KR20120005891A

KR20120005891A - 유비퀴틴 특이적 프로테아제 44（ｕｓｐ４４）의 에피토프 펩타이드 및 이의 이용

Info

Publication number: KR20120005891A
Application number: KR1020100066580A
Authority: KR
Inventors: 백광현; 슈레쉬 바라티
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2010-07-09
Filing date: 2010-07-09
Publication date: 2012-01-17

Abstract

본 발명은 유비퀴틴 특이적 프로테아제 44(ubiquitin specific peptidase 44; USP44)의 에피토프 펩타이드, 이를 이용하여 제조된 항체 및 상기 항체의 이용 에 관한 것이다.

Description

유비퀴틴 특이적 프로테아제 44（ＵＳＰ４４）의 에피토프 펩타이드 및 이의 이용{UBIQUITIN SPECIFIC PROTEASE 44 EPITOPE PEPTIDE AND USES THEREOF}

유비퀴틴화(ubiquitination)는 다양한 생물학적 반응과 연관되어 있는 전사후 수식(post-translational modification)이다(Ciechanover A. EMBO J, 1998; 17: 7151-60.). 탈유비퀴틴화는 탈유비퀴틴화 효소의 작용에 의해 수행되는 유비퀴틴화의 반대 과정이며, 대상 단백질에 붙은 유비퀴틴을 제거하여 다양한 세포내 반응을 조절한다(Amerik AY, Li SJ, Hochstrasser M., Biol Chem, 2000; 381: 981-92.). 유비퀴틴화와 탈유비퀴틴화는 신호전달, 전사 조절, 세포주기 조절, 면역 반응, 세포 사멸, 암 생성에 관여한다. 다중 단백질의 유비퀴틴화는 유비퀴틴 활성화 효소(E1), 유비퀴틴 접합 효소(E2), 유비퀴틴 결합 효소(E3)의 순차적인 작용에 의해 이루어진다(Ciechanover A. EMBO J, 1998; 17: 7151-60.; 및 Koegl M, Hopper et al., Cell 1999; 96: 635-44.). 다중유비퀴틴이 결합된 단백질은 26S의 프로테아좀 통로에 들어가서 유비퀴틴에 의존하는 방식으로 분해된다(Pickart CM., Annu Rev Biochem, 2001; 70: 503-33.).

탈유비퀴틴화(deubiquitination)는 프로테아좀을 이용한 단백질 분해에서 중요한 역할을 한다. 탈유비퀴틴화 효소는 단백질 분해 효소의 집단으로, 주로 다중유비퀴틴 사슬을 제거하는 역할을 한다. 대부분의 탈유비퀴틴화 효소는 시스테인 프로테아제이고, 5 종류의 하위 패밀리로 분류된다. 여기에는 UCH(ubiquitin C-terminal hydrolase), USP(ubiquitin specific processing protease), JAMM(Jab1/Pab1/MPN-domain containing metallo-enzyme), OTU(Otu-domain ubiquitin aldehyde-binding proteins) 및 Ataxin-3/Josephin이 있다(Amerik AY, Hochstrasser M., Biochim Biophys Acta 2004; 1695: 189-07; 및 Baek KH., Curr Protein Pept Sci, 2006; 7: 171-7.). 유비퀴틴 특이적 프로테아제 44(ubiquitin-specific protease, 이하, 'USP44'라고 한다)는 USP 패밀리에 속한다. 인간 USP44의 유전자는 12번 염색체에 존재하고 712개의 아미노산으로 구성된 단백질을 형성한다(GenBank: NM_032147).

모든 USP는 Cys, His, Asn/Asp 잔기의 효소 활성부를 가지고 있다(Nijman SM et al., Cell 2005; 123: 773-86.; 및 Wilkinson KD. Cell Dev Biol 2000; 11: 141-8.). 그 밖의 도메인 구조로는 UBA(ubiquitin associated), DUSP(domain in USP), ZnF-UBP(zinc-finger ubiquitin specific protease) 등이 있다. 인간의 유전체 안에서 ZnF-UBP의 구조를 갖는 USP는 10종으로 USP3, USP5, USP13, USP16, USP20, USP22, USP33, USP44, USP45, USP49가 있다. ZnF-UBP 구조는 100개 가량의 잔기로 구성되며 효소 활성을 조절하는 데 필요하다.

