CN108289937A - 用于产生和递送来自干细胞的有益因子的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本文提供了与诱导自我更新或衰老干细胞群有关的方法和装置，以产生用于治疗个体中的疾病或病症的一种或多种有益因子。还提供了用于诱导衰老的组合物和方法，其可用于诱导干细胞群中的衰老，以产生用于治疗个体中的疾病或病症的一种或多种有益因子。还描述了用于控制和定制产生要治疗的疾病或病症的有益因子的方法和装置。还提供了生产有益因子的因子生成单元，以及向有需要的个体递送有益因子的装置。

Description

用于产生和递送来自干细胞的有益因子的方法和装置
相关申请的交叉引用
本申请要求保护2015年6月3日提交的美国临时申请系列号62/170,604、和2015年6月3日提交的美国临时申请系列号62/170,619以及2015年6月12日提交的美国临时申请系列号62/175,203的优先权，其每一篇通过引用以其整体并入。
发明背景
成体干细胞例如成年间充质干细胞(MSC)在生物体的整个寿命期间在许多器官内产生分化的细胞类型，并因此最终负责多细胞生物体的寿命。干细胞具有三个重要特性：(1)自我更新，可以维持原有的干细胞群；(2)分化成多种成熟细胞，替代成年组织中成熟的成熟细胞；和(3)其在整个生命中维持稳定性干细胞集合(Tollervey and Lunyak，2011)。在临床上利用这些特性，基于干细胞的移植疗法已经，例如，显示了：通过刺激邻近细胞释放神经营养因子恢复神经元完整性、防止老化导致的认知衰退、促进中枢神经系统和周围神经损伤后的恢复；刺激髓鞘复原过程和神经元的神经胶质复原支持；防止视网膜损伤并保持视网膜屏障性能；阻止氧化损伤、产生强烈的炎症抑制和自身免疫反应、提供免疫调节、指导血管生成并产生有利于复原或器官和组织修复的微环境。
人脂肪来源的间充质干细胞(hADSC或hAMSC)是目前干细胞的主要来源之一，具有直接的临床意义。然而，移植的间充质干细胞存在致瘤潜力和植入后滞留不良等问题。
虽然已知干细胞具有信号能力并且能够产生和分泌因子，但是这种产生不能通过移植来控制。因此，仍然需要控制和定制治疗因子的产生，以及其从干细胞的产生和至需要的个体的递送。本文提供了解决此需求的方法和装置。
发明概述
本文提供了与诱导自我更新或衰老干细胞群有关的方法和装置，以产生用于治疗个体中的疾病或病症的一种或多种有益因子。还提供了用于诱导衰老的组合物和方法，其可用于诱导干细胞群中的衰老，以产生用于治疗个体中的疾病或病症的一种或多种有益因子。还描述了用于控制和定制产生要治疗的疾病或病症的有益因子的方法和装置。还提供了生产有益因子的因子生成单元(FPU)，以及向有需要的个人的有益因子的递送。
本发明的一个方面，本文提供在个体中治疗疾病或病症的方法，其包括将由干细胞群产生的一种或多种因子递送至所述个体或来自所述个体的生物流体。在一个变化中，所述该细胞包含间充质干细胞(MSC)。在一些变化中，所述干细胞包含SR细胞和SEN细胞。在一些具体变化中，干细胞群包含至少50％SR细胞，或包含至少50％SEN细胞。在一些变化中，所述干细胞在暴露至诱导剂时已诱导产生所述因子。在具体变化中，所述细胞群向所述诱导剂的暴露为约24小时。在一些变化中，所述诱导剂包含IL-2。在一些变化中，所述干细胞包含至少50％SR细胞，而在其他变化中，所述干细胞包含至少50％SEN细胞。在一些变化中，所述因子分泌自所述细胞。由于本发明还涵盖递送，在一些变化中，所述因子在诱导后24、48或72小时递送。在一些变化中，所述递送包括使用透皮贴剂、单采系统、基于微针的系统、乳剂或dermaroller。在一些变化中，所述疾病或病症是癌症、自身免疫性疾病、心血管疾病、糖尿病、皮肤病、神经退行性疾病、骨质疏松症、骨关节炎、脊髓损伤、肝脏疾病、肾脏疾病、与年龄相关的病理学、脱发、烧伤、需要皮肤移植的病况或皮肤损伤。在一些变化中，所述干细胞是脂肪来源的干细胞(ADSC)。在一些变化中，所述干细胞源自小泡基质部分。在一些变化中，所述因子对所述个体是自体的，而在其他变化中，所述因子对所述个体是异源的。在一些变化中，所述因子在因子产生单元中产生。在一些变化中，所述因子包括白细胞介素1β(IL1b)、白细胞介素3(IL3)、白细胞介素-13受体亚单元α-2(IL13Rα2)、白细胞介素1受体α(IL1Rα)、促β细胞素(Probetacellulin，BTC)、集落刺激因子(CSF1)、成纤维细胞生长因子6(FGF6)、神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、瘦素、血小板来源的生长因子Bβ(PDGF BB)、脑源性神经营养因子(BDNF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、骨形态发生蛋白6(BMP6)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、胰岛素样生长因子结合蛋白-4(IGFBP4)、干细胞因子/c-kit配体(SCF)、基质细胞来源的因子-1α(SDF1a)、基质细胞来源的因子-1β(SDF1b)、基血管紧张素(ANG)、集落刺激因子2(CSF2)、转化生长因子β1(TGFb1)、转化生长因子β3(TGFb3)、肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)、趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、趋化因子(C-C基序)配体5(CCL5)、趋化因子(C-C基序)配体7(CCL7)、趋化因子(C-C基序)配体8(CCL8)、趋化因子(C-C基序)配体11(CCL11)、趋化因子(C-C基序)配体13(CCL13)、趋化因子(C-C基序)配体22(CCL22)、趋化因子(C-C基序)配体23(CCL23)、趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)、CXC趋化因子配体10(CXCL10)、趋化因子(C-X-C基序)配体13(BLC)、趋化因子(C-C基序)配体23(CCL23)、趋化因子(C-C基序)配体28(CCL28)、趋化因子(C-C基序)配体11(嗜酸细胞活化趋化因子1)、趋化因子(C-X-C基序)配体6(GCP-2)、FLT3LG(Fms相关的酪氨酸激酶3配体)和Fractalkine(CX3CL1)。在一些变化中，将所述因子递送至来自所述个体的生物流体。在一些变化中，将所述因子递送至来自所述个体的血浆。在一些变化中，将所述因子递送至所述血浆诱导血液中调节性T细胞的产生。在一些变化中，因子的递送进一步包括将所述血液引回入所述受试者。
在本发明的另一方面中，本文提供在因子产生单元中产生一种或多种因子的方法，其包括将诱导剂添加至干细胞群以诱导因子的产生，由此产生所述一种或多种因子。所述因子可分离自因子产生单元。在一个变化中，因子产生单元中的干细胞包含间充质干细胞(MSC)。在另一个变化中，因子产生单元中的干细胞包含脂肪来源的干细胞(ADSC)。在另一个变化中，因子产生单元中的干细胞来自小泡基质部分。因子产生单元中的干细胞可包含SR和SEN细胞。在一个变化中，所述干细胞群包含至少50％SR细胞；在另一个变化中，所述干细胞群包含至少50％SEN细胞。在一些变化中，因子产生单元中的干细胞在暴露至诱导剂时已诱导产生所述因子。诱导剂可以是蛋白质、小分子或基于基因的诱导剂。在一个变化中，诱导剂包含IL-2。在一些变化中，所述因子分泌自所述细胞。在一些变化中，所述因子在诱导后24、48或72小时获得。在一些变化中，所述干细胞群来自单独个体；在其他变化中，所述干细胞群来自多个个体。在具体的变化中，产生因子的集合，其包含白细胞介素1β(IL1b)、白细胞介素3(IL3)、白细胞介素-13受体亚单元α-2(IL13Rα2)、白细胞介素1受体α(IL1Rα)、促β细胞素(BTC)、集落刺激因子(CSF1)、成纤维细胞生长因子6(FGF6)、神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、瘦素、血小板来源的生长因子Bβ(PDGF BB)、脑源性神经营养因子(BDNF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、骨形态发生蛋白6(BMP6)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、胰岛素样生长因子结合蛋白-4(IGFBP4)、干细胞因子/c-kit配体(SCF)、基质细胞来源的因子-1α(SDF1a)、基质细胞来源的因子-1β(SDF1b)、基血管紧张素(ANG)、集落刺激因子2(CSF2)、转化生长因子β1(TGFb1)、转化生长因子β3(TGFb3)、肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)、趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、趋化因子(C-C基序)配体5(CCL5)、趋化因子(C-C基序)配体7(CCL7)、趋化因子(C-C基序)配体8(CCL8)、趋化因子(C-C基序)配体11(CCL11)、趋化因子(C-C基序)配体13(CCL13)、趋化因子(C-C基序)配体22(CCL22)、趋化因子(C-C基序)配体23(CCL23)、趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)、CXC趋化因子配体10(CXCL10)、趋化因子(C-X-C基序)配体13(BLC)、趋化因子(C-C基序)配体23(CCL23)、趋化因子(C-C基序)配体28(CCL28)、趋化因子(C-C基序)配体11(嗜酸细胞活化趋化因子1)、趋化因子(C-X-C基序)配体6(GCP-2)、FLT3LG(Fms相关的酪氨酸激酶3配体)和Fractalkine(CX3CL1)。在多个变化中，所述因子用于癌症、自身免疫疾病、心血管疾病、糖尿病、皮肤病、神经退行性疾病、骨质疏松症、骨关节炎、脊髓损伤、肝脏疾病、肾脏疾病、与年龄相关的病理学、脱发、烧伤、需要皮肤移植的病况或皮肤损伤的治疗。在具体变化中，所述因子用于皮肤美容应用。
本发明的另一方面，本文提供产生一种或多种适于皮肤美容应用的因子的方法，其包括将干细胞群与10％PRP温育，由此产生一种或多种适于皮肤美容应用的因子。
本发明的另一方面，本文提供在样品中增加调节性T细胞数目的方法，其包括将包含T细胞的样品与因子组合物接触，其中所述因子组合物包含收集自与IL-2温育72小时后的SR-hADSC的因子。在一些变化中，与因子组合物接触的样品是血液。在其他变化中，与因子组合物接触的样品是血浆。
本发明的另一方面，本文提供因子产生单元，其包含基质和输入的干细胞群。本发明的一些变化中，所述基质是三维基质。因子产生单元的基质可包含聚合物材料，例如在一些变化中，聚合物材料包含生物可降解聚合物；而在其他变化中，聚合物材料包含非生物可降解聚合物。在一些变化中，聚合物材料包含聚乙烯对苯二甲酸乙二酯、聚酯纤维、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯腈、硅酮、聚氨基甲酸酯、聚碳酸盐/酯、聚醚酮酮、聚醚醚酮、聚醚酰亚胺、聚酰胺、聚苯乙烯、聚醚砜、聚砜、聚己酸内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚甘油癸二酸、聚二醇柠檬酸盐、多羟基丁酸酯、聚醚酰胺、聚二烷酮、纤维连接蛋白、胶原、明胶、透明质酸、壳聚糖及其组合、共混物或共聚物。在其他变化中，基质包含多种电纺纳米纤维或三维打印的纳米纤维。在具体变化中，纳米纤维与干细胞电纺。在一些变化中，多种电纺纤维配置为人工细胞外基质。在一些变化中，干细胞群设置在所述基质表面上，而在一些变化中，干细胞群设置在所述基质的聚合材料内。在一些变化中，干细胞是SR和SEN干细胞，例如SR-MSC和SEN-MSC。在一些变化中，干细胞群包含至少50％SR细胞，在一些变化中，SR细胞是诱导的SR细胞。在一些变化中，干细胞群包含至少50％SEN细胞，在一些变化中，SEN细胞是诱导的SEN细胞。在一些变化中，所述因子产生单元是单采系统的一部分。具体变化中，单采系统是血浆单采系统。在一些变化中，产生因子且所述因子用于调节免疫细胞。在一些变化中，产生因子并用于增加调节T细胞的产生。在一些变化中，产生因子且所述因子用于治疗自身免疫疾病、癌症、糖尿病、皮肤病、神经退行性疾病、骨质疏松症、骨关节炎、肝脏疾病、肾脏疾病、与年龄相关的病理学、需要皮肤移植的病况或皮肤损伤。
本发明的另一方面，本文提供具体的因子组合物，其用于治疗多种疾病和病症。在一个变化中，本发明的因子组合物包含收集自与IL-2温育72小时后的SR-hADSC的因子。在另一个变化中，本发明的因子组合物包含白细胞介素1β(IL1b)、白细胞介素3(IL3)、白细胞介素-13受体亚单元α-2(IL13Rα2)、白细胞介素1受体α(IL1Rα)、促β细胞素(BTC)、集落刺激因子(CSF1)、成纤维细胞生长因子6(FGF6)、神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、瘦素、血小板来源的生长因子Bβ(PDGF BB)、脑源性神经营养因子(BDNF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、骨形态发生蛋白6(BMP6)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、胰岛素样生长因子结合蛋白-4(IGFBP4)、干细胞因子/c-kit配体(SCF)、基质细胞来源的因子-1α(SDF1a)、基质细胞来源的因子-1β(SDF1b)、基血管紧张素(ANG)、集落刺激因子2(CSF2)、转化生长因子β1(TGFb1)、转化生长因子β3(TGFb3)、肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)、趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、趋化因子(C-C基序)配体5(CCL5)、趋化因子(C-C基序)配体7(CCL7)、趋化因子(C-C基序)配体8(CCL8)、趋化因子(C-C基序)配体11(CCL11)、趋化因子(C-C基序)配体13(CCL13)、趋化因子(C-C基序)配体22(CCL22)、趋化因子(C-C基序)配体23(CCL23)、趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)、CXC趋化因子配体10(CXCL10)、趋化因子(C-X-C基序)配体13(BLC)、趋化因子(C-C基序)配体23(CCL23)、趋化因子(C-C基序)配体28(CCL28)、趋化因子(C-C基序)配体11(嗜酸细胞活化趋化因子1)、趋化因子(C-X-C基序)配体6(GCP-2)、FLT3LG(Fms相关的酪氨酸激酶3配体)和Fractalkine(CX3CL1)。在一些变化中，本发明的因子组合物可进一步以乳霜或洗剂的形式配制。在其他变化中，本发明的因子组合物进一步在包含微针的贴剂上配制。在其他变化中，本发明的因子组合物进一步配制以与基于dermaroller的递送系统组合。本发明的另一方面，本文提供试剂盒，其包含本发明因子组合物的任一种。
