTTSLVSLPSGDQGITSLTNPSGGKTSSASSVTSPSIGLETLRANVSAVKSDIAPTAGHLSQTSSPAEVSILDVTTAPTPGISTTITTMGTNSISTTTPNPEVGMSTMDSTPATERRTTSTEHPSTWSSTAASDSWTVTDMTSNLKVARSPGTISTMHTTSFLASSTELDSMSTPHGRITVIGTSLVTPSSDASAVKTETSTSERTLSPSDTTASTPISTFSRVQRMSISVPDILSTSWTPSSTEAEDVPVSMVSTDHASTKTDPNTPLSTFLFDSLSTLDWDTGRSLSSATATTSAPQGATTPQELTLETMISPATSQLPFSIGHITSAVTPAAMARSSGVTFSRPDPTSKKAEQTSTQLPTTTSAHPGQVPRSAATTLDVIPHTAKTPDATFQRQGQTALTTEARATSDSWNEKEKSTPSAPWITEMMNSVSEDTIKEVTSSSSVLRTLNTLDINLESGTTSSPSWKSSPYERIAPSESTTDKEAIHPSTNTVETTGWVTSSEHASHSTIPAHSASSKLTSPVVTTSTREQAIVSMSTTTWPESTRARTEPNSFLTIELRDVSPYMDTSSTTQTSIISSPGSTAITKGPRTEITSSKRISSSFLAQSMRSSDSPSEAITRLSNFPAMTESGGMILAMQTSPPGATSLSAPTLDTSATASWTGTPLATTQRFTYSEKTTLFSKGPEDTSQPSPPSVEETSSSSSLVPIHATTSPSNILLTSQGHSPSSTPPVTSVFLSETSGLGKTTDMSRISLEPGTSLPPNLSSTAGEALSTYEASRDTKAIHHSADTAVTNMEATSSEYSPIPGHTKPSKATSPLVTSHIMGDITSSTSVFGSSETTEIETVSSVNQGLQERSTSQVASSATETSTVITHVSSGDATTHVTKTQATFSSGTSISSPHQFITSTNTFTDVSTNPSTSLIMTESSGVTITTQTGPTGAATQGPYLLDTSTMPYLTETPLAVTPDFMQSEKTTLISKGPKDVSWTSPPSVAETSYPSSLTPFLVTTIPPATSTLQGQHTSSPVSATSVLTSGLVKTTDMLNTSMEPVTNSPQNLNNPSNEILATLAATTDIETIHPSINKAVTNMGTASSAHVLHSTLPVSSEPSTATSPMVPASSMGDALASISIPGSETTDIEGEPTSSLTAGRKENSTLQEMNSTTESNIILSNVSVGAITEATKMEVPSFDATFIPTPAQSTKFPDIFSVASSRLSNSPPMTISTHMTTTQTGSSGATSKIPLALDTSTLETSAGTPSVVTEGFAHSKITTAMNNDVKDVSQTNPPFQDEASSPSSQAPVLVTTLPSSVAFTPQWHSTSSPVSMSSVLTSSLVKTAGKVDTSLETVTSSPQSMSNTLDDISVTSAATTDIETTHPSINTVVTNVGTTGSAFESHSTVSAYPEPSKVTSPNVTTSTMEDTTISRSIPKSSKTTRTETETTSSLTPKLRETSISQEITSSTETSTVPYKELTGATTEVSRTDVTSSSSTSFPGPDQSTVSLDISTETNTRLSTSPIMTESAEITITTQTGPHGATSQDTFTMDPSNTTPQAGIHSAMTHGFSQLDVTTLMSRIPQDVSWTSPPSVDKTSSPSSFLSSPAMTTPSLISSTLPEDKLSSPMTSLLTSGLVKITDILRTRLEPVTSSLPNFSSTSDKILATSKDSKDTKEIFPSINTEETNVKANNSGHESHSPALADSETPKATTQMVITTTVGDPAPSTSMPVHGSSETTNIKREPTYFLTPRLRETSTSQESSFPTDTSFLLSKVPTGTITEVSSTGVNSSSKISTPDHDKSTVPPDTFTGEIPRVFTSSIKTKSAEMTITTQASPPESASHSTLPLDTSTTLSQGGTHSTVTQGFPYSEVTTLMGMGPGNVSWMTTPPVEETSSVSSLMSSPAMTSPSPVSSTSPQSIPSSPLPVTALPTSVLVTTTDVLGTTSPESVTSSPPNLSSITHERPATYKDTAHTEAAMHHSTNTAVTNVGTSGSGHKSQSSVLADSETSKATPLMSTTSTLGDTSVSTSTPNISQTNQIQTEPTASLSPRLRESSTSEKTSSTTETNTAFSYVPTGAITQASRTEISSSRTSISDLDRPTIAPDISTGMITRLFTSPIMTKSAEMTVTTQTTTPGATSQGILPWDTSTTLFQGGTHSTVSQGFPHSEITTLRSRTPGDVSWMTTPPVEETSSGFSLMSPSMTSPSPVSSTSPESIPSSPLPVTALLTSVLVTTTNVLGTTSPEPVTSSPPNLSSPTQERLTTYKDTAHTEAMHASMHTNTAVANVGTSISGHESQSSVPADSHTSKATSPMGITFAMGDTSVSTSTPAFFETRIQTESTSSLIPGLRDTRTSEEINTVTETSTVLSEVPTTTTTEVSRTEVITSSRTTISGPDHSKMSPYISTETITRLSTFPFVTGSTEMAITNQTGPIGTISQATLTLDTSSTASWEGTHSPVTQRFPHSEETTTMSRSTKGVSWQSPPSVEETSSPSSPVPLPAITSHSSLYSAVSGSSPTSALPVTSLLTSGRRKTIDMLDTHSELVTSSLPSASSFSGEILTSEASTNTETIHFSENTAETNMGTTNSMHKLHSSVSIHSQPSGHTPPKVTGSMMEDAIVSTSTPGSPETKNVDRDSTSPLTPELKEDSTALVMNSTTESNTVFSSVSLDAATEVSRAEVTYYDPTFMPASAQSTKSPDISPEASSSHSNSPPLTISTHKTIATQTGPSGVTSLGQLTLDTSTIATSAGTPSARTQDFVDSETTSVMNNDLNDVLKTSPFSAEEANSLSSQAPLLVTTSPSPVTSTLQEHSTSSLVSVTSVPTPTLAKITDMDTNLEPVTRSPQNLRNTLATSEATTDTHTMHPSINTAVANVGTTSSPNEFYFTVSPDSDPYKATSAVVITSTSGDSIVSTSMPRSSAMKKIESETTFSLIFRLRETSTSQKIGSSSDTSTVFDKAFTAATTEVSRTELTSSSRTSIQGTEKPTMSPDTSTRSVTMLSTFAGLTKSEERTIATQTGPHRATSQGTLTWDTSITTSQAGTHSAMTHGFSQLDLSTLTSRVPEYISGTSPPSVEKTSSSSSLLSLPAITSPSPVPTTLPESRPSSPVHLTSLPTSGLVKTTDMLASVASLPPNLGSTSHKIPTTSEDIKDTEKMYPSTNIAVTNVGTTTSEKESYSSVPAYSEPPKVTSPMVTSFNIRDTIVSTSMPGSSEITRIEMESTFSLAHGLKGTSTSQDPIVSTEKSAVLHKLTTGATETSRTEVASSRRTSIPGPDHSTESPDISTEVIPSLPISLGITESSNMTIITRTGPPLGSTSQGTFTLDTPTTSSRAGTHSMATQEFPHSEMTTVMNKDPEILSWTIPPSIEKTSFSSSLMPSPAMTSPPVSSTLPKTIHTTPSPMTSLLTPSLVMTTDTLGTSPEPTTSSPPNLSSTSHEILTTDEDTTAIEAMHPSTSTAATNVETTSSGHGSQSSVLADSEKTKATAPMDTTSTMGHTTVSTSMSVSSETTKIKRESTYSLTPGLRETSISQNASFSTDTSIVLSEVPTGTTAEVSRTEVTSSGRTSIPGPSQSTVLPEISTRTMTRLFASPTMTESAEMTIPTQTGPSGSTSQDTLTLDTSTTKSQAKTHSTLTQRFPHSEMTTLMSRGPGDMSWQSSPSLENPSSLPSLLSLPATTSPPPISSTLPVTISSSPLPVTSLLTSSPVTTTDMLHTSPELVTSSPPKLSHTSDERLTTGKDTTNTEAVHPSTNTAASNVEIPSSGHESPSSALADSETSKATSPMFITSTQEDTTVAISTPHFLETSRIQKESISSLSPKLRETGSSVETSSAIETSAVLSEVSIGATTEISRTEVTSSSRTSISGSAESTMLPEISTTRKIIKFPTSPILAESSEMTIKTQTSPPGSTSESTFTLDTSTTPSLVITHSTMTQRLPHSEITTLVSRGAGDVPRPSSLPVEETSPPSSQLSLSAMISPSPVSSTLPASSHSSSASVTSLLTPGQVKTTEVLDASAEPETSSPPSLSSTSVEILATSEVTTDTEKIHPFSNTAVTKVGTSSSGHESPSSVLPDSETTKATSAMGTISIMGDTSVSTLTPALSNTRKIQSEPASSLTTRLRETSTSEETSLATEANTVLSKVSTGATTEVSRTEAISFSRTSMSGPEQSTMSQDISIGTIPRISASSVLTESAKMTITTQTGPSESTLESTLNLNTATTPSWVETHSIVIQGFPHPEMTTSMGRGPGGVSWPSPPFVKETSPPSSPLSLPAVTSPHPVSTTFLAHIPPSPLPVTSLLTSGPATTTDILGTSTEPGTSSSSSLSTTSHERLTTYKDTAHTEAVHPSTNTGGTNVATTSSGYKSQSSVLADSSPMCTTSTMGDTSVLTSTPAFLETRRIQTELASSLTPGLRESSGSEGTSSGTKMSTVLSKVPTGATTEISKEDVTSIPGPAQSTISPDISTRTVSWFSTSPVMTESAEITMNTHTSPLGATTQGTSTLDTSSTTSLTMTHSTISQGFSHSQMSTLMRRGPEDVSWMSPPLLEKTRPSFSLMSSPATTSPSPVSSTLPESISSSPLPVTSLLTSGLAKTTDMLHKSSEPVTNSPANLSSTSVEILATSEVTTDTEKTHPSSNRTVTDVGTSSSGHESTSFVLADSQTSKVTSPMVITSTMEDTSVSTSTPGFFETSRIQTEPTSSLTLGLRKTSSSEGTSLATEMSTVLSGVPTGATAEVSRTEVTSSSRTSISGFAQLTVSPETSTETITRLPTSSIMTESAEMMIKTQTDPPGSTPESTHTVDISTTPNWVETHSTVTQRFSHSEMTTLVSRSPGDMLWPSQSSVEETSSASSLLSLPATTSPSPVSSTLVEDFPSASLPVTSLLNPGLVITTDRMGISREPGTSSTSNLSSTSHERLTTLEDTVDTEDMQPSTHTAVTNVRTSISGHESQSSVLSDSETPKATSPMGTTYTMGETSVSISTSDFFETSRIQIEPTSSLTSGLRETSSSERISSATEGSTVLSEVPSGATTEVSRTEVISSRGTSMSGPDQFTISPDISTEAITRLSTSPIMTESAESAITIETGSPGATSEGTLTLDTSTTTFWSGTHSTASPGFSHSEMTTLMSRTPGDVPWPSLPSVEEASSVSSSLSSPAMTSTSFFSTLPESISSSPHPVTALLTLGPVKTTDMLRTSSEPETSSPPNLSSTSAEILATSEVTKDREKIHPSSNTPVVNVGTVIYKHLSPSSVLADLVTTKPTSPMATTSTLGNTSVSTSTPAFPETMMTQPTSSLTSGLREISTSQETSSATERSASLSGMPTGATTKVSRTEALSLGRTSTPGPAQSTISPEISTETITRISTPLTTTGSAEMTITPKTGHSGASSQGTFTLDTSSRASWPGTHSAATHRSPHSGMTTPMSRGPEDVSWPSRPSVEKTSPPSSLVSLSAVTSPSPLYSTPSESSHSSPLRVTSLFTPVMMKTTDMLDTSLEPVTTSPPSMNITSDESLATSKATMETEAIQLSENTAVTQMGTISARQEFYSSYPGLPEPSKVTSPVVTSSTIKDIVSTTIPASSEITRIEMESTSTLTPTPRETSTSQEIHSATKPSTVPYKALTSATIEDSMTQVMSSSRGPSPDQSTMSQDISTEVITRLSTSPIKTESTEMTITTQTGSPGATSRGTLTLDTSTTFMSGTHSTASQGFSHSQMTALMSRTPGDVPWLSHPSVEEASSASFSLSSPVMTSSSPVSSTLPDSIHSSSLPVTSLLTSGLVKTTELLGTSSEPETSSPPNLSSTSAEILAITEVTTDTEKLEMTNVVTSGYTHESPSSVLADSVTTKATSSMGITYPTGDTNVLTSTPAFSDTSRIQTKSKLSLTPGLMETSISEETSSATEKSTVLSSVPTGATTEVSRTEAISSSRTSIPGPAQSTMSSDTSMETITRISTPLTRKESTDMAITPKTGPSGATSQGTFTLDSSSTASWPGTHSATTQRFPQSVVTTPMSRGPEDVSWPSPLSVEKNSPPSSLVSSSSVTSPSPLYSTPSGSSHSSPVPVTSLFTSIMMKATDMLDASLEPETTSAPNMNITSDESLAASKATTETEAIHVFENTAASHVETTSATEELYSSSPGFSEPTKVISPVVTSSSIRDNMVSTTMPGSSGITRIEIESMSSLTPGLRETRTSQDITSSTETSTVLYKMPSGATPEVSRTEVMPSSRTSIPGPAQSTMSLDISDEVVTRLSTSPIMTESAEITITTQTGYSLATSQVTLPLGTSMTFLSGTHSTMSQGLSHSEMTNLMSRGPESLSWTSPRFVETTRSSSSLTSLPLTTSLSPVSSTLLDSSPSSPLPVTSLILPGLVKTTEVLDTSSEPKTSSSPNLSSTSVEIPATSEIMTDTEKIHPSSNTAVAKVRTSSSVHESHSSVLADSETTITIPSMGITSAVDDTTVFTSNPAFSETRRIPTEPTFSLTPGFRETSTSEETTSITETSAVLYGVPTSATTEVSMTEIMSSNRIHIPDSDQSTMSPDIITEVITRLSSSSMMSESTQMTITTQKSSPGATAQSTLTLATTTAPLARTHSTVPPRFLHSEMTTLMSRSPENPSWKSSLFVEKTSSSSSLLSLPVTTSPSVSSTLPQSIPSSSFSVTSLLTPGMVKTTDTSTEPGTSLSPNLSGTSVEILAASEVTTDTEKIHPSSSMAVTNVGTTSSGHELYSSVSIHSEPSKATYPVGTPSSMAETSISTSMPANFETTGFEAEPFSHLTSGFRKTNMSLDTSSVTPTNTPSSPGSTHLLQSSKTDFTSSAKTSSPDWPPASQYTEIPVDIITPFNASPSITESTGITSFPESRFTMSVTESTHHLSTDLLPSAETISTGTVMPSLSEAMTSFATTGVPRAISGSGSPFSRTESGPGDATLSTIAESLPSSTPVPFSSSTFTTTDSSTIPALHEITSSSATPYRVDTSLGTESSTTEGRLVMVSTLDTSSQPGRTSSSPILDTRMTESVELGTVTSAYQVPSLSTRLTRTDGIMEHITKIPNEAAHRGTIRPVKGPQTSTSPASPKGLHTGGTKRMETTTTALKTTTTALKTTSRATLTTSVYTPTLGTLTPLNASMQMASTIPTEMMITTPYVFPDVPETTSSLATSLGAETSTALPRTTPSVFNRESETTASLVSRSGAERSPVIQTLDVSSSEPDTTASWVIHPAETIPTVSKTTPNFFHSELDTVSSTATSHGADVSSAIPTNISPSELDALTPLVTISGTDTSTTFPTLTKSPHETETRTTWLTHPAETSSTIPRTIPNFSHHESDATPSIATSPGAETSSAIPIMTVSPGAEDLVTSQVTSSGTDRNMTIPTLTLSPGEPKTIASLVTHPEAQTSSAIPTSTISPAVSRLVTSMVTSLAAKTSTTNRALTNSPGEPATTVSLVTHPAQTSPTVPWTTSIFFHSKSDTTPSMTTSHGAESSSAVPTPTVSTEVPGVVTPLVTSSRAVISTTIPILTLSPGEPETTPSMATSHGEEASSAIPTPTVSPGVPGVVTSLVTSSRAVTSTTIPILTFSLGEPETTPSMATSHGTEAGSAVPTVLPEVPGMVTSLVASSRAVTSTTLPTLTLSPGEPETTPSMATSHGAEASSTVPTVSPEVPGVVTSLVTSSSGVNSTSIPTLILSPGELETTPSMATSHGAEASSAVPTPTVSPGVSGVVTPLVTSSRAVTSTTIPILTLSSSEPETTPSMATSHGVEASSAVLTVSPEVPGMVTSLVTSSRAVTSTTIPTLTISSDEPETTTSLVTHSEAKMISAIPTLAVSPTVQGLVTSLVTSSGSETSAFSNLTVASSQPETIDSWVAHPGTEASSVVPTLTVSTGEPFTNISLVTHPAESSSTLPRTTSRFSHSELDTMPSTVTSPEAESSSAISTTISPGIPGVLTSLVTSSGRDISATFPTVPESPHESEATASWVTHPAVTSTTVPRTTPNYSHSEPDTTPSIATSPGAEATSDFPTITVSPDVPDMVTSQVTSSGTDTSITIPTLTLSSGEPETTTSFITYSETHTSSAIPTLPVSPGASKMLTSLVISSGTDSTTTFPTLTETPYEPETTAIQLIHPAETNTMVPRTTPKFSHSKSDTTLPVAITSPGPEASSAVSTTTISPDMSDLVTSLVPSSGTDTSTTFPTLSETPYEPETTATWLTHPAETSTTVSGTIPNFSHRGSDTAPSMVTSPGVDTRSGVPTTTIPPSIPGVVTSQVTSSATDTSTAIPTLTPSPGEPETTASSATHPGTQTGFTVPIRTVPSSEPDTMASWVTHPPQTSTPVSRTTSSFSHSSPDATPVMATSPRTEASSAVLTTISPGAPEMVTSQITSSGAATSTTVPTLTHSPGMPETTALLSTHPRTETSKTFPASTVFPQVSETTASLTIRPGAETSTALPTQTTSSLFTLLVTGTSRVDLSPTASPGVSAKTAPLSTHPGTETSTMIPTSTLSLGLLETTGLLATSSSAETSTSTLTLTVSPAVSGLSSASITTDKPQTVTSWNTETSPSVTSVGPPEFSRTVTGTTMTLIPSEMPTPPKTSHGEGVSPTTILRTTMVEATNLATTGSSPTVAKTTTTFNTLAGSLFTPLTTPGMSTLASESVTSRTSYNHRSWISTTSSYNRRYWTPATSTPVTSTFSPGISTSSIPSSTAATVPFMVPFTLNFTITNLQYEEDMRHPGSRKFNATERELQGLLKPLFRNSSLEYLYSGCRLASLRPEKDSSATAVDAICTHRPDPEDLGLDRERLYWELSNLTNGIQELGPYTLDRNSLYVNGFTHRSSMPTTSTPGTSTVDVGTSGTPSSSPSPTTAGPLLMPFTLNFTITNLQYEEDMRRTGSRKFNTMESVLQGLLKPLFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGLNREQLYWELSKLTNDIEELGPYTLDRNSLYVNGFTHQSSVSTTSTPGTSTVDLRTSGTPSSLSSPTIMAAGPLLVPFTLNFTITNLQYGEDMGHPGSRKFNTTERVLQGLLGPIFKNTSVGPLYSGCRLTSLRSEKDGAATGVDAICIHHLDPKSPGLNRERLYWELSQLTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHRTSVPTSSTPGTSTVDLGTSGTPFSLPSPATAGPLLVLFTLNFTITNLKYEEDMHRPGSRKFNTTERVLQTLLGPMFKNTSVGLLYSGCRLTLLRSEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGVDREQLYWELSQLTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHWIPVPTSSTPGTSTVDLGSGTPSSLPSPTTAGPLLVPFTLNFTITNLKYEEDMHCPGSRKFNTTERVLQSLLGPMFKNTSVGPLYSGCRLTLLRSEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGVDREQLYWELSQLTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHQTSAPNTSTPGTSTVDLGTSGTPSSLPSPTSAGPLLVPFTLNFTITNLQYEEDMHHPGSRKFNTTERVLQGLLGPMFKNTSVGLLYSGCRLTLLRPEKNGAATGMDAICSHRLDPKSPGLNREQLYWELSQLTHGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHRSSVAPTSTPGTSTVDLGTSGTPSSLPSPTTAVPLLVPFTLNFTITNLQYGEDMRHPGSRKFNTTERVLQGLLGPLFKNSSVGPLYSGCRLISLRSEKDGAATGVDAICTHHLNPQSPGLDREQLYWQLSQMTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHRSSGLTTSTPWTSTVDLGTSGTPSPVPSPTTTGPLLVPFTLNFTITNLQYEENMGHPGSRKFNITESVLQGLLKPLFKSTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGVATRVDAICTHRPDPKIPGLDRQQLYWELSQLTHSITELGPYTLDRDSLYVNGFTQRSSVPTTSTPGTFTVQPETSETPSSLPGPTATGPVLLPFTLNFTITNLQYEEDMRRPGSRKFNTTERVLQGLLMPLFKNTSVSSLYSGCRLTLLRPEKDGAATRVDAVCTHRPDPKSPGLDRERLYWKLSQLTHGITELGPYTLDRHSLYVNGFTHQSSMTTTRTPDTSTMHLATSRTPASLSGPMTASPLLVLFTINFTITNLRYEENMHHPGSRKFNTTERVLQGLLRPVFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPKKDGAATKVDAICTYRPDPKSPGLDREQLYWELSQLTHSITELGPYTLDRDSLYVNGFTQRSSVPTTSIPGTPTVDLGTSGTPVSKPGPSAASPLLVLFTLNFTITNLRYEENMQHPGSRKFNTTERVLQGLLRSLFKSTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGTATGVDAICTHHPDPKSPRLDREQLYWELSQLTHNITELGPYALDNDSLFVNGFTHRSSVSTTSTPGTPTVYLGASKTPASIFGPSAASHLLILFTLNFTITNLRYEENMWPGSRKFNTTERVLQGLLRPLFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGEATGVDAICTHRPDPTGPGLDREQLYLELSQLTHSITELGPYTLDRDSLYVNGFTHRSSVPTTSTGVVSEEPFTLNFTINNLRYMADMGQPGSLKFNITDNVMQHLLSPLFQRSSLGARYTGCRVIALRSVKNGAETRVDLLCTYLQPLSGPGLPIKQVFHELSQQTHGITRLGPYSLDKDSLYLNGYNEPGPDEPPTTPKPATTFLPPLSEATTAMGYHLKTLTLNFTISNLQYSPDMGKGSATFNSTEGVLQHLLRPLFQKSSMGPFYLGCQLISLRPEKDGAATGVDTTCTYHPDPVGPGLDIQQLYWELSQLTHGVTQLGFYVLDRDSLFINGYAPQNLSIRGEYQINFHIVNWNLSNPDPTSSEYITLLRDIQDKVTTLYKGSQLHDTFRFCLVTNLTMDSVLVTVKALFSSNLDPSLVEQVFLDKTLNASFHWLGSTYQLVDIHVTEMESSVYQPTSSSSTQHFYLNFTITNLPYSQDKAQPGTTNYQRNKRNIEDALNQLFRNSSIKSYFSDCQVSTFRSVPNRHHTGVDSLCNFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLPFWAVILIGLAGLLGVITCLICGVLVTTRRRKKEGEYNVQQQCPGYYQSHLDLEDLQ

