CN111699389A - 使用蛋白质标记物grp78选择高效干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用蛋白质标记物GRP78选择高效干细胞的方法，更具体地，涉及其中仅分离高效干细胞而去除GRP78表达降低的衰老干细胞的方法。使用根据本发明的蛋白质标记物GRP78允许通过去除衰老干细胞仅高效干细胞获得分离。因此，蛋白质标记物GRP78能够用作用于控制干细胞治疗产品质量、评估其稳定性和有效性的有效指标材料，并且用于制备治疗功效优异的干细胞治疗产品。

Description

使用蛋白质标记物GRP78选择高效干细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种使用蛋白质标记物GRP78筛选高效干细胞的方法，更具体地，涉及一种去除GRP78表达降低的衰老干细胞并仅分离高效干细胞的方法。
背景技术
近年来，通过将诸如胚胎干细胞和成体干细胞之类的干细胞分化为各种细胞，已经进行了关于使用干细胞作为细胞疗法的可能性的各种研究。由于具有分化为多种细胞的能力，多能胚胎干细胞作为细胞治疗产品引起了人们的关注。然而，胚胎干细胞的使用带来了伦理问题，因此在实践中难以将这些胚胎干细胞用于细胞疗法。为了避免这些伦理问题，已经积极地进行了关于使用成体干细胞的研究(神经科学趋势“Trends inNeurosciences”23：450，2000)。
尽管成体干细胞具有缺点：当将这些细胞移植到他人时，它们具有感染风险并且具有相对较低的分化潜能，但是这些细胞具有能够大量获得和对医疗应用非常安全的优势。具体地说，即使将这些细胞移植到体内进行器官再生，它们也不会引起癌症，也不会引起免疫排斥，因为它们起源于成人。因此，这些成体干细胞可用于自体移植。此外，成体干细胞根据周围组织的特征具有位点特异性分化潜能，即使以未分化状态注射也不会引起癌症。因此，这些成体干细胞有利地具有在移植后立即产生需要细胞的潜力，并且如果需要，还具有产生和储存未分化干细胞的自我更新的潜力(JACC：转化科学基础2“JACC：Basic toTranslational Science 2”：702-716，2017)。
将干细胞开发成细胞治疗产品期间，长时间培养分离的干细胞的过程对于获得具有最佳治疗效果所需的细胞数量至关重要。由于长期培养，不可避免地在混合大量衰老细胞或混合各种传代细胞的状态下进行细胞治疗产品的开发。这可能会导致干细胞治疗产品的稳定性和有效性以及质量控制方面的问题(欧洲细胞与材料“European Cells andMaterials”31：136-159，2016)。因此，为了使用成体干细胞开发细胞治疗产品，需要筛选由于长期培养而混合的衰老细胞的方法。尽管实际上已经进行了各种努力来控制干细胞治疗产品的质量，但是建立的明确标记物仍然不足。
因此，本发明人进行了大量的工作以寻找可用于去除衰老干细胞并仅筛选高效干细胞的标记物，结果，发现在成体干细胞的长期培养中随着传代次数增加与葡萄糖代谢相关的蛋白质GRP78可以用作衰老相关的干细胞标记物，从而完成了本发明。
本背景技术部分中公开的以上信息仅用于增强对本发明背景技术的理解。因此，它可能不包含构成本发明所属领域中已知的传统技术的信息。
发明内容
本发明的目的是提供用于使用成体干细胞开发干细胞治疗产品并控制干细胞治疗产品质量的标记物GRP78。
本发明的另一个目的是提供去除衰老干细胞并分离高效干细胞以产生功效优异的干细胞治疗产品的方法。
本发明的又一个目的是提供使用蛋白质标记物GRP78筛选高效干细胞的组合物和试剂盒。
为了实现上述目的，本发明提供使用GRP78的特异性抗体或适体分离高效干细胞的方法。
本发明还提供用于筛选高效干细胞的组合物，该组合物包含能够测量GRP78基因的mRNA或该基因编码的蛋白质的表达水平的试剂。
本发明还提供用于筛选高效干细胞的试剂盒，该试剂盒包含该组合物。