세포의 탈유비퀴틴화 정도를 알아보기 위해서, USP44의 발현 정도를 확인해볼 필요가 있다. USP44가 세포유사분열 후기의 개시를 조절하므로 이에 특이적인 항체는 유사분열 동안의 분자신호전달을 연구하는 데 유효한 수단이 될 것이다.

본 발명자들은 USP44 단백질에 대한 연구를 계속하여, USP44의 신규 에피토프 및 USP44에 대한 항체를 개발하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 USP44의 에피토프 폴리펩타이드 및 이를 코딩하는 뉴클레오타이드를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 에피토프를 이용하여 USP44에 대한 항체를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 USP44에 대한 항체를 이용하여 검체의 탈유비퀴틴화 정도를 검사하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 USP44의 에피토프 폴리펩타이드 및 이를 코딩하는 뉴클레오타이드를 제공한다.

상기 USP44 유전자 정보는 이미 공개되어 있다(GenBank: NM_032147).

상기 USP44의 에피토프는 서열번호 1로 나타내었다. 상기 뉴클레오타이드는 서열번호 2에 기재된 뉴클레오타이드일 수 있다.

상기 “USP44의 에피토프 폴리펩타이드”는, 본 발명에서 “USP44 에피토프”, “USP44 폴리펩타이드” 또는 “USP44의 폴리펩타이드 에피토프” 등의 표현으로도 사용된다. 상기 폴리펩타이드는 발명의 상세한 설명과 특허청구의 범위에 사용된 바와 같이, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열 데이터를 가진다. 또한 상기 폴리펩타이드를 변형한 것, 예를 들면, 특정 부위 지향 돌연변이(site-directed mutation) 유발, 랜덤 돌연변이 유발 및 점돌연변이 유발 기술에 의한 변형 폴리펩타이드는 모두 본 발명의 범위에 속한다.

또한 “USP44의 에피토프 폴리펩타이드”, “USP44 에피토프” 또는 “USP44의 폴리펩타이드 에피토프”와 같은 용어들은, 이 용어들에 의해 언급된 펩타이드 및 단백질은 물론 실질적으로 상동성을 가지는 모든 유사체 및 대립유전자의 변형을 모두 포함한다.

상기 서열번호 1에 기재된 폴리펩타이드는, USP44의 178-190 aa 구간의 펩타이드인, “EPFQEKIVVKREV”(서열번호 1)이다.

본 발명은 상기 폴리펩타이드에 대한 항체를 제공한다.

"항체"는 특정 에피토프에 결합하는 항체 및 이의 단편을 포함하는 임의의 면역글로불린이다. 항체는 다양한 방식으로 변형될 수 있는바, 본 발명에서 “항체"란 용어는 특이적 결합 도메인을 보유한 임의의 특정 분자 또는 물질을 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 즉, 본 발명에서 “항체”란 용어는 항체 단편, 항체의 유도체, 기능성 등가물 및 상동물, 예컨대, 천연 유래인지 또는 전체 또는 부분 합성 유래인지의 여부에 관계없이 면역글로불린 결합 도메인을 함유하는 임의의 폴리펩타이드를 모두 포함한다. 따라서, 다른 폴리펩타이드에 융합된 면역글로불린 결합 도메인 또는 이의 등가물을 함유하는 키메라 분자도 포함된다.

본 발명에 따른 상기 항체는, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 및 항체 분자의 기능적인 단편, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv의 형태도 포함한다.

상기 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 재조합 항체를 제조하는 방법은 이 기술분야에 널리 알려져 있다.

다른 측면에서 본 발명은, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 USP44의 폴리펩타이드에 대한 항체를 이용하여 USP44 단백질의 발현 정도를 측정함으로써, 검체의 탈유비퀴틴화 정도를 검사하는 방법을 제공한다.

USP44는 세포 내에서 탈유비퀴틴 활성을 나타낸다. 본 발명에 따른 USP44에 대한 항체를 이용하면 검체(예를 들면, 세포)에서 USP44가 얼마나 발현되었는지를 알 수 있으므로, 검체의 탈유비퀴틴화 정도를 검사할 수 있다.

