CN112430626A - 一种基因修饰的脐间充质干细胞、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因修饰的脐间充质干细胞、制备方法及应用，包括以下步骤：步骤1：将hTIMP2基因连接到腺相关病毒载体AAV8上，得到AAV‑hTIMP2；步骤2：将脐带间充质干细胞(hUB‑MSCs)接种至培养皿中培养，hUB‑MSCs感染AAV‑hTIMP2，得到hTIMP2基因修饰的hUB‑MSCs；步骤3：将基因修饰的hUB‑MSCs进行传代扩增至P4，即得所需基因修饰的脐带间充质干细胞；本发明构建的基因修饰的脐带间充质干细胞仍保留了干细胞的特性，如表面标志物的表达情况、三分化能力等，而且同时分泌TIMP2蛋白；有望用于制备治疗AD药物。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物技术领域，具体涉及一种基因修饰的脐间充质干细胞、制备方法及应用。
背景技术
MSCs(Mesenchymal stem cell，MSCs)是来源于中坯层的具有自我更新能力的成体干细胞。MSCs的应用较为广泛，除了作为一种重要的组织工程细胞用于治疗骨、软骨性疾病外，还是一种理想的基因运载载体细胞。MSCs作为基因运载载体具有多种优势：1、来源丰富，可以从骨髓、脐带、脐血、脂肪、羊水、胎盘等多种组织分离提取。分离培养方法简单而且扩增能力强。2、MSCs不表达或低表达HLA分子，免疫原性弱，在同种异体中也能存活较长时间。3、MSCs本身可通过分泌细胞因子(如TGF-β、IL-10)或表达表面配体的作用调节机体免疫功能。4、MSCs还具备在体内向病理损伤部位迁移的能力。
随着中国人口老龄化加剧，神经退行性疾病相继增加，其治疗已经成为亟待解决的问题。阿尔兹海默症(Alzheimer’s Disease，AD)是一种典型的呈进行性发展的神经退行性疾病，主要症状为记忆和认知功能受损，其治疗和护理为家庭和社会带来沉重负担。其病因主要是β淀粉样蛋白在大脑海马区的沉积而导致神经元的凋亡。最近研究表明，免疫系统的失衡而引起的神经炎症也是导致阿尔兹海默症的重要因素。
Tony Wyss-Coray等人发现，人脐带血浆和年轻人血浆能有效改善老年小鼠海马相关功能障碍，其发挥作用的主要原因是血浆中含有较高浓度的TIMP2蛋白。TIMP2蛋白是一种金属蛋白酶抑制剂，由细胞分泌到血液而在机体发挥作用，尤其在维持海马相关功能上有很大作用。
目前，对于MSCs的基因修饰方法一般包括：电转法、病毒转染和质粒转染等；其中，病毒转染是一种有效且操作简捷的转染方法。腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)是简单的非致病性单链DNA病毒，重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。尽管AAV转染技术相对成熟，但想要获得可稳定表达TIMP2基因的细胞株难度较大，此外在完成基因编辑后，MSCs可否维持自身特性(如表面标志物、分化能力或旁分泌能力)亦是其中难题。
目前AD的治疗方式包括，药物治疗、心理社会治疗、认知的康复训练等。此外有报道采用人脐带血浆和年轻人血浆来治疗AD，且取得一定疗效，但人脐带血浆和年轻人血浆治疗AD的方法存在来源不足和血液传播疾病风险等问题。目前，临床用于AD治疗相关药物稀少，而国内更是仅有1款，这些药物均为症状改善药物，不可从根本的病理上改善AD。
发明内容
本发明提供一种可稳定表达TIMP2，并可持续分泌TIMP2蛋白功能的基因修饰的脐间充质干细胞、制备方法及应用。
一种基因修饰的脐带间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将hTIMP2基因连接到腺相关病毒载体AAV8上，得到AAV-hTIMP2；
