CN101341244A - 获取间质干细胞的方法 - Google Patents

获取间质干细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101341244A
CN101341244A CNA2006800410207A CN200680041020A CN101341244A CN 101341244 A CN101341244 A CN 101341244A CN A2006800410207 A CNA2006800410207 A CN A2006800410207A CN 200680041020 A CN200680041020 A CN 200680041020A CN 101341244 A CN101341244 A CN 101341244A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
stem cell
interstital stem
interstital
mscs
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2006800410207A
Other languages
English (en)
Inventor
林赛江
埃利亚斯·赖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Agency for Science Technology and Research Singapore
Original Assignee
Agency for Science Technology and Research Singapore
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Agency for Science Technology and Research Singapore filed Critical Agency for Science Technology and Research Singapore
Publication of CN101341244A publication Critical patent/CN101341244A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/135—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/73—Hydrolases (EC 3.)
    • C12N2501/734—Proteases (EC 3.4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Abstract

我们描述了一种获取细胞培养物的方法，该方法包括提供通过把人胚胎肝细胞(hESC)集落及其衍生物进行分散，并在没有细胞饲养层的情况下，在含有FGF2和可选择的PDGF AB的无血清培养基中增殖细胞。优选地，采用分散剂对人胚胎干细胞(hESC)集落进行分散，所述分散剂为胰蛋白酶。