本发明还提供筛选高效干细胞的方法，该方法包括以下步骤：(a)从干细胞中提取DNA或蛋白质；(b)测量GRP78基因的mRNA或该基因编码的蛋白质的表达水平；(c)将测得的基因的mRNA或基因编码的蛋白质表达水平与对照进行比较；(d)如果与对照相比表达水平增加，则选择干细胞作为高效干细胞。
附图说明
图1a示出经衰老的成体干细胞的形态变化。
图1b示出年轻细胞和衰老细胞的成体干细胞特异性细胞标记物的变化。
图1c示出在传代过程中成体干细胞是否具有衰老细胞特征的检测结果。
图2示出从不同代的成体干细胞的蛋白质组学分析结果中显著获得GRP78。
图3示出衰老成体干细胞中GRP78基因水平的变化。
图4示出衰老成体干细胞中GRP78蛋白质水平的变化。
图5示出在衰老过程中GRP78在细胞中的表达位置。
图6示出GRP78蛋白质水平是成体干细胞特有的变化。
图7示出在各细胞区域中GRP78蛋白质的表达水平。
图8示出通过使用磁体的分离方法从成体干细胞分离GRP78后的GRP78表面标记物。
具体实施方式
除非另外定义，否则本说明书中使用的所有技术和科学术语具有与本领域的技术人员通常理解的相同含义。通常，本说明书中使用的术语是本领域公知的并且是常用的。
在本发明中，通过检查随着成体干细胞衰老的蛋白质组学变化，鉴定在衰老干细胞中表现出显著表达变化的GRP78(葡萄糖调节蛋白质78)。可以确认，随着衰老进展，干细胞中的GRP78基因和蛋白质的表达明显降低，衰老干细胞中GRP78蛋白质向细胞质和膜的转运减少，而GRP78蛋白质在细胞质和膜中的表达显著降低。此外，可以证实，使用MACS(磁激活细胞分选)可以去除不表达GRP78蛋白质的衰老干细胞，并选择性地仅分离在膜中表达GRP78蛋白质的高效干细胞。
因此，本发明的一个方面涉及使用GRP78的特异性抗体或适体分离高效干细胞的方法。
在本发明中，该方法可以包括以下步骤：(a)将GRP78特异性一抗结合至干细胞；(b)将固定有二抗的珠子与一抗结合；(c)使用MACS(磁激活细胞分选)分离表达GRP78的干细胞。
在本发明中，高效干细胞可以在膜中表达GRP78。
在本发明中，步骤(c)可以进一步包括去除在细胞膜中表达低水平的GRP78的干细胞的步骤，并且细胞膜中表达低水平的GRP78的干细胞可以是衰老干细胞。
本发明的GRP78的核苷酸序列和氨基酸序列可以从诸如NCBI的GenBank(例如GenBank登录号AAA52614.1)之类的已知数据库获得。
在本发明中，干细胞优选为成体干细胞，但不限于此。
如本文所用，术语“干细胞”是指能够分化为动物的内胚层、中胚层和外胚层细胞的多能细胞，或能够分化为组织或功能紧密相关的细胞的多潜能细胞。该术语是指具有自我更新能力并能够分裂为两个或多个新细胞的细胞，并且干细胞可以分为全能干细胞、多能干细胞和多潜能干细胞。
如本文所用，术语“成体干细胞”是指通过从每种组织中分离干细胞并在体外培养分离的干细胞而获得的多潜能细胞，包括骨髓干细胞、视网膜干细胞，视网膜穆勒神经胶质细胞、神经干细胞等。干细胞可源自哺乳动物，包括人和灵长类动物，以及牲畜，例如牛、猪、绵羊、马、狗、小鼠、大鼠和猫。优选地，干细胞可以源自人。
如本文所用，术语“衰老”是指成体干细胞的分化或增殖能力由于个体年龄的增加或传代次数的增加而降低。
如本文所用，术语“传代”是指在以下方法中的替换培养容器或分隔并培养细胞群：其中一部分细胞定期转移到新鲜培养容器中以在健康状态长期连续培养细胞，然后在更换培养基的同时连续传代培养细胞。一次传代是指一次更换培养容器或分隔并培养细胞群。在本发明中，低代或年轻代干细胞可以指分化能力或治疗作用高的干细胞，而高代或衰老代干细胞可以指分化能力或治疗作用低的干细胞，但不限于此。
在本发明中，年轻代可以为0至3代，优选为0至2代。另外，衰老代可以为15至25代，优选地20至25代。
也就是说，本发明中的“衰老干细胞”是指成体干细胞的分化或增殖能力由于传代次数的增加而降低的干细胞，“高效干细胞”是指作为细胞治疗产品具有优异疗效的干细胞，因为其中的成体干细胞具有非常高的分化或增殖能力。换句话说，“高效干细胞”是指具有等同于年轻代干细胞的分化或增殖潜能的那些细胞。
