KR20190141136A - 포유동물 근육-유래 줄기 세포의 새로운 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포유동물 만능성 근육-유래 중간엽 줄기 세포 또는 그의 집단을 수득하는 단계, 상기 줄기 세포, 줄기 세포 집단을 관련 화합물 또는 조성물에 노출시키는 단계, 및 상기 세포에 미치는 효과를 평가하는 단계를 포함하는, 화합물 또는 조성물이 포유동물에게 미치는 효과를 평가하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 약물 개발, 독성 시험 및 최적화된 개인 맞춤형 의약에 적용가능한, 신뢰가능한 평가 방법이다.

Description

포유동물 근육-유래 줄기 세포의 새로운 용도

본 발명은 근육 조직으로부터 유래된 포유동물 줄기 세포의 새로운 용도, 더욱 구체적으로, 제약 치료 분야 뿐만 아니라, 약물 개발 및 스크리닝 뿐만 아니라, 독성 시험에서의 상기 포유동물 줄기 세포의 새로운 용도에 관한 것이다.

약물 개발에 점점 더 많은 비용이 지출되고 있는데, 그 이유는 특히 약물 효능 평가와 연관된 막대한 비용 및 관련된 약물 후보물질과 연관된 유해 효과 결정 때문이다. 종래 약물 개발 프로세스는 예측하지 못한 유해 효과의 결과로서 후보물질 작용제의 높은 탈락 수준과 연관된 큰 문제점으로 어려움을 겪고 있다. 그러므로, 약물 개발 프로세스에서 비용 및 탈락을 감소시키기 위해서는 개선된 모델이 요구되고 있다.

추가로, 특정 질환, 예컨대, 더욱 구체적으로, 특정 암, 및 유전적 기능 부전 또는 퇴행과 연관된 질환의 적절한 의학적 치료는 환자의 고유한 유전적 배경을 특징으로 하며, 환자에게 맞춤화된 치료 해결안; 즉, 그에 딱 맞는 환자에서 딱 맞는 용량으로 딱 맞는 약물을 사용하는 요법을 점점 더 요구하는 경향이 있다. 더욱 최근에는, 관련 치료에 대한 환자의 예상 반응으로 의학적 치료를 적합화시키기 위한 목적으로, 줄기 세포를 사용하여 환자의 유전자 코드를 평가하고/거나, 환자의 반응을 측정하고 있다.

상기 방법은 불가피하게 줄기 세포의 만족스러운 이용가능성을 요구하고 있다. 줄기 세포 사용은 여전히 논란의 대상이 되고 있고, 환자로부터 줄기 세포를 수집하는 것은 힘들고/거나, 고통스러운 일일 수 있다. 포유동물에서는 2개의 주요 카테고리의 줄기 세포: 배아 줄기 세포 및 성체 줄기 세포로 분화될 수 있다. 배아 줄기 세포는 대개 주어진 환자에 대해서는 이용불가능하고, 어느 경우에서는 윤리적 문제와도 연관성이 있다. 성체 줄기 세포는 성체 신체의 다양한 조직에서 발견될 수 있다. 그의 역할은 그가 발견된 조직을 유지하고, 수복시키는 것이다. 이들 세포는 개체의 일생 동안 생산되고, 신생아일 때 뿐만 아니라, 아동기 또는 성인기에도 발견될 수 있다. 여러 유형의 성체 줄기 세포가 공지되어 있다: 혈액 세포의 기초를 형성하고, 면역계에서 중요한 역할을 하는 조혈 줄기 세포 (HSC)는 골수에서 및 제대에서 발견될 수 있다. 제대로부터의 줄기 세포는 대개 성인 환자가 그를 필요로 할 때에는 더 이상 이용이 불가능하다. 성체 중간엽 줄기 세포의 일반 공급원은 골수 또는 지방 조직으로부터 추출되며, 수집은 침습적이고, 고통스럽다. 이러한 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 만능성이고, 골, 연골, 지방, 근육 등으로 분화될 수 있다. 유도 만능 줄기 세포 (IPSC)는 섬유모세포와 같은 분화된 세포로부터 인공적으로 생성되어 왔다. 전사 인자를 코딩하는 4개의 특정 유전자의 도입이 성체 세포를 만능성 줄기 세포로 전환시킬 수 있다.