Description

获取间质干细胞的方法
采用2005年9月2日提交的申请系列号为US60/713,992的美国临时申请作为参考。
前述申请，以及在本申请、前述申请以及每个前述申请诉讼期间中所引用或参考的每份文件，和在前述申请、文件以及该申请和文件中所引用的任何文件中所引用或提及的任何产品的操作指南或目录，都通过参考的方式结合在本文中。此外，在本文中所引用的任何文件，和在本文的引用文件中所引用或参考的所有文件，以及本文或结合到本文中的任何产品的所有操作指南或目录，都通过参考的方式结合在本文中。通过参考方式结合到本文中的文件或任何教导都再次可以用在本发明的实践中。通过参考方式结合到本文中的文件不是承认的现有技术。
技术领域
本发明涉及研发，细胞生物学、分子生物学以及遗传学领域。尤其特殊地，本发明涉及从胚胎干细胞中获取间质干细胞的方法。
背景技术
与分化细胞不同，干细胞具有分裂以及自我更新或分化成表型和功能不同子细胞的能力(Keller Genes Dev.2005；19：1129-1155；Wobus andBoheler，Phsysiol Rev.2005；85：635-678；Wiles，Methods in Enzymology.1993；225：900-918；Choi et al，Methods Mol Med.2005；105：359-368)。
鼠胚胎干细胞(ESCs)的多能性以及它们分化成来自所有三个胚层(three germ layers)的能力使得胚胎干细胞成为用于再生性治疗多种疾病和组织损伤的理想细胞源(Keller，Genes Dev.2005；19：1129-1155；Wobus and Boheler，Physiol Rev.2005；85：635-678)。然而，胚胎干细胞的这种特别的性质也带来独特的挑战，即需要足量并同质性地产生用于治疗特定疾病或组织损伤的合适细胞类型以保证治疗效果，并抑制对组织修复和再生有害的其它细胞类型的产生。目前，既可以强化胚胎干细胞向特定细胞系分化和/或富集特定组织细胞类型的方法过于低效并且一般会产生导致肿瘤发生的异质细胞群体(Keller，Genes Dev.2005；19：1129-1155；Wobus and Boheler，Physiol Rev.2005；85：635-678)。
有关于治疗肌肉骨骼损伤、在心血管疾病方面提高心功能以及改善GVHD严重性的疗效的书面证据(Le Blanc and Pittenger，2005)表明间质干细胞(MSCs)是多能干细胞。作为限制性细胞系，它们具有受限地但却高水平地分化成间质细胞类型的潜能，例如脂肪细胞、软骨细胞以及骨细胞，而其形成畸胎瘤的风险是微不足道的。宿主对移植MSCs的免疫排异通常可以通过自体同源或异源移植来规避。MSCs可以从几种成体组织包括骨髓(BM)、脂肪组织(ad)、脐带血中分离出来并在体外扩增。然而，用于扩增它们的组织的可获得性是有限的并且需要采用有风险的侵入方法，而且体外培养虽然是重要的，但仍然是有限的。
可替换的MSCs来源是不受限制地供应可无限扩增且多能的人体胚胎干细胞(hESCs)，其也可以排除具有潜在性风险的侵入性技术。如果hESC细胞系变得足够大的话，宿主对源自hESC的MSCs(hESC-MSC)的免疫排斥性就可以通过治疗性克隆所产生的自体同源性hESCs或免疫兼容的异源性hESCs来规避。
之前已经描述过从hESC中分离MSC或MSC样细胞。Barberi，等(2005)PloS Med 2，e161公开了一种方法，其包括在挑拣占细胞总群数50％的CD73+细胞之前，hESCs与鼠OP9细胞在血清存在的条件下共培养40天。Xu，C.等.(2004)干细胞22，972-80描述一种方法，该方法包括用表达hTERT(Xu等)的逆转录病毒感染源自胚胎的hESCC。然而，这些方法的关键组成部分即外源DNA的病毒感染、在鼠细胞中的暴露以及血清的使用引入了不可接受的致肿瘤和xenozootic感染的风险，因而在临床应用中排除使用这些MSCs。
本发明试图解决现有技术中的方法所存在上述以及其它问题。
发明内容
根据本发明，正如权利要求中所提出的，我们提供了间质干细胞(MSC)、间质干细胞系、分化的间质干细胞、获取这些细胞的方法以及这些细胞的应用。优选实施方式列于在权利要求中并且在说明书中作了描述。
除非另有指出，本发明的实际操作采用传统化学技术、分子生物学、微生物学、重组DNA以及免疫学，它们都属于本领技术人员的能力。这些技术在文献中有解释。参考，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch，以及T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A laboratory Manual，Second Edition，Books 1-3，Cold Spring Harbor laboratory press；Ausubel，F.M.et al(1995and periodic supplements；Current Protocols in Molecular Biology，ch.9，13，and 16，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，and A.Kahn，1996，DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques，JohnWiley & Sons；J.M.Polak and James O`D.McGee，1990，OligonucleotideSynthesis：A Practical Approach，IrI Press；D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesis andPhysical Analysis of DNA Methods in Enzymology，Academic Press；UsingAntibodies：A Laboratory Manual：Portable Protocol NO.I by EdwardHarlow，David Lane，Ed Harlow(1999，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies：A Laboratory Manual by Ed Harlow(Editor)，David Lane(Editor)(1988，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-314-2)，1855；and Lab Ref：A Handbook of Recipes，Reagents，and Other Reference Tools for Use at the Bench，Edited Jane Roskams andLinda Rodgers，2002，Cold Spring Harbor Laboratory，ISBN 0-87969-630-3。这些工具书每份都通过参考方式结合在本文中。
附图说明
图1A-1G：hESC-MSC培养物的特性表现。
图1A：相衬下的细胞形态学。
图1B：hESC-MSC中多能性相关基因的表达。通过基于Taqman的定量RT-PCR来测量转录水平并将其标准化为hESC的水平。HESC的转录水平源自HuES9和H1hESC细胞系的平均值。
图1C：HuES9和H1hESC，HuES9.E1，HuES9.E3和H1.E2hESC-MSC培养物以及E14鼠ESC细胞系中多能性相关基因的免疫蛋白印迹分析(Western blot analysis)。
图1D：肾包膜下移植HuES9和HuES9.E1。在移植HuES9.E1(上部)或HuES9(底部)4个月之后，石蜡包埋并对肾切片进行H&E染色。
图1E：人体HuES9ESC细胞系、鼠E14ESC细胞系、鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层以及HuES9.E1的碱性磷酸酶活性。
图1F：用PCR法对人Alu和鼠c-mos重复序列做基因组DNA分析。
图1G：HuES9.E1的染色体G显带分析(上图)和光谱核型分析(SKY)(中图)。下图显示了9号染色体臂间畸变。
图2A-2B：用FACS分析法展现表面抗原的表达谱。
图2A：对HuES9.E1HuES9.E3和H1.E2hESC-MSCs，HuES9hESCs，以及鼠胚胎成纤维饲养层细胞进行染色并用WinMDI软件在Cyan LX(Dako North America，Inc.，Carpinteria，CA)仪器上进行分析。通过把相同样本量的细胞和异型配对的鼠单克隆抗体进行温育的方法来测定非特异性荧光。
图2B：在用FACS法分析BM-MSCs之前，HuES9.E1和HuES9.E3hESC-MSCs在含血清的BM-MSC培养基中传代两次。
图3A-3C：HuES9.E1细胞的分化。采用标准方法诱导HuES9.E1细胞经历成脂肪细胞、成软骨细胞、成骨细胞的分化的过程。
图3A：脂肪细胞分化.：i)在诱导向脂肪细胞分化后14天，用油红对细胞油滴进行染色；ii)在7天和14天时用Taqman定量RT-PCR法测定PPARγmRNA。所有测定值标准化为HuES9.E1的量；iii)用Taqman定量RT-PCR所测定的PPARγmRNA在HuES9和HI hESCs、源自它们的MSC细胞培养物(HuES9.E1、HuES9.E3及H1.E2)以及源自成体组织的MSCs(BM-MSC和ad-MSC)中的相对水平。所有值都以HuES9.E1的量为准进行标准化。
图3B：成软骨细胞分化：i)在诱导向成软骨细胞分化21天后，用爱尔新蓝(alcian blue)(左边)对细胞中的蛋白多糖进行染色并采用基于HRP的可视化分析法检测对骨胶原II型的免疫反应；ii)用在7天和14天时用Taqman定量RT-PCR法测定Aggrecan和PPARγmRNA。所有值都以HuES9.E1的量为准进行标准化；iii)用Taqman定量RT-PCR所测定的PPARγmRNA在HuES9和HI hESCs、源自它们的MSC细胞培养物(HuES9.E1、HuES9.E3及H1.E2)以及源自成体组织的MSCs(BM-MSC和ad-MSC)中的相对水平。所有值都以HuES9.E1的量为准进行标准化。
图3C：成骨细胞分化：i)在诱导向成骨细胞分化21天后，用vonKossa染色剂对细胞进行染色使其矿化，ii，iii)在第7天和14时用Taqman定量RT-PCR测定骨特异性碱性磷酸酶(ALP)和骨涎蛋白(BSP)mRNA。所有值都以HuES9.E1的量为准进行标准化。
图4A-4D：基因表达分析。
图4A：对3种由HuES9.E1，HuES9.E3和H1.E2所构成的hESC-MSC培养物，3种BMMSC样品，3种ad-MSC样品以及3种由HuES9、H1和H3s3所构成的hESC细胞系中所表达的基因进行聚类分析。
图4B：对hESC-MSCs和BMMSCs(左边)之间以及hESC-MSCs和hESCs(右边)之间的基因表达作两两对比。
图4C：hESC-MSCs和BM-MSCs的通常所表达的基因进行分析(＜2倍差异)。采用Panther分类系统根据生物学过程对该基因进行分类。如果生物学过程显著性高于或低于代表物(p＜0.01)，则通过把每个生物学过程所观测到的基因频率与包括23481个基因的NCBI：H.人类(H.sapiens)基因数据库中的基因频率进行比较。对显著性高于或低于代表物的过程进行分组并图示。
图4D：hESC-MSCs和BM-MSCs中差异性表达基因(＞2倍差异)的分析。对通过基因在hESC-MSCs和BM-MSCs中高度表达的显著性高于或低于代表物(p＜0.01)生物学过程进行分组并图示。
图5A-5D：hESC-MSCs传代与否的分类。
图5A：FACS分析HuES9.E1，HuES9.E3和H1.E2hESC-MSCs，对HuES9hESCs以及鼠胚胎成纤维饲养细胞进行染色并用WinMDI软件在Cyan LX(Dako North America，Inc.，Carpinteria，CA)仪器上分析是否存在CD24。通过把相同的细胞试样和异型配对的鼠单克隆抗体进行温育来确定非特异性荧光。
图5B：对经过胰蛋白酶消化并在添加了PDGF及FGF2的无饲养层培养基中增殖一周的HuES9细胞中的CD105+、CD24-细胞进行分类，。挑选在Q4中表达的CD105+、CD24-细胞进行培养。
图5C：两两比较Q4.1与其它名为Q4.2-Q4.5的各种Q4培养物的基因表达。
图5D：两两比较所有Q4培养物和由HuES9.E1，HuES9.E3和H1.E2所组成的hESC-MSCs的基因表达，并对所有Q4培养物和BM-MSCs两两进行比较；e)Q4.3的SKY分析。
图6：HuES9.E1条件培养基中的蛋白质分析。80％融合的HuES9.E1细胞培养物用PBS洗涤3次，在由不含酚红并添加了ITS、5ng/ml FGF2，5ng/ml PDGF AB谷氨酸盐-青霉素-链霉素以及β-巯基乙醇的DMEM培养基所组成的化学合成培养基中培养过夜。该培养物随后用PBS洗涤3次，然后用新鲜的合成培养基进行替换。在0，24，48和72小时时间移取培养基样液，500g离心并对上清液作0.2μ微孔过滤。10μl培养基在4-12％SDS-PAGE中分离并作银染。
图7：抗体阵列。根据操作指南(RayBio Norcross，CA)把1ml合成(CM)或非合成(NCM)培养基和
Figure A20068004102000151
细胞因子抗体阵列一起进行培养。实施例中列出了每个阵列的抗体图。配体与特异性抗体之间的结合可以通过基于HRP的化学发光分析进行肉眼观测。对各膜的不同曝光度进行了分析。按照是否在与CM杂交的膜上出现了信号而在与NCM杂交的膜上没有产生信号对抗原进行打分。对4个独立的CM和NCM批次所作的分析数据概括在实施例中。
图8：201个基因产物在生物学过程中的分布。这201个基因在GO分裂系统中被分配到不同的生物学过程中。分泌基因组的基因频率相对于Unigene、Entrez和基因库归类的数据库中基因的频率而言是过度呈现，p值＜0.05的58种生物学过程被分成3个主要的组别：代谢，防御性响应以及组织分化。
图9：把201基因产物分布到多个途径中。这201个基因在GO分裂系统中被分入不同的途径中。分泌基因组的基因频率相对于Unigene、Entrez和基因库归类的数据库中基因的频率而言是过度呈现，p值＜0.05的30种生物学过程被分成几个主要的类别：受体结合、信号传导、细胞-细胞间相互作用、细胞迁移、免疫应答以及代谢。
具体实施方式
从hESCs中获取间质干细胞(MSC)或MSC样细胞的现有方法包括把人端粒逆转录酶(hTERT)基因转染到正在分化的hESCs(Xu等，2004)或者和鼠op9细胞系进行共培养(Barberi et al.，2005)。在这些分化方法中使用外源性遗传物质和鼠细胞引入了不可以接受的致肿瘤风险或被xenozootic感染性试剂感染的风险。
相反的，我们的方法提供了临床相关并可重复的用于从正在分化的hESCs中分离类似或相同(优选同源的)MSC群体的操作方法。总体上，我们的方法包括把胚胎干细胞(ES)集落分散成多个细胞，随后涂布这些细胞并增殖。这些细胞在没有共培养物的条件下，在不含血清的具有成纤维生长因子2(FGF2)的培养基中进行增殖，以便获取间质干细胞(MSCs)。
因此，我们的方法不需要血清，不需要使用鼠细胞或遗传操作，并且所需的操作和时间更少，因而是高度升级的(highly scalable)。实施例描述了从两个不同的hESC细胞系HuES9和H-1，也可以是第三种细胞系，Hes-323中分离MSCs，并阐述了本方法的稳健性。通过本方法所获取的人ES细胞分化的MSCs(hESC-MSCs)以及本文所描述的组分与骨髓分化的MSCs(BM-MSCs)相当类似。
在优选实施方式中，胚胎干细胞培养物包括人胚胎干细胞(hESC)培养物。
在一个实施方式中，生成间质干细胞的方法包括在对CD105+CD24-进行挑选之前，用胰蛋白酶消化并在没有饲养层的添加有FGF2和可选的PDGF的培养基中增殖hESCs。
在优选实施方式中，该方法包括在没有饲养层的情况下在添加有FGF2以及可选的PDGF AB的培养基中增殖一周后从经胰蛋白酶消化的hESCs中挑选CD105+，CD24-细胞，这可以导致生成hESC-MSC细胞培养物，其中至少部分，优选基本上全部，更优选所有细胞彼此之间都是类似的或者相同的(优选同源的)。
本文所描述的用于生成临床相关的并在实体、生物学以及功能上都类似于BM-MSCs的hESCMSC培养物的方法可以潜在地缓和用于分离BM-MSCs的BM的限制供应，所述BM-MSCs已经在许多临床和临床前的动物研究中表现出了治疗效果10，25。它也可以免除了所需要的有风险的BM抽吸过程，减少了每个患者等待时间以及制备BM-MSCs的费用，并减少了批次间的差异。此外，从诸如hESC之类的有限细胞类型中高水平地分化MSCs为研究和更好地理解MSC的分化过程和生物学提供了有用的模式，虽然其目前在临床和临床前有着广泛的应用，但其分化过程和生物学仍旧是一个谜。
由本方法所产生的间质干细胞的其它应用包括取代临床或治疗应用中的成体组织源性MSCs；替换用于作诸如人ESCs等其它细胞类型增殖、脐带血或骨髓干细胞群体扩增饲养层的成体组织源性MSCs；以及制备用于治疗心血管疾病的MSC合成培养基。
胚胎干细胞集落的消化
我们用于产生间质干细胞的方法包括把胚胎干细胞集落分散或消化成细胞。
胚胎干细胞集落可能包括huES9集落(Cowan CA，Klimanskaya I，McMahon J，Atienza J，Witmyer J，et al.(2004)Derivation of embryonicstem-cell lines from human blastocysts.N Engl J Med 350：1353-1356)或者H1 ESC集落(Thomson JA，Itskovitz-Eldor J，Shapiro SS，Waknitz MA，Swiergiel JJ，et al.(1998)Embryonic Stem Cell Lines Derived From HumanBlastocysts.Science 282：1145-1147)。
优选地，集落中的细胞被消化或分散至相当的程度，也就说至少成为细胞团。更优选地，集落被消化或分散成相当的程度即集落中的细胞是单个的，也就是说，该集落完全消化。
消化可以通过分散剂来实现。
分散剂可以是能够使集落中至少一些细胞相互之间分开的任何物质。该分散剂优选包括破坏集落中细胞间粘连，或者破坏细胞和基质之间粘连的试剂。优选地，该分散剂包括蛋白酶。
在优选实施方式中，该分散剂包括胰蛋白酶。胰蛋白酶消化可以例如在大约37℃下持续3min左右。随后在被接种之前对这些细胞进行中和、离心并重悬于培养基中。
在优选实施方式中，本方法包括用胰蛋白酶分散人胚胎干细胞的培养板并接种细胞(plating the cell out)。
消化包括至少下列步骤顺序中的一部分：抽吸、洗涤、胰蛋白酶消化，温育，移取，终止，重新接种并将试样等分。下列方法改编自HedrickLab，UC San Diego(http:\\hedricklab.ucsd.edu/Protocol/COSCell.html)。
在吸取过程中，把培养基从容器中抽吸或者一般是移取出来，例如烧瓶。在洗涤步骤中，用例如5-10ml体积的缓冲介质对细胞进行洗涤，优选不含Ca2+和Mg2+的介质。例如，这些细胞可以用不含钙和镁的PBS进行洗涤。在胰蛋白酶消化步骤中，往容器中添加一定量的分散剂，并摇动容器以使分散剂溶液覆盖生长的表面。例如，可以往烧瓶中添加1ml溶于Hank`s平衡盐溶液中的胰蛋白酶。
在温育步骤中，细胞在预定温度下保留一定时间。例如细胞可以在37℃下保留几分钟(例如2-5分钟)。在移取步骤中，细胞可以通过机械作用来移取，例如通过刮取或用手击打容器壁。这些细胞成片脱落并从表面上滑下来。
在终止步骤中，往烧瓶中加入一定体积的培养基。该培养基优选含有中和试剂以停止分散剂的作用。例如，如果分散剂为诸如胰蛋白酶之类的蛋白酶，那么培养基中就含有诸如血清蛋白之类的蛋白，其可以消除蛋白酶的活性。在特定实施例中，往烧瓶中添加了3ml含有细胞培养基的血清以补足4ml的体积。用吸管吸取这些细胞以便分开或分散这些细胞。
在再接种(re-sending)步骤中，细胞被接种到新鲜的培养皿中并添加新鲜培养基。大规模的接种可以以不同的比例进行。例如，细胞可以1/15和1/5的稀释度进行重新接种。在一个特定实施例中，细胞接种可以通过添加1滴细胞液到25cm2烧瓶中以及添加3滴细胞液到另一烧瓶中来实现从而接种培养物，并且随后往每个烧瓶，例如75cm2的烧瓶中添加7-8ml培养基以提供1/15和1/5的稀释度。在等分试样步骤中，细胞可以等份分入新的培养皿中或者以任何期望的比例分配，并添加培养基。
细胞培养物的维持
消化的细胞可以细胞培养物的形式接种并维持。
细胞可以接种在培养容器或诸如胶状板之类的基质上。非常重要地，细胞在不存在共培养物，例如没有饲养层细胞的情况下生长并增殖。
细胞培养物中的细胞在不含血清的培养基中生长，其中添加了一种或多种诸如成纤维生长因子2(FGF2)以及可选择的源自血小板的生长因子AB(PDGF AB)之类的生长因子，浓度为例如5ng/ml。如果通过胰蛋白酶消化、洗涤并再接种(replating)后细胞培养物中的细胞是融合性的，则细胞优选是分裂的或者是1∶4次培养的。
不存在共培养物
在高度优选的实施方式中，我们的方法包括在没有共培养物的情况下对细胞进行培养。词语“共培养物”是指两种或多种不同种类一起生长的细胞的混合物，例如基质饲养层细胞。
由此，在典型的ES细胞培养物中，培养皿内表面通常覆盖有鼠胚胎干细胞饲养层，其已经通过处理因而不会分裂。饲养层提供粘着表面以使ES细胞贴壁并生长。此外，饲养层细胞把营养因子释放到ES细胞生长所需的培养基质中。在本文所描述的方法和组分中，ES和MSC细胞在没有该共培养物的情况下进行培养。
优选地，细胞被培养成单层或在没有饲养层细胞的情况进行培养。根据本方法的优选实施方式，胚胎干细胞在没有饲养层细胞的情况下进行培养以便生长出间质干细胞(MSC)。
在优选实施方式中，分离或消化的胚胎干细胞被直接接种在培养基质上。该培养基质包括组织培养容器，流入Petri培养皿。该容器经过预处理的。在优选实施方式中，细胞被接种在胶状组织培养板上并在其上生长。
下面是制作明胶铺底的培养板的一个示例性方法。制备0.1％的凝胶蒸馏水溶液并高压灭菌。其可以在室温下保存。在组织培养皿的底部覆盖明胶溶液并温育5-15min。除去明胶，然后培养皿就可以使用了。培养基应当在加入细胞前添加以防止低渗溶解。
不含血清的培养基
分离或解决的胚胎干细胞在培养基中培养，该培养基优选是不含血清的培养基。
词语“不含血清的培养基”包括不含血清蛋白的细胞培养基，例如胎牛血清。不含血清的培养基是现有技术中已知的，并在例如美国专利5,631,159和5,661,034中作了公开。不含血清的培养基可以从例如Gibco-BRL(Invitrogen)处商业获得。
不含血清的培养基可以是不含蛋白的，其中没有蛋白，水解物以及未知其组成的成分。不含血清的培养基可以包括其中的所有成分都具有已知化学结构的化学合成培养基。不含血清的化学合成培养基是有利的，因为它提供了完全限定的系统，其排除了变量使重现性得以提高并具有更可靠的性能，而且减少了被外来试剂所污染的可能性。
在优选实施方式中，不含血清的培养基包括Knockout DMEM培养基(Invitrogen-Gibco，Grand Island，New York)。
不含血清的培养基中可以添加有一种或多种诸如血清替换培养基之类的成分，浓度例如为5％、10％、15％等。不含血清的培养基优选添加有10％的来自Invitrogen-Gibco(Grand Island，New York)的血清替换培养基。
生长因子
培养分开或消化胚胎干细胞的不含血清的培养基包括一种或多种生长因子。许多生长因子是已知的，包括PDGF，EGF，TGF-a，FGF，NGF，(促)红细胞生成素，TGF-b，IGF-I以及IGF-II.
在优选实施方式中，生长因子包括成纤维细胞生长因子2(FGF2)。该培养基也可以包括其它生长因子，例如源自血小板的生长因子AB(PDGF AB)。这些生长因子是现有技术中已知的。在高度优选的实施方式中，该方法包括在含有FGF2和PDGF AB这两种生长因子的培养基中培养细胞。
FGF2是广谱促有丝分裂、血管生成以及神经营养性的因子，其在多种组织和细胞类型中低浓度表达而在大脑及垂体中则可以达到高浓度。FGF2已经涉及到多种生理和病例过程，包括肢体发育，血管生成，伤口愈合以及肿瘤生长。FGF2可以商业获得，例如从Invitrogen-Gibco(GrandIsland，New York)。
源自血小板的生长因子(PDGF)是多种细胞类型的潜在促细胞分裂剂，包括成纤维细胞，平滑肌，结缔组织。PDGF，其由名为链A和链B两条链的二聚体构成，能以AA或BB同型二聚体或AB异型二聚体存在。人PDGF-AB是由13.3kDa的A链和12.2kDa的B链所组成的25.5kDa同型二聚体蛋白。PDGF AB可以商业获得，例如从Invitrogen-Gibco(Grand Island，New York)。
生长因子(多种生长因子)，优选FGF2以及可选择的PDGF AB，优选以约100pg/ml，约500pg/ml，约1ng/ml，约2ng/ml，约3ng/ml，约4ng/ml，最优选约5ng/ml的浓度存在于培养基中。该培养基也可以包括PDGFAB，优选浓度5ng/ml。
分裂细胞
培养物中的细胞一般会持续生长直到融合，此时接触抑制会导致细胞分裂和生长的停止。该细胞随即从基质或烧瓶中被分离出来，然后通过稀释到组织培养基中并移植的方式来“分裂”，次级培养或传代。
本文所描述的方法以及组合物因而可以包括传代，或在培养期间的分裂。优选地，细胞培养物中的细胞以1∶2或更大的比例，优选1∶3，或者更优选1∶4，1∶5或更大比例分裂。词语“传代”指包括取细胞系融合培养物试样，接种到新鲜培养基中，并培养细胞系直至得到融合或饱和。
选择，筛选或挑选步骤
在高度优选的实施方式中，本方法进一步包括选择或挑选步骤，以便进一步分离或选择间质干细胞。
选择或挑选步骤包括通过一种或多种表面抗原标记物的方式从细胞培养物中选择间质干细胞(MSC)。采用选择或挑选步骤进一步加强了特异性挑选或选择MSCs的严格性而且潜在地减少了源自初始材料的hESCs以及其它hESC胚胎干细胞可能的污染。这样随后还进一步减少了畸形瘤形成的风险以及进一步增加本文的方法的临床相关性。
许多基于抗原表达的选择或挑选方法是已知的，并且任何这些方法都可以用于本文的选择或挑选步骤。在特别优选的实施方式中，选择或挑选可以通过激发荧光的细胞挑选(FACS)方式来实现。这样，根据已有技术，FACS包括把细胞暴露在报告物质中，例如标记抗体，该标记抗体结合并标记由细胞所表达的抗原。生产抗体及对其进行标记以形成报告物质的方法是已知的，并在例如Harlow and Lane中有所描述。细胞然后通过FACS仪，它基于标记把细胞彼此挑选出来。
我们已经明白虽然已知有大量候选表面抗原与MSCs相关，例如CD105，CD73，ANPEP，ITGA4(CD49d)，PDGFRA，但某些MSC相关表面抗原例如CD29和CD49e在诸如hESCs之类的ES细胞中也有表达，并且它们的表达可通过FACs分析来证实。表面抗原与MSCs的相关性并不足以把该抗原定性为用来从诸如hESC之类的ES细胞中分离MSCs的选择性标记物。由此，选择或挑选步骤优选采用在MSCs和ES细胞之间区别性表达的抗原。
我们的方法中的选择或挑选步骤可以基于抗原的表达来阳性选择间质干细胞。该抗原可以通过例如实施例中所描述的hESCs和hESCMSCs基因表达谱的对比来识别。在特定实施方式中，所述选择或挑选可以特定地利用下表E1A和E1B中所示的任何抗原。
在优选实施方式中，我们的方法中的选择或挑选步骤可以基于确定在MSCs上表达而不在诸如hESCs中表达的ES细胞抗原的表达来阳性选择间质干细胞。
这样，按照实施例中所示，我们证实CD73在MSCs3中有高度表达，而在hESCs(图4A)上没有高度表达。此外，根据实施例证实CD73和CD105两者都是在MSCs中有高度表达的抗原并且属于与hESC相比在hESC-MSCs中表达量居前20位的高表达抗原(图3，表格)，使用CD73或CD105(或两者)作为推定MSCs的选择性标记物，在hESCs分化所产生的推定MSCs的挑选中是等效的。
可替换地，或者另外地，选择或挑选步骤可以否定性选择基于在诸如hESCs的胚胎干细胞(ES细胞)中高度表达而在例如hESC-MSC中没有高度表达的相反抗原。选择或挑选可以基于已知或先前确定的诸如MIBP、ITGB1BP3和PODXL22和CD24之类的hESC-特异性表面抗原。
实施例表明FACS分析证实CD24在hESC上有表达而在hESC-MSCs上不表达。因此，CD24可以单独用作否定性选择或挑选标记物，或者和阳性标记物CD105一起来挑选由hESC培养物分化而来的推定MSCs。
重要地，间质干细胞能够维持自身更新而无需转化。由此，例如，已知诸如与肿瘤细胞之类的无限生长分化的细胞或肿瘤细胞系融合之类的转化处理，用诸如SV40、EBV、HBV、或HTLV-1之类的转化病毒对细胞系进行病毒感染，用诸如含有大T抗原的SV40载体(R.D.Berry，Br.J.Cancer，57，287-289，1988)之类的特定合适载体所进行的转染，端粒酶(Bodnar-A-G et al，Science(1998)279；p349-52)或者含有人乳头瘤病毒DNA序列的载体(美国专利5,376,542)，显性致癌基因的引入，或者突变等等因而在本文所描述的制备间质干细胞的方法中都是不需要的。
在优选实施方式中，间质干细胞和细胞系(或源自其的分化细胞)不会展示出一种或多种胚胎干细胞的特征。优选这些特征包括表达OCT4基因以及碱性磷酸酶活性。优选地，间质干细胞表现出一种或多种多能性特征性标记物表达的减少。这些多能性标记物在下面有进一步的描述，仅包括Nanog，BMP4，FGF5，Oct4，Sox-2以及Utf1。
由本文所述方法制备的间质干细胞优选是非肿瘤基因的。优选地，如果该间质干细胞被植入免疫损伤或免疫缺陷宿主动物，相比于导致肿瘤形成的亲代胚胎干细胞，其不会导致肿瘤形成。优选地，免疫损伤或免疫缺陷宿主动物是SCID鼠或Rag1-/-鼠。优选地，在接种延长期之后间质干细胞不会形成肿瘤，优选大于两周，更优选大于两月，最优选大于9个月。具体的致肿瘤测试方法描述于实施例中。
本方法制备的间质干细胞也优选展示一种或多种下列特性。优选在细胞培养基中维持至少10代时，它们具有基本稳定的染色体组型，这通过染色体数来评估。它们也优选表现出基本稳定的代与代之间的基因表达模式。我们通过此所表达的意思是在这一代间质干细胞和下一代干细胞之间所选一组基因中的一段或多段，优选基本上所有基因的表达水平都不会发生明显变化。
优选地，基因组包括下列基因中的一个或多个，亚群，或全部：cerberus(基因库登录号：NM_009887，AF031896，AF035579)，FABP(基因库登录号：NM_007980，M65034，AY523818，AY523819)，Foxa2(基因库登录号：NM_010446，X74937，L10409)，Gata-1(基因库登录号：NM_008089，X15763，BC052653)，Gata-4(G基因库登录号：NM_008092，AF179424，U85046，M98339，AB075549)，Hesx1(基因库登录号：NM_010420，X80040，U40720，AK082831)，HNF4a(基因库登录号：NM_008261，D29015，BC039220)，c-kit(基因库登录号：NM_021099，Y00864，AY536430，BC075716，AK047010，BC026713，BC052457，AK046795)，PDGFRα(NM_011058，M57683，M84607，BC053036)，Oct4(基因库登录号：NM_013633，X52437，M34381，BC068268)，Runx1(基因库登录号：NM_009821，D26532，BC069929，AK051758)，Sox17(基因库登录号：NMJ)11441，D49474，L29085，AK004781)，Sox2(基因库登录号：NM_011443，U31967，AB 108673)，Brachyuiy(NM_009309，X51683)，TDGF1(基因库登录号：NM_011562，M87321)and Tie-2(基因库登录号：NM_013690，X67553，X71426，D13738，BC050824)。本文所述方法既能够产生分化细胞也可产生间质干细胞，其包括间质干细胞的克隆后代。词语细胞的“克隆后代”是指基本不经任何转化处理或基因替换的细胞后代。不经实质性基因改变的克隆后代与亲代细胞或祖细胞，优选胚胎干细胞(保留减弱的潜能)的基因基本相同。词语“间质干细胞”也应当优选包括源自间质干细胞的细胞系，即间质干细胞系，反之亦然。
祖细胞的获得
在优选实施方式中，本文所述方法进一步采取了选择或筛选间质干细胞的步骤。
该进一步的步骤可以发生在上述步骤之前，在该两步骤之间或在这些步骤之后。该进一步的步骤实际上可以是独立发生的，并特异性地分化一种或多种来自ES细胞的祖细胞或细胞系。
我们因而公开了一种分化间质干细胞的替换方法。该方法包括：(a)提供胚胎干细胞(ES)；并(b)建立来自胚胎干细胞的祖细胞系；其中祖细胞系是基于自我更新的能力来选择的。
然而，优选的，这几种方法可以一起采用。由此，例如，我们的方法包括在分散步骤或增殖步骤之前，期间，或之后从胚胎干细胞中分化祖细胞或祖细胞系。这样，该方法例如可以包括通过提供由分散胚胎干细胞集落所获得的细胞或者其子代细胞的方法来获取间质干细胞(MSC)，从胚胎干细胞中分化一种或多种祖细胞或祖细胞系并在没有共培养物的情况下在不含血清但含FGF2的培养基中增殖细胞。
优选地，基于其自我更新的能力来选择祖细胞系，或者该方法可以基于缺乏自我更新能力，或者同时采用上述两种方法来选择排除体细胞。
在优选实施方式中，在没有共培养物的情况下，优选在没有饲养层细胞的情况下，构建祖细胞系。优选地，在没有共培养物的情况下选择排除胚胎干细胞。
在优选实施方式中，构建祖细胞系而不进行转化。该祖细胞系可以通过把胚胎干细胞或其子代细胞暴露在可以促进推定的祖细胞自我更新的条件下构建。优选地，促进自我更新的条件阻碍胚胎干细胞的增殖。
促进自我更新的条件可以包括在丰富培养基中进行生长。更优选地，促进自我更新的条件包括在没有LIF的情况下生长细胞。优选地，促进自我更新的条件包括连续传代过程。优选地，自我更新的条件包括至少12次连续传代。
在优选实施方式中，祖细胞系相对于胚胎干细胞具有减小的潜力。优选地，祖细胞系是谱系限制的，优选非多能性的。优选地，祖细胞系是不会致肿瘤形成的。
优选地，分化祖细胞系的步骤包括把胚胎干细胞暴露在加强分化成特定谱系的条件中。优选地，加强分化的条件包括从胚胎干细胞中产生胚胎。优选地，在多能性消失后把细胞从加强分化的条件中移离。
优选地，从谱系限制性促进条件中移除细胞包括消化类胚体。优选，该方法包括消化已经生长了约3-6天之间的类胚体。
在优选实施方式中，祖细胞系表现出减弱表达或基本不表达OCT4和碱性磷酸酶活性两者中的一者或两者。
优选地，祖细胞系相对于其所来源的胚胎干细胞系表现出多功能性标记物的减弱表达，多功能性标记物优选从下列组中选择：Nanog，BMP4，FGF5，Oct4，Sox-2和Utf1。
在优选实施方式中，祖细胞系表现出一种多种下列特性：(a)可以在细胞培养物中维持大于40代；(b)在细胞培养物中维持至少10代时具有基本稳定染色体组型或染色体数目；(c)代与代之间具有基本稳定的基因组型。
优选地，祖细胞系在移植到受体动物中时基本不诱导畸形瘤的形成，受体动物优选免疫损伤受体动物，优选3周以后，更优选2-9个月之后。
优选地，胚胎干细胞或祖细胞系是哺乳动物，优选鼠或人胚胎干细胞或祖细胞系。
优选地，祖细胞系包括内皮细胞祖细胞系，优选E-RoSH细胞系。可替换地，或另外地，祖细胞系可以包括间质祖细胞干细胞，优选huES9.E1细胞系。
在一些实施方式中，该方法进一步包括步骤(d)从祖细胞系中获取分化细胞。
优选地，在分化之前祖细胞系增殖至少5代。
我们提供从胚胎干细胞(ES)中生成分化细胞，该方法包括：(a)从胚胎干细胞中获取祖细胞系；(b)增殖祖细胞系；以及(c)从祖细胞系中获取分化的细胞。
提供了一种方法，其包括：(a)提供胚胎干细胞(ES)；(b)从胚胎干细胞中获取祖细胞；以及(c)从祖细胞中构建祖细胞系，其中基于其自我更新的能力选择祖细胞。
该方法特定地用于从胚胎干细胞(ES)中产生分化细胞。优选地，分化的细胞是内皮细胞或间质细胞。更优选地，分化的细胞是脂肪细胞或骨细胞。
我们提供由根据本发明任何前述方面的方法所产生的祖细胞系。
本为所描述的方法和组成也可以进一步包括其它步骤，其中采用该MSCs的其它因素或特性来进行选择或筛选或者既选择又筛选。
定向分化
在优选实施方式中，产生源自胚胎干细胞并具有特定谱系的祖细胞系的方法优选进一步包括第一步骤，即使得胚胎干细胞定向地向特定期望的谱系或感兴趣的谱系分化。本发明的方法也可以包括第二步骤，即促进推定祖细胞的自我更新以及阻碍胚胎干细胞的增殖。
第一个步骤可以包括促进感兴趣的特定细胞系的生长或增殖。不同的感兴趣的特定细胞系的祖细胞系可以通过把细胞暴露在促进那样感兴趣的细胞系发生分化环境中来制得。例如，可以把胚胎干细胞暴露在诸如促进或启动分化的生长因子或小分子中。
由此，本文所描述的用于构建源自胚胎干细胞的具有特定谱系的细胞系优选包括加强胚胎干细胞向特定细胞系分化的步骤。优选地，在预定时期内实行该加强分化的步骤。因而，优选地，胚胎干细胞或它们的子代细胞过渡性地暴露在加强分化的环境中。
加强或定向分化的方法的选择决定于感兴趣的特定细胞系，感兴趣的细胞系是为了制备期望的祖细胞。本领域技术人员可以意识到不同的细胞可使用各种不同的方法。
内胚层祖细胞
在期望胚胎干细胞向内胚层组织定向分化的地方，例如，形成类胚体并消化(见后文)。该消化的类胚体可以暴露在诱导内胚层分化的生长因子或药物及其组合物中。该生长因子和药物的例子包括激活素A，FGF4，地塞米松以及维甲酸。
造血祖细胞和内皮祖细胞
另一方面，在期望胚胎干细胞向造血细胞系或内皮细胞系定向分化的地方，消化类胚体可以暴露在诱导造血细胞或内皮细胞分化的生长因子或药及其组合物中。这类生长因子和药物包括GM-CSF，G-CSF，SCF，PDGF，IL-3，(促)红细胞生成素，TNFa以及雷帕霉素。
心脏中胚层祖细胞以及成肌祖细胞
另一方面，在期望胚胎干细胞向心脏中胚层细胞系以及成肌细胞系定向分化的地方，消化的类胚体可以暴露在可以诱导心脏中胚层细胞以及成肌细胞分化的生长因子或药物及其组合物中组合物中。这类生长因子和药物的例子包括地塞米松，PPARγ抑制剂以及睾丸激素及其类似物。
第二步骤包括把分化细胞接种在丰富培养基中。在该实施方式中，连续增殖可以选择性地富集随即就可以克隆的祖细胞。
类胚体的形成
在一些实施方式中，加强分化的步骤包括从胚胎干细胞形成类胚体。类胚体，及其制备方法是已知的。词语“类胚体”是指由悬浮液中胚胎干细胞生长所产生的培养物中的球状克隆体。类胚体是混合细胞类型的，并且特定细胞类型的分布和出现时间与在胚胎中所观测到的一样。优选地，类胚体是通过把胚胎干细胞接种到半固体培养基中产生的，优选在Lim et al，Blood.1997；90：1291-1299中所描述的甲基纤维素培养基。优选地，该类胚体的年龄在3-6天之间。
在该实施方式中，类胚体是消化的，也就是把组成细胞相互分离开，例如通过胶原酶或胰蛋白酶消化，以便从谱系限制性促进环境中移离出来。
优选实施方式中的方法包括选择用于分化期望特定谱系的推定祖细胞的步骤。该选择步骤可以基于细胞形态，或通过标记物的表达等方式来实施。基因表达谱或抗原表达谱也可以用于选择特定期望谱系的祖细胞。随后对该用于期望特定谱系的推定祖细胞进行培养，或者之后立即实施其它选择步骤。
在优选实施方式中，在加强分化的步骤之后把分化细胞暴露在促进自我更新的推定祖细胞并阻碍胚胎干细胞增殖的环境中。该环境可以优选包括在没有共培养物或饲养层细胞的环境中进行培养。
丰富培养基
可替换地，或者另外地，该环境包括接种到培养基中。本文所用的词语“丰富培养基”是指营养丰富的培养基。优选地，该培养基包括相关细胞生长所必需的营养物。优选地，该丰富培养基含有血清。更优选地，其包括基本上所有的该生长所必需的营养物。最优选地，该丰富培养基支持、促进和有阻于相关细胞的生长。在高度优选的实施方式中，相关细胞是感兴趣的祖细胞或推定祖细胞。丰富培养基的例子是含有4500mg/l D-葡萄糖并添加有20％胎牛血清、非必需氨基酸、L谷氨酸以及β-巯基乙醇的DMEM。
在优选实施方式中，该丰富培养基不包括其它促进或有助于胚胎干细胞生长的生长调节剂或激素，例如白血病抑制因子(LIF)
根据该实施方式，持续的增殖可以选择性富集随后能够被克隆的祖细胞。
在培养基中长期维持
优选地，本文所述方法包括培养胚胎干细胞或它们的子代细胞超过一代。优选地，培养细胞大于5，大于10，大于15，大于20，大于25，大于50，大于40，大于45，大于50，大于100，大于200，大于500或者大于800代。特别地，细胞系可以维持1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，20，25，30，35，40，45，50，75，100，200，500或更多代。