本发明的另一个方面涉及用于筛选高效干细胞的组合物，该组合物包含能够测量GRP78基因的mRNA或该基因编码的蛋白质的表达水平的试剂。
在本发明中，能够测量mRNA表达水平的试剂优选为能够扩增GRP78基因的引物或与GRP78基因特异性结合的探针，但不限于此。
此外，所述组合物可以进一步包含能够扩增样品的DNA的扩增器件，并且还可以任选地包含用于从样品中提取基因的器件。通过PCR扩增样品的DNA的方法和从样品中提取基因的方法是本领域已知的，在此省略其详细描述。
如本文所用，术语“引物”是指具有短的游离3'-末端羟基的核酸序列，其是可以与互补模板形成碱基配对的短核酸序列并用作模板链复制的起点。引物可以在合适的温度下在合适的缓冲液中在用于聚合的试剂(例如，DNA聚合酶或逆转录酶)和四种不同的核苷三磷酸的存在下引发DNA合成。PCR条件以及正义和反义引物的长度可以基于本领域已知的那些进行修改。
如本文所用，术语“探针”是指核酸，例如RNA或DNA的片段，其可以与mRNA特异性结合并且长度为数个核苷酸至数百个核苷酸。由于探针已被标记，因此它可以确定是否存在特定的mRNA。
可以将探针构建为寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针、RNA探针等。可以基于本领域已知的那些来修饰合适的探针和杂交条件。
本发明的引物或探针可以通过氨基磷酸酯固体载体法或其他公知的方法化学合成。该核酸序列也可以使用本领域已知的众多手段进行修饰。该修饰的非限制性实例包括甲基化、加帽、被天然核苷酸的一个或多个同源物取代，以及核苷酸之间的修饰，例如，修饰成不带电荷的接头(例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)或带电荷的接头(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。
在本发明中，用于测量蛋白质表达水平的试剂优选是GRP78基因编码的蛋白质的特异性抗体或适体，但不限于此。
可以在本发明中使用的在蛋白质水平上的定性或定量检测/测量方法的实例包括蛋白质印迹(Western blotting)、ELISA、放射免疫测定、免疫扩散、免疫电泳、免疫组织染色、免疫沉淀测定、补体固定测定、与溶液/悬浮液中标记抗体结合、质谱或使用抗体的蛋白质阵列等。
在该方法中使用的试剂或药剂是已知的。例如，它可以是与标记物特异性结合的抗体、底物、核酸或肽适体、或与标记物特异性相互作用的受体、配体或辅因子、或可以与蛋白质特异性结合的抗体、抗体片段、适体、亲和力多聚体(avidity multimer)或拟肽(peptidomimetics)。
如本文所用，术语“抗体”是指可以与蛋白质或肽分子的抗原性位点特异性结合的蛋白质分子。可以通过按照常规方法将每个基因克隆到表达载体中以获得由标记基因编码的蛋白质，并按照常规方法从所得蛋白质生产抗体来生产该抗体。抗体的形式没有特别限制，并且多克隆抗体、单克隆抗体或其具有抗原结合能力的部分包括在本发明的抗体中，并且所有免疫球蛋白质抗体，特异性抗体例如人源化抗体等还可被包括在本发明的抗体中。此外，抗体不仅包括具有两个全长轻链和两个全长重链的完整抗体，而且包括抗体分子的功能片段。表述“抗体分子的功能片段”是指至少具有抗原结合能力的片段，功能片段的实例包括Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv等。
在本发明中，抗体可以是可以与GRP78蛋白质特异性结合的抗体。优选地，它可以是能够特异性结合GRP78蛋白质的多克隆抗体、单克隆抗体或其一部分。
在本发明中，高效干细胞可以是非衰老的年轻细胞。
在本发明中，年轻的干细胞可以具有0至3、优选地0至2的传代数。另外，衰老干细胞可以具有15至25、优选地20至25的传代数。