WO2015/091210에는 예컨대, 근육 미세생검과 같은 최소한의 침습적 노력으로 수득될 수 있고, 충분한 양으로 이용가능한, 포유동물 근육-유래 만능성 중간엽 줄기 세포가 개시되어 있다. 상기 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 적어도 CD105에 대해, 바람직하게는 CD44, CD90 및 CD105에 대해서는 양성이고 CD45, MHCII 및 CD29에 대해서는 음성이다. 상기 MSC는 전형적으로 miR-128, miR-133B, 및 miR-802에 대해 추가로 양성이고 miR-218에 대해서는 약간 양성이고 miR-656에 대해서는 음성이다. 또한 상기 세포는 그의 만능성을 상실하지 않으면서, 다회에 걸친 냉동-해동 사이클에도 견뎌내는 것으로 나타났다. 세포 배양을 위해, 근육 미세생검이 외식편으로서 사용되고, 전구체 세포는 적당한 시기에 자발적으로 출현한다는 것도 추가로 밝혀져 있다. 상기와 같이 수행함으로써, 조작 횟수는 감소되고, 이로써 잠재적인 오염원을 막을 수 있다. 근육 미세생검 (외식편)에 의해 자연적으로 분비되는 성장 인자 정도면 충분하기 때문에, 외부 성장 인자를 첨가할 필요도 없다. 근육-유래 세포는 상이한 계통 및 상이한 발생 단계로부터의 서브집단의 혼합물이다. 만능성 중간엽 줄기 세포의 밀도에 기초하여, 그의 특이적인 분자 마커의 발현과 관련하여, 및 (불연속) 밀도 구배 도움으로, 실질적으로 순수한 만능성 중간엽 줄기 세포의 서브집단 3개가 근육 외식편으로부터 단리되었다. 서브집단 3개 모두 CD44 양성인 세포를 >90% 포함한다. CD90에 대한 발현율은 25-35% 분획의 경우, 36%이고, <15% 분획의 경우, 48%이고, 15-25% 분획의 경우, 73%이다. CD105에 대한 발현율은 3개 집단에서 55% 초과, 바람직하게는 60% 초과이고, 80% 또는 85% 또는 90% 또는 심지어는 95% 정도로 높을 수 있다. 또한, 3개 집단은 상이한 CFU-F 및 증식성 특성을 보인다 (WO2015/091210 실시예 섹션 참조).

이제 WO2015/091210에 개시된 바와 같은 중간엽 줄기 세포는, 인공적인 유도 없이도 만능성을 띠고, 다수의 세포 유형으로 분화될 수 있고, 쉽게 이용할 수 있으며, 이에 특히 새로운 제약 화합물을 스크리닝하고/거나, 시험하는 데 적합한 것으로 나타나 있다. 이들 세포의 수집, 더욱 구체적으로, 근육 미세생검에 의한 것은 용이하고, 어떤 유의적인 고통도 포함하지 않는다.

WO2015/091210에 개시된 줄기 세포는, 관련 줄기 세포가 어느 시점에서든 관련 환자로부터 수집될 수 있고, 그러므로 약물 효능 및 유해한 약물 효과에 대해 적절하게 평가될 수 있기 때문에, 관련 환자에게 맞춤화된 치료 해결안을 포함하는 개인 맞춤형 의료에서 사용하는 데 특히 적합한 것으로 추가로 밝혀져 있다.

더욱 구체적으로, 본 발명은 포유동물 만능성 근육-유래 중간엽 줄기 세포 또는 그의 집단을 수득하는 단계, 상기 줄기 세포 또는 줄기 세포 집단을 관련 화합물 또는 조성물에 노출시키는 단계; 및 상기 줄기 세포 또는 세포 집단에 미치는 그의 효과를 평가하는 단계를 포함하고, 여기서 포유동물 만능성 근육-유래 줄기 세포는 근육 미세생검, 이어서 밀도 구배 원심분리에 의해 수득되고, 적어도 CD105에 대해 양성이고 CD45, MHCII 및 CD29에 대해 음성인, 화합물 또는 조성물, 바람직하게는 제약 화합물 또는 조성물이 포유동물에게 미치는 효능 및/또는 유해 효과를 평가하는 방법에 관한 것이다.

포유동물 만능성 근육-유래 중간엽 줄기 세포는 포유동물 근육 조직으로부터 미세생검을 수집하고, 가능하게는 배양 배지 중에 미세생검을 배치하고, 상기 배양 배지로부터 출현하는 세포를 수집하고, 수득된 세포를 거의 전면생장시까지 성장시키고, 수득된 세포를 해리시키고, 밀도 구배 분별에 의해 배지의 남은 세포로부터 중간엽 줄기 세포를 분리함으로써 수득할 수 있다.

이롭게는, 미세생검은 골격근 조직, 예컨대, 목, 어깨, 흉부, 등, 꼬리, 팔다리, 뒷다리, 앞다리, 후반신, 뒷발 등으로부터의 근육으로부터 수득된다. 말 또는 인간과 같은 포유동물의 경우, 미세생검은 바람직하게는 상완 삼두근 근육 조직으로부터 수득되고, 더욱 바람직하게는 상완 삼두근의 장두로부터, 또는 삼각근으로부터 채취된다.