培养物中的细胞一般会持续生长直到融合，此时接触抑制会导致细胞分裂和生长的停止。该细胞随后从基质或烧瓶中被分离出来，以及通过稀释到组织培养基中并重新接种的方式进行“分裂”或传代。祖细胞由此可以在培养期间被传代或分裂；优选它们以1∶2或更大的比例，优选1∶3，更优选1∶4，1∶5或更大比例。词语“传代”指包括获取细胞系的融合培养物，接种到新鲜培养基中，并培养细胞系直至实现融合或饱和。
然而基于它们自我更新的能力，根据本方法所得的祖细胞可以维持许多代。另一方面，已经明确直接源自生物体的“正常”(也就是未转化的体细胞)细胞是无限生长分化的。用另外的话说，该体细胞在培养物(它们是无限生长分化的)中具有有限的寿命。它们不会无限连续生长，而是在一定次数的传代后最终会失去增殖或分裂的能力。在达到“急变期”该细胞在约50代后死亡。由此，该体细胞仅可以有限次的传代。
重要地，祖细胞能够维持自我更新而无需转化。由此，例如，已知诸如与肿瘤细胞之类的无限生长分化的细胞或肿瘤细胞系融合，用诸如SV40、EBV、HBV、或HTLV-1之类的转化病毒对细胞系进行病毒感染，用诸如含有大T抗原的SV40载体(R.D.Berry，Br.J.Cancer，57，287-289，1988)之类的特定合适载体所进行的转染，端粒酶(Bodnar-A-G et al，Science(1998)279；p349-52)或者含有人乳头瘤病毒DNA序列的载体(美国专利5,376,542)，显性致癌基因的引入，或者突变之类的转化处理因而在本文所描述的制备间质干细胞的方法中都是不需要的。
根据本文所述方法的优选实施方式，祖细胞可以在不用转化的情况下增殖超过50代。在优选实施方式中，作为祖细胞系和祖细胞可以不受限制地增殖而无需转化。祖细胞和祖细胞系相对于它们的亲代胚胎干细胞优选是谱系限制性的。特殊地，它们不能形成所有3个胚层。在高度优选的实施方式中，原始细胞系优选是非多能性的。
祖细胞的特性
在优选实施方式中，祖细胞和细胞系(或源自它们的分化细胞)不会展示出一种或多种胚胎干细胞的特性。优选这些特征包括表达OCT4基因以及碱性磷酸酶活性。优选地，祖细胞表现出一种或多种多能性特征性标记物表达的减少。这些多能性标记物在下面有进一步的描述，仅包括Nanog，BMP4，FGF5，Oct4，Sox-2以及Utf1。
用本文所述方法制备的祖细胞优选是非致肿瘤发生的。优选地，相对于会导致肿瘤发生的亲代胚胎干细胞的接种，祖细胞在被接种到免疫损伤或免疫缺陷宿主动物中时不会导致形成肿瘤。优选地，免疫损伤或免疫缺陷宿主动物时SCID鼠或Rag1-/-鼠。优选地，祖细胞在接种延长期中不会形成肿瘤，优选地大于2周，更优选大于2个月，最优选大于9个月。具体的致肿瘤发生的测试方法描述于实施例中。
通过本文所述方法制备的祖细胞也优选表现出一种或者多种下列特性。优选在细胞培养物中维持至少10代时，它们具有基本稳定的染色体组型，其通过染色体数目来评估。它们也优选表现出基本稳定的代与代之间的基因表达模式。我们通过此所表达的意思是在这一代间质干细胞和下一代干细胞之间所选一组基因中的一段或多段，优选基本上所有基因的表达水平都不会发生明显变化。
优选地，基因组包括下列基因中的一个或多个，亚组，或全部：cerberus(基因库登录号：NM_009887，AF031896，AF035579)，FABP(基因库登录号：NM_007980，M65034，AY523818，AY523819)，Foxa2(基因库登录号：NM_010446，X74937，L10409)，Gata-1(基因库登录号：NM_008089，X15763，BC052653)，Gata-4(基因库登录号：NM_008092，AF179424，U85046，M98339，AB075549)，Hesx1(基因库登录号：NM_010420，X80040，U40720，AK082831)，HNF4a(基因库登录号：NM_008261，D29015，BC039220)，c-kit(基因库登录号：NM_021099，Y00864，AY536430，BC075716，AK047010，BC026713，BC052457，AK046795)，PDGFRα(NM_011058，M57683，M84607，BC053036)，Oct4(基因库登录号：NM_013633，X52437，M34381，BC068268)，Runx1(基因库登录号：NM_009821，D26532，BC069929，AK051758)，Sox17(基因库登录号：NM_011441，D49474，L29085，AK004781)，Sox2(基因库登录号：NM_011443，U31967，AB108673)，Brachyury(NM_009309，X51683)，TDGF1(基因库登录号：NM_011562，M87321)and Tie-2(基因库登录号：NM_003690，X67553，X71426，D13738，BC050824)。
本文所述方法使祖细胞和祖细胞系的生产和分化的细胞一样成为可能，其包括祖细胞的克隆子代。词语细胞的“克隆子代”是指基本不经任何转化处理或基因替换的细胞的子代。该没有经历实质性基因组改变的克隆子代与亲代细胞，或祖细胞，优选胚胎干细胞(保留减弱的潜能)的基因基本相同。词语“祖细胞”也优选包括源自祖细胞的细胞系，也就是亲代细胞系，反之亦然。
自我更新和分化的调节剂
本发明的方法也用于识别推定自我更新或分化的调节剂。该方法包括实施描述用来存在或不存在候选分子的条件下产生祖细胞系或分化细胞，并识别该分子的存在对过程是否有影响的方法。例如，加速祖细胞或分化细胞产生的分子可以被用作分化过程的阳性调节剂(或者可替换地作为自我更新的抑制剂)。相反地，妨碍该过程的分子可以被认为是分化的抑制剂或自我更新促进剂。
在优选实施方式中，我们也提供所选细胞系的细胞，优选祖细胞，其可根据本方法获得。迄今为止，祖细胞的制备对于要确定是否任何所选细胞都是祖细胞而言是过于复杂的。采用根据本发明中能够提供基本100％纯祖细胞配制品的培养物，可以实现单个祖细胞的分离。
我们在优选实施方式中进一步提供包括大量细胞的组合物，其中主要细胞是所选谱系的祖细胞。优选地，至少60％的细胞是所选谱系的祖细胞。更优选地，至少60％的细胞是祖细胞。此外，本发明提供分离的祖细胞。词语细胞系优选指能够在培养物中维持并生长且表现出无限生长分化或无限寿命的细胞。
本文所述方法可以和降低mTOR活性相组合以促进分化，这公开于US60/609,216中，其以参考的方式结合在本文中。
祖细胞的使用
本发明的方法能够产生各种类型的祖细胞和细胞系。
例如，我们公开了制备外周血祖细胞(PBPC)、神经祖细胞、造血祖细胞、骨髓祖细胞、骨髓成体细胞，骨骼肌祖细胞、胰岛祖细胞、间叶细胞祖细胞、心脏中胚层干细胞、肺上皮祖细胞、肝脏祖细胞，以及内胚层祖细胞的方法。
根据本文所述方法所制备的祖细胞可以用于各种商业的重要研究，诊断，以及治疗目的。这些用法总体上是本领域所公知的，因而仅在本文中作大概描述。
例如，干细胞可用于为再生性治疗而制备祖细胞群。祖细胞可以通过体外扩增的方法来制备或直接施用给患者。它们也可以用于外伤造成的损毁组织的再生。
由此，造血祖细胞可用于骨髓更换，而心脏祖细胞则可用于心脏衰竭的患者。皮肤祖细胞可用于培育患者移植用皮肤，而内皮祖细胞可用于诸如支架或人造心脏之类的人工修复术的内皮化。
胚胎干细胞和组织干细胞衍生物可用作治疗诸如糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病等用的祖细胞的来源。干细胞，例如可以用作癌症免疫疗法所用NK或枝状细胞的祖细胞的来源，祖细胞可通过本文所述方法或组合物来制备。
确信的是本文所述方法和组合物使祖细胞的生产成为可能，其当然可以采用现有技术中的已知方法来进行分化。由此，任何分化细胞的使用都等同于伴随着那些用作细胞来源的祖细胞。
本方法所制备的祖细胞和本文的组合物可以用于疾病的治疗，或用于制备治疗疾病的药物组合物。该疾病可以包括可通过再生性疗法进行治疗的疾病，包括心力衰竭，骨髓疾病，皮肤疾病，烧伤，糖尿病、阿尔茨海默病病、帕金森病等退行性疾病以及癌症。
我们因此描述了疾病治疗方法，包括：(a)提供胚胎干细胞(ES)；(b)从胚胎干细胞构建祖细胞，祖细胞干细胞基于其自我更新的能力从胚胎干细胞中得以选择；(c)可选择地从祖细胞干细胞系中获取分化细胞；以及(d)把祖细胞系或分化细胞施用于病人。
所获得的MSCs的特性
通过本文所述方法和组成所得的MSCs优选满足通常用于识别MSCs9的形态、显性和功能标准，这是现有技术中已知的。为了便于引用，由本文所述方法和组成所获得的间质干细胞，特别是源自人胚胎干细胞的，可以是指“hESC-MSC s”。
由此，通过本文所述方法和组合所得的MSCs可以优选表现出一种或多种间质干细胞的形态学特性。例如，所获得的MSCs可以形成具有成纤维表型的粘着单层。
进一步地，所得的MSCs优选表现出与间质干细胞类似或相同的表面抗原表达谱。由此，所得的MSCs的表面抗原表达谱可以包括CD29+、Cd44+、CD49a以及e+、CD105+、CD166+以及CD34-、CD45-9-11中的一种或多种，优选所有。
利用现有技术中的已知方法和下面的方法，可以把所获得的MSCs化成任何间叶细胞系。由此，通过本文的方法和组合所获得的MSCs表现出包括成脂肪、成软骨和成骨分化潜能。
所述获得的间质干细胞，例如，hESC-MSCs，在体内具有基本的增殖能力。在一些实施方式中，所得的间质干细胞经过至少10个群体倍增的同时维持正常的双倍体染色体组型。优选地，然而，MSCs能够经历至少20-30个群体倍增的，同时维持维持正常的双倍体染色体组型。在优选实施方式中，在整个这段时间中MSCs表现出稳定的基因表达和表面抗原表达谱。
优选地，所得的MSCs不会表现出任何缺陷，例如基因表达中的染色体畸变和/或改变。在优选实施方式中，该缺陷是不明显的直到10代以后，优选13代，更优选15代以后。
HESC-MSC基因组
实施例描述了用来分析源自MSCs(hESC-MSCs)的人ESC基因组的实验。
根据实施例7-15所示，hESC-MSCs具有和源自成体骨髓的MSCs(BM-MSCs)类似的表达谱。这些结果表明用我们的方法所得的MSCs和源自它们骨髓的类似物具有明显的生物学类似性，例如，在分泌旁分泌因子方面。由此，hESC-MSCs可以用于BM-MSCs所适用的任何目的。
我们进一步提供了通过hESC-MSCs培养物所合成的培养基。该合成培养基包含hESC-MSCs分泌的分子，包括201个独特的基因产物。该合成培养基和包括其中的任何分子的组合，特别地包括蛋白质或多肽，可以用于增加或替换hESC-MSCs的活性，其目的在于例如治疗或防止疾病。
hESC-MSCs的基因组分析显示所表达的蛋白参与了3种生物学过程：代谢，防御响应以及组织分化，包括血管形成、造血细胞生成以及骨骼成长。由此，hESC-MSCs可以用于治疗这些功能在其中发挥一定作用的疾病，或者对其所进行的修复或治疗，包括任何一种或多种这些生物学过程。类似地，hESC-MSCs所表达的蛋白，单个或组合，优选以合成培养基的形式，被用于补充或代替hESC-MSCs的活性，其目的在于例如治疗或防止这类疾病。
hESC-MSCs的201种基因产物显示于激活心脏血管生物学、骨骼成长以及造血细胞形成中重要信号途径，例如Jak-STAT、MAPK、Toll样受体、TGF-beta信号和mTOR信号途径。因此，hESC-MSCs及其所表达蛋白等，可以用于防止或治疗涉及任何这些信号途径的或者其病因涉及一种或多种这些信号途径缺陷的疾病。
进一步地，任何一种或多种由所述MSCs所分泌的蛋白，包括以合成培养基的形式，可用于与所述BM-MSCs所针对的相同目的。
HESC-MSCs也可以用作任何由它所分泌或表达的蛋白的来源，这列于实施例10-14中，尤其是在本文的列表中。我们因而提供了在任何实施例10-14中所示的产生多肽的方法，该方法包括按照获取所述间质干细胞，培养间质干细胞并从间质干细胞中分离多肽，优选从间质干细胞所生长的培养基中分离。
同源性
在优选实施方式中，由所述方法产生的间质干细胞本质上是类似或相同的(优选是同源的)。这也就是说，用该方法所分离的间质干细胞(MSC)集落相互之间表现出高度类似或一致性，无论是在表型或是其它方面。
相似性或一致性可通过多种方法来测定并通过一种或多种特性来测量。在优选实施方式中，集落在基因表达上是相似或相同的。优选地，该方法是一种通过其所选择的任何两种或多种间质干细胞表现出基本相同或相似的基因表达谱的方法，也就是说，所表达基因的一致性和其表达水平的组合。优选地，基本上所有分离的间质干细胞都表现出基本相同或相似的基因表达谱。
基因表达的同源性可以用多种方法来测量。优选地，全基因组基因的表达是通过例如实施例的抽提RNA的阵列杂交来实施的。可以抽提总RNA并转化成cDNA，其和含有来自相关基因组的大量基因序列的芯片杂交。优选地，该阵列包括NCBI参考序列(RdefSeq)基因，其为经生物技术信息国家中心工作者与合作者基于现行标准确认、注释并治愈的特征基因。
随后采用分析软件对样品之间的基因表达进行对比。在优选实施方式中，基因表的相似性和一致性被表示成“相关系数”。在该测量中，两种样品之间的高相关系数表示两种样品之间的基因表达模式的高度相似性。相反地，两种样品之间的低相关系数表示两种样品之间基因表达模式的的相似性。标准化的实施可以在数据分析之前消除系统误差或偏差(包括密度偏差、空间偏差、板偏差以及背景偏差)。
相关性测试是现有技术中已知的并包括T检验和Pearson`s检验，这在例如Hill，T.& Lewicki，P.(2006).Statistics：Methods and Applications.Statsoft，Tulsa，OK，ISBN：1884233587(同样是Statsoft，Inc.(2006)。ElectronicStatistics Textbook.Tulsa，OK：Statsoft.WEB：
http://www.statsoft.com/textbook/stathome.html)。可以参考Khojastehet al，2005，A stepwise framework for the normalization of array CGH data，BMC Bioinformatics 2005，6：274.An Intra-class correlation coefficient(ICC)也可以实施，这描述于Khojasteh etal，supra中。
在优选实施方式中，进行Pearson`s检验以生成Pearson`s相关系数。相关系数1.0表示相同的基因表达类型。
在优选实施方式中，cDNA被杂交到Sentrix HumanRaf-8表达珠芯片(Expression BeadChip)上并用Illumina Beadstation 500x扫描。优选地，抽提数据，标准化并采用Illumina BeadStudio(Illumina，Inc，SanDiego，CA，USA)进行分析。然而读者容易明白任何合适的芯片和扫描硬件和软件(其输出相关性测量值)可以用于分析基因表达谱的相似性。
优选地，任何两种优选通过上述方式所测得的分离物基因表达相关系数大于0.65，优选大于0.85，更优选大于0.90，最优选大于0.95。
在一些实施方式中，所述方法产生的间质干细胞是这样的，所获取任何两种或多种间质干细胞分离物之间的基因表达相关系数与相同RNA样品的技术性复制子之间的相关系数相同或略小一点，其中技术性复制在相隔一段时期后实施，例如相隔1个月。在另一个实施方式中，任何两种或多种间质干细胞分离物之间的相关系数大于0.9，优选大于0.95。
优选地，对于经历上述选择或挑选程序的细胞而言，基因表达相关系数在这样的范围内。优选地，主要分离物之间的基因表达相关系数，优选所有分离物，落在这样的范围内。
由此，根据实施例所示，相关系数显示所获的5种间质干细胞之间具有高度相似性，其中4种细胞系之间的相关系数为0.96，其中1种为0.9；相对地，在相隔一个月时间所进行分析的RNA样品技术性复制子之间的相关系数在0.97和0.98之间。
因此，我们提供了产生相互之间基本类似或相同的(优选同源的)间质干细胞。分离物优选表现出几乎相同的基因表达谱。
和上述“内”同质性(也就是用所述方法获得的MSCs分离物之间的同质性)一样，这些分离物和其它细胞或细胞类型中间的同质性也可以被评估。特别地，与用其它方法获得的间质干细胞进行了比较，例如来自骨髓的间质干细胞(BM-MSCs)。在优选实施方式中，用本方法所得的MSCs与组合显示出与BM-MSC类似的，或同源，或者一致的基因表达谱。由此，所获得的MSCs显示出比BM-MSCs的基因表达相关系数大于0.5，优选大于0.6，优选大于0.7。
由此，按照实施例所示，可以发现3种独立获取的hESC-MSC群和3种单独的BM-MSC样品具有类似的相关系数0.72。
间质干细胞形成的调节剂
我们的方法也可用于识别推定的从胚胎干细胞中形成间质干细胞的调节剂。该方法包括在存在或不存在候选分子的情况下实施所述用于产生间质干细胞的方法，以及识别该分子的存在对该过程是否产生影响。例如，加速间质干细胞繁殖的分子可用作间质干细胞形成的阳性调节剂。相反地，阻碍该过程的分子可被认为是间质干细胞形成的抑制剂。
在优选实施方式中，我们也提供了根据该方法所能获得的细胞，优选间质干细胞。迄今为止，间质干细胞的制备既复杂，表型又基本不相似或相同(例如，关于基因表达)，还因为它们用包括共培养或存在血清的方法来生产因而不适用于临床目的。利用根据本发明的培养物，其可以提供几乎100％纯种的间质干细胞制剂，它们相互之间是类似的或相同的(优选同源的)。
此外，我们描述了分化细胞的生产过程，该方法包括通过所述方法获取间质干细胞，并分化成间质干细胞。例如，我们提供分化成脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞等细胞的方法。我们进一步提供可用该方法获得的分化的细胞。也提供用该间质干细胞和分化的细胞所制备的细胞系。词语细胞系优选指能够在培养物种维持并生长并表现出无限生长分化或永生的细胞。
本文所述方法可以和mTOR活性的降低相组合以促进分化，这公开于US60/609,216中，其以参考的方式结合在本文中。
应用
本文所述方法和组合可用于上调细胞间叶细胞样或内皮标记物的表达。它们也可以或者替代地用于下调干细胞或细胞多能性的表达。本文所述方法和组合可以用于识别能够促进或阻碍干细胞自我更新或分化的试剂。该方法包括在存在候选分子的情况下实施根据任何前述权利要求的方法，并在其后确定效果。
本方法所述方法和组合也生产祖细胞系或分化的细胞，其可用于疾病的治疗，或用于制备治疗疾病的药物组合物，该疾病包括下述任何一种：可通过再生性疗法进行治疗的疾病、心力衰竭、骨髓疾病、皮肤病、烧伤、诸如糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病等退行性疾病以及癌症。
根据本文所述方法制备的间质干细胞和分化的细胞可以用于各种商业性重要研究、诊断以及治疗目的。这些应用一般都是现有技术所公知的，仅在此作大概描述。
例如，干细胞可以用于产生再生性治疗目的间质干细胞和分化的细胞群。间质干细胞和分化的细胞可以通过体外扩增的方法来制备或者直接给患者施用。他们也可以用于外伤损毁组织的再生。
由此，脂肪细胞或脂肪可以从此可用于软骨修复而骨细胞则可用于骨头的修复。用本文所述方法和组合所获得的间质干细胞可以分化成这些类型并用于的目的。
胚胎干细胞及其组织干细胞衍生物可用作用于治疗例如糖尿病阿尔茨海默病、帕金森病等退行性疾病的间质干细胞和分化细胞的来源。干细胞，例如可用作分化成癌症免疫性治疗用的NK或枝状细胞的间质干细胞和分化细胞的来源，间质干细胞和分化的细胞可以用本文所述方法和组合来制备。
可以确定本文所述方法和组合使生产间质干细胞成为可能，采用现有技术中已知的方法必然可以对所述间质细胞进行分化。由此，分化细胞的任何应用都同样适用于那些用作分化细胞来源的间质干细胞。
本文所述方法和组合所生成的间质干细胞和分化的细胞可以用于疾病的治疗，或用于制备治疗疾病的药物组合物，该疾病包括下述任何一种：可通过再生性疗法进行治疗的疾病、心力衰竭、骨髓疾病、皮肤病、烧伤、诸如糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病等退行性疾病以及癌症。
我们因此描述了治疗疾病的方法包括：(a)提供胚胎干细胞(ES)；(b)由胚胎干细胞来构建间质干细胞系，其中该间质干细胞通过分散胚胎干细胞(ES)集落，或其子代细胞来获得，并在没有共培养物的情况下在不含血清而含有FGF2的培养基种增殖细胞；(d)可选地，从间质干细胞系中获取分化的细胞；以及(e)给患者施用间质干细胞系或分化的细胞。该培养基可选地含有PDGF AB。
我们的方法一般可用于上调细胞的间叶细胞样或内皮标记物。选择性地，或者额外地，它们可以用于下调干细胞或细胞多能性标记的表达。
我们进一步提供根据前述发明任何方面的用于生成治疗或制备治疗下述一种疾病的药物的祖细胞系或分化细胞的方法：可用再生性疗法治疗的疾病、心力衰竭、骨髓疾病、皮肤病、烧伤、诸如糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病等退行性疾病以及癌症。
我们也提供了用根据本发明前述方面的方法所生成的分化细胞。
分化细胞
分化细胞，例如终末分化的细胞，可用从根据所述方法制备的间质干细胞或细胞系中获取。我们因此公开了用于生成分化细胞的方法，该方法包括生成所述间质干细胞或细胞系，并从这些细胞中获取分化的细胞。用本文所述方法制备的间质干细胞可以分化成任何这些细胞类型或用于所述目的。
根据本发明的方法制备的分化细胞可以包括任何或所有下列细胞：
i)脂肪细胞：功能性脂肪或脂肪组织细胞类型，其发现于整个身体中，尤其在皮肤下面。脂肪细胞为调节能量、热量以及缓冲机械冲击而储存和合成脂肪。
ii)心肌细胞：心脏的功能性肌细胞类型，其允许连续而有节律的跳动。
iii)软骨细胞：为关节、耳道、气管、会厌软骨、喉、椎骨和肋骨末端之间的椎间盘制造软骨的功能性细胞类型。
iv)成纤维细胞：体内大多数组织中所发现的连接或支持细胞。成纤维细胞提供了有意的支持平台以帮助特定组织的功能性细胞正确地工作。
v)肝细胞：消除代谢废物毒素、破坏血红细胞并回收它们的组成成分以及用于血浆蛋白的合成的功能性细胞类型。
vi)造血细胞：造血的功能性细胞。造血细胞发现于成体骨髓。在胎儿中，在肝脏、脾、骨髓以及在子宫中围绕胎儿的支持组织中发现造血细胞。
vii)肌细胞：肌肉功能性细胞类型。
viii)神经细胞：专用于传导冲动的大脑功能性细胞类型。
ix)成骨细胞：负责制造骨骼的功能性细胞类型。
x)胰岛细胞：胰腺的功能性细胞，其负责分泌胰岛素、胰高血糖素、促胃液素以及生长激素抑制因子。同时，这些分子调节包括碳水化合物的代谢、血糖水平以及向胃中分泌酸液等多种过程。
间质干细胞以及分化细胞的应用
根据本文所述的方法制备的祖细胞系及分化细胞和本文所述组合物可用于各种重要的商业研究、诊断以及治疗目的。
例如，为分化的细胞群可用于制备分化表型特异性的抗体和cDNA文库。培养、纯化及修饰抗体的一般技术和它们在免疫检测中的用途以及免疫分离方法在Handbook of Experimental Immunology(Weir &Blackwell，eds.)；Current Protocols in Immunology(Coligan et al，eds.)；andMethods of Immunological Analysis(Masseyeff et al.，eds.，Weinheim：VCHVerlags GmbH)中公开了。而涉及mRNA和cDNA文库制备的一般技术则在RNA Methodologies：A Laboratory Guide for Isolation andCharacterization(R.E.Farrell，Academic Press，1998)；cDNA LibraryProtocols(Cowell & Austin，eds.，Humana Press)；and Functional Genomics(Hunt & Livesey，eds.，2000)中公开了。相对的同源细胞群特别适用于药物筛选和治疗性应用。
祖细胞系和分化细胞的这些及其它应用在下文以及本文的其它部分中作了进一步描述。祖细胞系和分化细胞可特定的用于制备治疗疾病的药物组合物。这类疾病包括可通过再生性疗法进行治疗的疾病，包括心力衰竭、骨髓疾病、皮肤病、烧伤、诸如糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森疾病等退行性疾病以及癌症。
如实施例所示，通过本文所述方法以及组合物所制得的间质干细胞具有与骨髓源性间质细胞(BM-MSCs)类似或相同的性质。因此，间质干细胞及其任何分化细胞都可以用于BM-MSCs的已知应用中，或者用于可能用到它们的地方。
药物筛选
根据本文所述方法制得的祖细胞系和分化细胞和本文所述组合物也可以用于筛选因子(例如溶剂、小分子药物、肽、多聚核苷酸等等)或影响分化细胞特征的环境条件(例如培养条件或操作)。
在某些应用中，祖细胞系和分化细胞被用于筛选促进成熟或促进这类细胞在长期培养中表达及维持的因子。例如，候选成熟因子或生长因子可通过把它们添加到处于不同孔中的祖细胞或分化细胞中，然后根据进行进一步培养所期望的标准来确定任何所导致的表型变化并利用这些细胞。
进一步地，祖细胞系和分化细胞的基因表达谱可用于识别在这些细胞中特异性或高表达的受体、转录因子及信号分子。特异性配体、受体的小分子抑制剂或激动剂、翻译因子以及信号分子都可以用于调节祖细胞系和分化细胞的分化和性质。
特定的筛选应用涉及药物研究中药物化合物的测试。读物一般是指标准教科书“In vitro Methods in Pharmaceutical Research”，AcademicPress，1997以及美国专利5030015)，以及本文其它地方关于药物筛选的一般性描述。候选药物化合物的评估通常包括把分化细胞和候选化合物混合在一起，确定由该化合物所导致的细胞形态学、标记物表型或代谢活性改变(与未经处理或与经无效化合物处理的细胞进行对比)，然后把化合物作用与所观测到的改变相关联。
进行筛选可以是因为，例如该化合物被设计成具有对特定细胞类型由药理作用，或者是因为被设计成具有其它作用的化合物可能具有意想不到的副作用。两种或更多种药物可以组合起来进行检测(通过同时或依次的方式来进行组合)以便检测可能的药物和药物之间的相互作用。在某些应用中，化合物最初被筛选是因为其潜在毒性(Castell et al.，pp.375-410“In vitro Methods in Pharmaceutical Research”，AcademicPress，1997)。对细胞毒性的检测首先可以通过细胞生活力、生存力、形态学已经特定标记物、受体或酶的表达或释放。药物对染色体DNA的作用能够通过测量DNA合成或修复的方法来进行检测。[3H]胸腺嘧啶或BrdU结合物，尤其在细胞循环中不定期的，或高于细胞复制所需水平，与药效一致。副作用也可能包括非正常速率的姊妹染色单体交换，其通过杂交分裂相(metaphase spread)来进行测定。读物可参考A.Vickers(PP375-410“In vitro Methods in Pharmaceutical Research”Academic Press，1997)以获取更详尽的描述。
组织再生
根据本文所述方法和组合所获得的间质干细胞和分化细胞也可以用于需要进行该治疗的人类患者的组织重构或再生。细胞以被允许移植到企望组织点的方式进行使用并重构或再生功能缺陷区域。
例如，本文所述方法和组合物可以用于调节干细胞的分化。祖细胞系及分化的细胞可用于组织工程，例如皮肤移植的生长。干细胞分化的调节可用于人工器官或组织的生物工程化，或用于修复学，例如支架。
癌症
根据本文所述方法获得的祖细胞系及分化细胞和本文所述的组合物可以用于癌症的治疗。
词语“癌症”和“癌症”是指或描述哺乳动物中以不受调节的细胞生长为典型特征的生理状态。癌的例子包括但不限于恶瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤以及白血病。
这类癌的更特殊的例子包括鳞片状细胞癌、小细胞肺癌、肺小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌、诸如成胶质细胞瘤和神经纤维瘤病之类的胶质细胞肿瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、涎腺癌、肾癌(kidney cancer)、肾癌(renal cancer)、前列腺癌、外阴肿瘤、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)以及各种类型的头部和颈部癌。其它例子为固定的肿瘤癌症，包括结肠癌、乳腺癌、肺癌，以及前列腺癌、包括白血病和淋巴瘤的恶性血液病、Hodgkin`s病、再生障碍性贫血、皮肤癌及类似的腺瘤息肉病。其它例子还包括脑瘤、直肠瘤、乳腺肿瘤、子宫颈瘤、眼肿瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、前列腺瘤、皮肤瘤、睾丸肿瘤、赘生物、骨肿瘤、滋养层肿瘤、输卵管肿瘤、直肠瘤、结肠肿瘤、肾脏肿瘤、胃部肿瘤以及甲状旁腺肿瘤。乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、直肠癌、肺癌、恶性黑色素瘤、白血病、淋巴癌、卵巢癌、宫颈癌以及胆道癌也包括在内。
根据本文所述方法和组合所获得的间质干细胞及分化细胞也可用于和抗癌药物的组合，例如内皮抑素和血管抑制素或者细胞毒性药物或化疗药物。例如，诸如阿霉素、柔毛霉素、顺铂、足叶乙甙、紫杉醇、泰索帝及生物碱。例如长春新碱、诸如甲氨蝶呤之类的抗代谢物。此处所用的词语“细胞毒性药物”是指抑制或防止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该词语试图包括放射性同位素(例如I、Y、Pr)、化疗药物、以及诸如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒剂或其片段之类的毒素。
同样地，该词语包括肿瘤基因产物/酪氨酸激酶抑制剂，例如WO94/22867中公开的双环安沙霉素类(bicyclic ansamycins)、EP600832中公开的1，2-bis(arylamino)benzoic acid衍生物、EP600831中公开的6，7-diamino-phthalazin-1-one衍生物、或者是抑制酪氨酸与含SH2基质蛋白的肽(例如参见WO94/07913)。“化疗药物”是用于治疗癌症的化合物。化疗药物的例子包括阿霉素(adriamycin)、多比柔星(Doxorubicin)、5-氟脲嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C)、环磷酰胺、噻替派、白消安、细胞毒素、紫杉醇、甲氨蝶呤、顺铂、美法仑、长春碱、争光霉素、足叶乙甙、VP-16、长春瑞滨、卡铂、替尼泊、柔红霉素、洋红霉素、氨甲喋呤、放线菌素、丝裂霉素、烟酰胺、埃斯培拉霉素(参见美国专利4,675,187)、美法仑以及其它相关氮芥以及内分泌治疗(例如二乙基己烯雌酚(DES))、三苯氧胺、LHRH拮抗剂、黄体酮、抗黄体酮等等)。
干细胞
如本文中所使用的，词语“干细胞”是指一种细胞面临两种分化选择：子代细胞与种细胞相同(自我更新)或者它们可以是更特殊细胞类型的祖细胞(分化)。因此干细胞能够适应一种或其它途径(其它途径存在于能够形成每种细胞类型中的一种的地方)。干细胞因此是非终末分化且能够产生其它细胞类型的细胞。
本文所指的干细胞可以包括全能干细胞、亚全能干细胞、以及多能干细胞。
全能干细胞
词语“全能”细胞是指具有变成成体组织中任何细胞类型或者变成胚外膜(例如胎盘)的细胞。由此。受精卵和由其分裂所产生的大约前4代细胞是仅有的全能细胞。
亚全能干细胞
“亚全能干细胞”是真正的干细胞，其具有产生任何体内分化细胞的潜能。然而，它们并不能有助于产生源自滋养层的胚外膜。已经发现了几种类型的亚全能细胞。
胚胎干细胞
胚胎干细胞(ES)可以从胚胞的内细胞群(ICM)中分离而得，胚泡为移植发生时胚胎发育的阶段。
胚胎生殖细胞
胚胎生殖细胞(EG)可以从流产胎儿性腺前体中分离而来。
胚胎癌细胞
胚胎癌细胞(EC)可以从畸形恶瘤中分离得到，畸形恶瘤时偶然发生于胎儿性腺的肿瘤。与前两种不同，它们通常是异倍体。所有这三种类型的亚全能干细胞仅能从胚胎或胎儿组织中分离得到并在培养基中培养生长。防止这些亚全能细胞进行分化的方法是现有技术中已知的。成体干细胞
成体干细胞包含各种类型，其包括神经、皮肤以及血形成干细胞，这些干细胞是骨髓移植中的活性活性成分。这些后面的几种干细胞类型也是源自脐带干细胞的主要部分。虽然细胞类型的精确数目受到所选干细胞类型的限制，但是成体干细胞可以在实验室或体内发育成熟并形成功能性的、更特定的细胞类型。
多能干细胞
多能干细胞是真正的干细胞，但其仅能分化成有限种细胞类型。例如，骨髓就含有分化成所有血细胞但无法分化成其它细胞类型的多能干细胞。多能干细胞发现于成体动物中。可以认为体内每个器官(脑、肝)都含有它们，在其中它们能够替换死亡或受损细胞。
表征干细胞的方法是现有技术中已知的，其包括采用诸如克隆分析、流式细胞分析、长期培养以及分子生物学技术，例如PCR、RT-PCR及印迹杂交法(Southern blotting)等标准分析方法。
除了形态学区别，人和鼠科动物的亚全能干细胞在它们的细胞表面抗原(干细胞标记物)表达上有所不同。识别包括阶段特异性胚胎抗原1和4(SSEA-1和SSEA-4)及肿瘤排斥抗原1-60及1-81(TRA-1-60、TRA-1-81)在内的干细胞标记物抗体可以通过商业方式获取，例如从Chemicon International，Inc(Temecua，CA，USA)。这些抗原的利用单克隆抗体的免疫检测法已经广泛地用于表征亚全能干细胞(Shamblott M.J.et.al.(1998)PNAS 95：13726-13731；Schuldiner M.et al.(2000).PNAS97：11307-11312；Thomson J.A.et.al.(1998).Science 282：1145-1147；ReubinoffB.E.et.A1(2000).Nature Biotechnology18：399-404；Henderson J.K.et al.(2002).Stem cells 20：329-337 Pera M.et.al.(2000).J.Cell Science 113：5-10)。
干细胞来源
各种类型的干细胞，其可以包括下列非限制性例子，可以用于本文所述用于生长祖细胞、祖细胞系及分化细胞的方法与组合物中。
美国专利5,851,832报道了从脑组织中获取的多能神经干细胞。美国专利5,766,948报道了从新生脑半球中获取的神经原。美国专利5,654,183和5,849,553报道了哺乳动物神经嵴干细胞的用途。美国专利6,040,180报道了以体外方式从哺乳动物多能CNS干细胞中产生分化神经细胞。WO98/50526和WO99/01159报道了神经神经上皮干细胞、少突胶质细胞-星形胶质细胞前体、以及细胞系限制性神经细胞前体的产生和分离。美国专利5,968,829报道了从胚胎前脑中获取并在含有葡萄糖、转铁蛋白、胰岛素、硒、黄体酮及几种其它生长因子的培养基中培养的神经干细胞。
肝原代细胞能够从通过合适胶原酶和透明质酸酶的组合所进行的灌注法从人活检组织或手术切除组织中获取。可替换地，EP0953633A1报道了通过制备切碎人肝脏组织、在生长培养液中重悬浓缩的组织细胞并在培养基中扩增细胞从而分离肝脏细胞。该生长培养液含有葡萄糖、胰岛素、转铁蛋白、T3、FCS以及各种允许肝细胞在不发生恶性转化的情况下进行生长的组织抽提物。肝脏中的细胞被认为含有特定的细胞，包括薄壁组织细胞、Kuffer细胞、窦状小管上皮细胞、以及胆管上皮细胞、也包括具有分化成成熟肝细胞或胆管上皮细胞能力的前体细胞(指“肝母细胞”或“卵细胞”)(L.E.Rogler，Am.J.Pathol.150：591，1997；M.Alison，Current Opin.Cell Biol.10：710，1998；Lazaro et al.，Cancer res.58：514，1998).
美国专利5,192,553报道了用于分离人新生或胎儿造血干细胞或祖细胞。美国专利5,716,827报道了作为Thyl-1阳性祖细胞的人造血细胞，并在体外合适的生长培养基中再生它们。美国专利5,635,387报道了用于培养人造血细胞及其前体细胞的方法和装置。美国专利6,015,554描述了重新构建人淋巴和枝状细胞的方法。
美国专利5,486,359报道了能够分化成多于一种结缔组织细胞的人间质干细胞的同源种群，例如骨头、软骨、肌腱、韧带以及真皮等。它们从骨髓或骨膜中获得。也报道了用于增殖间质干细胞的培养基。WO99/01145报道了从经诸如G-CSF或GM-CSF之类的生长因子处理的个体的外周血中分离到的人间质干细胞。WO00/53795报道了成脂肪干细胞及(lattices)，其中基本不含脂肪细胞和红细胞。据报道这些细胞能够进行增殖并培养以产生激素及合成培养基。
可以使用任何脊椎动物物种的干细胞。和非人灵长类动物、家畜、牲畜以及其它诸如啮齿动物、小鼠、大鼠等非人哺乳动物一样，来自人类的干细胞包括在内。
来自妊娠期之后所形成的组织的灵长类亚全能干细胞(pPS)属于适用于本发明的干细胞，例如妊娠期间的任何时候所中取得的胚囊或新生或胚胎组织。非限制性实施例是胚胎干细胞的初级培养物或所构建的细胞系。
培养基和饲养层细胞
用于分离并增殖亚全能细胞的培养基可能有任何几种不同的配方，只要所获得的细胞具有期望的特征，并能够被进一步增殖。
合适的来源如下所述：Dulbecco′s modified Eagles medium(DMEM)，Gibco#1 1965-092；Knockout Dulbecco′s modified Eagles medium(KODMEM)，Gibco#10829-018；200mM L-谷氨酸，Gibco#15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050；β-巯基乙醇，Sigma#M7522；人重组碱性成纤维生长因子(bFGF)，Gibco#13256-029。示例性含血清胚胎干细胞(ES)培养基由80％的DMEM(典型的KO DMEM)、20％的不会热失活的特级胎牛血清(FBS)、0.1mM非必需氨基酸、1mM L-谷氨酸、以及0.1mM的β-巯基乙醇组成。该培养基经过过滤并在4℃下保存不超过2周。不含血清的胚胎干细胞(ES)培养基用80％的KO DEME、20％的血清替代物、0.1mM非必需氨基酸、1mM L-谷氨酸以及0.1mMβ-巯基乙醇组成。有效的血清替代物是Gibco#10828-028。培养基是经过并在4℃下保存不超过2周。在使用之前，人bFGF被加到终浓度为4ng/mL(Bodnar etal.，Geron Corp，国际专利公开文本WO99/20741)。
在优选实施方式中，培养基包括Knockout DMEM培养基(Invitrogen-Gibco，Grand Island，New York)，其中添加10％血清替换物培养基(Invitrogen-Gibco，Grand Island，New York)，5ng/mlFGF2(Invitrogen-Gibco Grand Island，New York)以及5ng/ml PDGFAB(Peprotech，Rocky Hill，New Jersey)。
饲养层细胞(在用到之处)在mEF培养基中增殖，其含有90％DMEM(Gibco#11965-092)，10％FBS(Hyclone#30071-03)，以及2mM谷氨酸。MEFs在T150烧瓶(Coming#430825)，隔一天用胰岛素以1∶2的比例传代(分裂细胞，保持细胞的次融合状态。为了制备饲养层细胞，细胞在一定剂量下进行照射以已知分化但允许支持人间质干细胞的重要因子的合成(约4000rads的γ射线)。6孔培养板(例如Falcon#304)在37℃下通过温育的方法用每孔1ml 0.5％明胶包被过夜，并以每孔375000个经照射的mEFs进行培养。饲养层细胞一般在种植后使用5小时-4天。就在接种pPS细胞之前采用新鲜人胚胎干细胞(hES)培养基来替换该培养基。
用于培养其它干细胞的条件是已知的，并能够根据细胞类型进行合适地优化。用于特定细胞类型的培养基和培养技术是指在前述部分所引用文献中所提供的内容。
胚胎干细胞
胚胎干细胞可以从灵长类物种成员的胚细胞中分离而得(Thomson etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：7844，1995)。人胚胎干细胞(hES)可以通过Thomson et al(美国专利5,843,780；Science 282：1145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38：133 ff.，1998)所描述的技术从人胚囊细胞中制备而得。
大概地，从人体外预先移植的胚胎中获取人胚细胞。可选择地，可以采用体外受精(IVF)的晶胚，或者一个人晶胚细胞可以在G1.2和G2.2培养基(Gardner et al.，Fertil.Steril.69：84，1998)中发育至胚囊阶段。发育的晶胚被选择用于胚胎干细胞的分离。通过简短地暴露在链霉蛋白酶(Sigma)中来移除Zona pellucida。该内细胞群可以通过免疫手术的方法来分离，其中晶胚暴露在1∶50稀释的兔抗人脾细胞抗血清中30min，然后在DMEM中洗涤3次，每次5min，并在1∶5稀释的Guinea pigcomplement(Gibco)暴露3min(参见Solter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA72：5099，1975)。在DMEM中作两次进一步洗涤后，水解的滋养外胚层细胞通过轻轻地吸取而从完整的内细胞群(ICM)中除去，并且该ICM被接种在mEF饲养层上。