步骤2：将人脐带间充质干细胞hUB-MSCs接种至培养皿中培养，hUB-MSCs感染AAV-hTIMP2，得到hTIMP2基因修饰的hUB-MSCs；
步骤3：将基因修饰的hUB-MSCs进行传代扩增至P4，即得所需基因修饰的脐带间充质干细胞。
进一步的，所述步骤2中hUB-MSCs感染AAV-hTIMP2过程如下：
取脐带间充质干细胞的培养基，向其中加入AAV-hTIMP2，其中MOI为6×105，加入AAV-hTIMP2的同时加入聚凝胺；聚凝胺的终浓度为6μg/mL，继续培养24h，更换为无血清MSCs培养基。
进一步的，所述步骤2中培养时间为18～20小时，培养温度为37℃，培养氛围为5％的CO2。
进一步的，所述步骤2感染过程中，培养基的用量为100ul/cm2。
进一步的，所述感染AAV-hTIMP2后培养条件为37℃，5％浓度的CO2。
一种基因修饰的脐带间充质干细胞的在制备治疗AD药物中的应用。
本发明的有益效果是：
(1)本发明构建的基因修饰的脐带间充质干细胞仍保留了干细胞的特性，如表面标志物的表达情况、三分化能力等，而且同时分泌TIMP2蛋白；
(2)本发明以AAV为载体构建过表达TIMP2蛋白的hUB-MSCs-T，糅合了MSCs和人脐带血浆对AD的治疗作用；采用的基因传递载体同为AAV，其被整合到细胞基因组AAV安全位点，不会因为随机插入而导致细胞癌变，并且AAV能长时表达，有利于提高基因修饰细胞比例，降低操作难度。
附图说明
图1为本发明脐带间充质干细胞和对比例中hUB-MSCs感染AAV-hTIMP2的感染率图。
图2为本发明实施例1中hUB-MSCs-T表达hTIMP2的ELISA检测结果示意图。
图3为本发明实施例1中hUB-MSCs-T P3代细胞和对比例细胞表面标记示意图。
图4为本发明实施例1中hUB-MSCs-T P3代细胞和对比例细胞三系分化潜能示意图。
图5为本发明实施例1中hUB-MSCs-T P3代细胞和对比例细胞的细胞周期和细胞凋亡示意图。
图6为本发明实施例1得到的hUB-MSCs-T细胞和对比例对小鼠行为学旷场实验结果示意图。
图7为本发明实施例1得到的hUB-MSCs-T细胞和对比例对小鼠行为学新物体识别结果示意图。
图8为本发明实施例1得到的hUB-MSCs-T细胞和对比例对小鼠行为学不同训练阶段小鼠巴恩斯迷宫逃避实验结果示意图。
图9为本发明实施例1hUB-MSCs-T细胞和对比例对小鼠行为学不同训练阶段小鼠巴恩斯迷宫逃避实验第4天第1次训练结果和D12长时记忆测试结果对比示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
一种基因修饰的脐带间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将hTIMP2基因连接到腺相关病毒载体AAV8上，得到AAV-hTIMP2；人TIMP2cDNA序列在Ensembl数据库上查询得到后，由北京擎科生物科技公司合成并连接到AAV表达载体pAAV[Exp]-CMV上，获得AAV-hTIMP2。
腺相关病毒产品使用干冰冷藏运输，可直接放置-80℃冷冻保存至少1年，也可放置-20℃冷冻保存2～3周。使用前，将病毒液放置冰上进行溶解。实验过程中，亦需保持冰上放置。溶解后的腺相关病毒可放置4℃保存1～2周(在4℃条件下，腺相关病毒比慢病毒相对稳定，一般不会出现显著的活性降低问题)。若实际用量较少，可将溶解的腺相关病毒少量分装多管，再放置-80℃冷冻保存。如果需要对腺相关病毒进行稀释，请使用PBS稀释使用。
步骤2：将脐带间充质干细胞接种至培养皿中培养，hUB-MSCs感染AAV-hTIMP2，得到hTIMP2基因修饰的hUB-MSCs；
取hUB-MSCs(人脐带间充质干细胞)用无血清MSCs培养基培养，传代培养。