말의 경우, 예를 들어, 미세생검은 상완 삼두근의 장두에서 약 5 cm 깊이에서 수집될 수 있고, 약 10 내지 약 30 mg, 바람직하게는 약 12 mg 초과 또는 약 15 mg 초과 및/또는 약 25 mg 미만 또는 약 20 mg 미만의 조직을 함유할 수 있다.

포유동물 및 골격 근육 조직 공급원에 따라, 통상의 기술자는 그의 일반 지식에 기초하여 및/또는 과도한 부담 없이 통상의 실험에 의해 미세생검의 깊이 및 추출하고자 하는 조직 샘플의 양을 적합화시킬 수 있을 것이다.

배양 배지는 약 20% 우태아 혈청, 약 5 ml 페니실린 (1,000 U/ml)-스트렙토마이신 (10,000 ㎍/ml), 약 2.5 ml 암포테리신 B (250 ㎍/ml) 및 약 5 ml HEPES를 포함하는 DMEM/F12, 또는 동물 단백질을 포함하지 않는 다른 특정 배지 (예를 들어, FBS 무함유 배지)를 포함할 수 있다. 또한, 배양 배지는 필요에 따라 특정 적용에 맞게 적합화될 수 있다.

바람직하게는 포유동물 만능성 근육-유래 줄기 세포는 CD44, CD90 및 CD105에 대해 양성이고 CD45, MHCII 및 CD29에 대해 음성이다.

완벽을 기하기 위해, 관련 포유동물 만능성 근육-유래 줄기 세포는 miR-128, miR-133B, 및 miR-802에 대해 추가로 양성일 수 있는 것으로 나타났다. 추가로, 이는 miR-218에 대해서는 약간 양성이고 miR-656에 대해서는 음성일 수 있다.

시험하고자 하는 관련 화합물 또는 조성물, 바람직하게는 제약 화합물 또는 조성물의 효과는 그 자체가 공지된 방식으로, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자의 일반 지식 범위 내에서 결정될 수 있다. 한 예로서, 특히, 제약 화합물 또는 조성물인 경우, 관련 화합물 또는 조성물의 효과는 제약 화합물 또는 조성물의 부재하에서 수행된 대조군과의 비교에 의해 평가될 수 있다.

본 발명의 방법은 또한 방법이 상기 포유동물 만능성 근육-유래 줄기 세포 또는 그의 집단의 양성 반응 수준을 평가함으로써 환자에 의한 양성 반응의 가능성을 평가하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 포유동물 만능성 근육-유래 줄기 세포 또는 그의 집단이 환자로부터 유래된 것인, 개인 맞춤형 의학적 치료 방법에도 적용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명은 문헌에 이미 기술되어 있는 방법에 대한, 효과적이고, 유망한 대안을 제공하고, 줄기 세포 수집의 최소 침습 특성에 기인하여 살아있는 포유동물에 대해 수행될 수 있는 가능성을 제공한다. 공지된 바와 같이, 근육-유래 세포는 상이한 계통 및 상이한 발생 단계로부터의 서브집단의 혼합물이다. 그의 밀도에 기초하여, 그의 특이적인 분자 마커의 발현과 관련하여, 및 (불연속) 밀도 구배 도움으로, 실질적으로 순수한 만능성 중간엽 줄기 세포의 서브집단 3개를 근육 외식편으로부터 선택할 수 있다. 세포 배양은 간단한 방법으로 개시될 수 있다: 근육 미세생검이 외식편으로 사용될 수 있고, 전구체 세포는 적당한 시기에 자발적으로 출현한다. 상기와 같이 수행함으로써, 조작 횟수는 감소되고, 이로써 잠재적인 오염원을 막을 수 있고, 근육 미세생검 (외식편)에 의해 자연적으로 분비되는 성장 인자 정도면 충분하기 때문에, 외부 성장 인자를 첨가할 필요도 없다.

유도 만능 줄기 세포 (IPSC)를 이용하는 최신 평가 방법과 달리, 본 발명은 추가로 자가 만능성 줄기 세포에 미치는 관련 효과를 평가함으로써 화합물 또는 조성물이 환자에 미치는 효능 및/또는 유해 효과를 평가하는 데 특히 적합한 것으로 보인다. 평가는 따라서 결과가 유전적 특이성 또는 이상에 덜 의존하기 때문에 (IPSC 또는 비-자가 세포와 비교하여) 신뢰성이 더 높다. 이러한 이점은 특별한 관련성이 있으며, 더욱 특히, 유전 장애에 대한 약리학적 효과를 평가하는 데 및 최적화된 개인 맞춤형 의약에서 그러하다.

여기서 이점들 중 하나는 또한 상기 중간엽 줄기 세포 (MSC)가 배양물 중에서 섬유모세포 유사 콜로니를 형성할 수 있다는 점이다. 추가로, 다른 중간엽 줄기 세포 공급원 경우에 보통 관찰되는 것과 달리, 상기 세포는 지방세포, 연골세포 및 골세포로 분화될 수 있고, 그의 만능성을 상실하지 않으면서, 다회에 걸친 냉동-해동 사이클에도 견뎌낼 수 있다.