由SEQ ID NO:3的氨基酸序列表示的多肽在本文中被称为MUC16^c114并由成熟MUC16的C末端具114个氨基酸的残基组成(SEQ ID NO:2是成熟MUC16的序列)。MUC16^c114包括具58个氨基酸的胞外结构域、具25个氨基酸的跨膜结构域和具31个氨基酸的胞质尾。MUC16^cl14能够在SEQ ID NO:3的位置1、24和30(根据最初MUC16出版物Yin BW和Lloyd KO,2001,《生物化学杂志》276(29):27371-5，也被称为氨基酸位置Asn1777、Asn1800和Asn1806)处的天冬酰胺氨基酸残基处被N-糖基化。

MUC16^cl14(SEQ ID NO:3)

NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLPFWAVILIGLAGLLGLITCLICGVLVTTRRRKKEGEYNVQQQCPGYYQSHLDLEDLQ

MUC16^c114中存在的具58个氨基酸的胞外结构域序列表示为SEQ ID NO:95：NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP(SEQ ID NO:95)

如本文所使用的，术语“核酸”或“多核苷酸”意指任何RNA或DNA，其可以是未经修饰或经修饰的RNA或DNA。多核苷酸包含但不限于单链和双链DNA、作为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA、作为单链区和双链区的混合物的RNA、以及包括可以是单链或更典型地双链或单链区和双链区的混合物的DNA和RNA的杂交分子。另外，多核苷酸是指包括RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包含含有一个或多个经修饰的碱基的DNA或RNA，以及具有为了稳定性或其它原因而修饰的主链的DNA或RNA。

如本文所使用的，术语“药学上可接受的载剂”旨在包含与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌化合物和抗真菌化合物、等渗化合物以及吸收延迟化合物等。药学上可接受的载剂及其调配物是本领域技术人员已知的并且在例如在以下文献中进行描述：《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,(第20版,编辑：A.Gennaro,2000,宾夕法尼亚州费城利平科特威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA.))。

如本文所使用的，术语“多克隆抗体”意指源自至少两(2)种不同产生抗体的细胞系的抗体的制备。该术语的使用包含至少两(2)种抗体的制备，所述抗体含有与抗原的不同表位或区特异性结合的抗体。

如本文所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以便意指包括通过肽键或经修饰的肽键即肽等排体彼此连接的两个或更多个氨基酸的聚合物。多肽是指通常被称作肽、糖肽或寡聚物的短链和通常被称作蛋白质的较长链两者。多肽可以含有除20个基因编码氨基酸以外的氨基酸。多肽包含通过如翻译后加工等天然过程或通过本领域众所周知的化学修饰技术进行修饰的氨基酸序列。此类修饰在基本文本和更详细的专著以及大量研究文献中都有详细描述。

如本文所使用的，当关于例如细胞或核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组”表示细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者细胞源自如此修饰的材料。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因，或表达以其它方式异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。

如本文所使用的,“样品”或“生物样品”是指从受试者中分离的体液或组织样品。在一些情况下，生物样品可以由以下组成或包括以下：全血、血小板、红细胞、白细胞、血浆、血清、尿液、粪便、表皮样品、阴道样品、皮肤样品、颊拭子、精子、羊水、培养细胞、骨髓样品、肿瘤活检、吸出物和/或绒毛膜绒毛、培养细胞、内皮细胞、滑液、淋巴液、腹水、间质液或细胞外液等。术语“样品”还可以涵盖细胞之间的空间中的流体，包含龈沟液、骨髓、脑脊液(CSF)、唾液、粘液、痰、精液、汗液、尿液或任何其它体液。样品可以通过任何方式从受试者获得，包含但不限于静脉穿刺、排泄、射精、按摩、活检、针抽吸、灌洗、刮擦、手术切口或干预或本领域已知的其它方式。血液样品可以是全血或其任何部分，包含血细胞(红细胞、白细胞或白血球和血小板)、血清和血浆。

如本文所使用的，术语“单独的”治疗使用是指通过不同途径同时施用或者基本上同时施用至少两种有效成分。

如本文所使用的，术语“顺序”治疗使用是指在不同时间施用至少两种有效成分，施用途径相同或不同。更具体地，顺序使用是指在另一种或其它有效成分开始施用之前，完全施用一种有效成分。因此，在施用一种或多种其它有效成分前几分钟、几小时或几天，可以施用一种有效成分。在此情况下不存在同时治疗。

如本文所使用的，术语“同时”治疗使用是指以相同的途径同时或基本上同时施用至少两种活性成分。

如本文所使用的，术语“单链抗体”或“单链Fv(scFv)”是指Fv片段的两个结构域V_L和V_H的抗体融合分子。单链抗体分子可以包括具有许多单个分子的聚合物，例如，二聚体、三聚体或其它聚合物。此外，虽然F_v片段的两个结构域V_L和V_H由单独的基因编码，但是这两个结构域可以使用重组方法通过使这两个结构域能够成为单个蛋白链的合成连接子来连接，在所述单个蛋白链中，V_L区和V_H区配对以形成单价分子(被称为单链F_v(scF_v))。Bird等人(1988)《科学》242:423-426和Huston等人(1988)《美国国家科学院院刊》85:5879-5883。此类单链抗体可以通过重组技术或完整抗体的酶促或化学切割来制备。

V_H和V_L结构域直接连接或者通过编码肽的连接子(例如，约10、15、20、25个氨基酸)连接，所述连接子将V_H的N末端与V_L的C末端连接，或者将V_H的C末端与V_L的N末端连接。在一些实施例中，连接子通常可以富含甘氨酸用于柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸用于溶解度。连接子可以连接胞外抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区。

尽管去除了恒定区并引入了连接子，scFv蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。单链Fv多肽抗体可以由包括编码V_H和V_L的序列的核酸表达，如由Huston等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)》,85:5879-5883(1988)所描述的。还参见美国专利第5,091,513号、第5,132,405号和第4,956,778号；以及美国专利公开第20050196754号和第20050196754号。已经描述了具有抑制活性的拮抗scFv(参见例如Zhao等人,《杂交瘤(Hybridoma)》(Larchmt)27(6):455-51(2008)；Peter等人,《恶病质、肌肉减少症和肌肉杂志(J Cachexia Sarcopenia Muscle)》(2012)；Shieh等人,《免疫学杂志(J Imunol)》183(4):2277-85(2009)；Giomarelli等人,《血栓形成与止血杂志(Thromb Haemost)》97(6):955-63(2007)；Fife等人,《临床研究杂志(J Clin Invst)》116(8):2252-61(2006)；Brocks等人,《免疫技术(Immunotechnology)》3(3):173-84(1997)；Moosmayer等人,《免疫学疗法(Ther Immunol)》2(10):31-40(1995)。已经描述了具有刺激活性的激动性scFv(参见例如Peter等人,《生物化学杂志》25278(38):36740-7(2003)；Xie等人,《自然生物技术(NatBiotech)》15(8):768-71(1997)；Ledbetter等人,《免疫学关键性综述(Crit RevImmunol)》17(5-6):427-55(1997)；Ho等人,《生物化学与生物物理学学报(Bio ChimBiophys Acta)》1638(3):257-66(2003))。

如本文所使用的，“特异性结合”是指识别另一分子(例如，抗原)并与其结合，但是基本上不识别其它分子并不与其结合的分子(例如，抗体或其抗原结合片段)。如本文所使用的，术语“特异性结合”特定分子(例如，多肽或多肽上的表位)、“与”特定分子“特异性结合”或“对”特定分子“具有特异性”可以例如通过这样的分子来表现，所述分子对与其结合的所述特定分子的K_D为约10^-4M、10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M或10^-12M。术语“特异性结合”也可以指分子(例如，抗体或其抗原结合片段)与特定多肽(例如，MUC16多肽)或特定多肽上的表位结合，而基本上不与任何其它多肽或多肽表位结合的结合。

如本文所使用的，术语“受试者”、“个体”或“患者”可互换使用并且是指单个生物体、脊椎动物、哺乳动物或人。在某些实施例中，个体、患者或受试者是人。

如本文所使用的，“协同治疗效果”反映了由至少两种药剂的组合产生的大于相加的治疗效果，并且所述效果超过了所述药剂以其它方式单独施用所产生的效果。例如，较低剂量的一种或多种药剂可以用于治疗疾病或病症，从而提高治疗功效并降低副作用。

如本文所使用的，“治疗(treat/treating/treatment)”涵盖对如人等受试者的本文所描述的疾病或病症的治疗并且包含：(i)抑制疾病或病症，即，阻止其发展；(ii)缓解疾病或病症，即，导致病症消退；(iii)减缓病症的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或病症的一种或多种症状的进展。在一些实施例中，治疗意指与疾病相关的症状例如减轻、减少、治愈或处于缓解状态。在一些实施例中，“抑制”意指减少或减缓肿瘤的生长。在一些实施例中，对肿瘤生长的抑制可以是例如5％或更多、10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多或90％或更多。在一些实施例中，抑制可以是完全的。

还应了解，如本文所描述的各种治疗医学疾病和病状的模式旨在表示“基本的”，其包含完全的治疗但也包含次于其的治疗，并且其中实现了一些生物学或医学相关的结果。治疗可以是对慢性疾病的连续长期治疗或用于治疗急性病状的单次或几次施用。

考虑了本文所描述的抗MUC16抗体的氨基酸序列修饰。可以引入此类修饰以改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学性质，例如，使经编码的氨基酸去糖基化，或破坏抗体与C1q、Fc受体结合的能力或激活补体系统。抗MUC16抗体的氨基酸序列变体通过将适当的核苷酸改变引入抗体核酸中，通过肽合成或通过化学修饰来制备。此类修饰包含例如抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。只要获得的抗体具有期望的性质，缺失、插入和取代的任何组合都可以获得所关注的抗体。修饰还包含蛋白质的糖基化模式的改变。用于取代诱变的最受关注的位点包含高变区，但是还考虑了FR改变。

保守氨基酸取代是将给定氨基酸改变为具有类似生物化学性质(例如，电荷、疏水性和大小)的不同氨基酸的氨基酸取代。“保守取代”在下表中示出。

一种类型的取代型变体涉及取代亲本抗体的一个或多个高变区残基。产生此类取代型变体的便利方式涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。具体地，使若干高变区位点(例如，6-7个位点)突变以在各位点处产生所有可能的氨基酸取代。由此产生的抗体变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒展示，作为与包装在每个颗粒内的M13的基因III产物的融合物。然后针对噬菌体展示的变体的生物活性(例如，结合亲和力)对所述变体进行筛选，如本文所公开的。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以执行丙氨酸扫描诱变，以鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。可替代地或另外地，可能有利的是分析抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体与抗原之间的接触点。根据本文详述的技术，此类接触残基和相邻残基是供取代的候选者。一旦产生了此类变体，就如本文所描述的对所述组变体进行筛选，并且可以选择在一个或多个相关测定中具有类似或优越性质的抗体用于进一步开发。

本发明技术的抗MUC16^c114免疫球蛋白相关组合物

本文提供了与成熟MUC16的C末端具114个氨基酸的残基(例如，MUC16^c114)免疫特异性结合的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物。在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物是抗MUC16构建体，其包括与MUC16，如成熟MUC16的C末端具114个氨基酸的残基(例如，MUC16^c114)免疫特异性结合的抗体部分。此类抗MUC16免疫球蛋白相关组合物的实例描述于WO2020/102555和WO2020/227538中，所述文献以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物是抗MUC16抗体(例如，全长抗MUC16抗体)或其抗原结合片段。在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物与表达MUC16的细胞(例如，表达MUC16的癌细胞)结合。在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物是与MUC16特异性结合的全长抗体(例如，全长IgG)或其抗原结合片段。

本发明技术的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物，如与成熟MUC16的C末端具114个氨基酸的残基(例如，MUC16^c114)免疫特异性结合的抗MUC16抗体或其抗原结合片段可以包含例如，单克隆抗体、多克隆抗体、重组产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包含双特异性抗体(BsAb))、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包括两个重链和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、内抗体、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链可变片段(scFv)、骆驼化抗体、亲和抗体和二硫键连接的Fv(dsFv)、Fc融合蛋白、免疫缀合物或其片段。此类抗体和抗原结合片段可以通过本领域已知的方法制备。本发明技术的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物可以是串联scFv、双功能抗体(Db)、单链双功能抗体(scDb)、双亲和力再靶向(DART)抗体、F(ab')2、双可变结构域(DVD)抗体、杵臼(KiH)抗体、对接锁定(DNL)抗体、化学交联抗体、异源多聚体抗体、单克隆抗体、全长抗体或异源缀合物抗体。

使用IgBLAST算法预测了表1中的示例性CDR序列。参见例如Ye J.等人,《核酸研究(Nucleic Acids Research)》41:W34-W40(2013)，所述文献的公开内容通过引用整体并入本文。本领域技术人员将认识到，已知许多算法用于预测抗体重链和轻链可变区中的CDR位置，以及包括来自本文所描述的抗体的CDR的免疫球蛋白相关组合物，但基于除IgBLAST之外的预测算法，也在本公开的范围内。

表1.示例性抗MUC16抗体CDR序列。

一方面，本公开提供了一种抗MUC16抗体或其抗原结合片段，所述抗MUC16抗体或其抗原结合片段包括重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)和轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，其中(a)所述V_H包括SEQ ID NO:4的V_H-CDR1序列、SEQ ID NO:5的V_H-CDR2序列和SEQ ID NO:6的V_H-CDR3序列；和/或(b)所述V_L包括SEQ ID NO:7的V_L-CDR1序列、SEQ ID NO:8的V_L-CDR2序列和SEQ ID NO:9的V_L-CDR3序列。

一方面，本公开提供了一种抗MUC16抗体或其抗原结合片段，所述抗MUC16抗体或其抗原结合片段包括重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)和轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，其中(a)所述V_H包括SEQ ID NO:10的V_H-CDR1序列、SEQ ID NO:11的V_H-CDR2序列和SEQ IDNO:12的V_H-CDR3序列；和/或(b)所述V_L包括SEQ ID NO:13的V_L-CDR1序列、SEQ ID NO:14的V_L-CDR2序列和SEQ ID NO:15的V_L-CDR3序列。

另一方面，本公开提供了一种抗MUC16抗体或其抗原结合片段，所述抗MUC16抗体或其抗原结合片段包括重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)和轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，其中(a)所述V_H包括SEQ ID NO:16的V_H-CDR1序列、SEQ ID NO:17的V_H-CDR2序列和SEQID NO:18的V_H-CDR3序列；和/或(b)所述V_L包括SEQ ID NO:19的V_L-CDR1序列、SEQ ID NO:20的V_L-CDR2序列和SEQ ID NO:21的V_L-CDR3序列。

在又另一方面，本公开提供了一种抗MUC16抗体或其抗原结合片段，所述抗MUC16抗体或其抗原结合片段包括重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)和轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，其中(a)所述V_H包括SEQ ID NO:22的V_H-CDR1序列、SEQ ID NO:23的V_H-CDR2序列和SEQ ID NO:24的V_H-CDR3序列；和/或(b)所述V_L包括SEQ ID NO:25的V_L-CDR1序列、SEQ IDNO:26的V_L-CDR2序列和SEQ ID NO:27的V_L-CDR3序列。

一方面，本公开提供了一种抗MUC16抗体或其抗原结合片段，所述抗MUC16抗体或其抗原结合片段包括：(a)重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ IDNO:28或SEQID NO:29的V_H-CDR1序列、V_H-CDR2序列和V_H-CDR3序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的V_L-CDR1序列、V_L-CDR2序列和V_L-CDR3序列；或者(b)重链免疫球蛋白可变结构域(VH)，所述VH包括SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的V_H-CDR1序列、V_H-CDR2序列和V_H-CDR3序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35的V_L-CDR1序列、V_L-CDR2序列和V_L-CDR3序列；或者(c)重链免疫球蛋白可变结构域(VH)，所述VH包括SEQ ID NO:36的V_H-CDR1序列、V_H-CDR2序列和V_H-CDR3序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:37的V_L-CDR1序列、V_L-CDR2序列和V_L-CDR3序列；或者(d)重链免疫球蛋白可变结构域(VH)，所述VH包括SEQ IDNO:38的V_H-CDR1序列、V_H-CDR2序列和V_H-CDR3序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:39的V_L-CDR1序列、V_L-CDR2序列和V_L-CDR3序列。

一方面，本公开提供了一种抗MUC16抗体或其抗原结合片段，所述抗MUC16抗体或其抗原结合片段包括重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)和轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，其中：(a)所述V_H包括选自SEQ ID NO:28-29、32-33、36或38中的任一者的氨基酸序列；和/或(b)所述V_L包括选自SEQ ID NO:30-31、34-35、37或39中的任一者的氨基酸序列。所述抗MUC16抗体或抗原结合片段的V_H和/或V_L结构域可以包括前导序列。前导序列的实例包含但不限于METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO:93)和MGWSCIILFLVATATGKL(SEQ ID NO:94)。

在一些实施例中，所述抗MUC16抗体或其抗原结合片段包括：(a)重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸序列；或者(b)重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35的氨基酸序列；或者(c)重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:37的氨基酸序列；或者(d)重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列。

在某些实施例中，所述免疫球蛋白相关组合物包含以下特性中的一个或多个：(a)轻链免疫球蛋白可变结构域序列，所述轻链免疫球蛋白可变结构域序列与SEQ ID NO:30-31、34-35、37或39中的任一者的轻链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同；和/或(b)重链免疫球蛋白可变结构域序列，所述重链免疫球蛋白可变结构域序列与SEQ ID NO:28-29、32-33、36或38中的任一者的重链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同。参见表2。另一方面，本文所提供的免疫球蛋白相关组合物中的一个或多个氨基酸残基被另一种氨基酸取代。取代可以是如本文所定义的“保守取代”。

表2.示例性抗MUC16抗体V_H和V_L结构域序列。

V_H和V_L CDR序列以下划线标出。

在任何上述实施例中，所述抗体进一步包括任何同种型的Fc结构域，例如但不限于IgG(包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(包含IgA1和IgA2)、IgD、IgE或IgM和IgY。恒定区序列的非限制性实例包含：

人IgD恒定区，Uniprot：P01880(SEQ ID NO:40)

APTKAPDVFPIISGCRHPKDNSPVVLACLITGYHPTSVTVTWYMGTQSQPQRTFPEIQRRDSYYMTSSQLSTPLQQWRQGEYKCVVQHTASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK

人IgG1恒定区，Uniprot：P01857(SEQ ID NO:41)

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

人IgG2恒定区，Uniprot：P01859(SEQ ID NO:42)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

人IgG3恒定区，Uniprot：P01860(SEQ ID NO:43)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK

人IgM恒定区，Uniprot：P01871(SEQ ID NO:44)

GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY

人IgG4恒定区，Uniprot：P01861(SEQ ID NO:45)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

人IgA1恒定区，Uniprot：P01876(SEQ ID NO:46)

ASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY

人IgA2恒定区，Uniprot：P01877(SEQ ID NO:47)

ASPTSPKVFPLSLDSTPQDGNVVVACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQNVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCPDGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRMAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY

人Igκ恒定区，Uniprot：P01834(SEQ ID NO:48)

TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

人Igλ恒定区，Uniprot：P01834(SEQ ID NO:49)

QPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

在一些实施例中，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物包括与SEQ ID NO:40-47至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的重链恒定区。另外地或可替代地，在一些实施例中，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物包括与SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的轻链恒定区。

在一些实施例中，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物与MUC16多肽的细胞外结构域结合。在某些实施例中，表位是构象表位或非构象表位。在一些实施例中，所述MUC16多肽具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

一方面，本公开提供了一种免疫球蛋白相关组合物，所述免疫球蛋白相关组合物包括与选自SEQ ID NO:50-69中的任一者的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

V_H和V_L结构域以斜体标出，CDR序列以下划线标出，连接子序列以常规字体表示。

另外地或可替代地，在一些实施例中，本发明技术的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物是多特异性的并且与CD3多肽的细胞外结构域结合。在某些实施例中，本发明技术的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物包含抗CD3抗体部分，所述抗CD3抗体部分包括：V_H结构域，所述V_H结构域包括序列

DVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSRGYTNYADSVKGRFTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTATYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:70)；以及V_L结构域，所述V_L结构域包括序列

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDTSKVASGVPARFSGSGSGTDYSLTINSLEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:71)。

另外地或可替代地，在某些实施例中，本发明技术的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物包含抗CD3抗体部分，所述抗CD3抗体部分包括

DVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSRGYTNYADSVKGRFTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTATYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTVTVSSGEGTSTGSGGSGGSGGADDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDTSKVASGVPARFSGSGSGTDYSLTINSLEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:72)的氨基酸序列。

另外地或可替代地，在一些实施例中，本发明技术的多特异性抗MUC16×CD3免疫球蛋白相关组合物包括选自SEQ ID NO:73-92中的任一者的氨基酸序列。

V_H和V_L结构域以斜体标出，MUC16抗原结合片段的V_H和V_L CDR序列以下划线标出，连接子序列以常规字体表示，并且组氨酸标签以虚线下划线表示。

本发明技术的免疫球蛋白相关组合物可以进一步在N或C末端处与异源多肽重组融合或与多肽或其它组合物化学缀合(包含共价和非共价缀合)。例如，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物可以与在检测测定中用作标记的分子和效应子分子如异源多肽、药物或毒素重组融合或缀合。参见例如WO 92/08495：WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利第5,314,995号；以及EP 0 396 387。

在本发明技术的免疫球蛋白相关组合物的任何上述实施例中，所述抗体或抗原结合片段可以任选地与选自由以下组成的组的药剂缀合：同位素、染料、发色团、造影剂、成像剂、细胞毒性剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或其任何组合。对于化学键或物理键，免疫球蛋白相关组合物上的官能团通常与药剂上的官能团缔合。可替代地，药剂上的官能团与免疫球蛋白相关组合物上的官能团缔合。

在某些实施例中，成像剂是可检测的标记，如显色的、酶的、放射性同位素的、同位素的、荧光的、有毒的、化学发光的、核磁共振造影剂或其它标记。

合适的显色标记的非限制性实例包含二氨基联苯胺和4-羟基偶氮-苯-2-羧酸。

合适的酶标记的非限制性实例包含苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸酯脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。

合适的放射性同位素为本领域技术人员所熟知并且包含β-发射体、γ-发射体、正电子发射体和x-射线发射体。合适的放射性同位素标记的非限制性实例包含³H、¹⁸F、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、³²P、³³P、³⁵S、¹¹C、¹⁴C、⁵¹Cr、⁵⁷To、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁷⁵Se、¹⁵²Eu、⁹⁰Y、⁶⁷Cu、²¹⁷Ci、²¹¹At、²¹²Pb、⁴⁷Sc、²²³Ra、²²³Ra、⁸⁹Zr、¹⁷⁷Lu和¹⁰⁹Pd。在某些实施例中，¹¹¹In是用于体内成像的优选同位素，因为其避免了¹²⁵I或¹³¹I标记的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物或其抗原结合片段在肝脏中脱卤的问题。另外，¹¹¹In具有对成像更有利的γ发射能量(Perkins等人,《欧洲核医学杂志(Eur.J.Nucl.Med.70:296-301(1985)；Carasquillo等人,《核医学杂志(J.Nucl.Med.)》25:281-287(1987))。例如，与具有1-(P-异硫氰基苄基)-DPTA的单克隆抗体偶联的¹¹¹In在非肿瘤组织，特别是肝脏中显示出很少的摄取，并且因此增强了肿瘤定位的特异性(Esteban等人,《核医学杂志》28:861-870(1987))。

合适的非放射性同位素标记的非限制性实例包含157Gd、⁵⁵Mn、¹⁶²Dy、⁵²Tr和⁵⁶Fe。

合适的荧光标记的非限制性实例包含¹⁵²Eu标记、荧光素标记、异硫氰酸标记、罗丹明标记、藻红蛋白标记、藻蓝蛋白标记、别藻蓝蛋白标记、绿色荧光蛋白(GFP)标记、邻苯二甲醛标记和荧光胺标记。

化学发光标记的非限制性实例包含鲁米诺标记、异鲁米诺标记、芳香族吖锭酯标记、咪唑标记、吖锭盐标记、草酸酯标记、荧光素标记、荧光素酶标记以及水母发光蛋白标记。

核磁共振造影剂的非限制性实例包含重金属核，如Gd、Mn和铁。

本领域普通技术人员已知的用于将上文所描述的标记与所述抗MUC16抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链和融合蛋白缀合的技术描述于以下中：例如Kennedy等人,《临床化学学报(Clin.CMm.Acta)》70:1-31(1976)以及Schurs等人,《临床化学学报》81:1-40(1977)。后者中提到的偶联技术是戊二醛法、高碘酸盐法、二马来酰亚胺法、间马来酰亚胺苄基-N-羟基琥珀酰亚胺酯法，所有这些方法都通过引用并入本文。

细胞毒性剂的非限制性实例包含细胞抑制或杀细胞剂、放射性金属离子，例如α-发射体，以及毒素，例如假单胞菌外毒素、相思子毒素、霍乱毒素、蓖麻毒素A和白喉毒素。

在某些实施例中，药剂是诊断剂。诊断剂是用于通过定位含有抗原的细胞来诊断或检测疾病的试剂。有用的诊断剂包含但不限于放射性同位素、染料(如具有生物素-链霉亲和素复合物)、造影剂、荧光化合物或分子及用于磁共振成像(MRI)的增强剂(例如，顺磁性离子)。美国专利第6,331,175号描述了MRI技术和与MRI增强剂缀合的抗体的制备，并且通过引用以其整体并入本文。优选地，诊断剂选自由以下组成的组：放射性同位素、用于磁共振成像的增强剂和荧光化合物。为了用放射性金属或顺磁性离子装载抗MUC16免疫球蛋白相关组合物，可能有必要使其与具有用于连接多个供结合离子的螯合基团的长尾的试剂反应。此类尾可以是聚合物，如聚赖氨酸、多糖，或具有可以与螯合基团的侧接基团结合的其它衍生化或可衍生化链，所述螯合基团例如为乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、双-缩氨基硫脲、聚肟及已知可用于此目的的类似基团。使用标准化学方法将螯合物与抗体偶联。螯合物通常通过基团与抗体连接，所述基团能够在免疫反应性损失最小并且聚集和/或内部交联最小的情况下与分子形成键，其它更不寻常的用于将螯合物与抗体缀合的方法和试剂公开在于1989年4月25日授权于Hawthorne的标题为“抗体缀合物”的美国专利第4,824,659号中，所述文献的公开内容以其整体并入本文。特别有用的金属螯合物组合包含与诊断同位素一起用于放射性成像的2-苄基-DTPA及其单甲基和环己基类似物。当与本文所提供的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物一起使用时，与如锰、铁和钆等非放射性金属络合的相同螯合物可用于MRI。

如NOTA、DOTA和TETA等大环螯合物与各种金属和放射性金属一起使用，所述各种金属和放射性金属具体地是分别用于镓、钇和铜的放射性核素。此类金属螯合物可以通过剪裁所关注的金属的环大小非常稳定。本文也涵盖了对于稳定结合核素感兴趣的其它环型螯合物，如大环聚醚，如用于RAIT的²²³Ra。

药剂和免疫球蛋白相关组合物上的官能团可以直接缔合。例如，药剂上的官能团(例如，巯基)可以与免疫球蛋白相关组合物上的官能团(例如，巯基)缔合以形成二硫化物。可替代地，官能团可以通过交联剂(即，连接子)缔合。下文描述了交联剂的一些实例。交联剂可以与药剂或免疫球蛋白相关组合物连接。缀合物中的药剂或免疫球蛋白相关组合物的数量也受到另一个缀合物上存在的官能团的数量的限制。例如，与缀合物缔合的试剂的最大数量取决于免疫球蛋白相关组合物上存在的官能团的数量。可替代地，与药剂缔合的免疫球蛋白相关组合物的最大数量取决于药剂上存在的官能团的数量。

在又另一个实施例中，缀合物包括与一种药剂缔合的一种免疫球蛋白相关组合物。在一个实施例中，缀合物包括与至少一种免疫球蛋白相关组合物化学键合(例如，缀合)的至少一种药剂。药剂可以通过本领域技术人员已知的任何方法与免疫球蛋白相关组合物化学键合。例如，药剂上的官能团可以与免疫球蛋白相关组合物上的官能团直接连接。合适的官能团的一些实例包含例如氨基、羧基、巯基、马来酰亚胺、异氰酸酯、异硫氰酸酯和羟基。

药剂也可以通过如二醛、碳二亚胺、二马来酰亚胺等交联剂与免疫球蛋白相关组合物化学键合。交联剂可以例如从伊利诺伊州罗克福德的皮尔斯生物技术公司(PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,Ill)获得。皮尔斯生物技术公司网站可以提供帮助。包含铂交联剂的另外的交联剂在以下中描述：荷兰阿姆斯特丹的Kreatech生物技术公司(Kreatech Biotechnology,B.V.,Amsterdam,The Netherlands)的美国专利第5,580,990号；第5,985,566号；以及第6,133,038号。

可替代地，药剂和免疫球蛋白相关组合物上的官能团可以是相同的。同双官能交联剂通常用于交联相同的官能团。同双官能交联剂的实例包含EGS(即，乙二醇双[琥珀酸琥珀酰亚胺酯])、DSS(即，辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、DMA(即，二亚胺代己二酸二甲酯2HCl)、DTSSP(即，3,3'-二硫代双[磺基琥珀酰亚胺丙酸酯])、DPDPB(即，1,4-二-[3'-(2'-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]丁烷)和BMH(即，双马来酰亚胺己烷)。此类同双官能交联剂也可从皮尔斯生物技术公司获得。

在其它情况下，将药剂从免疫球蛋白相关组合物中切割下来可能是有益的。上文所描述的皮尔斯生物技术公司的网站也可以帮助本领域技术人员选择合适的交联剂，所述交联剂可以被例如细胞中的酶切割。因此，可以将药剂从免疫球蛋白相关组合物中分离出来。可切割连接子的实例包含SMPT(即，4-琥珀酰亚胺氧羰基-甲基-a-[2-吡啶基二硫代]甲苯)、磺基-LC-SPDP(即，磺基琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰氨基)己酸酯)、LC-SPDP(即，琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰氨基)己酸酯)、磺基-LC-SPDP(即，磺基琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯)、SPDP(即，N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基己酸酯)和AEDP(即，3-[(2-氨基乙基)二硫代]丙酸HCl)。

在另一个实施例中，缀合物包括与至少一种免疫球蛋白相关组合物物理键合的至少一种药剂。可以采用本领域技术人员已知的任何方法将药剂与免疫球蛋白相关组合物物理键合。例如，免疫球蛋白相关组合物和药剂可以通过本领域技术人员已知的任何方法混合在一起。混合的顺序并不重要。例如，可以通过本领域技术人员已知的任何方法将药剂与免疫球蛋白相关组合物物理混合。例如，可以将免疫球蛋白相关的组合物和药剂置于容器中并通过例如摇动容器来搅拌，以混合免疫球蛋白相关组合物和药剂。

免疫球蛋白相关组合物可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行修饰。例如，免疫球蛋白相关组合物可以通过交联剂或官能团进行修饰，如上文所描述的。

在一些实施例中，本发明技术的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物以其对非靶的结合亲和力的至少约10倍(包含例如至少约10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶或10⁷倍中的任一者)的亲和力与成熟MUC16的C末端具114个氨基酸的残基(例如，MUC16^c114)结合。在一些实施例中，非靶是非MUC16的抗原。结合亲和力可以通过本领域已知的方法确定，如ELISA、荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀测定(RIA)。K_d可以通过本领域已知的方法确定，如利用例如Biacore仪器的表面等离子体共振(SPR)测定，或利用例如Sapidyne仪器的动力学排除测定(KinExA)。

在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物与来自除人以外的物种的MUC16多肽交叉反应。在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物对人MUC16完全特异并且不表现物种或其它类型的非人交叉反应性。在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物特异性识别在癌细胞(如实体瘤)的细胞表面上表达的MUC16。在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物特异性识别在以下中的一种或多种的细胞表面上表达的MUC16：卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、脑癌细胞、胰腺癌细胞、肾癌细胞、输卵管癌细胞、子宫(例如，子宫内膜)癌细胞、原发性腹膜癌细胞或表达MUC16的任何其它组织的癌细胞。在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物特异性识别在癌细胞系，例如卵巢癌细胞系，如OVCAR3、OVCA-432、OVCA-433和CAOV3的细胞表面上表达的MUC16。

在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物与MUC16蛋白或其片段的至少一种等位基因变体交叉反应。在一些实施例中，当与天然存在的MUC16或其片段相比时，等位基因变体具有至多约30，如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个氨基酸取代中的任一者，如保守氨基酸取代。在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物不与MUC16蛋白或其片段的任何等位基因变体交叉反应。

在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物与MUC16蛋白的至少一种物种间变体交叉反应。在一些实施例中，例如，MUC16蛋白或其片段是人MUC16，并且MUC16蛋白或其片段的物种间变体是其小鼠或大鼠变体。在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物不与MUC16蛋白的任何物种间变体交叉反应。

结合亲和力可以用K_d、K_off、K_on或K_a表示。如本文所使用的术语“K_off”旨在是指免疫球蛋白相关组合物从免疫球蛋白相关组合物/抗原复合物中解离的解离速率常数，如由动力学选择装置所确定的。如本文所使用的术语“K_on”旨在是指免疫球蛋白相关组合物与抗原缔合形成免疫球蛋白相关组合物/抗原复合物的缔合速率常数。如本文所使用的术语平衡解离常数“K_d”是指特定免疫球蛋白相关组合物-抗原相互作用的解离常数，并且描述了在平衡时占据免疫球蛋白相关组合物分子的溶液中存在的所有抗体结合结构域的一半所需的抗原的浓度，并且等于K_off/K_on。Kd的测量以所有结合剂在溶液中为前提。在免疫球蛋白相关组合物被束缚于细胞壁的情况下，例如被束缚于酵母表达系统中，对应的平衡速率常数表示为EC50，其给出了K_d的良好近似值。亲和力常数K_a是解离常数K_d的倒数。

解离常数(K_d)用作示出抗体部分对抗原的亲和力的指标。例如，根据用户手册和附带的试剂盒，通过使用用各种标志物药剂标记的免疫球蛋白相关组合物的Scatchard方法，以及通过使用Biacore(由安玛西亚生物科学公司(Amersham Biosciences)制造)，通过表面等离子体共振分析生物分子相互作用，可以进行简单的分析。使用这些方法得到的K_d值以M(Mols)为单位表示。与靶标特异性结合的免疫球蛋白相关组合物的K_d可以例如≤10^{- 7}M、≤10^-8M、≤10^-9M、≤10^-10M、≤10^-11M、≤10^-12M或≤10^-13M。

免疫球蛋白相关组合物的结合特异性可以通过本领域已知的方法进行实验确定。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIAcore-测试和肽扫描。在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物的结合亲和力通过测试抗MUC16免疫球蛋白相关组合物对在表面上表达MUC16的细胞(例如，HepG2细胞)的结合亲和力来测量。

在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物以约10^-7M至约10^-13M(如约10^-7M至约10^-13M、约10^-9M至约10^-13M或约10^-10M至约10^-12M)的K_d与靶MUC16(例如，MUC16^c114)特异性结合。因此，在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物与靶MUC16(例如，MUC16^c114)之间的结合的K_d为约10^-7M至约10^-13M、约1×10^-7M至约5×10^-13M、约10^-7M至约10^{- 12}M、约10^-7M至约10^-11M、约10^-7M至约10^-10M、约10^-7M至约10^-9M、约10^-8M至约10^-13M、约1×10^-8M至约5×10^-13M、约10^-8M至约10^-12M、约10^-8M至约10^-11M、约10^-8M至约10^-10M、约10^-8M至约10^{- 9}M、约5×10^-9M至约1×10^-13M、约5×10^-9M至约1×10^-12M、约5×10^-9M至约1×10^-11M、约5×10^-9M至约1×10^-10M、约10^-9M至约10^-13M、约10^-9M至约10^-12M、约10^-9M至约10^-11M、约10^-9M至约10^-10M、约5×10^-10M至约1×10^-13M、约5×10^-10M至约1×10^-12M、约5×10^-10M至约1×10^-11M、约10^-10M至约10^-13M、约1×10^-10M至约5×10^-13M、约1×10^-10M至约1×10^-12M、约1×10^-10M至约5×10^-12M、约1×10^-10M至约1×10^-11M、约10^-11M至约10^-13M、约1×10^-11M至约5×10^-13M、约10^{- 11}M至约10^-12M或约10^-12M至约10^-13M。

抗Muc16免疫球蛋白相关组合物的功能活性。在某些实施方案中，本文所描述的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物在体外抑制重组表达MUC16多肽(例如，MUC16 c114)的细胞的基质胶侵袭。在某些实施例中，重组表达糖基化的MUC16 c114的细胞是SKOV3细胞。在某些实施例中，MUC16多肽被糖基化。

在某些实施例中，MUC16多肽在SEQ ID NO:3的氨基酸残基Asn1、Asn24和Asn30(在Yin和Lloyd(2001)《生物化学杂志》276:27371-27375中也分别被称为Asn1777、Asn1800和Asn1806)处被N-糖基化。在某些实施例中，糖基化包括N连接的壳二糖。在某些实施例中，糖基化由N连接的壳二糖组成。在某些实施例中，与其中细胞用对照抗体(例如，不靶向MUC16的抗体)处理的细胞的体外基质胶侵袭相比，基质胶侵袭被抑制至少1.25、1.5、1.75、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在某些实施例中，与其中细胞用对照抗体(例如，不靶向MUC16的抗体)处理的细胞的体外基质胶侵袭相比，基质胶侵袭被抑制约1.25、1.5、1.75、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。

本领域技术人员已知确定抗MUC16免疫球蛋白相关组合物介导的基质胶侵袭的抑制的测定。例如，可以从马萨诸塞州的BD生物科学公司(BD Biosciences,MA)购买BDBioCoat^TMMatrigel^TM侵袭插入物或腔室(24孔板中的目录号354480)和对照插入物(24孔板中的目录号354578)。可以按照制造商的方案进行基质胶侵袭测定。简而言之，使24孔板中的基质凝胶腔室(储存在-20℃下)和对照插入物(储存在4℃下)达到室温。在37℃5％ CO₂湿润温育箱中，用0.5mL的插入物中的无血清培养基将两个插入物以及24孔板的外孔再水合2小时。培养的SKOV3细胞用胰蛋白酶消化并用培养基洗涤。将一百万个细胞分离到另一个离心管中并用无血清培养基洗涤3次。这些细胞随后在0.5mL无血清培养基中被调整至5,000个细胞。去除再水合的插入物中的培养基，并将插入物转移到新的24孔板中，所述孔板含有0.75mL的10％胎牛血清(FBS)，所述孔中含有用作化学引诱剂的培养基。立即地，将0.5mL的无血清培养基中的细胞(5,000个细胞)添加到插入物中。应适当小心以确保插入物和外孔中没有滞留气泡。将24孔板在37℃5％ CO₂湿润温育箱中温育48小时。在温育之后，通过将棉签插入到基质胶或对照插入物中进行“擦洗”并在膜表面上移动棉签尖端的同时轻轻施加压力，从膜的上表面去除非侵入性细胞。用第二棉签重复擦洗，所述第二棉签用培养基湿润。然后将插入物在含有蒸馏水中的0.5mL的0.5％结晶紫染色剂的新24孔板中染色30分钟。染色后，将插入物在3烧杯蒸馏水中冲洗，以去除多余的染色剂。将插入物在新的24孔板中风干。在200倍放大的倒置显微镜下手工计数侵入的细胞。对三份膜的几个区域进行计数并记录在图中。