본 발명은 신규한 USP44의 에피토프 및 USP44에 대한 항체를 제공하므로, 이를 이용하여 세포 내의 USP44의 발현 정도를 쉽게 확인할 수 있다.

도 1은 USP44 단백질의 1차 구조(a) 및 10개의 USPs의 서열 얼라인먼트(b)를 나타낸 것이다. 80-100% 상동성을 가지는 보존 잔기들은 박스 표시하여 나타내었다.
도 2의 (a)는 USP44의 염기 서열과 아미노산 서열을 나타낸 것이다. DNASTAR(LaserGene)의 MegAlign 소프트웨어(Clustral method)를 사용한, 젠뱅크 (GenBank) 액세션 넘버 NM_032147로부터 유래된 USP44 아미노산 얼라이언먼트이다. (b)는 다른 탈유비퀴틴화 효소인 USP36 및 USP17과 USP44의 보존 도메인을 비교하여 나타낸 것이다. 보존 잔기들을 포함하는 이 도메인들은 탈유비퀴틴 효소의 기능에 중요한 역할을 한다.
도 3은 USP44 mRNA의 조직별 발현 양상을 나타낸 것이다. (a)는 마우스의 여러 조직에서의 USP44의 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다: 각 래인에 해당되는 조직은, 양성 대조군인 pDEST-myc-USP44 플라스미드(1 래인), 뇌(2 래인), 근육(3 래인), 난소(4 래인), 위(5 래인), 신장(6 래인), 폐(7 래인), 간(8 래인), 고환(9 래인), 지라(10 래인) 및 장(11 래인). 모든 조직은 기저치 수준(basal level)으로 조사되었다. (b)는 마우스의 여러 조직에 대한 인 시튜(in situ ) 혼성화법 분석 결과를 나타낸 것이다: 각 패널의 왼쪽 그림은 음성 대조군(센스 프로브)임.
도 4는 본 발명의 USP44 에피토프 폴리펩타이드에 대한 항체 검증 결과를 나타낸 것이다. (a)는 293T 세포에 감염된 USP44의 약 80 kDa의 단백질 검출 결과를 나타낸 것이다: 293T 세포는 pcDNA-6myc 벡터에 감염되거나(1 래인), pcDNA-6myc-USP44에 감염되었다(2 래인). (b)는 다양한 세포에서 USP44 항체가 USP44 단백질을 검출한 결과를 나타낸 것이다: 각각의 래인은 pcDNA-6myc-USP44에 감염된 세포주를 나타내는데, 구체적으로 293T(2 래인), Ba/F3 (3 래인), NIH3T3 (4 래인), MDCK (5 래인), HeLa (6 래인) 그리고 양성 대조군인 293T 세포(1 래인)이다. (c)는 USP44의 위치를 확인한 결과이다: 1번 패널은 항-USP44로 염색된 HeLa 세포를, 2번 패널은 DAPI 핵 염색을, 그리고 3번 패널은 통합 이미지를 나타낸 것이다.

본 발명에서는 USP44의 mRNA가 포유동물(예: 마우스)의 어느 조직에서 발현하는지 in situ 혼성화(hybridization) 기법으로 분석하였다. 동물의 각 조직에서 USP44의 mRNA는 RT-PCR로 다시 확인하였다. USP44가 세포유사분열 후기의 개시를 조절하므로 이에 특이적인 항체는 유사분열 동안의 분자신호전달을 연구하는 유효한 수단이 될 것이다. 본 발명에서는 USP44에 대한 항체를 생산했고, 이를 통해 약 80 kDa 크기의 단백질을 검출해 낼 수 있다. 이 항체는 웨스턴 블랏팅과 면역형광 분석법으로 규명하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실시예 1: 재료 및 방법

1-1: 세포 배양

293T(인간 배아 신장 세포주, ATCC에서 구입), NIH3T3(마우스 배아 섬유모세포, ATCC에서 구입), HeLa(인간 자궁경부암 세포주, ATCC에서 구입), Ba/F3(IL-3 의존적 마우스 pro-B 세포, ATCC에서 구입), MDCK(Madin-Darby 개 신장표피 세포, ATCC에서 구입)는 DMEM(GIBCO BRL, Rockville, MD, USA) 혹은 RPMI 1640 배양액에서 10% FBS(GIBCO BRL, Rockville, MD, USA), 1% 페니실린/스트렙토마이신(GIBCO BRL, Rockville, MD, USA)을 추가하여 배양하였다.