本发明的另一方面，本文提供在SR干细胞中诱导衰老的方法，例如出于诱导一组因子的目的，所述方法包括转染入所述细胞一种或多种选自下组的微小RNA(miRNA)：miR-17-5p、miR-18a-5p、miR-20a-5p、mir-92a1-5p、mir-19a-3p、mir-125b1-5p、mir100-5p和mir-let7a-2-3p。在一个变化中，the SR干细胞是SR-hADSC。
应该理解的是，本文所述的多种变化的一个、一些或所有特性可以组合以形成本发明的其它变化。本发明的这些和其他方面对于本领域的技术人员将变得显而易见。
附图简述
图1A阐述了用于实践本文描述的本发明的一个方面的示例性方法。
图1B阐述了使用hADSC组合物(本文可互换地称为hADMC)治疗个体的示例性方法。
图1C阐述了本发明的一个示例性方法，其从个体分离hADSC开始，到放置在本文所述的示例性因子产生单元中。
图2A和2B显示了产生因子和因子组合物并实践了如本文所述的本发明的一个方面的示例性方法。
图2C阐述了用于实施本文所述的本发明的一个方面的一个示例性方法，其用于示例性使用免疫调节因子以影响调节性T细胞(Treg)的产生。
图2D图示了本发明的因子产生单元中的hADSC，如本文所述。
图3A-3D阐述了复制性衰老(SEN)如何损害人脂肪来源的间充质干细胞(hADSC，在本文中也可互换地称为hADSC)的迁移特性。图3A显示了hADSC的生长曲线，并且表示为培养日中的累积群倍增。图3B显示衰老相关β-半乳糖苷酶的检测。图3C显示SR(左)和SEN(右)hADSC的离体迁移测定。图3D显示了SR-hADSC(左)和SEN-hADSC(右)的迁移。
图4A-4C阐述了IL-2受体亚型的基因表达及其与IL-2诱导的SR-hADSC和SEN-hADSC中膜的结合。图4A显示了IL-2受体组合物的示意图。图4B显示了在存在或不存在IL-2的情况下，通过定量PCR(qPCR)SR和SEN-hADSC评估的IL-2受体α、β和γ。图4C显示了IL-2Rα和IL-2Rβ的细胞膜相关蛋白水平。
图5阐述了用IL-2刺激SR和SEN-hADSC的效果。通过定量RT-PCR评估STAT5A、STAT5B和VEGFAmRNA的表达。
图6A-6D显示了在IL-2处理后SR与SEN细胞之间基因表达水平的比较。
图7A-7D阐述了功能上一致的基因集合中，在IL-2处理后SR和SEN细胞的基因表达水平。
图8A-8D阐述了经IL-2处理的SR和SEN-hADSC的RNA-seq概貌的分析。图8A提供了RNA-seq分析设计的示意图。图8B显示ACTB标准化之前各条件的基因特异性RNA-seq读取计数的分布。图8C显示用于标准化的ACTB的条件特异性RNA-seq读取计数。图8D显示ACTB标准化后各条件的基因特异性RNA-seq读取计数的分布。
图9显示用于RNA-seq实验质量控制的外部RNA控制联合体(ERCC，一组常见的外部RNA对照)的剂量响应。
图10A-10B表示在SEN-hADSC(衰老hADSC)和SR-hADSC(自我更新hADSC)中在IL-2处理后差异表达的基因的表格。图10A显示了在SR和SEN-hADSC中IL-2处理后用于上调的基因的富集的生物途径。图10B显示了在SR和SEN-hADSC中IL-2处理后用于下调的基因的富集的生物途径。
图11-90阐述了在单独培养基(无IL-2刺激)温育或使用IL-2刺激后，在因子生成单元中保持的来自SR-hADSC或SEN-hADSC的命名蛋白质(因子)的分泌增加。
图91-96阐述了在用作hADCS培养基的10％富血小板血浆(PRP)中基本存在的特定命名因子的存在。
图97阐述了鉴定T细胞(Treg)的FACS分析门控策略。
图98阐述了本发明的示例性因子产生单元中产生的因子影响Treg的产生。
图99阐述了用于鉴定如图98所述的Treg群的示例性门控策略。
图100显示了示例性因子生产单元的示意图。
图101以示意形式显示了示例性因子产生单元。
图102以示意形式显示了包括多个中空纤维的示例性因子产生单元。
图103是沿线A-A截取的图102中提供的因子产生单元的横截面图。
图104以示意形式显示了包括流体处理隔室和细胞隔室的示意性形式的另一个示例性因子产生单元。
图105描绘了包含形成为膜或纤维垫的电纺聚合物纤维的另一个示例性因子产生单元。
图106A-B显示可以是反向透析系统或单采系统的一部分的示例性因子产生单元。具体而言，图106A显示了包括由多个中空聚合物纤维(管)形成的盒的因子产生单元。图106B提供了图106A中的中空聚合物管之一的横截面图，其显示了截留在纤维壁内的干细胞。
图107显示了封闭系统内的示例性因子产生单元。
图108阐释了衰老相关miRNA(SA-miRNA)功能以建立hADSC衰老表型。
图109阐释了描绘SA-β-Gal阳性和将SR-hADSC转化成SEN-hADSC的视野。
图110证明了SA-miRNA对基因转录(对SA-miRNA靶基因)的直接影响。
图111证明了SA-RNA对基因转录的间接影响。
图112显示用SA-miRNA转染的SR-hADSC和SEN-hADSC中的平均标准化蛋白质表达水平。
图113阐释了SA-miRNA在复制衰老中的新靶基因及其功能关系和富集。
发明详述
本文描述了与诱导干细胞(SC)群(例如间充质干细胞(MSC))有关的方法和组合物，以产生用于治疗个体中的疾病或病症的一种或多种有益因子，其中根据要治疗的疾病或病症的要求定制该产生。还提供了用于诱导衰老的组合物和方法，其可用于在干细胞群中诱导衰老，进而产生用于治疗个体中的疾病或病症的一种或多种有益因子。还提供了用于生产有益因子的因子产生单元及其制造和使用方法。
I.因子的产生
A.背景和整体系统
本文所述的发明提供了用于以下的组合物、装置和方法：通过诱导干细胞产生一种或多种有益因子，以及将所述因子递送和施用至有需要的个体。生产系统是可定制的，适合于产生有利于特定临床需要的因子。这些因子可以使用个体自身的细胞(自体系统)或使用来自另一个体的细胞(异源的系统)来产生。递送可以意味着急性或慢性施用范式，并且实际上可以使用任何递送系统。
本文所提供的有益因子可以是多肽(全长蛋白质和肽)，包括伤口愈合因子、凋亡因子、抗凋亡因子、抗炎因子、免疫调节因子、血管生成因子、趋化因子因子、细胞因子因子、白细胞介素、白细胞介素受体、生长因子、生长因子受体、激素、粘附促进因子、增殖诱导因子、信号转导刺激因子及其受体、神经营养因子、复原因子和修复触发因子。但是，有益因子不限于蛋白质，还包括小分子和代谢物。
B.输入细胞
如本文所提供，诱导包含干细胞的哺乳动物细胞群以产生一种或多种所需的有益因子。用于生产的细胞群(即输入细胞)不必纯粹由干细胞组成。只要输入细胞包含可被诱导或一般修饰以分泌因子的合适类型的干细胞，在输入细胞群中可包含一种或多种细胞类型。示例性干细胞包括但不限于胚胎干(ES)细胞、成体干细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)和用各种方法诱导成SR的SEN细胞。更具体地，成体干细胞包括但不限于造血干细胞(HSC)和间充质干细胞(MSC)。其他类型的可采用的细胞可以是间质小泡部分、血浆细胞、脐带血细胞、胎盘细胞、骨髓来源的细胞、上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞、成纤维细胞、软骨细胞、肝细胞、抗原呈递细胞、肥大细胞、肌细胞、抗体产生细胞、神经元和胶质细胞。
在一个示例性变化中，诱导MSC产生一种或多种有益因子。在细胞群中使用MSC可能是有益的。MSC是起源于中胚层的非造血成体干细胞的一个亚群，通常具有自我更新能力并不仅多向分化成中胚层谱系如软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞和肌细胞，还多向分化成外胚层细胞和内胚层细胞。MSC几乎存在于所有组织中。
MSC可以来源于任何合适的组织。在一个变化中，MSC源自脂肪组织(ADSC)，特别是从消化或机械分离的脂肪组织获得的基质血管部分(SVF)。如本文所用，术语“脂肪”是指任何脂肪组织，并且脂肪组织可以来自具有脂肪组织的任何生物体。脂肪组织可以是来源于哺乳动物的皮下，网膜/内脏，乳房，性腺或其他脂肪组织位点的棕色或白色脂肪组织。在某些变化中，脂肪是皮下白色脂肪组织，内脏脂肪组织或脂肪抽吸样品。脂肪组织的一个方便来源是吸脂手术，但是脂肪组织的来源不需要如此限制。可用任何合适的酶(例如胶原酶)消化脂肪组织以产生MSC，或可机械分离。在一些变化中，MSC人是脂肪来源的MSC(hADMC或hADSC或hADMSC)。在其他变化中，MSC来自非人哺乳动物脂肪组织。
输入细胞可以是自体的(来自接受因子的个体的细胞)或异源的(不是来自接受因子的个体的细胞)。输入细胞可以包含来自单个个体的细胞，或者可以包含来自多于一个个体的细胞的混合物。细胞可能纯粹是ADSC，或者可以是细胞的异质混合物。可以理解的是，本领域的技术人员将具有定制输入细胞的能力，以便控制随后的因子产生。
在一些变化中，输入细胞包含干细胞，其中干细胞至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或甚至90％为SR干细胞(例如SR-ADSC，或SR-hADSC)。在示例性变化中，输入细胞是MSC并且包括至少50％的SR MSC。SR干细胞可以根据其形态、增殖指数和一个或多个标记物来定义。
在一些变化中，输入细胞包含干细胞，其中干细胞至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或甚至90％为SEN干细胞(例如SEN-ADSC，或SEN-hADSC)。在示例性变化中，输入细胞是MSC并且包含至少50％的SEN MSC。SEN干细胞可以根据其形态、增殖指数和一个或多个标记物来定义。
1.衰老的诱导
在一些变化中，为了实现特定的一组预期的因子的产生，合意的是使用衰老或接近衰老的干细胞(统称为SEN)。如本文所用，SEN干细胞是那些复制衰老的细胞。复制衰老表征为生长停滞、凋亡抵抗、高水平的代谢活动、形态学和细胞大小改变、肿瘤抑制因子P16、P21、P53和/或RB的高水平表达、衰老相关β半乳糖苷酶活性(SA-β-gal)增加和合成和修复DNA的能力丧失。干细胞的复制老化可以影响其生物学特性。
在特定的变化中，干细胞是SEN-ADSC，例如SEN-hADSC。干细胞可能是天然的SEN，或者它们可能被诱导以经历衰老。全文当提到SEN细胞时，应理解该术语既包括天然存在的SEN干细胞，也包括那些诱导为SEN的干细胞。诱导干细胞经历衰老的示例性方法包括但不限于非编码miRNA的递送(如下所述)，递送衰老诱导剂，如WO2013/078392中所述的那些，包括但不限于暴露至基因毒素、辐射、紫外线、肿瘤抑制诱导剂、有丝分裂抑制剂、核酸损伤剂、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、激素抑制剂、生长因子抑制剂或PARP抑制剂。
在一个变化中，诱导衰老的方法包括将衰老相关的miRNA模拟物转染到SR细胞群或包含至少一些需要诱导的SR细胞的干细胞群以实现SEN状态。在这种变化中，SR-ADSC用选自miR-17-5p、miR-18a-5p、miR-20a-5p、mir-92a1-5p、mir-19a-3p、mir-125b1-5p、mir100-5p和mir-let7a-2-3p的miRNA转染，如实施例10和图108-112所述。
2.干性的诱导(复原)
在其他变化中，为了实现预期因子特定集合的产生，预期利用为SR细胞并表现出高度干性的干细胞。在特定的变化中，干细胞是SR-ADSC，例如SR-hADSC。干细胞可以是天然的SR，也可以复原成为SR。全文当提及SR细胞时，应该理解该术语包括天然存在的SR干细胞以及那些诱导成为SR的干细胞。诱导干细胞经历复原的示例性方法包括但不限于WO2012058097和WO2013126565(降低干细胞群中SINE/ALU反转录转座子转录物的水平或活性)中所述的那些。
在一个变化中，示例性方法包括分离包含干细胞的样品。如上所述，通过观察特定特征来测定样品以确定其是否是SEN或SR。如果是SEN，细胞可能会像上面提到的那样复原成为SR。复原的SEN干细胞释放的因子可能与SR干细胞相同或不同。
在一个变化中，使SEN干细胞复原涉及降低SINE/ALU逆转录转座子的水平或活性。降低可以包括向所述细胞中引入包含或编码靶向SINE/ALU逆转录转座子转录物的小干扰RNA(siRNA或shRNA)分子的任何构建体。例如，小干扰RNA可以包含选自以下的分子：单链RNA、成对双链RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)和PIWI RNA(piRNA)。该构建体可以产生SINE/ALU转录物的稳定下调，或者在一些变化中可以暂时下调。例如，构建体可以包含载体如质粒载体或病毒载体。例如，病毒载体可以选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关载体。