在某些实施例中，本文所描述的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物能够在小鼠模型研究中抑制或减少转移、抑制肿瘤生长或诱导肿瘤消退。例如，可以将肿瘤细胞系引入到无胸腺裸鼠中，并且可以向无胸腺鼠一次或多次施用本文所描述的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物，并且可以在数周和/或数月的时间断内监测注射的肿瘤细胞的肿瘤进展。在一些情况下，向无胸腺裸鼠施用抗MUC16免疫球蛋白相关组合物可以在引入肿瘤细胞系之前发生。在某些实施例中，表达MUC16 c114的SKOV3细胞用于本文所描述的小鼠异种移植模型。

在一些实施例中，与模拟处理的小鼠相比，本文所描述的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物在小鼠模型中抑制肿瘤生长或诱导肿瘤消退至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％，如通过本文所描述的方法所评估的或本领域技术人员已知的。在一些实施例中，与模拟处理的小鼠相比，本文所描述的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物在小鼠模型中抑制肿瘤生长或诱导肿瘤消退至少约25％或35％，任选地约75％，如通过本文所描述的方法所评估的或本领域技术人员已知的。在一些实施例中，与模拟处理的小鼠相比，本文所描述的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物在小鼠模型中抑制肿瘤生长或诱导肿瘤消退至少约1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文所描述的方法所评估的或本领域技术人员已知的。模拟处理的小鼠可以例如用磷酸盐缓冲盐水或对照(例如，抗IgG抗体)处理。

确定肿瘤生长抑制或肿瘤消退可以例如通过在一段时间内监测肿瘤大小，如通过可触知肿瘤的物理测量或其它视觉检测方法来评估。例如，可以产生肿瘤细胞系以重组表达可视化剂，如绿色荧光蛋白(GFP)或荧光素酶，然后可以通过显微镜进行GFP的体内可视化，并且可以通过向异种移植小鼠施用荧光素酶底物并检测由于荧光素酶处理荧光素酶底物而产生的发光来进行荧光素酶的体内可视化。GFP或荧光素酶的检测程度或水平与异种移植小鼠中的肿瘤的大小相关。

在某些实施例中，与模拟处理的小鼠相比，本文所描述的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物可以增加肿瘤异种移植模型中的动物的存活率。在一些实施例中，与模拟处理的小鼠相比，本文所描述的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物将小鼠在肿瘤异种移植模型中的存活率提高至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文所描述的方法所评估的或本领域技术人员已知的。在一些实施例中，与肿瘤异种移植模型中的模拟处理的小鼠相比，本文所描述的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物将小鼠在肿瘤异种移植模型中的存活率增加至少约25％或35％，任选地约75％，如通过本文所描述的方法所评估的或本领域技术人员已知的。在一些实施例中，与肿瘤异种移植模型中的模拟处理的小鼠相比，本文所描述的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物将小鼠在肿瘤异种移植模型中的存活率提高至少约1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文所描述的方法所评估的或本领域技术人员已知的。例如，可以通过绘制在肿瘤细胞系注射之后存活小鼠的数量对时间(例如，数天或数周)的存活率曲线来确定存活率。模拟处理的小鼠可以例如用磷酸盐缓冲盐水或对照(例如，抗IgG抗体)处理。

在某些实施例中，当细胞与抗MUC16免疫球蛋白相关组合物接触时，本文所描述的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物被内化到表达MUC16多肽的细胞中。当涉及被细胞内化的分子时，“内化的”或“内化”是指与细胞膜的细胞外表面接触的分子穿过细胞膜到达细胞膜的细胞内表面和/或进入细胞质。在某些实施例中，重组表达糖基化的MUC16 c114的细胞是SKOV3细胞。在某些实施例中，MUC16 c114的糖基化形式例如在SEQ ID NO:3的Asn1、Asn24和Asn30(在Yin和Lloyd(2001)《生物化学杂志》276:27371-27375中也分别被称为Asn1777、Asn1800和Asn1806)处被N-糖基化。在某些实施例中，糖基化包括N连接的壳二糖。在某些实施例中，糖基化由N连接的壳二糖组成。

确定本文所描述的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物内化到细胞中的测定，例如使用放射性标记的抗体是本领域技术人员已知的。例如，可以在表达MUC16 c114的SKOV3细胞上研究⁸⁹Zr标记的抗体的内化。简而言之，将大约1×10⁵个细胞接种于12孔板中并在37℃5％ CO₂温育箱中温育过夜。将一定体积的放射性标记的蛋白质添加到每个孔中并将板在37℃和4℃下温育1、5、12和24小时。在每个温育期之后，收集培养基并用1mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗细胞。通过在4℃下用100mM甘氨酸(1:1，pH 3.5)在1mL的100mM乙酸中洗涤细胞来收集表面结合活性。然后用1mL的1MNaOH溶解粘附的细胞。收集每次洗涤并计算其活性。最后一次洗涤的活性与所有洗涤的总活性的比率用于确定内化的％。在某些实施例中，测定在37℃下进行。在某些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物在与抗MUC16免疫球蛋白相关组合物一起温育的至少1％、2％、3％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的细胞中被内化。在某些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物在与抗MUC16免疫球蛋白相关组合物一起温育的约1％、2％、3％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的细胞中被内化。在某些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物在细胞与抗MUC16免疫球蛋白相关组合物接触的1、2、3、4、8、12、16、20或24小时内被内化。

核酸。还考虑了编码抗MUC16免疫球蛋白相关组合物的核酸分子。在一些实施例中，编码本文所描述的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物的核酸(或核酸集)可以进一步包括编码肽标签(如蛋白质纯化标签，例如His-标签、HA标签)的核酸序列。

本文还考虑了包括抗MUC16免疫球蛋白相关组合物的分离的宿主细胞、编码抗MUC16免疫球蛋白相关组合物的多肽组分的分离的核酸或包括编码本文所描述的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物的多肽组分的核酸的载体。

本申请还包含这些核酸序列的变体。例如，变体包含与编码抗MUC16免疫球蛋白相关组合物的核酸序列杂交的核苷酸序列(如抗MUC16抗体，例如全长抗MUC16抗体、其抗原结合片段或本申请的抗MUC16抗体部分，至少在中等严格的杂交条件下)。

本发明技术还提供了本发明技术的核酸插入在其中的载体。

简而言之，编码抗MUC16免疫球蛋白相关组合物的天然或合成核酸表达抗MUC16免疫球蛋白相关组合物可通过将核酸插入到合适的表达载体中来实现，使得核酸与5'和3'调节元件可操作地连接，包含例如启动子(例如，淋巴细胞特异性启动子)和3'非翻译区(UTR)。所述载体可以适于在真核宿主细胞中进行复制和整合。典型的克隆和表达载体含有用于调节期望的核酸序列的表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本公开的核酸也可以用于使用标准基因递送方案来进行核酸免疫和基因疗法。用于基因递送的方法在本领域是已知的。参见例如美国专利第5,399,346号、第5,580,859号、第5,589,466号，所述美国专利通过引用以其整体并入本文。在一些实施例中，本发明技术提供了基因疗法载体。

可以将核酸克隆到多种类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，所述载体包含但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别关注的载体包含表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域众所周知的，并且例如在Green和Sambrook等人(2013,《分子克隆：实验室手册》,纽约冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory,New York))以及其它病毒学和分子生物学手册中描述。可用作载体的病毒包含但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中有复制功能的起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一种或多种可选标志物(参见例如，WO 01/96584；WO 01/29058；以及美国专利第6,326,193号)。

已经开发了多种基于病毒的系统用于基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术，将选择的基因插入载体中，并且包装到逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并体内或离体递送到受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施例中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一些实施例中，使用慢病毒载体。源自如慢病毒等逆转录病毒的载体是适于实现长期基因转移的工具，因为其允许转基因的长期稳定整合以及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体具有优于源自如鼠白血病病毒等肿瘤逆转录病毒的载体的附加优势，因为慢病毒载体可以转导如肝细胞等非增殖细胞。其还具有低免疫原性的附加优点。

另外的启动子元件，例如增强子调节转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp的区中，但是许多启动子最近已显示出也在起始位点下游含有功能元件。启动子元件之间的间距通常是灵活的，使得当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加至50bp。

适合的启动子的一个实例是即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这个启动子序列是能够驱动与其操作性地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。适合的启动子的另一个实例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包含但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)立即早期启动子、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcomavirus)启动子、以及人类基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明技术不应限于使用组成型启动子。还考虑了诱导型启动子作为本发明技术的一部分。使用诱导型启动子提供了能够在期望此类表达时开启与其操作性地连接的多核苷酸序列的表达或者在不期望表达时关闭所述表达的分子开关。诱导型启动子的实例包含但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物的表达是可诱导的。在一些实施例中，编码抗MUC16免疫球蛋白相关组合物的核酸序列与诱导型启动子，包含本文所描述的任何诱导型启动子可操作地连接。

诱导型启动子

使用诱导型启动子提供了能够在期望此类表达时开启与其操作性地连接的多核苷酸序列的表达或者在不期望表达时关闭所述表达的分子开关。用于真核细胞的示例性诱导型启动子系统包含但不限于激素调节元件(参见例如Mader,S.和White,J.H.《美国国家科学院院刊》90:5603-5607(1993))、合成配体调节元件(参见例如Spencer,D.M.等人1993)《科学》262:1019-1024)和电离辐射调节元件(参见例如Manome,Y.等人《生物化学(Biochemistry)》32:10607-10613(1993)；Datta,R.等人,《美国国家科学院院刊》89:1014-10153(1992))。用于体外或体内哺乳动物系统的另外的示例性诱导型启动子系统在Gingrich等人,《神经科学年度综述(Annual Rev.Neurosci)》21:377-405(1998)中综述。在一些实施例中，用于表达抗MUC16免疫球蛋白相关组合物的诱导型启动子系统是Tet系统。在一些实施例中，用于表达抗MUC16免疫球蛋白相关组合物的诱导型启动子系统是来自大肠杆菌的lac阻遏物系统。

用于本发明技术的示例性诱导型启动子系统是Tet系统。此类系统基于Gossen等人,(1993)描述的Tet系统。在示例性实施例中，所关注的多核苷酸受包括一个或多个Tet操作子(TetO)位点的启动子控制。在失活状态下，Tet阻遏物(TetR)将与TetO位点结合并抑制从启动子的转录。在活性状态下，例如，在存在诱导剂如四环素(Tc)、脱水四环素、多西环素(Dox)或其活性类似物的情况下，诱导剂使得TetR从TetO释放，由此允许转录发生。多西环素是抗生素四环素家族的成员，化学名称为1-二甲基氨基-2,4a,5,7,12-五羟基-11-甲基-4,6-二氧代-1,4a,11,11a,12,12a-六氢四环六氢并四苯-3-甲酰胺。

在一个实施例中，TetR被密码子优化用于在哺乳动物细胞，例如鼠或人细胞中表达。由于遗传密码的简并性，大多数氨基酸由多于一个密码子编码，允许给定核酸的核苷酸序列发生实质性变化，而所述核酸编码的氨基酸序列没有任何改变。然而，许多生物体展现出密码子使用的差异，也被称为“密码子偏倚度”(即，对给定氨基酸使用特定密码子的偏倚度)。密码子偏倚度通常与特定密码子的主要tRNA种类的存在相关，这继而增加了mRNA翻译的效率。因此，可以通过密码子优化来定制源自特定生物体(例如，原核生物)的编码序列，用于提高在不同生物体(例如，真核生物)中的表达。

Tet系统的其它具体变化包含以下“Tet-Off”和“Tet-On”系统。在Tet-Off系统中，转录在存在Tc或Dox的情况下是失活的。在该系统中，由与来自单纯疱疹病毒的VP16的强反式激活结构域融合的TetR组成的四环素控制的反式激活因子蛋白(tTA)调节靶核酸的表达，所述靶核酸在四环素应答性启动子元件(TRE)的转录控制下。TRE由与启动子(通常是源自人巨细胞病毒(hCMV)立即早期启动子的最小启动子序列)融合的TetO序列串联体组成。在不存在Tc或Dox的情况下，tTA与TRE结合并激活靶基因的转录。在存在Tc或Dox的情况下，tTA不能与TRE结合，并且靶基因的表达保持无活性。

相反地，在Tet-On系统中，转录在存在Tc或Dox的情况下是有活性的。Tet-On系统基于反向四环素控制的反式激活因子rtTA。像tTA一样，rtTA是由TetR阻遏物和VP16反式激活结构域组成的融合蛋白。然而，TetR DNA结合部分中的四个氨基酸变化改变rtTA的结合特性，使得其只能在存在Dox的情况下识别靶转基因的TRE中的tetO序列。因此，在Tet-On系统中，TRE调节的靶基因的转录仅在存在Dox的情况下被rtTA刺激。

另一个诱导型启动子系统是来自大肠杆菌的lac阻遏物系统(参见Brown等人,《细胞(Cell)》49:603-612(1987))。lac阻遏物系统通过调节与包括lac操作子(lacO)的启动子可操作地连接的所关注的多核苷酸的转录来发挥功能。lac阻遏物(lacR)与LacO结合，由此阻止所关注的多核苷酸的转录。所关注的多核苷酸的表达由合适的诱导剂诱导，例如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。

为了评估多肽或其部分的表达，要引入到细胞中的表达载体还可以含有可选标志物基因或报告基因或两者，以促进从试图通过病毒载体转染或感染的细胞的群体中鉴定和选择表达细胞。在其它方面，可选标志物可以携带在单独的DNA片段上并在共转染程序中使用。可选标志物和报告基因两者均可以侧接适当的调节序列以使得能够在宿主细胞中表达。有用的可选标志物包含例如抗生素抗性基因，如neo等。

报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和评价调节序列的功能。通常，报告基因是不存在于受体生物或组织中或不由受体生物或组织表达并且编码对其表达表现为通过一些易于检测到的性质(例如，酶促活性)的多肽的基因。在已经将DNA引入到受体细胞中后的适合时间处测定报告基因的表达。适合的报告基因可以包含对荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶进行编码的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tel等人,2000《欧洲生化学会联合会快报》479:79-82)。适合的表达系统是众所周知的，并且可以使用已知技术制备或商购获得。通常，将具有最小5'侧翼区并示出最高水平的报告基因表达的构建体鉴定为启动子。此类启动子区可以与报告基因连接并用于评价药剂调节启动子驱动的转录的能力。

在一些实施例中，提供了编码本文所描述的任何抗MUC16免疫球蛋白相关组合物的核酸。在一些实施例中，核酸包括一个或多个编码本文所描述的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物的重链和轻链的核酸序列。在一些实施例中，所述一个或多个核酸序列中的每一个包含在单独的载体中。在一些实施例中，至少一些核酸序列包含在同一载体中。在一些实施例中，所有的核酸序列包含在同一载体中。载体可以选自例如由哺乳动物表达载体和病毒载体(如源自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒的载体)组成的组。

将基因引入细胞中并进行表达的方法是本领域已知的。在表达载体的上下文中，载体可以通过本领域的任何方法容易地引入到宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物手段转移到宿主细胞中。

用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的物理方法包含磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、微注射、电穿孔等。用于产生包括载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域众所周知的。参见例如Green和Sambrook(2013,《分子克隆：实验室手册》,纽约冷泉港实验室)。在一些实施例中，通过磷酸钙转染将多核苷酸引入到宿主细胞中。

用于将所关注的多核苷酸引入到宿主细胞中的生物方法包含使用DNA和RNA载体。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体已成为将基因插入到哺乳动物，例如，人细胞中的最广泛使用的方法。其它病毒载体可以源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒1、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如美国专利第5,350,674号和第5,585,362号。

用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的化学手段包含胶分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒以及包含水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体的基于脂质的系统。用作体外和体内递送媒剂的示例性胶态系统是脂质体(例如人工膜囊泡)。

在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。考虑使用脂质调配物将核酸引入到宿主细胞中(体外、离体或体内)。另一方面，核酸可以与脂质缔合。可以将与脂质缔合的核酸包封在脂质体的含水内部、散布在脂质体的脂质双层、经由与脂质体和寡核苷酸二者缔合的连接分子与脂质体连接、捕获在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质合并、作为脂质中的悬浮液而含有、含有微团或与微团复合、或以其它方式与脂质缔合。与脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体缔合的组合物不限于溶液中的任何具体结构。例如，所述组合物可以按以下存在：双层结构、微团、或“塌陷”结构。所述组合物还可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或性状并不均匀的聚集体。脂质是可以是天然存在的脂质或合成脂质的脂肪物质。例如，脂质包含在细胞质中天然存在的脂肪滴，以及含有长链脂肪烃的化合物及其衍生物，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇、和醛的类别。

无论用于将外源核酸引入到宿主细胞中或以其它方式将细胞暴露于本发明技术的抑制剂的方法如何，为了证实重组DNA序列存在于宿主细胞中，可以进行多种测定。此类测定包含例如本领域技术人员众所周知的“分子生物学”测定，如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，如例如通过免疫学方法(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所描述的测定来检测特定肽的存在或不存在，以鉴定落入本发明技术的范围内的药剂。

抗MUC16免疫球蛋白相关组合物和抗MUC16抗体部分的制备。在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物是单克隆抗体或源自单克隆抗体。在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物包括来自单克隆抗体的V_H和V_L结构域或其变体。在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物进一步包括来自单克隆抗体的C_H1和C_L结构域或其变体。可以制备单克隆抗体，例如使用本领域已知的方法，包含杂交瘤方法、噬菌体展示方法或使用重组DNA方法。另外地，本文描述了示例性噬菌体展示方法。

在杂交瘤法中，仓鼠、小鼠或其它适当的宿主动物典型地用免疫剂免疫以引发产生或能够产生将会与免疫剂特异性地结合的抗体的淋巴细胞。可替代地，淋巴细胞可以在体外免疫。免疫剂可以包含所关注的蛋白质的多肽或融合蛋白。通常，如果期望人来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，或者如果期望非人哺乳动物来源的细胞，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用如聚乙二醇等合适的融合剂使淋巴细胞与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，具体地啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以在合适的培养基中培养，所述培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的永生化细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常将包含阻止缺乏HGPRT的细胞的生长的次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)。

在一些实施例中，永生化细胞系有效融合，支持所选抗体产生型细胞稳定地高水平表达抗体并且对如HAT培养基等培养基敏感。在一些实施例中，永生化细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，其可以从例如加利福尼亚州圣地亚哥的Salk研究所细胞分配中心(SalkInstitute Cell Distribution Center,San Diego,California)和弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,Virginia)获得。还已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。

然后可以测定培养杂交瘤细胞的培养基中针对多肽的单克隆抗体的存在。可以通过免疫沉淀或通过体外结合测定，如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)来确定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。此类技术和测定在本领域中是已知的。单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson和Pollard的Scatchard分析,《分析生物化学(Anal.Biochem.)》,107:220(1980)来确定。

在鉴定了期望的杂交瘤细胞之后，可以通过有限稀释程序对克隆进行亚克隆，并通过标准方法进行生长。Goding,同上。用于此目的的合适的培养基包含，例如，杜氏改良伊氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)和RPMI-1640培养基。可替代地，杂交瘤细胞可以在哺乳动物中作为腹水在体内生长。

通过如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法等常规免疫球蛋白纯化程序可以将由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基或腹水液中分离或纯化。

在一些实施例中，根据本文所描述的任何抗MUC16免疫球蛋白相关组合物，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物包括来自选自抗体文库(如呈递scFv或Fab片段的噬菌体文库)的克隆的序列。可以通过从组合文库中筛选具有一种或多种期望的活性的抗体片段来鉴定克隆。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库，并从此类文库中筛选具有期望的结合特性的抗体。此类方法在例如Hoogenboom等人,《分子生物学方法(Methods inMolecular Biology)》178:1-37(O'Brien等人编辑,新泽西州托托瓦的人权出版社(HumanPress,Totowa,N.J.),2001)中综述并在例如以下中进一步描述：McCafferty等人,《自然》348:552-554；Clackson等人,《自然》352:624-628(1991)；Marks等人,《分子生物学杂志》222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,《分子生物学方法》248:161-175(Lo编辑,新泽西州托托瓦的人权出版社,2003)；Sidhu等人,《分子生物学杂志》338(2):299-310(2004)；Lee等人,《分子生物学杂志》340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,《美国国家科学院院刊》101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等人,《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》284(1-2):119-132(2004)。

在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆V_H和V_L基因的储库，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以从所述噬菌体文库中筛选抗原结合噬菌体，如Winter等人,《免疫学年度评论(Ann.Rev.Immunol.)》,12:433-455(1994)中所描述的。噬菌体通常展示抗体片段，作为scFv片段或者作为Fab片段。来自免疫来源的文库提供了针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。可替代地，可以克隆天然储库(例如，来自人)，以提供针对广泛的非自身抗原以及自身抗原的单一抗体来源，而无需任何免疫，如Griffiths等人,《欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J)》,12:725-734(1993)中所描述的。最后，通过从干细胞克隆未重排的V-基因片段，并且使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变CDR3区并在体外完成重排，也可以合成制备天然文库，如Hoogenboom和Winter,《分子生物学杂志》,227:381-388(1992)中所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包含，例如：美国专利第5,750,373号以及美国专利公开第2005/0079574号、第2005/0119455号、第2005/0266000号、第2007/0117126号、第2007/0160598号、第2007/0237764号、第2007/0292936号和第2009/0002360号。