1-2: 항체 생산

인간 USP44에 대한 펩타이드 다중항체를 제작하기 위해 USP44의 178-190 aa 구간의 폴리펩타이드인, EPFQEKIVVKREV(서열번호 1)를 써모 사이언티픽사(Thermo Scientific, USA)에 의뢰하여 아미노산을 직접 축합시켜 제작하였고, 토끼 두 마리에 주사하여 항체의 생성을 유도했다. 일차 주사에서는 정제된 펩타이드(500 μg / 0.5 ml PBS buffer)를 동일 부피의 CFA(Complete Freud's adjuvant)와 섞어서 사용하였다. 2주 후에 이차 접종을 실시하였는데, 정제된 펩타이드(200 μg / 0.5 ml PBS buffer)를 동일 부피의 CFA(Complete Freud's adjuvant)와 섞어서 2차 접종을 수행하였다. 10일 후, 마지막 접종이 시행되었다. 전체 혈액은 혈청으로 분리되었다. 항체의 특이도는 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다.

상기 웨스턴 블랏팅은 다음과 같이 수행하였다. 세포 추출물은 10% SDS-PAGE를 이용해 단백질 크기별로 분리했고, PVDF 필름(Millipore, Bedford, MA, USA)에 이동시켰다. 이 필름은 블럭 용액(Tris-버퍼 식염수(TBS) 속 5% 비지방 건조 우유)에서 1 시간 반응시킨 후, 트윈20(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 포함한 TBS에 3번 씻어 주었다. 이후 필름은 제작한 항체의 혈청으로 10 시간 냉온에서 반응시킨 후, 트윈 20을 포함한 TBS로 3번 씻어주고, HRP 컨쥬게이티드 항-토끼 항체(SCBT, USA)에 상온에서 1 시간 반응시켰다. 원하는 단백질이 필름 위에 존재하는가를 확인하기 위해 화학발광(ECL) 탐지 시스템(AbFrontier, Seoul, Korea)을 이용해 감광하였다.

1-3: 형광현미경 분석

HeLa 세포를 덮개 유리에 깔고, PBS로 씻어주었다. 4%의 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 상온에서 10분간 고정하고 0.1% 트리톤 X-100/PBS로 세포막을 개방시켰다. 세포는 1%의 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 처리한 후 상온에서 1시간 방치하였다. 토끼 USP44 항체는 PBS-T(0.1% 트윈 20을 함유한 PBS)로 희석하여 처리하였고 4℃에서 밤새 반응시켰다. 세포는 PBS-T로 씻어냈고 TRITC 접합 염소 항토끼 IgG(Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA)로 상온에서 1시간 염색하였다. 세포핵은 DAPI(Vector laboratories, Peterborough, UK)로 염색하였고, 유리 슬라이드에 벡타쉴드 마운팅 미디엄(Vectashield mounting medium; Vetor laboratories, Peterborough, UK)을 이용해 올려졌다. 사진은 니콘 이클립스 50i(Nikon Eclipse 50i) 현미경으로 촬영하였다.

1-4: 바이오인포매틱스

구조상 동일한 유사한 시스테인(Cys) 잔기를 가지는 가상적인 탈유비퀴틴화 효소들은 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST)에 의해 이미 추려져 있다(Lee HJ et al., Gene Expr Patterns 2006; 6: 277-84.; Kim YK et al.,. Gene Expr Patterns 2007; 7: 143-8.). USP44는 최근에 가상의 탈유비퀴틴화 효소로서 지정되었고, USP44 유전자의 조성과 위치는 UCSC 지놈 바이오인포메틱스(http://genome.ucsc.edu)에 있는 인간 유전체 데이터베이스에서 분석하였다. 이 분석 작업은 USP36, USP22, USP42와 비교하여 수행하였다. 서열은 DNASTAR 프로그램으로 비교되었다.