可以使用任何用于引入构建体的合适机制，例如转化，转导，转染或感染。在一些变化中，该方法可以包括通过脂质或脂质体。此外，靶向SINE/ALU反转录转座子的合成piRNA的递送可以通过使用任何类型的生物弹射装置来实现，所述生物弹射装置提供用DNA转染细胞的物理方法并且不依赖于特定的配体-受体或任何生物化学特征参见例如US20040033589)。
在一个变化中，可以通过Wang等人所述的那些方法来实现复原。(Nature，2014年12月18日；516(7531)：405-9)，以递送HERVH驱动基于HERVH的转录；或驱动LBP9转录因子驱动的成体干细胞复原。
在一些变化中，在足以诱导或恢复增殖能力的量的输入干细胞群中降低SINE/ALU反转录转座子转录物的水平或活性的步骤仅在首先鉴定为SEN的细胞中进行。例如，可以通过本文所述的质量控制(QC)技术筛选细胞(新鲜或冷冻保存)以鉴定SEN细胞，并且可以靶向这些细胞的复原。因此，本文所述的任何方法可以包括QC步骤以在复原和/或诱导之前鉴定细胞的衰老状态。或者，在一些变化中，为复原SEN和SR干细胞的混合群中的所有细胞都可以使用本文所述的任何方法进行处理。一旦复原，仅之前SEN复原的细胞群的因子，或SR/复原SEN的混合群的因子可以直接从这些细胞(例如，无诱导)中使用。备选地或另外地，可以诱导复原的SEN细胞群，复原的SEN和SR细胞的混合群或仅SR细胞群产生因子，并如本文所述使用它们所得的因子。在一些变化中，来自诱导群和非诱导群的因子(和/或细胞本身)可以组合或单独使用。在一些变化中，施用诱导的或未诱导的群的提取物。这在图1A中示意性地描述。
在使用冷冻保存或其他储存方法的情况下，使用复原的干细胞可能特别重要。与可能处于SR状态的新鲜分离的干细胞相比，长期传代或从低温保存复苏干细胞通常降低了干细胞分裂的能力。
C.干细胞的诱导和因子的产生
如本文所提供，来自SEN和SR干细胞的因子的产生对于治疗广泛的疾病和病症是可定制的。响应于诱导剂，在特定的条件设置下，可以诱导干细胞产生或分泌特定的因子组合。对产生的因子的特定组合的贡献包括哪种类型的干细胞被诱导、干细胞群的表征为SR或SEN、选择使用的诱导剂、诱导的持续时间和诱导后的时间间隔。
在本文提供的变化中，因子集合通常可以表征为例如多个因子的集合，其中一种或多种因子是伤口愈合因子、凋亡因子、抗凋亡因子、抗炎因子、免疫调节因子、血管生成因子、趋化因子因子、细胞因子因子、白细胞介素、白细胞介素受体、生长因子、生长因子受体、激素、粘附促进因子、增殖诱导因子、信号转导刺激因子及其受体、神经营养因子、复原因子和修复触发因子。
1.诱导剂和条件
本发明的干细胞与本发明的诱导剂接触(例如与其组合)。如本文所用，诱导剂可以是能够与干细胞相互作用或影响干细胞(例如特异性或非特异性地结合受体；诱导转录和翻译)的任何分子或遗传修饰，通过整合到干细胞的基因组中来产生诱导因子或使其异位表达，影响或诱导干细胞的基因表达，影响干细胞的信号转导，和/或影响干细胞的转录、翻译或翻译后机制以诱导一种或多种因子的产生和分泌。
诱导剂的非限制性实例包括小分子、蛋白质、肽、抗体、寡核苷酸、适体、由核酸分子编码的因子以及RNAi、miRNA或长ncRNA。
用于基因导入的病毒载体的代表性实例包括腺病毒载体、腺伴随病毒载体和逆转录病毒载体。通过将靶基因导入DNA或RNA病毒如减毒逆转录病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德比斯病毒(Sindbis virus)、仙台病毒(Sendai virus)，SV40或人免疫缺陷病毒(HIV)，并用这种重组病毒感染细胞或使用CRISPR技术将靶基因引入细胞。
在一个变化中，所述诱导剂包括细胞因子例如IL-2、维甲酸及其来源的物、趋化因子(chemotactic factor)、趋化因子(chemokine)、激素、生长因子、白细胞三烯、前列腺素、血栓和血小板活化因子(PAF)，和由细胞分泌的介体调节子如但不限于肥大细胞分泌的调节子。
在一个示例性变化中，诱导剂是IL-2或IL-2的同种型。
诱导因子可以与任何类型的培养基中的细胞组合，或通过基因工程的方式(例如，如果诱导因子由核酸分子编码)递送，以及作为RNAi、miRNA、长ncRNA递送。
包含诱导后产生/分泌的因子的培养基在本文中可以称为“条件培养基”。
在一个示例性变化中，细胞在包含富血小板血浆(PRP，例如10％PRP)的培养基中培养，且诱导剂与培养基混合。
在另一个变化中，细胞在血浆、血清、脐带血血清和血小板来源的物如血小板裂解物中培养。在一个变化中，使用人血小板裂解物来培养SVF。在其他变化中，SVF培养基中包含富血小板血浆。
在另一个示例性变化中，当基质小泡部分用于因子产生时，胎牛血清(FBS)和成纤维细胞生长因子(FGF)-2是可用于培养基中的物质。
在另一个变化中，细胞在无血清培养基中培养。无血清培养基可以包含组分，例如在标准无血清培养基制剂中提供的元素，包括能量来源如葡萄糖、无机盐、脂溶性成分、氮源和维生素或脂质组合物。
通常，诱导干细胞包括将干细胞暴露于诱导剂(本文中通常可互换地称为将干细胞暴露于诱导剂/用诱导剂引发/与诱导剂接触/用诱导剂诱导/与诱导剂温育/用诱导剂刺激)预定量的时间，例如长于5分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、30小时、36小时小时、42小时、48小时、3天、4天或甚至长于5天。细胞可以暴露于恒定水平的诱导剂或不同的水平(例如，初始更高，随后使用更低水平，随暴露时间增加水平，随暴露时间降低水平，随暴露时间随机水平等)。在暴露之后，在使用由细胞产生的因子之前，可以洗涤或以其他方式处理细胞以除去诱导剂。变化的温育时间影响因子的产生，因此可以变化进而定制特定下游临床应用的产品。在一些变化中，在除去诱导剂之后立即收集因子；在一些变化中，去除诱导剂5分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、3天、4天或者甚至长于5天后收集/去除/递送/使用所述因子。在一些示例性变化中，在去除诱导剂后24、48或72小时收集/去除/递送/使用因子。在其它示例性变化中，将细胞与诱导剂组合如上文规定的时间段，除去诱导剂(例如替换培养基)，使细胞恢复如下范围的预先确定的诱导后时间段：一(1)小时、六(6)小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时，或任何这些诱导后时间段的组合。
2.因子产生的诱导
诱导和产生可以经定制以产生特定的因子。这可以通过各种方式来实现，例如通过选择特定的细胞群，通过调整细胞培养基的组成，或通过选择特定的诱导剂。如本文所提供的以及下文所述，因子的产生发生在本文提供的因子生产单元中的任何一个中。因子产生单元包含输入干细胞群和为细胞群提供支持的基质。
培养的持续时间(例如，诱导后)可经调整或控制以通过因子生成单元定制因子生产。可以在诱导后5分钟至5天的预定时间收集因子，如上所述。
可能有益于本文所述方法的因子包括但不限于参与皮肤再生/复原通路的白细胞介素、白细胞介素受体和结合蛋白、生长因子、生长因子受体、趋化因子、细胞因子、趋化因子、提供细胞粘附的分子、促进细胞增殖的因子、神经营养因子、可促进皮肤再生的因子、可促进或抑制伤口愈合的因子、可促进透明质酸合成的因子、可促进皮肤弹性的因子、抑制恶性肿瘤形成的因子、与抑制UV诱导的皮肤损伤和色素沉着有关的因子、刺激毛发生长的因子、刺激代谢，内分泌功能和改善胰岛素敏感性的因子、促进一氧化氮产生的因子、抗细胞凋亡因子、促凋亡因子因子、抗坏死，抗炎因子和可用于抑制哮喘和过敏反应的因子、免疫调节剂、管生成剂、免疫调节剂、信号转导配体和受体、抑制脑炎症、脑外伤和神经肌肉疾病方面的神经营养因子、抑制神经元发育异常的因子，促进脊髓运动神经元轴突退化逆转并刺激神经发生和神经元存活的因子、通过产生胶原、弹性蛋白和透明质酸促进细胞外基质(ECM)恢复的因子、杀菌、抗微生物、抗真菌活性以及促进细胞存活、组织修复、再生和细胞分化的因子。
图11-17显示了在与单独含有10％PRP(富血小板血浆)的培养基温育24小时后，保持在本发明的因子产生单元中的来自SR-hADSC的下述命名蛋白质(因子)的分泌增加(无IL-2刺激)。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。因子产生单元产生的因子是有益的，并且可以提供以下治疗益处：刺激烧伤和导致组织损伤时的炎症的疾病中的免疫反应，如伤口愈合、炎性肠病(IBD)如克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎(RA)、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、多发性肌炎、皮肌炎和硬皮病、与老化和光损伤皮肤有关的皮肤美容应用以及需要具有杀菌和抗真菌活性的抗微生物蛋白的治疗。
图11显示白细胞介素5(IL5)和白细胞介素6(IL6)的分泌增加。IL-6的受控生产和递送对于递送抗炎症状况、骨质疏松症和用于改善睡眠相关状况可能是预期的。IL-5的受控产生和递送对于增强免疫力可能是预期的，例如增加Th1细胞、巨噬细胞、IFN-γ和树突细胞的产生。
图12显示白细胞介素1受体4(IL1R4)的分泌增加。图13显示神经营养因子3(NT3)、血小板来源的生长因子Aα(PDGF AA)、血小板来源的生长因子Aβ(PDGF AB)和原血小板碱性蛋白(pro-platelet basic protein，PPBP)的分泌增加。图14显示趋化因子(C-C基序)配体18(CCL18)、趋化因子(C-C继续)配体25(CCL25)、趋化因子(C-C基序)配体27(CCL27)和CXC趋化因子配体11(CXCL11)的分泌增加。图15显示细胞间粘附分子1(ICAM-1)和金属蛋白酶抑制剂2(TIMP-2)的分泌增加。图16显示了金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)的分泌增加。图17显示了血管上皮(VE)钙粘蛋白(钙依赖性细胞粘附蛋白)的分泌增加。
图18-19显示了与单独的10％PRP温育24小时后(无IL-2刺激),来自SR-hADSC的以下命名的蛋白质(因子)的分泌增加。发现这些蛋白质不存在于PRP中。图18显示白细胞介素4(IL4)的分泌增加。图19显示胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP1)的分泌增加。
该因子产生单元(图18-19)产生的因子可以为刺激活化的B细胞和T细胞增殖以及B细胞分化为血浆细胞提供治疗益处。IL-4诱导B细胞类别转换成IgE，并上调MHC II类产生。IL-4减少Th1细胞、巨噬细胞、IFN-γ和树突细胞的产生。IL-4在血管外组织中的存在促进巨噬细胞向M2细胞的替代激活，并抑制巨噬细胞向M1细胞的经典活化。已经显示IGFBP1和2及其蛋白水解片段通过影响人牙龈成纤维细胞的增殖和迁移而在炎性条件下改善组织修复。
图20-31显示在与10％PRP单独温育48小时后(无IL-2刺激)，保持在本发明的因子产生单元中的来自SR-hADSC的下述命名蛋白质(因子)的增加。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。在这些条件下由因子产生单元产生的因子可以提供以下治疗益处：毛发生长和形态发生、皮肤创伤、皮肤病症、皮肤病损害、皮炎、牛皮癣、湿疣、疣、血管瘤、瘢痕瘤、皮肤癌、特应性皮炎、白塞病、慢性肉芽肿病、皮肤T细胞淋巴瘤、溃疡、以引起炎症和免疫失调的初始损伤为特征的病理状态，其导致慢性组织重塑包括纤维化和功能丧失、抗感染的皮肤防御、胶原、弹性蛋白和透明质酸的新合成、黑素瘤生长的抑制、糖尿病性溃疡、心肌梗塞、动脉粥样硬化、乳糜泻、类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)、哮喘、脑炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、炎性骨溶解、过敏性疾病、感染性休克、肺纤维化(例如特发性肺纤维化)炎性vacultides(例如结节性多动脉炎，Wegner肉芽肿、Takayasu动脉炎、颞动脉炎和淋巴瘤样肉芽肿)、创伤后血管成形术(例如血管成形术后的再狭窄)、未分化的脊椎关节病、未分化的关节病、关节炎、炎性骨溶解、慢性肝炎以及由慢性病毒或细菌感染导致的慢性炎症、慢性肝纤维化、肝硬化、暴发性肝衰竭、过敏性气道炎症、急性肺损伤、心肌梗塞、胎儿母体耐受、骨关节炎、GVHD、神经退行性病变的治疗例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿氏舞蹈症或继创伤如中风和脑或脊髓外伤后的神经退行性病变。
图20显示白细胞介素9(IL9)和白细胞介素18结合蛋白α(IL18BPa)的分泌增加。图21显示白细胞介素1受体II型(IL1R2)、白细胞介素2受体β(IL-2Rb)、白细胞介素2受体γ(IL-2Rg)、白细胞介素5受体α(IL5Ra)、白细胞介素10受体β(IL10Rb)、白细胞介素18受体辅助蛋白(IL18Rb)和白细胞介素21受体(IL-21R)的分泌增加。图22显示胰岛素样生长因子2(IGF2)、转化生长因子α(TGFa)、转化生长因子β1/潜伏相关肽(LAP)(TGFb1)和转化生长因子β2(TGFb2)的分泌增加。图23显示受体酪氨酸蛋白激酶ErbB-3(ErbB3)、Fas配体(FasLG)、白血病抑制因子(LIF)、催乳素(PRL)因子、血小板来源的生长因子受体αPDGFRα)、血小板来源的生长因子受体β(PDGFRb)、干细胞因子试剂盒受体(SCFR)和唾液酸结合Ig样凝集素5(Siglec 5)的分泌增加。图24显示CXC趋化因子配体16(CXCL16)的分泌增加。图25显示活化的白细胞粘附分子(ALCAM)、E选择蛋白(免疫粘附中的细胞表面糖蛋白)、细胞间粘附分子2(ICAM2)、L选择素(淋巴细胞粘附分子)和血小板内皮细胞粘附分子(PECAM 1)的分泌增加。图26显示活化素A(INHBA)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)和瘦素受体(LEPR)的分泌增加。图27显示骨形态发生蛋白5(BMP5)、骨形态发生蛋白7(BMP7)、巨噬细胞集落刺激因子1受体(MCSFR)、基质金属蛋白酶1(MMP1)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、基质金属蛋白酶9(MMP9)和基质金属蛋白酶13(MMP13)的分泌增加。图28显示单核细胞分化抗原(CD14)、细胞分化抗原(CD80)、心肌营养素-1(CT-1)和白血病抑制因子(LIF)的分泌增加。图29显示内皮因子(ENG)的分泌增加。图30显示了具有免疫球蛋白样和EGF样结构域的酪氨酸激酶1(TIE1)和具有免疫球蛋白样和EGF样结构域的酪氨酸激酶2(TIE2)分泌的增加。图31显示活化素A(抑制素βA、INHBA)、瘦素受体(瘦素R)和转化生长因子β1(TGFb1)的分泌增加。