抗MUC16免疫球蛋白相关组合物可以使用噬菌体展示来从文库中筛选对靶MUC16(例如，MUC16^c114)具有特异性的抗MUC16抗体部分的而制备。文库可以是具有至少1×10⁹个(如至少约1×10⁹、2.5×10⁹、5×10⁹、7.5×10⁹、1×10¹⁰、2.5×10¹⁰、5×10¹⁰、7.5×10¹⁰或1×10¹¹个中的任一者)独特人抗体片段的多样性的人scFv噬菌体展示文库。在一些实施例中，文库是由从来自健康供体的人PMBC和脾脏中提取的DNA构建的天然人文库，涵盖所有人重链和轻链亚家族。在一些实施例中，文库是由从PBMC中提取的DNA构建的天然人文库，所述PBMC分离自患有各种疾病的患者，如患有自身免疫性疾病的患者、癌症患者和患有感染性疾病的患者。在一些实施例中，文库是半合成人文库，其中重链CDR3是完全随机化的，其中所有氨基酸(除了半胱氨酸)同样可能存在于任何给定位置(参见例如Hoet,R.M.等人,《自然生物技术》23(3):344-348,2005)。在一些实施例中，半合成人文库的重链CDR3的长度为约5至约24个(如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个中的任一者)氨基酸。在一些实施例中，文库是全合成噬菌体展示文库。在一些实施例中，文库是非人噬菌体展示文库。

以高亲和力与靶MUC16(例如，MUC16^c114)结合的噬菌体克隆可以通过噬菌体与靶MUC16的迭代结合来选择，所述靶MUC16与固相载体(例如，用于溶液淘选的珠粒或用于细胞淘选的哺乳动物细胞)结合，随后去除未结合的噬菌体并洗脱特异性结合的噬菌体。然后将结合的噬菌体克隆洗脱并用于感染合适的宿主细胞，如大肠杆菌XL1-Blue，用于表达和纯化。在细胞淘选的实例中，将在细胞表面过度表达MUC16的HEK293细胞与噬菌体文库混合，之后收集细胞并洗脱结合的克隆，并用于感染合适的宿主细胞，用于表达和纯化。可以用溶液淘选、细胞淘选或两者的组合进行多轮(如约2、3、4、5、6或更多轮中的任一者)淘选，以富集与靶MUC16特异性结合的噬菌体克隆。可以通过本领域已知的任何方法，包含例如ELISA和FACS，测试富集的噬菌体克隆与靶MUC16的特异性结合。

单克隆抗体也可以通过重组DNA方法制备，如美国专利第4,816,567号中所描述的方法。编码本发明技术的单克隆抗体的DNA可以容易地分离，并且使用常规程序测序(例如，通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。如上文所描述的杂交瘤细胞或本发明技术的MUC16特异性噬菌体克隆可以作为此类DNA的来源。一旦分离，就可以将DNA置于表达载体中，然后将其转染到宿主细胞中，如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不以其它方式产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以获得在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。还可以通过以下对DNA进行修饰：例如，通过用编码序列取代人重链和轻链恒定结构域和/或框架区来代替同源性非人序列(美国专利第4,816,567号；Morrison等人,同上)或者通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价连接。此类非免疫球蛋白多肽可以取代本发明技术的免疫球蛋白相关组合物的恒定结构域，或者可以取代本发明技术的免疫球蛋白相关组合物的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生嵌合的二价免疫球蛋白相关组合物。

抗体可以是单价抗体。用于制备单价抗体的方法是本领域已知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和经修饰的重链的重组表达。重链通常在Fc区中的任何点处被截短，以防止重链交联。可替代地，相关的半胱氨酸残基被另一个氨基酸残基取代或缺失以防止交联。

体外方法也适合于制备单价抗体。消化抗体以产生其片段特别是Fab片段可以使用本领域已知的任何方法来完成。

具有期望的结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原组合位点)可以与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合优选地与包括至少部分的铰链区、CH2区和CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域融合。在一些实施例中，含有轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)存在于融合中的至少一个融合中。将编码免疫球蛋白重链融合和(如果需要)免疫球蛋白轻链的DNA插入到单独的表达载体中，并且共转染到合适的宿主生物体中。

Fc区变体。在一些实施例中，可以将一种或多种氨基酸修饰引入到本文所提供的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物的Fc区中，由此产生Fc区变体。在一些实施例中，Fc区变体具有增强的ADCC效应子功能，通常和与Fc受体(FcR)结合有关。在一些实施例中，Fc区变体的ADCC效应子功能降低。可以改变效应子功能的Fc序列变化或突变的实例很多。例如，WO00/42072和Shields等人,《生物化学杂志》9(2):6591-6604(2001)描述具有改善或减弱的与FcR的结合的抗体变体。这些公开的内容通过引用确切地并入本文。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是治疗性抗体对肿瘤细胞的作用的机制。ADCC是细胞介导的免疫防御，其中免疫系统的效应子细胞主动裂解靶细胞(例如，癌细胞)，其膜表面抗原已经被特异性抗体(例如，抗MUC16抗体)结合。典型的ADCC涉及通过抗体激活NK细胞。NK细胞表达作为Fc受体的CD16。这种受体识别与靶细胞的表面结合的抗体的Fc部分并与其结合。NK细胞的表面上最常见的Fc受体被称为CD16或FcγRIII。Fc受体与抗体的Fc区的结合使得NK细胞激活、溶细胞颗粒的释放以及随后的靶细胞凋亡。ADCC对肿瘤细胞杀伤的贡献可以用特异性测试来测量，所述特异性测试使用已经用高亲和力FcR转染的NK-92细胞。将结果与不表达FcR的野生型NK-92细胞进行比较。

在一些实施例中，本发明技术考虑了包括Fc区的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物变体，所述Fc区具有一些但不是全部的效应子功能，这使其成为抗MUC16免疫球蛋白相关组合物在体内的半衰期很重要，但某些效应子功能(如CDC和ADCC)不必要或有害的应用的理想候选者。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的降低/耗竭。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保免疫球蛋白相关组合物缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结于Ravetch和Kinet,《免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.)》9:457-492(1991)的第464页上的表3中。用于评估所关注分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于以下中：美国专利第5,500,362号(参见例如Hellstrom,I.等人,《美国国家科学院院刊》83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,《美国国家科学院院刊》82:1499-1502(1985)；美国专利第5,821,337号(参见Bruggemann,M.等人,《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》166:1351-1361(1987))。可替代地，可以采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定(加利福尼亚州山景城的细胞科技公司(CellTechnology,Inc.Mountain View,Calif.))；和CytoTox 96^TM非放射性细胞毒性测定(威斯康星州麦迪逊市的普洛麦格公司(Promega,Madison,Wis.)))。用于此类测定的有用的效应子细胞包含外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可以在体内，例如在如Clynes等人,《美国国家科学院院刊》95:652-656(1998)中公开的动物模型中评估所关注的抗体的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定以确认免疫球蛋白相关组合物不能与C1q结合并且因此缺乏CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人,《免疫学方法杂志》202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,《血液(Blood)》101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,《血液》103:2738-2743(2004))。还可以使用本领域已知的方法执行FcRn结合和体内清除/半衰期确定(参见例如，Petkova,S.B.等人,《国际免疫学(Int'l.Immunol.)》18(12):1759-1769(2006))。

效应子功能降低的抗体包含取代了Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个Fc区残基的抗体(美国专利第6,737,056号)。此类Fc突变体包含在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个氨基酸位置处有取代的Fc突变体，包含将残基265和297取代为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利第7,332,581号)。

描述了与FcR的结合改善的或减少的某些免疫球蛋白相关组合物变体。(参见例如美国专利第6,737,056号；WO 2004/056312和Shields等人,《生物化学杂志》9(2):6591-6604(2001)。)

在一些实施例中，提供了一种抗MUC16免疫球蛋白相关组合物变体，所述抗MUC16免疫球蛋白相关组合物变体包括变体Fc区，所述变体Fc区包括改善ADCC的一种或多种氨基酸取代。在一些实施例中，变体Fc区包括改善ADCC的一种或多种氨基酸取代，其中所述取代位于变体Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU编号)处。在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物变体在其变体Fc区中包括以下氨基酸取代：S298A、E333A和K334A。

在一些实施例中，在Fc区中进行使C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即，改善或减少)的改变，例如，如美国专利第6,194,551号、WO 99/51642和Idusogie等人,《免疫学杂志》164:4178-4184(2000)中描述的。

在一些实施例中，提供了一种抗MUC16免疫球蛋白相关组合物变体，所述抗MUC16免疫球蛋白相关组合物变体包括变体Fc区，所述变体Fc区包括增加半衰期和/或改善与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的一种或多种氨基酸取代。在US2005/0014934A1(Hinton等人)中描述了半衰期增加且与FcRn的结合改善的抗体。那些抗体包括其中具有改善Fc区与FcRn的结合的一种或多种取代的Fc区。此类Fc变体包含在以下Fc区残基中的一个或多个处具有取代的Fc变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc区残基434的取代(美国专利第7,371,826号)。关于Fc区变体的其它实例，还参见Duncan和Winter,《自然》322:738-40(1988)；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号；以及WO 94/29351。

考虑了包括本文所描述的任何Fc变体或其组合的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物(如全长抗MUC16抗体)。

糖基化变体。在一些实施例中，本文所提供的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物被改变以增加或降低抗MUC16免疫球蛋白相关组合物被糖基化的程度。通过改变抗MUC16免疫球蛋白相关组合物或其多肽部分的氨基酸序列，使得产生或去除一个或多个糖基化位点，可以方便地完成针对抗MUC16免疫球蛋白相关组合物的糖基化位点的添加或缺失。

当抗MUC16免疫球蛋白相关组合物包括Fc区时，可以改变与其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包括通常通过N键与Fc区的CH2结构域的Asn297连接的支链双触角寡糖。参见例如Wright等人,《生物技术趋势(TIBTECH)》,15:26-32(1997)。寡糖可以包含各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在双触角寡糖结构的“干”中与GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施例中，可以对本发明技术的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物中的寡糖进行修饰，以便产生具有某些改善的性质的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物变体。

与Fc的CH2结构域连接的N-聚糖是异质的。CHO细胞中产生的抗体或Fc融合蛋白被岩藻糖基转移酶活性岩藻糖基化。参见Shoji-Hosaka等人,《生物化学杂志》140:777-83(2006)。通常，在人血清中可以检测到小百分比的天然存在的去岩藻糖基化IgG。Fc的N-糖基化对于FcγR的结合是重要的；并且N-聚糖的无岩藻糖基化增加了Fc与FcγRIIIa的结合能力。增加的FcγRIIIa结合可以增强ADCC，这在期望细胞毒性的某些免疫球蛋白相关组合物治疗应用中是有利的。

在一些实施例中，当Fc介导的细胞毒性是不期望的时，增强的效应子功能可能是有害的。在一些实施例中，Fc片段或CH2结构域未被糖基化。在一些实施例中，CH2结构域中的N-糖基化位点被突变以防止糖基化。

在一些实施例中，提供了包括Fc区的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物变体，其中与Fc区连接的碳水化合物结构具有减少的岩藻糖或缺乏岩藻糖，这可以改善ADCC功能。具体地，本文考虑了抗MUC16免疫球蛋白相关组合物，其具有相对于野生型CHO细胞中产生的相同抗MUC16免疫球蛋白相关组合物上的岩藻糖的量的减少的岩藻糖。即，其特征在于具有比其将以其它方式由天然CHO细胞(例如，产生天然糖基化模式的CHO细胞，如含有天然FUT8基因的CHO细胞)产生时更低量的岩藻糖。在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物是其中其上少于约50％、40％、30％、20％、10％或5％的N-连接的聚糖包括岩藻糖的组合物。例如，此类抗MUC16免疫球蛋白相关组合物中的岩藻糖的量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。在一些实施例中，抗MUC16免疫球蛋白相关组合物是其中其上的N-连接的聚糖均不包括岩藻糖，即其中抗MUC16免疫球蛋白相关组合物完全不含岩藻糖，或不含岩藻糖或未去岩藻糖基化的组合物。岩藻糖的量是通过计算Asn297处的相对于如通过MALDI-TOF质谱法测量的与Asn 297连接的所有糖结构(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)的总和的糖链内的岩藻糖的平均量确定的，例如，如WO 2008/077546中所描述的。Asn297是指位于Fc区中约位置297(Fc区残基的EU编号)处的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297还可以位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，即，位置294与300之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改进的ADCC功能。参见例如美国专利公开第US2003/0157108号(Presta,L.)；US2004/0093621(协和发酵工业株式会社(Kyowa Hakko KogyoCo.,Ltd))。与“去岩藻糖化”或“岩藻糖缺失型”免疫球蛋白相关组合物变体相关的出版物的实例包含：US2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人,《分子生物学杂志》336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人,《生物技术和生物工程(Biotech.Bioeng.)》87:614(2004)。能够产生去岩藻糖化抗体的细胞系的实例包含缺乏蛋白岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka等人,《生物化学与生物物理学集刊(Arch.Biochem.Biophys.)》249:533-545(1986)；美国专利申请第US2003/0157108A1号,Presta,L；以及WO 2004/056312 A1,Adams等人，尤其在实例11处)和基因敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、基因敲除CHO细胞(Yamane-Ohnuki等人,《生物技术和生物工程》87:614(2004)；Kanda,Y.等人,《生物技术和生物工程》,94(4):680-688(2006)；以及WO2003/085107)。

抗MUC16免疫球蛋白相关组合物变体进一步设置有二等分的寡糖，例如，其中与抗MUC16免疫球蛋白相关组合物的Fc区连接的双触角寡糖被GlcNAc二等分。此类抗MUC16免疫球蛋白相关组合物变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类免疫球蛋白相关组合物变体的实例描述于例如以下中：WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利第6,602,684号(Umana等人)；US2005/0123546(Umana等人)以及Ferrara等人,《生物技术与生物工程(Biotechnology and Bioengineering)》,93(5):851-861(2006)。还提供了在寡糖中有至少一个半乳糖残基与Fc区连接的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物变体。此类抗MUC16免疫球蛋白相关组合物变体可以具有改善的CDC功能。此类免疫球蛋白相关组合物变体描述于例如以下中：WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；以及WO1999/22764(Raju,S.)。

在一些实施例中，包括Fc区的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物变体能够与FcγRIII结合。在一些实施例中，包括Fc区的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物变体在存在人效应子细胞(例如，T细胞)的情况下具有ADCC活性，或者与包括人野生型IgG1Fc区的其它方面相同抗MUC16免疫球蛋白相关组合物相比，在存在人效应子细胞的情况下具有增加的ADCC活性。

半胱氨酸工程化变体。在一些实施例中，可能期望产生半胱氨酸工程化抗MUC16免疫球蛋白相关组合物，其中一个或多个氨基酸残基用半胱氨酸残基取代。在一些实施例中，取代的残基出现在抗MUC16免疫球蛋白相关组合物的可及位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基由此定位于抗MUC16免疫球蛋白相关组合物的可及位点处并可以用于将抗MUC16免疫球蛋白相关组合物缀合到如药物部分或连接子-药物部分等其它部分以产生抗MUC16免疫缀合物，如本文进一步描述的。半胱氨酸工程化的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物(如抗MUC16抗体或其抗原结合片段)可以如例如美国专利第7,521,541号中所描述的产生。

衍生物。在一些实施例中，可以进一步修饰本文所提供的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物以含有本领域中已知且容易获得的另外的非蛋白质部分。适合于抗MUC16免疫球蛋白相关组合物的衍生化的部分包含但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包含但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇以及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而可以在制造中具有优势。聚合物可以具有任何分子量并且可以是支链或非支链的。与抗MUC16免疫球蛋白相关组合物连接的聚合物的数量可以变化，并且如果连接多于一种聚合物，则所述聚合物可以是相同或不同的分子。用于衍生化的聚合物的数量和/或类型通常可以基于包含但不限于以下的考虑因素来确定：要改善的抗MUC16免疫球蛋白相关组合物的特定性质或功能、抗MUC16免疫球蛋白相关组合物衍生物是否将在定义的条件下在疗法中使用等。

在一些实施例中，提供了抗MUC16免疫球蛋白相关组合物与可以通过暴露于辐射而选择性地加热的非蛋白质部分的缀合物。在一些实施例中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人,《美国国家科学院院刊》102:11600-11605(2005))。辐射可以具有任何波长并且包含但不限于不损害普通细胞但将非蛋白质部分加热到抗MUC16免疫球蛋白相关组合物-非蛋白部分附近的细胞被杀死的温度的波长。

VEGF抑制剂

在胚胎发育和正常生长两者期间，以及在许多病理异常和疾病中，调节血管系统和其组分的生长和分化的网络中的中心通路是由血管内皮生长因子(“VEGF”)和VEGF的细胞受体(“VEGFR”)介导的。(参见G.Breier等人,《细胞生物学趋势(Trends in CellBiology)》,6:454-456(1996))。

VEGF是与血小板源性生长因子(“PDGF”)相关的二聚体、二硫键连接的46-kDa糖蛋白。其由正常细胞系和肿瘤细胞系产生；是内皮细胞选择性有丝分裂原；在体内测试系统(例如，兔角膜)中显示血管生成活性；对内皮细胞和单核细胞具有趋化性；并在内皮细胞中诱导纤溶酶原激活剂，所述内皮细胞参与毛细血管形成期间细胞外基质的蛋白水解降解。VEGF的许多亚型是已知的，虽然其表现出相当的生物活性，但分泌其的细胞类型和其肝素结合能力不同。另外，还有VEGF家族的其它成员，如胎盘生长因子(“PGF”)和VEGF-C。VEGF的细胞受体(VEGFR)是跨膜受体酪氨酸激酶，其特征在于具有七个免疫球蛋白样结构域的细胞外结构域和细胞内酪氨酸激酶结构域。已经表征了各种类型的VEGF受体，包含VEGFR-1(也被称为flt-1)、VEGFR-2(也被称为KDR)和VEGFR-3。

大量人肿瘤，尤其是神经胶质瘤和癌症表达高水平的VEGF和VEGFR。这导致一种假设，即肿瘤细胞释放的VEGF以旁分泌的方式刺激毛细血管的生长和肿瘤内皮的增殖，并通过改善的血液供应加速肿瘤生长。VEGF表达增加可以解释患有神经胶质瘤的患者的脑水肿的发生。VEGF有助于血管高通透性和水肿的形成。事实上，与许多其它生长因子的表达或施用相关的血管高通透性和水肿似乎是通过VEGF产生介导的。

炎性细胞因子刺激VEGF产生。缺氧导致许多组织中的VEGF的显著上调。因此，涉及梗塞、闭塞、局部缺血、贫血或循环障碍的情况通常引起VEGF/VPF介导的应答。血管高通透性、相关水肿、跨内皮交换改变和大分子外渗(通常伴有渗出)可以导致过度基质沉积、异常基质增生、纤维化等。因此，VEGF介导的高通透性可以显著导致具有这些病因学特征的病状。因此，这些血管生成调节因子已成为重要的治疗靶标。参见Hicklin和Ellis,《临床肿瘤学杂志(J.Clin Oncology)》,23:1011-1027(2005)。

大量VEGF抑制剂已在文献中描述，所述文献可以用于本公开的各个实施例中。VEGF抑制剂可以是小分子抑制剂、抑制性核酸(例如，siRNA、反义寡核苷酸、shRNA、sgRNA、核酶)或抗体或其抗原结合片段。

除了下文进一步详细描述的那些，在这方面可以使用的VEGF抑制剂在以下专利文档中描述：US2003/0105091、US2006/0241115、美国专利第5,521,184号、美国专利第5,770,599号、美国专利第5,990,141号、美国专利第6,235,764号、美国专利第6,258,812号、美国专利第6,515,004号、美国专利第6,630,500号、美国专利第6,713,485号、美国专利第5,792,825号和第6,025,688号、第WO2005/070891号、第WO 01/32651号、第WO 02/68406号、第WO 02/66470号、第WO 02/55501号、第WO 04/05279号、第WO 04/07481号、第WO 04/07458号、第WO 04/09784号、第WO 02/59110号、第WO 99/450029号、第WO 00/59509号、第WO 99/61422号、第WO 00/12089号、第WO 00/02871和第WO 01/37820号，所有这些专利以其整体并入本文，具体地与本文所描述的本发明技术中有用的VEGF抑制剂相关的部分。

