KR20150069374A - 줄기세포의 노화 억제용 조성물 - Google Patents
줄기세포의 노화 억제용 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20150069374A KR20150069374A KR1020130155689A KR20130155689A KR20150069374A KR 20150069374 A KR20150069374 A KR 20150069374A KR 1020130155689 A KR1020130155689 A KR 1020130155689A KR 20130155689 A KR20130155689 A KR 20130155689A KR 20150069374 A KR20150069374 A KR 20150069374A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- stem cells
- cells
- dlx5
- runx2
- expression
- Prior art date
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 70
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 230000032683 aging Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 76
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 101150118728 Dlx5 gene Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 102000015775 Core Binding Factor Alpha 1 Subunit Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 108010024682 Core Binding Factor Alpha 1 Subunit Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 230000009758 senescence Effects 0.000 claims abstract description 41
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 35
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 32
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 9
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 68
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 claims description 68
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 28
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 claims description 23
- 102000010781 Interleukin-6 Receptors Human genes 0.000 claims description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 14
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 12
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 claims description 9
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims description 8
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 7
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 6
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 6
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 6
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 6
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 3
- 101150086605 Runx2 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101001007348 Arachis hypogaea Galactose-binding lectin Proteins 0.000 claims 2
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 claims 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 87
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 abstract description 11
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 34
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 20
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 19
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 18
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 15
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 12
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 11
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 9
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 9
- 108010017324 STAT3 Transcription Factor Proteins 0.000 description 9
- 102100024040 Signal transducer and activator of transcription 3 Human genes 0.000 description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 5
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 5
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 5
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 5
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 5
- 229960003989 tocilizumab Drugs 0.000 description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 3
- 102100037792 Interleukin-6 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 2
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 2
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000087799 Koma Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000004067 Osteocalcin Human genes 0.000 description 2
- 108090000573 Osteocalcin Proteins 0.000 description 2
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 2
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 description 2
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- -1 glycosyl HMC Chemical compound 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000004072 osteoblast differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azaniumylethylamino)acetate Chemical compound NCCNCC(O)=O PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 2-Amino-2-Deoxy-Hexose Chemical compound NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKYKXTRKURYNGW-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxy-9,10-dioxo-9,10-dihydroanthracene-2-sulfonic acid Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=C1C(O)=C(O)C(S(O)(=O)=O)=C2 JKYKXTRKURYNGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OMRLTNCLYHKQCK-DHGKCCLASA-N 4-nitrophenyl N-acetyl-beta-D-glucosaminide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 OMRLTNCLYHKQCK-DHGKCCLASA-N 0.000 description 1
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JDBGXEHEIRGOBU-UHFFFAOYSA-N 5-hydroxymethyluracil Chemical compound OCC1=CNC(=O)NC1=O JDBGXEHEIRGOBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound CC1=CNC(=S)NC1=O ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TWGNOYAGHYUFFR-UHFFFAOYSA-N 5-methylpyrimidine Chemical compound CC1=CN=CN=C1 TWGNOYAGHYUFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 6-methyladenine Chemical compound CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOSIULRWFAEMFL-UHFFFAOYSA-N 7-deazaguanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1CC=N2 LOSIULRWFAEMFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000011690 Adiponectin Human genes 0.000 description 1
- 108010076365 Adiponectin Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 102000002268 Hexosaminidases Human genes 0.000 description 1
- 108010000540 Hexosaminidases Proteins 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108010016731 PPAR gamma Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102100038825 Peroxisome proliferator-activated receptor gamma Human genes 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710097214 Protein N-terminal asparagine amidohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 102100034233 Protein N-terminal asparagine amidohydrolase Human genes 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101150106167 SOX9 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010084592 Saporins Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229940119059 actemra Drugs 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003092 anti-cytokine Effects 0.000 description 1
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000034127 bone morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000010094 cellular senescence Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 201000003445 large cell neuroendocrine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GZCNJTFELNTSAB-UHFFFAOYSA-N n'-(7h-purin-6-yl)hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCNC1=NC=NC2=C1NC=N2 GZCNJTFELNTSAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000007651 self-proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 230000023895 stem cell maintenance Effects 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical group [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229950000329 thiouracil Drugs 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/204—IL-6
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5412—IL-6
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 줄기세포, 보다 구체적으로는 중간엽 줄기세포의 분화 또는 노화 억제용 조성물 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명은 줄기세포의 노화 및 다분화능 상실의 원인 인자로서 IL-6 및이에 의해 발현이 유도되는 Runx2/Dlx5를 새롭게 발굴하였으며, 이들의 발현 억제를 통해 장기간의 배양기간에도 줄기세포의 노화가 억제되고 다분화능이 유지될 수 있음을 제안한다.
본 발명은 줄기세포의 치료적 유효량을 수득하기 위해 인 비트로에서 여러 계대를 거치면서 장기 배양을 할 때 나타나는 노화 및 골 계열로의 분화 치중의 문제를 근본적으로 해결함으로써 희소가치가 높은 치료자원으로서의 줄기세포를 보다 효율적으로 이용할 수 있도록 한다.
본 발명은 줄기세포의 노화 및 다분화능 상실의 원인 인자로서 IL-6 및이에 의해 발현이 유도되는 Runx2/Dlx5를 새롭게 발굴하였으며, 이들의 발현 억제를 통해 장기간의 배양기간에도 줄기세포의 노화가 억제되고 다분화능이 유지될 수 있음을 제안한다.
본 발명은 줄기세포의 치료적 유효량을 수득하기 위해 인 비트로에서 여러 계대를 거치면서 장기 배양을 할 때 나타나는 노화 및 골 계열로의 분화 치중의 문제를 근본적으로 해결함으로써 희소가치가 높은 치료자원으로서의 줄기세포를 보다 효율적으로 이용할 수 있도록 한다.
Description
본 발명은 줄기세포의 다분화능을 유지하고 노화를 억제하기 위한 조성물에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 생물을 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서, 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 세포분열이 정지된 분화 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.
줄기세포는 크게 배아(embryo)에서 얻어지고 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력(totipotent)을 지닌 전분화능(pluripotency)의 배아줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)와 각 조직에서 얻어지는 다분화능(multipotency)의 성체줄기세포(adult stem cell)로 구분된다. 배아줄기세포는 무제한적 증식이 가능한 미분화 세포로 모든 세포로 분화할 수 있으며, 성체줄기세포와 달리 배(germ) 세포도 만들 수 있어 다음 세대로 유전될 수 있다. 그러나 이러한 이점에도 불구하고 배아줄기세포를 세포 치료제로 이용하는 데에는 암화 형성, 면역거부반응 및 윤리적 법률적 제약 등 실용화에 어려운 점이 많은 상황이다. 최근 이러한 문제점을 극복하기 위한 대안으로 중간엽 줄기세포가 제시되고 있다. 중간엽 줄기세포는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포로의 분화가 가능한 다능성을 가진 세포로 면역 반응을 조절하는 기능도 가지고 있는 것으로 보고되고 있다.