在9-15天后，自内细胞群的产物既可以通过暴露在具有1mM EDTA的不含钙和镁的磷酸盐缓冲液(PBS)中，通过暴露在分散酶或胰岛素中，也可以通过采用移液管的机械分离法而从细胞团中分离出来。分离的细胞被重新接种在新鲜的胚胎干细胞(ES)培养基的mEF饲养层上，并观察集落的形成。集落显示未分化的形态通过移液管单独选择，机械地分离成细胞团，并重新接种。胚胎干细胞样的形态具有如下特征即明显高的细胞核-细胞质比例以及显眼的核仁。所获得的胚胎干细胞随后通过胰蛋白酶作用，暴露在IV型胶原酶(约200U/mL；Gibco)或通过采用移液管单独选择集落的方法每隔1-2周进行常规地split。优选细胞团的大小为50-100个细胞。
胚胎生殖细胞
人胚胎生殖(hEG)细胞可以从在最后一次经期之后约8-11周时所获取的人胎儿物质中所存在的原生殖细胞中制备得到。合适的制备方法公开于Shamblott et al.，ProcNatl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998以及美国专利6,090,622中。
简要地，用等渗缓冲液清洗生殖脊，然后放入0.1mL0.05％胰蛋白酶/053mM EDTA钠溶液(BTL)中并分成＜1mm3的块(chunks)。随后用100/ul移液管对该组织进行移液以便进一步消化细胞。37℃下孵育5min，然后加入约3.5mL EG生长培养基。EG生长培养基为DMEM、4500mg/LD-葡萄糖、2200mg/L mM重碳酸钠；15％胚胎干细胞(ES)优等胎牛血清(BRL)；2mM谷氨酸(BRL)；1mM丙酮酸钠；1000-2000U/mL人重组白血病抑制因子(LIF，genzyme)；1-2ng/ml人重组碱性成纤维生长因子(bFGF，genzyme)；以及10uM佛司可林(溶于10％DMSO中)。在替换方式中，采用透明质酸酶/胶原酶/DNAse来分离EG细胞。解剖用胎儿材料(fetal material)获取生殖腺原基或具有肠系膜(meseteries)的生殖脊，生殖脊在PBS中洗涤，随后被放入0.1mL HCD消化溶液中(0.01V型透明质酸酶，0.002％DNAse I，0.1％IV型胶原酶，它们全部都来自Sigma并在EG生长培养基中制备。把组织切碎并在37℃下孵育1h或过夜，在1-3mL的Eg生长培养基中重悬，并饲养层上进行培养。
把亚融合饲养层细胞铺在96孔组织培养板上，该融合饲养层细胞在不含LIF、bFGF或佛司可林的经处理的EG生长培养基中培养3天，用5000rad的射线钝化。合适的饲养层为STO细胞(ATCC登录号.CRL1503)。往细胞中加入0.2mL初生生殖细胞(PGC)悬浮液。7-10天后在EG生长培养基中进行首次传代，把每个孔转入24孔培养皿的一个孔中，该培养皿事先铺有经辐射处理的STO鼠纤维原细胞。该细胞在培养基每天一换的条件下培养直至观察到细胞形态与EG细胞相同为止，一般在7-30或1-4次传代以后。
自我更新和分化
自我更新
自我更新的干细胞可以通过该技术领域中各种已知的方法进行识别，例如，形态学、免疫组织化学、分子生物学等等。
该干细胞优选表现出Oct4和/或SSEA-1表达升高。优选地，任何Flk-1、Tie-2以及c-kit中的一种或多种表达降低。自我更新的干细胞优选表现出相对于无法自我更新的细胞而言具有缩短的细胞周期。
例如，在标准二维显微图像的中，人胚胎干细胞表现出在该图像平面上的核/质比，显著的核仁以及形成具有少数无法识别的细胞连接的致密型集落。细胞系能够用标准G-banding技术(在许多提供常规染色体分类服务的临床诊断实验室中都可获得，例如Cytogenetics Lab atOakland Calif)，进行染色体分类并与公开的人染色体作对比。
人胚胎干细胞和人胚胎生殖细胞也可以通过细胞标记物的表达来表征。总体上，在本文中所讨论的组织特异性标记物可以采用合适的免疫学技术来检测，例如用于膜结合标志物的流式细胞术、用于胞内标记物的免疫组织化学和用于分泌到培养基中的标记物的酶联免疫法。蛋白标记物的表达也可以通过使用特异性标记引物的逆转录酶-PCR在mRNA水平上进行检测。进一步的细节参见美国专利5843780。
阶段特异性的胚胎抗原(SSEA)是特定胚胎细胞类型的特征。SSEA标记物的抗体可以从Development Studies Hybridoma Bank(Betheda Md.)获得。其它有用的标记物可以采用标明Tra-1-60和Tra-1-81的抗体(Andrews et al.，Cell Linesfrom Human Gern Cell Tumors，in E.J.Robertson，1987，supra)来检测。人胚胎干细胞一般是SSEA-1阴性而SSEA-4阳性的。HEG细胞一般是SSEA-1阳性的。PPS细胞的体外分化导致SSEA-4、Tra-1-60以及Tra-1-81表达的消失而SSEA-1.pPS细胞的表达也能够通过碱性磷酸酶活性的出现来进行表征，其可以按照厂商(Vector Laboratories，Burlingame Calif)的描述，通过用4％的多聚甲醛来固定细胞，并随即用Vector Red作为基质进行增殖。
胚胎干细胞一般也是端粒酶阳性的以及OCT-4阳性的。端粒酶活性可以利用TRAP活性分析来确定(Kim et al.，Science 266：2011，1997)，采用可商业获得的试剂盒(TRAPeze.RTM.XK Telomerase Detection Kit，Cat.S7707；Intergen Co.，Purchase N.Y.；或TeloTAGGG.TM.TelomerasePCR ELISA plus，Cat.201389；Roche Diagnostics.Indianapolis)。hTERT的表达也能用RT-PCR造mRNA水平上来评估。LightCycler TeloTAGGG.TM.hTERT定量试剂盒(Cat.3012344；Roche Diagnostics)可以为了研究目的而商业获得。
分化
分化中的细胞，包括间质干细胞以及从中所分化而得的已分化细胞。优选表现出强化的4E-BP1和/或S6K1的去磷酸化过程。它们优选表现出Oct4和/或SSEA-1的升高表达。优选地，FlK-1、Tie-2以及c-kit中任何一种或多种表达升高。优选地，Brachyury、AFP、nestinl中任何一种或多种表达以及nurr表达升高。自我更新的干细胞优选表现出相对于无法自我更新的细胞具有更长的细胞周期。
分化中的干细胞，也就是开始或进入分化途径的细胞，能够根据多种表型标准来进行表征，包括特殊的转录改变。该标准包括但不限于形态学特点的表征、细胞标记物表达和酶活性的检测和定量、基因表达以及细胞体外功能性特征的确定。总体上，分化干细胞会具有一种或多种细胞类型特点，该特点是分化过程的终产物，即分化的细胞。例如，如果目标细胞类型是肌细胞，处于向该细胞分化过程中的干细胞会例如具有肌球蛋白表达的特点。
在多个方面，由此，标准依赖于分化干细胞的结局，并且下文对各种细胞类型的作了总体描述。
分化或分化中神经细胞的感兴趣的标志物包括β-微管蛋白EIII或神经丝，神经细胞的特征；胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，存在于星形细胞中；半乳糖脑苷脂酶(GaIC)或髓磷脂碱性蛋白(MBP)；少突细胞的特征；OCT-4，未分化人胚胎干细胞的特征；nestin，神经前体的特征以及其它细胞。A2B5和NCAM各自为神经胶质细胞的祖细胞以及神经祖细胞的特征。细胞也能够用来检测特征性生物活性物质的分泌。例如，分泌GABA的神经细胞能够通过谷氨酸脱羧酶或GABA的产生而得以识别。多巴胺能神经细胞能通过多巴脱羧酶、多巴胺或酪氨酸水解酶的产生而得以识别。
用于分化或分化中的肝细胞的感兴趣的标记物包括α-胎蛋白(肝脏祖细胞)；白蛋白、α1-抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、细胞色素p450活性、转铁蛋白、脱唾液酸糖蛋白受体以及糖原仓库(肝细胞)；CK7、CK9以及γ-谷氨酰转移酶(胆囊上皮细胞)。已经报道肝细胞分化过程需要转录因子BNF-4α(Li et al.，Genes Dev.14：646，2000)。依赖于HNF-4α表达的标记物包括α1-抗胰蛋白酶、α-胎蛋白、载脂蛋白E(apoE)、葡萄糖激酶、胰岛素生长因子1和2、IGF-1受体、胰岛素受体以及烟酸。HNF-4表达依赖的标记物包括白蛋白、载脂蛋白AI(apoAI)、载脂蛋白AII(apoAII)、载脂蛋白B(apoB)、载脂蛋白CIII(apoCIII)、载脂蛋白CII(apoCII)、醛缩酶B、苯基丙氨酸羟化酶、L-型脂肪酸结合蛋白、转铁蛋白、视黄醇结合蛋白以及(促)红细胞生成素(EPO)。
源自pPS细胞的混合细胞群体中的细胞类型源自pPS细胞能够通过特征性形态以及它们所表达的标记物而得以识别。对于骨骼肌而言为：myoD、肌细胞生成素以及myf-5。对于内皮细胞而言为：PECAM(血小板内皮细胞粘附分子)、Flk-1、tie-i、tie-2、血管内皮(VE)钙粘素、MECA-32以及MEC14.7。对于平滑肌细胞而言为：特定的肌球蛋白重链以及ANF。对于胰腺细胞而言为：pdx和胰岛素分泌。对于造血细胞及其祖细胞而言：GATA-1、CD34、AC133、β-major球蛋白以及β-major球蛋白样基因PH1。
列于本文中或是本领域已知的特定的组织特异性标记物能够通过免疫学技术来检测，例如用于表面标记物的流式免疫细胞化学、用于细胞内或细胞表面标记物的免疫组织化学(例如，固定的细胞或组织部分)、细胞抽提物的免疫印迹(Western blot)分析，以及酶联免疫检测，其用于细胞抽提物或分泌到培养基中的产物。组织特异性基因产物的表达也能够利用Northern blot分析、dot-blot杂交分析或者利用在标准扩增方法中采取了序列特异性引物的逆转录酶起始聚合酶链式反应(RT-PCT)在mRNA水平上对其进行分析。本文所列的特定标记物序列数据能够从公共数据库中获得，例如基因库(URL：www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez)。
实施例
实施例1.方法
hESC-MSC的获取(间质干细胞)
按照之前的描述6，7扩增Hues9和H1 hESCs。
为了分化hESCs，在6cm板上铺满培养的hESCs在37℃下用胰蛋白酶消化3min，中和，离心，并在Knockout DMEM培养基中重悬(Invitrogen-Gibco，Grand Island，New York)，往明胶覆盖的10cm板中添加10％的血清替换培养基(Invitrogen-Gibco，Grand Island，New york)、5ng/ml FGF2(Invitrogen-Gibco，Grand Island，New york)以及5ng/mlPDGF AB(Peprotech，Rocky Hill，New Jersey)。当细胞融合时用胰蛋白酶进行处理并1∶4split。
HESCs经胰蛋白酶消化一周后实施CD105+和CD24-的挑选。分化的hESCs用胰蛋白酶消化3min，中和，离心，在培养基中重悬并随后置于细菌培养皿中。2小时之后置于37℃的CO2培养箱中，收获细胞，用PBS洗涤并在室温下与CD24-PE与CD105-FITC(PharMingen，San Diego，California)一起温育90min。
细胞随后用PBS进行洗涤并采用FACS Diva软件(BD BiosciencesPharmingen，San Diego，CA)在FACS Aria上进行挑选。按照前述那样内容26制备BM MSCs。细胞在添加有青霉素-链霉素-谷氨酸、非必需氨基酸基10％胎牛血清(Invitrogen Gibco，Grand Island，New York)的DMEM中进行培养。
按照前述那样3实施向脂肪细胞、软骨细胞以及骨细胞的分化。采用标准技术实行油红、阿利新蓝和von Kossa染色。利用羊抗骨胶原a1 II型抗体和连接有HRP的驴抗羊IgG抗体(Santa Cruz，Santa Cruz，California)在多聚甲醛固定的石蜡包埋切片上进行胶原II型的免疫反应。
染色体分类
细胞在Petri培养皿中达到80％的融合。用秋水仙酰胺对细胞进行处理以抑制有丝分裂并通过标准低渗处理法收获细胞，再用甲醇∶醋酸(3∶1)固定化。采用标准空气干燥法制备切片并与SKY paint probe(ASI)进行杂交。根据厂商所提供并在我们的实验室中建立的操作规程实施杂交后冲洗。每份培养物中有20-30个中期细胞。每份培养物染色体组型代表了＞80％的中期细胞。
迁移研究
2×106个细胞在4个小时后按照前述27那样被重悬于30ul的生理盐水中并移植到肾薄膜下，老鼠被解剖并取出肾脏，固定在4％的多聚甲醛中，用石蜡包埋，4uM切片并用H&E染色。
Western Blot分析
使用标准方法28。简要地，细胞在RIPA缓冲液中裂解并在4℃下14,000rpm离心15min。使20ug上清液变性，在10SDS-聚酰胺凝胶中分离，电转移至硝酸纤维素膜上，并且膜依次与一抗、随后与HRP结合的二抗进行温育，或者随后与生物素结合的二抗进行温育并加入neutroavidin-HRP，最后加入HRP加强的化学发光底物，ECS(PierceRockford，IL)。
所用一抗为1∶200稀释的OCT4抗体、SOX-2抗体或β-肌动蛋白抗体(Santa Cruz Biotechnology，CA)，二抗为HRP连接的羊抗兔、兔抗羊或兔抗鼠抗体。
PCR
按照前述那样实施用于检测鼠和人特异性重复序列的基因组PCR。用于检测鼠和人特异性重复序列的基因组PCR。通过利用大容量cDNAArchive试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)对1ug总RNA进行逆转录从而实施实时RT-PCR。cDNA在水中稀释10倍并用Taqman引物(Applied Biosystems，Foster City，CA)扩增40个循环。
表面抗原分析
利用FACS对hESC-MSCs细胞表面抗原进行分析。该细胞用胰蛋白酶消化5min，离心，在培养基中重悬并在置于37℃，含5％CO2的培养箱中的细菌培养皿中培养2-3小时。采用FACS对hESC-MSCs细胞表面抗原和hESCs进行分析。
细胞用胰蛋白酶消化1min，离心，PBS洗涤，室温下在4％多聚甲醛中固定0.5h，洗涤并在2％FCS中室温下封闭0.5h，同时进行搅拌。1.5×105个细胞随后与下列各种连接的单克隆抗体室温下温育90min：CD24-PE、CD29-PE、CD44-FITC，CD49a-PE、CD49e-PE、CD105-FITC、CD166-PE、CD34-FITC、CD45-FITC(PharMingen，San Diego，CA)。
温育后，清洗细胞并在PBS中重悬。通过把等量的细胞试样与同种型匹配的鼠单克隆抗体(PharMingen，San Diego，CA)温育来确定非特异性荧光。通过收集利用了WinMDI软件Cyan LX仪(Dako NorthAmerica，Inc.，Carpinteria，CA)上的20000个来对数据进行分析。通过把等量的细胞试样与同种型匹配的鼠单克隆抗体(PharMingen，SanDiego，CA)，或单独与二抗进行温育从而确定非特异性荧光。
Illumina基因芯片分析
利用Illumina RNA扩增试剂盒(Ambion，Inc.，Austin，TX)并根据厂商说明书，把分别来自初级BM和成脂肪MSCs的3份样品的总RNA(2ug)，来自HuES9.E1、EuES9.E3、HuES9.E1的两份生物复制品的RNA(2ug)和来自3份未分化的hESC细胞系H1、Hes3和HuES9的总RNA(2ug)转换成生物素化cRNA。
利用Rneasy试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化样品。根据IlluminaBeadStation 500x手册实施与Sentrix HumanRef-8 Expression BeadChip(Illumina，Inc.，Austin，TX)的杂交，清洗以及扫描。利用厂商所提供的Illumina BeadStudio抽提数据，标准化并分析。99％置信度下低于检测限(LOD)的转录信号被当作不表达的(not expressed)基因而排除。
实施例2.从人ES细胞系中产生MSC培养物
如果用蛋白酶分散hESC集落并且随后在不存在饲养层的情况下在铺有明胶的培养板上传代，并且在不含血清并添加血清替换培养介质，FGF2以及可选地PDGF AB的培养基中两周内长起彼此类似或相同的纤维原细胞。
培养物具有类似于BM-MSCs(附图1A)的成纤维细胞形态。用胶原酶分散hESC的方法在生产这些纤维原样细胞中是无效的。
两种单克隆培养物，huES9.E1和huES9.E3，独立地从huES9ESC细胞系分化而来，而第三中单克隆培养物，H1.E2则从H1ESC细胞系中产生。几种亚全能相关基因的表达一般是减少了，例如，HESX1、POUFL5、SOX-2、UTF-1以及ZFP42的转录水平比其在hESCs中的水平要低于超过101-5倍(＞101-5)(附图1B)。OCT4、NANOG以及SOX2的蛋白水平也减少了(图1C)。以huES9.E1为代表，这些细胞都没有可检测到的碱性磷酸酶活性(图1D)。
与其亲代HuES9不同，1×106个HuES9.E1细胞在被移植至免疫损伤SCID鼠肾包膜中的4个月观测期中都没有诱导形成畸形瘤(图1E)。为了评估这些细胞被鼠饲养层细胞8污染或融合的可能性，测试这些培养物并且鼠特异性c-mos重复序列呈阴性而人特异性alu重复序列则呈阳性(图1F)。
HuES9.E1、huES9.E3和H1.E2的平均群体倍增时间分别是72、72和120小时。群体倍增时间高度依赖于细胞密度且在融合度为30％-80％之间是最优选的。在大约80次群体倍增后，HuES9.E1具有46XX inv(9)(p13q12染色体组型)。从子代huES9hESC细胞系6开始出现9号染色体畸变。HuES9.E3也具有46XX inv(9)(p13q12染色体组型)，而H1.E1则在36和32次群体倍增时间后具有具有46，XY染色体组型。我们观察到细胞在约35次群体倍增之后开始出现不正常，在～10-30％的细胞中出现非克隆性染色体畸变(数据未示出)并且在35次群体倍增后细胞便无法使用了。
实施例3.表面抗原表达谱
利用FACS分析对HuES9/E1、HuES9/E3以及H1.E2的表面抗原表达谱的描绘揭示了表面抗原表达谱，其与BMMSCs的表面抗原表达谱即CD29+、CD44+、CD49a和e+、CD105+、CD166+以及CD34-、CD45-9-11在性质上类似(图2A)。标记细胞的荧光标记和分布随着各种hESC-MSC培养物的不同而不同。(图2A)
为了把这些细胞的表面抗原表达谱与BM-MSCs进行比较，HuES9.E1、HuES9.E3以及H1.E1在添加有10％胎牛血清的相同的BM-MSC培养基中增殖2代。即使培养条件发生变化，HuES9.E1、HuES9.E3以及H1.E1依旧是CD29+、CD44+、CD49a和e+、CD105+、CD166+以及CD34-、CD45-(图2B；H1.E1的数据未示出)并与BM-MSCs十分相似。不同的是CD49a，其具有在BM-MSCs中的表达要低得多。这些数据表明hESC-MSCs表现出BM-MSC表面抗原表达谱的特征，这种表达谱是稳定且不会受到其所处微环境变化的影响。
实施例4.hESC-MSC的分化潜能：成脂肪、成软骨以及成骨
由于所有与MSCs相关的表面抗原在许多其它细胞类型中也有表达且这些表面抗原的表达是多样化的，按照传统对假定的MSCs的识别依赖于功能参数9。有报道MSCs在培养物中默认的分化途径是伴随者不同程度脂肪生成和软骨生成的成骨作用9。
因而通过利用已公开规程3中的成脂肪、成软骨以及成骨作用标准分化条件对HuES9.E1的分化潜能进行测试。
成脂肪分化是高度有效的，在＞99％的细胞中都观察到了油滴(图3A)。与其作为成脂肪过程中的重要转录因子的角色相一致地，源自MSCs的hESC中的PPARγmRNA，其大约比其各自子代ESC细胞系中的PPARγmRNA要高出10-100倍，进一步提高了2倍(图3A)。
成软骨或软骨的形成也是有效的，＞99％的细胞在胞外基质中都产生了蛋白多糖，这通过alcian blue染色检测可知(图3B)，并且20％的细胞对骨胶原II具有免疫反应。软骨蛋白聚糖(Aggrecan)的转录水平也有所提高13(图3B)，所述软骨蛋白聚糖为软骨特异性胞外基质蛋白。然而，尽管在基质中出现了骨胶原II的免疫反应，骨胶原II的转录水平则降低了，所述骨胶原II为另一种软骨特异性胞外基质蛋白。其原因未知，但已知某些mRNAS特别是那些具有丰富AU element的mRNAS在转录时会变得不稳定14，15。
当诱导HuES9.E1细胞经历成骨或骨形成时骨特异性碱性磷酸酶(ALP)和骨唾液酸糖蛋白(BSP)的表达下调了2-3倍(图3C)。然而，骨形成的高级阶段时下调水平最小化，所述高级阶段通过较少的vonKossa染色来判定(图3C)。在分化的培养物中存在＜1％的阳性染色。
实施例5.基因表达谱
描绘hESC-MSCs的基因表达谱是为了1)评估hESC-MSCs培养物和源自成体组织的MSCs的相关性，所述源自成体组织的MSCs是利用来自3个不同个体的BM-MSCs以及源自脂肪的(ad)MSCs而获得的，并且属于3种人ESC细胞系；2)评估3种hESC-MSC彼此之间的相关性；3)比较源自hESC的MSCs和那些源自BM的MSCs之间的相似和不同之处。
从总RNA中制备的经标记的cDNA与含有24000个独特特征的Illumina BeadArray杂交。3种hESC-MSC培养物即HuES9.E1、HuES9.E3和H1.E2中，3种BM-MSC样品以及3种源自脂肪的(ad)-MSC样品中所表达的基因Hierarchiacal聚类显示hESC-MSC的表达谱比它的亲代hESCs更接近于源自成体组织的MSCs即所谓的BM-MSC与ad-MSC(图4A)。
有趣的是，MSCs根据其来源组织而进行聚类，并且其进一步被划分入成体组织中而不是胚胎组织中，这一点从ad-MSCs与BMMSCs作为相对于hESC-MSCs的区别性组而得以聚类中得到提示。hESC-MSCs和BM-MSCs之间基因表达的两两比较显示其相关系数为0.72，这提示在hESC-MSC和BM-MSCs的基因表达都是相当保守的同时，它们也存在显著的区别(图4B)。hESC-MSCs和hESCs之间两两比较证实了hESC-MSCs和hESC之间的区别，其相关系数为0.65(图4C)。
为了评价3种hESC-MSC培养物各自之间的相关性，HuES9.E1、H1.E2和HuES9.E3各自与由HuES9.E1、H1.E2和HuES9.E3所构成的同一参照物作了比较。HuES9.E1、H1.E2和HuES9.E3与同一参照物之间的相关系数时本质上是一致的，即0.93，0.95和0.93，这分别提示了HuES9.E1、H1.E2和HuES9.E3是高度相似的(图4C)。
在hESC-MSCs和BM-MSCs中的表达高于检测限且置信度为99％的8699和8505个基因中，各自的6376基因在hESC-MSCs和BM-MSCs中以＜2.0倍的差别程度进行表达。由于这些基因可能提供了解MSCs基础生物学的方法，我们检测了受这些基因驱动的生物学过程。在6376个共同表达的基因中，4064个基因可以在模式分类基因表中寻找到(2006年3月；http://www.pantherdb.org/)。
把这些基因分入不同生物学过程的分类显示与NCBI：H.sapiens基因数据库的23481个基因所构成的参考列表相比，在某些生物学过程中基因频率显著高于或低于代表基因(p，0.01)。这些过程包括关于分解代谢和合成代谢活力的基础代谢过程、需要高强度后转录修饰例如糖基化的分泌产物合成、以及细胞表达(图4C)。
与它们的间质潜能一样，涉及外胚层分化尤其是神经发育的基因也存在不能呈现的问题。基因表达分析也提示MAPKKK信号在BM-MSC和hESC-MSCs中都是显著的。由至少3种亚族所构成的MAPKKK信号，即所谓的经典MAPK(也被认为是ERK)，应急激活的蛋白激酶/c-Jun N-末端激酶(JNK)以及p38激酶，与表达、分化、发育、细胞应急响应调节、细胞循环、凋亡和生存18-21相关。
对hESC-MSC和BM-MSC的基因表达谱的进一步分析显示1142和1134个基因各自在hESC-MSC和BM-MSC中以＞2倍的程度进行表达。在这些基因中，738和880个基因各自位于模式分类基因列表中(2006年3月；http://www.pantherdb.org/)并被分类入生物学过程。选择了在与NCBI：H.sapiens基因数据库中23481个基因所构成的参考列表相比时显著高于或低于代表基因(p＜0.01)的生物学过程。
优选在BM-MSCs中表达的基因根据涉及代谢过程、细胞结构、分化以及信号传递的生物学过程进行分类，同时优选表达的hESC-MSC基因按照涉及表达、分化、免疫和信号传导的那些过程进行分类(图3C)。在与分化相关的生物学过程中基因的过度呈现与hESC-MSC较之BM-MSC具有更高分化能力是相一致。
虽然hESC-MSC或BM-MSC中的高表达基因在总的分化和信号传递分类中是过度呈现的，但是各种类型中的特定生物学过程在hESC-MSC和BM-MSC中具有不同的代表基因。例如，与诸如胚胎形成和分裂等早期胚胎发育相关的分化过程在hESC-MSC是过度呈现的，而那些与晚期胚胎发育例如骨骼发育及肌肉发育相关的过程则在BM-MSC中是过度呈现的。类似地，胞外基质蛋白介导的信号传递以及MAPKKK cascade在BM-MSC中是过度呈现的。总而言之，这些观察结果提示hESC-MSC和BM-MSC中的分化潜能和信号途径的利用是不相同的。
实施例5’.对hESCs和hESCs以及源自hESC的MSCs的表面标记物进行区分以分离源自单个细胞的MSC群体
全基因组基因表达要求有在hESC-MSC或hESC中高表达的基因，其编码膜蛋白以便于从正在分化的hESCs中分离MSCs。从在hESC-MSCs和hESCs中编码假定膜蛋白的前20位高表达基因列表中，选择编码抗其基因产物的抗体的候选基因可以商业获得(下表E1A和E1B)。在hESC源(hESC derived)中高度表达的那些候选基因中
  符号   倍数变化   登录号   异名
  ANPEP   715.50   NM_001150.1   CD13；LAP1，PEPN，gp150
  ENG   479.50   NM_000118.1   END；ORW；HHT1；ORW1；CD105
  SCN9A   251.20   NM_002977.1   PN1；NE-NA
  TRPV2   187.90   NM_016113.3   VRL；VRL1；VRL-1；MGC12549
  RAMP1   182.30   NM_005855.1
  F2RL2   152.03   NM_004101.2   PAR3
  NTSR1   141.15   NM_002531.1   NTR
  GABRA2   122.05   NM_000807.1
  SLC16A4   106.60   NM_004696.1   MCT4
  ITGA4   103.60   NM_000885.2   CD49D
  NCAM2   93.31   NM_000885.2   NCAM21；MGC51008
  IL1R1   86.80   NM_004540.2   P80；IL1R；IL1RA；CD121A；D2S1473；IL-1R-α
  PDGFRA   80.25   NM_000877.2   CD140A；PDGFR2
  VCAM1   71.30   NM_006206.2   INCAM-100
  SSFA2   69.74   NM_080682.   CS1；CS-1；KRAP；SPAG13；KIAA1927
  TRHDE   58.63   NM_006751.3 PAP-II
  EDG2   55.82   NM_001401.3   LPA1；edg-2；vzg-1；Gper26；Mrec1.3；rec.1.3
  NT5E   48.15   NM_002526.1   eN；NT5；NTE；eNT；CD73；E5NT
  FLRT2   46.51   NM_013231.2   KIAA0405
 FAP     44.43     NM_004460.2   FAPA；DPPIV；SEPRASE
表E1A.在源自hESC的MSC中的表达超过hESC的高表达膜蛋白
符号 倍数变化 登录号 Synonyms
 ITGB1BP3  2642.33  NM_014446.1  MIBP
 PTPRZ1  2126.50  NM_002851.1  PTPZ；HPTPZ；PTP18；PTPRZ；RPTPB
 CNTN1  430.00  NM_175038.1  F3；GP135
 PCDH1  342.08  NM_002587.3  PC42；PCDH42；MGC45991
 PODXL  303.06  NM_005397.2  PCLP；Gp200
 GPR64  217.67  NM_005756.1  HE6；TM7LN2
 PROM1  209.04  NM_006017.1  AC133；CD133；PROML1
 GPRC5C  205.00  NM_002036.2  RAIG3；RAIG-3
 CD24  166.98  NM_013230.1  CD24A
 CLDN3  166.42  NM_001306.2  RVP1；HRVP1；CPE-R2；CPETR2
 TACSTD1  163.81  NM_002354.1  EGP；KSA；M4S1；MK-1；EGP40；MIC18；TROP1；Ep-CAM；Hegp-2；CO17-1A；GA733-2
 HTR3A  140.00  NM_000869.1  HTR3
 FGFR4  139.96  NM_022963.1  TKF；JTK2
 ADCY1  127.44  NM_021116.1
 FGFR3  123.27  NM_022965.1  ACH；CEK2；JTK4；HSFGFR3EX
 IL17RB  91.70  NM_018725.2  CRL4；EVI27；IL17BR；IL17RH1；MGC5245
 SORL1  66.79  NM_003105.3  LR11；LRP9；SORLA；gp250；SorLA-1
 GPM6B  60.70  NM_005278.2  M6B
  KCNS3   35.26   NM_002252.3   KV9.3；MGC9481
  FZD3   33.94   NM_017412.2   Fz-3；hFz3
表E1B.在hESC的表达超过源自hESC的MSC的高表达膜蛋白。
上表E1A和E1B显示在源自hESC的MSCs中(表E1A)或在其亲代hESCs(表E1B)中高表达的表面抗原编码基因。基于通过微阵列杂交的基因表达分析，相对于hESCs(HuES9、H1及Hes3hESCs)在源自hESC的MSCs(HuES9.E1、HuES9.E3以及H1E2)中高表达的前20位基因(表E1A)以及相反的(表E1B)。
MSCs为ENG(CD105)、ITGA4(CD49d)、PDGFRA、NT5E(CD73)，这些都是源自成体组织的MSCs的特征性表面标记物9-11并且前述被识别为高表达hESC特异性基因ITGB1BP3和PODXL22以及CD24属于那些在hESC中具有高表达的候选基因，这些hESC特异性基因与hESCs并不相关。我们证实CD24在hESC中相对于其在hESC-MSC中而言具有高度表达(图5A)。
实施例6.获取同源性hESC-MSC群体
我们接下来检测这些标记物在强化hESC-MSCs同质性中的有效性。在用胰蛋白酶消化过后1周，在添加有血清替代介质FGF2以及可选地PDGF AB的培养基中进行培养，通过FACS挑选表达CD105且不表达CD24的细胞。
CD105+和CD24-的细胞大约构成了培养物5％(图5B)。挑选的细胞以1个细胞/孔的密度接种到10×96孔板上，以100个细胞/孔的密度接种到1×24孔板上，以1000个细胞/孔的密度接种到3×6孔板上。在这些细胞中，只有在18份1000个细胞/孔中的5份培养物产生了MSC样培养物，这暗示这些MSC样培养物有可能是从单一细胞分化而来的。
利用含约24,000特定特征的Illumina BeadArray对这5份培养物Q4.1-Q4.5的全基因组基因表达谱所进行的描绘揭示了这5种培养物之间的相似性，其中4份细胞系的相关系数为0.96而剩下的一份则为0.90(图5C)。从我们这方面看，在距使用同一RNA样品至少一个月时间后所实施的技术性重复实验之间的相关系数一般在0.97-0.98之间。Q4.1-Q4.5也都与由huES9.E1、H1E2以及huES9.E3所构成的hESC-MSCs高度相似，而与BM-MSCs的相关系数为0.87和0.81(图5D)。
相反地，Q4.1-Q4.5与其亲代HuES9.E1 hESC细胞系的相关系数低于0.55(图5D)。采用G显带进行染色体分析并在任意选择的Q4.3中实施SKY。Q4.3具有9号染色体发生畸变的正常染色体组型，所述染色体畸变源自其亲代HuES9hESC细胞系(图5E)6。这些观察结果一起显示通过在添加有bFGF2及可选的PDGF BB的培养基中增殖一周后再从胰蛋白酶消化的hESC培养物中挑选CD105+和CD24-细胞的方法可以产生高度同源的MSC培养物。
把阳性和阴性选择性标记物结合到制备规程中导致获得了5种具有的相互之间几乎相同的全基因组表达谱的单克隆分离物，并证实了选择的特异性或挑选标准。5种分离物之间基因表达两两综合比较显示出几乎相同的基因表达谱，其与采用同一RNA样品的技术性重复试验中所观察到的基因表达谱相似。
实施例7-15描述了多个试验以分析源自人ESC的MSCs(hESC-MSCs)基因组。在这些试验中，采用临床适用的试验方案来对用源自人ESC的MSCs(hESC-MSCs)合成的化学合成的不含血清培养基进行了分析。该合成培养基用多维蛋白识别技术(MuDPIT)以及细胞因子抗体阵列分析法来进行分析，并发现存在201种独特基因产物。
86-88％的这些基因产物具有利用微阵列或qRT-PCR分析法可检测到的转录水平。计算机分析预测这些基因产物显著分为3个主要的生物学过程组别：代谢、防御性响应以及包括血管形成、造血以及骨骼成长在内的组织分化。其也预测201个基因产物激活了心脏血管生物学、骨骼成长以及造血作用中的重要信号途径，例如JakSTAT、MAPK、Toll样受体、TGF-β信号传递以及mTOR信号传递途径。
实施例7.源自人ESC的MSCs(hESC-MSCs)的蛋白组学分析：材料和方法
合成培养基的制备
HuES9.E1按照上述那样进行培养。用PBS对80％融合的HuES9.E1细胞培养物洗涤3次，在由不含酚红并添加有ITS(Invitrogen-Gibco，GrandIsland，New York)、5ng/ml FGF2(Invitrogen-Gibco，Grand Island，NewYork)、5ng/ml PDGF AB(Peprotech，Rocky Hill，New Jersey)谷氨酸-青霉素-链霉素以及β-巯基乙醇的DMEM所构成的化学合成培养基(Catalog 31053；Invitrogen-Gibco，Grand Island，New York)中培养过夜。该培养物随后用PBS清洗3次，并随即放入新鲜培养基中。3天后，收集培养基，500g离心并0.2μ微孔过滤上清液。为了LC MS/MS检测，合成培养基被放入截止分子量为3500的透析袋中(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)，在10倍体积0.9％NaCl中透析3次，然后利用Slide-A-Lyzer浓缩液浓缩20倍，随后在0.2μ过滤之前于100倍体积的0.9％NaCl中透析10次。对同样体积的非合成培养基进行透析并平行地对合成培养基进行浓缩。
细胞因子抗体Blot检测
依据厂商的说明书(RayBio Norcross，GA)用RayBio Cytokine抗体阵列检测1ml合成或非合成培养基中是否存在细胞因子以及其它蛋白质。
LC MS/MS分析
按照所公开的那样{Washburn，2001#2997}对2ml经透析的合成(CM)或非合成培养基(NCM)中的蛋白质进行还原，烷基化并用胰蛋白酶消化。该样品随后经过使消化混合物通过合成Sep-Pak C-18 SPE芯(Waters，Milford，MA，USA)，3％乙腈(ACN)(JT Baker，Phillipsburg，NJ)以及0.1％蚁酸(FA)缓冲液清洗两次，并在70％的CAN和0.1％的FA缓冲液中抽提，从而得以脱盐。该抽提的样品随后通过speedvac到约10％的初始体积并用0.1％的蚁酸调节从而得到水合。样品在LC MS//MS分析之前，于4℃下保存。
通过利用LC-MS/MS系统(LTQ，ThermoFinnign，San Jose，CA，USA)对脱盐的蛋白质进行MudPIT分析。该样品被加载到强离子(SCX)交换柱(Biodbasic SCX，5um，thermo Eletron，San Jose，USA)上并且在第一维中用50ul的缓冲液冲洗6次(0、2、5、10、100和1000mM的含5％ACNyiji 0.1蚁酸的氯化氨)分馏。浓缩从SCX柱子洗脱的肽并在Zorbax peptide trap(Agilent，Pola Alto，CA，USA)中脱盐。第二维色谱分离在home-packed nanobored C18柱(75um，id.10cm，5um颗粒)上进行并直接进入pico-frit纳米电喷雾针尖(New Objective，Wubrun，MA，USA)中，以200nL/min的流速梯度洗脱120min。
LTQ在数据独立模式中进行操作，通过对来自每次MS扫描中3个最强峰执行MS/MS扫描。对于每次试验，通过home-wrriten程序把6次盐洗脱的MS/MS(dta)谱组合成多路存取系统控制终端类文件。蛋白识别利用经由in-house Mascot服务器对照IPI人蛋白质数据库对组合数据进行搜寻而实现。搜索参数为：利用胰蛋白酶对2处未裂解处中的最大一处进行处理；固定化的修饰为氨基甲酸甲基化物并且多样化的修饰物为甲硫氨酸氧化以及蛋白质N端乙酰化。把肽前体以及片段离子各自的分子量公差设定为20和0.8Da。如果2种不同的肽被发现具有50分或更高分值则把该蛋白质识别结果作为真阳性结果接受。既然多种生长因子和细胞因子使小分子蛋白/肽且少量分泌，则相应的MS/MS谱便是弱的并且对于每种蛋白质仅识别一种肽。对于那些mascot分值在20和50之间的肽，对MS/MS谱进行手动确证。
生物信息学
已确证的蛋白质通过去掉在非合成培养基中所识别的背景蛋白的方法而得以比较。每种蛋白的IPI识别符通过蛋白质交叉参考表被转换为基因标识。用GeneSpringGX7.3表达分析仪(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)把基因产物分成不同的GO分类系统(gene ontology分类体系)中的生物学过程或途径。随后，把各个过程或途径中的基因频率与基因库中的人类基因数据库进行对比，那些基因频率显著较高(p＜0.05)的过程或途径被认为受到MSC分泌的显著调节。
QRT-PCR
按照厂商说明用Trizol试剂(Gibco-BRL)从HuES9.E1中抽提总RNA并在旋转柱(spin column)(Nucleospin RNA II系统，Macherey-NagelGmbH&Co.，
Figure A20068004102000721
Germany)中进行纯化。利用高容量cDNA Archive kit(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)在50ul反应体积中把1ug总RNA被转换成具有随机引物的cDNA。该cDNA用蒸馏水稀释成100ul体积。根据厂商说明把1ul用于途径特异性的RT2 Profiler PCR Arrays(SuperArray，Frederick，USA)中所设定的每种引物。用于分析板是：Chemmokines&Receptors PCR Array(cat.no.APH-022)，NfkB SignalingPathwayPCR Array(cat.no.APH-025)，炎症细胞因子&受体(InflammatoryCytokines&Receptors)PCR Array(cat.no.APH-011)，普通细胞因子PCRArray(cat.no.APH-021)，JAK/STAT信号途径PCR Array(cat.no.APH-039)。
实施例8.源自人ESC的MSCs(hESC-MSCs)基因组分析：合成培养基(CM)和非合成培养基(NCM)的制备