示例性VEGF抑制剂包含但不限于利尼法尼(ABT-869，雅培公司(Abbott))、AEE-788(诺华公司(Novartis))(也被称为AE-788和NVP-AEE-788)、阿昔替尼(AG-13736，辉瑞公司(Pfizer))(也被称为AG-013736)、AG-028262(辉瑞公司)、血管抑制素(创远达公司(EntreMed))(也被称为CAS登记号86090-08-6、K1-4和rhu血管抑制素等)、Avastin^TM(基因技术公司(Genentech))(也被称为贝伐单抗、R-435、rhuMAB-VEGF和CAS登记号216974-75-3)、兰尼单抗(Lucentis，基因技术公司)、凡努西单抗、布洛赛珠单抗、hPV19、IBI305、AVE-8062(味之素公司(Ajinomoto Co.)和赛诺菲-安万特公司(Sanofi-aventis))(也被称为AC-7700和康普瑞汀A4类似物等)、西地尼布(AZD-2171，阿斯利康公司(AstraZeneca))、(拜耳股份公司(Bayer AG)和文石(Onyx))(也被称为CAS登记号284461-73-0、BAY-43-9006、raf激酶抑制剂、索拉非尼、索拉非尼类似物和IDDBCP150446)、BMS-387032(Sunesis公司(Sunesis)和百时美施贵宝(Bristol-Myers Squibb))(也被称为SNS-032和CAS登记号345627-80-7)、CEP-7055(瑟法隆(Cephalon)和赛诺菲-安万特公司)(也被称为CEP-11981和SSR-106462)、多韦替尼(CHIR-258，巨浪公司(Chiron))(也被称为CAS登记号405169-16-6、GFKI和GFKI-258)、CP-547632(OSI制药公司(OSIPharmaceuticals)和辉瑞公司)(也被称为CAS登记号252003-65-9)、CP-564959、乐伐替尼(E-7080，卫材公司(EisaiCo.))(也被称为CAS登记号417716-92-8和ER-203492-00)、帕唑帕尼(GW786034，葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline))、GW-654652(葛兰素史克公司)和密切相关的吲唑基嘧啶Kdr抑制剂、IMC-1C11(英克隆公司(ImClone))(也被称为DC-101和c-p1C11)、替伏扎尼(KRN-951，麒麟啤酒公司(Kirin Brewery Co.))和其它密切相关的喹啉-脲VEGF抑制剂、PKC-412(诺华公司)(也被称为CAS登记号120685-11-2、苯甲酰星形孢菌素、CGP-41251、米哚妥林(midostaurin)和STI-412)、PTK-787(诺华公司和拜耳先灵公司(Schering))(也被称为登记号212141-54-3和212142-18-2、PTK/ZK、PTK-787/ZK-222584、ZK-22584、VEGF-TKI、VEGF-RKI、PTK-787A、DE-00268、CGP-79787、CGP-79787D、瓦他拉尼、ZK-222584)和密切相关的苯胺酞嗪衍生物VEGF抑制剂、SU11248(苏根(Sugen)和辉瑞公司)(也被称为SU-11248、SU-011248、SU-11248J、和苹果酸舒尼替尼)、SU-5416(苏根和辉瑞公司/法玛西亚公司(Pharmacia))(也被称为CAS登记号194413-58-6、司马沙尼、204005-46-9)、奥兰替尼(SU-6668，苏根和大鹏(Taiho))(也被称为CAS登记号252916-29-3、SU-006668和TSU-68等)和WO-09948868、WO-09961422和WO-00038519(其通过引用整体并入本文)中描述的密切相关的VEGF抑制剂、VEGF Trap(再生元公司(Regeneron)和赛诺菲-安万特公司)(也被称为AVE-0005和全身性VEGF Trap等)和WO-2004110490(其通过引用整体并入本文)中描述的密切相关的VEGF抑制剂、沙利度胺(新基公司(Celgene))(也被称为CAS登记号50-35-1、沙利度胺(Synovir)、沙利度胺制药(Thalidomide Pharmion)和沙利度胺(Thalomid))、特西伐替尼(XL-647，伊克力西斯公司(Exelixis))(也被称为EXEL-7647)、XL-999(伊克力西斯公司)(也被称为EXEL-0999)、福林替尼(XL-880，伊克力西斯公司)(也被称为EXEL-2880)、凡德他尼(ZD-6474，阿斯利康公司)(也被称为CAS登记号443913-73-3、凡德他尼(Zactima)和AZD-6474)和密切相关的苯胺喹唑啉VEGF抑制剂和ZK-304709(拜耳先灵公司)(也被称为ZK-CDK、MTGI)以及其它密切相关的化合物，包含在WO-00234717、WO-02074742、WO-02100401、WO-00244148、WO-02096888、WO-03029223、WO-02092079和WO-02094814(其通过引用整体并入本文)中描述的靛玉红衍生物VEGF抑制剂。

在本发明技术的方法中有用的其它VEGF抑制剂包含：(a)US2003/0125339或美国专利第6,995,162号中描述的化合物，所述美国专利通过引用整体并入本文，具体地公开VEGF抑制剂(例如，4TBPPAPC)的部分；(b)US2003/0125339或US2003/0225106或美国专利第6,995,162号或美国专利第6,878,714号中描述的经取代的烷基胺衍生物，所述美国专利中的每一个通过引用整体并入本文，具体地公开VEGF抑制剂(例如，AMG 706)的部分；以及(c)US2006/0241115中描述的VEGF抑制剂，包含其中式IV的那些。

包含本发明技术的抗MUC16^c114×CD3多特异性免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF 抑制剂的调配物

本发明技术的药物组合物可以通过本领域众所周知的方法制造，如常规的制粒、混合、溶解、包封、冻干或乳化方法等。组合物可以以各种形式产生，包含颗粒、沉淀物或微粒、粉末，包含冷冻干燥、旋转干燥或喷雾干燥的粉末、非晶形粉末、片剂、胶囊、糖浆、栓剂、注射剂、乳剂、酏剂、悬浮液或溶液。调配物可以任选地含有适合于所需的特定剂型的溶剂、稀释剂以及其它液体媒剂、分散剂或悬浮助剂、表面活性剂、pH调节剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、稳定剂和防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。在某些实施例中，本文所公开的组合物被调配用于向如人等哺乳动物施用。

用于口服施用的液体剂型包含但不限于药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性化合物以外，液体剂型还可以含有本领域中常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、环糊精、二甲基甲酰胺、油(具体地，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨醇酐的脂肪酸酯和其混合物。除了惰性稀释剂，口服组合物还可以包含佐剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和香剂。

可注射制剂(例如，无菌可注射水性或油性悬浮液)可以根据已知技术、使用适合的分散剂或湿润剂和悬浮剂来调配。无菌可注射制剂还可以是肠胃外可接受的无毒稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如像1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的媒剂和溶剂中有水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发性油通常用作溶剂或悬浮培养基。出于此目的，可以采用任何温和的固定油，包含合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，使用如油酸等脂肪酸来制备可注射物。可注射调配物可以例如通过滤过细菌截留过滤器，或通过掺入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述无菌固体组合物可以在仅在使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射培养基中。调配用于肠胃外施用的组合物可以通过团注注射或定时推注来注射，或者可以通过连续输注来施用。

为了延长本公开的化合物的效果，通常期望减缓来自皮下或肌内注射的化合物的吸收。这可以通过使用水溶性差的晶体或非晶形材料的液体悬浮液来实现。由此，化合物的吸收速率取决于其溶解速率，所述溶解速率进而可以取决于晶体大小和晶型。可替代地，通过将化合物溶解或悬浮在油性媒剂中来实现肠胃外施用的化合物形式的延迟吸收。通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成化合物的微囊基质来制备可注射储库型(depot)形式。根据化合物与聚合物的比率以及所采用的特定聚合物的性质，可以对化合物释放速率进行控制。其它可生物降解的聚合物的实例包含聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储库型可注射调配物还通过将化合物截留在与人体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。

用于口服施用的固体剂型包含胶囊、片剂、丸剂、粉末和颗粒剂。在此类固体剂型中，活性化合物与以下混合：至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体，如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或a)填充剂或增充剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇以及硅酸；b)粘结剂，例如，羧甲纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、以及阿拉伯胶；c)保湿剂，如甘油；d)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐以及碳酸钠；e)溶液阻滞剂，如石蜡；f)吸收促进剂，如季铵化合物；g)湿润剂，例如，鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；h)吸附剂，如高岭土和膨润土；以及i)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠和其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包括如磷酸盐或碳酸盐等缓冲剂。

类似类型的固体组合物还可以用作软填充明胶胶囊和硬填充明胶胶囊中的填充剂，所述明胶胶囊使用如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂。片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣和外壳，如肠溶包衣、释放控制包衣和药物调配领域中所熟知的其它包衣来制备。所述剂型可以任选地含有乳浊剂并且其组成还可以使得所述剂型仅或者在肠道的特定部分中任选地以延迟的方式释放活性成分。可以使用的包埋组合物的实例包含聚合物质和蜡。

活性化合物还可以与如上所述的一种或多种赋形剂一起呈微包封形式。在此类固体剂型中，活性化合物可以与如蔗糖、乳糖或淀粉等至少一种惰性稀释剂混合。在正常的情况下，除了惰性稀释剂以外，此类剂型还可以包括另外的物质，例如压片润滑剂和其它压片助剂，如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包括缓冲剂。所述剂型可以任选地含有乳浊剂并且其组成还可以使得所述剂型仅或者在肠道的特定部分中任选地以延迟的方式释放活性成分。可以使用的包埋组合物的实例包含聚合物质和蜡。

施用模式和有效剂量

可以采用本领域技术人员已知的用于使细胞、器官或组织与抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂接触的任何方法。合适的方法包含体外、离体或体内方法。体内方法通常包含向哺乳动物，合适地人施用抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂，如本文所描述的那些。当用于体内疗法时，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂以有效量(即，具有期望的治疗效果的量)施用于受试者。剂量和剂量方案将取决于受试者的疾病症状的程度、特定抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂的特性，例如其治疗指数、受试者和受试者病史。

有效量可以在临床前试验和临床试验期间通过医生和临床医师熟悉的方法确定。可用于所述方法的有效量的抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂可以通过用于施用药物化合物的多种众所周知的方法中的任一种方法施用于有需要的哺乳动物。抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂可以全身或局部施用。

抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂可以掺入到药物组合物中以单独或组合施用于受试者，以便治疗或预防本文所描述的病症。此类组合物典型地包含活性剂和药学上可接受的载剂。如本文所使用的，术语“药学上可接受的载剂”包含与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂以及吸收延迟剂等。还可以将补充的活性化合物掺入到组合物中。

药物组合物通常被调配成与其预定施用途径相容。施用途径的实例包含肠胃外(例如，静脉内、皮内、腹膜内或皮下)、口服、吸入、经皮(局部)、眼内、离子电渗和经粘膜施用。用于肠胃外、皮内、皮下应用的溶液或悬浮液可以包含以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。可以用如盐酸或氢氧化钠等酸或碱调节pH。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。为了患者或治疗医师的方便，剂量调配物可以提供在含有治疗过程(例如，7天的治疗)的全部必要设备(例如，药物小瓶、稀释剂小瓶、注射器和针头)的试剂盒中。

在一些实施例中，本文所描述的抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂通过肠胃外途径或局部途径施用。

适合于可注射用途的药物组合物可以包含无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载剂包含生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(新泽西州帕西波尼市的巴斯夫公司(BASF,Parsippany,N.J.))或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，用于肠胃外施用的组合物必须是无菌的并且应具有达到易于注射的程度的流动性。所述载剂应当在制造和储存条件下是稳定的并且必须抵抗如细菌和真菌等微生物的污染作用而保存。

本文所描述的抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂可以包含载剂，所述载剂可以是溶剂或分散培养基，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及其合适的混合物。恰当的流动性可以例如通过使用如卵磷脂等包衣、在分散液的情况下通过维持所需的粒度、以及通过使用表面活性剂来维持。可以通过各种抗细菌剂以及抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞以及类似物质来防止微生物的作用。可以包含谷胱甘肽和其它抗氧化剂以防氧化。在许多情况下，组合物中包含等渗剂，例如糖，多元醇，如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现。

无菌可注射溶液可以通过将所需量的活性化合物根据需要与以上列举的成分中的一种或其组合一起并入适当溶剂中，随后过滤灭菌处理来制备。通常，分散液通过将活性化合物掺入到无菌媒剂中来制备，所述无菌媒剂含有基础分散培养基以及来自以上列举的那些成分的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，典型的制备方法包含真空干燥和冷冻干燥，所述真空干燥和冷冻干燥可以产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何另外的期望成分的粉末。

口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载剂。出于口服治疗性施用的目的，活性化合物可以掺入赋形剂并且以片剂、锭剂或胶囊剂例如明胶胶囊剂的形式使用。口服组合物还可以使用用作漱口水的液体载剂进行制备。可以包含药学上相容的粘结剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、糖衣片等可以含有以下成分中的任一种或具有类似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素，黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如海藻酸、淀粉羟基乙酸钠(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或斯特罗特斯(Sterotes)；助流剂，如胶态二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。

对于通过吸入施用，包含本发明技术的抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂的组合物可以从含有适合的推进剂，例如气体，如二氧化碳的加压容器或分配器或者从雾化器以气溶胶喷雾形式递送。此类方法包含在美国专利第6,468,798号中描述的那些。

本文所描述的本发明技术的抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂的全身施用也可以通过经粘膜或经皮方式进行。对于经粘膜或经皮施用，在调配物中使用适合于待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域中已知的，并且例如对于经粘膜施用，包含清洁剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻腔喷雾剂来完成。对于经皮施用，将活性化合物调配成如本领域通常已知的软膏剂、药膏剂、凝胶剂或乳膏剂。在一个实施例中，经皮施用可以通过离子电渗执行。

本发明技术的抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂可以在载剂系统中调配。载剂可以是胶体系统。胶体系统可以是脂质体、磷脂双层媒剂。在一个实施例中，治疗性抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂被包封在脂质体中，同时维持结构完整性。本领域技术人员将会理解，有多种制备脂质体的方法。(参见Lichtenberg等人,《生化分析方法(Methods Biochem.Anal.)》,33:337-462(1988)；Anselem等人,《脂质体技术(LiposomeTechnology)》,CRC出版社(CRC Press)(1993))。脂质体制剂可以延迟清除和增加细胞摄取(参见Reddy,《药物治疗年鉴(Ann.Pharmacother.)》,34(7-8):915-923(2000))。还可以将活性剂加载到由药学上可接受的成分制备的颗粒中，所述成分包含但不限于可溶性、不溶性、可渗透性、不可渗透性、可生物降解性或胃滞留性聚合物或脂质体。此类颗粒包含但不限于纳米颗粒、可生物降解性纳米颗粒、微粒、可生物降解性微粒、纳米球、可生物降解性纳米球、微球、可生物降解性微球、胶囊、乳液、脂质体、胶束和病毒载体系统。

载剂也可以是聚合物，例如可生物降解性、生物相容性聚合物基质。在一个实施例中，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂可以包埋在聚合物基质中，同时维持蛋白质完整性。所述聚合物可以是天然的，如多肽、蛋白质或多糖，或是合成的，如聚α-羟基酸。实例包含由例如胶原、纤连蛋白、弹性蛋白、乙酸纤维素、硝酸纤维素、多糖、纤维蛋白、明胶以及其组合制成的载剂。在一个实施例中，聚合物是聚乳酸(PLA)或共聚乳酸/乙醇酸(PGLA)。聚合物基质可以以多种形式和大小制备并分离，包含微球和纳米球。聚合物调配物可以延长治疗效果的持续时间。(参见Reddy,《药物治疗年鉴》,34(7-8):915-923(2000))。用于人生长激素(hGH)的聚合物调配物已经用于临床试验。(参见Kozarich和Rich,《化学生物学(Chemical Biology)》,2:548-552(1998))。

聚合物微球缓释调配物的实例描述于以下中：PCT公开WO 99/15154(Tracy等人)、美国专利第5,674,534号和第5,716,644号(两者为Zale等人)、PCT公开WO 96/40073(Zale等人)和PCT公开WO 00/38651(Shah等人)。美国专利第5,674,534号和第5,716,644号以及PCT公开WO 96/40073描述了含有促红细胞生成素颗粒的聚合物基质，所述促红细胞生成素颗粒用盐稳定以防止聚集。

在一些实施例中，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂用将保护抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂免于从体内快速消除的载剂制备，如控释调配物，包含植入物和微包封递送系统。可以使用可生物降解的生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。此类调配物可以使用已知的技术制备。这些材料还可以例如从阿尔扎公司(Alza Corporation)和新星制药有限公司(NovaPharmaceuticals,Inc.)商购获得。脂质体悬浮液(包含靶向具有针对细胞特异性抗原的单克隆抗体的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如，如美国专利第4,522,811号中所描述的。

也可以调配抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂以增强细胞内递送。例如，脂质体递送系统是本领域已知的，参见，例如Chonn和Cullis,“脂质体药物递送系统的最新进展(Recent Advances in Liposome DrugDelivery Systems)”,《生物技术当前述评(Current Opinion in Biotechnology)》6:698-708(1995)；Weiner,“用于蛋白质递送的脂质体：选择制造和开发过程(Liposomes forProtein Delivery:Selecting Manufacture and Development Processes)”,《免疫方法(Immunomethods)》,4(3):201-9(1994)；以及Gregoriadis,“用于药物递送的工程脂质体：进展和问题(Engineering Liposomes for Drug Delivery:Progress and Problems)”,《生物科技趋势(Trends Biotechnol.)》13(12):527-37(1995)。Mizguchi等人,《癌症快报(Cancer Lett.)》,100:63-69(1996)描述了一种融合脂质体将蛋白质在体内和在体外递送到细胞的用途。

抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂的剂量、毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准制药程序来确定，例如，以用于确定LD50(使50％的群体致死的剂量)和ED50(对50％的群体具有治疗有效性的剂量)。毒性作用与治疗效果之间的剂量比为治疗指数并且所述治疗指数可以被表示为比率LD50/ED50。在一些实施例中，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂表现出高治疗指数。尽管可以使用表现出有毒副作用的抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂，但是应该注意设计将此类化合物靶向到受影响组织的部位的递送系统，从而使对未感染细胞的潜在损伤最小化并由此减少副作用。

可以使用从细胞培养测定和动物研究获得的数据来调配一系列用于在人类中使用的剂量。此类化合物的剂量处于包含ED50在内的具有很小毒性或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可以根据所采用的剂型和所利用的施用途径而在这个范围内变化。对于任何抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂，治疗有效剂量可以从细胞培养测定中初步估算。在动物模型中可以将剂量调配为实现包含如在细胞培养中确定的IC50(即，测试化合物的实现症状的半数最大抑制的浓度)在内的循环血浆浓度范围。此类信息可以用于更精确地确定可用于人的剂量。可以例如通过高效液相色谱法来测量血浆中的水平。

典型地，足以实现治疗或预防效果的抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂的有效量的范围为约0.000001mg/千克体重/天至约10,000mg/千克体重/天。合适地，剂量范围为约0.0001mg/千克体重/天至约100mg/千克体重/天。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重/天、两天或三天或者处于1-10mg/kg/周、两周或三周的范围内。在一个实施例中，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂的单剂量范围为0.001-10,000微克/kg体重。在一个实施例中，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂浓度在每递送毫升0.2至2000微克的载剂范围内。示例性治疗方案需要每天一次或每周一次地施用。在治疗性应用中，有时要求相对短的间隔下相对高的剂量，直到疾病进展减少或终止并且直到受试者示出疾病症状的部分或完全改善为止。此后，可以施用患者预防方案。

在一些实施例中，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂的治疗有效量可以定义为抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂在靶组织处的浓度为10^-12至10^-6摩尔，例如，大约10^-7摩尔。此浓度可以根据0.001至100mg/kg的全身剂量或按体表面积计的等效剂量进行递送。将优化剂量计划表以维持靶组织的治疗浓度。在一些实施例中，剂量通过每日或每周单次施用来施用，但是也可以包含连续施用(例如，肠胃外输注或经皮施用)。在一些实施例中，本发明技术的抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂的剂量以“低”、“中”或“高”剂量水平提供。在一个实施例中，提供的低剂量为约0.0001毫克/千克/小时至约0.5毫克/千克/小时，合适地为约0.001毫克/千克/小时至约0.1毫克/千克/小时。在一个实施例中，提供的中剂量为约0.01毫克/千克/小时至约1.0毫克/千克/小时，合适地为约0.01毫克/千克/小时至约0.5毫克/千克/小时。在一个实施例中，提供的高剂量为约0.5毫克/千克/小时至约10毫克/千克/小时，合适地为约0.5毫克/千克/小时至约2毫克/千克/小时。

熟练技术人员应理解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间安排，包含但不限于疾病或病症的严重程度、先前治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄，和存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的本文所描述的药学组合物对受试者进行的治疗可以包含单次治疗或系列治疗。

根据本发明方法治疗的哺乳动物可以是任何哺乳动物，例如包含：如绵羊、猪、牛和马等农场动物；如狗和猫等宠物动物；如大鼠、小鼠和兔等实验室动物。在一些实施例中，哺乳动物是人。

本发明技术的治疗方法

一方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的妇科癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的至少一种抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和有效量的至少一种VEGF抑制剂。妇科癌症的实例包含但不限于卵巢癌、输卵管癌、子宫癌或子宫内膜癌。在某些实施例中，受试者是人。

另外地或可替代地，在一些实施例中，在施用至少一种抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和至少一种VEGF抑制剂之后，受试者表现出肿瘤生长减少、肿瘤增殖减少、肿瘤负荷降低或存活率增加。另外地或可替代地，在本文所公开的组合疗法方法的一些实施例中，相对于用抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物单一疗法或VEGF抑制剂单一疗法观察到的，应答时间和/或应答持续时间得到改善。

在本文所公开的方法的任何和所有实施例中，至少一种抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和至少一种VEGF抑制剂是单独、依序或同时施用的。抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂可以口服、鼻内、肠胃外、静脉内、肌内、腹膜内、肌内、动脉内、皮下、鞘内、囊内、眶内、肿瘤内、皮内、经气管、脑室内、局部或通过植入的储库施用。如本文所使用的术语“肠胃外”包含皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内以及颅内注射或输注技术。本文所公开的包含任何抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和/或VEGF抑制剂的调配物可以被设计成短效、快速释放或长效的。在其它实施例中，化合物可以以局部而非全身方式施用，如在肿瘤位点处施用(例如，通过注射)。

另外地或可替代地，在本文所公开的方法的一些实施例中，至少一种抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物可以在向患有妇科癌症的受试者施用VEGF抑制剂之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、同时或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)施用。