세포 치료나 재생의학에서 최소 필요한 세포의 수는 1X109 정도이며, 배양조건 및 기준을 확립하는 단계에서 필요한 세포들까지 고려하면 그 양은 더욱 늘어난다. 기존의 다양한 기원의 중간엽 줄기세포로 이 정도 수의 세포를 공급하려면 최소 인 비트로에서 10번 이상의 계대가 필요하며, 이 과정에서 세포는 노화되고 변형되어 더 이상 치료의 개념에 적합하지 않게 된다. 이는 지금의 중간엽 줄기세포의 배양시스템이 반드시 풀어야 할 문제점의 하나로서, 중간엽 줄기세포를 세포치료제로 실용화하기 위해서는 이러한 문제점을 해결 할 수 있는 새로운 대량생산 방법이 필요하다. 이에, 치료적 유효량을 만족하는 세포 숫자를 수득할 때까지 노화를 억제하고 다분화능을 유지시키는 세포 배양 기술의 확립이 절실히 요구되고 있다.
골수 유래 중간엽 줄기세포는 자가 증식이 가능하며 특정 세포 배양 환경이 주어지면 골, 지방, 연골 등 중간엽 계열의 세포로 분화가 가능하며 재생의학 분야에서 임상적으로 이용 가치가 있는 줄기세포군이다. 골수 유래 중간엽 줄기세포를 임상적용 하기 위해서는 대량의 세포가 필요하다. 필요한 세포 수를 얻기 위해서는 in vitro 에서 장기간의 세포 배양을 통하여 필요한 세포 숫자를 얻어야 하지만, 실제로 장기간 배양된 골수 유래 중간엽 줄기세포는 다분화능을 잃고 특정 계열로 분화능이 제한된다. 또한, 장기간 배양된 이 세포들은 결국 노화되어 줄기세포로서의 가치를 잃게 되기 때문에 필요한 세포 숫자를 얻을 때 까지 노화를 억제하고 다분화능을 유지시키는 세포 배양 기술이 확립될 필요성이 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 줄기세포의 노화 및 다분화능 손실의 원인 인자를 규명하고, 상기 인자를 조절함으로써 치료용 줄기세포의 줄기성(stemness)을 유지하면서 노화를 억제하는 조성물을 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 노화된 줄기세포에서 분비되는 사이토카인인 IL-6와, 이에 의해서 발현이 유도되는 Runx2 및 Dlx5가 줄기세포의 노화 및 다분화능 상실의 원인이며, 이들의 발현 또는 활성을 억제할 경우 장기간의 배양에도 다능성을 유지하고 노화가 억제되어 치료용 세포자원으로서 필요한 특성을 상실하지 않는다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 줄기세포의 분화 또는 노화 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포 분화 또는 노화 억제용 조성물의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 인터루킨-6(IL-6) 또는 IL-6 수용체 억제제를 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 분화 또는 노화 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 줄기세포의 노화 및 다분화능 손실의 원인 인자를 규명하고, 상기 인자를 조절함으로써 치료용 줄기세포의 줄기성(stemness)을 유지하면서 노화를 억제하는 조성물을 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 노화된 줄기세포에서 분비되는 사이토카인인 IL-6와, 이에 의해서 발현이 유도되는 Runx2 및 Dlx5가 줄기세포의 노화 및 다분화능 상실의 원인이며, 이들의 발현 또는 활성을 억제할 경우 장기간의 배양에도 다능성을 유지하고 노화가 억제되어 치료용 세포자원으로서 필요한 특성을 상실하지 않는다는 사실을 발견하였다.
본 발명에 따르면, 노화된 줄기세포에서 IL-6가 유의하게 발현이 증가하며, 이의 발현 또는 활성을 억제할 경우 자가 증식 및 다능성 유지에 중요한 Sox2의 발현이 증가함을 확인하였다. 따라서, IL-6의 저해는 줄기세포의 노화를 효율적으로 억제하는 유용한 수단이 될 수 있다.
본 명세서에서 용어“줄기세포(stem cell)”는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서, 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 미분화 세포들을 지칭한다. 줄기세포는 발달 가능한 만능성 또는 다능성 세포이다. 줄기세포는 2개의 딸줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래(전이(transit)) 세포로 분열될 수 있으며, 이후에 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다. 구체적으로는, 본 발명의 조성물로 분화 또는 노화가 억제되는 줄기세포는 중간엽 줄기세포이다.
본 명세서에서 용어“중간엽 줄기세포”는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포로의 분화가 가능한 다분화능(multipotency)을 가진 줄기세포를 의미한다. 중배엽 줄기세포는 소용돌이 모양의 형태와 기본적인 세포표면 표식자 CD73(+), CD105(+), CD34(-), CD45(-)의 발현 정도를 통하여 식별된다.
본 명세서에서 용어“줄기세포의 노화(senescence)”는 줄기세포가 일정 횟수의 분열 이후에 자가재생(self-renewal) 및 다분화능(multipotency)으로 대표되는 줄기성을 상실함으로써 개체수 및 재생능이 감소하는 현상을 의미한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 인터루킨-6(IL-6) 또는 IL-6 수용체 억제제는 IL-6 또는 IL-6 수용체에 특이적으로 결합하는 항체이다. IL-6 수용체(CD126, Cluster of Differentiation 126)에 대한 항체로서 예를 들어 토실리주맙(Tocilizumab)을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 IL-6 수용체를 특이적으로 인식하여 결합하는 여하한 항체도 본 발명에서 이용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 인터루킨-6(IL-6) 또는 IL-6 수용체 억제제는 IL-6 유전자 또는 IL6R(Interleukin 6 receptor) 유전자의 발현을 억제하는 핵산분자이다.
보다 구체적으로는, 상기 핵산 분자는 siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 가장 구체적으로는, 본 발명에서 이용되는 발현 억제용 핵산분자는 siRNA이다.
본 명세서에서 용어“siRNA”는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.
siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음)등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 가장 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기 , 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 타겟 유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어 “shRNA”는 단일 가닥으로 50-70개로 구성된 뉴클레오타이드를 의미하며, in vivo상에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루고 있다. 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성한다.
본 명세서에서 용어 “miRNA(microRNA)”는 유전자 발현을 조절하며, 전장 20-50개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 20-45개 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 20-40개 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 20-30개 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 21-23개의 뉴클레오타이드로 구성된 단일 가닥 RNA분자를 의미한다. miRNA는 세포내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오타이드이며, 짧은 스템-루프 구조를 가진다. miRNA는 1 또는 2이상의 mRNA(messenger RNA)와 전체 또는 부분적으로 상동성을 가지며, 상기 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제시킨다.
본 명세서에서 용어 “리보자임(ribozyme)”은 RNA의 일종으로 특정한 RNA의 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA 분자를 의미한다. 리보자임은 타겟 전령 RNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 되어 있다.
본 명세서에서 용어 “PNA(Peptide nucleic acid)”는 핵산과 단백질의 성질을 모두 가지고 있는 분자로서, DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합이 가능한 분자를 의미한다. PNA는 핵산염기(nucleobase)가 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1999년에 처음 보고되었다(문헌 [Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O, "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide", Science 1991, Vol. 254: pp1497-1500]). PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 펩티드 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이며, 이 경우 펩티드 핵산의 기본골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산염기는 공간적 크기와 핵산염기 사이의 거리가 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소(nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다.