图32显示了在与单独的10％PRP温育48小时(无IL-2刺激)后，本发明的因子产生单元保持的从SR-MSC分泌的神经生长因子受体(NGFR)的增加。发现NGFR不存在于PRP中。在这些条件下由因子产生单元产生的因子可以为治疗神经退行性病变提供治疗移除，如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿舞蹈病或继创伤如中风和大脑或脊髓创伤以及独立或联合治疗需要肌肉骨骼和心脏修复的病况。
图33-39显示了在与单独的10％PRP温育72小时后(无IL-2刺激)，本发明的因子产生单元保持的从SR-hADSC分泌的以下命名蛋白质(因子)的增加。由因子产生单元产生的因子可以为治疗神经退行性病变提供治疗益处，例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿舞蹈病或继发性创伤如中风和脑或脊髓损伤，和需要肌肉骨骼和心脏修复的条件下单独或联合治疗。皮肤伤口、皮肤病、皮肤病损伤、皮炎、牛皮癣、湿疣、疣、血管瘤、瘢痕瘤、皮肤癌、特应性皮炎、白塞病、慢性肉芽肿病、皮肤T细胞淋巴瘤、溃疡、以引起炎症和免疫失调的初始损伤为特征的病理状态，其导致慢性组织重塑包括纤维化和功能丧失、抗感染的皮肤防御、胶原、弹性蛋白和透明质酸的新合成、黑素瘤生长的抑制、糖尿病性溃疡、心肌梗塞、动脉粥样硬化、乳糜泻、类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)、哮喘、脑炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、炎性骨溶解、过敏性疾病、感染性休克、肺纤维化(例如特发性肺纤维化)炎性vacultides(例如结节性多动脉炎，Wegner肉芽肿、Takayasu动脉炎、颞动脉炎和淋巴瘤样肉芽肿)、创伤后血管成形术(例如血管成形术后的再狭窄)、未分化的脊椎关节病、未分化的关节病、关节炎、炎性骨溶解、慢性肝炎以及由慢性病毒或细菌感染导致的慢性炎症、慢性肝纤维化、肝硬化、暴发性肝衰竭、过敏性气道炎症、急性肺损伤、心肌梗塞、胎儿母体耐受、骨关节炎、GVHD。
在图33-39中，相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。图33显示了白细胞介素1β(IL1b)、白细胞介素3(IL3)、白细胞介素-13受体亚单元α-2(IL13Rα2)和白细胞介素1受体α(IL1Rα)的分泌增加。图34显示促β细胞素(BTC)、集落刺激因子(CSF1)、成纤维细胞生长因子6(FGF6)、神经胶质细胞来源的神经营养因子(GDNF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、瘦素和血小板来源的生长因子Bβ(PDGFBB)的分泌增加。图35显示了干细胞因子/c-kit配体(SCF)、基质细胞来源的因子-1α(SDF1a)、基因细胞来源的因子-1β(SDF1b)、转化生长因子β1(TGFb1)、转化生长因子β3(TGFb3)和肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)的分泌增加。图36显示胰岛素样生长因子1(IGF1)的分泌增加。图37显示了转化生长因子β1(TGFb1)和血小板来源的生长因子Bβ(PDGF BB)的分泌增加。图38显示了趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、趋化因子(C-C基序)配体5(CCL5)、趋化因子(C-C基序)配体7(CCL7)、趋化因子(C-C基序)配体8(CCL8)和趋化因子(C-C基序)配体11(CCL11)的分泌增加。图39显示了趋化因子(C-C基序)配体13(CCL13)、趋化因子(C-C基序)配体22(CCL22)、趋化因子(C-C基序)配体23(CCL23)、趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)和CXC趋化因子配体10(CXCL10)的分泌增加。
图40-42显示了在与单独的10％PRP温育72小时后(无IL-2刺激)，本发明的因子产生单元保持的从SR-hADSC分泌的以下命名蛋白质(因子)的增加。发现这些因子被不在PRP中。图40-42显示了在与单独的10％PRP温育72小时后(无IL-2刺激)，本发明的因子产生单元保持的从SR-hADSC分泌的以下命名蛋白质(因子)的增加。发现这些因子被不在PRP中。在这些条件下由因子产生单元产生的因子可以为下述的治疗提供治疗益处：神经退行性病变如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿舞蹈病或继创伤如中风和脑或脊髓创伤、湿疣、疣、血管瘤、瘢痕瘤、皮肤癌、色素性视网膜炎、特发性肺纤维化、慢性肝纤维化、肝硬化、暴发性肝衰竭、过敏性气道炎症、急性肺损伤、特应性皮炎、白塞病、慢性肉芽肿疾病、皮肤T细胞淋巴瘤、溃疡，以引起炎症和免疫失调的初始损伤为特征的病理状态，其导致慢性组织重塑包括纤维化和功能丧失、肾缺血性损伤、囊性纤维化、鼻窦炎和鼻炎或者整形外科疾病、自身免疫性肝炎和需要肌肉骨骼和心脏修复的病症的独立或组合治疗。
图40显示了脑源性神经营养因子(BDNF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、骨形态发生蛋白6(BMP6)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)和胰岛素样生长因子结合蛋白-4(IGFBP4)的分泌增加。图41显示了趋化因子(CXC基序)配体13(BLC)、趋化因子(C-C基序)配体23(CCL23)、趋化因子(C-C基序)配体28(CCL28)、趋化因子(C-C基序)配体11(嗜铬细胞活化趋化因子1)、趋化因子(CXC基序)配体6(GCP-2)、FLT3LG(Fms相关的酪氨酸激酶3配体)和Fractalkine(CX3CL1)的分泌增加。图42显示基血管紧张素(ANG)和集落刺激因子2(CSF2)的分泌增加。嗜酸细胞活化趋化因子1可作为抗哮喘和过敏反应的药物。Flt3LG刺激造血细胞祖细胞的增殖和分化，Fractalkine调节细胞毒性效应T细胞，诱导迁移T&B细胞淋巴细胞，NK细胞和单核细胞，BLC控制B细胞在淋巴组织中的组织。CCL23与肺和肝组织中的免疫调节有关，ANG信号与心血管疾病中的保护作用相关，CSF2被用作治疗类风湿性关节炎的潜在疗法并刺激巨噬细胞。此外，刺激白细胞的产生并防止化疗后的中性粒细胞减少。已批准其用于治疗非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、真菌感染和霍奇金病。
图43显示用IL-2刺激24小时后，本发明的因子产生单元中保持的来自SR-hADSC的趋化因子(C-C基序)配体27(CCL27)和TNFRSF1B(肿瘤坏死因子受体超家族成员1B)的分泌增加。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。
图44-53显示了用IL-2刺激48小时后，在本发明的因子产生单元中保持的来自SR-hADSC的以下命名的蛋白质(因子)的增加。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。
图44-53显示了在用IL-2刺激48小时后，在本发明的因子产生单元中保持的来自SR-hADSC的以下命名的蛋白质(因子)的增加。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。在这些条件下由因子产生单元产生的因子可以为治疗自身免疫性疾病提供治疗益处。如本文所提及的，“自身免疫性疾病”是指以受试者对其自身细胞、组织和/或器官的免疫反应引起的细胞、组织和/或器官损伤为特征的受试者的病况。可以用本发明的免疫调节细胞治疗的自身免疫性疾病的示例性，非限制性实例包括斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、肾上腺自身免疫性疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少症、白塞病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻性皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、Churg-Strauss综合征、瘢痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、盘状红斑狼疮、基本混合性冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病(Graves'disease)，格林-巴利(Guillain-Barre)、桥本甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA神经病、幼年型关节炎、扁平苔藓(lichen planus)、梅尼埃病(Meniere's disease)、混合性结缔组织病、多发性硬化症、I型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、寻常性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、银屑病关节炎、雷诺氏现象(Raynauld's phenomenon)、赖特氏综合征(Reiter's syndrome)、结节病、硬皮病、进行性系统性硬化症、舍格伦综合征(Sjogren's syndrome)、古德帕斯丘综合症(Good pasture'ssyndrome)、僵人综合征(stiff-man syndrome)、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、大动脉炎(takayasu arteritis)、颞动脉/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎如皮炎疱疹样血管炎、白癜风、韦格纳肉芽肿病、抗肾小球基质膜病、抗磷脂综合征、神经系统自身免疫病、家族性地中海热、朗伯-伊顿重症肌无力综合征(Lambert-Eaton MyasthenicSyndrome)、交感性眼炎、多内分泌疾病、银屑病等以及需要增强血管生成的疾病和病症。
图44显示了白细胞介素9(IL9)、白细胞介素11(IL11)、白细胞介素12α(IL12a)、白细胞介素12β(IL12b)和白细胞介素18结合蛋白α(IL18BPa)的分泌增加。图45显示了白细胞介素1受体I型(IL1R1)、白细胞介素1受体II型(IL1R2)、白细胞介素1受体IV型(IL1R4)、白细胞介素2受体β(IL-2Rb)、白细胞介素受体γ(IL-2Rg)、白细胞介素5受体α(IL5Ra)白细胞介素10受体β(IL10Rb)、白细胞介素18受体β(IL18Rb)和白细胞介素21受体(IL-21R)的分泌增加。图46显示了成纤维细胞生长因子4(FGF4)、FGF9、MSPα/HGF样因子(HGF样)、胰岛素样生长因子1(IGF1)、IGF2、胰岛素样生长因子结合蛋白-6(IGFBP6)、LAP(TGFβ家族)和血小板来源的生长因子αα(PDGFAA)的分泌增加。图47显示了血小板来源的生长因子Aβ(PDGFAB)、血小板来源的生长因子Bβ(PDGFBB)、基质细胞来源的因子-1α(SDF1a)、结合唾液酸的Ig样凝集素5(Siglec 5)、转化生长因子α(TGFa)、转化生长因子β2(TGFb2)、血管内皮生长因子(VEGF)和血管内皮生长因子D(VEGFD)的分泌增加。图47还显示DR6、Dtk、EGFR、内皮因子、ErbB3、Fas、Fas LG和IGF1sR的分泌增加。图48显示了瘦素(LEP)、瘦素受体(LEPR)、巨噬细胞集落刺激因子1受体(MCSFR)、神经营养因子4(NT4)、骨保护素(OPG)、血小板来源的生长因子受体α(PDGFRα)、血小板来源的生长因子受体β(PDGFRb)和催乳素(PRL)的分泌增加。图49显示干细胞因子受体(SCFR)、血管生成素1受体(TIE1)、血管生成素1受体(TIE2)、TNF超家族成员10C(TNFSF10C)、TNF超家族成员10D(TNFSF10D)、TNF超家族成员14(TNFSF14)、尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)和血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)的分泌增加。图50显示了趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、CCL3、CCL5、CCL8、CCL17、CCL20、CCL25、CXC趋化因子配体5(CXCL5)、CXCL11和CXCL16的分泌增加。图51显示活化的白细胞粘附分子(ALCAM)、骨形态发生蛋白5(BMP5)、BMP7、E选择素(内皮细胞粘附分子)、细胞间粘附分子2(ICAM2)、ICAM3、L选择素(淋巴细胞粘附分子)和基质金属蛋白酶1(MMP1)的分泌增加。图52显示了基质金属蛋白酶13(MMP13)、MMP3、MMP9、血小板内皮细胞粘附分子(PECAM1)、金属蛋白酶抑制剂TIMP1、TIMP2、TIMP4和血管上皮(VE)钙粘蛋白(钙依赖性细胞粘附蛋白)的分泌增加。图53显示了单核细胞分化抗原(CD14)、细胞分化抗原(CD80)、心肌营养素-1(CT-1)、白血病抑制因子(LIF)、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、血小板生成素(THPO)和淋巴细胞趋化蛋白(XCL1)的分泌增加。