为了确保合成培养基的污染最小化而添加诸如血清替代物等介质，HuES9.E1 MSC被培养至80％融合，用PBS清洗3次，在由不含酚红并添加了ITS(胰岛素、转铁蛋白以及selenoprotein)、5ng/ml FGF2，5ng/mlPDGF AB谷氨酸盐-青霉素-链霉素以及β-巯基乙醇的DMEM培养基所组成的化学合成培养基温育过夜。HuE9.E1 MSCs在该基本培养基中增殖至少一周。第二天，细胞培养物再次用PBS进行清洗，并在新现的合成培养基中进行温育。
在条件处理3天后收集培养基，该合成培养基(CM)一般和等量的非合成培养基(NCM)平行进行分析或处理。为了进行LC MS/MS分析，在按材料和方法项中的0.9％生理盐水中粗透析之前，把该培养基浓缩～10倍。经浓缩的CM和NCM的平均蛋白质浓度各自为98.0±17.9ug/ml和41.6±1.2ug/ml(n＝3)。用MSCs对培养基的调节处理通过在蛋白凝胶运行培养基试样而得以监测。培养基中的蛋白组合物随着时间的增加而增加(图6)。CM比NCM具有更复杂的蛋白组合物。
实施例9.源自ESC的MSCs(hESC-MSCs)的蛋白质组分析：通过LCMS/MS以及抗体阵列对MSC合成培养基进行分析
LC MS/MS分析识别了250种存在于独立制备的几批CM中的蛋白质，但在经类似处理的NCM中没有发现该蛋白质。这些蛋白质为：
IPI00021428肌动蛋白，α骨骼肌；2.IPI00414057肌动蛋白α1骨骼肌蛋白；3.IPI00008603肌动蛋白，动脉平滑肌；4.IPI00021439肌动蛋白，细胞质1；5.IPI00023006肌动蛋白，α心肌；6.IPI00021440肌动蛋白，细胞质2；7.IPI00025416肌动蛋白，γ肠平滑肌；8.IPI00479925凝集素；9.IPI00015102 CD166抗原前体；10.IPI00007423酸性亮氨酸丰富的核磷蛋白质32家族成员B；11.IPI00413331 36kDa蛋白；12.IPI00412577 34kDa蛋白；13.IPI00413506 33kDa蛋白质；14.IPI00418169推定蛋白DKFZp686P03159；15.IPI00003815Rho GDP-解离抑制剂1；16.IPI00004656β-2-微球蛋白前体；17.IPI00218042骨形态形成蛋白1前体的splice isoform BMP1-5；18.IPI00009054骨形态形成蛋白1前体的剪接异构体BMP1-3；19.IPI00014021骨形态形成蛋白1前体的剪接异构体BMP1-1；20.IPI002180420骨形态形成蛋白1前体的剪接异构体BMP1-4；21.IPI00006980蛋白C14或f166；22.IPI00296165补体C1r亚成分前体；23.IPI00152540 OTTHUMP00000016748；24.IPI00305064剪接异构体CD44抗原前体；25.IPI00297160推定蛋白DKFZp451K1918；26.IPI00293539 Cadherin-11前体的剪接异构体2；27.IPI00304227Cadherin-11前体的剪接异构体1；28.IPI00386476 Cadherin 11，2型，前蛋白原异构体1；29.IPI00024046 Cadherin-13前体；
30.IPI00290085 Neural-cadherin前体；31.IPI00029739剪接异构体1 of补体因子H前体；32.IPI00012011 Cofilin，非肌性异构体；33.IPI00007257 calsyntenin 1异性体2；34.IPI00218539胶原α-1(XI)链前体的剪接异构体B；35.IPI00477350胶原，XI型，α1；36.IPI00329573Splice Isoform Long of Collagen α-1(XII)chain前体；37.IPI00221384胶原α-1(XII)链前体的短剪接异构体(Splice Isoform Short of Collagen α-1(XII)chain前体)；38.IPI00400935胶原α-1(XVI)链前体；39.IPI00297646胶原α-1(1)链前体；40.IPI00164755 Prepro-α2(I)胶原前体；41.IPI00304962胶原α-2(I)链前体；42.IPI00021033胶原α-1(III)链前体；43.IPI00167087 COL3A1蛋白；44.IPI00021034胶原α-1(IV)链前体；45.IPI00479324α2IV型胶原前蛋白原；46.IPI00306322胶原α-2(IV)链前体；47.IPI00303313胶原α-1(V)链前体；48.IPI00477611184IcDa蛋白；49.IPI00293881 COL5A2蛋白；50.IPIOOO 18279胶原α-3(V)链前体；51.IPI00291136胶原α-1(VI)链前体；52.IPI00304840剪接异构体2C2 of胶原α-2(VI)链前体；53.IPI00220613剪接异构体2C2A of胶原α-2(VI)链前体；54.IPI00022200α3 VI型胶原异构体1前体；55.IPI00072918α3VI型胶原异构体4前体；56.IPI00220701胶原α-3(VI)链前体的剪接异构体2；57.IPI00072917α3VI型胶原异构体3前体；58.IPI00021828胱抑素B；59.IPI00007778Di-N-乙酰几丁质(acetylchitobiase)前体；60.IPI00295741组织蛋白酶B前体；
61.IPI00299219蛋白CYR61前体；62.IPI00514900 42 IdDa蛋白；63.IPI00333770与胞质分裂蛋白10的主要贡献者(Dedicator)相似；64.IPI00478332胞质分裂蛋白9的主要贡献者(Dedicator)相似；65.IPI00000875延伸因子1-γ；66.IPI00465248α-烯醇化酶；67.IPI00013769α-烯醇化酶，肺特异性；68.IPI00216171γ-烯醇化酶；69.IPI00218803Fibulin-1前体的剪接异构体B；70.IPI00296537 Fibulin-1前体的剪接异构体C；71.IPI00328113原纤纬蛋白-1前体；72.IPI00019439原纤纬蛋白2前体；73.IPI00385645成纤维细胞生长因子17前体的剪接异构体2；74.IPI00216602成纤维细胞生长因子2前体的剪接异构体5；75.IPI00216604成纤维细胞生长因子2前体的剪接异构体8；76.IPI00034099假定蛋白FLJ21918；77.IPI00333541细丝蛋白-A；78.IPI00302592细丝蛋白A，α；79.IPI00339227假设蛋白DKFZp68601166；80.IPI00414283纤维连接蛋白前体(FN)(冷凝球蛋白)(CIG).剪接异构体3；81.纤维连接蛋白前体的剪接异构体5；82.IPI00339319纤维连接蛋白前体的剪接异构体11；83.IPI00556632纤维连接蛋白前体的剪接异构体12；84.IPI00411462假设蛋白DKFZp686B 18150；85.IPI00029723卵泡抑制蛋白相关的蛋白1前体；86.IPI00005401多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶5；87.IPI00219025谷氧还蛋白-1；88.IPI00171411高尔基体磷蛋白2；89.IPI00026314凝溶胶蛋白前体；
90.IPI00219757谷胱甘肽S-转移酶P；91.IPI00027569C型不均一核糖核蛋白(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C-1ike)1；92.IPI00003881 HNRPF蛋白；93.IPI00442294 Neurotrimin前体的剪接异构体1；94.IPI00003865热休克同源71kDa蛋白的剪接异构体1；95.IPI00037070热休克同源71kDa蛋白的剪接异构体2；96.IPI0022036210kDa热休克蛋白，线粒体；97.IPI00024284基底膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白前体；98.IPI00297284胰岛素样生长因子结合蛋白2前体；99.IPI00297284胰岛素样生长因子结合蛋白2前体；100.IPI00029236胰岛素样生长因子结合蛋白5前体；101.IPI00029236胰岛素样生长因子结合蛋白5前体；102.IPI00029235胰岛素样生长因子结合蛋白6前体；103.IPI00029235胰岛素样生长因子结合蛋白6前体；104.IPI00016915胰岛素样生长因子结合蛋白7前体；105.IPI00016915胰岛素样生长因子结合蛋白7前体；106.IPI00328163K-A-I蛋白；107.IPI00021396管内皮生长因子受体2前体；108.IPI00298281层粘连蛋白γ-1链前体；109.IPI00219219半乳糖凝集素-1；110.IPI00023673半乳糖凝集素-3结合蛋白前体；111.IPI00021405核纤层蛋白-A/C的剪接异构体A；112.IPI00216953核纤层蛋白-A/C的剪接异构体ADelta10；113.IPIOO1 80173预测：与原肌球蛋白4相似；114.IPI00401614预测：与FKSG30相似；115.IPI00374397预测：与原肌球蛋白4相似；116.IPI00374732预测：与PPIA蛋白相似；117.IPI00402104预测：与肽基脯氨酰异构酶A异构体1相似；亲环素A；肽基脯氨酰；118.IPI00455415预测；与C型不均一核糖核蛋白相似dJ845O24.4；119.IPI00454722预测：与磷脂酰乙醇胺-结合蛋白相似；120.IPI00454852预测：与畸胎瘤源的生长因子1相似；121.IPI00002802蛋白-赖氨酸6-氧化酶前体；122.IPI00410152潜在转化生长因子β结合蛋白1异构体LTBP-1L；123.IPI00220249潜在转化生长因子β结合蛋白，异构体IL前体；124.IPI00220249潜在转化生长因子β结合蛋白，异构体IL前体″；125.IPI00410152潜在转化生长因子β结合蛋白1异构体LTBP-1L；126.IPI00020986光蛋白聚糖前体；127.IPI00291006苹果酸脱氢酶，线粒体前体；128.IPI00005707巨噬细胞甘露糖受体2前体；129.IPI00020501肌球蛋白-11；130.IPIOOO 19502肌球蛋白-9；131.IPI00604620核仁素；132.IPI00220740剪接异构体2 of核仁磷酸蛋白；133.IPI00219446磷脂酰乙醇胺-结合蛋白；134.IPI00299738前胶原C-内肽酶增强子1前体；135.IPI00015902β血小板源性生长因子受体前体；136.IPI00216691抑制蛋白-1；137.IPI00169383磷酸甘油酸激酶1；138.IPI00219568磷酸甘油酸激酶，睾丸特异；139.IPI00296180尿激酶型纤溶酶原激活物前体；140.IPI00215943网蛋白1的剪接异构体3；141.IPI00215942网蛋白1的剪接异构体2；142.IPI00014898网蛋白1的剪接异构体1；143.IPI00398777网蛋白1异构体8；144.IPI00398776网蛋白1异构体7；145.IPI00186711网蛋白1异构体6；146.IPI00420096网蛋白1异构体3；147.IPI00398779网蛋白1异构体11；148.IPI00398778网蛋白1异构体10；149.IPI00398002网蛋白1异构体1；150.IPI00419585肽基脯氨酰顺反异构酶A；151.IPI00472718肽基脯氨酰异构酶A异构体2；152.IPI00000874过氧化还原酶-1；153.IPI00024915过氧化还原酶-5，线粒体前体；154.IPI00375306过氧化还原酶5前体，异构体b；155.IPI00012503剪接异构体Sap-mu-0 of激活剂前体多肽前体；156.IPI00374179蛋白酶体激活因子亚基1异构体2；157.IPI00030154蛋白酶体激活因子配合物亚基1；158.IPI00168812 PTK7蛋白酪氨酸激酶7异构体d前体；159.IPI00419941 PTK7蛋白酪氨酸激酶7异构体a前体；160.IPI00003590Quiescin Q6，异构体a；161.IPI00015916骨源生长因子(片段)；162.IPI00015916骨源生长因子；163.IPI00298289网状蛋白-4的剪接异构体2；164.IPI00021766网状蛋白-4的剪接异构体1；165.IPI00013895调钙结合蛋白；166.IPI00010402假定蛋白；167.IPI00218733超氧化物歧化酶；168.IPI00014572SPARC前体；169.IPI00005614收缩蛋白β链，脑1的长剪接异构体(Splice Isoform Long of Spectrin beta chain，brain 1)；170.IPI00008780外周血人类斯钙素-2前体；171.IPI00301288 SEL-OB蛋白；172.IPI00216138胶转蛋白；173.IPI00018219转化生长因子-β-诱导蛋白ig-h3前体；174.IPI00304865转化生长因子，β受体III″；175.IPI00296099血小板反应素-1前体；176.IPI00032292金属蛋白酶抑制剂1前体；177.IPI00027166金属蛋白酶抑制剂2前体；178.IPI00220828胸腺素β-4；179.IPI00180240胸腺素样3(thymosin-like 3)；180.IPI00299633 OTTHUMP00000031270(片段)；181.IPI00465028磷酸丙糖异构酶1变异体(片段)；182.IPI00451401磷酸丙糖异构酶的剪接异构体2；183.IPI00010779原肌球蛋白4；184.IPI00216975原肌球蛋白α-4链的剪接异构体2；185.IPI00180675微管蛋α-3链；186.IPI00218343微管蛋白α-6链；187.IPI00216298硫氧还蛋白；188.IPI00472175 CDNAFLJ46672菲斯，克隆TRACH3009008，与硫氧还蛋白还原酶高度相似；189.IPI00450472泛蛋白连接酶E2I；190.IPI00018352泛素羧基末端水解酶L1；191.IPI00010207泛素-倍改性剂1(Ubiquitin-fold modifier 1)前体；192.IPI00260630 URB；193.IPI00021263 14-3-3蛋白δ/Δ；194.IPI00642991假设蛋白DKFZp686F 10164；195.IPI00470919假设蛋白DKFZp686K08164；196.IPI00719088胶原，VI型，α1前体；197.IPI00654685与SPARC前体相似；198.IPI00641961胶原，XII型，α1；199.IPI00645849细胞外基质蛋白1；200.IPI00554786硫氧还蛋白还原酶1；201.IPI00645018纤溶酶原激活物，尿激酶；202.IPI00552339金属蛋白酶的组织抑制因子1；203.IPI00642997肌动蛋白，细胞质2；204.IPI00719778与膜联蛋白相似A2；205.IPI00647915胶转蛋白2；206.IPI00552815胶原，V型，α1；207.IPI00552981 CDNA PSEC0266菲斯，克隆NT2RP3003649，与Homo sapiens fibulin-lD mRNA高度相似；208.IPI00180776 29 IcDa蛋白；209.IPI00552416细丝蛋白A，α；210.IPI00640698肌动蛋白，γ肠场平滑肌；211.IPI00514530肌动蛋白，α1，骨骼肌；212.IPI00556442胰岛素样生长因子结合蛋白2变异体(片段)；213.IPI00513782凝溶胶蛋白；214.IPI00478731 29 IcDa蛋白；215.IPI00396479 24 IcDa蛋白；216.IPI00334627 39 IcDa蛋白；217.IPI00555762 PTK7蛋白酪氨酸激酶7异构变异体(片段)；218.IPI00658202 97 IcDa蛋白；219.IPI00006273 CYR61蛋白；220.IPI00719405 TMSL6蛋白；221.IPI00658096胸腺素β-4；222.IPI00376163 5 IdDa蛋白；223.IPI00556217原纤维蛋白1变异体(片段)；224.IPI00514817与核纤层蛋白A/C类似；225.IPI00644087 Progeria；226.IPI00655812横纹肌肉瘤抗原MU-RMS-40.12；227.IPI00604517与核仁素相似；228.IPI00444262 CDNA FLJ45706菲斯，克隆FEBRA2028457，与核仁素高度相似；229.IPI00412473蛋白；230.IPI00414489蛋白；231.IPI00411463蛋白；232.IPI00556415胶转蛋白变异体(片段)；233.IPI00718825钙调蛋白；234.IPI00478156 17 kDa蛋白；235.IPI00386621 CALM3蛋白；236.IPI00647001酸性；237.IPI00642650与外周血人斯钙素2前体相似；238.IPI00641471胶原样蛋白；239.IPI00514669 SH3富谷氨酸结合结构域蛋白样3；240.IPI00719422磷酸丙糖异构酶(片段)；241.IPI00003734Putative S100钙结合蛋白H_NHO456N16.1；242.IPI00029574 11 kDa蛋白；243.IPI00641047凝溶胶蛋白；244.IPI00647556凝溶胶蛋白；245.IPI00654821假设蛋白LOC54845异构体1；246.IPI00647572 Dickkopf相关的蛋白-3前体；247.IPI00639879与胞质分裂蛋白sepA相似；248.IPI00657746与胞质分裂蛋白8的主要贡献者(Dedicator)相似；249.IPI00555993血管内皮生长因子受体3变异体；250.IPI00552545胞质分裂蛋白8的主要贡献者(Dedicator)。
同时，这250种蛋白质由132各独特的已知基因编码：ACTA1；COL5A2；HSPA8；PSAP；ACTA2；COL5A3；HSPE1；PSME1；ACTB；COL6A1；HSPG2；PTK7；ACTC；COL6A2；IGFBP2；QSCN6；ACTG1；COL6A3；IGFBP5；RTN4；ACTG2；CSTB；IGFBP6；S100A1 1；AGRN；CTBS；IGFBP7；SH3BGRL3；ALCAM；CTSB；K-A-I；SOD1；ANP32B；CYR61；KDR；SPARC；ANXA2；DOCK10；LAMC1；SPTBN1；ARHGDIA；DOCK8；LGALS1；STC2；B2M；ECM1；LGALS3BP；SVEP1；BMP1；EEF1G；LMNA；TAGLN；C14orf166；ENO1；LOX；TAGLN2；C1R；ENO1B；LTBP1；TGFBI；CALM1；ENO2；LUM；TGFBR3；CD109；FBLN1；MDH2；THBS1；CD44；FBN1；MRC2；TIMP1；CDH11；FBN2；MYH11；TIMP2；CDH13；FGF17；MYH9；TMSB4X；CDH2；FGFR2；NCL；TMSL3；CFH/HF1；FLJ21918；NPM1；TMSL6；CFL1；FLNA；PBP；TPI1；CLSTN1；FN1；PCOLCE；TPM4；COL11A1；FSTL1；PDGFRB；TUBA3；COL12A1；GALNT5；PFN1；TUBA6；COL16A1；GLRX；PGK1；TXN；COL1A1；GOLPH2；PGK2；TXNRD1；COL1A2；GSN；PLAU；UBE2I；COL3A1；GSTP1；PLEC1；UCHL1；COL4A1；HNRPCL1；PPIA；UFM1；COL4A2；HNRPF；PRDX1；URB；COL5A1；HNT；PRDX5；YWHAZ.
有32种蛋白是未知的：IPI00642991假定蛋白DKFZp686F10164；IPI00470919假定蛋白DKFZp686K08164；IPI00654685与SPARC前体相似；IPI00719778与膜联蛋白A2相似；IPI00552981 CDNA PSEC0266菲斯，克隆NT2RP3003649，与Homo sapiens fibulin-1D mRNA高度相似；IPI00180776 29 IcDa蛋白；IPI00478731 29 IcDa蛋白；IPI00396479 24IcDa蛋白；IPI00334627 39 IcDa蛋白；IPI00658202 97 IcDa蛋白；IPI00376163 5 IcDa蛋白；IPI00514817与核纤层蛋白A/C相似；IPI00644087 Progerin；IPI00655812横纹肌肉瘤抗原MU-RMS-40.12；IPI00604517与核仁素相似；IPI00444262 CDNA FLJ45706菲斯，克隆FEBRA2028457，与核仁素高度相似；IPI00412473蛋白；IPI00414489蛋白；IPI00411463蛋白；IPI00478156 17 IcDa蛋白；IPI00386621 CALM3蛋白；IPI00647001酸性；IPI00642650与外周血人类斯钙素基因2前体相似；IPI00641471胶原体样蛋白；IPI00514669SH3富谷氨酸结合结构域蛋白样3；IPI00003734推定的S100钙结合蛋白H NH0456N16.1；IPI00029574 11 IcDa蛋白；IPI00654821假定蛋白LOC54845异构体1；IPI00647572 Dickkopf相关的蛋白-3前体；IPI00639879与胞质分裂蛋白sepA相似；IPI00657746与胞质分裂蛋白8的主要贡献者(Dedicator)相似；IPI00555993管内皮生长因子受体3变异体。
本文的MSCs由此可以用作任何或所有的这些蛋白质，或者由它们所分泌的任何蛋白或其它分子的来源。
MSCs已经显示出分泌大范围的影响其周围细胞的细胞因子和生长因子8。这些因子中的许多都是不易用鸟枪法(shot-gun)LC MS/MS检测的小分子。因此，CM和NCM也通过与5种集中载有抗101种细胞因子/生长因子抗体的不同抗体阵列杂交来进行分析(同样参见图7)。
抗体阵列排布
血管生成序列I
  A   B   C   D   E   F   G   H
  1   POS   POS   NEG   NEG   血管生成素   EDF   ENA-78   b-FGF
  2   POA   POS   NEG   NEG   血管生成素   EDF   ENA-78   b-FGF
  3   GRO   INF-□   IGF-I   IL-6   IL-8   LEPTIN   MCP-1   PDGF-BB
  4   GRO   INF-□   IGF-I   IL-6   IL-8   LEPTIN   MCP-1   PDGF-BB
  5   PIGF   RANTES   TGF-□1   TIMP-1   TIMP-2   血小板生成素   VEGF   VEGF-D
  6   PIGF   RANTES   TGF-□1   TIMP-1   TIMP-2   血小板生成素   VEGF   VEGF-D
  7   BLANK   BLANK   BLANK   BLANK   BLANK   BLANK   Neg   POS
  8   BLANK   BLANK   BLANK   BLANK   BLANK   BLANK   Neg   POS
人类趋化因子抗体序列I
A B   C   D  E   F   G   H   I   J   K  L
  1 POS POS   NEG   NEG  BLC   CCL28   Ckβ8-1   CTACK   CXCL16   ENA-78   Eotaxin  Eotaxin-2
  2 POS POS   NEG   NEG  BLC   CCL28   Ckβ8-1   CTACK   CXCL16   ENA-78   Eotaxin  Eotaxin-2
  3 Eotaxin-3 Fractalkine  GCP-2   FRO  GROα   HCC-4   I-309   I-TAC   IL-8   IP-10   淋巴细胞趋化因子  MCP-1
  4 Eotaxin-3 Fractalkine  GCP-2   GRO  GROα   HCC-4   I-309   I-TAC   IL-8   IP-10   淋巴细胞趋化因子  MCP-1
  5   MCP-2   MCP-3   MCP-4   MDC   MIG   MIP-1α  MIP-1β   IL-8  MIP-3α   MIP-3β   MPIF-1   NAP-2
  6   MCP-2   MCP-3   MCP-4   MDC   MIG   MIP-1α  MIP-1β   MIP-1δ  MIP-3α   MIP-3β   MPIF-1   NAP-2
  7   PARC   RANTES   SDF-1β   SDF-1β   TARC   TECK  BLANK   BLANK  BLANK   BLAND   BLANK   POS
  8   PARC   RANTES   SDF-1β   SDF-1β   TARC   TECK  BLANK   BLANK  BLANK   BLAND   BLANK   POS
Figure A20068004102000821
基质金属蛋白酶抗体序列I
  A   B   C   D   E   F   G   H
  1   POS   POS   NEG   NEG   MMP-1   MMP-2   MMP-3   MMP-8
  2   POS   POS   NEG   NEG   MMP-1   MMP-2   MMP-3   MMP-8
  3   MMP-9   MMP-10   MMP-13   TIMP-1   TIMP-2   TIMP-3   TIMP-4   POS
  4   MMP-9   MMP-10   MMP-13   TIMP-1   TIMP-2   TIMP-3   TIMP-4   POS
Figure A20068004102000822
人类细胞因子抗体序列I
  A   B   C   D   E   F   G   H
  1   POS   POS   NEG   NEG   GCSF   GM-CSF   GRO   GROα
  2   POS   POS   NEG   NEG   GCSF   GM-CSF   GRO   GROα
  3   IL-1α   IL-2   IL-3   IL-5   IL-6   IL-7   IL-8   IL-10
  4   IL-1α   IL-2   IL-3   IL-5   IL-6   IL-7   IL-8   IL-10
  5   IL-13   IL-15   IFN-γ   MCP-1   MCP-2   MCP-3   MIG   RANTES
  6   IL-13   IL-15   IFN-γ   MCP-1   MCP-2   MCP-3   MIG   RANTES
  7   TGF-β1   TGF-α   BLANK   BLANK   BLANK   BLANK   BLANK   POS
  8   TGF-β1   TGF-α   BLANK   BLANK   BLANK   BLANK   BLANK   POS
Figure A20068004102000823
人类细胞因子抗体序列V
  A   B   C  D E  F   G  H  I J K L
  1   POS   POS   POS  POS NEG  NEG   ENA-78  GCSF  CM-CSF GRO GRO-α POS
  2   I-309   IL-1α   IL-1β  IL-2 IL-3  IL-4   IL-5  IL-6  IL-7 IL-8 IL-10 I-309
  3   IL-12P40p70   IL-13   IL-15  IFN-γ MCP-1  MCP-2   MCP-3  MCSF  MDC MIG MIP-1β IL-12p10p70
  4   MIP-1δ   RANTES   SCF  SDF-1 TARC  TGF-β1   TNF-α  TNF-β  FGF IGF-1 血管生成素 MIP-1δ
  5   制瘤素M   血小板生成素   VEGF  PDGF-BB LEPTIN  BDNF   BLC  Ckβ8-1  Eotaxin Eotaxin-2 Eotaxin-3 制瘤素M
  6   FGF-4   FGF-6   FGF-7  FGF-9 Flt-3Ligand Fractalkine  GCP-2  CDNF  HGF IGFBP-1 IGFBP-2 FGF-4
  7   IGFBP-3   IGFBP-4   IL-16   IP-10   LIF   LIGHY5   MVP-4   MIF   MIP-3α   NAP-2   NT-3   IGFBP-3
  8   NT-4   破骨细胞形成抑制因子   PARC   PIGF   TGF-β2   TGF-β3   TIMP-1   TIMP-2   NEG   POS   POS   NT-4
已经发现HuES9.E1 MSCs在4种独立制备的CM而非NCM中的3种培养基中重复分泌72种细胞因子/生长因子。72中蛋白通过抗体阵列(名称、基因标识、基因ID)来识别：1.MDC ADAMI 1 GI_11496997-A；2.血管生成素ANGGI_42716312-S；3.BDNF BDNF GI_34106709-A；4.1-309 CCL1 GI_4506832-S；5.Eotaxin CCLI 1 GI_22538399；6.MIP-1δCCL15 GI_34335180-A；7.HCC-4 CCL16GI_22538800；8.MCP-I CCL2 GI_22538812-S；9.Ckβ8-1CCL23 GI_22538807-A；10.Eotaxin-2 CCL24 GI_22165426-S；11.Eotaxin-3 CCL26 GI_22547151-S；12.RANTES CCL5 GI_22538813；13.MCP-3 CCL7 GIJ3435401-S；14.MCP-2 CCL8GI_22538815-S；15.MCSF CSF1 GI_27262666-I；16.GM-CSF CSF2 GI_27437029-S；17.GCSF CSF3 GI_27437048；18.Fractalkine CX3CL1 GI_4506856-S；19.GRO-aCXCL1 GI_4504152-S；20.1-TAC CXCLI 1 GI_14790145-S；21.SDF-I CXCL12GI_40316923；22.BLC CXCL13 GI_5453576-S；23.ENA-78 CXCL5 GI_41872613-S；24.IP-IO CXCR3 GI_4504098-S；25.EGF EGF GI_6031163-S；26.FGF-4 FGF4GI_4503700；27.FGF-6 FGF6 GI_10337586；28.FGF-7 FGF7 GI_15147344；29.FGF-9 FGF9 GI_4503706-S；30.Fit 3 Ligand FLT3LG GI_38455415-S；31.GDNFGDNF GI_40549410；32.GCP-2 GOLGA4 GI_45359854-S；33.HGF HGFGI_33859834-S；34.IFN-γIFNG GI_10835170-S；35.IGF-I IGF1 GI_199231H-S；36.IGFBP-1IGFBP1 GI_4504614-S；37.IGFBP-2IGFBP2 GI_10835156-S；38.IGFBP-4IGFBP4 GI_10835020-S；39.IL-I0 IL10 GI_24430216-S；40.IL-12p40p70 IL12BGI_24497437-S；41.IL-13 IL13
GI_26787977-S；42.IL-16 IL16 GI_27262654-A；43.IL-Ia ILIAGI_27894329-S；44.EL-1β IL1B GI_27894305-S；45.IL-2 IL2GI_28178860-S；46.IL-3 IL3 GI_28416914-S；47.IL-6 IL6 GI_10834983-S；48.IL-7 IL7 GI_28610152-S；49.IL-8 IL8 GI_28610153-S；50.SCF KITLGGI_4580419-A；51.LEPTIN LEP GI_4557714-S；52.LIF LIF GI_6006018-S；53.MIF MIF GI_4505184-S；54.MMP-I MMP1 GI_13027798-S；55.MMP-10MMP10 GI_4505204-S；56.MMP-13MMP13 GI_13027796-S；57.MMP 3 MMP3 GI_13027803-S；58.MMP-9 MMP9 GI_4826835-S；59.PARC PARC GI_24307990；60.PDGF-BB PDGFB GI_15451785-A；61.PIGF PIGF GI_27894289-A；62.TGF-β1 TGFB1 GI_10863872；63.TGF-β2TGFB2 GI_4507462-S；64.血小板生成素THPO GI_40805871-S；65.TIMP-I TIMP1 GI_4507508-S；66.TIMP-2 TIMP2 GI_9257247-S；67.TIMP-3 TIMP3 GI_21536431-S；68.TIMP-4 TIMP4 GI_4507514-S；69.TNF-αTNF GI_25952110；70.破骨细胞抑制因子TNFRSF11BGI_22547122-S；71.VEGF VEGF GI_30172563-S；72.淋巴细胞趋化因子XCL1 GI_4506852-S.
29种蛋白无法通过抗体阵列来进行检测(名称、基因标识、基因ID)：b FGF CCL23 GI_22538807-A；MCP-4 CCL13 GI_22538799-S；TARCCCL17 GI_22538801-S；MIP-3b CCL19 GI_22165424-S；MIP-3a CCL20GI_4759075-S；MPIF-1 CCL23 GI_22538807-A；TECK CCL25GI_22538797-A；CTACK CCL27 GI_22165428-S；CCL28 CCL28GI_22538810-A；MIP-1b  CCL4 GI_4506844-S；SDF-1a CXCL12GI_40316923-1；SDF-1b CXCL12 GI_40316923-1；CXCL16 CXCL16 GIJ1545764-S；MIG CXCL9 GI_4505186-S；MIP-1a CXCR6 GI_5730105-S；IGFBP-3 IGFBP3 GI_19923 HO-S；IL-15 IL 15 GI_26787979-A；IL-4IL4GI_27477091-A；IL-5 IL5 GI_28559032-S；TNF-b LTA GI_6806892-S；MMP-2 MMP2 GI_11342665-S；MMP-8 MMP8 GI_4505220-S；NAP-2NAP1L4 GI_21327711-S；NT-3 NTF3 GI_45359869-S；NT-4 NTF5GI_34328933-S；制瘤素M OSM GI_28178862-S；TGF-b1TGFB1GI_10863872-S；LIGHT TNFSFl4 GI_25952146-A；VEGF-DVEGFD GI_19924297-S。
然而，只有3种基因产物，名为IGFBP2、TIMP1以及TIMP2也通过LC MS/MS分析得以检测，这可能是因为多种细胞因子和生长因子是小分子物质而在传统的LC MS/MS中无法进行检测。
LC MS/MS和抗体阵列分析各自所识别的132和72种基因产物具有3种共同基因，名为IGFBP2、TIMPl和TIMP2。因此，总计201种独特的基因产物得到了识别(下表E2)
Figure A20068004102000851
Figure A20068004102000861
表E2.由LC MS/MS与抗体阵列所识别的201种独特基因产物的字母顺序列表。由LC MS/MS与抗体阵列所识别的蛋白是组合的并通过它们的基因符号来表示。各种基因的转录水平利用高通量激光共聚焦微珠芯片平台(Illumina BeadArray)进行评估。
这29种名称为ENA-78，FGF-4，FGF-7，FGF-9，GCP-2，G-CSF，GM-CSF，GRO-a，HCC-4，HGF，IGFBP-I，IGFBP-2，IGFBP-4，IL-Iβ，IL-6，IL-8，IP-10，LIF，MCP-1，MCSF，MIF，破骨细胞抑制因子，PARC，PIGF，SCF，TGF-β2，TIMP-I，TIMP-2，VEGF的基因产物在之前已经被报道由源自MSCs(13、16、19-21)的成体组织来分泌。4种其它名为IGFBP3、MIP-3α、制瘤素M及TGF-β3(参照上面)的蛋白被报道由源自MSCs的成体组织所分泌，但未出现在我们的201种基因产物列表中。
实施例10.源自人ESC的MSCs(hESC-MSCs)的蛋白质组分析：通过基因组基因表达分析的验证
201种基因产物与通过把总RNA杂交结合至激光共聚焦微珠芯片平台(Illumina BeadArray)的方法所产生的hESC-MSCs全基因组表达谱进行的对比显示134种或67％的基因产物具有高于检测限(LOD)且置信度为99％(表E2)的基因转录水平。同时由LC MS/MS所识别的115种基因产物或132种基因产物的88％具有可检测的转录水平(表E2)，通过抗体阵列所识别的27种基因产物或72种基因产物中的38％具有可检测的转录水平，并且45种基因产物或72种基因产物中的38％的转录水平无法检测到(表E2)。两种基因产物的探针，ENO1B和SVEP1没有出现在Illumina BeadArray中。可能是72种基因中多数的转录水平都太低以致无法用Illumina BeadArray检测，因为已知编码细胞因子/趋化因子的mRNAs具有丰富AU的元件，该元件可以导致转录期间mRNA的迅速降解。
因此采用了更灵敏的qRT-PCR检测。随机选择了72种基因产物中的42种并进行了检测。如果用＜35的标准Ct值来定义成可检测，那么36种基因产物或者42种基因产物种的86％都具有可检测的转录水平(表E3)。该频率相当于由LC MS/MS所识别的基因产物中观测到的频率88％，而其基因转录可以通过Illumina BeadArray进行检测。此外，所有转录水平可通过Illumina BeadArray检测的15种基因产物都可以用qRT-PCR对其转录水平进行检测(表E3)。27种转率水平无法通过Illumina BeadArray进行检测的基因产物中的21种(78％)都可以利用qRT-PCR对其转录水平进行检测(表E3)。
  符号   Illumina BeadArray   标准Ct
  1.   BDNF   ＞LOD   13.38
  2.   CCL2   ＞LOD   11.28
  3.   CCL7   ＞LOD   17.35
  4.   CCL8   ＞LOD   30.28
  5.   CXCL1   ＞LOD   14.09
  6.   CXCL12   ＞LOD   16.83
  7.   CXCL5   ＞LOD   19.93
  8.   IL1A   ＞LOD   16.6
  9.   IL1B   ＞LOD   11.44
  10.   IL6   ＞LOD   18.92
  11.   IL8   ＞LOD   8.53
  12.   MIF   ＞LOD   16.23
  13.   MMP3   ＞LOD   15.96
  14.   TGFB2   ＞LOD   15.16
  15.   TNFRSF11B   ＞LOD   12.28
  16.   CCL1   ＞LOD   34.67
  17.   CCL11   ＞LOD   26.13
  18.   CCL23   ＞LOD   37.33
  19.   CCL24   ＞LOD   10.82
  20.   CCL26   ＞LOD   30.38
  21.   CCL5  ＞LOD   27.97
  22.   CSF1  ＞LOD   14.35
  23.   CSF2  ＞LOD   23.92
  24.   CSF3  ＞LOD   32.47
  25.   CX3CL1  ＞LOD   25.04
  26.   CXCL11  ＞LOD   22.38
  27.   CXCR3  ＞LOD   28.41