본 명세서에서 용어 “안티센스 올리고뉴클레오타이드”이란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 오타이드 본 발명의 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 타겟 유전자의 mRNA에 상보적이고 타겟 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고 타겟 유전자의 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(trans의 cation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 10 내 40 염기이다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995). 올리고뉴클레오타이드 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Runx2 또는 Dlx5의 억제제를 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 분화 또는 노화 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명자들은 노화된 줄기세포에서 발현이 증가하는 IL-6가 골분화 주요 전사인자인 Runx2 및 Dlx5의 발현을 유도하며, 이에 의해 줄기세포의 자가 증식 및 다능성 유지 여부의 주요 표지자인 Sox2의 발현이 감소하며, 반대로 Runx2 및 Dlx5의 발현을 억제하자 Sox2의 발현이 회복됨을 확인하였다. 따라서, Runx2 및 Dlx5는 IL-6와 함께 줄기세포 노화 억제의 효율적인 타겟이 될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 Runx2 또는 Dlx5의 억제제는 Runx2 또는 Dlx5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 Runx2 또는 Dlx5의 억제제는 Runx2 유전자 또는 Dlx5 유전자의 발현을 억제하는 핵산분자이다.
보다 구체적으로는, 상기 핵산 분자는 T-DNA, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 분화 또는 노화가 억제되는 줄기세포는 중간엽 줄기세포이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 줄기세포 분화 또는 노화 억제용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 시험물질을 미분화 줄기세포에 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 줄기세포 내 IL-6 또는 IL-6 수용체의 발현량을 측정하는 단계, 상기 IL-6 또는 IL-6 수용체의 발현량이 감소되는 경우에는 상기 시험물질은 줄기세포 분화 또는 노화 억제용 조성물로 판정된다.
본 발명의 방법에 따르면, 우선 미분화 줄기세포에 시험물질을 접촉시킨다. 구체적으로는, 미분화 줄기세포는 중간엽 줄기세포이다. 본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어“시험물질”은 IL-6 또는 IL-6 수용체의 발현량에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화학 물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA (small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이어, 시료가 처리된 세포에서 IL-6 또는 IL-6 수용체의 발현량을 측정한다. 발현량의 측정은 단백질 및 유전자 수준에서 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있으며, 예를 들어 단백질의 경우 항원-항체 반응을 이용한 면역분석(immunoassay) 방법으로, 유전자의 경우 유전자 증폭 또는 마이크로 어레이 등을 통해 측정될 수 있다. 측정 결과, IL-6 또는 IL-6 수용체의 발현이 억제되는 경우에는 상기 시험물질은 줄기세포 분화 또는 노화 억제용 조성물로 판정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 줄기세포 분화 또는 노화 억제용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 시험물질을 미분화 줄기세포에 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 줄기세포 내 Runx2 또는 Dlx5의 발현량을 측정하는 단계, 상기 Runx2 또는 Dlx5의 발현량이 감소되는 경우에는 상기 시험물질은 줄기세포 분화 또는 노화 억제용 조성물로 판정된다.
본 발명에 따르면, IL-6에 의해 발현이 유도되는 Runx2 또는 Dlx5의 발현을 직접 억제하여도 줄기세포의 미분화 표지자인 Sox2의 발현이 회복되므로, Runx2 또는 Dlx5의 발현변화 여부를 통해 줄기세포 분화 또는 노화 억제용 조성물의 후보물질을 탐색할 수 있다. 구체적인 스크리닝 방법 및 과정에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 줄기세포, 보다 구체적으로는 중간엽 줄기세포의 분화 또는 노화 억제용 조성물 및 이의 스크리닝 방법을 제공한다.
(b) 본 발명은 줄기세포의 노화 및 다분화능 상실의 원인 인자로서 IL-6 및이에 의해 발현이 유도되는 Runx2/Dlx5를 새롭게 발굴하였으며, 이들의 발현 억제를 통해 장기간의 배양기간에도 줄기세포의 노화가 억제되고 다분화능이 유지될 수 있음을 제안한다.
(c) 본 발명은 줄기세포의 치료적 유효량을 수득하기 위해 인 비트로에서 여러 계대를 거치면서 장기 배양을 할 때 나타나는 노화 및 골 계열로의 분화 치중의 문제를 근본적으로 해결함으로써 희소가치가 높은 치료자원으로서의 줄기세포를 보다 효율적으로 이용할 수 있도록 한다.
도 1은 계대가 길어짐에 따른 골수유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)의 노화가 진행됨을 나타낸 그림이다. 도 1a는 7번의 계대 배양을 통하여 진행된 노화를 확인한 Senescence-associated β-galactosidase 분석 결과이다. 도 1b는 7번의 계대배양 동안 노화가 진행된 결과, 크기가 큰 세포 집단이 늘어나는 것을 확인한 FACS 분석결과를 나타낸 그림이다. 도 1c는 노화된 7 계대 세포군에서 줄기세포의 고유 능력인 콜로니 형성 능력이 급격히 감소하고, 아울러 초기 골아세포 분화 표지자인 ALP(alkaline phosphatase)가 발현됨을 확인한 결과를 나타낸 그림이다. 도 1d는 노화된 7 계대 세포군에서 골분화 주요 전사인자인 Runx2와 Dlx5의 단백질이 발현되고, 줄기 세포의 자가 증식 및 다능성 유지에 중요한 유전자인 Sox2의 발현이 감소하는 것을 확인한 결과를 나타내는 그림이다.
도 2는 LCP(Large cell population)가 SCP(small cell population)의 세포노화 및 골계열로의 분화에 미치는 영향을 나타낸 그림이다. 도 2a는 비균질 세포 파퓰레이션을 FACS 기기를 이용하여 세포 크게에 따라 LCP 및 SCP로 분리한 결과를 나타낸 그림이다. 도 2b 및 도 2c는 LCP 및 SCP 각각의 콜로니 형성능력을 비교한 결과로서, 본 발명자들의 예상대로 SCP에 비하여 LCP는 콜로니 형성능력이 거의 없음을 Crystal violet 염색(도 2b, 현미경 배율 x100) 및 Senescence-associated β-galactosidase 어세이(도 2c)를 통해 각각 확인되었다. 도 2d 및 도 2e는 Cell Culture Insert를 이용하여 세포 배양 접시 바닥에는 SCP를, 배양 접시위에 삽입된 Insert에는 LCP를 배양한 결과 다분화능을 가진 SCP가 LCP에 의하여 노화가 진행됨을 확인한 결과로서, Senescence-associated β-galactosidase 염색 결과(도 2d) 및 상기 결과를 정량화한 그래프(도 2e)를 보여주는 그림이다. 도 2f는 LCP에 의하여 SCP에서의 Runx2와 Dlx5의 발현이 증가되고 Sox2의 발현은 현저히 감소됨을 나타낸 그림이다.