如图44所示，某些因子会增加。IL18BPa可以阻断白细胞介素IL18诱导的干扰素γ的产生，并且与由感染、创伤和过敏引发的炎症反应的抑制相关。IL9防止细胞凋亡和黑素瘤抑制。IL11与脂肪生成抑制因子相关，改善化疗后血小板恢复并调节Ag/Ab反应。IL9参与骨细胞增殖分化。IL12诱导干扰素γ，刺激Th1和Th2分化，有效的免疫调节剂。
图54显示用IL-2刺激48小时后在本发明的因子产生单元中保持的来自SR-hADSC的神经生长因子受体(NGFR)的分泌增加。图54还显示使用IL-2在IL-2刺激后24小时IL8和TNFRSF1A的分泌增加。发现NGFR、IL8和TNFRSF1A不存在于PRP中。
图55-57显示了用IL-2刺激72小时后本发明的因子产生单元中保持的来自SR-hADSC的以下命名的蛋白质(因子)的分泌增加。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。图55显示了白细胞介素1受体α(IL1Ra)、白细胞介素6(IL6)和白细胞介素-13受体亚单元α-2(IL13Ra2)的分泌增加。图56显示了成纤维细胞生长因子6(FGF6)、原血小板碱性蛋白(PPBP)、干细胞因子(SCF)和血管内皮生长因子受体-3(VEGFR3)的分泌增加。图57显示了趋化因子(C-C基序)配体22(CCL22)、CCL23、CCL24、CCL26和CXC趋化因子配体10(CXCL10)的分泌增加。
图58显示了用IL-2刺激72小时后本发明的因子产生单元中保持的来自SR-hADSC的血管紧张素(ANG)、脑源性神经营养因子(BDNF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、集落刺激因子2(CSF2)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF-7)、干扰素γ(IFNγ)，胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP1)和来自SR-hADSC的IGFBP2的分泌增加。发现这些因子不存在于PRP中
图59显示近与10％PRP(无IL-2刺激)温育24小时后本发明的因子产生单元中保持的来自SEN-hADSC的成纤维细胞生长因子6(FGF6)、CXC趋化因子配体16(CXCL16)和基质细胞来源的因子-1α(SDF1a)的分泌增加。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。
图60显示了仅与10％PRP(无IL-2刺激)温育24小时后本发明的因子产生单元中保持的来自SEN-hADSC的脑源性神经营养因子(BDNF)、B淋巴细胞趋化因子(CXCL13；BLC)、趋化因子(C-C基序)配体1(CCL1)、Flt-3LG相关的酪氨酸激酶3配体)、Fractalkine(T细胞趋化因子CX3CL1)、粒细胞趋化蛋白2(GCP-2)/CXCL6、白细胞介素1α(IL1a)、白细胞介素4(IL4)、IL15和干扰素γ(IFNγ)的分泌增加。发现这些因子不存在于PRP中。
图61-70显示了仅与10％PRP(无IL-2刺激)温育48小时后本发明的因子产生单元中保持的来自SEN-hADSC的下述命名蛋白(因子)的分泌增加。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。图61显示白细胞介素2β(IL-2b)、IL3、IL5和IL6的分泌增加。图62显示白细胞介素1受体II(IL1R2)、白细胞介素2受体γ(IL-2Rg)、白细胞介素5受体α(IL5Ra)、白细胞介素10受体β(IL10Rb)、白细胞介素18受体结合蛋白α(IL18BPa)、白细胞介素18受体β(IL18Rb)和白细胞介素21受体(IL-21R)的分泌增加。图63显示了胰岛素样生长因子1(IGF1)、IGF2、LAP(TGFβ家族)、瘦素(LEP)、瘦素受体(LEPR)、血小板来源的生长因子Aα(PDGFAA)、血小板来源的生长因子Aβ(PDGFAB)和血小板衍生生长因子Bβ(PDGFBB)的分泌增加。图64显示了血小板来源的生长因子受体α(PDGFRα)、干细胞因子(SCF)、干细胞因子受体(SCFR)、转化生长因子β1(TGFb1)、转化生长因子β2(TGF b2)、转化生长因子α(TGFa)、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)和VEGFR3的分泌增加。图65显示了死亡受体6(DR6；TNF受体超家族成员21)、神经胶质细胞系衍生物的神经营养因子(GDNF)、神经营养因子3(NT3)、具有免疫球蛋白样和EGF-样结构域1的酪氨酸激酶(TIE1)、TIE2和TNF超家族成员14(TNFSF14)的分泌增加。图66显示了趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、CCL5、CCL8、CCL17、CCL18和CCL23的分泌增加。图67显示了趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)、CCL25、CCL26、CCL27、CXC趋化因子配体10(CXCL10)和CXCL11的分泌增加。图68显示了活化的白细胞粘附分子(ALCAM)、骨形态发生蛋白5(BMP5)、BMP7、E选择素(内皮细胞粘附分子)、细胞间粘附分子1(ICAM1)、ICAM2、L选择素(淋巴细胞粘附分子)和基质金属蛋白酶1(MMP1)的分泌增加。图69显示基质金属蛋白酶3(MMP3)、MMP9、MMP13、血小板内皮细胞粘附分子(PECAM1)、金属蛋白酶抑制剂TIMP1、TIMP2和TIMP4的分泌增加。图70显示了单核细胞分化抗原(CD14)、单核细胞分化抗原(CD80)、心肌营养素-1(CT-1)和白血病抑制因子(LIF)的分泌增加。CT-1在体内具有广谱的生物活性，其可以减轻肾毒性，预防损伤后神经元死亡，对肌萎缩侧索硬化症(ALS)神经肌肉变性起到保护作用。
图71-72显示了仅与10％PRP(无IL-2刺激)温育48小时后保持在本发明的因子产生单元中的来自SEN-hADSC的以下命名的蛋白质(因子)的分泌增加。发现这些因子不存在于PRP中。图71显示了骨形态发生蛋白4(BMP4)、趋化因子(C-C基序)配体11(CCL11)、CCL23、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP1)、IGFBP2、IGFBP4和神经生长因子受体(NGFR)的分泌增加。图72显示白细胞介素7(IL7)、IL10、IL13和IL16的分泌增加。
图73显示仅与10％PRP(无IL-2刺激)温育72小时后保持在本发明的因子产生单元中的来自SEN-hADSC的促β细胞素(BTC)、白细胞介素-13受体亚单元α-2(IL13Ra2)和基质细胞衍生因子-1β(SDF1b)的分泌增加。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。
图74显示仅与10％PRP(无IL-2刺激)温育72小时后保持在本发明的因子产生单元中的来自SEN-hADSC的肝细胞生长因子(HGF)、白细胞介素8(IL8)和TNFRSF1A(肿瘤坏死因子受体超家族1A成员)的分泌增加。发现这些因子不存在于PRP中。
图75显示用IL-2刺激24小时后保持在本发明的因子产生单元中的来自SEN-hADSC的趋化因子(C-C基序)配体23(CCL23)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、表皮生长因子(EGF)、CCL11(嗜酸细胞活化趋化因子1)、IL4和神经生长因子受体(NGFR)的分泌增加。发现这些因子不存在于PRP中。
图75还显示了在IL-2刺激24h后CXCL16、HCC4、sgp130和TNFRSF1B的分泌增加。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。
图76-86显示了在用IL-2刺激48小时后保持在本发明的因子产生单元中的来自SEN-hADSC的以下命名的蛋白(因子)的分泌增加。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。图76显示了白细胞介素1β(IL1b)、IL3、IL5、IL6、IL9、IL10、IL12b和白细胞介素18结合蛋白α(IL18BPa)的分泌增加。图77显示白细胞介素1受体α(IL1Ra)、IL1R4、IL10Rb、IL18Rb、IL1R2、IL-21R、IL-2Rb、IL-2Rg和IL5Ra的分泌增加。图78显示了成纤维细胞生长因子6(FGF6)、胰岛素样生长因子IGF1和IGF2、LAP(TGFβ家族)、神经营养因子3(NT3)、血小板来源的生长因子r Aα(PDGFAA)、血小板来源的物生长因子Aβ(PDGFAB)和血小板来源的生长因子受体α(PDGFRα)的分泌增加。图79显示干细胞因子(SCF)、转化生长因子2(TGF2)、TGFa、TGFb1、TGFb3、肿瘤坏死因子β(TNFb)、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)和VEGF R3的分泌增加。图80显示了DR6(TNF受体超家族成员21)、内皮因子(ENG)、受体酪氨酸蛋白激酶erbB-3(ErbB3)、Fas配体(FasLG)、神经胶质细胞系来源的物的神经营养因子(GDNF)、GITR配体(GITR LG)和瘦素受体(LEPR)的分泌增加。图81显示催乳素(PRL)、干细胞因子受体(SCFR)、结合唾液酸的Ig样凝集素5(Siglec 5)、血管生成素1受体(TIE1)和血管生成素1受体(TIE2)的分泌增加。图82显示了趋化因子(C-C基序)配体8(CCL8)、CCL13、CCL15、CCL17、CCL18和CCL20的分泌增加。图83显示了趋化因子(C-C基序)配体22(CCL22)、CCL24、CCL26、CXC趋化因子配体9(CXCL9)和CXCL11的分泌增加。图84显示活化素A(INHBA)、骨形态发生蛋白5(BMP5)、E选择素(内皮细胞粘附分子)、细胞间粘附分子1(ICAM 1)、ICAM 2、L选择素(淋巴细胞粘附分子)和巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)的分泌增加。图85显示基质金属蛋白酶1(MMP1)、MMP13、MMP3、MMP9、血小板内皮细胞粘附分子(PECAM1)和金属蛋白酶抑制剂4(TIMP-4)的分泌增加。图86显示了单核细胞分化抗原(CD14)、淋巴细胞分泌素(XCL1)、心肌营养素-1(CT-1)、白血病抑制因子(LIF)、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)和原血小板碱性蛋白(PPBP)的分泌增加。
图87显示了在用IL-2刺激48小时后保持在本发明的因子产生单元中的来自SEN-hADSC的脑源性神经营养因子(BDNF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP2)、IL-2、IL16和干扰素γ(INFγ)的分泌增加。发现这些因子不存在于PRP中。
图88-89显示了在用IL-2刺激72小时后保持在本发明的因子产生单元中的来自SEN-hADSC的下述蛋白质(因子)的分泌增加。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。图88显示了脂联素(Acrp30)、刺鼠相关蛋白(AgRP)、ANGPT2(血管生成素2)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、促β细胞素(BTC)、白细胞介素-13受体亚单元α-2(IL13Ra2)、瘦素(LEP)、神经营养因子4(NT4)和基质细胞来源的因子-1α(SDF1a)的分泌增加。图89显示了趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、CCL4、CCL5、CCL23、CCL25、CCL27、CXC趋化因子配体10(CXCL10)、基质细胞来源的因子-1β(SDF1b)、金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)、TIMP2和肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)的分泌增加。
图90显示了在用IL-2刺激72小时后保持在本发明的因子产生单元中的来自SEN-hADSC的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL13的分泌增加。发现这些因子不存在于PRP中。
通常，本文提供的输入细胞和系统可产生因子，包括但不限于HB-EGF；FGF1、2和4；PDGF；IGF-1；TGF-β1和β2；TGF-β3；IL-1α和-β；IL-10；IL-4；IL-2、IL-12；IL-6、IL-8、IL-17a；LEP和LEPR；内皮因子；Adipoq；IGFBP1、IGFPB3；CSF1、CSF3和受体CSFR1；PPBP/NAP-2；HGF；NGRF；EGF；TNF-α及其组合。
使用本文提供的涉及皮肤再生途径的输入细胞和系统产生的示例性白细胞介素包括但不限于IL 1b(白细胞介素1β)、IL 2b(白细胞介素2β)、IL 3(白细胞介素3)、IL 6(白细胞介素6)、IL6ST(白细胞介素6ST)、IL 9(白细胞介素9)、IL 11(白细胞介素11)、IL12a(白细胞介素12α)、IL 12b(白细胞介素12β)、IL 13(白细胞介素13)和IL 17(白细胞介素17)。