  28.   IL10  ＞LOD   27.4
  29.   IL12B  ＞LOD   22.17
  30.   IL13  ＞LOD   14.96
  31.   IL16  ＞LOD   32.98
  32.   IL2  ＞LOD   31.87
  33.   IL3  ＞LOD   32.24
  34.   IL7  ＞LOD   22.3
  35.   TGFB1  ＞LOD   10.63
  36.   TNF  ＞LOD   31.72
  37.   CCL15  ＞LOD   ＞35
  38.   CCL16  ＞LOD   ＞35
  39.   CXCL13  ＞LOD   ＞35
  40.   IFNG  ＞LOD   ＞35
  41.   VEGF  ＞LOD   ＞35
  42.   XCL1  ＞LOD   ＞35
表E3.定量RT-PCR检测转录产物。随机选择可为抗体阵列所识别的72种基因产物中的42种进行qRT-PCR分析。在Illumina BeadArray检测中，一种高通量全基因组表达检测，12种基因产物具有高于检测限(LOD)且置信度为99％的转录水平。每种基因的Ct值都相对于β肌动蛋白进行标准化。
实施例11.源自人ESC的MSCs(hESC-MSCs)的蛋白质组分析：由所分泌蛋白调节的生物学过程
为了研究所分泌的产物是否具有修复受伤组织或器官的潜能，基因产物首先根据其生物学过程和依照基因本体(GO)中的途径进行分类。随后，所分泌的与各种过程或途径相关的MSC基因组中独特基因的频率与用Unigene、Entrez即基因库分类的数据库中代表性途径或过程的基因频率进行了对比。与58种生物学过程和30种途径相关的基因频率明显较高(p＜0.05)。
通过基因本体分类的生物学过程受这201种独特基因产物的调节：
基因本体(GO)生物学过程  #基因(ref) ％(ref)   #基因(expt)   ％(expt) p值
  1.GO：42221：化学刺激反应   130   0.53   23   11.56   2.50E
  2.GO：42330：趋性   130   0.53   23   11.56   2.50E
  3.GO：6935：趋化性   130   0.53   23   11.56   2.50E-24
  4.GO：9605：外界刺激反应   157   0.65   24   12.06   9.45E-24
  5.GO：50896：刺激反应   158   0.650   24   12.06   1.11E-23
  6.GO：9628：非生物性刺激反应   150   0.62   23   11.56   7.83E-23
  7.GO：48513：器官发育   116   0.48   11   5.53   3.06E-09
  8.GO：7275：发育   827   3.40   23   11.56   3.27E-07
  9.GO：16052：碳水化合物分解代谢   51   0.21   6   3.02   3.66E-06
  10.GO：19320：己糖分解代谢   51   0.21   6   3.02   3.66E-06
  11.GO：44248：细胞分解代谢   51   0.21   6   3.02   3.66E-06
  12.GO：44265：细胞大分子分解代谢   51   0.21   6   3.02   3.66E-06
  13.GO：44275：细胞碳水化合物分解代谢   51   0.21   6   3.02   3.66E-06
  14.GO：46164：乙醇分解代谢   51   0.21   6   3.02   3.66E-06
  15.GO：46365：单糖分解代谢   51   0.21   6   3.02   3.66E-06
  16.GO：6007：葡萄糖分解代谢   51   0.21   6   3.02   3.66E-06
  17.GO：6096：糖酵解   51   0.21   6   3.02   3.66E-06
  18.GO：9057：大分子分解代谢   51   0.21   6   3.02   3.66E-06
  19.GO：9056：代谢   53   0.22   6   3.02   4.60E-06
  20.GO：15980：有机物氧化的能量产生   65   0.27   6   3.02   1.53E-05
  21.GO：19318：己糖代谢   65   0.27   6   3.02   1.53E
  22.GO：44262：细胞碳水化合物代谢   65   0.27   6   3.02   1.53E
  23.GO：5975：碳水化合物代谢   65   0.27   6   3.02   1.53E
  24.GO：5996：单糖代谢   65   0.27   6   3.02   1.53E
  25.GO：6006：葡萄糖代谢   65   0.27   6   3.02   1.53E
  26.GO：6066：乙醇代谢   65   0.27   6   3.02   1.53E
  27.GO：6091：前体代谢和能量的产生   65   0.27   6   3.02   1.53E
  28.GO：6092：碳水化合物代谢的主要途径   65   0.27   6   3.02   1.53E
  29.GO：43170：大分子代谢   571   2.35   16   8.04   2.03E-05
  30.GO：1525：血管新生   44   0.18   5   2.51   2.90E-05
  31.GO：1568：血管生长   47   0.19   5   2.51   4.02E-05
  32.GO：1944：脉管生长   47   0.19   5   2.51   4.02E-05
  33.GO：48514：血管形态生成   47   0.19   5   2.51   4.02E-05
  34.GO：6950：应激反应   10   0.04   3   1.51   6.18E-05
  35.GO：9611：创伤反应   10   0.04   3   1.51   6.18E-05
  36.GO：1660：发烧   2   0.01   2   1.01   6.64E-05
  37.GO：31649：热生成   2   0.01   2   1.01   6.64E-05
  38.GO：43207：外部生物刺激响应   2   0.01   2   1.01   6.64E-05
  39.GO：6952：防御性反应   2   0.01   2   1.01   6.64E-05
  40.GO：6954：炎症反应   2   0.01   2   1.01   6.64E-05
  41.GO：6955：免疫反应   2   0.01   2   1.01   6.64E-05
  42.GO：9607：生物刺激反应   2   0.01   2   1.01   6.64E-05
43.GO：9613：对害虫，病原菌或者寄生虫的反应 2   0.01 2   1.01   6.64E-05
  44.GO：9887：器官形态生成   53   0.22   5   2.51   7.23E-05
  45.GO：1659：体温调节   3   0.01   2   1.01   1.98E-04
  46.GO：30097：造血   26   0.11   3   1.51   1.22E-03
  47.GO：48534：造血或淋巴器官发育   26   0.11   3   1.51   1.22E-03
  48.GO：1501：骨骼发育   38   0.16   3   1.51   3.67E-03
  49.GO：1503：骨化   38   0.16   3   1.51   3.67E-03
  50.GO：31214：生物矿物生成   38   0.16   3   1.51   3.67E-03
  51.GO：46849：骨重建   38   0.16   3   1.51   3.67E-03
  52.GO：6793：磷代谢   13   0.05   2   1.01   4.88E-03
  53.GO：6796：磷酸盐代谢   13   0.05   2   1.01   4.88E-03
  54.GO：9888：组织发育   54   0.22   3   1.51   9.82E-03
  55.GO：45045：分泌途径   34   0.14   2   1.01   3.14E-02
  56.GO：6887：细胞外排   34   0.14   2   1.01   3.14E-02
  57.GO：46903：分泌   36   0.15   2   1.01   3.49E-02
  58.GO：1570：血管生成   5   0.02   1   0.50   4.02E-02
  GO途径   p值
  1.细胞因子受体相互作用   4.97E-47
  2.ECM-受体相互作用   3.21E-17
  3.Jak-STAT信号通路   1.19E-10
  4.MAPK信号通路   1.19E-08
  5.Toll样受体信号通路   1.34E-05
  6.TGF-β信号通路   0.000292
  7.mTOR信号通路   0.0143
  8.Fc epsilon RI信号通路   0.00267
  9.上皮细胞在幽门螺杆菌感染中的信号   0.0183
  10.细胞通讯   1.17E-17
  11.间隙连接   0.00077
  12.紧密连接   0.0459
  13.黏着   1.54E-21
  14.微丝骨架调节   2.65E-13
  15.白细胞迁移   3.88E-05
  16.补体和血栓形成   0.0488
  17.抗原的形成和出现   0.0102
  18.细胞凋亡   0.00648
  19.T细胞受体信号通路   0.000866
  20.造血细胞系   3.32E-14
  21.I型糖尿病   4.60E-06
  22.固碳   0.000257
  23.糖酵解和糖原异生   0.00106
  24.二苯乙烯，香豆素和木质素   0.00348
  25.苯丙氨酸代谢   0.00488
  26.苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成   0.00567
  27.甲烷代谢   0.00739
  28.磷酸盐还原循环(CO固定)   0.00739
  29.肌醇代谢   0.0163
  30.柠檬酸循环(TCA循环)   0.0404
这58种生物学过程可能接近于3个主要的组：代谢、防御性反应以及组织分化，同时30种途径可能广泛地分成几类：受体结合、信号传导、细胞-细胞间作用、细胞迁移、免疫响应以及代谢(图8、图9)。推定的生物学过程和途径都提示所分泌的蛋白对调节能量产生的细胞代谢、细胞分解、大分子生物合成及分泌、消除损毁组织及产生新组织所必须的过程有较大影响(图8、图9)。
与MSC合成培养基中细胞因子和趋化因子的大量出现并占据优势地位相一致，分析也预测到所分泌的因子可能引起多种依赖于外部刺激的细胞响应例如趋化现象、趋性和多种免疫响应(图8)。注意，该合成培养基也能诱导对组织分化尤其是促进血管形成、造血和骨生长来说是重要的生物学过程(图8)。在那些被预测通过所分泌的蛋白质组进行调节的途径中，受体介导的细胞因子结合以及ECM途径与所分泌蛋白质组中的细胞因子和ECM成分相符(图9)。能被所分泌的蛋白质组所激活的主要信号传导途径包括Jak-STAT信号途径、MAPK信号途径、Toll样受体信号途径、TGF-β信号途径、mTOR信号途径、FcεRI信号途径和幽门螺杆菌感染中上皮细胞信号途径。分泌蛋白质组的计算机分析也提示MSC分泌能够加强细胞-细胞间的相互作用、迁移及免疫响应。
实施例12.源自人ESC的MSCs(hESC-MSCs)的蛋白质组分析：讨论
MSCs已经用于临床前和临床试验中以治疗众多疾病(3-5，24-27)。然而，作用机制仍旧没有得到准确地了解。虽然MSCs具有分化成多种细胞类型的潜能，例如能潜在地修复或再生损毁组织的内皮细胞、心肌细胞凋亡(cardiomyctes)、软骨细胞，由于MSCs的分化效率通常太低而无法介导组织修复或恢复组织功能，因而MSCs的治疗作用不能单独受源自MSC的修复性细胞类型。MSCs的某些治疗性作用可以通过MSCs(8)所分泌的旁分泌因子来介导。我们在此通过组合两种技术，LC-LC-MS和抗体阵列描述了所分泌的hESC-MSCs蛋白质组的组成。
虽然通过LC-LC-MS进行的鸟枪法(shot-gun)蛋白质组分析是一种灵敏的技术且具有高通量的能力，但是其无法检测包括多数细胞因子、趋化因子和生长因子在内的小分子蛋白/肽。这种情况通过利用抗体阵列而得以部分缓解。采用这两种技术所获得的MCS分泌蛋白质的定性表达谱具有较高重复性。LC MS/MS所识别的蛋白出现在两个独立制备的几批CM中，同时那学通过抗体阵列得以识别的蛋白质则出现在4种独立制备的几批CM中的至少3种当中。所获的hESC-MSCs分泌蛋白表达谱几乎包括所有之前所报道的源自成体组织的MSCs所分泌的因子，同样还包括许多其它尚未公开的蛋白。蛋白质高水平表达通过采用高通量微阵列基因表达分析法对蛋白质表达谱中86％-88％基因产物的转录产物所进行检测得到进一步证实。
为了评价和估计MSC进行大规模分泌的前者性能，我们利用较易获得的计算机工具对基因表达进行了分析，其基于基因产物而非基于后转录修饰蛋白。与细胞因子和趋化因子在分泌过程中大量出现并占据优势地位相符的，计算机分析预测了诸如趋化现象、趋性、细胞对外部刺激的响应、细胞分解、大分子物质的生物合成及分泌、细胞因子-细胞因子受体相互间作用、细胞-细胞关联以及基础代谢例如葡萄糖代谢和氨基酸代谢之类通常与细胞因子及趋化因子相关的多种过程和途径。本文所描述的MSCs能够用于治疗这些功能在其中起到一定作用的疾病。
虽然这些过程和途径对任何特定细胞或组织类型中的受伤、修复以及再生过程而言并不是特异性的，但是它们的促进免疫细胞迁移至受伤组织，细胞代谢中ECM的重塑和增加将对大多数受伤或患病组织产生缓解作用。
除了这些与细胞因子和趋化因子相关的基因途径外，计算机分析也预测到所分泌的蛋白调节包括血管形成、造血和骨生长的多种过程(3-5，24-27)。途径分析进一步揭示了可能涉及介导MSCs的某些缓解作用的候选途径。实际上，这些候选途径多数都已经在血管形成、造血以及肌骨骼生物学。例如，Jak-STAT信号与保护作用(28)、造血(29，30)、以及骨胳修复和重塑(31，32)；MAPK信号则在心血管响应(33，34)、骨骼修复和重塑(32，35)以及造血作用(36)中扮演重要角色；Toll样受体信号已涉及心血管病理学的开始和进展过程及先天与获得性免疫(38)当中；TGF-β信号对正确的心脏发育、心脏重塑、心力衰竭与血管形成(39-41)过程、造血作用(42)、骨骼与软骨的形成及重塑(27，43)以及一般性伤口的愈合(44)而言是关键性的；并且mTOR作为重要的细胞生长及分化调节因子其在正常的生理机能和疾病中扮演了非特异性但是关键的角色(45-47)。
总之，我们对源自hESC的MSCs中分泌的蛋白质，包括已报道成体组织的MSCs所分泌的多种细胞因子在内，所进行的分析提示所分泌蛋白质组能够潜在地对组织修复和再生尤其是对心脏血管、造血以及肌骨骼组织的修复和再生产生调节作用，从而为MSC移植研究中MSC所介导的对组织修复和再生的缓解作用提供了分子学支持。该分泌的蛋白质组也揭示了多种可进行较好检验的MSC介导组织修复分子机理假设且也揭示了调节组织修复与再生的潜在药物作用靶点。源自hESC的MSCs和成体组织MSCs之间的明显相似性提示任一MSC培养物的合成培养基都可能具有类似的生物学活性。
由此，这表明通过我们的方法所获取MSCs与源自的骨髓类似物具有显著的生物学相似性。这些发现阐述了hESC-MSCs与成体BM-MSCs在其分泌缓解因子的能力方面具有共同指出。进一步地，本文所示MSCs所分泌的一种或多种蛋白质，包括合成培养基形式，可以用于和本文所述MSCs相同的目的。
然而，hESC-MSCs与成体组织MSCs相比具有几大有点。把hESC细胞系用作MSC的组织来源构成了可无限更新与扩增的组织来源，并加强了MSCs制备批次之间的重复性和一致性，由此获得了临床适用的CM。它也提升了CM制备的可测量性及研发低成本off-the-shelf疗法的潜力。此外，用于制备hESC-MSC CM的不含血清的化学合成培养基减少了令人生厌且多样化的与诸如血清或血清替代介质等相关的复杂培养基添加剂的污染。因此，我们对CM的阐述与基于MSC的生物制剂转向临床应用十分相关。
实施例13.58种生物学过程中每个过程所涉及的201个基因的列表
Figure A20068004102000941
Figure A20068004102000942
Figure A20068004102000952
Figure A20068004102000953
Figure A20068004102000954
Figure A20068004102000955
Figure A20068004102000956
Figure A20068004102000957
Figure A20068004102000961
Figure A20068004102000962
Figure A20068004102000963
Figure A20068004102000964
Figure A20068004102000965
Figure A20068004102000966
Figure A20068004102000971
  防御性反应
  GI_27894305-S IL1B  β白细胞介素1
  GI_27894329-S IL1A  α白细胞介素1
  生长
  GI_42716312-S ANG   血管生成素，核糖核酸酶，RNase A家族，5
  GI_5902810-A BMP1   骨形态发生蛋白1
  GI_27262662-A CDH11   OB-钙粘素2型钙粘素11(成骨细胞)
  GI_2726662-A CSF 1   集落刺激因子1(巨噬细胞)
  GI_27437029-A CSF2   集落刺激因子2(粒细胞-巨噬细胞)
  GI_27437048-A CSF3   集落刺激因子3(粒细胞)
  GI_34222286-S CYR61   富含半胱氨酸血管生成诱导剂，61
  GI_24430140-A FBN1   原纤维蛋白1(Marfan综合征)
  GI_4755135-S FBN2   原纤维蛋白2(先天性挛缩性蜘蛛样指)
  GI_10337586-S FGF6   成纤维细胞生长因子6
  GI_24430216-S IL10   白细胞介素10
  GI_28610153-S IL8   白细胞介素8
  GI_11321596-S KDR  插入激酶结构域受体(III型受体酪氨酸激酶)
  GI_4580419-A KITLG   KIT配体
  GI_6006018-S LIF   白血病抑制因子(胆碱能分化因子)
  GI_7262388-S PCOLCE   前胶原C-内肽酶增强子
  GI_4507170-S SPARC   富半胱氨酸的酸性分泌蛋白(骨连接蛋白)
  GI_10863872-S TGFB1   β1转化生长因子(进行性骨干发育不全)
  GI_4507470-S TGFBR3   B受体III转化生长因子(β聚糖，300kDa)
  GI_40317625-S THBS1   血小板反应素1
  GI_40805871-S THPO  血小板生成素(骨髓增殖性白血病病毒癌基因配体，巨核细胞生长和生长因子)
  GI_4507508-S TIMP1   TIMP金属蛋白酶抑制因子1
  GI_30172563-S VEGF   血管内皮生长因子
Figure A20068004102000983
Figure A20068004102000984
Figure A20068004102000991
Figure A20068004102000992
Figure A20068004102000993
Figure A20068004102000994
Figure A20068004102000995
Figure A20068004102000997
Figure A20068004102001001
Figure A20068004102001002
Figure A20068004102001003
Figure A20068004102001004
Figure A20068004102001005
Figure A20068004102001012
Figure A20068004102001013
Figure A20068004102001014
Figure A20068004102001016
Figure A20068004102001017
Figure A20068004102001021
Figure A20068004102001022
Figure A20068004102001023
Figure A20068004102001024
Figure A20068004102001025
Figure A20068004102001031
Figure A20068004102001032
Figure A20068004102001041
Figure A20068004102001043
Figure A20068004102001044
Figure A20068004102001051
Figure A20068004102001052
Figure A20068004102001053
Figure A20068004102001054
Figure A20068004102001055
Figure A20068004102001062
Figure A20068004102001064
实施例14.30种途径种每个途径所涉及的201个基因的列表
Figure A20068004102001065
Figure A20068004102001071
Figure A20068004102001072
Figure A20068004102001073
Figure A20068004102001081
Figure A20068004102001092
Figure A20068004102001093
Figure A20068004102001094
Figure A20068004102001102
Figure A20068004102001111
Figure A20068004102001121
Figure A20068004102001131
Figure A20068004102001141
Figure A20068004102001151
实施例15.实施例7-14的参考文献
1.Le Blanc，K.，and Pittenger，M.(2005)Cytotherapy 7，36-45。
2.Reiser，J.，Zhang，X.Y.，Hemenway，C.S.，Mondal，D.，Pradhan，L.，and La Russa，V.F.(2005)Expert Opin Biol Ther 5，1571-1584
3.Hui，J.H.，Ouyang，H.W.，Hutmacher，D.W.，Goh，J.C，and Lee，E.H.(2005)Ann Acad Med Singapore 34，206-212
4.Caplan，A.I.(2005)Tissue Eng 11，1198-1211
5.Menasche，P.(2005)Curr Opin MoI Ther 7，293-299
6.Laflamme，M.A.，and Murry，C.E.(2005)Nat Biotechnol 23，845-856
7.Kinnaird，T.，Stabile，E.，Burnett，M.S.，Shou，M.，Lee，C.W.，Barr，S.，Fuchs，S.，and Epstein，S.E.(2004)Circulation 109，1543-1549
8.Caplan，A.L，and Dennis，J.E.(2006)J Cell Biochem
9.Leedham，S.J.，Brittan，M.，McDonald，S.A.，and Wright，N.A.(2005)J Cell MoI Med 9，11-24
10.Togel，F.，Hu，Z.，Weiss，K.，Isaac，J.，Lange，C，and Westenfelder，C.(2005)Am J Physiol Renal Physiol 289，F31-42.
11.Patschan，D.，Plotkin，M.，and Goligorsky，M.S.(2006)Curr OpinPharmacol 6，176-183.
12.Miyahara，Y.，Nagaya，N.，Kataoka，M.，Yanagawa，B.，Tanaka，K.，Hao，H.，Ishino，K.，Ishida，H.，Shimizu，T.，Kangawa，K.，Sano，S.，Okano，T.，Kitamura，S.，and Mori，H.(2006)Nat Med 12，459-465.
13.Gnecchi，M.，He，H.，Noiseux，N.，Liang，O.D.，Zhang，L.，Morello，F.，Mu，H.，MeIo，L.G.，Pratt，R.E.，Ingwall，J.S.，and Dzau，V.J.(2006)Faseb J 20，661-669.
14.Gnecchi，M.，He，H.，Liang，O.D.，MeIo，L.G.，Morello，F.，Mu，H.，Noiseux，N.，Zhang，L.，Pratt，R.E.，Ingwall，J.S.，and Dzau，V.J.(2005)NatMed 11，367-368.
15.Mayer，H.，Bertram，H.，Lindenmaier，W.，Korff，T.，Weber，H.，andWeich，H.(2005)J Cell Biochem 95，827-839.
16.Nakagami，H.，Maeda，K.，Morishita，R.，Iguchi，S.，Nishikawa，T.，Takami，Y.，Kikuchi，Y.，Saito，Y.，Tamai，K.，Ogihara，T.，and Kaneda，Y.(2005)Arterioscler Thromb Vase Biol 25，2542-2547
17.Van Overstraeten-Schlogel，N.，Beguin，Y.，and Gothot，A.(2006)Eur J Haematol 76，488-493
18.Cheng，L.，Qasba，P.，Vanguri，P.，and Thiede，M.A.(2000)J CellPhysiol 184，58-69
19.Liu，C.H.，and Hwang，S.M.(2005)Cytokine 32，270-279
20.Haynesworth，S.E.，Baber，M.A.，and Caplan，A.I.(1996)J CellPhysiol 166，585-592
21.Kinnaird，T.，Stabile，E.，Burnett，M.S.，and Epstein，S.E.(2004)Circ Res 95，354-363
22.Barreau，C，Paillard，L.，and Osborne，H.B.(2005)Nucleic AcidsRes 33，7138-7150.
23.Espel，E.(2005)Semin Cell Dev Biol 16，59-67
24.Bhatia，R.，and Hare，J.M.(2005)Congest Heart Fail 11，87-91；quiz92-83
25.Mauney，J.R.，Volloch，V.，and Kaplan，D.L.(2005)Tissue Eng 11，787-802
26.Zimmet，J.M.，and Hare，J.M.(2005)Basic Res Cardiol 100，471-481
27.Lin，Z.，Willers，C，Xu，J.，and Zheng，M.H.(2006)Tissue Eng
28.Negoro，S.，Kunisada，K.，Tone，E.，Funamoto，M.，Oh5 H.，Kishimoto，T.，and Yamauchi-Takihara，K.(2000)Cardiovasc Res 47，797-805
29.Ward，A.C，Touw，L，and Yoshimura，A.(2000)Blood 95，19-29
30.Ungureanu，D.，and Silvennoinen，O.(2005)Sci STKE 2005，pe49
31.Blair，H.C，Robinson，L.J.，and Zaidi，M.(2005)Biochem BiophysRes Commun 328，728-738
32.Malemud，C.J.(2004)Clin Orthop Relat Res，S145-151
33.Nigro，J.，Osman，K，Dart，A.M.，and Little，P.J.(2006)Endocr Rev27.242-259.
34.Pandya，N.，Santani，D.，and Jain，S.(2005)Cardiovasc Drug Rev 23，247-254.
35.Berenbaum，F.(2004)Curr Opin Rheumatol 16，616-622.
36.Platanias，L.C.(2003)Blood 101，4667-4679.
37.de Kleijn，D.，and Pasterkamp，G.(2003)Cardiovasc Res 60，58-67.
38.Ozato，K.，Tsujimura，H.，and Tamura，T.(2002)BiotecliniquesSuppl，66-68，70，72passim.
39.Euler-Taimor，G.，and Heger，J.(2006)Cardiovascular Research 69，15-25.
40.Bertolino，P.，Deckers，M.，Lebrin，F.，and ten Dijke，P.(2005)Chest128，585S-590S.
41.Bobik，A.(2006)Arterioscler Thromb Vase Biol.
42.Ruscetti，F.W.，Akel，S.，and Bartelmez，S.H.(2005)Oncogene 24，5751-5763.
43.Janssens，K.，ten Dijke，P.，Janssens，S.，and Van HuI，W.(2005)Endocr Rev 26，743-774.
44.Faler，B.J.，Macsata，R.A.，Plummner，D.，Mishra，L.，and Sidawy，A.N.(2006)Perspect Vase Surg Endovasc Ther 18，55-62.
45.Wullschleger，S.，Loewith，R.，and Hall，M.N.(2006)Cell 124，471-484.
46.Proud，C.G.(2004)Cardiovasc Res 63，403-413.
47.Tee，A.R.，and Blenis，J.(2005)Semin Cell Dev Biol 16，29-37
一般性参考文献
1.Le Blanc，K.& Pittenger，M.Mesenchymal stem cells：progresstoward promise.Cytotherapy 7，36-45(2005).
2.Xu，C.et al.Immortalized fibroblast-like cells derived from humanembryonic stem cells support undifferentiated cell growth.Stem Cells 22，972-80(2004).
3.Barberi，T.，Willis，L.M.，Socci，N.D.& Studer，L.Derivation ofmultipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells.PLoS Med 2，e161(2005).
4.van den Bos，C.et al.Human mesenchymal stem cells respond tofibroblast growth factors.Hum Cell 10，45-50(1997).
5.Kilian，O.et al.Effects of platelet growth factors on humanmesenchymal stem cells and human endothelial cells in vitro.Eur J Med Res9，337-44(2004).
6.Cowan，CA.et al.Derivation of embryonic stem-cell lines fromhuman blastocysts.N Engl J Med 350，1353-6(2004).
7.Thomson，J.A.et al.Embryonic Stem Cell Lines Derived from HumanBlastocysts.Science 282，1145-1147(1998).
8.Que，J.et al.Generation of hybrid cell lines with endothelial potentialfrom spontaneous fusion of adult bone marrow cells with embryonicfibroblast feeder.In Vitro Cell Dev Biol Anim 40，143-9(2004).
9.Javazon，E.H.，Beggs，K.J.& Flake，A.W.Mesenchymal stem cells：paradoxes of passaging.Exp Hematol 32，414-25(2004).
10.Barry，F.P.& Murphy，J.M.Mesenchymal stem cells：clinicalapplications and biological characterization.Int J Biochem Cell Biol 36，568-84(2004).
11.Majumdar，M.K.et al.Characterization and functionality of cellsurface molecules on human mesenchymal stem cells.J Biomed Sci 10，228-41(2003).
12.Rosen，E.D.The transcriptional basis of adipocyte development.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 73，31-4(2005).
13.Okazaki，K.& Sandell，L.J.Extracellular matrix gene regulation.Clin Orthop Relat Res，S 123-8(2004).
14.Barreau，C，Paillard，L.& Osborne，H.B.AU-rich elements andassociated factors：are there unifying principles？Nucleic Acids Res 33，7138-50(2005).
15.Espel，E.The role of the AU-rich elements of mRNAs in controllingtranslation.Semin Cell Dev Biol 16，59-67(2005).21
16.Gerstenfeld，L.C.& Shapiro，F.D.Expression of bone-specific genesby hypertrophic chondrocytes：implication of the complex functions of thehypertrophic chondrocyte during endochondral bone development.J CellBiochem 62，1-9(1996).
17.Knott，L.& Bailey，AJ.Collagen cross-links in mineralizing tissues：a review of their chemistry，function，and clinical relevance.Bone 22，181-7(1998).
18.Su，B.& Karin，M.Mitogen-activated protein kinase cascades andregulation of gene expression.Curr Opin Immunol 8，402-11(1996).
19.Torres，M.& Forman，HJ.Redox signaling and the MAP kinasepathways.Biofactors 17，287-96(2003).
20.Matsukawa，J.，Matsuzawa，A.，Takeda，K.& Ichijo，H.TheASK1-MAP kinase cascades in mammalian stress response.J Biochem(Tokyo)136，261-5(2004).
21.Sekine，Y.，Takeda，K.& Ichijo，H.The ASK1-MAP Kinase Signalingin ER Stress and Neurodege-nerative Diseases.Curr MoI Med 6，87-97(2006).
22.Cai，J.et al.Assessing self-renewal and differentiation in hESC lines.Stem Cells(2005).
23.Reubinoff，B.E.，Pera，M.F.，Fong，C.Y.，Trounson，A.& Bongso，A.Embryonic stem cell lines from human blastocysts：somatic differentiation invitro.Nat Biotechnol 18，399-404(2000).
24.Lim，S.C.& Oh，S.H.The role of CD24 in various human epithelialneoplasias.Pathol Res Pract 201，479-86(2005).
25.Bhatia，R.& Hare，J.M.Mesenchymal stem cells：future source forreparative medicine.Congest Heart Fail 11，87-91；quiz 92-3(2005).
26.Pittenger，M.F.et al.Multilineage potential of adult humanmesenchymal stem cells.Science 284，143-147(1999).
27.Damjanov，L，Damjanov，A.& Softer，D.Production ofteratocarcinomas from embryos transplanted to extra-uterine sites，inTeratocarcinomas and embryonic stem cells：a practical approach，(ed.Robertson，EJ.)1-17(IRL Press Limited，Oxford，1987).
28.Yin，Y.et al.AFP(H-)，ESC-Derived Cells Engraft and Differentiateinto Hepatocytes in Vivo.Stem Cells 20，338-346(2002).
本文所提到的每份申请和专利，和上述各份申请和专利包括所述各份申请和专利的诉讼中引用或参考的文件(申请所引用的文献)以及在各份申请和专利及申请所引用文件中所引用或提及的任何产品厂商说明书或目录表，在此都以参考的方式结合在本文中。进一步地，本文所引用的所有文件以及本文引用文件中所引用或参考的所有文件以及本文所提及或引用的任何产品的任何厂商说明书或目录表，在此都以参考的方式结合在本文中。
对本发明的方法和系统所作的各种修改或变型对本领域技术人员而言是显而易见的且不会脱离本发明的范围和实质。虽然已经联系特定优选实施方式对本发明作了描述，但是应当理解如权利要求的那样本发明不应当被过度地限制于这些特定实施方式中，此外在本发明范围内可以对所述实施方式作出各种修改和增加。当然，为了实施本发明而对所述实施方式作出的对分子生物学及相关领域技术人员所作出的各种修改都落在权利要求的保护范围之内。进一步地，可以在不脱离本发明范围的情况下对下述独立权利要求的特征进行各种组合。