도 3은 Human Cytokine Array를 이용하여 LCP에서 분비되는 사이토카인을 동정한 결과, LCP에서 IL-6의 발현 및 분비가 SCP에 비해 높음을 다각도로 확인한 결과를 보여주는 그림이다. 도 3a는 인간에서 분비되는 36가지의 특정 시이토카인의 항체가 코팅되어 있는 막에 48시간동안 각 조건의 세포가 배양되었던 배양액을 처리하여 각 세포들이 배양액으로 분비한 사이토카인의 종류를 확인한 결과를 보여주는 그림이다. 도 3b는 도 3a의 결과들을 정량화한 그래프를 나타낸다. 도 3c는 도 3a 및 도 3b에서 확인된 IL-6가 정말 LCP에서 많이 분비되는지 확인하고자 각 세포를 키웠던 배양액을 모은 후 IL-6 특이적 항체를 이용하여 ELISA assay를 수행하한 결과를 나타낸 그림이다.
도 4는 IL-6가 SCP의 세포노화 및 자가 재생능력에 미치는 영향을 나타낸 그림이다. 도 4a는 IL-6를 중간엽 줄기세포에 처리하자 STAT3 인산화가 진행됨을 확인한 결과를 나타낸 그림이다. 도 4b 및 도 4c는 IL-6가 SCP의 노화를 가속시키고 콜로니 형성능력을 감소시킴을 각각 Senescence-associated β-galactosidase 어세이(도 4b) 및 OD값 측정을 통해 확인한 결과를 나타낸 그림이다. 도 4d는 IL-6가 Runx2와 Dlx5의 단백질 발현을 농도 의존적으로 증가시키고, Sox2의 단백질 발현은 감소시킴을 확인한 결과를 나타낸 그림이다.
도 5는 IL-6가 SCP의 다분화능에 미치는 영향을 나타낸 그림으로, IL-6가 ALP, Runx2 및 오스테오칼신(ostepcalcin)의 발현을 증가시켜 골분화를 유도함을 보여준다.
도 6은 IL-6 수용체에 대한 항체인 토실리주맙(tocilizumab)이 골수유래 중간엽 줄기세포의 골계열로의 분화에 미치는 영향을 나타낸 그림이다. 도 6a는 Cell Culture Insert System을 이용한 실험에서 토실리주맙 처리에 의해 SCP에서의 STAT3 인산화가 감소함을 나타낸 그림이다. 도 6b는 증가하였던 Runx2와 Dlx5의 발현이 다시 감소함을 보여주고, 도 6c는 감소되었던 Sox2의 발현이 회복됨을 보여줌으로써, LCP에 의하여 골분화 단계로 어느정도 계열이 제한되었던 SCP가 토실리주맙 투여로 인하여 전분화능을 다시 회복함을 확인하였다.
도 7은 IL-6에 의해 유도된 Runx2 및 Dlx5가 Sox 2의 발현을 조절함을 보여주는 그림이다. Runx와 Dlx5의 발현을 억제하였을 시 Sox2의 발현을 증가하지만(도 7a) Sox2를 억제하였을때는 Runx2와 Dlx5의 발현은 큰 변화가 없음을 관찰함으로써(도 7b) Sox2가 Runx2와 Dlx5에 의하여 발현이 조절됨을 확인하였다. 도 7c는 Runx2와 Dlx5를 표적으로 하는 siRNA를 이용하여 Runx2/Dlx5의 유전자 발현을 억제하자 Sox2의 발현이 다시 증가함을 나타낸 그림이다. 도 7d는 세포내에서 Sox2가 결합할 수 있는 특정 염기서열을 가진 벡터를 세포 내로 형질전환시킨 후 IL-6, Runx2 및 Dlx5의 발현을 조절하여 Sox2의 전사활성을 측정한 결과를 나타낸 그림이다. 도 7e는 IL-6 부재 하에서 Runx2와 Dlx5의 과발현을 통해 Sox2의 전사활성이 감소됨을 보여주는 그림이다.
도 2는 LCP(Large cell population)가 SCP(small cell population)의 세포노화 및 골계열로의 분화에 미치는 영향을 나타낸 그림이다. 도 2a는 비균질 세포 파퓰레이션을 FACS 기기를 이용하여 세포 크게에 따라 LCP 및 SCP로 분리한 결과를 나타낸 그림이다. 도 2b 및 도 2c는 LCP 및 SCP 각각의 콜로니 형성능력을 비교한 결과로서, 본 발명자들의 예상대로 SCP에 비하여 LCP는 콜로니 형성능력이 거의 없음을 Crystal violet 염색(도 2b, 현미경 배율 x100) 및 Senescence-associated β-galactosidase 어세이(도 2c)를 통해 각각 확인되었다. 도 2d 및 도 2e는 Cell Culture Insert를 이용하여 세포 배양 접시 바닥에는 SCP를, 배양 접시위에 삽입된 Insert에는 LCP를 배양한 결과 다분화능을 가진 SCP가 LCP에 의하여 노화가 진행됨을 확인한 결과로서, Senescence-associated β-galactosidase 염색 결과(도 2d) 및 상기 결과를 정량화한 그래프(도 2e)를 보여주는 그림이다. 도 2f는 LCP에 의하여 SCP에서의 Runx2와 Dlx5의 발현이 증가되고 Sox2의 발현은 현저히 감소됨을 나타낸 그림이다.
도 3은 Human Cytokine Array를 이용하여 LCP에서 분비되는 사이토카인을 동정한 결과, LCP에서 IL-6의 발현 및 분비가 SCP에 비해 높음을 다각도로 확인한 결과를 보여주는 그림이다. 도 3a는 인간에서 분비되는 36가지의 특정 시이토카인의 항체가 코팅되어 있는 막에 48시간동안 각 조건의 세포가 배양되었던 배양액을 처리하여 각 세포들이 배양액으로 분비한 사이토카인의 종류를 확인한 결과를 보여주는 그림이다. 도 3b는 도 3a의 결과들을 정량화한 그래프를 나타낸다. 도 3c는 도 3a 및 도 3b에서 확인된 IL-6가 정말 LCP에서 많이 분비되는지 확인하고자 각 세포를 키웠던 배양액을 모은 후 IL-6 특이적 항체를 이용하여 ELISA assay를 수행하한 결과를 나타낸 그림이다.
도 4는 IL-6가 SCP의 세포노화 및 자가 재생능력에 미치는 영향을 나타낸 그림이다. 도 4a는 IL-6를 중간엽 줄기세포에 처리하자 STAT3 인산화가 진행됨을 확인한 결과를 나타낸 그림이다. 도 4b 및 도 4c는 IL-6가 SCP의 노화를 가속시키고 콜로니 형성능력을 감소시킴을 각각 Senescence-associated β-galactosidase 어세이(도 4b) 및 OD값 측정을 통해 확인한 결과를 나타낸 그림이다. 도 4d는 IL-6가 Runx2와 Dlx5의 단백질 발현을 농도 의존적으로 증가시키고, Sox2의 단백질 발현은 감소시킴을 확인한 결과를 나타낸 그림이다.
도 5는 IL-6가 SCP의 다분화능에 미치는 영향을 나타낸 그림으로, IL-6가 ALP, Runx2 및 오스테오칼신(ostepcalcin)의 발현을 증가시켜 골분화를 유도함을 보여준다.