使用本文提供的输入细胞和系统产生的示例性白细胞介素受体和结合蛋白包括但不限于IL1Rα(白细胞介素1受体α)、IL1R1(白细胞介素1受体1型)、IL1R2(白细胞介素1受体2型)、IL 1R4(白细胞介素1受体4)、IL 2Ra(白细胞介素2受体α)、IL 2Rg(白细胞介素2受体γ)、IL 5Ra(白细胞介素5受体α)、IL 6R(白细胞介素6受体)、IL 10Rb(白细胞介素10受体β)、IL 13Ra(白细胞介素13受体α)、IL 18Rb(白细胞介素受体β)、IL 18BP(白细胞介素18结合蛋白)、IL 21R(白细胞介素21受体)。
使用本文提供的输入细胞和系统产生的示例性生长因子包括但不限于：bFGF2(碱性成纤维细胞生长因子2)、bNGF(β-神经生长因子)、FGF4(成纤维细胞生长因子4)、FGF6(成纤维细胞生长因子6)、成纤维细胞生长因子9(FGF 9)、Fas配体、IGFBP1(胰岛素生长因子结合蛋白1)、IGFBP3(胰岛素生长因子结合蛋白3)、IGFBP6(胰岛素生长因子结合蛋白6)、LAP(转化生长因子样)、IGF-1(胰岛素样生长因子1)、IGF-2(胰岛素样生长因子2)、PDGF(血小板来源的生长因子)、PDGFAA(血小板来源的生长因子Aα)、PDGFAB(血小板源性生长因子Aβ)、PDGFBB(血小板源性生长因子Bβ)、TGFB1(转化生长因子β1)、ANG(血管生成素)、BDNF(脑源性神经营养因子)、BMP4(骨形态发生蛋白4)、BMP 6(骨形态发生蛋白6)、bNGF(β-神经生长因子)、BTC(促β细胞素)、CNTF(睫状神经营养因子)、EGF(表皮生长因子)、HGF(肝细胞生长因子)、肝细胞样生长因子、NT3(神经营养因子3)、NT4(神经营养因子4)、OPG(骨保护素)、Siglec5(唾液酸结合If-样凝集素5)和TGF A(转化生长因子α)、TGF b1(转化生长因子β1)、TGF b 2(转化生长因子β3)、VEGF(血管内皮生长因子)、VEGFD(血管内皮生长因子D)和PLGF(胎盘生长因子)。
使用本文提供的输入细胞和系统产生的示例性生长因子受体包括但不限于PDGFRA(血小板来源的生长因子受体α)、VEGFR2(血管内皮生长因子受体2)、VEGFR3(血管内皮生长因子受体3)、NGFR(神经生长因子受体)、EGFR(上皮生长因子受体)和TNFRSF 10D(肿瘤坏死因子受体10D)。
使用本文提供的输入细胞和系统产生的示例性趋化因子包括但不限于CCL 2(趋化因子配体2)、CCL 3(趋化因子配体3)、CCL 4(趋化因子配体4)、CCL 5(趋化因子配体5)、CCL 7(趋化因子配体7)、CCL 8(趋化因子配体8)、CCL 13(趋化因子配体13)、CCL 15(趋化因子配体16)、CCL17(趋化因子配体17)、CCL18(趋化因子配体18)、CCL19(趋化因子配体19)、CCL20(趋化因子配体20)、CCL22(趋化因子配体22)、CCL 23(趋化因子配体23)、CCL 24(趋化因子配体24)、CCL25(趋化因子配体25)、CCL 26(趋化因子配体26)、CCL 27(趋化因子配体27)、CCL 28(趋化因子配体28)、CXC L1(趋化因子配体1)、CXCL1/2/3(趋化因子配体1/2/3)、CXCL5(CX趋化因子配体5)、CXCL9(CX趋化因子配体9)、CXCL 10(CX趋化因子配体10)、CXCL 13(CX趋化因子配体13)和CXCL 16(CX趋化因子配体16)。
使用本文提供的输入细胞和系统产生的提供细胞粘附信号传导的示例性分子包括但不限于ALCAM(细胞粘附分子)、E-选择素和VE钙粘蛋白。
使用本文提供的输入细胞和系统产生的可以促进细胞增殖的示例性因子包括但不限于BMP4(骨形态发生蛋白4)、BMP5(骨形态发生蛋白5)、BMP6(骨形态发生蛋白6)、BMP7(骨形态发生蛋白7)、CSF1R(集落刺激因子1受体)、ICAM2(细胞间粘附分子2)、MMP1(基质金属肽酶1)、MMP3(基质金属肽酶3)、MMP9(基质金属肽酶9)和TIMP4(金属蛋白酶抑制剂4)。
皮肤衰老和与皮肤老化有关的生理变化包括干燥症、屏障功能的丧失、由于胶原和弹性蛋白纤维的破坏引起的弹性损失、皱纹变化以及最终导致皮肤变薄的表皮细胞的有效周转的丧失、颧部脂肪萎缩和色素改变。尽管老化是不可避免的，但在本文所述的组合物的一些变化中可以用来对抗这些生理和解剖变化。使用本文提供的输入细胞和系统产生的可以促进皮肤再生的示例性因子包括但不限于CXCL16(趋化因子配体16)、IGF-2(胰岛素样生长因子2)和TIE2(具有免疫球蛋白/EGF样结构域的酪氨酸激酶)。
使用本文提供的输入细胞和系统产生的可促进伤口愈合的示例性因子包括但不限于活化素A、IGF-2(胰岛素样生长因子2)和LEPR(瘦素受体)。
使用本文提供的输入细胞和系统产生的可促进皮肤中的透明质酸合成的示例性的因子包括但不限于激活素A、LEPR(瘦素受体、TGFB1(转化生长因子β1)、EGF(表皮生长因子)、HGF(肝细胞生长因子)和PDGF(血小板衍生生长因子)。
使用本文提供的输入细胞和系统产生的可促进皮肤弹性的示例性因子包括但不限于IGFBP1(胰岛素样生长因子结合蛋白1)、IGFBP2(胰岛素样生长因子结合蛋白2)、IGFBP4(胰岛素样生长因子结合蛋白4)、TIMP1(金属蛋白酶抑制剂1)和TIMP2(金属蛋白酶抑制剂2)。
使用本文提供的输入细胞和系统产生的抑制恶性肿瘤和UV诱导的皮肤老化的示例性因子包括但不限于内皮因子和SCFR(c-KIT干细胞因子受体)。
使用本文提供的输入细胞和系统产生的抑制伤口愈合或炎症反应的示例性因子包括但不限于CD14(细胞分化抗原14)、CD80(细胞分化抗原80)，IFNγ(干扰素γ)和LIF(白血病抑制因子)。
在示例性变化中，本文提供的输入细胞和系统产生的NGF(神经生长因子受体)可以是对治疗脱发有益的因子。
能够使用本文提供的输入细胞和系统产生的其它因子包括但不限于Adipoq(脂联素)、AgRP(刺鼠相关蛋白)、ANGPT2(血管生成素2)、AREG(双调蛋白)、Ax1(酪氨酸-蛋白激酶受体UFO)、BTC(β细胞素)、CD14(细胞分化抗原14)、CD80(细胞分化抗原80)、CT-1(cardiotropin-1)、Dtk(酪氨酸蛋白激酶受体TYRO3)、ErbB3(受体酪氨酸蛋白激酶erb-3)、OPG(骨保护素)、OSM(制瘤素M)、PPBP(血小板碱性蛋白)、PRL(促乳素)、THPO(血小板生成素)和TIE-1(血管生成素1受体)。
在一个示例性变化中，用IL-2诱导剂刺激SR-hADSC24小时，并使其产生因子24小时。图43显示了用IL-2诱导24小时后产生的因子的集合。
在另一个示例性变化中，用IL-2诱导剂刺激SR-hADSC 24小时，并使其产生因子48小时。图43-57显示了用IL-2诱导48小时后产生的因子的集合。
在另一个示例性变化中，用IL-2诱导剂刺激SR-hADSC24小时，并使其产生因子72小时。图43-58显示了用IL-2诱导72小时后产生的因子的集合。
在另一个示例性变化中，SR-hADSC是仅24小时的培养基，并使其产生因子24小时。图11-19显示了仅使用培养基诱导24小时后产生的因子的集合。
在另一个示例性变化中，SR-hADSC是仅24小时的培养基，并使其产生因子48小时。图11-42显示了仅用培养基诱导48小时后产生的因子的集合。
在另一个示例性变化中，SR-hADSC是仅24小时的培养基，并使其产生因子72小时。图20-42显示了仅使用培养基诱导72小时后产生的因子的集合。
在一个示例性变化中，用IL-2诱导剂刺激SEN-hADSC24小时，并使其产生因子24小时。图75显示了用IL-2诱导24小时后产生的因子的集合。
在另一个示例性变化中，用IL-2诱导剂刺激SEN-hADSC 24小时，并使其产生因子48小时。图75-90显示了用IL-2诱导48小时后产生的因子的集合。
在另一个示例性变化中，用IL-2诱导剂刺激SEN-hADSC 24小时，并使其产生72小时的因子。图75-90显示了用IL-2诱导72小时后产生的因子的集合。
在另一个示例性变化中，仅用培养基刺激SEN-hADSC 24小时，并使其产生24小时的因子。图59-60显示了仅使用培养基诱导24小时后产生的因子的集合。
在另一个示例性变化中，仅用培养基刺激SEN-hADSC 24小时，并使其产生48小时的因子。图59-74显示了仅使用培养基诱导48小时后产生的因子收集。
在另一个示例性变化中，仅用培养基刺激SEN-hADSC 24小时，并使其产生72小时的因子。图59-74显示了仅使用培养基诱导72小时后产生的因子的集合。
在示例性变化中，用于在因子生成单元中产生一种或多种因子的方法包括使用包含至少50％SEN-hADSC的输入细胞，向细胞群添加IL-2诱导剂以促进因子产生；并收集因子。
3.示例性的诱导方法
图1A描绘了用于实践本文描述的本发明的一个方面的示例性方法。
一般而言，基于细胞的SEN状态，可能存在如本文所述使用的多种类别的干细胞及其子组合。每个群和子组合可能产生不同的营养因子。例如，细胞群可能是完全SR、完全SEN或(更可能)SR和SEN细胞的混合群。如本文所述，可以诱导完全SR细胞群产生特定因子，并且可以产生营养因子的第一概貌(图1A“表型3”)。可以如本文所述仅复原SEN细胞群，并且可以在没有诱导(“表型1”)或具有诱导(“表型2”)的情况下产生因子。第四种表型可以是未被诱导产生因子的分离的SR细胞(“表型4”)。这些不同的群(复原的，以前的SEN细胞，诱导的和未诱导的，以及诱导的/诱导的SR细胞)可以单独或以各种亚组合方式用于治疗本文所述的任何疾病/病症。
图1A一般地阐述了用于修饰本发明的示例性输入细胞(人脂肪来源的间充质干细胞(hADSC))的特性以产生刚才提到的任何表型1-3的方法。如图1A所示，可以采取脂肪组织间充质干细胞(MSC)提取物，或者可以使用冷冻保存的细胞样品101。脂肪组织(和因此的MSC)可以来自自体或异源(例如来自用复原的和/或诱导的hADSC和/或提取物处理的同一患者，或来自供体MSC)。可以根据任何适当的方法收获脂肪组织。MSC可以从脂肪组织中扩增和/或分离，但通常培养MSC 103。任选地，作为培养步骤的一部分的单独步骤，可以检查(QC)细胞以确定SEN细胞的存在和/或对其进行鉴定。此后，如本文所述，可以使任何SEN-hADSC复原，使得所有细胞处于SR状态(其包括之前的SEN细胞，现在已经复原)，而不是SEN状态。
在一些变化中，只有鉴定的SEN细胞在SEN细胞群中或在SEN和SR细胞混合群中复原。例如，如果仅使SEN细胞复原，则可以首先从SR细胞中分离出SEN细胞。或者，可使包含SEN和SR细胞二者的混合群的所有细胞都复原。
例如，在图1A中，QC步骤可以鉴定仅SEN细胞的群113、SEN/SR细胞的混合群115和仅SR细胞的群117，或者该方法可以包括细胞分选步骤用于在该方法中分离SEN和SR细胞。此后，可以允许细胞在具有或没有诱导的情况下产生营养因子。例如，可以通过将所有或一些细胞暴露于IL-2(在该实例中)对其“诱导”(例如，准备好可靠且有效地产生预期的因子子集)107，107'，107"。如图1所示，细胞可以用IL-2诱导，具有或不具有用于治疗终点的复原。如图1A所示，每个亚群(可以任选地诱导复原的SEN仅113，仅SR-仅117和混合的复原的SEN和SR 115，且可以产生不同的营养因子集合，这些不同的群可以以任何亚组合(包括具有未诱导的SR细胞或来自它们的营养因子)进行组合用于在所描述的任何治疗方法中使用。例如，未诱导的复原的SEN细胞可以产生有益的营养因子集合(表型1)，且诱导的复原的SEN细胞可以产生有益的营养因子集合(表型2)，且诱导的SR细胞可以产生有益的营养因子集合(表型类型3)。如已经描述的，这些的任何组合可以经组合以形成治疗性细胞(hADSC)和/或其提取物的集合。
在另一个变化中，如图1A、1B、2A和2B所示，使用因子产生单元产生一种或多种因子(或图2A中的因子组合物)可以是受控或定制的。在例如用IL-2诱导/刺激细胞群后，细胞群产生一种或多种因子。随后可以在预定的时间点收集一种或多种因子，例如在24小时、48小时或72小时，如图所示，这取决于预期收集的因子。例如，如果在24小时产生白细胞介素，在48小时产生生长因子，在诱导后72小时产生趋化因子，并且需要生长因子用于配制成皮肤复原霜，可以培养因子产生单元并在诱导后48小时收集因子。因子产生的控制也可以通过因子产生单元中包含的细胞类型和基质类型来控制。可以理解的是，因子收集的时间点可以早于24小时和晚于72小时。
图2B是示意图，示出了五个示例性因子产生单元(A-E)其填入用于受控产生因子的个体hADSC。在该示例性方面，每个因子产生单元含有模拟干细胞的天然生长环境的ECM样3-D支架。所有五种因子产生单元都在合适的培养基中含有干细胞，例如，含有10％PRP的StemPro MSC SFM无Xeno培养基(除了因子产生单元A，其代表无细胞对照因子产生单元)。因子产生单元填充SR或SEN细胞，并用IL-2刺激或无刺激24小时。
D.因子组合物
如本文所述产生的因子可以配制成任何合适的组合物。对于本文所述的任何疾病和病症，组合物可定制为特定适应症的使用。
这些因子可以用任何合适的载体和/或赋形剂配制成局部组合物、口服剂型、植入物、可注射组合物或静脉内组合物。在一些情况下，包括额外的作用剂以增强所述因子的皮肤渗透或生物利用率，或增强皮肤外观的其它成分。一种或多种因子可以包括在组合物中。可以配制组合物用于一种或多种因子的即时、持续或受控释放。
并入组合物中的因子的量通常在构成所需量的因子的有效量的范围内，以诱导所需的生物反应。
在一个变化中，组合物包含由用IL-2诱导24小时的SR干细胞(例如SR-hADSC)产生的因子，其中在诱导完成后24小时收集因子。
在一个变化中，组合物包含由用IL-2诱导24小时的SR干细胞(例如SR-hADSC)产生的因子，其中在诱导完成后48小时收集因子。
在一个变化中，组合物包含由用IL-2诱导24小时的SR干细胞(例如SR-hADSC)产生的因子，其中在诱导完成后72小时收集因子。
在一个变化中，组合物包含由用IL-2诱导24小时的SEN干细胞(例如SEN-hADSC)产生的因子，其中在诱导完成后24小时收集因子。