1-5: 유전자 발현 벡터 및 세포 내 유전자 도입

pDEST-myc-USP44는 Dr. Yumei Leng(HHMI/Brigham and Women's Hospital, Boston, MA, USA)로부터 제공받았다. 포유류 발현벡터 pDEST-myc에서의 USP44는 in vivo 탈유비퀴틴 분석에 이용되었다.

pcDNA-6myc-USP44는 pcDNA3.1(Invitrogen, USA)의 유전자 발현 삽입부에 6myc 표지자와 USP44의 유전자의 ORF를 동조시켜서 삽입하여 제조하였다. 해당 DNA는 세포 내에서 6myc-USP44의 혼성 단백질을 생성한다.

각 세포에 USP44 포함 벡터를 감염시키기 위해, 유전자 발현 백터 DNA를 1 μg을 600 μl의 150 mM NaCl과 150 μl의 10 mM PEI (Polyscience, Warrington, PA, USA)에 혼합하였다. 혼합물을 상온에서 15분간 반응시키고 100 Φ 크기의 배양 접시에 5.4 ml 배양액에서 자라고 있는 세포에 처리하였다. 배양액은 시약 처리 5 시간 후에 교체하였다. 발현 클론의 DNA 서열은 자동서열 분석기인 ABI 3730XL DNA 분석기(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 분석하였다.

1-6: 인 시튜 혼성화법( in situ hybridization )

USP44 mRNA가 발현하는 조직을 보여주기 위해서 다양한 성체 마우스의 조직에 인 시튜 혼성화법(in situ hybridization)을 시행하였다. 성체 마우스의 조직은 100 mM PBS(pH7.4)에 용해된 4% 파라포름알데하이드로 4℃에서 밤새 고정하였다. 표본은 에탄올 경사법을 이용해 탈수시켰고 파라핀으로 빈공간을 채웠으며 5 μm의 두께로 절편을 만들었다. 침수 후, 분석은 인 시튜 혼성화법 키트(InnoGenex, San Ramon, CA, USA)로 시행하였다. 인 시튜 혼성화법의 특이도를 확인하기 위해, 센스 프로브로 표지된 대조군표본을 안티센스로 표지된 실험군 표본과 비교하였다.

1-7: RT - PCR 에 의한 발현 분석

마우스의 여러 조직에서 USP44 mRNA의 발현을 조사하기 위해서 RT-PCR 분석을 수행하였다. 마우스의 여러 가지 조직은 공지된 방법으로 분리하였다(Lim SK et al., Int J Oncol 2004; 24: 357-64.) 발현량의 차이를 비교하는 기준으로는 GAPDH 유전자를 사용하였으며, 사용한 프라이머 염기서열은 다음과 같다:

포워드 프라이머: 5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3' (서열번호 3)

리버스 프라이머: 5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3' (서열번호 4)

실시예 2: USP44 의 구조 분석

고유한 위치에 Cys, His, Asn/Asp 잔기를 갖는 가상적 탈유비퀴틴화 효소를 검증하기 위해서, NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 제공하는 BLAT 알고리듬을 이용하여 GenBank의 데이터베이스를 검색하였고, QQD-box에 존재하는 QEDAHEFL 시퀀스를 검색 대상으로 하였다. 가상적인 탈유비퀴틴화 효소인 USP44가 징크-핑거 유비퀴틴-특이적 프로테아제 도메인(zinc-finger ubiquitin-specific protease domain)을 29번에서 97번 아미노산 서열 위치에 가지고 있고 UCH 도메인을 273번에서 679번 아미노산 서열 위치에 가지고 있음을 확인했다(도 1a). ZnF-UBP 도메인을 갖는 10종의 USP 유전자를 비교한 결과를 도 1B에 수록하였다. USP44는 고유한 위치에 Cys, His, Asn/Asp 잔기를 가지고 있다(도 2a). 도 2a에서, UCH 도메인은 실선 밑줄로 구분하였고, Zn-UBP 도메인은 점선 밑줄로 구분하였다. USP 유전자들 사이의 서열상의 유사점은 고유한, Cys, His, Asn/Asp 잔기에 국한된다(도 2b). 인간의 USP44의 유전자는 염색체 12에 위치하고 있고 5개의 엑손으로 구성된다. 서열분석을 통해서 USP44는 2139 bp의 오픈 리딩 프레임(ORF)를 가지고 있으며, 이것이 712개의 아미노산을 갖는 80kDa의 펩타이드로 번역되는 것을 알 수 있었다. USP44의 펩타이드 서열에 의해 유추해 낸 등전점(pI)은 7.9이다. 등전점 계산은 CALCULATOR v3.3 프로그램을 이용하였다(http://www.scripps.edu/~cdputnam/protcalc.html). 하기 표 1 은 USP 44 유전자의 엑손과 인트론 크기를 상세하게 나타낸 것이다.