도 6은 IL-6 수용체에 대한 항체인 토실리주맙(tocilizumab)이 골수유래 중간엽 줄기세포의 골계열로의 분화에 미치는 영향을 나타낸 그림이다. 도 6a는 Cell Culture Insert System을 이용한 실험에서 토실리주맙 처리에 의해 SCP에서의 STAT3 인산화가 감소함을 나타낸 그림이다. 도 6b는 증가하였던 Runx2와 Dlx5의 발현이 다시 감소함을 보여주고, 도 6c는 감소되었던 Sox2의 발현이 회복됨을 보여줌으로써, LCP에 의하여 골분화 단계로 어느정도 계열이 제한되었던 SCP가 토실리주맙 투여로 인하여 전분화능을 다시 회복함을 확인하였다.
도 7은 IL-6에 의해 유도된 Runx2 및 Dlx5가 Sox 2의 발현을 조절함을 보여주는 그림이다. Runx와 Dlx5의 발현을 억제하였을 시 Sox2의 발현을 증가하지만(도 7a) Sox2를 억제하였을때는 Runx2와 Dlx5의 발현은 큰 변화가 없음을 관찰함으로써(도 7b) Sox2가 Runx2와 Dlx5에 의하여 발현이 조절됨을 확인하였다. 도 7c는 Runx2와 Dlx5를 표적으로 하는 siRNA를 이용하여 Runx2/Dlx5의 유전자 발현을 억제하자 Sox2의 발현이 다시 증가함을 나타낸 그림이다. 도 7d는 세포내에서 Sox2가 결합할 수 있는 특정 염기서열을 가진 벡터를 세포 내로 형질전환시킨 후 IL-6, Runx2 및 Dlx5의 발현을 조절하여 Sox2의 전사활성을 측정한 결과를 나타낸 그림이다. 도 7e는 IL-6 부재 하에서 Runx2와 Dlx5의 과발현을 통해 Sox2의 전사활성이 감소됨을 보여주는 그림이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험 방법
인간 골수천자액으로부터 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양
골수 천자액(BM aspirates)은 IRB(Institutional Review Board)의 승인 하에 14명의 성인 기증자의 후장골릉(posterior iliac crest)에서 수득하였다. 인간 골수유래의 중간엽 줄기세포는 플라스틱 세포배양 플라스크에 흡착하는 능력을 기준으로 선별하였다. 세포들은 10% FBS(Gibco, Grand Island, NY, USA) 및 1% 항생제-항진균제 용액(Invitrogen)이 보충된 DMEM-LG(low-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium; Invitrogen, Grand Island, NY, USA)에서 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 80-90% 컨플루언스에 도달하였을 때 0.25% 트립신/EDTA(Invitrogen)로 세포를 채집하고 3분간 1300 rpm에서 원심분리하였다. 채집된 세포(P1)을 5000 cells/cm2 농도로 다시 플레이팅한 뒤 7 계대(P7)에서 80-90% 컨플루언스에 도달할 때까지 서브컬쳐링하였다.
CFU-F(Colony-forming Unit Fibroblast) 분석
배양액을 1:1 아세톤:메탄올 고정액에 고정시키고, 20% 크리스탈 바이올렛 용액(Merck, Darmstadt, Germany)으로 30분 간 암조건에서 염색한 뒤 증류수로 세척하였다. 이후, 염색된 세포들의 콜로니 형성 능력을 측정하였다.
세포 증식 분석
세포 증식은 헥소사민 효소 분석(hexosaminidase assay)을 통해 측정하였다. 간단하게, 세포를 PBS, 7.5 mM PNAD(p-nitrophenyl-N-acetyl-β-d-glucosaminide; pH 5.0; Sigma)를 함유하는 0.1 M 시트르산 완충액(Sigma, St. Louis, MO, USA)으로 세척하고 각각의 웰에 0.5% 트리톤 X-100(Sigma)을 첨가한 뒤 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 이후, 5 mM EDTA(Sigma)를 함유하는 50 mM 글리신 완충액(pH 10.4; Amresco, Solon, OH, USA)을 각각의 웰에 첨가하였다. 방출된 헥소사민의 흡광도를 405 nm에서 측정하였다. 모든 시료는 3번의 실험을 하였다.
노화 관련 β-갈락토시다아제(SA-β-gal) 분석
세포노화분석 킷(Millipore, Temecula, CA, USA)을 이용하여 제조자의 설명서에 따라 SA-β-gal 분석을 수행하였다. 간단하게는, 세포를 PBS로 세척하고 상온에서 15분 간 1×고정용액으로 고정시켰다. 세포를 증류수로 세척하고 1× SA-β-gal 검출 용액(1:4:4 X-gal:용액 A:용액 B)으로 CO2가 없는 배양기에서 4시간 동안 37℃ 암조건으로 염색하였다. SA-β-gal양성세포는 파란 색을 띄었다. 양성 세포의 수는 위상차 현미경으로 측정하였다.
ALP(Alkaline Phosphatase) 염색
배양액을 2:3 시트르산 완충액:아세톤 고정액으로 고정시키고 알칼린 염색 용액(Sigma)을 이용하여 암조건에서 30분 간 ALP 염색을 수행하였다. 세포를 증류수로 세척하고, Mayer 헤마톡실린 용액(Sigma)으로 5분간 염색 후 세정하였다.
다계열 분화(Multi-lineage Differentiation)
골수 줄기세포의 분화를 위한 배양은 이전에 보고된 바와 같이 실시하였다[21]. 간단하게는, 세포를 12 웰-플레이트에 8 × 104cells/well로 씨딩하였다. 각각의 계열로의 분화 활성을 측정하기 위하여 알리자린레드 S (골분화), 오일레드 O(지방분화) 및 사프라닌 O(연골분화)로 염색하였다.
크기별 세포 분류(Size Fractionation Cell Sorting)
골수 줄기세포를 0.25% 트립신/EDTA와 함께 배양하여 수집하고, PBB로 두 번 세척한 뒤 미리 데워진 PBS에서 재부유시켰다. 크기가 작은 세포군(Small cell population; SCP) 또는 크기가 큰 세포군 (Large-cell population; LCP)를 분류하여 FACS(fluorescence-activated cell sorting; Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)로 분석하였다.
유세포 분석
배양된 세포를 0.02% EDTA로 수집하고 1% FBS 및 0.05% 소듐 아자이드를 포함하는 PBS(FACS 완충액)로 두 번 세척하였다. 단일세포를 FACS 완충액에서 20분 간 4℃에서 다음의 항체를 접합시킴으로써 표지하였다: Sox2-PerCP-Cy(BD Bioscience, San Jose, CA, USA) 또는 PerCP-Cy-mouse-IgG 동형 대조군(BD Bioscience). 세포를 FACS 완충액으로 세척한 뒤 FACS(Beckman Coulter)로 분석하였다.