即，本发明中的“衰老干细胞”是指由于传代次数的增加，成体干细胞的分化或增殖能力降低的干细胞。“高效干细胞”是指作为细胞治疗产品具有优异疗效的干细胞，因为其中的成体干细胞具有非常高的分化或增殖能力。换句话说，“高效干细胞”是指那些具有等同于年轻代干细胞的分化或增殖能力的细胞。
本发明的另一方面涉及用于筛选高效干细胞的试剂盒，该试剂盒包含能够测量GRP78基因的mRNA或该基因编码的蛋白质的表达水平的试剂。
在本发明中，试剂盒可以是RT-PCR试剂盒、DNA芯片试剂盒或蛋白质芯片试剂盒。
本发明的试剂盒可以是由适于分析方法的一种或多种组合物、溶液或器械组成的诊断试剂盒，并且可以是RT-PCR试剂盒、DNA芯片试剂盒或蛋白质芯片试剂盒。除了标记基因的各特异性引物对之外，RT-PCR试剂盒还可包含试管或其他合适的容器、反应缓冲液、脱氧核苷酸(dNTP)、酶，诸如Taq聚合酶和逆转录酶、DNA酶或RNA酶抑制剂、DEPC水、无菌水等。此外，它可以包含用作定量对照的基因的特异性引物对。DNA芯片试剂盒可以包含基片，其中连接有对应于所述基因的cDNA或其片段作为探针。基片可以包含对应于定量对照基因的cDNA或其片段。
此外，根据本发明的试剂盒可以是诊断试剂盒，其包括用于测量蛋白质水平的试剂，其中用于测量蛋白质水平的试剂优选为该蛋白质的特异性抗体。因此，包含用于测量蛋白质水平的试剂的试剂盒可以是，例如用于检测标记物的试剂盒，其包含进行ELISA所需的必需成分。该试剂盒还可包含可检测形成“抗原-抗体复合物”的抗体的试剂，例如标记的第二抗体、生色团、酶(例如，与抗体缀合)及其底物。而且，它可以包含对照蛋白质的特异性抗体以进行定量。
此外，可以通过测量检测标记的信号强度来定量测定形成的抗原-抗体复合物的量。这样的检测标记可以选自但不必限于酶、荧光物质、配体、发光物质、微粒、氧化还原分子和放射性同位素。
测量蛋白质水平的分析方法包括但不必限于蛋白质印迹、ELISA、放射免疫测定、放射免疫扩散、欧氏(Ouchterlony)免疫扩散测定、火箭免疫电泳测定、免疫组织染色测定、免疫沉淀测定、补体固定测定、荧光激活细胞分选仪(FACS)、蛋白质芯片测定等，蛋白质水平可以使用本领域技术人员已知的方法来测量。
本发明的另一方面涉及筛选高效干细胞的方法，该方法包括以下步骤：(a)从干细胞中提取DNA或蛋白质；(b)测量GRP78基因的mRNA或该基因编码的蛋白质的表达水平；(c)将测得的基因的mRNA或基因编码的蛋白质表达水平与对照进行比较；(d)如果与对照相比表达水平增加，则选择干细胞作为高效干细胞。
在本发明中，优选通过选自但不限于聚合酶链反应(PCR)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、实时PCR，RNA酶保护测定(RPA)、微阵列和核酸印记(Northern blotting)中的任何一种检测基因的mRNA表达。
在本发明中，优选通过选自但不限于蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)、放射免疫扩散，酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀、流式细胞仪、免疫荧光测定、欧氏测定、补体固定测定和蛋白质芯片测定中的任何一种来测量蛋白质的表达水平。
在本发明中，对照可以是衰老干细胞，高效干细胞可以是非衰老的年轻干细胞。
在本发明中，年轻的干细胞可以具有0至3、优选地0至2的传代数。此外，衰老干细胞可以具有15至25、优选地20至25的传代数。
即，本发明中的“衰老干细胞”是指成体干细胞的分化或增殖能力由于传代次数的增加而降低的干细胞，“高效干细胞”是指由于其中的成体干细胞具有非常高的分化或增殖能力而具有作为细胞治疗产品的优异功效的干细胞。换句话说，“高效干细胞”是指具有与年轻代干细胞等同的分化或增殖能力的那些细胞。
实施例
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施例仅用于说明本发明，并且本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1：衰老干细胞的表征