본 설명에서, "제약" (제약 화합물, 제약 조성물)이라는 용어는 약물 또는 약학과 관련된 것임을 의미하는 것으로 이해되고, 인간용 및 수의학용 의약, 둘 모두를 포함한다.

본 설명에서, 본원에서 측정가능한 값, 예컨대, 파라미터, 양, 시간상 기간 등을 지칭할 때 사용되는 "약"이라는 용어는 명시된 값의 및 그로부터의 +/-10% 이하, 바람직하게는 +/-5% 이하, 더욱 바람직하게는 +/-1% 이하, 및 더욱더 바람직하게는 +/-0.1% 이하의 변동을 포함하는 것을 의미하며, 상기와 같은 변동이 본 개시된 발명에 수행하기에 적절한 한 그러하다. "약"이라는 수식어가 지칭하는 값 또한 구체적으로 그 자체, 및 개시된 값임을 이해하여야 한다.

본 발명과 관련된 일반 방법에 대해서는 예컨대, 문헌 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed." (Sambrook et al., 1989)], [Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987)], 시리즈 [Methods in Enzymology (Academic Press), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987)]; ["Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Ed." (F. M. Ausubel et al., eds., 1987 & 1995)]; [Recombinant DNA Methodology II (R. Wu ed., Academic Press 1995)] (상기 문헌들은 본원에서 참조로 포함된다)를 포함하는, 널리 공지된 서적을 참조한다.

본 발명의 실시에서 유용한 일반 기술에 관한 추가의 상세한 설명을 위해, 실시자는 세포 생물학, 조직 배양, 및 발생학의 표준 서적 및 리뷰를 참조할 수 있다. 문헌 ["Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach" (E. J. Robertson, ed., IRL Press Ltd. 1987)]; ["Guide to Techniques in Mouse Development" (P. M. Wasserman et al. eds., Academic Press 1993)]; ["Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro" (M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993)]; ["Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy" (P. D. Rathjen et al., al.,1993)]을 포함한다. 줄기 세포 분화는 예컨대, 문헌 [[Robertson. 1997. Meth Cell Biol 75: 173]; 및 [Pedersen. 1998. Reprod Fertil Dev 10: 31], 및 [Usas et al., 2011] (상기 문헌들은 본원에서 참조로 포함된다)에서 리뷰된다.

세포 배양 및 배지 수집에서의 일반 기술은 문헌 [Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al. 1997. Curr Opin Biotechnol 8: 148)]; [Serum-free Media (K. Kitano. 1991. Biotechnology 17: 73)]; [Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr Opin Biotechnol 2: 375, 1991)], [Culture of animal cells: A manual of basic technique, Freshney, R.I. et al. 2005, 5^th Edition, Wiley, New York] (상기 문헌들은 본원에서 참조로 포함된다)에 개략적으로 설명되어 있다.

"줄기 세포"라는 용어는 일반적으로, 자기 재생이 가능한, 즉, 분화 없이도 증식할 수 있고, 그 또는 그의 자손은 상대적으로 더욱 특수화된 적어도 하나의 세포 유형을 생성할 수 있는 것인, 비특수화 또는 상대적으로 덜 특수화되고, 증식 능력이 있는 세포를 지칭한다. 상기 용어는 실질적으로 무한 자기 증식이 가능한 줄기 세포, 즉, 여기서 줄기 세포의 자손 또는 그의 적어도 일부는 실질적으로 비특수화 또는 상대적으로 덜 특수화된 표현형, 분화 잠재능, 및 모 줄기 세포의 증식 능력을 포함하는 것인 줄기 세포 뿐만 아니라, 제한된 자기 증식을 나타내는 줄기 세포, 즉, 여기서 자손 또는 그의 일부의 추가 증식 및/또는 분화 능력은 모 세포와 비교하여 명백하게 감소된 것인 줄기 세포를 포함한다. 예로서, 및 제한 없이, 줄기 세포는 하나 이상의 계통을 따라 분화하여 점점 더 상대적으로 더욱 특수화된 세포를 생산할 수 있거나 (여기서 상기 후손 및/또는 점점 더 상대적으로 더욱 특수화된 세포는 그 자체가 본원에 정의된 바와 같은 줄기 세포일 수 있다), 또는 심지어는 최종적으로 분화된 세포, 즉, 유사 분열 후의 세포일 수 있는, 완전히 특수화된 세포를 생산할 수 있다.