在一些实施例中，将抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和VEGF抑制剂以一定的顺序和时间间隔施用于受试者，例如哺乳动物，如人，使得首先施用的治疗剂与其次施用的治疗剂一起作用，以提供比单独施用每种治疗剂时更大的益处。例如，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和VEGF抑制剂可以在不同时间点同时或以任何顺序依序施用；然而，如果不同时施用，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和VEGF抑制剂在时间上足够接近地施用，以便提供两种治疗剂的组合的期望的治疗或预防效果。在一个实施例中，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和VEGF抑制剂在重叠的时间发挥其作用。在一些实施例中，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和VEGF抑制剂各自以独立的剂型、以任何合适的形式以及通过任何合适的途径施用。在其它实施例中，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如双特异性)免疫球蛋白相关组合物和VEGF抑制剂以单一剂型同时施用。

应当理解，这些治疗剂中的任一者的施用频率可以是在约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约20天、约28天、约一周、约2周、约3周、约4周、约一个月、约每2个月、约每3个月、约每4个月、约每5个月、约每6个月、约每7个月、约每8个月、约每9个月、约每10个月、约每11个月、约每年、约每2年、约每3年、约每4年或约每5年的时间段内一次或多于一次。

例如，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物或VEGF抑制剂可以每日、每周、每两周或每月施用特定的时间段。抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物或VEGF抑制剂可以在14天时间段内每日给药，或在七天时间段内每日给药两次。抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物或VEGF抑制剂可以每日施用7天。

可替代地，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物或VEGF抑制剂可以每日、每周、每两周或每月施用特定的时间段，接着施用特定的非治疗时间段。在一些实施例中，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物或VEGF抑制剂可以每日施用持续14天，接着进行七天的非治疗，并重复两个以上循环的每日施用持续14天，接着进行七天的非治疗。在一些实施例中，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物或VEGF抑制剂可以每日施用两次持续七天，接着进行14天的非治疗，其可以重复一个或两个以上循环的每日施用两次持续七天，接着进行14天的非治疗。

在一些实施例中，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物或VEGF抑制剂在14天的时间段内每天施用。在另一个实施例中，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物或VEGF抑制剂在12天、或11天、或10天、或九天或八天的时间段内每日施用。在另一个实施例中，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物或VEGF抑制剂在七天的时间段内每天施用。在另一个实施例中，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物或VEGF抑制剂在六天、或五天、或四天或三天的时间段内每天施用。

在一些实施例中，在一定时间间隔内施用单剂量的抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和VEGF抑制剂，使得两种治疗剂可以一起发挥作用(例如，在1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、5天、6天、1周或2周内)。在一些实施例中，施用治疗剂的治疗时间段之后是特定时间持续时间的非治疗期，在此期间不向受试者施用治疗剂。该非治疗期之后可以是一系列相同或不同频率、相同或不同时间长度的后续治疗和非治疗期。在一些实施例中，治疗期和非治疗期交替进行。应当理解，循环疗法中的治疗期可以继续直到受试者已经达到完全应答或部分应答为止，此时可以停止治疗。可替代地，循环疗法中的治疗期可以继续直到受试者已经达到完全应答或部分应答为止，此时治疗期可以继续特定数量的循环。在一些实施例中，治疗期的长度可以是特定数量的循环，而与受试者应答无关。在一些其它实施例中，治疗期的长度可以继续直到受试者复发为止。

在一些实施例中，将抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和VEGF抑制剂循环施用于受试者。循环疗法涉及在一段时间内施用第一种药剂(例如，第一种预防剂或治疗剂)，然后在一段时间内施用第二药剂和/或第三药剂(例如，第二和/或第三预防剂或治疗剂)，并重复该顺序施用。循环疗法可以减少对疗法中的一种或多种的耐药性的发展，避免或减少疗法之一的副作用，和/或提高治疗功效。

在一些实施例中，在施用VEGF抑制剂之前，施用抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物特定的时间段长度。例如，在21天的循环中，可以在第1至5天、第1至7天、第1至10天或第1至14天施用抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物，并且可以在第6至21天、第8至21天、第11至21天或第15至21天施用VEGF抑制剂。在其它实施例中，在施用VEGF抑制剂之前，施用抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物特定的时间段长度。例如，在21天的循环中，可以在第1至5天、第1至7天、第1至10天或第1至14天施用抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物，并且可以在第6至21天、第8至21天、第11至21天或第15至21天施用VEGF抑制剂。

在一个实施例中，施用是按21天剂量计划表进行的，其中从第八天开始每天一次剂量的抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物施用七天，接着进行七天的非治疗，与VEGF抑制剂的每日两次施用持续七天组合，接着进行14天的非治疗(例如，在21天计划表的第8-14天施用抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物并在第1-7天施用VEGF抑制剂)。

在另一个实施例中，施用是按21天剂量计划表进行的，其中从第八天开始每天一次剂量的VEGF抑制剂施用七天，接着进行七天的非治疗，与抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物的每日两次施用持续七天组合，接着进行14天的非治疗(例如，在第21天计划表的第8-14天施用VEGF抑制剂并在第1-7天施用抗MUC16^c114×CD3多特异性(如，双特性)免疫球蛋白相关组合物)。

在一些实施例中，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和VEGF抑制剂各自以单一疗法期间通常用于所述药剂的剂量和计划表施用。在其它实施例中，当伴随施用抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和VEGF抑制剂时，药剂中的一种或两种可以有利地以比在单一疗法期间使用所述药物时通常施用的剂量更低的剂量施用，使得剂量低于引起不良副作用的阈值。

抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和VEGF抑制剂的组合的治疗有效量或合适的剂量取决于许多因素，包含待治疗疾病的严重程度的性质、特定抑制剂、施用途径和个体受试者的年龄、体重、总体健康状况和应答。在某些实施例中，合适的剂量水平是达到通过肿瘤消退或疾病进展、无进展生存率或总生存率的其它标准测量来测量的治疗应答的剂量水平。在其它实施例中，合适的剂量水平是实现这种治疗应答并且还最小化与治疗剂施用相关的任何副作用的剂量水平。

抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物的合适日剂量通常可以在单剂量、分剂量或多剂量的范围内，是作为单一药剂的最大耐受剂量的约10％至约120％。在某些实施例中，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物的合适剂量是作为单一药剂的最大耐受剂量的约20％至约100％。在其它实施例中，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物的合适剂量是作为单一药剂的最大耐受剂量的约25％至约90％。在一些实施例中，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物的合适剂量是作为单一药剂的最大耐受剂量的约30％至约80％。在其它实施例中，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物的合适剂量是作为单一药剂的最大耐受剂量的约40％至约75％。在一些实施例中，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物的合适剂量是作为单一药剂的最大耐受剂量的约45％至约60％。在其它实施例中，抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物的合适剂量是作为单一药剂的最大耐受剂量的约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约105％、约110％、约115％或约120％。

VEGF抑制剂的合适日剂量通常可以在单剂量、分剂量或多剂量的范围内，是作为单一药剂的最大耐受剂量的约10％至约120％。在某些实施例中，VEGF抑制剂的合适剂量为作为单一药剂的最大耐受剂量的约20％至约100％。在一些其它实施例中，VEGF抑制剂的合适剂量为作为单一药剂的最大耐受剂量的约25％至约90％。在一些其它实施例中，VEGF抑制剂的合适剂量为作为单一药剂的最大耐受剂量的约30％至约80％。在一些其它实施例中，VEGF抑制剂的合适剂量为作为单一药剂的最大耐受剂量的约40％至约75％。在一些其它实施例中，VEGF抑制剂的合适剂量为作为单一药剂的最大耐受剂量的约45％至约60％。在其它实施例中，VEGF抑制剂的合适剂量是作为单一药剂的最大耐受剂量的约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约105％、约110％、约115％或约120％。

例如，当如通过本发明技术的方法所确定的施用于适当的受试者时，治疗有效量的抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和VEGF抑制剂可以部分或完全减轻妇科癌症的一种或多种症状和/或使得存活率增加，减少肿瘤负荷，减少肿瘤复发，减少癌症细胞的数量，减少肿瘤大小，根除肿瘤，抑制癌症细胞向外周器官的浸润，抑制或稳定肿瘤生长，以及稳定或改善受试者的生活质量。

本发明技术的试剂盒

本公开提供了用于治疗妇科癌症的试剂盒，所述试剂盒包括本文所公开的抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物、本文所公开的VEGF抑制剂和用于治疗妇科癌症的说明书。当考虑同时施用时，试剂盒可以包括已经被调配成如片剂等单一药物组合物或者作为单独的药物组合物的抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和VEGF抑制剂。当抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和VEGF抑制剂不同时施用时，试剂盒可以包括已被调配成在单一包装中或在单独包装中的单独药物组合物的抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和VEGF抑制剂。

另外地或可替代地，在一些实施例中，试剂盒进一步包括用于治疗妇科癌症的至少一种化疗剂和/或至少一种免疫检查点抑制剂。此类化疗剂的实例包含但不限于紫杉烷、烷化剂、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂(例如，拓扑异构酶II抑制剂)、内质网应激诱导剂、抗代谢物和有丝分裂抑制剂。在一些实施例中，所述化疗剂选自由以下组成的组：苯丁酸氮芥(chlorambucil)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)、链脲菌素(streptozocin)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、苯达莫司汀(bendamustine)、乌拉莫司汀(uramustine)、雌莫司汀(estramustine)、卡莫司汀、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、甘露舒凡(mannosulfan)、白消安(busulfan)、达卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、塞替派(thiotepa)、六甲蜜胺(altretamine)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲(hydroxyurea)、甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、道诺霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、SN-38、ARC、NPC、喜树碱(campothecin)、拓扑替康(topotecan)、9-硝基喜树碱(9-nitrocamptothecin)、9-氨基喜树碱(9-aminocamptothecin)、里比芬(rubifen)、吉马替康(gimatecan)、二氟替康(diflomotecan)、BN80927、DX-8951f、MAG-CPT、安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、替尼泊苷(teniposide)、多柔比星、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、吉西他滨、巴卡亭III(accatin III)、10-脱乙酰基紫杉醇(10-deacetyltaxol)、7-木糖基-10-脱乙酰基紫杉醇(7-xylosyl-10-deacetyltaxol)、三尖杉宁碱(cephalomannine)、10-脱乙酰基-7-表紫杉醇(10-deacetyl-7-epitaxol)、7-表紫杉醇(7-epitaxol)、10-脱乙酰基巴卡亭III(10-deacetylbaccatinIII)、10-脱乙酰基三尖杉宁碱(10-deacetyl cephaolmannine)和其混合物。

免疫检查点抑制剂的实例包含免疫调节/刺激抗体，如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM3抗体、抗4-1BB抗体、抗CD73抗体、抗GITR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗TIGIT抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗ICOS抗体、抗BTLA抗体和抗LAG-3抗体。特异性免疫检查点抑制剂包含伊匹单抗(ipilimumab)、纳武单抗(nivolumab)、皮地利珠单抗(pidilizumab)、兰布罗利珠单抗(lambrolizumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、阿特朱单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、MPDL3280A、BMS-936559、MEDI-4736、MSB 00107180、AMP-224、MDX-1105、阿维单抗(arelumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、IMP321、MGA271、BMS-986016、利瑞鲁单抗(lirilumab)、乌瑞芦单抗(urelumab)、PF-05082566、IPH2101、MEDI-6469、CP-870,893、莫加穆利珠单抗(Mogamulizumab)、瓦利路单抗(Varlilumab)、加利昔单抗(Galiximab)、AMP-514、AUNP 12、吲哚莫德(Indoximod)、NLG-919、INCB024360、DLBCL抑制剂和其任何组合。

试剂盒可以进一步包括与本文所描述的一种或多种试剂盒组分相容的药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。任选地，将本发明技术的试剂盒的上文所描述的组分包装在合适的容器中，并贴上用于治疗妇科癌症(例如，表达MUC16的妇科癌症)的标签。妇科癌症的实例包含但不限于卵巢癌、输卵管癌、子宫癌和子宫内膜癌。

试剂盒可以任选地包含说明书，所述说明书通常包含在治疗产品的商业包装中，其含有关于例如关于此类治疗产品的使用的适应症、用法、剂量、制造、施用、禁忌症和/或警告的信息。

实例

提供以下实例以进一步展示本公开的方法。这些实例仅是说明性的，并不旨在以任何方式限制本公开的范围。对于以下实例中的每一个，可以使用本文所描述的任何抗MUC16^c114×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物或任何VEGF抑制剂。

实例1：材料与方法

人噬菌体展示淘选。E-人噬菌体展示文库用于筛选与MUC16^ecto特异性结合的克隆。使用15个不同的噬菌体子文库进行独立淘选。通过FACS确定对MUC16^ecto呈阳性的单个scFv噬菌体克隆并对具有独特DNA编码序列的克隆进行另外的表征。进一步验证阳性噬菌体克隆与MUC16^ecto过度表达HEK293细胞的结合。对于FACS筛选，将噬菌体克隆与MUC16^ecto过度表达HEK293细胞一起温育，然后与抗M13小鼠抗体一起温育。在洗涤之后，将APC标记的抗小鼠IgG第2抗体添加到反应中。通过FACS测量结合并表示为平均荧光强度(MFI)。用单独的第2抗体、M13 K07辅助噬菌体和仅用细胞温育的细胞用作阴性对照。

细胞系和细胞毒性。对于噬菌体展示筛选，使用未经修饰的HEK293、表达MUC16的HEK293(HEK-MUC16WT)或表达突变体MUC16的HEK293细胞(HEK293-MUC16mut)。对于细胞毒性测定，使用SKOV3(MUC16^Neg)、SKOV3-MUC16^ecto(MUC16^Pos)、OVCAR3(MUC16^Pos)、OVCAR432(MUC16^Pos)和SKOV8(MUC16^Pos)细胞系。对于基于荧光素酶的细胞毒性测定、成像和存活率测定；使用经修饰以表达MUC16^ecto和荧光素酶基因的SKOV3(SKOV3-MUC16^ecto-Luc)、野生型等基因SKOV3-Luc和OVCAR3-Luc细胞。所有人卵巢癌细胞系在补充10％热灭活的胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和链霉素(P/S)和2mM L-谷氨酰胺的RPMI(美国纽约州格兰德岛的英杰公司(Invitrogen,Grand Island,NY,USA))中维持。使用核型分析验证细胞并常规检查支原体污染。使用Gallios流式细胞仪和Kaluza软件(美国加利福尼亚州布雷亚的贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter,Brea,CA,USA))进行流式细胞术分析。使用APC缀合的抗Muc16抗体检测MUC16^ecto表达。人T细胞源自从纽约血液中心(New York Blood Center)获得的新鲜血液源性白细胞浓缩物(白细胞包)，使用具有Accu-prep(axis-Shield PoC AS公司(axis-Shield PoC AS))的密度梯度离心分离单核细胞。用浓度为2×10⁶/ml的PHA(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich,St Louis,MO))分离、激活和扩增T细胞。在存在100IU/ml重组人IL-2(Proleukin)的情况下，在补充有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和链霉素以及2mM L-谷氨酰胺的RPMI中培养T细胞。使用流式细胞术和计数珠(E生物科学公司(Ebioscience))对活细胞进行计数。对于基于LDH的细胞毒性，在存在0.2μg/ml的相关BiTED的情况下，将肿瘤细胞和激活的T细胞以1:1共培养16小时。根据制造商方案，LDH释放测定用于定量死细胞。对于基于荧光素酶的细胞毒性测定，在存在0.5μg/ml的BiTED的情况下，将激活的供体T细胞与SKOV3-Luc、SKOV3-MUC16^ecto-Luc或OVCAR3-Luc以指定的效应子:靶标比率共培养48小时，并且随后与荧光素酶测定试剂(普洛麦格公司)混合。使用板分光光度计分析裂解物的发光。所有细胞毒性实验由至少四个分离的供体进行并且重复至少三次。

SDS-PAGE验证。使用SDS-PAGE评估候选抗CD3ε双特异性接合子。使用 Bis-Tris凝胶(4-12％)和MEX×1运行缓冲液在还原条件下在70℃下运行样品10分钟。预期条带大小为50KDa。

免疫沉淀。对于免疫沉淀实验，将1.5μM的亲和纯化的BTM蛋白(由与人Fc融合的MUC16^c57-114的高度保守的细胞外部分组成的合成融合蛋白)添加到PBS缓冲液中等量的MUC16 BiTED中，并在存在蛋白G琼脂糖的情况下旋转温育混合物。通过在4℃下温育混合物90分钟，将免疫复合物吸附到25μl蛋白G-琼脂糖珠粒(微孔)(用PBS缓冲液预洗涤3次)悬浮液上。用600μl的PBS缓冲液洗涤珠粒3次。最后，将珠粒重悬于30μl的pH为2.7的0.1M甘氨酸中，用于洗脱复合物。将洗脱液与SDS样品缓冲液混合，加热8分钟，并通过NuPAGE^TM4-12％Bis-Tris蛋白质凝胶(生命技术有限公司(Life Technology)，NP0335BOX)分离蛋白质。通过考马斯蓝染色检测凝胶中的蛋白条带。

与MUC16^ecto结合的BiTED的动力学分析。在加载有NTA传感器芯片的BiaCore X100仪器上进行EXT170-8 BiTED和Muc16 BTM蛋白(MUC16的55mer高度保守的胞外结构域区)的动力学分析。EXT170-8 BiTED包括SEQ ID NO:89的氨基酸和SEQ ID NO:93的前导序列。

EXT170-8 BiTED的全长核酸序列提供如下：

ATGGAAACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGATCTACCGGTGACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCTGCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACTATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGATGTTAGCAAGTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCCAGGCTCCTGATCTCTGCTGCATCCGGTCTGCAAAGTTGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCTCCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAATAGTTTCCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTTCTAGAGGTGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGATCCCTCGAGATGGCCCAGGTGCAGTTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTCAGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCAATCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCGCCAGTCTTACATCACTGATTCTTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCAACTAGTGGCGGGGGAGGATCCGACGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCTGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAAGCTAGCGGCTATACCTTCACCCGGTACACCATGCACTGGGTGCGCCAGGCACCTGGACAGGGACTGGAATGGATCGGCTACATCAACCCCTCCCGGGGCTACACCAACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCACCACCGATAAGTCCACCAGCACCGCTTACATGGAACTGTCCTCCCTGAGATCCGAGGACACCGCTACCTACTATTGCGCCCGGTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGACAGGGAACCACAGTGACCGTGTCCTCTGGCGAGGGCACCTCTACTGGATCTGGGGGAAGTGGTGGTTCTGGCGGCGCTGACGACATCGTGCTGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTCTGAGCCCAGGCGAGAGAGCTACCCTGTCCTGCAGAGCCTCCCAGTCCGTGTCCTACATGAATTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCGGTGGATCTACGACACCTCCAAGGTGGCCTCTGGCGTGCCAGCCCGGTTTTCCGGATCTGGCTCTGGCACCGACTACTCCCTGACCATCAACAGCCTGGAAGCCGAGGACGCTGCCACCTATTACTGCCAGCAGTGGTCCTCCAACCCCCTGACCTTTGGAGGCGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCACCACCATCATCACCACTAA(SEQ ID NO:96)

EXT170-8 BiTED的全长氨基酸序列提供如下：

前导序列以下划线标出，V_H和V_L结构域以黑体表示，His标签用虚线表示。

简而言之，以20μg/ml的浓度将His标记的EXT170-8 BiTED固定在NTA传感器芯片上，并以570、285、142.5、71.25和35.625nM(20、10、5、2.5和1.25ul/ml)的浓度注射MUC16BTM蛋白(35kDa)。通过Biacore X100评估软件使用动力学模型1:1结合分析原始数据。

ELISA。将96孔透明的平底板(Thermo Scientific，14-245-153)用在4℃下在0.1M碳酸氢钠包被缓冲液(pH 8.0)中稀释过夜的1μg/ml BTM(MUC16的55mer高度保守的细胞外结构域区)包被。每个孔用PBS-T(0.05％ Tween-20)洗涤并且随后在室温下用PBS+2％ BSA封闭1小时。然后用PBS-T洗涤孔，然后统计生物素化的BiTED(生物素标记试剂盒；罗氏公司(Roche)，11418165001)或具有游离rhCA-125的生物素化的Muc16 BiTED(R&D系统公司(R&Dsystems)，5609-MU)。使用1:1、5:1和10:1的rhCA-125与包被的BTM的比率。在板摇床上在室温下温育一小时之后，用PBS-T洗涤孔。然后向每个孔中添加1:200的PBS中的链霉亲和素-HRP A(R&D系统公司，890803)并在箔下室温温育1小时。在添加TMB ELISA过氧化物酶底物(洛克兰(Rockland))之前，用PBS-T洗涤每个孔，并在室温下在箔下显影20分钟。然后用0.6N硫酸将反应淬灭。通过SpectraMax iD3酶标仪测量450nm和540nm的波长(用于板折射校正)。然后进行分析，对一式四份样品的波长取平均值，说明板折射(540nm)以及剩余的HRP-TMB吸光度(来自BTM包被的阴性对照条件的残余检测，接着是Strep-HR、TMB底物，并且然后是终止溶液；不包括生物素化的Muc16 BiTED)。根据制造商的说明(R&D系统公司，DVE00)，对在完全RPMI中培养48小时的6孔板中培养的OVCAR 3细胞进行VEGF检测。