정량적 실시간 PCR
이전에 보고된 방법에 따라 PCR 분석을 수행하였다[21]. 간단하게는, 총 RNA를 RNeasy 킷(Qiagen, Valencia, CA, USA)을 이용하여 제조자의 설명서에 따라 분리하였다. 1 mg의 총 RNA를 Omniscript 킷(Qiagen)을 이용하여 역전사하였다. 프라이머 세트는 Bioneer (Daejeon, South Korea)에서 구입하였으며, 사용된 프라이머는 다음과 같다: GAPDH(P267613), Runx2(P229954), Dlx5(P199945), PPAR-γ(P102359), adiponectin(P160254), Sox9(P232240), IL-6(P211161), ALP (P324388) 및 Sox2(P200205). type II collagen 및 osteocalcin에 대한 입증된 프라이머가 없어 다음과 같이 설계하였다: type II collagen, 5′-GAGTGGAAGAGCGGAGACTA-3′(센스) 및 5′-CTCCATGTTGCAGAAGACTT-3′(안티센스); osteocalcin, 5′-AGAGCCCCAGTCCCCTACCC-3′(센스) 및 5′-AGGCCTCCTGAAAGCCGATG-3′(안티센스).
RNA 간섭
Sox2(L-011778)에 대한 ON-TARGETplus SmartPool siRNA를 Dharmacon (Boulder, CO, USA)에서 구입하였다. 스크램블, Runx2(siRNA No. 1132367) 및 Dlx5(siRNA No. 1042423) siRNA는 Bioneer Inc.에서 구입하였다. 스크림불 센스 siRNA는 5′-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3′를 타겟으로 하며, 스크램블 안티센스 siRNA는 5′-ACGAAAUUGGUGGCGUAGG-3′를 타겟으로 한다. 간략하게는, 세포를 6 웰-플레이트에 70-80% 컨플루언시가 되도록 플레이팅 한 뒤에 Lipofectamine™ 2000(Invitrogen)을 이용하여 100 nM의 Sox2, Runx2, Dlx5 또는 스크램블(음성 대조군) siRNA로 형질전환하고, 6시간 후에 새로운 배양액을 첨가하였다.
PCMV6- 및 pcDNA3.3-매개 과발현
BM-MSC cDNA로부터 Runx2 및 Dlx5를 증폭하고 각각 PCMV6 및 pcDNA3.3 벡터에 클로닝하였다. 전달 유전자를 삽입하지 않은 모크 벡터를 대조군으로 사용하였다. 간략하게는, 세포를 6 웰-플레이트에 70-80% 컨플루언시가 되도록 플레이팅 한 뒤에 Lipofectamine™ 2000(Invitrogen)을 이용하여 PCMV6-Runx2 또는 pcDNA3.3-Dlx5로 형질전환하고, 6시간 후에 새로운 배양액을 첨가하였다.
웨스턴 블롯팅
세포를 수동성 용해 완충액(Passive Lysis Buffer, Promega, Madison, WI, USA)에서 파쇄하였다. 단백질 농도를 Bio-Rad 단백질 분석기(Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)로 측정하고, 10% SDS-PAGE(Sigma)로 30 μg의 단백질을 분석하였다. 옮겨진 막을 5% 탈지유(BD, Sparks, MD, USA)로 블로킹하고 Sox2 항체(Abcam, Cambridge, UK), Runx2 항체(Abcam), Dlx5 항체(Abcam), STAT3 항체(BD Bioscience), Tyr-p-STAT3 항체(Cell Signaling Technology, Inc. Boston, MA, USA) 및 Ser-p-STAT3 항체(Cell Signaling Technology, Inc.)와 함께 4시간 동안 배양하였다. 막은 로딩 컨트롤인 β-actin 항체(Santa Cruz Biotechnology) 또는 GAPDH 항체(Research Diagnostics, Flanders, NJ, USA)로 추가적으로 표지하였다. 단백질 발현은 3명의 기증자로부터 모두 확인되었으며, 데이터는 대표적인 것을 기재하였다.
프로테옴 프로파일러 인간 사이토카인 분석
골수유래 중간엽 줄기세포의 SCP, LCP 및 혼합 시료 내에서 분비되는 사이토카인을 분비하기 위하여 Proteome Profiler Human Cytokine Array Panel A 분석킷(Cat. No. ARY005; R&D Systems Inc.)을 이용하였다. 니트로셀룰로오스 막에 36개의 각기 다른 항-사이토카인 항체를 각각 두 개씩 스팟팅 (spotting)하고, 막을 블로킹 용액에서 1시간 동안 상온에서 인큐베이션한 뒤 1×세척 완충액으로 3번 세척하였다. 각 배양액의 시료를 막에 첨가하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 막을 1×세척 완충액으로 세척하고, 스트렙타비딘-HRP를 각각의 막에 상온에서 30분 간 첨가하였다. 사이토카인이 결합한 막 부위를 Chemiluminescent Reagent Mix를 이용하여 X-레이 필름 상에 시각화하였다. 각각의 사이토카인의 신호를 측정하고 Fuji 영상 스캐너의 TINA 2.0 프로그램을 이용하여 배경신호를 제거함으로써 정량화하였다.
IL-6 ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
배양액의 상층액 및 ELISA 킷(KOMA Biotech Inc., Seoul, Korea)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 SCP, LCP 및 혼합 시료 내로 분비되는 IL-6의 양을 측정하였다. 간략하게, 세포 배양 상층액을 항체가 코팅된 웰에 로딩하고 상온에서 마이크로플레이트 쉐이커 상에서 4시간 동안 배양하였다. 웰을 세척 완충액으로 세척하고 검출용 항체와 함께 상온에서 3시간 동안 배양하였다. 마지막으로, 플레이트를 분광광도 마이크로플레이드 리더로 450 nm에서 측정하였다. 모든 분석은 두 번 수행되었으며(n=3), IL-6 농도는 표준 곡선을 이용하여 계산하였다.
IL-6 농도의 측정
인 비트로에서 골수유래 중간엽 줄기세포에서의 STAT3 인산화를 유도하기 위해 필요한 IL-6(KOMA Biotech Inc.)의 광학 농도를 측정하기 위하여, 세포들을 대조군(IL-6을 처리하지 않은 군) 및 실험군(1, 10 또는 50ng/mL의 IL-6을 처리한 군)으로 구성하였다. 세포들을 24시간 동안 배양하고 1, 4, 12 및 24시간 째에 STAT3 및 pSTAT3 발현을 웨스턴 블롯팅으로 측정하였다.
IL-6 수용체의 항체 농도의 측정
인간화된 항-인간 IL-6 수용체 단일클론 항체인 토실리주맙(Tocilizumab, Actemra)은 JW Pharmaceutical(Seoul, Korea)을 통해 Chugai Pharma Manufacturing Co., Ltd.에서 제공받았다. IL-6 신호전달을 억제하는 토실리주맙의 광학농도를 결정하기 위하여, 세포들을 대조군(토실리주맙을 처리하지 않은 군) 및 실험군(25 또는 및 50/mL의 토실리주맙을 처리한 군)으로 구성하였다. 세포들을 24시간 동안 50 ng/mL IL-6 하에서 배양하고, 24시간 째에 STAT3 및 pSTAT3 발현을 웨스턴 블롯팅으로 측정하였다.