본원에서 사용되는, "중간엽 줄기 세포" 또는 "MSC"라는 용어는 중간엽 계통의 세포, 전형적으로, 2개, 바람직하게는 3개 이상의 중간엽 계통, 예컨대, 골세포 (골), 연골세포 (연골), 근육세포 (근육), 힘줄 세포 (힘줄), 섬유모세포 (결합 조직), 지방세포 (지방) 및 스트로모겐 (골수 기질) 계통의 세포를 생성할 수 있는, 포유동물 성체, 중배엽 유래 줄기 세포를 지칭한다. 일반적으로, 그러나, 제한 없이, 예컨대, 문헌 [Pittenger et al. 1999 (Science 284: 143-7)] 또는 [Barberi et al.,2005 (PLoS Med 2: e161)],및 [Usas et al., 2011]에 기술되어 있는 바와 같이, 관련 기술분야에서 허용되는 표준 분화 조건 및 세포 표현형 평가 방법을 사용하여, 세포가 각 지방세포, 연골세포 및 골세포 계통의 세포를 형성할 수 있다면, 그 세포는 MSC인 것으로 간주될 수 있다. MSC라는 용어는 또한 MSC의 자손, 예컨대, 대상체의 생물학적 샘플로부터 수득된 MSC의 시험관내 또는 생체외 증식에 의해 수득된 자손도 포함한다.

ISCT는 세포가 중간엽 줄기 세포 (MSC)로서 정의되기 위해서는 소지하여야 하는 특성을 하기와 같이 정확하게 결정하였다: 세포는 플라스틱 부착성이고, 마커 CD73, CD90 및 CD105에 대해 양성이고 마커 CD14 (또는 CD11b), CD34, CD45, CD79a (또는 CD19) 및 MHC-II에 대해 음성이어야 하고, 중배엽 기원의 세포, 예컨대, 골모세포, 연골모세포 및 지방세포로 분화할 수 있는 능력을 보여야 한다 (Dominici et al., 2006). 다른 MSC 마커, 예컨대, CD29 또는 CD44의 사용 또한 보고되었다 (Pittenger et al., 1999). 그러므로, 본 발명에 따라 사용되는 포유동물 MSC 세포는, 세포가 적어도 중간엽 마커 CD105, 및 바람직하게는 또한, 하기 마커: CD44 및 CD90 중 하나 이상의 것을 발현 또는 공동 발현한다는 것 (즉, 그에 대해 양성이라는 것)으로 정의된다. 본 발명의 포유동물 MSC 세포는 또한, 세포가 하기 마이크로RNA: miR-128, miR-133B, miR-218 또는 miR-802 중 하나 이상의 것을 발현 또는 공동 발현한다는 것 (즉, 그에 대해 양성이라는 것)으로 정의된다. 본 발명의 포유동물 MSC 세포는 또한, 세포가 miR-656을 발현하지 않는다는 것으로 정의된다.

마이크로RNA, miRNA, miR 또는 eca-miR이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 예컨대, 동물과 같은 살아있는 유기체의 내인성 유전자로부터 유래된, 19-25개의 뉴클레오티드 성숙한 비-코딩 RNA 또는 그의 전구체, 또는 그의 단편을 지칭한다. 성숙한 마이크로RNA는 프리-마이크로RNA (pre-miR)로 명명되는, 대략 75개의 뉴클레오티드 길이의 더욱 긴 헤어핀 유사 전구체로부터 프로세싱된 것이다.

세포가 특정 마커 또는 마이크로RNA에 대해 양성이라고 한다면, 이는 통상의 기술자가 적절한 측정을 수행하였을 때, 적합한 대조군과 비교하여, 상기 마커 또는 마이크로RNA에 대하여, 예컨대, 항체 검출가능 또는 역전사 중합효소 연쇄 반응에 의해 검출과 같이, 독특한 신호의 존재 또는 증거에 관하여 결론을 내릴 것이라는 것을 의미한다. 방법을 통해 마커 또는 마이크로RNA를 정량적으로 평가할 수 있는 경우, 양성 세포는 대조군과 유의적으로 상이하고, 그보다 더 높거나, 또는 더 강력한, 예컨대, 제한 없이, 대조군 세포에 의해 생성된 상기 신호보다 적어도 1.5배 더 높은, 예컨대, 적어도 2배, 적어도 4배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 더 높은 또는 그 초과로 더 높은 신호를 생성한다.

세포 특이적 마커의 발현은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 면역학적 기술, 예컨대, 면역-세포화학법 또는 친화성 흡착법, 웨스턴 블롯 분석법, FACS, ELISA 등을 사용하여, 또는 효소 활성에 관한 임의의 적합한 생화학적 검정법에 의해, 또는 마커 mRNA의 정량을 측정하는 임의의 적합한 기술, 예컨대, 노던 블롯, 반-정량적 또는 정량적 RT-PCR 등에 의해 검출될 수 있다.