FACS分析。使用Gallios流式细胞仪和Kaluza软件(美国加利福尼亚州布雷亚的贝克曼库尔特公司)进行流式细胞术分析。使用APC缀合的抗Muc16抗体检测Muc16^ecto表达。将人细胞用小鼠抗人CD3(PE/APC，赛默飞世尔公司(Thermofisher)UCHT1/OKT3)、PD-1(APC，赛默飞世尔公司MIH4)、TIM3(APC，赛默飞世尔公司F38-2E2)、LAG3(APC，赛默飞世尔公司3DS223H)、颗粒酶B(APC，赛默飞世尔公司GB11)、CD4(PE，赛默飞世尔公司RPA-T4)、CD8(PE，赛默飞世尔公司RPA-T8)、VEGF(PE，R&D系统公司IC2931P)和CD45(APC，赛默飞世尔公司HI30)染色。将肿瘤、脾细胞或腹膜细胞沉淀并用FACS缓冲液(PBS+2.5％ FBS)洗涤3次。用合适的抗体将细胞重悬，在FACS缓冲液中稀释并在4℃下在黑暗中温育30分钟。随后用冷FACS缓冲液将细胞洗涤3次并在FACS分析之前重悬于1X DAPI中。

细胞因子测量。通过从指定动物的眶后出血收集的血液测量血清细胞因子，并离心分离血清部分。使用MILLIPLEX MAP人细胞因子/趋化因子、预混合13Plex试剂盒和Luminex IS100系统进行细胞因子检测。IL-2(艾博抗公司(abcam)，ab174444)和IFN-γ(艾博抗公司，ab174443)的专用细胞因子测定是根据制造商方案用商业ELISA试剂盒进行的。

动物成像和体内实验。6-8周龄的雌性NSG小鼠购自美国缅因州巴尔港的杰克逊实验室(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME,USA)。在第0天腹膜内(i.p.)注射3×10⁶个SKOV3-MUC16^ecto/-Luc或OVCAR3肿瘤细胞，并且在第7天不处理动物，单独用T细胞静脉内(i.v)处理或用T细胞和5μg MUC16^ecto-BiTED的组合处理动物。BiTED处理组中的动物在第9、11、14、16和18天接受另外的5μg MUC16^ecto-BiTED处理，总共6次处理，持续2周。向荷瘤小鼠腹膜内注射D-荧光素(金生物技术公司(Goldbio Technology))(150mg/kg)，并且在10分钟之后在异氟醚麻醉下成像。使用卡尺IVIS成像系统实现生物发光成像，并用LivingImage 4.0软件(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))进行分析。使用25cm视场、培养基分箱水平和60秒曝光时间实现图像采集。用αPD-1封闭抗体(克隆EH12.2H7，百进生物公司(BioLegend))处理的动物在肿瘤接种(第0天)之后第7、14、21和28天(每周注射×4周)接受250μg i.p注射。在肿瘤接种之后第7、11、14、18和21天，用αVEGF封闭抗体(Invivo Gen公司(Invivo Gen)，hvegf-mab1)处理的动物接受5mg/kg i.p注射。监测所有小鼠的存活率并在出现痛苦迹象时对其实施安乐死。

统计分析。使用Mantel-Cox(对数秩)测试分析存活率曲线并且使用非配对双尾T测试进行其它分析(p值<0.05被视为显著的)。所有计算使用Prism 7(GraphPad)软件进行。

实例2：人噬菌体淘选和MUC16^ecto特异性克隆的鉴定

人噬菌体展示文库用于筛选与MUC16的保留部分特异性结合的克隆(图1(a))。使用经修饰以过度表达MUC16^ecto(MUC16^c114)的HEK293细胞通过流式细胞术筛选阳性克隆。选择与MUC16^ecto而非突变体形式结合的克隆，以进一步发展成双特异性双功能抗体(BiTED)(图1(b))。双特异性T细胞接合性双功能抗体(BiTED)涉及两个共价连接的单链可变片段(scFv)。一个scFv对肿瘤相关抗原(TAA)具有特异性，并且另一个与T细胞受体的CD3亚基结合(参见Baeuerle PA,Reinhardt C.《癌症研究(Cancer Res.)》2009；69(12):4941-4)。总共筛选了15个文库，产生了540个克隆，所述克隆通过流式细胞术进行验证。其中，鉴定了53个独特的克隆，并且最终16个克隆显示出与MUC16^ecto的优先结合。

实例3：MUC16^ecto特异性双特异性T细胞接合性双功能抗体的验证

将源自候选噬菌体文库的单链可变片段(scFv)克隆到具有表达抗人CD3εscFv抗体的一条臂的双特异性抗体构建体中。抗人CD3εscFv抗体的氨基酸序列由SEQ ID NO:72表示。

纯化MUC16^ecto-BiTED并通过SDS-page确认(图1(c))。为了确定BiTED与MUC16^ecto的结合亲和力，使用了先前验证的BTM蛋白(由与人Fc主链pFUSE融合的MUC16^c57-114的高度保守的细胞外部分组成的合成融合蛋白)，并使用表面等离子体共振进行动力学分析。铅MUC16^ecto-BiTED的解离常数(K_D)为69.9nM(图1(d))。

实例4：与MUC16的细胞外结构域结合并且不脱落CA-125的MUC16^ecto-BITED

先前的研究已经表明，本文所公开的MUC16^ecto抗原结合片段对MUC16(CA-125)的保留结构域而非切割的部分具有特异性(Rao TD等人,《ACS化学生物(ACS Chem Biol.)》2017；12(8):2085-96)。先导候选选择策略被特别设计用于鉴定识别MUC16^ecto(MUC16-C114)的N-糖基化位点(N31)而非突变体区(MUC16-N123)的杂交瘤克隆(图1(a)-1(b))。MUC16^ecto-BiTED(SEQ ID NO:97)与MUC16^ecto的直接蛋白-蛋白结合通过免疫共沉淀进行评估(图2(a))。如图2(a)所示，MUC16^ecto-BiTED与BTM的混合物产生了预期的蛋白质条带(泳道4，约55kDa)，但不具有MUC16^ecto-BiTED的BTM没有产生预期的蛋白质条带(泳道2)，反之亦然(泳道3)。

为了进一步验证与MUC16^ecto结合的BiTED，使用板结合的BTM进行ELISA测定。如图2(b)所示，MUC16^ecto-BiTED以浓度依赖性方式与BTM结合。接下来，为了评估这种结合是否可以被脱落的CA-125破坏，在CA-125对BTM的浓度增加的情况下重复ELISA测定。在1:1、5:1和至多10倍的CA-125与BTM浓度增加时，未观察到MUC16^ecto-BiTED结合的减少(图2(c))。

实例5：MUC16^ecto-BiTED在体外表现出针对卵巢癌细胞系组的特异性细胞毒性

评估了MUC16^ecto-BiTED针对具有不同程度MUC16表达的各种卵巢癌细胞系的体外效力。使用包含SKOV3(MUC16^neg)、SKOV8(MUC16^pos)、OVCAR3(MUC16^pos)和OVCAR432(MUC16^pos)的组，鉴定针对MUC16^pos而非MUC16^neg卵巢癌细胞系具有细胞毒性的合适BiTED候选(图3(a))。为了最小化观察到的一些细胞毒性是由细胞系特异性差异引起的可能性，使用了经修饰以表达MUC16^ecto的等基因SKOV3细胞系(Rafiq S等人,《自然生物技术(NatBiotechnol.)》2018；36(9):847-56，Chekmasova AA等人,《临床癌症研究(Clin CancerRes.)》2010；16(14):3594-606)。如图3(b)所示，观察到不同效应子与靶标比率下的剂量依赖性细胞毒性。

OVCAR3细胞内源性地表达MUC16并脱落高水平的CA-125(Yin BW等人,《国际癌症杂志(Int J Cancer.)》2002；98(5):737-40)，使该细胞系成为测试在存在CA-125脱落的情况下MUC16^ecto-BiTED可以介导细胞毒性的假设的理想候选细胞。在存在MUC16^ecto-BiTED的情况下，OVCAR3细胞以不同的E:T比率被有效裂解(图3(c))。与在不同E:T比率下与单独的T细胞一起温育相比，用MUC16^ecto-BiTED处理野生型SKOV3(MUC16^neg)细胞没有导致任何显著的细胞毒性(图3(d))。综上所述，MUC16^ecto-BiTED对MUC16^pos卵巢癌细胞系表现出特异性细胞毒性，并且这种细胞毒性在存在CA-125的情况下得以保留。为了评估BiTED介导的细胞毒性的机制，评估了在存在或不存在BiTED的情况下与MUC16^pos卵巢癌细胞一起温育24小时的T细胞中的细胞内颗粒酶-B和细胞因子水平。CD4⁺和CD8⁺T细胞两者显示细胞内颗粒酶-B水平升高(图3(e))。类似地，细胞内T细胞IL-2和IFN-γ在含有MUC16^ecto-BiTED的共培养条件下显著升高(图3(f))。

实例6：MUC16^ecto-BiTED延迟体内转移性卵巢癌的进展

为了评估MUC16^ecto导向的双特异性T细胞接合子的体内功效，向雌性NSG小鼠腹膜内(i.p)注射3×10⁶个SKOV3肿瘤细胞，所述肿瘤细胞被修饰以表达MUC16^ecto和荧光素酶。在肿瘤接种之后七天，小鼠未经处理，用静脉内(i.v)激活的单独的人T细胞处理，或者用i.vT细胞和MUC16^ecto-BiTED处理。

在第9、11、14、16和18天，用MUC16^ecto-BiTED处理的荷瘤小鼠接受另外的BiTED注射，在两周内总共6次剂量。在肿瘤注射之后第14、21、28和42天对动物进行成像。如图4(a)-4(b)所示，与未处理或用单独的T细胞处理相比，MUC16^ecto-BiTED延迟疾病的影像学进展。使用相同的实验模型，评估了用BiTED处理的小鼠中的血清细胞因子。用T细胞和BiTED处理的荷瘤小鼠在处理之后七天显示全身性IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-10水平显著升高(图4(c))。没有发现IL-6、GM-CSF、IL-13或IL-17a水平的显著升高。

实例7：MUC16^ecto-BiTED作为单一疗法以及与免疫检查点阻断组合增加存活率

接下来，评估了用MUC16^ecto-BiTED处理对荷瘤小鼠存活率的影响。如图5(a)所示，与用单独的T细胞处理相比，施用MUC16^ecto-BiTED使得SKOV3-MUC16^ecto荷瘤小鼠的存活率显著增加(中值OS；42.5天对52天，**p<0.005)。

由于用于本实验的肿瘤模型具有持续水平的MUC16表达，通过抗原丢失或下调的免疫逃避是疾病进展的不太可能的机制。为了更好地了解BiTED处理失败的潜在机制，从BITED处理的早期死于疾病的动物中收获脾脏，并将人T细胞表型与应答者进行比较。应答者被定义为存活超过55天的经处理的动物。与对疗法应答较好的动物相比，在非应答者中发现表达PD-1、TIM-3和LAG3的CD3+人T细胞的比例增加(图5(b))。这些结果表明，一定程度的T细胞功能障碍可能是处理失败的基础。为了测试这一假设，将EH12.2H7(加利福尼亚州圣地亚哥的百进生物公司(BioLegend,San Diego,CA))的抗PD-1(αPD-1)免疫检查点抑制与MUC16^ecto-BiTED组合。组合显著提高了生存率(中值OS；62对75天，**p<0.05)，包含存活超过100天的动物比例(图5(c))。用BiTED的处理优于单独的αPD-1疗法(中值OS；62对44天，**p<0.05)。

实例8：抑制肿瘤血管生成协同改善BiTED免疫疗法

血管生成在卵巢癌中的关键作用已被广泛描述(Mesiano S等人,《美国病理学杂志(Am J Pathol.)》1998；153(4):1249-56)。VEGF表达增加是卵巢癌中的预后不良指标(Paley PJ等人,《癌症(Cancer)》1997；80(1):98-106)，并且针对VEGF的单克隆抗体在卵巢癌的临床管理中起着重要的作用(Colombo N等人,《肿瘤血液学重要评论(Crit Rev OncolHematol.)》2016；97:335-48)。进一步地，VEGF抑制也显示出减少腹水，所述腹水是充分描述的免疫抑制肿瘤微环境。

已显示OVCAR3细胞分泌VEGF(Bourgeois DL等人,《癌细胞国际(Cancer CellInt.)》2015；15:112)。据推测，将MUC16^ecto-BiTED与抗VEGF(αVEGF)抗体组合可能比BiTED单一疗法显著提高功效。首先，雌性NSG小鼠被植入OVCAR3细胞。与单独的T细胞输注相比，用MUC16^ecto-BiTED处理提高了存活率(图6(a))(中值OS；66.5对99天，**p<0.005)。使用细胞内流式细胞术(图6(b))和ELISA(图6(c))验证了这些实验中使用的OVCAR3细胞中VEGF的表达。接下来，用MUC16^ecto-BiTED和αVEGF疗法处理OVCAR3荷瘤小鼠。与hvegf-mab1(加利福尼亚州圣地亚哥的InvivoGen公司(InvivoGen,San Diego,CA))对VEGF的抑制作用组合，MUC16^ecto-BiTED使得比单独的MUC16^ecto-BiTED处理显著改善总存活率(中值OS；140对97.5天，**p<0.005)(图6(d))。用T细胞加αVEGF处理不如用MUC16^ecto-BiTED的疗法(中值OS；97.5对59天，*p<0.005)，表明在没有伴随的细胞毒性T细胞接合的情况下，单独抑制血管生成是不够的。与BiTED/αPD-1和BiTED单一疗法相比，在用BiTED/αVEGF组合处理的小鼠中发现腹水显著减少(图6(e))。对腹膜肿瘤细胞的评估显示，与BiTED/αPD-1和BiTED单一疗法相比，BiTED/αVEGF组合显著降低了肿瘤负荷(图6(f))。尽管用αVEGF加T细胞处理的小鼠腹水减少(图6(e))，但腹膜肿瘤细胞没有减少(图6(f))，表明这种组合缺乏存活率益处(图6(d))。

这些结果表明，使用与成熟MUC16的C末端具114个氨基酸的残基(例如，MUC16^c114)和T细胞特异性结合的抗MUC16×CD3多特异性(例如，双特异性)免疫球蛋白相关组合物和VEGF抑制剂的组合疗法方法可用于治疗有需要的受试者的妇科癌症。

等效物

本发明技术不限于本申请中所描述的特定实施例，这些特定实施例旨在作为本发明技术的单个方面的单独绘示。在不脱离本发明技术的精神和范围的情况下，可以对本发明的技术进行许多修改和变化，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。根据以上描述，除了本文所列举的那些方法和装置之外，在本发明技术的范围内的在功能上等效的方法和装置对本领域技术人员而言将是显而易见的。此类修改和变化旨在落入本发明技术的范围内。应当理解，本发明技术不限于特定方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，当然，所述特定方法、试剂、化合物、组合物或生物系统可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不旨在是限制性的。

另外，在按照马库什(Markush)组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开也由此按照马库什组中的任何单独成员或成员子组进行描述。

如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文所公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围可以容易地被认为是充分地描述和使能被分解为至少相等的两份、三份、四份、五份、十份等的相同范围。作为非限制性实例，本文中所讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等所有语言包含列出的数字并且是指随后可以被分解为如上文所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解，范围包含每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1个、2个或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个细胞的组，等等。

在本文中提到或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物在其不与本说明书中的明确教导不一致的程度上以全文引用的方式并入本文中，包含所有附图和表格。

Claims (20)

1.一种用于治疗有需要的受试者的妇科癌症的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用有效量的抗MUC16×CD3双特异性抗体或其抗原结合片段和有效量的VEGF抑制剂，其中所述抗MUC16×CD3双特异性抗体或抗原结合片段包括第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点与包括MUC16胞外结构域序列的MUC16多肽特异性结合，其中所述MUC16胞外结构域序列由SEQ ID NO:95组成。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述MUC16多肽具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一抗原结合位点包括重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)和轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，其中

(a)所述V_H包括SEQ ID NO:4的V_H-CDR1序列、SEQ ID NO:5的V_H-CDR2序列和SEQ ID NO:6的V_H-CDR3序列；并且所述V_L包括SEQ ID NO:7的V_L-CDR1序列、SEQ ID NO:8的V_L-CDR2序列和SEQ ID NO:9的V_L-CDR3序列；或者

(b)所述V_H包括SEQ ID NO:10的V_H-CDR1序列、SEQ ID NO:11的V_H-CDR2序列和SEQ IDNO:12的V_H-CDR3序列；并且所述V_L包括SEQ ID NO:13的V_L-CDR1序列、SEQ ID NO:14的V_L-CDR2序列和SEQ ID NO:15的V_L-CDR3序列；或者

(c)所述V_H包括SEQ ID NO:16的V_H-CDR1序列、SEQ ID NO:17的V_H-CDR2序列和SEQ IDNO:18的V_H-CDR3序列；并且所述V_L包括SEQ ID NO:19的V_L-CDR1序列、SEQ ID NO:20的V_L-CDR2序列和SEQ ID NO:21的V_L-CDR3序列；或者

(d)所述V_H包括SEQ ID NO:22的V_H-CDR1序列、SEQ ID NO:23的V_H-CDR2序列和SEQ IDNO:24的V_H-CDR3序列；并且所述V_L包括SEQ ID NO:25的V_L-CDR1序列、SEQ ID NO:26的V_L-CDR2序列和SEQ ID NO:27的V_L-CDR3序列。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一抗原结合位点包括：

(a)重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的V_H-CDR1序列、V_H-CDR2序列和V_H-CDR3序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的V_L-CDR1序列、V_L-CDR2序列和V_L-CDR3序列；或者

(b)重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的V_H-CDR1序列、V_H-CDR2序列和V_H-CDR3序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35的V_L-CDR1序列、V_L-CDR2序列和V_L-CDR3序列；或者

(c)重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ ID NO:36的V_H-CDR1序列、V_H-CDR2序列和V_H-CDR3序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:37的V_L-CDR1序列、V_L-CDR2序列和V_L-CDR3序列；或者

(d)重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ ID NO:38的V_H-CDR1序列、V_H-CDR2序列和V_H-CDR3序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:39的V_L-CDR1序列、V_L-CDR2序列和V_L-CDR3序列。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一抗原结合位点包括：

(a)重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸序列；或者

(b)重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35的氨基酸序列；或者

(c)重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:37的氨基酸序列；或者

(d)重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述抗MUC16×CD3双特异性抗体或抗原结合片段进一步包括选自由以下组成的组的同种型的Fc结构域：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述抗MUC16×CD3双特异性抗原结合片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述抗MUC16×CD3双特异性抗体或抗原结合片段是人的或人源化的。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述抗MUC16×CD3双特异性抗体或抗原结合片段是串联scFv、双功能抗体(Db)、单链双功能抗体(scDb)、双亲和力再靶向(DART)抗体、F(ab')2、双可变结构域(DVD)抗体、杵臼(KiH)抗体、对接锁定(DNL)抗体、化学交联抗体、异源多聚体抗体、单克隆抗体、全长抗体或异源缀合物抗体。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述抗MUC16×CD3双特异性抗体或抗原结合片段包括与T细胞特异性结合的第二抗原结合位点。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述第二抗原结合位点包括：重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)，所述V_H包括SEQ ID NO:70的氨基酸序列；以及轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，所述V_L包括SEQ ID NO:71的氨基酸序列。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述第二抗原结合位点包括SEQ ID NO:72的氨基酸序列。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述抗MUC16×CD3双特异性抗体或抗原结合片段包括SEQ ID NO:73-92中的任一者的氨基酸序列。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述VEGF抑制剂是小分子抑制剂、siRNA、反义寡核苷酸、shRNA、sgRNA、核酶或抗体或其抗原结合片段。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述VEGF抑制剂是贝伐单抗(bevacizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、凡努西单抗(vanucizumab)、布洛赛珠单抗(brolucizumab)、hPV19、IBI305或VEGF Trap。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述VEGF抑制剂选自由以下组成的组：利尼法尼(linifanib)、AEE-788、阿昔替尼(axitinib)(AG-13736)、AG-028262、血管抑制素(Angiostatin)、康普瑞汀A4(combretastatin A4)、西地尼布(cediranib)、索拉非尼(sorafenib)、沙利度胺(thalidomide)、瓦他拉尼(vatalanib)、DC-101、SNS-032、苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate)、司马沙尼(semaxanib)、CEP-7055、多韦替尼(dovitinib)、CP-547632、CP-564959、乐伐替尼(lenvatinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、GW-654652、替伏扎尼(tivozanib)、苯甲酰星形孢菌素(benzoylstaurosporine)、奥兰替尼(orantinib)、特西伐替尼(tesevatinib)、XL-999、福林替尼(foretinib)、凡德他尼(vandetanib)和ZK-304709。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述VEGF抑制剂和所述抗MUC16×CD3双特异性抗体或抗原结合片段是单独、依序或同时施用的。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述妇科癌症选自由以下组成的组：卵巢癌、输卵管癌、子宫癌和子宫内膜癌。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述VEGF抑制剂是口服、鼻内、肠胃外、静脉内、肌内、腹膜内、肌内、动脉内、皮下、鞘内、囊内、眶内、肿瘤内、皮内、经气管、脑室内或局部施用的。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述抗MUC16×CD3双特异性抗体或抗原结合片段是口服、鼻内、肠胃外、静脉内、肌内、腹膜内、肌内、动脉内、皮下、鞘内、囊内、眶内、肿瘤内、皮内、经气管、脑室内或局部施用的。