取P1脐带间充质干细胞的培养基(24孔板中接种MSC 3×104，6孔板接种1.5×105，T75接种1×106)，放置在37℃、5％CO2的培养箱中培养18～20个小时。
感染过程如下：
取上述培养过的细胞，向其中加入AAV-hTIMP2，其中MOI为6×105，加入AAV-hTIMP2的同时加入聚凝胺；聚凝胺的终浓度为6μg/mL，继续培养24h，更换为无血清MSCs培养基。
转导时靶细胞的融合度应为50～60％；在冰上溶解冻结的病毒液，为了吸取到准确数量的病毒，请先轻柔吸打，混匀溶解后的病毒颗粒，再取适量的病毒液至适量的培养基中，然后轻柔混匀(避免涡旋震荡)。为了获得较好的转导效果，培养基用量尽可能少，以覆盖培养皿表面为宜。一般来说，用量约100ul/cm2。吸出原有培养基，然后向细胞中加入含有病毒的培养基。轻柔地摇动培养板以使病毒液都能覆盖每一处细胞。放置于37℃、5％CO2的培养箱中培养过夜。24小时不换液，如果培养基变黄可以加入新配置完全培养基，继续培养至融合度为90％左右传代。
步骤3：将基因修饰的hUB-MSCs进行传代扩增至P4，即得所需基因修饰的脐带间充质干细胞。
实施例1
按照以下步骤制备基因修饰的脐带间充质干细胞：
步骤1：人TIMP2 cDNA序列在Ensembl数据库上查询得到后，由北京擎科生物科技公司合成并连接到AAV表达载体pAAV[Exp]-CMV上，获得AAV-hTIMP2；
步骤2：将hUB-MSCs接种至培养皿中培养，hUB-MSCs感染AAV-hTIMP2，得到hTIMP2基因修饰的hUB-MSCs；
所用到的hUB-MSCs由成都康景生物科技有限公司提供。hUB-MSCs用无血清MSCs培养基进行培养，按照1:6传代，通常2天生长到培养瓶地面的90％～95％。
取1.5×105P1脐带间充质干细胞接种在6孔板中，放置在37℃、5％CO2的培养箱中培养18个小时。
取上述培养过的细胞，向其中加入AAV-hTIMP2，其中MOI为6×105，加入AAV-hTIMP2的同时加入聚凝胺(将上述物质均加入到1ml新鲜培养基中)；聚凝胺的终浓度为6μg/mL，继续培养24h，更换为2ml新鲜完全培养基。
步骤3：将基因修饰的hUB-MSCs进行传代扩增至P4，即得所需脐带间充质干细胞(hUB-MSCs-T)。
为了找到病毒感染hUB-MSCs的优化条件，我们用同种血清型的含GFP报告基因的病毒(AAV8-GFP)进行感染方案优化试验；经试验MOI＝×105，聚凝胺终浓度为6ug/ml为最优的感染条件。
上述试验结果如图1所示，左侧为对比例(MOI为6×105未加入聚凝胺)，右侧为实施例1条件(MOI为6×105，聚凝胺终浓度为6μg/mL)；从图中可以看出，未加聚凝胺时EGFP阳性百分比即感染率为61.6％；加入聚凝胺时感染率为97.5％。
将实施例1得到的基因修饰的脐带间充质干细胞(hUB-MSCs-T)通过ELISA方法检测其上清中TIMP2的含量，该细胞连续四代中都能在培养上清中检测到稳定的TIMP2表达。24小时培养1×105个hUB-MSCs-T细胞收集到2ml培养上清液，因此1×105个hUB-MSCs-T细胞24h分泌到细胞外的TIMP2含量为40ng(如图2所示)。
上述检测方法如下：将不同代次1×105个hUB-MSCs-T接种于12孔板中培养24h，收集2ml培养上清用ELISA试剂盒检测TIMP2蛋白含量，按照ELISA的试剂盒要求，用TIMP2标准品绘制TIMP2标准曲线，将标本按照不同倍数稀释，通过标准曲线计算检测标本TIMP2含量，即得到图2所示结果。
对比例
取2×106个hUB-MSCs用无血清间MSCs培养基培养，按1:6传代，通常2d细胞已生长到90％～95％培养瓶地面，hUB-MSCs连续传代培养至P4。