마이크로RNA의 발현은 예를 들어, 전체 유전자 발현에 대한 검정법을 이용하여 (예컨대, 마이크로RNA 발현 프로파일링 분석을 위한 마이크로어레이 분석법, 즉시 사용가능한 마이크로RNA qPCR 플레이트 또는 RNA 서열분석을 이용하여), 또는 특이적 검출 검정법, 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 정량적 PCR, 정량적 역전사 (실시간) PCR (qRT-PCR), 잠금 핵산 (LNA) 실시간 PCR, 또는 노던 블롯팅에 의해 결정될 수 있다. 특히, 마이크로RNA의 발현의 측정은 상기 마이크로RNA의 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 마이크로RNA에 직접 및 특이적으로 결합할 수 있거나, 또는 상기 마이크로RNA를 특이적으로 역전사시킬 수 있다. 대안적으로, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 상기 마이크로RNA로부터 수득된 cDNA에 결합할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 또한 상기 마이크로RNA로부터 수득된 cDNA를 증폭시킬 수 있다.

본 개시내용에 열거된 마커 단백질에 대한 핵산 및 아미노산 서열 데이터는 일반적으로 공지되어 있고, 공용 데이터베이스로부터, 예컨대, 그 중에서도 특히, NIH "Protein Reviews on the Web" 데이터베이스 (http://mpr.nci.nih.gov/prow/), NIH "Entrez Gene" 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene) 또는 유니프로트/스위스프로트(Uniprot/Swissprot) 데이터베이스 (http://www.expasy.org/)로부터 입수할 수 있다. 상기 마커에 대해 적합한 검출 시약 및 방법은 상기 서열 정보에 기초하여 디자인될 수 있거나, 또는 더욱 일반적으로는 상업적으로 이용가능하다 (예컨대, 표지된 모노클로날 항체 시약).

"CD105"라는 용어는 CD105로 공지된 항원, 또는 그의 동의어, 예컨대, 엔도글린을 포함한다. CD105는 세포 표면에 위치하는 막 당단백질이고, 공지된 중간엽 줄기 세포 마커이다. 예로서, 말 CD105 항원의 부분적인 아미노산 서열은 수탁 번호 AGW16345.1 하에 진뱅크(Genbank) 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다.

"CD90"이라는 용어는 항원 CD90, 또는 그의 동의어, 예컨대, Thy-1 막 당단백질을 포함한다. 예로서, 말 CD90 항원의 아미노산 서열은 수탁 번호 ACG61223.1 하에 진뱅크 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다.

"CD44"라는 용어는 일반적으로 CD44로 공지된 항원, 또는 그의 동의어, 예컨대, 세포외 기질 수용체 III, GP90 림프구 귀소/부착 수용체, HUTCH-I, 헤르메스(Hermes) 항원, 히알루로네이트 수용체, 또는 식세포성 당단백질 1을 포함한다. 예로서, 말 CD44 항원의 아미노산 서열은 수탁 번호 CAA47331.1 하에 진뱅크 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다.

상기 MSC 마커 검출용의 예시적인 상업적으로 이용가능한 항체 시약으로는 특히 모노클로날 항체 항-CD105-RPE (ABD 세로테크(ABD Serotec)), 항-CD44-APC (BD 파르미겐(BD Pharmigen)), 및 항-CD90 (VMDR)을 포함한다. CD105, CD44, 또는 CD90에 특이적으로 결합하는 대안적 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 확인될 수 있다.

본 개시내용에 열거된 마이크로RNA는 일반적으로 공지되어 있고, 공용 데이터베이스로부터, 예컨대, 그 중에서도 특히, miRBase 데이터베이스 (http://www.mirbase.org)로부터 입수할 수 있다. "miR-128"이라는 용어는 miR-128로 공지된 마이크로RNA, 또는 그의 전구체를 포함한다. 예로서, 말 miR-128의 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 MI0012821 하에 miRBase 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다. "miR-133B"라는 용어는 miR-133B로 공지된 마이크로RNA, 또는 그의 전구체를 포함한다. 예로서, 말 miR-133B의 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 MI0012844 하에 miRBase 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다. "miR-656"라는 용어는 miR-656으로 공지된 마이크로RNA, 또는 그의 전구체를 포함한다. 예로서, 말 miR-656의 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 MI0012915 하에 miRBase 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다. 통상의 기술자는 마이크로RNA가 다른 명칭, 또는 동의어로 지칭될 수 있다는 것을 잘 알고 있다.

"세포 집단"이라는 용어는 일반적으로 세포 그룹을 지칭한다. 세포 집단은 공통 유형이거나, 또는 공통된 특징을 가지는 세포의 적어도 일부로 이루어질 수 있거나, 또는 그를 포함할 수 있다. 상기 특징으로는 제한 없이, 형태적 특징, 분화 잠재능 (예컨대, 만능성, 다능성, 단일 분화성 등; 예컨대, 다능성 또는 단일 분화성일 경우, 특정 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력), 또는 1, 2, 3개 이상의 세포 연관 마커, 예컨대, 표면 항원의 존재 및/또는 수준을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 특징이 세포 집단 또는 그의 일부를 정의할 수 있다. 바람직하게는 상기 세포 집단은 중간엽 줄기 세포 집단, 더욱 바람직하게는 실질적으로 균질한 중간엽 줄기 세포 집단이다.