Claims (54)

1、一种获取间质干细胞(MSC)的方法，该方法包括通过分散胚胎干细胞(ES)集落，或者其子代细胞，并在没有共培养物的情况下在不含血清而含有FGF2的培养基中进行增殖。
2、根据权利要求1的方法，其特征在于，胚胎干细胞集落为人胚胎干细胞集落(hESC)。
3、根据权利要求1或2的方法，其特征在于，胚胎干细胞集落用胰蛋白酶进行分散。
4、根据权利要求1、2或3的方法，其特征在于，该方法包括在把细胞移植出去之前用胰蛋白酶分散铺满培养板中的人胚胎干细胞(hESC)。
5、根据任何前述权利要求的方法，其特征在于，没有共培养物的情况包括在没有细胞饲养层的情况下对细胞进行培养。
6、根据任一前述权利要求的方法，其特征在于，细胞在培养物基质上进行增殖。
7、根据任一前述权利要求的方法，其特征在于，培养基质包括明胶铺底的平板。
8、根据任一前述权利要求的方法，其特征在于，不含血清的培养基包括浓度约为5ng/ml的FGF2。
9、根据任一前述权利要求的方法，其特征在于，不含血清的培养基进一步包括PDGF AB，优选浓度约为5ng/ml。
10、根据任一前述权利要求的方法，其特征在于，不含血清的培养基中添加了血清替换介质。
11、根据任一前述权利要求的方法，其特征在于，在融合时通过胰蛋白酶消化细胞以1∶4的比例分裂。
12、根据任一前述权利要求的方法，其特征在于，进一步包括从基于细胞表面标记物表达的经增殖的细胞中选择间质干细胞的步骤。
13、根据权利要求12的方法，其特征在于，通过选择高表达一种或多种下列表面标记物的细胞来从选择间质干细胞：ANPEP(CD13；LAP1；PEPN；gp150：NM_001150.1)；ENG
(END；ORW；HHT1；ORW1；CD105：NM_000118.1)；SCN9A(PN1；NE-NA：NM_002977.1)；TRPV2(VRL；VRL1；VRL-；MGC12549：NM_06113.3)；RAMP1(：NM_005855.1)；F2RL2(PAR3：NM_004101.2)；NTSR1(NTR：NM_002531.1)；GABRA2(：NM_000807.1)；SLC16A4(MCT4：NM_004696.1)；ITGA4(CD49D：NM_000885.2)；NCAM2(NCAM21；MGC51008：NM_004540.2)；I11R1(P80；IL1R；IL1RA；CD121A；D2S1473；IL-1R-α：NM_000877.2)；PDGFRA
(CD140A；PDGFR2：NM_006206.2)；
VCAM1(INCAM-100：NM_080682.1)；SSFA2(CS1；CS-；KRAP；SPAG13；KIAA1927：M_006751.3)；TRHDE(PAP-II：NM_013381.1)；EDG2(LPA1；edg-2；vzg-1；Gpcr26；Mrec1.3；rec.1.3：NM_001401.3)；NT5E(eN；NT5；NTE；eNT；CD73；E5NT：NM_002526.1)；以及
FLRT2(KIAA0405：NM_013231.2)；FAP(FAPA；DPPIV；SEPRASE：M_004460.2)。
14、根据权利要求12或13的方法，其特征在于，表明标记物包括CD105(登录号NM_000118.1)。
15、根据权利要求12或13的方法，其特征在于，表面标记物包括CD73(登录号NM_002526.1)。
16、根据权利要求12-15中的任一权利要求的方法，其特征在于，通过选择高表达一种或多种下列表面标记物的细胞来获取间质干细胞：
ITGB 1BP3(MIBP：NM_014446.1)；PTPRZ1
(PTPZ；HPTPZ；PTP18；PTPRZ；RPTPB：NM_002851.1)；CNTN1(F3；GP135：NM_75038.1)；PCDH1(PC42；PCDH42；MGC45991：NM_002587.3)；
PODXL(PCLP；Gp200：NM_005397.2)；GPR64(HE6；TM7LN2：NM_005756.1)；PROM1(AC133；CD133；PROML1：NM_006017.1)；
GPRC5C(RAIG3；RAIG-3：NM 022036.2)；
CD24(CD24A：NM 013230.1)；CLDN3(RVP1；HRVP1；CPE-R2；CPETR2：NM_001306.2)；TACSTD1
(EGP；KSA；M4S1；MK-1；EGP40；MIC 18；TROP1；Ep-CAM；hEGP-2；CO17-1A；GA733-2：NM_002354.1)；HTR3A(HTR3：NM_000869.1)；FGFR4
(TKF；JTK2：NM_022963.1)；ADCY1(：NM_021116.1)；FGFR3
(ACH；CEK2；JJTK4；HSFGFR3EX：NM_022965.1)；IL17RB
(CRL4；EVI27；IL17BR；IL17RH1；MGC5245：NM_018725.2)；
SORL1(LR11；LRP9；SORLA；gp250；SorLA-1：NM_003105.3)；GPM6B(M6B：NM_005278.2)；KCNS3(KV9.3；MGC9481：NM_002252.3)；以及FZD3(Fz-3；hFz3：NM_017412.2)。
17、根据权利要求12-16中任一所述的方法，其特征在于，表明标记物包括CD24(登录号NM_013230.1)。
18、根据权利要求12-17中任一所述的方法，其特征在于，通过选择CD105+、CD24-的细胞来获得间质干细胞。
19、根据权利要求12-17中任一所述的方法，其特征在于，通过用抗表面抗原的抗体标记细胞的方法来选择间质干细胞。
20、根据权利要求12-19中任一所述的方法，其特征在于，通过荧光激活的细胞挑选法(FACS)来选择间质干细胞。
21、根据任一前述权利要求的方法，其特征在于，这些细胞的传代超过少于35代。
22、根据任一前述权利要求的方法，其特征在于，这些细胞被增殖约14天，优选增殖约7天。
23、根据任一前述权利要求的方法，其特征在于，胚胎干细胞(hESC)集落包括huES9集落。
24、根据任一前述权利要求的方法，其特征在于，胚胎干细胞(hESC)集落包括H1 ESC集落。
25、根据任一前述权利要求的方法，其特征在于，所获得的间质干细胞(MSC)展现出表面抗原表达谱，所述抗原是下列一种或多种，优选所有的抗原：CD29+、CD44+、CD49a及e+、CD105+、CD166+和CD34-、CD45-。
26、根据任一前述权利要求的方法，其中所获得的间质干细胞(MSC)表现出HESX1、POUFL5、SOX-2、UTF-1和ZFP42中一种或多种，优选全部，表达减小。
27、根据任一前述权利要求的方法，其特征在于，所获得的间质干细胞(MSC)表现出OCT4、NANOG和SOX2中的一种或多种，优选全部，表达减小。
28、根据任一前述权利要求的方法，其特征在于，所获得的间质干细胞(MSC)表现出无法检测到的碱性磷酸酶活性。
29、根据任一前述权利要求的方法，其特征在于，所获得的间质干细胞(MSC)如果被移植到SCID鼠中，其不会形成畸胎瘤。
30、根据任一前述权利要求的方法，其特征在于，所获得的细胞培养物是鼠特异性c-mos重复序列阴性的而人特异性alu重复序列则为阳性。
31、根据任一前述权利要求的方法，其特征在于，所获得的间质干细胞(MSC)能够经受骨生成、脂肪生成或软骨形成，优选能够分化成骨细胞、脂肪或软骨。
32、根据任一前述权利要求的方法，其特征在于，所获得的细胞培养物包含huES9.E1、huES9.E3或H1.E2。
33、根据任一前述权利要求的方法，其特征在于，任何两种或更多种，优选全部，间质干细胞都通过展示基本一致的基因表达谱的方法来进行选择
34、根据任一前述权利要求的方法，其特征在于，通过该方法所获得的任何两种或更多种间质干细胞分离物之间的基因表达相关系数高于0.9。
35、根据任一前述权利要求的方法，其特征在于，任何两种或更多种，优选全部，通过该方法所获得的间质干细胞分离物彼此之间基本类似或相同(优选同源)。
36、根据任一前述权利要求，其特征在于，利用该方法所获得的间质干细胞与亲代培养物细胞之间的基因表达相关系数高于0.8。
37、一种获得间质干细胞系的方法，该方法包括实施根据任一前述权利要求的方法，然后从所选细胞中获得细胞系。
38、一种获得间质干细胞系的方法，该方法包括通过根据权利要求1-36中任一者所述方法获得的间质干细胞，或者通过权利要求37所述方法获得的间质干细胞，并分化细胞培养物、间质干细胞或间质干细胞系。
39、根据权利要求38所述方法，其中分化间质细胞是骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞。
40、能利用任一前述权利要求的方法来获得的细胞或细胞系。
41、从胚胎干细胞中获得细胞培养的方法，该方法包括：(a)提供胚胎干细胞集落；(b)分散hESC集落；(c)对分散的细胞进行增殖：(i)不存在饲养层(ii)不含血清但存在有FGF2；以及(d)随后获得细胞培养物。
42、权利要求41所述的方法，其进一步包括权利要求1-36中任一者所述的特征。
43、一种疾病治疗方法，该方法包括获得权利要求1-39中任一所述的间质干细胞、间质干细胞系或分化间质干细胞，可以视情况而定地从间质干细胞或间质肝细胞系中获得分化细胞，并对患者施用该间质干细胞、间质干细胞系或分化细胞。
44、可用权利要求1-39任一所述方法获得的间质干细胞、间质干细胞系或已分化间质干细胞在制备治疗或者防治个体中所患疾病的药物中的应用。
45、一种药物组合物，其包括可用权利要求1-39任一所述方法获得的间质干细胞、间质干细胞系或分化间质干细胞，连同药学可接受的赋形剂或载体。
46、根据权利要求43或44所述方法，其中所述疾病从由以下物质所构成组中选择：心力衰竭、骨髓疾病、皮肤病、烧伤以及诸如糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病等退行性疾病以及癌症。
47、合成细胞培养基的方法，该方法包括在细胞培养基中对可用权利要求1-39任一所述方法获得的间质干细胞、间质干细胞系或分化间质干细胞进行培养，并且可视情况而定分离该细胞培养基。
48、可根据权利要求47的方法获得的合成培养基。
49、获得实施例10-14中任一所述多肽的方法，该方法包括获得权利要求1-39任一所述的间质干细胞、间质干细胞系或分化间质干细胞，并从间质干细胞、间质干细胞系或分化间质干细胞中分离所述多肽。
50、根据权利要求48所述的合成培养基在个体疾病治疗方法中的应用。
51、基本按照上文中参考附图1-9所述的以及按照附图1-9所示的获得细胞培养物的方法。
52、基本按照上文中参考附图1-9所述的以及按照附图1-9所示的获得间质干细胞的方法。
53、基本按照上文中参考附图1-9所述的以及按照附图1-9所示的获得细胞培养物的方法。
54、基本按照上文中参考附图1-9所述的以及按照附图1-9的获得的细胞培养物、间质干细胞、间质干细胞系或分化间质干细胞。
CNA2006800410207A 2005-09-02 2006-08-15 获取间质干细胞的方法 Pending CN101341244A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US71399205P 2005-09-02 2005-09-02
US60/713,992 2005-09-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101341244A true CN101341244A (zh) 2009-01-07