Sox2-의존성 GFP 활성에 대한 리포터 어세이
Sox2-의존성 GFP 리포터 활성을 CignalTM Reporter Assay(SABiosciences, Frederick, MD, USA)를 이용하여 제조자의 설명서에 따라 수행하였다. 상기 리포터는 Sox2의 전사조절인자(TRE, AACAAAGAGT)를 포함한다. rhIL-6 또는 Runx2 및 Dlx5 siRNA(100 ng)를 인코딩하는 플라스미드와 Sox2-의존성 리포터(50 ng)를 Lipofectamine™ 2000(Invitrogen)를 이용하여 골수유래 중간엽 줄기세포에 형질 전환하였다. 36시간 뒤에, 형질전환된 세포를 Sox2 신호를 분석하기 위한 이중-루시퍼라아제 어세이(Promega)를 통해 분석하였다.
통계적 분석
통계적 분석은 스튜던트의 t-검정을 이용하여 수행하였으며, 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다. P<0.05(*로 표시)인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
실험 결과
계대 증가에 따른 중간엽 줄기세포의 노화
골수 유래 중간엽 줄기세포는 7번의 계대 배양을 통하여 노화가 되는 것을 노화 관련 갈락토시다제 분석(Senescence-associated β-galactosidase assay)을 통하여 확인하였다(도 1a). 골수 유래 중간엽 줄기세포의 노화 표지자중 하나가 세포 크기의 증가이다. 이러한 현상 역시 FACS 분석을 통하여 7번 정도 계대 배양 되었을 때, 크기가 큰 세포 집단이 늘어나는 것을 확인할 수 있었다(도 1b). 줄기세포의 고유 능력인 콜로니 형성 능력이 7 계대에서 급격히 감소한 것을 확인할 수 있었으며, 초기 골아세포 분화 표지자인 ALP(alkaline phosphatase)를 발현하였다(도 1c). 이는 골분화 주요 전사인자인 Runx2와 Dlx5의 단백질 발현을 확인함으로서 미분화 세포가 장기간 배양을 통하여 초기 골아 세포로 분화가 되고 있음을 보여주며, 줄기 세포의 자가 증식 및 다능성 유지에 중요한 유전자인 Sox2의 발현이 감소하는 것으로 보아 7 계대의 중간엽 줄기세포는 다분화능을 잃는 것으로 보인다(도 1d).
LCP의 줄기세포 노화 및 다능성에 대한 영향
본 발명자들은 노화된 세포의 크기가 크다는 것에 착안, 전체 골수 유래 줄기세포 집단에서 노화가 되었을 것으로 예상되는 크기가 큰 세포군(Large cell population; LCP)과 상대적으로 다능성을 가진 것으로 알려진 크기가 작은 세포군 (Small cell population; SCP)을 FACS 기기를 이용하여 분리하였다(도 2a). 예상대로 작은 세포에 비하여 LCP는 콜로니 형성능력이 거의 없었으며, 노화가 상당부분 진행되어 있었다(도 2b 및 2c). 본 발명자들은 골수 유래 중간엽 줄기세포의 노화 및 다능성 손실의 원인이 이러한 이종적인 집단이 서로 영향을 주어 전체적인 세포 집단의 노화를 가져 오는 것이라 예상하였다. 이를 확인하기 위하여, SCP와 LCP 간의 직접적인 접촉을 차단하면서 서로가 분비하는 사이토카인이 세포 노화에 영향을 줄 수 있는지 확인하고자 하였다. Cell Culture Insert를 이용하였으며, 세포 배양접시 바닥에는 SCP를, 배양 접시위에 삽입된 Insert에는 LCP를 배양하였다. 그 결과, 다분화능을 가진 SCP는 LCP에 의하여 노화가 진행되는 것을 보여 주었으며 골분화 표지자인 ALP를 발현함으로서 골 분화 계열로 제한되어 간다는 것을 확인할 수 있었다(도 2d 및 2e). LCP에 의하여 SCP는 골분화 주요 전사인자인 Runx2와 Dlx5의 발현이 증가되었으며, 줄기성 유지에 있어 중요한 유전자인 Sox2의 발현은 현저히 감소하였다(도 2f).
노화 인자의 동정
LCP가 노화에 영향을 미치는 현상의 원인을 규명하기 위하여 본 발명자들은 LCP에서 분비되는 사이토카인 중 노화의 원인이 되는 인자를 찾고자 하였다. 이를 위해 Proteome Human Cytokine Array를 수행한 결과, 인터루킨-6(Interleukin-6, IL-6)가 SCP에 비하여 LCP에서 유의하게 증가된 발현을 보이는 것을 확인하였으며(도 3a 및 3b), 이를 IL-6의 mRNA 수준과 ELISA를 통한 분비량 측정을 통해 다시 한번 확인하였다(도 3c 및 3d).
IL-6가 SCP의 세포노화 및 자가재생 능력에 미치는 영향
LCP에서 분비되는 IL-6가 정말 중간엽 줄기세포군의 다능성 세포 집단인 SCP의 노화 및 다능성 손실의 원인 물질인지를 규명하고자 인간 재조합 IL-6를 이용하여 실험을 하였다. IL-6를 중간엽 줄기세포에 처리한 후 세포가 반응하는지를 알아보고자 기존 IL-6의 하위 신호 전달 유전자로 알려진 STAT3의 인산화를 확인한 결과, 50 ng/mL의 농도에서 중간엽 줄기세포의 STAT3 인산화가 진행되는 것을 확인하였다(도 4a). 예상대로 IL-6는 SCP의 노화를 가속화 시키고 콜로니 형성능력을 감소시켰다(도 4b 및 4c). 또한, Runx2와 Dlx5의 단백질 발현을 농도 의존적으로 증가시켰으며, 자가 증식 및 다능성 유지에 중요한 Sox2의 단백질 발현은 감소시켰다(도 4d).
IL-6가 SCP의 다분화능에 미치는 영향
IL-6가 SCP의 다분화능에도 영향을 주는지 확인한 결과, 예상대로 IL-6 투여에 의하여 중간엽 줄기세포의 골분화능은 증가하였다(도 5).
이러한 다분화능의 상실이 IL-6에 의한 영향인지를 보다 다각적으로 확인하고자 본 발명자들은 IL-6 수용체에 대한 항체인 토실리주맙(Tocilizumab)을 이용하여 IL-6의 신호 전달을 막아보고자 하였다. Cell Culture Insert System을 이용한 실험에서, LCP에서 분비되는 다양한 사이토카인 중 IL-6에 대한 신호 전달만을 토실리주맙을 이용하여 특이적으로 저해한 결과 증가되었던 Runx2와 Dlx5의 발현은 다시 감소되었으며 감소되었던 Sox2의 발현은 어느 정도 회복되었다(도 6b). 뿐만 아니라, LCP에 의하여 골분화 단계로 어느 정도 계열이 제한되었던 SCP가 토실리주맙에 의하여 계열 제한이 되지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 6c). 이러한 결과는 LCP에서 분비되는 다양한 사이토카인 중 IL-6 신호전달이 중간엽 줄기세포의 세포 노화와 줄기성(stemness) 손실에 원인인자라는 것을 설명해 준다.