(1)细胞形态的变化
为了确认细胞形态随着成体干细胞衰老的进展如何变化，在显微镜下观察各代的细胞形态。具体地，将细胞于含有10％FBS和1％AA/PS的DMEM培养基中悬浮并培养，然后用DPBS洗涤两次。以相当于细胞培养液的约1/6的量添加0.25％的胰蛋白酶-EDTA，并通过在36.5℃、5％CO2培养箱中孵育3分钟来分离细胞。为了抑制胰蛋白酶-EDTA的作用添加中和剂，然后离心机中以3000rpm于4℃离心5分钟。将收集的细胞再次培养于DMEM培养基中。更换培养基，将细胞从第6代培养至第23代。
作为培养的结果，观察到随着传代次数的增加，成体干细胞具有较宽的面积和较薄的边缘(图1a)。
(2)成体干细胞标记物表达的变化
为了检查成体干细胞标志物表达的变化，检测细胞表面标志物，并使用图1b示出的流式细胞术。首先，培养调节数量的年轻细胞和衰老细胞，并对细胞进行抗原-抗体反应和荧光反应。CD90用作间充质干细胞的标志物，其表明分化能力随着衰老的进展而降低。CD146用作骨骼蛋白质标记物，其表明构成细胞骨架的蛋白质随着衰老的进展而减少。
(3)衰老相关(SA)-β-Gal分析的结果
为了检查成体干细胞在传代过程中是否具有衰老细胞的特征，进行了SA-b-gal分析。培养各代相同数量的细胞，并使用X-gal和溶液得出结果，以便将衰老细胞染成蓝色(图1c)。
这表明，随着传代次数的增加，成体干细胞具有衰老细胞的特征。
实施例2：蛋白质组学分析结果
为了检查蛋白质组学随着成体干细胞衰老的进展而发生的变化，使用各代培养的每个细胞团进行了蛋白质组学分析。具体而言，直接加入2DE裂解液以定量提取的蛋白质，每个样品使用100μg，然后2DE上运行凝胶并用碱性银染色。通过比较染色斑点进行图像分析。使用PDQuest软件(7.0版，伯乐)进行定量分析以检查扫描图像中蛋白质斑点的表达变化。通过总有效斑点强度将每个斑点的数量归一化，并选择与衰老细胞相比显示至少2倍的表达显著变化的蛋白质斑点。作为蛋白质鉴定的结果，选择了已显示为显著的葡萄糖调节的蛋白质78(以下称为GRP78)(图2)。
实施例3：检查衰老成体干细胞中GRP78基因表达
采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检查衰老成体干细胞在基因水平上的GRP78表达变化。收集各代的成体干细胞后，用DPBS洗涤细胞表面两次。使用TRIzol、氯仿和异丙醇仅提取RNA，使用75％的乙醇增高RNA提取物的纯度。将所得的RNA提取物合成为cDNA，并且仅DNA的GRP78基因被复制并通过PCR扩增。将扩增产物在含有生态染料的2％琼脂糖凝胶上于100V进行电泳30分钟，然后用UV照明器观察条带。
同时，每次传代使用相同量的cDNA，并且为了证明整个RT-PCR过程是一致进行的，每次传代提取的cDNA的量用于检查GAPDH基因的表达水平。
结果，如图3中所示，证实成体干细胞中GRP78的遗传水平随着衰老的进展而降低。
实施例4：检查衰老成体干细胞中GRP78蛋白质的表达
收集各代成体干细胞，然后用DPBS洗涤细胞表面两次。接着，使用RIPA缓冲液(25mM Tris-HCl Ph 7.6、150mM NaCl，1％NP-40、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS)提取细胞内蛋白质部分。通过BCA(二辛可宁酸)测定以白蛋白为标准物定量提取的蛋白质，并用于检查细胞中GRP78蛋白质表达。
制备12％SDS(十二烷基硫酸钠)-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，加载每代30μg定量蛋白质样品，并在制备的SDS-PAGE上进行电泳，以使根据大小分离提取的细胞内蛋白质。电泳后，通过电印迹将根据凝胶上大小分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。