용어 "실질적으로 균질한" 또는 "실질적으로 순수한" 중간엽 줄기 세포 집단이란, 상기 정의된 바와 같은 MSC의 일부를 포함하는 세포 집단을 의미하며, 여기서 상기 세포 집단 중 상기 일부는 적어도 50%, 예컨대, 적어도 55%, 바람직하게는 적어도 60%, 예컨대, 적어도 65%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 예컨대, 적어도 75%, 더욱더 바람직하게는 적어도 80%, 예컨대, 적어도 85%, 가장 바람직하게는 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 심지어 거의 100%이거나, 또는 100%이다.

"밀도 구배 원심분리"라는 표현은 세포의 밀도 기반 분리를 포함하는, 모든 유형의 세포 분리 기술 또는 생성물을 포함한다. 비제한적인 예는 수크로스 중합체, 또는 콜로이드성 실리카 구배의 밀도 구배 원심분리일 수 있다. 상업적으로 이용가능한 구배의 비제한적인 예로는 퍼콜 (폴리비닐피롤리돈 또는 실란으로 코팅된 콜로이드성 실리카), 피콜 (고분자량 수크로스 중합체), 피콜-플라크(Ficoll-Paque) (피콜 플러스 소듐 디아트리조에이트 및 에데테이트 칼슘 디소듐), 부력 밀도 용액 (BDS, 콜로이드성 실리카 포함), 림포프렙 (소듐 디아트리조에이트 및 다당류) 등이 있다. 통상의 기술자는 본 발명에 따른 방법으로 수득된 줄기 세포를 분리시키기 위해 적합한 구배를 선택할 수 있을 것이라는 것은 명백하다. 본 발명의 방법을 사용하여, 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 1250 x g (25℃, 20 min)로 원심분리한 후, <15%, 15-25%, 또는 25-35% 퍼콜 밀도 계면에서 발견된다. 이어서 단리되고, 임의적으로 확장된 일반 세포 집단으로부터 원하는 마커 단백질을 공동 발현하는 중간엽 줄기 세포를 그 자체가 공지된 방법에 의해, 예컨대, 예를 들어, 형광 활성화 세포 분류 (FACS), 자기 활성화 세포 분류 (MACS), 친화성 기반 기술, 특히, 친화성 크로마토그래피, 또는 프리플레이트 기술 및 그의 조합을 사용하여 선택하거나, 농축시키거나, 또는 단리시킬 수 있다. 예시적인 방법은 문헌 [Wu et al., 2010 (cf. Cell Tissue Research, Jun;340(3):549-67)]에 보고되어 있다.

원하는 발현 프로파일을 가지는 살아있는 세포를 각 마커에 특이적인 시약 (가장 일반적으로는 면역학적 시약, 예컨대, 예컨대, 모노클로날 항체)에 결합시킬 수 있고, 여기서 상기 시약은 결국에는 예컨대, 상기 시약이 결합하지 않은 세포로부터 그러한 결합이 이루어진 세포의 선별 또는 포획을 촉진시키기 위해 (예컨대, 형광단에 의해, 또는 자기 입자 또는 또 다른 유형의 정지상 상에의 고정화에 의해) 변형된다. 상기 방법에 관한 일반적인 가이던스를 위해, 특히 문헌 [Flow Cytometry and Cell Sorting, 2nd ed., by Andreas Radbruch (ed.), Springer 1999 (ISBN 3540656308)]; [In Living Color: Protocols in Flow Cytometry and Cell Sorting, 1st ed., by RA Diamond and S Demaggio (eds.), Springer 2000 (ISBN 3540651497)]; [Flow Cytometry Protocols (Methods in Molecular Biology), 2nd ed., by TS Hawley and RG Hawley (eds.), Humana Press 2004 (ISBN 1588292355)]; [Affinity Separations: A Practical Approach, P Matejtschuk (ed.), Oxford University Press, 1997 (ISBN 0199635501)]; 및 [Dainiak et al. 2007. Adv Biochem Eng Biotechnol 106: 1 - 18]을 참조한다.