Family

ID=37075090

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2006800410207A Pending CN101341244A (zh) 2005-09-02 2006-08-15 获取间质干细胞的方法
CNA2006800410387A Pending CN101341245A (zh) 2005-09-02 2006-08-15 获取祖细胞系的方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2006800410387A Pending CN101341245A (zh) 2005-09-02 2006-08-15 获取祖细胞系的方法

Country Status (9)

Country Link
US (6) US20080199849A1 (zh)
EP (2) EP1937801A1 (zh)
JP (2) JP2009506769A (zh)
KR (2) KR20080056182A (zh)
CN (2) CN101341244A (zh)
AU (2) AU2006285467A1 (zh)
BR (2) BRPI0617085A2 (zh)
IL (2) IL189882A0 (zh)
WO (2) WO2007027156A1 (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104487568A (zh) * 2012-07-11 2015-04-01 爱姆斯坦生物技术公司 人胚胎干细胞衍生的间充质样干细胞、方法及其应用
CN105624104A (zh) * 2015-06-01 2016-06-01 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） 一种提高人间充质干细胞功能的细胞处理方法
CN106085953A (zh) * 2016-07-19 2016-11-09 安徽惠恩生物科技股份有限公司 一种临床级脐带间质细胞提取制备方法
CN108570447A (zh) * 2018-01-26 2018-09-25 皓昇莱生物制药有限公司 一种筛选分化hPSCs向MSCs的方法
CN111093681A (zh) * 2017-07-16 2020-05-01 雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司 人类口腔粘膜干细胞分泌蛋白质组
CN112430626A (zh) * 2020-11-27 2021-03-02 成都康景生物科技有限公司 一种基因修饰的脐间充质干细胞、制备方法及应用
CN116836920A (zh) * 2023-08-21 2023-10-03 佛山市生物医学工程学会 一种无血清培养基及其制备间充质干细胞的方法

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8017395B2 (en) 2004-12-17 2011-09-13 Lifescan, Inc. Seeding cells on porous supports
JP2009500297A (ja) 2005-06-08 2009-01-08 セントカー・インコーポレーテツド 眼の変性についての細胞療法
JP5630781B2 (ja) 2006-04-14 2014-11-26 アドバンスド セル テクノロジー、インコーポレイテッド 血管コロニー形成細胞
US8741643B2 (en) 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
US8628964B2 (en) * 2006-10-11 2014-01-14 Drexel University Fetal pulmonary cells and uses thereof
EP2137296A2 (en) 2007-03-23 2009-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Somatic cell reprogramming
WO2008150498A1 (en) * 2007-05-30 2008-12-11 University Of Georgia Research Foundation Inc. Human embryonic stem cell derived mesoderm-like epithelium transitions to mesenchymal progenitor cells
WO2008151390A1 (en) * 2007-06-15 2008-12-18 Australian Stem Cell Centre Ltd Differentiation of human embryonic stem cells
US9080145B2 (en) 2007-07-01 2015-07-14 Lifescan Corporation Single pluripotent stem cell culture
RU2473685C2 (ru) 2007-07-31 2013-01-27 Лайфскен, Инк. Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток
WO2009034708A1 (ja) * 2007-09-11 2009-03-19 Sapporo Medical University 細胞増殖方法ならびに組織の修復および再生のための医薬
US20110236971A2 (en) 2007-09-25 2011-09-29 Maksym Vodyanyk Generation of Clonal Mesenchymal Progenitors and Mesenchymal Stem Cell Lines Under Serum-Free Conditions
RU2473684C2 (ru) 2007-11-27 2013-01-27 Лайфскен, Инк. Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток
US8512696B2 (en) * 2007-11-30 2013-08-20 Autologous, Llc Methods of isolating non-senescent cardiac stem cells and uses thereof
KR102026622B1 (ko) 2008-02-21 2019-09-30 얀센 바이오테크 인코포레이티드 세포 부착, 배양 및 탈리를 위한 방법, 표면 개질 플레이트 및 조성물
KR101077042B1 (ko) * 2008-03-28 2011-10-26 경희대학교 산학협력단 중배엽 줄기세포의 증식을 촉진하기 위한 ｃｄ45+ 세포 또는 ｃｄ45+ 세포 배양액의 용도
WO2009128533A1 (ja) * 2008-04-18 2009-10-22 国立大学法人名古屋大学 間葉系幹細胞およびその生産方法
US7939322B2 (en) 2008-04-24 2011-05-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm
US8623648B2 (en) 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
CN104962514B (zh) * 2008-05-27 2021-04-02 奥列弗·D·博斯 人骨骼肌中的褐色脂肪细胞祖细胞
WO2010002846A1 (en) 2008-06-30 2010-01-07 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
WO2010040262A1 (zh) * 2008-10-10 2010-04-15 深圳市嘉天源生物科技有限公司 分离动物胚胎间质性干细胞并提取其分泌物的方法
CN102272291B (zh) 2008-10-31 2018-01-16 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌谱系的分化
EP2350265B1 (en) 2008-10-31 2019-04-17 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage
MX356756B (es) 2008-11-20 2018-06-11 Centocor Ortho Biotech Inc Células madre pluripotentes en microportadores.
EP2366022B1 (en) 2008-11-20 2016-04-27 Janssen Biotech, Inc. Methods and compositions for cell attachment and cultivation on planar substrates
US8790638B2 (en) * 2009-02-04 2014-07-29 Stemedica Cell Technologies, Inc. Compositions of stem cells and stem cell factors and methods for their use and manufacture
KR101032271B1 (ko) * 2009-05-25 2011-05-06 (주)미래생명공학연구소 피부세포 재생용 조성물, 그 제조 방법, 피부세포 재생 방법 및 화장료 조성물
JPWO2010137722A1 (ja) * 2009-05-26 2012-11-15 武田薬品工業株式会社 再生医薬のスクリーニング方法
KR102058901B1 (ko) 2009-07-20 2019-12-24 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
MX340952B (es) 2009-07-20 2016-07-29 Janssen Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas.
RU2540016C2 (ru) 2009-07-20 2015-01-27 Янссен Байотек, Инк. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека
WO2011010966A1 (en) * 2009-07-23 2011-01-27 Agency For Science, Technology And Research (A*Star) Pre-natal mesenchymal stem cells
CN102858997B (zh) 2009-11-02 2014-06-18 新加坡科技研究局 用于监测细胞状态和用于永生间充质干细胞的方法
KR101841271B1 (ko) 2009-12-23 2018-03-22 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
US9150833B2 (en) 2009-12-23 2015-10-06 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
US20110206647A1 (en) * 2010-02-25 2011-08-25 Abt Holding Company Modulation of Angiogenesis
JP6013196B2 (ja) 2010-03-01 2016-10-25 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 多能性幹細胞から誘導した細胞を精製するための方法
EP2569419B1 (en) 2010-05-12 2019-03-20 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
WO2012012570A2 (en) * 2010-07-20 2012-01-26 University Of Southern California High telomerase activity bone marrow mesenchymal stem cells, methods of producing the same and pharmaceuticals and treatment methods based thereon
SG10201506855RA (en) 2010-08-31 2015-10-29 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells
CA2809305C (en) 2010-08-31 2019-06-11 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
BR112013004514A2 (pt) 2010-08-31 2016-06-07 Janssen Biotech Inc diferenciação das células-tronco embrionárias humanas
EP3679939A1 (en) * 2010-10-08 2020-07-15 Mesoblast International Sàrl Enhanced msc preparations
US20130309209A1 (en) * 2010-10-22 2013-11-21 Center For Regenerative Medicine Of Barcelona Formation of hematopoietic progenitor cells from mesenchymal stem cells
ES2629502T3 (es) 2011-03-11 2017-08-10 Children's Medical Center Corporation Métodos y composiciones relacionados con exosomas de células madre mesenquimales
CA2840192A1 (en) 2011-06-23 2012-12-27 The Children's Hospital Of Philadelphia Self-renewing endodermal progenitor lines generated from human pluripotent stem cells and methods of use thereof
EP2733204A4 (en) * 2011-07-11 2014-10-01 Univ Kumamoto Nat Univ Corp METHOD FOR THE PRODUCTION OF A PLURIPOTENTIAL CELL WITH FERMENTABLE BACTERIUM
EP2776557A4 (en) 2011-11-10 2015-04-08 Energesis Pharmaceuticals Inc BROWN ADIPOCYTE FOLLOWERS IN HUMAN SKELETAL MUSCLES
JP6344821B2 (ja) * 2011-11-21 2018-06-20 ユニバーシティ・ヘルス・ネットワーク 造血前駆体の集団および造血前駆体のための幹細胞を富化する方法
KR20140106550A (ko) 2011-11-30 2014-09-03 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 생물학적 모니터링을 위한 ｇｍ1 갱글리오사이드와 아넥신 ⅴ 마이크로입자 폴리펩타이드 비율
KR102203056B1 (ko) 2011-12-22 2021-01-14 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 단일 인슐린 호르몬 양성 세포로의 분화
WO2013134378A1 (en) 2012-03-07 2013-09-12 Janssen Biotech, Inc. Defined media for expansion and maintenance of pluripotent stem cells
KR101422559B1 (ko) * 2012-03-09 2014-07-24 창원대학교 산학협력단 지방유래 줄기세포 배양액, 이의 제조방법, 및 이를 포함하는 발모촉진용 조성물
CN108103006A (zh) 2012-06-08 2018-06-01 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化
US10370644B2 (en) 2012-12-31 2019-08-06 Janssen Biotech, Inc. Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom
KR101942769B1 (ko) 2012-12-31 2019-01-28 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Hb9 조절제를 사용하는 인간 배아 줄기세포의 췌장 내분비 세포로의 분화
RU2658488C2 (ru) 2012-12-31 2018-06-21 Янссен Байотек, Инк. Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток
EP4039798A1 (en) 2012-12-31 2022-08-10 Janssen Biotech, Inc. Suspension and clustering of human pluripotent cells
CN103509753B (zh) * 2013-08-12 2016-06-15 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种人体造血干细胞分化培养方法
TWI486447B (zh) * 2013-09-05 2015-06-01 Buddhist Tzu Chi Medical Foundation 人類間質幹細胞體外快速增生之佐劑、體外快速擴增人類間質幹細胞之方法、體外快速擴增人類間質幹細胞以獲取生長因子的方法及其用途
DK3143127T3 (da) 2014-05-16 2021-09-13 Janssen Biotech Inc Anvendelse af små molekyler til at forstærke mafa-ekspression i endokrine pankreasceller
AU2015264519B2 (en) 2014-05-18 2021-01-28 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to exosomes
CA2977578A1 (en) * 2015-03-04 2016-09-09 Mesoblast International Sarl Cell culture method for mesenchymal stem cells
AU2017235446A1 (en) * 2016-03-16 2018-11-08 Cell Medicine, Inc. Mesenchymal stem cells with enhanced efficacy
MA45479A (fr) 2016-04-14 2019-02-20 Janssen Biotech Inc Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen
US10767164B2 (en) 2017-03-30 2020-09-08 The Research Foundation For The State University Of New York Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation
AU2018363983A1 (en) * 2017-11-09 2020-05-21 Nipro Corporation Medicine for tissue regeneration, and preparation method therefor
US11285177B2 (en) 2018-01-03 2022-03-29 Globus Medical, Inc. Allografts containing viable cells and methods thereof
CN109943525B (zh) * 2019-03-15 2021-07-30 中科睿极(深圳)医学科技有限公司 无血清、无动物源成分、组分明确的培养基及其应用
JP6712740B1 (ja) * 2019-03-25 2020-06-24 学校法人東海大学 Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団の培養方法およびその利用
KR102280509B1 (ko) * 2020-09-04 2021-07-22 건국대학교 글로컬산학협력단 전분화능 줄기세포 기반 자가면역성 및 염증성 피부질환 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU749675B2 (en) 1998-03-13 2002-07-04 Mesoblast International Sarl Uses for human non-autologous mesenchymal stem cells
US20030082152A1 (en) * 1999-03-10 2003-05-01 Hedrick Marc H. Adipose-derived stem cells and lattices
KR100968164B1 (ko) 1999-03-10 2010-07-06 더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 지방 유래 간세포 및 격자
US7439064B2 (en) * 2000-03-09 2008-10-21 Wicell Research Institute, Inc. Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium
US7005252B1 (en) * 2000-03-09 2006-02-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Serum free cultivation of primate embryonic stem cells
US7011828B2 (en) * 2000-03-14 2006-03-14 Es Cell International Pte. Ltd. Implanting neural progenitor cells derived for human embryonic stem cells
US20020009743A1 (en) * 2000-05-17 2002-01-24 Carpenter Melissa K. Neural progenitor cell populations
CA2424062A1 (en) * 2000-09-29 2002-04-04 Derek Van Der Kooy Primitive neural stem cells and method for differentiation of stem cells to neural cells
CN1636054A (zh) 2001-07-06 2005-07-06 杰龙公司 来自人胚胎干细胞的间充质细胞和成骨细胞
US20050148034A1 (en) * 2002-04-12 2005-07-07 Hariri Robert J. Methods for identification of modulators of angiogenesis, compounds discovered thereby, and methods of treatment using the compounds
AU2003231358A1 (en) 2002-04-17 2003-10-27 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. METHOD OF FORMING PANCREATIC Beta CELLS FROM MESENCHYMAL CELLS
US20040052771A1 (en) 2002-07-12 2004-03-18 Lim Sai Kiang Hemangioblast progenitor cells
JP3762975B2 (ja) * 2003-03-18 2006-04-05 学校法人慶應義塾 単球由来多能性細胞ｍｏｍｃ
KR20060065712A (ko) * 2003-08-27 2006-06-14 가부시키가이샤 레노메딕스 켄큐쇼 간엽계 줄기세포의 간세포로의 분화 방법 및 인공 인간간장 세포
JP2005304443A (ja) * 2004-04-26 2005-11-04 Institute Of Physical & Chemical Research 前駆間葉系幹細胞
CA2563872C (en) 2004-05-07 2014-11-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of forming mesenchymal stem cells from embryonic stem cells

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104487568A (zh) * 2012-07-11 2015-04-01 爱姆斯坦生物技术公司 人胚胎干细胞衍生的间充质样干细胞、方法及其应用
CN105624104A (zh) * 2015-06-01 2016-06-01 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） 一种提高人间充质干细胞功能的细胞处理方法
CN105624104B (zh) * 2015-06-01 2018-10-12 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） 一种提高人间充质干细胞功能的细胞处理方法
CN106085953A (zh) * 2016-07-19 2016-11-09 安徽惠恩生物科技股份有限公司 一种临床级脐带间质细胞提取制备方法
CN111093681A (zh) * 2017-07-16 2020-05-01 雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司 人类口腔粘膜干细胞分泌蛋白质组
CN108570447A (zh) * 2018-01-26 2018-09-25 皓昇莱生物制药有限公司 一种筛选分化hPSCs向MSCs的方法
CN112430626A (zh) * 2020-11-27 2021-03-02 成都康景生物科技有限公司 一种基因修饰的脐间充质干细胞、制备方法及应用
CN116836920A (zh) * 2023-08-21 2023-10-03 佛山市生物医学工程学会 一种无血清培养基及其制备间充质干细胞的方法

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0617084A2 (pt) 2011-07-12
BRPI0617085A2 (pt) 2016-11-08
US20150197725A1 (en) 2015-07-16
AU2006285468A1 (en) 2007-03-08
AU2006285467A1 (en) 2007-03-08
US20080199849A1 (en) 2008-08-21
EP1943334A1 (en) 2008-07-16
IL189878A0 (en) 2008-11-03
EP1937801A1 (en) 2008-07-02
US8962318B2 (en) 2015-02-24
JP2009506769A (ja) 2009-02-19
WO2007027156A1 (en) 2007-03-08
IL189882A0 (en) 2008-11-03
KR20080056181A (ko) 2008-06-20
WO2007027157A1 (en) 2007-03-08
US20110008298A1 (en) 2011-01-13
KR20080056182A (ko) 2008-06-20
US20110014692A1 (en) 2011-01-20
CN101341245A (zh) 2009-01-07
US9005897B2 (en) 2015-04-14
US9018005B2 (en) 2015-04-28
JP2009506770A (ja) 2009-02-19
US20130280719A1 (en) 2013-10-24
US20080219957A1 (en) 2008-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101341244A (zh) 获取间质干细胞的方法
US9029146B2 (en) Mesenchymal stem cell conditioned medium
Lian et al. Derivation of clinically compliant MSCs from CD105+, CD24− differentiated human ESCs
US20220033773A1 (en) Derivation of human microglia from pluripotent stem cells
RU2511417C2 (ru) Способ выделения происходящих из пуповинной крови плюрипотентных стволовых клеток, экспрессирующих znf281
US8507275B2 (en) Method of inducing differentiation of embryonic stem cells into hemangioblast
JP2005500847A (ja) 分化誘導薬の同定のためのスクリーニング検定及び細胞治療用の分化細胞の調製
CN1470633A (zh) 全能体细胞
KR100802011B1 (ko) 층분리배양법을 이용한 골수에서의 중간엽 줄기세포분리방법
JP2009513107A (ja) 新規な胚様体（ｅｂ）の調製方法およびその使用
Lewis et al. Porcine skeletal muscle-derived multipotent PW1pos/Pax7neg interstitial cells: isolation, characterization, and long-term culture
CN115433707A (zh) 用于重新衍生不同的多能干细胞衍生的褐色脂肪细胞的方法
JP5416895B2 (ja) 単球由来多能性細胞（ｍｏｍｃ）の効率的な作製法
KR20140062440A (ko) Ｚｎｆ２８１을 발현하는 제대혈 유래 줄기세포의 대량 배양방법
US20180325960A1 (en) Enhanced postnatal adherent cell, and use for same
US20210403873A1 (en) Method of preparing mesenchymal-like stem cells and mesenchymal-like stem cells prepared thereby
KR101158664B1 (ko) Ｚｎｆ２８１을 발현하는 제대혈 유래 줄기세포의 대량 배양방법
KR20190141136A (ko) 포유동물 근육-유래 줄기 세포의 새로운 용도
HARDY Mesenchymal stem cells as trophic mediators of neural differentiation
Méndez-Ferrer et al. Hongzhe Li, Roshanak Ghazanfari, Dimitra Zacharaki, Nicholas Ditzel, 2 Joan Isern, 3 Marja Ekblom
Karlsen In vitro expansion of bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells: Effects of different incubator gas tensions
CN107208049A (zh) 祖细胞、其制备方法及其应用
박형섭 In vitro differentiation of muscle-derived stem cells and their potential role in attenuation of abdominal aortic aneurysm formation
KR20120030515A (ko) Ｚｎｆ２８１을 발현하는 제대혈 유래 줄기세포의 대량 배양방법
AU2012205203A1 (en) Screening assays for identifying differentiation-inducing agents and production of differentiated cells for cell therapy

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20090107