在转移到膜上的具有不同大小的蛋白质中，提取与GRP78大小相对应的膜部分。将取出的膜放入通过向含有GRP78特异性抗体的TTBS中添加5％脱脂缓冲液而得到的封闭缓冲液中，在摇床上与抗体在4℃的低温下一起温育。用一抗(以1：1,000的比例稀释)温育后，还将膜与兔IgG-HRP(辣根过氧化物酶)偶联的，一抗的特异性二抗(以1：3,000的比例稀释)进行温育。通过ECL(增强化学发光)进行检测。
同时，每次传代使用相同量的蛋白质，为了证明整个蛋白质印迹过程始终如一，使用β-肌动蛋白质抗体检测各代提取的蛋白质的表达水平。
结果，如图4所示，证实成体干细胞中GRP78蛋白质的水平随着衰老的进展而降低。
实施例5：随衰老GRP78的细胞内分布的变化
使用免疫荧光测定法(IFA)，检测取决于成体干细胞衰老的GRP蛋白质的细胞内分布。
将各代细胞在覆盖有盖玻片的6孔板的不同孔中培养至一定细胞数量。在显微镜下观察孵育达到相同细胞数量的各个孔板，然后除去培养基。用DPBS洗涤细胞两次以除去残留的细胞碎片，然后在室温下用2ml的4％多聚甲醛(PFA)固定10至20分钟。通过用0.05至0.25％的Triton X-100/PBS溶液温育10至15分钟，使固定的细胞透化。温育完成后，将细胞用PBS洗涤3次，每次10分钟，并用3％BSA(牛血清白蛋白)溶液封闭1小时。封闭完成后，将封闭缓冲液完全去除，并用纸巾(Kimwipe)小心清除边缘的水分。将GRP78抗体在3％BSA/PBS溶液中以1：100的比例稀释，并与细胞孵育24小时。此时，将细胞置于4℃的腔室振荡器中，以使反应良好地进行。与一抗的孵育完成后，将细胞用PBS洗涤3次，每次10分钟。为了结合二抗，将适合宿主的荧光偶联的二抗以1：500的比例加入至3％BSA/PBS溶液中，并与细胞一起孵育。此时，将板置于4℃的腔室振荡器上，并增加湿度以使其变湿。与二抗的温育完成后，将细胞用PBS洗涤3次，每次10分钟，并用DAPI染色以进行细胞核染色。为防止自发荧光，添加1mg/ml PBS中的硼氢化钠(NaBH4)作为淬灭溶液，并反应5分钟。淬灭完成后，将细胞用PBS洗涤3次，每次10分钟，并用固定溶液固定。将样品完全干燥，然后在共聚焦显微镜下观察。
结果，如在图5的图像中可以看到的，证实在年轻代中，GRP78蛋白质在包括膜位置在内的细胞质区域中均匀地表达/分布，并且在较老代中，GRP78蛋白质仅在细胞核位置上特异性表达。可以证实随着细胞衰老的进展，细胞核中GRP78蛋白质向细胞质和膜的转运减少。
实施例6：成体干细胞的特异性GRP78蛋白质
根据以上实施例4的方法，在每次传代中收集成体干细胞、癌细胞和成纤维细胞。用DPBS洗涤各代细胞表面两次，然后使用RIPA缓冲液(25mM Tris-HCl pH 7.6、150mMNaCl、1％NP-40、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS)提取细胞内蛋白质。通过BCA(二辛可宁酸)测定以白蛋白为标准物对提取的蛋白质进行定量，并用于检测细胞中GRP78的蛋白质表达。
制备了10％的SDS(十二烷基硫酸钠)-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，并将每代30μg定量蛋白质样品进行上样并在制备的SDS-PAGE上进行电泳，使得提取的细胞内蛋白质根据大小进行分离。电泳后，通过电印迹将根据凝胶上大小分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。
在转移到膜上的具有不同大小的蛋白质中，提取对应于GRP78大小的膜部分。将取出的膜放入通过向含有GRP78特异性抗体的TTBS中添加5％脱脂缓冲液而得到的封闭缓冲液中，与该抗体一起用振荡器在4℃的低温下温育。用一抗(以1：1,000的比例稀释)温育后，还将膜与兔IgG-HRP(辣根过氧化物酶)偶联的，一抗的特异性二抗(以1：3,000的比例稀释)一起温育。通过ECL(增强化学发光)进行检测。