"적합한 배양 배지"라는 표현은 세포, 중간엽 줄기 세포 (MSC) 또는 중간엽 줄기 세포 집단의 생존 및/또는 성장을 지원하는 모든 세포 배양 배지를 포함한다. 비제한적인 예로 임의적으로 항진균제 및 완충제로 보충된, DF20, DMEM-햄즈 F12(DMEM-Ham's F12), DMEM, 알파-MEM 등이 있다. 단지 예로서, 하기 배양 배지가 사용된다: 약 20% 우태아 혈청, 약 5 ml 페니실린 (1,000 U/ml)-스트렙토마이신 (10,000 ㎍/ml), 약 2.5 ml 암포테리신 B (250 ㎍/ml) 및 약 5 ml HEPES와 함께 DMEM/F12를 포함하는 DF20 배지. 다른 예로는 CTS (상표명) 및 테라피크(Therapeak) (상표명) 배양 배지가 있다.

세포를 "탈착," "분산," "해리" 또는 "분리"시키는 적절한 방법은 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본 발명에서 사용될 수 있다. 이는 예컨대, 단백질 분해 효소 처리, 2가 이온의 킬레이트화, 기계적 분해, 또는 상기 방법 중 임의의 것의 조합을 포함한다. 바람직하게는 상기 세포 해리는 바람직하게는 (예컨대, 상기 기술된 바와 같이) 트립신을 이용하는 효소 분해를, 임의적으로, 바람직하게는 (예컨대, 상기 기술된 바와 같이) EDTA를 이용하는 2가 이온의 킬레이트화, 및/또는 이러한 방식으로 처리된 세포의 기계적 해리와 함께 조합하여 수행하는 것을 포함할 수 있다. 기계적 해리는 예컨대, 보어가 작은 피펫 (예컨대, 1,000 ㎕ 마이크로피펫 팁)을 통해 세포를 반복적으로 통과시키고/거나, 세포를 함유하는 현탁액 스트림을 고체 표면에 대해 (예컨대, 배양 배쓸 벽에 대해) 피펫팅 아웃을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 MSC를 포함하는 세포 현탁액을 수득할 수 있다.

본원에서 사용되는, "노출시키는"이라는 용어는 관련 세포를 관련 제약 분야에 공지되어 있는 바와 같은, 예를 들어, 독성제 또는 제약 제제를 비롯한, 화합물 또는 조성물의 잠재적인 효과에 영향을 받도록 하는 모든 방법을 포함한다. 상기 방법으로는 예를 들어, 적절한 배지 중에서 관련 세포 및 관련 화합물 또는 조성물을 접촉시키는 것을 포함한다.

본 발명의 방법을 통해 화합물 또는 조성물이 포유동물의 자가 세포에 대해 미치는 효능 및/또는 유해 효과를 평가할 수 있고, 이로써, 유전적 특이성 또는 이상에 비의존적인 신뢰가능한 평가 방법을 제공할 수 있다. 그 결과, 본 발명의 방법은 유전 장애에 대한 약리학적 효과를 평가하는 데 특히 적합하다.

Claims (7)

1. 포유동물 만능성 근육-유래 중간엽 줄기 세포 또는 그의 집단을 수득하는 단계, 상기 줄기 세포 또는 줄기 세포 집단을 관련 화합물 또는 조성물에 노출시키는 단계, 및 관련 화합물 또는 조성물이 상기 줄기 세포 또는 줄기 세포 집단에 미치는 효과를 평가하는 단계를 포함하고, 여기서 포유동물 만능성 근육-유래 줄기 세포는 근육 미세생검, 이어서 밀도 구배 원심분리에 의해 수득되고, 적어도 CD105에 대해 양성이고 CD45, MHCII 및 CD29에 대해 음성인, 화합물 또는 조성물, 바람직하게는 제약 화합물 또는 조성물이 포유동물에게 미치는 효능 및/또는 유해 효과를 평가하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 포유동물 만능성 근육-유래 줄기 세포가 CD44, CD90 및 CD105에 대해 양성이고 CD45, MHCII 및 CD29에 대해 음성인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 포유동물 만능성 근육-유래 줄기 세포가 추가로 miR-128, miR-133B, 및 miR-802에 대해 양성인 방법.
4. 제3항에 있어서, 포유동물 만능성 근육-유래 줄기 세포가 추가로 miR-218에 대해 약간 양성이고 miR-656에 대해 음성인 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 화합물 또는 조성물의 효과가 관련 화합물 또는 조성물의 부재하에서 수행된 대조군과의 비교에 의해 평가되는 것인 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 약물 스크리닝 방법이고, 제약 화합물 또는 조성물이 다수의 개체로부터 유래된 상기 줄기 세포 또는 줄기 세포 집단에 대해, 또는 그로부터 유래된 분화된 세포에 대해 시험되는 것인 방법.
7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 만능성 근육-유래 줄기 세포 또는 그의 집단이 포유동물 환자로부터 유래되고, 방법이 상기 포유동물 만능성 근육-유래 줄기 세포 또는 그의 집단, 또는 그로부터 유래된 분화된 세포의 양성 반응 수준을 평가함으로써 포유동물 환자에 의한 양성 반응의 가능성을 평가하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.