실시예 3: 마우스 조직에서 USP44 mRNA 의 발현위치

마우스의 뇌, 근육, 난소, 위장, 신장, 폐, 간, 정소, 비장, 소장에 RT-PCR을 수행하였다. pDEST-myc-USP44를 양성 대조군으로 사용하였다(도 3a, 1번 래인). USP44 mRNA는 검사한 모든 조직에서 발현하였고, 정소, 비장, 폐, 위장, 난소에서 강하게 발현하였다(도 3b). 마우스 조직에서 USP44에 특이적인 mRNA 발현을 보여주기 위해, 인 시튜 혼성화법을 수행하였다. USP44 mRNA는 뇌의 cuboidal epithelium(도 3b; a-1, 화살표)의 세포질과 백질 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte)(도 3b; a-2, 화살표), 신장의 컬렉팅 튜불(collecting tubule)(도 3b, d-1, 화살표), 정소의 라히디히(Leydig) 세포(도 3b; g-1, 화살표)와 고환의 정상피(seminiferous epithelium), 난소의 간질세포(interstitial cell) (도 3b; h-1, 화살표)를 포함하는 다양한 조직에서 발현하였다. USP44는 소장의 상피에 풍부하고(도 3b; c-1, 화살표), 간의 간세포와 간세동이 상피세포(portal triad epithelium)(도 3b; f-1, 화살표), 췌장의 외분비세포, 피부의 표피(도 3b; j-1, 화살표)와 헤어 폴리클(hair follicle)(도 3b; j-2, 화살표), 위장의 상피(도 3b; l-1, 화살표)에 풍부하였다. 그러나 USP44는 심장의 심근(mycocardium), 난소의 난포막(theca folliculi)(도 3b; h), 비장의 적색 속질(red pulp)(도 3b; k,l)에서는 약하게 발현하였다. USP44는 소장의 점막근층(muscularis mucosae), 신장의 근위 세뇨관(proximal tubule)과 사구체(glomerulus)(도 3b; d-1, 화살표), 난소의 난자(도 3B; h), 췌장의 랑게르한스(Langerhans)(도 3b; i-1, 화살표)와 혈관(도 3b; i), 피부의 진피(도 3; j), 비장의 림프소절(lymphoid nodule)(도 3b; k), 위장의 점막근층(muscularis mucosae)과 벽세포(parietal cell)(도 3b; l-1, 화살표)에서는 발현하지 않았다.

실시예 4: 다양한 세포주에서 USP44 의 발현

USP44의 서열에서 항원성과 소수성을 분석하였다(항원성은 Hopp & Woods Proc Natl Acad Sci, USA 86:152-156를, 소수성은 Kyte & Doolittle, J Mol Biol, 157:105-132를 참고하여 분석함). 정제된 펩타이드(EPFQEKIVVKREV: 서열번호 1)는 토끼에서 다중 항체 혈청을 생산하는 데 항원으로 사용하였다. 생산한 토끼의 다중항체는 웨스턴 블랏팅으로 특이성을 확인하였다. pcDNA3-myc-USP44이 도입된 세포를 양성 대조군(2 래인)으로 사용하였고 pcDNA3-myc이 도입된 세포를 음성 대조군(1 래인)으로 사용하였다. 항체는 1:250의 희석 상태에서, 약 80 kDa의 크기를 갖는 단백질이 검출되었(도 4a). 다음으로 세포에 내재한 USP44를, 293T(도 4b의 2 래인), Ba/F3(3 래인), NIH3T3(4 래인), MDCK(5 래인), HeLa(6 래인) 등의 세포주에서 검사하였다. USP44 단백질은 NIH3T3에서 강하게 발현하고 HeLa에서는 비교적 적게 발현하였다(도 4b).