同时，每次传代使用相同量的蛋白质，为了证明整个蛋白质印迹过程是一致进行的，使用GAPDH和β-肌动蛋白质抗体检测各代提取的蛋白质的表达水平。
结果，如图6中所示，证实随着成体干细胞的衰老的进展，细胞中GRP78的基因水平为0.1，其对应于与年轻代的平均值(1)相比降低了约90％。衰老代蛋白质水平平均值约为0.7，其对应于与年轻代的平均值(1)相比降低了约30％。在癌细胞和成纤维细胞的情况下，证实GRP78蛋白质的表达水平没有降低，并且表达水平的增加也不是恒定的，表明表达水平没有变化。
实施例7：每个细胞区域中GRP78蛋白质的表达水平
为了检测在年轻代成体干细胞和衰老代成体干细胞中的每个细胞区域的GRP78表达水平，分离细胞质和膜蛋白质。所有离心程序均在4℃下进行，并将蛋白质储存在冰上。
为了从衰老成体干细胞和未分化的成体干细胞中提取细胞质蛋白质，分配200μl的细胞质裂解缓冲液(CST，亚细胞分离试剂盒)，并用刮刀刮下细胞。从获得的细胞中提取的悬浮液在冰上孵育20分钟。使用冷冻离心机以3,000rpm将样品离心5分钟，提取并分离除去沉淀的上清液。
另外，为了提取膜蛋白质，将100μl的细胞质裂解缓冲液(CST，亚细胞分离试剂盒)分配到上一步中获得的细胞沉淀中，并用25号针头刮掉沉淀。悬浮沉淀物后，将样品以3,000rpm离心10分钟。另外，提取并分离除沉淀以外的上清液。使用获得的细胞质蛋白质和膜蛋白质，进行实施例4和6中使用的蛋白质印迹分析以检测蛋白质表达水平的变化。
结果，基于在细胞质中用作标准标记物的α-微管蛋白质的表达水平，可以证实随着衰老的进展，细胞质中的GRP78蛋白质表达水平降低。另外，基于细胞膜中用作标准标志物的ATP酶蛋白质的表达水平，可以确认随着衰老的进展，细胞膜中的GRP78蛋白质的表达水平降低。由此确认，可以建议检查细胞膜中的GRP78蛋白质的表达水平并分离膜中表达高水平的GRP78的成体干细胞作为区分衰老干细胞和年轻干细胞的方法。
实施例8：通过MACS分离GRP78和检查标记物表达
基于以上实施例7中确认的结果，为了选择性分离存在于成体干细胞的细胞膜中的GRP78蛋白质，使用MACS(磁性激活细胞分选)技术分离细胞膜中表达GRP78蛋白质的成体干细胞。
为了使用磁体分离GRP78，制备了1×107个成体干细胞。将GRP78的特异性一抗结合到制备的成体干细胞上，然后使用离心机以300×g将细胞离心10分钟。除去上清液，并将剩余的沉淀悬浮在70μl洗涤缓冲液(MACS洗涤溶液和MACS BSA储备溶液的混合物)中。将10μl的封闭剂(MACS封闭液)添加到悬浮液中以防止与其他蛋白质结合，然后添加20μl的抗兔微珠。将所得混合物涡旋震荡并在遮光条件下在2至8℃的冰箱中孵育15分钟。孵育15分钟后，加入1ml洗涤缓冲液，并使用离心机以300×g将混合物离心10分钟。除去上清液，然后将沉淀悬浮在500μl洗涤缓冲液中。
为了通过MACS分离器分离附着于微珠的成体干细胞，在磁场中安装柱，并在其下方安装15ml锥形管。为了洗涤柱子，将3ml洗涤缓冲液添加到柱子中并通过重力使其下降，然后安装新的15ml锥形管。将制备的细胞置于柱中，并使其在重力下流动。此时，在锥形管中收集的细胞是未附着磁珠的GRP78阴性分选细胞，而在柱中收集的细胞是GRP78阳性分选细胞。在柱中的溶液由于重力而下降后，将柱从MACS分离器中取出，制备新的15ml锥形管，插入柱塞并推入柱中以收集GRP78阳性分选的细胞。
GRP78抗体的特异性荧光抗体附着于通过上述方法分离的细胞，然后使用流式细胞术获得结果以鉴定标记物。
结果证实了在年轻代和衰老代成体干细胞中GRP78阳性细胞群图和GRP78阴性细胞群图是分开的。这可用于仅特异性筛选其中GRP78蛋白质存在于膜中的细胞。
工业适用性
根据本发明的蛋白质标记物GRP78的使用使得通过去除衰老干细胞仅分离高效干细胞成为可能。因此，蛋白质标记物GRP78可以用作控制干细胞治疗产品的质量并评估其稳定性和有效性的有效标记物，并且可用于生产治疗功效优异的干细胞治疗产品。