对实施例1得到的hUB-MSCs-T和对比例得到的hUB-MSCs做流式检测；结果如图3所示。对实施例1得到的hUB-MSCs-T和对比例得到的hUB-MSCs进行细胞周期检测，收集1×106个hUB-MSCs及hUB-MSCs-T，用70％酒精于4℃固定过夜后，用溴化乙碇染色后上机检测。从图3中可以看出hUB-MSCs-T细胞与对照hUB-MSCs相比，均表达CD73、CD90、CD105等间充质干细胞表面标记，且阳性率＞95％；不表达CD34、CD45血液细胞标记，阳性率≤0.5％。
对实施例1得到的hUB-MSCs-T和对比例得到的hUB-MSCs进行细胞凋亡检测；收集1×106个hUB-MSCs及hUB-MSCs-T，先加入AnnexinV-FITC染色15min，再加入7-AAD染色5min后上机检测(如图5所示)。从图中可以看出，hUB-MSCs-T的细胞周期没有显著变化，而细胞凋亡比hUB-MSCs略微降低。
对实施例1得到的hUB-MSCs-T和对比例得到的hUB-MSCs做MSCs三系分化能力鉴定，严格按照MSCs功能鉴定试剂盒说明书操作。将hUB-MSCs-T和hUB-MSCs分别向脂肪、软骨和成骨细胞诱导分化，分化后的细胞用油红O染色鉴定脂肪分化、茜红素S染色鉴定成骨分化以及阿利辛蓝染色鉴定软骨分化(结果如图4所示)。从图中可以看出，hUB-MSCs-T细胞与对照hUB-MSCs都具有成脂、成骨和成软骨分化能力，符合间充质干细胞定义。
为了证明本发明基因修饰脐带间充质干细胞对AD的作用，对采用本发明得到的hUB-MSCs-T治疗后AD小鼠的行为进行分析，分别对小鼠治疗后第1周做旷场试验和新物体识别试验，治疗后第2周开始巴恩斯迷宫训练和短期记忆能力测试，第4周开始巴恩斯迷宫长期记忆测试。结果如图6、7、8、9所示。
本发明采用的小鼠选择22周龄雄性AD模型小鼠30只(B6C3-TG，南京大学模式动物研究所)，按照SPF动物级别饲养，饮水和食物充足，5只/笼，12h/12h光暗周期，饲养到28周龄时开始实验。
30只AD小鼠随机均分为PBS空白对照、hUB-MSCs和hUB-MSCs-T组，保证每个笼子都(标记)有3种(组)小鼠。每周5上午对3组小鼠尾静脉分别注射0.0067mol/L PBS缓冲液0.2mL/只或悬浮hUB-MSCs、悬浮hUB-MSCs-T 2×105个/只，连续8周。
从图6可以看出，3组AD小鼠中心区域进入次数和总的移动距离无明显变化(P＞0.05)，但PBS、hUB-MSCs、hUB-MSCs-T 3组小鼠的活动能力有提高的趋势。从图7中可以看出，hUB-MSCs、hUB-MSCs-T组小鼠对新物体都有相似明显的探索行为。从图8中可以看出，第1次训练，hUB-MSCs-T组小鼠找到逃逸盒的时间明显低于hUB-MSCs组和PBS组。至第4次训练，hUB-MSCs-T组小鼠找到逃逸盒的时间最短，hUB-MSCs组次之，PBS组小鼠耗时最长。从图9可以看出，经过4d的训练，3组小鼠均为找到逃逸盒的时间＜20s；12d长时记忆试验，hUB-MSCs-T组小鼠访问逃逸孔的次数明显多于其他组(P＜0.05)，而hUB-MSCs与PBS组小鼠无明显差异(P＞0.05)。
学习和记忆能力与突触可塑性相关，而细胞外基质分子参与突触可塑性。蛋白酶在突触的结构重排中发挥作用，基质金属蛋白酶(matix metalloproteinase，MMPs)是其中1种蛋白酶，主要参与细胞外基质分子降解。而金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP2)通过与MMPs结合来抑制MMP活性。其中TIMP2在大脑皮层、海马等于学习和记忆有关的区域的空间分布提示了TIMP2对于突触可塑性的作用。因此，TIMP2对于治疗AD有巨大的潜在价值。我们以AAV为载体构建过表达TIMP2蛋白的MSCs糅合了MSCs和人脐带血浆对AD的治疗作用。同时采用的基因传递载体为AAV，其被整合到细胞基因组AAV安全位点，不会因为随机插入而导致细胞癌变，并且AAV能长时表达，有利于提高基因修饰细胞比例，降低操作难度。