在一个变化中，组合物包含由用IL-2诱导24小时的SEN干细胞(例如SEN-hADSC)产生的因子，其中在诱导完成后48小时收集因子。
在一个变化中，组合物包含由用IL-2诱导24小时的SEN干细胞(例如SEN-hADSC)产生的因子，其中在诱导完成后72小时收集因子。
在一个变化中，组合物包含由未用任何诱导剂诱导的SR干细胞(例如SR-hADSC)产生的因子。
在一个变化中，组合物包含由未用任何诱导剂诱导的SEN干细胞(例如SEN-hADSC)产生的因子。
E.疾病和病症的治疗
一种或多种诱导因子，包含一种或多种诱导因子的条件培养基或包含一种或多种因子的组合物可用于治疗多种疾病和病症。
可以治疗的疾病和病症的非限制性列表包括癌症、自身免疫性疾病、心血管疾病、糖尿病、皮肤病、神经退行性疾病、骨质疏松症、骨关节炎、脊髓损伤、肝脏疾病、肾脏疾病、与年龄有关的病理学、脱发、烧伤、需要皮肤移植的病况和皮肤损伤。
因子产生方法的有利方面是可以根据特定的疾病、病症或待治疗的病况来定制治疗。细胞群和基质的可以根据所需要产生的因子来选择。而且，所产生的因子可以在预定的时间收集。选定的细胞群在特定时间点产生的因子在治疗某些疾病、病症或病况方面可能比其他更有益。
以下将更详细地讨论用于治疗的因子的特定使用方式和递送。
如本文更详细描述的，可使用任何适当的方法(例如，乳剂组合物，注射、植入、经由血浆去除术等)产生因子并将其直接递送至有需要的个体。
或者，可使用本发明的示例性因子产生单元产生因子，并可用于调节来自个体的免疫细胞。在这种变化中，这些因子可以与来自个体的样品(例如血液或血浆)中的免疫细胞接触，效应免疫细胞的调节(免疫调节)(例如诱导Treg的产生/分化)，其后将样品递送回个体。在这个变化中，因子本身仅任选地递送。相反，它们的使用可以离体发生。在一个变化中，本文考虑使用本文产生的免疫调节细胞(例如，如所述产生的Treg)与使用本文所述的方法产生的其他因子的组合物、其他活性剂或治疗方式进行组合的组合疗法。这些其它作用剂或治疗可包括已知药物和治疗这些病症的疗法，如但不限于皮质类固醇和非甾体抗炎化合物和刺激性药物。
用于治疗本文所述的其他疾病或病症的因子可根据治疗方案在家或在医生办公室完成。
图1B阐释了用例如复原和诱导的hADSC治疗受试者的一般方法。在该示例性方法中，该方法可以包括从待治疗的受试者201提取脂肪组织，随后培养来自该脂肪组织的MSC203的初始步骤(例如，当执行自体过程时)(如上文在图1A中所示)。受试者自身细胞的使用是任选的(如围绕201、203的虚线所示)，因为可以使用异源细胞(例如来自供体)代替或此外当使用不包含完整hADSC的处理的hADSC的提取物时可能是特别有效的。
随后可如上文图1A中所述处理培养的MSC(例如hADSC)以通过降低或抑制SINE/ALU逆转录转位子的活性(和/或水平)将其复原205，和/或随后对其诱导(例如通过将其暴露于IL-2)207。当通过暴露于如IL-2的诱导剂诱导细胞时，可以选择暴露的浓度和持续时间以引起强烈的诱导反应。这种处理的实例描述于下文实施例中。
一旦复原和诱导，可以使用来自hADSC的因子或提取物来治疗患者，如图1B的209所述。在该实例中，来自MSC的提取物可以通过任何适当的机制来施用，包括局部地或系统地施用，例如通过注射。如本文所用，施用复原的和诱导的MSC/hADSC可以包括施用实际的细胞细胞和/或细胞提取物。
1.真皮-化妆品和皮肤应用
在一些变化中，诱导的因子，包含一种或多种诱导的因子的条件培养基或包含一种或多种因子的组合物可在用于皮肤应用的组合物中使用，例如美容应用，用于皮肤再生，用于皮肤复原，用于伤口愈合或美容治疗。这些因子可以用于治疗美容状况，例如但不限于皱纹、细纹、疤痕(包括痤疮疤痕)、皮肤变色、老年斑、皮肤弹性降低、阳光损伤和脱发。这些美容状况可以通过含有仅在10％PRP(无诱导剂)中的ADSC的因子产生单元分泌的因子处理。在一些变化中，这些因子可以与微针应用结合使用以模仿轻度创伤以促进因子递送和生理益处。
在仅10％PRP存在下，在不同时间点(例如24、48、72小时)收集的因子产生单元产生的因子可用于有效防治细胞水平上的皮肤老化，以解决外在和内在老化问题。
在一个变化中，因子在24小时后因子由含有仅在10％PRP中的SR ADSC的因子产生单元产生，并且包含这些因子的组合物(用于阶段1皮肤复原疗法的真皮美容组合物)可用于实现炎症发展与其迅速消退之间的平衡。在该变化中，24小时收集的因子的示例性组合物包括白细胞介素5(IL5)、白细胞介素6(IL6)、白细胞介素4(IL4)、白细胞介素1受体4(IL1R4)、神经营养因子3(NT3)、血小板来源的生长因子α(PDGF AA)、血小板来源的生长因子Aβ(PDGF AB)和原血小板碱性蛋白(PPBP)趋化因子(C-C基序)配体18(CCL18)、趋化因子(C-C基序)配体25(CCL25)、趋化因子(C-C基序)配体27(CCL27)和CXC趋化因子配体11(CXCL11)、(ICAM-1)、金属蛋白酶抑制剂2(TIMP-2)、金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)、血管上皮(VE)钙粘蛋白(钙依赖性细胞粘附蛋白)和胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP1)。
在另一个变化中，因子在48小时后因子由含有仅在10％PRP中的SR ADSC的因子产生单元产生，并且可以使用包含这些因子的组合物(用于阶段2皮肤复原疗法的真皮美容组合物)促进从伤口愈合的炎症阶段转变成肉芽化阶段(增殖)。在该变化中，在48小时收集的因子的示例性组合物包括白细胞介素9(IL9)、白细胞介素18结合蛋白α(IL18BPa)、白细胞介素1受体II型(IL1R2)、白细胞介素2受体β(IL-2Rb)、白细胞介素2受体γ(IL-2Rg)、白细胞介素5受体α(IL5Ra)、白细胞介素10受体β(IL10Rb)、白细胞介素18受体辅助蛋白(IL18Rb)和白细胞介素21受体(IL-21R)、胰岛素样生长因子2(IGF2)、转化生长因子α(TGFa)、转化生长因子β1/潜伏相关肽(LAP)、转化生长因子β1(TGFb1)、转化生长因子β2(TGFb2)、受体酪氨酸蛋白激酶ErbB-3(ErbB3)、Fas配体(Fas LG)、白血病抑制因子(LIF)、催乳素(PRL)因子、血小板来源的生长因子受体α(PDGFRa)、血小板来源的生长因子受体β(PDGFRb)、干细胞因子kit受体(SCFR)和唾液酸结合Ig样凝集素5(Siglec 5)、CXC趋化因子配体16(CXCL16)、活化的白细胞细胞粘附分子(ALCAM)、E选择素(免疫粘附中的细胞表面糖蛋白)、细胞间粘附分子2(ICAM2)、L选择素(淋巴细胞粘附分子)、血小板内皮细胞粘附分子(PECAM1)、激活素A(INHBA)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)和瘦素受体(LEPR)、骨形态发生蛋白5(BMP5)、骨形态发生蛋白7(BMP7)、巨噬细胞集落刺激因子1受体(MCSFR)、基质金属蛋白酶1(MMP1)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、和基质金属蛋白酶13(MMP13)、单核细胞分化抗原(CD14)、细胞分化抗原(CD80)、心肌营养素-1(CT-1)和白血病抑制因子(LIF)、内皮因子(ENG)、具有免疫球蛋白样和EGF样结构域的酪氨酸激酶1(TIE1)和具有免疫球蛋白样和EGF样结构域的酪氨酸激酶2(TIE2)、瘦素受体(瘦素R)和神经生长因子受体(NGFR)。
在另一个变化中，在72小时后因子由含有仅在10％PRP中的SR ADSC的因子产生单元产生，并且包含这些因子的组合物(用于阶段3皮肤复原疗法的真皮美容组合物)可用于促进从肉芽形成转变为伤口上皮再形成(皮肤剥落，这是皮肤组织重塑的开始)。在这个阶段，在ECM产生阶段产生的低强度、无组织的III型胶原和弹性蛋白结构由更强的III型胶原和结构化的弹性蛋白纤维所取代，以为真皮提供强度和弹性。在该变化中，在72小时收集的示例性因子组合物，包含如白细胞介素1β(IL1b)、白细胞介素3(IL3)、白细胞介素-13受体亚单元α-2(IL13Rα2)、白细胞介素1受体α(IL1Rα)、促β细胞素(BTC)、集落刺激因子(CSF1)、成纤维细胞生长因子6(FGF6)、神经胶质细胞来源的神经营养因子(GDNF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、瘦素、血小板来源的生长因子Bβ(PDGF BB)、脑源性神经营养因子(BDNF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、骨形态发生蛋白6(BMP6)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、胰岛素样生长因子结合蛋白-4(IGFBP4)、干细胞因子/c-kit配体(SCF)、基质细胞来源的因子-1α(SDF1a)、基质细胞来源的因子-1β(SDF1b)、基血管紧张素(ANG)、集落刺激因子2(CSF2)、转化生长因子β1(TGFb1)、转化生长因子因子β3(TGFb3)、肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)、趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、趋化因子(C-C基序)配体5(CCL5)、趋化因子(C-C基序)配体7(CCL7)、趋化因子(C-C基序)配体8(CCL8)、趋化因子(C-C基序)配体11(CCL11)、趋化因子(C-C基序)配体13(CCL13)、趋化因子(C-C基序)配体22(CCL22)、趋化因子(C-C基序)配体23(CCL23)、趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)、CXC趋化因子配体10(CXCL10)、趋化因子(C-X-C基序)配体13(BLC)、趋化因子(C-C基序)配体23(CCL23)、趋化因子(C-C基序)配体28(CCL28)、趋化因子(C-C基序)配体11(嗜酸细胞活化趋化因子1)、趋化因子(C-X-C基序)配体6(GCP-2)、FLT3LG(Fms相关的酪氨酸激酶3配体)和Fractalkine(CX3CL1)。
在另一个变化中，可以使用上述真皮美容组合物的组合来促进伤口愈合，例如切口和擦伤的愈合、烧伤、皮肤移植和压迫性溃疡。
在另一个变化中，任何皮肤病症都可以由本发明的因子生成单元产生的因子组合物来治疗。皮肤病包括银屑病、银屑病性关节炎、皮炎(湿疹)，例如剥脱性皮炎或特应性皮炎、毛发糠疹、玫瑰糠疹、副银屑病、地衣类糠疹、扁平苔癣、光泽苔藓、鱼腥型皮肤病、角化病、皮肤病、斑秃、坏疽性脓皮病、白癜风，类天疱疮(例如眼瘢痕性类天疱疮或大疱性类天疱疮)、荨麻疹、角化不全、涉及关节囊内侧上皮相关细胞的过度增殖和炎症的类风湿性关节炎；皮炎如皮脂溢性皮炎和日光性皮炎；角化病如脂溢性角化病、老年性角化病、光化性角化病。光诱导的角化病和毛囊角化病；寻常痤疮；瘢痕疙瘩和预防瘢痕疙瘩的形成；痣；疣包括平疣、湿疣或尖锐湿疣和人乳头瘤病毒(HPV)感染如性病疣；白斑；扁平苔藓和角膜炎。皮肤病症可以是皮炎，例如特应性皮炎或过敏性皮炎，或银屑病。在一个变化中，这些病况中的任何一个可以通过使用SR hADSC的因子产生单元产生的因子处理72小时。在该变化中，组合物包含白细胞介素1β(IL1b)、白细胞介素3(IL3)、白细胞介素-13受体亚单元α-2(IL13Rα2)、白细胞介素1受体α(IL1Rα)促β细胞素(BTC)、集落刺激因子(CSF1)、成纤维细胞生长因子6(FGF6)、神经胶质细胞来源的神经营养因子(IGF-1)、胰岛素样生长因子1瘦素、血小板来源的生长因子Bβ(PDGF BB)、脑源性神经营养因子(BDNF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、骨形态发生蛋白6(BMP6)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、胰岛素样生长因子结合蛋白-4(IGFBP4)、干细胞因子/c-kit配体(SCF)、基质细胞来源的因子-1α(SDF1a)、基质细胞来源的因子-1β(SDF1b)、基血管紧张素(ANG)、集落刺激因子2(CSF2)、转化生长因子β1(TGFb1)、转化生长因子β3(TGFb3)、肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)、趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、趋化因子(C-C基序)配体5(CCL5)、趋化因子(C-C基序)配体7(CCL7)、趋化因子(C-C基序)配体8(CCL8)、趋化因子(C-C基序)配体11(CCL11)、趋化因子(C-C基序)配体13(CCL13)、趋化因子(C-C基序)配体22(CCL22)、趋化因子(C-C基序)配体23(CCL23)、趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)、CXC趋化因子配体10(CXCL10)、趋化因子(C-X-C基序)配体13(BLC)、趋化因子(C-C基序)配体23(CCL23)、趋化因子(C-C基序)配体28(CCL28)、趋化因子(C-C基序)配体11(嗜酸细胞活化趋化因子1)、趋化因子(C-X-C基序)配体6(GCP-2)、FLT3LG(Fms相关的酪氨酸激酶3配体)和Fractalkine(CX3CL1)。
这些因子可以单独递送，或与不同时间点产生的因子组合，例如由SR细胞在10％PRP(与PRP单独温育24、48或72小时后)中产生的因子可以与由SR细胞+使用IL-2(诱导72小时后)产生的因子组合。
在一些变化中，可递送逐步剂量的因子以治疗皮肤相关病况。
在一些变化中，多种逐步剂量的因子可以与下述免疫调节组合物组合递送。
使用本文提供的输入细胞和系统产生的可以促进皮肤再生的示例性因子包括但不限于CXCL16(趋化因子配体16)、IGF-2(胰岛素样生长因子2)和TIE2(具有免疫球蛋白/EGF样结构域的酪氨酸激酶)。