尽管已经参考特定特征详细描述了本发明，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，该描述仅是其优选实施方式，并且不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同形式来限定。

Claims (16)

1.一种使用GRP78的特异性抗体或适体分离高效干细胞的方法。
2.根据权利要求1所述的方法，包括以下步骤：
(a)将GRP78特异性一抗结合至干细胞；
(b)将固定有二抗的磁珠与所述一抗结合；和
(c)使用MACS(磁激活细胞分选)分离表达GRP78的干细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效干细胞在膜中表达GRP78。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(c)进一步包括去除膜中表达低水平GRP78的干细胞的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在膜中表达低水平GRP78的干细胞是衰老干细胞。
6.一种用于筛选高效干细胞的组合物，该组合物包含能够测量GRP78基因的mRNA或该基因编码的蛋白质的表达水平的试剂。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，能够测量mRNA表达水平的试剂是能够扩增GRP78基因的引物或与GRP78基因特异性结合的探针。
8.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，能够测量蛋白质表达水平的试剂是GRP78基因编码的蛋白质的特异性抗体或适体。
9.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述高效干细胞是非衰老的年轻干细胞。
10.一种用于筛选高效干细胞的试剂盒，该试剂盒包含权利要求6所述的组合物。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是RT-PCR试剂盒、DNA芯片试剂盒或蛋白质芯片试剂盒。
12.一种筛选高效干细胞的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从干细胞中提取DNA或蛋白质；
(b)测量GRP78基因的mRNA或该基因编码的蛋白质的表达水平；
(c)将测得的基因的mRNA或基因编码的蛋白质的表达水平与对照进行比较；和
(d)如果与对照相比表达水平增加，则选择干细胞作为高效干细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述基因的mRNA的表达水平通过选自聚合酶链反应(PCR)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、实时PCR、RNA酶保护测定(RPA)、微阵列和核酸印记中的任一种进行测量。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述蛋白质的表达水平通过选自蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)、放射免疫扩散、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀、流式细胞术、免疫荧光测定、欧氏测定、补体固定测定和蛋白质芯片测定中的任何一种进行测量。
15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述对照是衰老干细胞。
16.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述高效干细胞是非衰老的年轻干细胞。
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