在旷场试验和新物体识别试验中，与注射hUB-MSCs组或PBS对照组相比，hUB-MSCs-T组没有明显的改变，可能是因为这2种行为学试验对高级神经功能，如记忆和认知的改善没有很好的区分度。而在巴恩斯迷宫试验中，尤其是训练d1，4次间隔15min的训练对小鼠的学习能力有一定的区分度，hUB-MSCs-T组小鼠的学习能力明显强于hUB-MSCszu与PBS对照组小鼠，虽然2个MSCs治疗组小鼠较PBS对照组在长时记忆有明显改善(P＜0.05)，但是二者之间却没有明显差异(P＞0.05)。
hUB-MSCs-T之所以能发挥改善小鼠海马依赖性认知功能的作用可能是hTIMP2通过血脑屏障，进入中枢神经系统发挥作用。c-Fos是1种突触可塑性标记，通过小鼠大脑切片发现，随着年龄的增长，小鼠脑部c-Fos的活化减少。TIMP2通过血脑屏障进入到大脑中，增加老年小鼠大脑海马部位齿状回区域中的c-Fos活化。因此，可以推断TIMP2通过促进c-Fos的活化，增强了老年小鼠的突触可塑性，进而发挥改善海马依赖性认知功能的作用，TIMP2很可能是控制突触可塑性的关键介质。同时，鉴于大脑中还有许多潜在的靶标，TIMP2还可能通过与MMPS和整联蛋白的复杂相互作用来调节细胞外基质和结构蛋白更新，从而对大脑突触可塑性发挥作用，最终改善动物的认知功能。
本发明构建的基因修饰的脐带间充质干细胞仍保留了干细胞的特性，如表面标志物的表达情况、三分化能力等，而且同时分泌TIMP2蛋白。
Claims (7)
1.一种基因修饰的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将hTIMP2基因连接到腺相关病毒载体AAV8上，得到AAV-hTIMP2；
步骤2：将人脐带间充质干细胞hUB-MSCs接种至培养皿中培养，hUB-MSCs感染AAV-hTIMP2，得到hTIMP2基因修饰的MSC；
步骤3：将基因修饰的hUB-MSCs进行传代扩增至P4，即得所需基因修饰的脐带间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种基因修饰的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤2中hUB-MSCs感染AAV-hTIMP2过程如下：
取脐带间充质干细胞的培养基，向其中加入AAV-hTIMP2，其中MOI为6×105，加入AAV-hTIMP2的同时加入聚凝胺；聚凝胺的终浓度为6μg/mL，继续培养24h，更换为无血清MSCs培养基。
3.根据权利要求1所述的一种基因修饰的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤2中培养时间为18～20小时，培养温度为37℃，培养氛围为5％的CO2。
4.根据权利要求1所述的一种基于修饰的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤2感染过程中，培养基的用量为100ul/cm2。
5.根据权利要求2所述的一种基因修饰的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述感染AAV-hTIMP2后培养条件为37℃，5％浓度的CO2。
6.一种如权利要求1～5所述制备方法得到的一种基因修饰的脐带间充质干细胞。
7.根据权利要求6所述的一种基因修饰的脐带间充质干细胞的在制备治疗AD药物中的应用。
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