실시예 5: 세포핵에 위치하는 USP44

USP44의 세포내 위치를 확인하기 위해서 HeLa 세포를 파라포름알데하이드로 고정하였고, USP44의 항체로 염색하였다. 면역형광분석에서 USP44(붉은색)는 주로 세포핵에 위치하였고 세포 전반에 걸쳐 분포하였다(도 4c). 세포염색은 DAPI를 이용하여 세포핵을 염색하는 방법으로 검증하였다.

유비퀴틴화는 세포 단백질이 유비퀴틴 의존적으로 분해되기 위해서 필요한 기작이다. 세포 주기의 진행, 성장의 조절, 신호 전달, 유전자 발현 조절과 같은 많은 생물학적인 과정이 유비퀴틴화 기작을 통해서 조절된다. 유비퀴틴화와 탈유비퀴틴화는 세포의 항상성을 유지하기 위해서 중요한 역할을 한다. USP44는 고유한 위치에 Cys, His, Asp/Asn으로 구성된 효소활성부를 가지고, 이것이 탈유비퀴틴화 효소의 특성이 된다. USP44는 ZnF-UBP 도메인을 가진 10종의 USP 중에 포함된다(Quesada V et al., Biochem Biophys Res Commun 2004; 314: 54-62 및 Bonnet J et al., Trends Biochem Sci 2008; 33: 369-75). 최근에는 USP44가 유사분열 후기의 개시를 조절하는 관여하고 있다고 보고되었다(Stegmeier F et al., Nature 2007;19:876-81). USP44는 in vitro와 in vivo에서 APC 보조활성제(coactivator)인 Cdc20을 탈유비퀴틴화 시킴으로써 APC를 저해하는 Mad2-Cdc20 복합체의 형성을 안정화시킨다(Stegmeier F et al., Nature 2007;19:876-81). USP44가 APC 인히비터리 Mad2-Cdc20 복합체의 중요한 조절자이기 때문에, 이 단백질의 안정성은 적당한 세포분열을 유지하기 위해 필요하다.

USP44 mRNA의 발현 양상을 다양한 마우스 조직에서 인 시튜 혼성화법 기술을 통해서 분석하였다(도 3b). USP44 mRNA는 거의 모든 마우스 조직에서 발현하였고, 특히 폐, 췌장, 피부, 간, 위장, 소장에서 강하게 발현하였다. RT-PCR 결과는 정소, 비장, 폐, 위장, 난소에서 강한 발현을 확인하였다(도 3a).

USP44에 대한 다중 항체를 제작하여 다양한 포유류 세포주에서 USP44의 발현 양상을 확인하였다. NIH3T3 세포에서 약 80 kDa 크기인 내재 USP44의 강한 발현을 확인하였고 HeLa 세포에서도 약한 발현을 확인하였다(도 4b). 다중항체를 제작하기 위해 고안된 에피토프 펩타이드는 마우스 USP44와 66%의 동일하였으므로, 마우스와 인간 샘플 모두에서 사용할 수 있다. 이 항체를 면역형광법을 통하여서도 검증하였다. 면역형광법은 USP44가 주로 세포핵에 위치하고 세포질 전역에 약하지만 고루 분포함을 보여주었다(도 4c).

<110> CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> UBIQUITIN SPECIFIC PROTEASE 44 EPITOPE PEPTIDE AND USES THEREOF <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope peptide <400> 1 Glu Pro Phe Gln Glu Lys Ile Val Val Lys Arg Glu Val 1 5 10 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope peptide DNA <400> 2 gaaccatttc aggaaaaaat agtagtaaaa agagaagta 39 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 3 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverser primer <400> 4 tccaccaccc tgttgctgta 20

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 유비퀴틴 특이적 프로테아제 44(USP44)의 에피토프인 폴리펩타이드.
서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드.
제2항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 것인 뉴클레오타이드.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 USP44의 에피토프 폴리펩타이드에 대한 항체.
제4항에 있어서, 상기 항체는 폴리클로날 항체인 항체.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 USP44의 에피토프 폴리펩타이드에 대한 항체를 이용하여 USP44 단백질의 발현 정도를 측정함으로써, 검체의 탈유비퀴틴화 정도를 검사하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 항체는 폴리클로날 항체인, 검체의 탈유비퀴틴화 정도를 검사하는 방법.