IL-6로 유도된 RunX2 및 Dlx5에 의한 Sox2의 발현조절
본 발명자들은 IL-6에 의한 골분화 주요 전사인자인 Runx2와 Dlx5의 발현 증가가 줄기성 유지에 있어 중요한 인자인 Sox2의 발현에 영향을 주어서 결국 세포가 골분화 계열로 제한되면서 다분화능을 잃고 노화될 것이라는 가정을 하였다. 이를 확인하기 위하여 Runx2와 Dlx5를 표적으로 하는 siRNA(Small interfering RNA)를 이용하여 이들 유전자의 발현을 억제하였으며, 그 결과 IL-6가 처리된 조건에서도 Runx2/Dlx5의 유전자 발현을 억제하면 Sox2의 발현이 다시 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 7c). Sox2의 결합 모티프 서열을 리포터 벡터를 이용하여 Runx2와 Dlx5에 의한 Sox2의 전사활성 정도를 확인한 결과, Runx2/Dlx5를 억제하면 Sox2의 전사활성은 증가하였으며, 반대로 Runx2/Dlx5의 발현을 증가시키면 Sox2의 전사활성 정도는 감소됨을 확인하였다(도 7d 및 7e)
이러한 결과를 토대로 우리는 IL-6에 의한 Runx2/Dlx5의 발현 증가가 Sox2의 전사 활성에 영향을 미치며, Sox2의 발현이 감소된 중간엽 줄기세포는 자가 증식능과 다분화능을 잃고 노화가 된다는 것을 규명하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (12)
- 인터루킨-6(IL-6) 또는 IL-6 수용체 억제제를 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 분화 또는 노화 억제용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 인터루킨-6(IL-6) 또는 IL-6 수용체 억제제는 IL-6 또는 IL-6 수용체에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 인터루킨-6(IL-6) 또는 IL-6 수용체 억제제는 IL-6 유전자 또는 IL6R(Interleukin 6 receptor) 유전자의 발현을 억제하는 핵산분자인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 3 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 T-DNA, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
- Runx2 또는 Dlx5의 억제제를 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 분화 또는 노화 억제용 조성물.
- 제 6 항에 있어서, 상기 Runx2 또는 Dlx5의 억제제는 Runx2 또는 Dlx5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 6 항에 있어서, 상기 Runx2 또는 Dlx5의 억제제는 Runx2 유전자 또는 Dlx5 유전자의 발현을 억제하는 핵산분자인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 8 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 T-DNA, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 6 항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
- (a) 시험물질을 미분화 줄기세포에 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 줄기세포 내 IL-6 또는 IL-6 수용체의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 줄기세포 분화 또는 노화 억제용 조성물의 스크리닝 방법, 상기 IL-6 또는 IL-6 수용체의 발현량이 감소되는 경우에는 상기 시험물질은 줄기세포 분화 또는 노화 억제용 조성물로 판정된다.
- (a) 시험물질을 미분화 줄기세포에 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 줄기세포 내 Runx2 또는 Dlx5의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 줄기세포 분화 또는 노화 억제용 조성물의 스크리닝 방법, 상기 Runx2 또는 Dlx5의 발현량이 감소되는 경우에는 상기 시험물질은 줄기세포 분화 또는 노화 억제용 조성물로 판정된다.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130155689A KR20150069374A (ko) | 2013-12-13 | 2013-12-13 | 줄기세포의 노화 억제용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130155689A KR20150069374A (ko) | 2013-12-13 | 2013-12-13 | 줄기세포의 노화 억제용 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20150069374A true KR20150069374A (ko) | 2015-06-23 |
Family
ID=53516514
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020130155689A KR20150069374A (ko) | 2013-12-13 | 2013-12-13 | 줄기세포의 노화 억제용 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20150069374A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017176067A1 (ko) * | 2016-04-08 | 2017-10-12 | 파미셀 주식회사 | 줄기세포의 세포노화 검출용 키트 |
-
2013
- 2013-12-13 KR KR1020130155689A patent/KR20150069374A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017176067A1 (ko) * | 2016-04-08 | 2017-10-12 | 파미셀 주식회사 | 줄기세포의 세포노화 검출용 키트 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Varela-Eirín et al. | Targeting of chondrocyte plasticity via connexin43 modulation attenuates cellular senescence and fosters a pro-regenerative environment in osteoarthritis | |
| Sallustio et al. | TLR2 plays a role in the activation of human resident renal stem/progenitor cells | |
| Park et al. | Increased caveolin-1, a cause for the declined adipogenic potential of senescent human mesenchymal stem cells | |
| Oishi et al. | Osteogenic differentiation capacity of human skeletal muscle-derived progenitor cells | |
| Kondo et al. | Contribution of the interleukin‐6/STAT‐3 signaling pathway to chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells | |
| Wang et al. | Polycystin-1 mediates mechanical strain-induced osteoblastic mechanoresponses via potentiation of intracellular calcium and Akt/β-catenin pathway | |
| Torreggiani et al. | Role of Slug transcription factor in human mesenchymal stem cells | |
| CN101341244A (zh) | 获取间质干细胞的方法 | |
| JP6893633B2 (ja) | 分化細胞の抽出方法 | |
| Keire et al. | A role for versican in the development of leiomyosarcoma | |
| He et al. | miR-188-3p targets skeletal endothelium coupling of angiogenesis and osteogenesis during ageing | |
| Zhou et al. | KLF2+ stemness maintains human mesenchymal stem cells in bone regeneration | |
| Mrosewski et al. | Regulation of osteoarthritis-associated key mediators by TNFα and IL-10: effects of IL-10 overexpression in human synovial fibroblasts and a synovial cell line | |
| Conte et al. | Clearance of defective muscle stem cells by senolytics restores myogenesis in myotonic dystrophy type 1 | |
| US10017817B2 (en) | Skin activation by acceleration of PDGF-BB activity | |
| Dai et al. | lncRNA-MIAT facilitates the differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells into lymphatic endothelial cells via the miR-495/Prox1 axis | |
| KR101577007B1 (ko) | 지방유래줄기세포의 분화능력 탐지 마커 및 이의 용도 | |
| KR20150069374A (ko) | 줄기세포의 노화 억제용 조성물 | |
| WO2015088162A1 (ko) | 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 촉진용 조성물 | |
| CN102296114A (zh) | miRNA-20a及其抑制剂在制备胶质瘤干细胞侵袭调控剂中的应用 | |
| US20230002734A1 (en) | Methods for producing or isolating epicardial cells and uses thereof | |
| KR102142956B1 (ko) | 중간엽줄기세포의 증식 및 이동 능력 예측용 바이오마커 및 이의 용도 | |
| WO2018169094A1 (ja) | 不死化したヒト由来腫瘍血管内皮細胞の樹立方法及び不死化したヒト由来腫瘍血管内皮細胞 | |
| CN102321585B (zh) | miRNA-106a及其抑制剂在制备胶质瘤干细胞侵袭调控剂中的应用 | |
| Kwon et al. | An activating mutation in Pdgfrb causes skeletal stem cell defects with osteopenia and overgrowth in mice |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20131213 |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20150429 Patent event code: PE09021S01D |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| PE0601 | Decision on rejection of patent |
Patent event date: 20151120 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PE06012S01D Patent event date: 20150429 Comment text: Notification of reason for refusal Patent event code: PE06011S01I |