使用本文提供的输入细胞和系统产生的可促进伤口愈合的示例性因子包括但不限于活化素A、IGF-2(胰岛素样生长因子2)和LEPR(瘦素受体)。
使用本文提供的输入细胞和系统产生的可促进皮肤中的透明质酸合成的示例性的因子包括但不限于激活素A、LEPR(瘦素受体、TGFB1(转化生长因子β1)、EGF(表皮生长因子)、HGF(肝细胞生长因子)和PDGF(血小板衍生生长因子)。
使用本文提供的输入细胞和系统产生的可促进皮肤弹性的示例性因子包括但不限于IGFBP1(胰岛素样生长因子结合蛋白1)、IGFBP2(胰岛素样生长因子结合蛋白2)、IGFBP4(胰岛素样生长因子结合蛋白4)、TIMP1(金属蛋白酶抑制剂1)和TIMP2(金属蛋白酶抑制剂2)。
使用本文提供的输入细胞和系统产生的抑制恶性肿瘤和UV诱导的皮肤老化的示例性因子包括但不限于内皮因子和SCFR(c-KIT干细胞因子受体)。
使用本文提供的输入细胞和系统产生的抑制伤口愈合或炎症反应的示例性因子包括但不限于CD14(细胞分化抗原14)、CD80(细胞分化抗原80)，IFNγ(干扰素γ)和LIF(白血病抑制因子)。
当用作化妆品(用于治疗美容或皮肤状况)时，可以根据治疗疗程来递送这些因子。根据因子递送的方式，治疗可以在家中或在医生办公室完成。在微针(下面描述)步骤或其他皮肤表面步骤之后递送因子可以是治疗疗程的一部分。
2.肿瘤学应用
在一些变化中，所产生的/分泌的因子，包含一种或多种因子的条件培养基，包含一种或多种因子的组合物或免疫调节的免疫细胞(例如本文产生的Treg)可用于治疗与异常的细胞分化相关的疾病或病症如癌症。细胞增殖性和/或分化性病症的实例包括任何类型的癌症(例如癌、肉瘤、转移性病症或造血系统肿瘤性病症，例如白血病)。如本文所考虑的，癌症可以是肺、乳房、甲状腺、淋巴腺和淋巴组织、胃肠器官和泌尿生殖道的癌症。癌症可以是腺癌，通常认为其包括恶性肿瘤例如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤，肺的非小细胞癌，小肠癌和食管癌。
在本发明的一个变化中，用IL-2刺激由SR细胞产生的，并在刺激后72小时收集的因子组合物可以施用于个体以治疗癌症。本文也考虑了过继性T细胞疗法的因子，当离体产生免疫调节的T细胞时，使用以IL-2刺激由SR细胞产生，并在刺激后72小时收集的因子，并与血液或血浆接触。
3.自身免疫性疾病
在一些变化中，所产生/分泌的因子，包含一种或多种因子的条件培养基，包含一种或多种因子的组合物或免疫调节的免疫细胞(例如本文产生的Treg)可用于治疗或减少自身免疫性疾病的体征和症状。
在本发明的一个变化中，用IL-2刺激由SR细胞产生，并在刺激后72小时收集的因子组合物可以施用于个体以治疗自身免疫性疾病。这样的组合物包含细胞因子和前列腺素，并且使用本发明中描述的装置，在递送给个体时这些因子可以释放到血液或受影响的组织中。
在一个变化中，本文提供的是可以用于重置效应T细胞/Treg细胞平衡以治疗T细胞依赖性炎性自身免疫疾病的因子，其中在效应T细胞之间经常存在(在某些自身免疫性疾病中数量增加)和功能性Treg(在某些自身免疫性疾病中数量减少)细胞间的不平衡。因此，本文提供了用于重置效应T细胞/Treg平衡而不递送IL-2药物本身的方法和因子生成单元。该方法适用于本文列举的任何自身免疫疾病，包括但不限于自身免疫性血管炎、斑秃、糖尿病、慢性移植物抗宿主病、阿尔茨海默氏病和年龄相关的神经退行性疾病、脑脊髓炎、多发性硬化、ALS、牙周感染、类风湿性关节炎、与癌症免疫疗法如CAR-T相关的可变程度的自身免疫性炎症、狼疮和强直性脊柱炎(Smigiel等，Immunol Rev.2014：40-59)。这种产生对于伤口愈合和伤口修复也是有用的。
在一个变化中，在SR细胞(或SEN细胞复原为SR)中产生用于Treg产生的因子，其中用IL-2诱导SR细胞产生因子(与IL-2结合约24小时的时间段)。在这些条件下产生的因子可以增加Treg产生(例如增加CD4+CD25+FoxP3+和/或CD4+CD25-FoxP3+的Treg)。在一个变化中，将SR细胞与IL-2一起温育约24小时，随后使来自SR细胞的条件培养基与血液的血液、血浆或外周血单核细胞(PBMC)接触约72小时的时间段，从而免疫调节血液、血浆或PBMC中的初始T细胞(T细胞)。
图2C显示了本发明的一个示例性方面，其包括对免疫调节有用的因子的产生和测试并且举例说明了Treg的产生。
4.神经退行性疾病和中风
在一些变化中，所产生/分泌的因子，包含一种或多种因子的条件培养基，包含一种或多种因子的组合物或免疫调节的免疫细胞(例如本文产生的Treg)可用于治疗或或减少神经退行性病症的体征和症状，包括但不限于阿尔茨海默病、多发性硬化症、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)和亨廷顿舞蹈症，以及预防损伤后的神经元死亡。使用本文提供的输入细胞和系统可以帮助治疗神经退行性疾病的示例性因子包括在诱导后24-72小时收集的由SEN hADSC+IL-2产生的因子；或诱导后48小时收集的由SR hADSC+IL-2产生的因子。在刺激后48小时收集的使用SEN ADSC+IL-2从因子产生单元获得的因子可经递送以实现针对细胞迁移的治疗效果，并根据需要增强血管再生和预防细胞凋亡。在一些变化中，组合来自这两个条件的因子并递送至需要的个体。
5.年龄相关的疾病
在一些变化中，所产生/分泌的因子，包含一种或多种因子的条件培养基，包含一种或多种因子的组合物或免疫调节的免疫细胞(例如本文产生的Treg)可用于治疗或减少与年龄有关的疾病的体征和症状。这种与年龄有关的疾病包括但不限于骨质疏松症、骨关节炎和关节炎。使用本文提供的输入细胞和系统可以帮助治疗年龄相关性疾病的示例性因子包括但不限于白细胞介素9(IL9)，白细胞介素18结合蛋白α(IL18BPa)，白细胞介素1受体II型(IL1R2)、白细胞介素2受体β(IL-2Rb)、白细胞介素2受体γ(IL-2Rg)、白细胞介素5受体α(IL5Ra)、白细胞介素10受体β(IL10Rb)、白细胞介素18受体辅助蛋白(IL18Rb)和白细胞介素21受体(IL-21R)、胰岛素样生长因子2(IGF2)、转化生长因子α(TGFa)、转化生长因子β1/潜伏相关肽(LAP)、转化生长因子β1(TGFb1)、转化生长因子β2(TGFb2)、受体酪氨酸蛋白激酶ErbB3(ErbB3)、Fas配体(Fas LG)、白血病抑制因子(LIF)、催乳素(PRL)因子、血小板来源的生长因子受体(PDGFRα)、血小板来源的生长因子受体β(PDGFRb)、干细胞因子kit受体(SCFR)和唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素5(Siglec 5)、CXC趋化因子配体16(CXCL16)、活化的白细胞粘附分子(ALCAM)、E选择素(免疫粘附中的细胞表面糖蛋白)、细胞间粘附分子2(ICAM2)、L选择素(淋巴细胞粘附分子)和血小板内皮细胞粘附分子(PECAM 1)、激活素A(INHBA)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)、瘦素受体(LEPR)、骨形态发生蛋白5(BMP5)、骨形态发生蛋白7(BMP7)、巨噬细胞集落刺激因子1受体(MCSFR)、基质金属蛋白酶1(MMP1)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、基质金属蛋白酶9(MMP9)和基质金属蛋白酶13(MMP13)、单核细胞分化抗原(CD14)、细胞分化抗原(CD80)、心肌营养素-1(CT-1)和白血病抑制因子(LIF)、内皮因子(ENG)、具有免疫球蛋白样和EGF样结构域的酪氨酸激酶1(TIE1)具有免疫球蛋白样和EGF样结构域的酪氨酸激酶2(TIE2)、瘦素受体(瘦素R)和神经生长因子受体(NGFR)。
在一个示例性变化中，当需要治疗年龄相关性疾病的因子时，SR干细胞群(例如hADSC)可以放置在含有10％PRP的培养基中的因子产生单元中，并且可以在48小时收集因子。
6.心血管疾病
在一些变化中，所产生/分泌的因子，包含一种或多种因子的条件培养基，包含一种或多种因子的组合物或免疫调节的免疫细胞(例如本文产生的Treg)可用于治疗或减少心血管疾病的体征和症状。这样的心血管疾病包括但不限于心肌梗塞和增强干细胞相关疗法。在放置于单独的10％PRP或与从因子产生单元使用SEN ADSC+IL-2刺激后48小时后收集获得的因子的组合中后48小时，从包含SR ADSC的因子产生单元获得的因子可递送以实现肌细胞分化，细胞迁移和血管生成的增强的治疗效果。当需要增强血运重建和预防细胞凋亡时，可以使用类似的因子组合物来治疗病症。
在一些变化中，当需要通过HGF的增强的细胞存活和旁分泌以促进心肌梗塞中的心脏保护时，可以使用含有无IL-2刺激的SEN ADSC(仅在PRP中)的因子产生单元来产生因子，在置于PRP中72小时后收集因子。
7.其他疾病
在一些变化中，所产生/分泌的因子，包含一种或多种因子的条件培养基，包含一种或多种因子的组合物或免疫调节的免疫细胞(例如本文产生的Treg)可用于治疗或减少其他疾病的征兆和症状，包括但不限于糖尿病、脊髓损伤、克罗恩氏病、再生障碍性贫血、类风湿性关节炎、脑损伤、移植物抗宿主病(GVHD)、肾脏疾病、肝硬化和中风，以及神经系统疾病和脊髓损伤。
II.因子产生单元
本文描述的是用于产生多种因子的系统，其对于如上所述的各种疾病和病症是有益的。所述系统可以包括因子产生单元，所述因子产生单元包含输入干细胞群和为细胞群提供支持的基质。在与合适的诱导剂接触后，刺激因子产生单元的细胞群以产生/分泌一种或多种因子。特定类型的因子的产生可以通过诱导剂的选择、细胞的选择、基质的选择和/或刺激/诱导后细胞培养的持续时间来定制。
图2D图示了如本文所述的本发明的示例性因子产生单元中的hADSC。因子产生单元举例说明了由模拟干细胞(例如MSC)天然存在的3-D细胞外基质(ECM)的聚合物基质/纤维制成的3-D支架。因子产生单元允许细胞维持在其天然环境中，从而维持干细胞的形态和分泌特性。干细胞产生生长因子、细胞因子和其他营养因子，其对因子产生单元局部环境的维持和调节以及因子产生单元空间以外的生物活性分子的分泌起重要作用。左下两个小图显示了没有细胞的3D支架，右下两个小图显示来自健康的49岁患者的表达GFP的hADSC细胞，放大倍数为10x和40x(PD 8)。通过病人ADSC的慢病毒转导产生表达GFP的ADSC，以使基质中的细胞可视化。表达GFP的hADSC在StemPro MSC SFM无Xeno培养基(ThermoFisherScientific)中以10％PRP维持在因子产生单元中12天。GFP显示了因子产生单元中的细胞形态和细胞活力。
A.细胞
如本文所提供的，输入细胞群可以包括可被诱导产生/分泌因子的任何合适类型的干细胞。产生的因子可以用于治疗或减轻多种疾病和病症的体征和症状。
因子产生单元可以包括输入细胞群，其被诱导产生因子以递送至个体。输入细胞可以是自体的(来自接受因子的个体的细胞)或异源的(不是来自接受因子的个体的细胞)。
因子产生单元可以包括SR细胞(包括SEN细胞，其复原为SR)、SEN细胞(包括诱导为SEN的SR细胞)、仅SR细胞、仅SEN细胞、SR和SEN细胞的混合物及其任何变化。
B.基质
除了细胞群之外，因子生成单元还包含为细胞群提供支持的基质。
能够成为细胞群的的基质或支架或可保持或携载细胞群的任何合适的结构都可以用作细胞群的基质。例如，群的细胞可以被放置并支撑在基质如膜(film)、膜(membrane)、片，网，盘，棒，纤维，纳米纤维的表面，包封或嵌入材料内。
因子产生单元可容纳一定体积的细胞，例如多孔板、管、室或其他容器。在一些变化中，因子产生单元是包括各种隔室和/或过滤机构的组件。在进一步的变化中，因子产生单元是可以放置在身体组织或管腔内的植入物。或者，因子产生单元可以包括设置在另一个结构上或层叠在另一个结构上的涂层，例如在多孔板的孔上。
在一些变化中，因子产生单元是单采系统的一部分。术语“单采单采(apheresis)”是指去除血液成分的过程或系统的总称。该过程更具体地由被去除的特定血液成分限定。例如，如果血浆被移除，则该过程或系统称为“血浆单采法”或血浆单采类型系统。”单采系统可用于交换细胞类型(例如，进行红细胞单采用于镰状细胞病)、处理血浆(例如去除抗体、副蛋白、胆固醇)或修饰血液成分(例如光分离)。
用于形成基质的聚合物是生物相容的，并且可以是可生物降解的或不可生物降解的。示例性的聚合物包括但不限于聚酰胺、聚(硅氧烷)、聚(硅酮)、聚(乙烯)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙烯醇)、聚(丙烯酸)、聚(醋酸乙烯酯)、聚丙烯酰胺、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(乙二醇)、聚(甲基丙烯酸)、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(丙交酯-共-乙醇酸)、聚酸酐、聚原酸酯、聚(碳酸酯)、聚(丙烯腈)、聚(环氧乙烷)、聚苯胺、聚乙烯咔唑、聚苯乙烯、聚(乙烯基苯酚)、聚羟基酸聚(己内酯)、聚酸酐、聚羟基烷酸酯、聚氨基甲酸酯、胶原、白蛋白、藻酸盐、壳聚糖,纤维连接蛋白、明胶、淀粉、透明质酸及其共混物和共聚物。
基质可以包含一种或多种纤维。纤维可以在毫米、微米或纳米范围内。如本文所用，“纤维”指具有任何直径的纤维，包括纳米纤维(直径小于1000纳米(nm))和微纤维(直径小于50微米(μm))。用于制造本文所述的基质的纤维的直径可以在约50nm至约20μm的范围内。例如，纤维直径可以为约50nm、约100nm、约200nm、约300nm、约400nm、约500nm、约600nm、约700nm、约800nm、约900nm、约1μm、约2μm、约5μm、约6μm、约7μm、约8μm、约9μm、约10μm、约15μm、约20μm、约25μm、约30μm、约35μm、约40μm、约45μm或约50μm。
在一些情况下，基质包含一种或多种纳米纤维可能是有益的。这些纳米纤维可以配置成形成各种尺寸、形状和几何形状的二维(2D)或三维(3D)基质。在一个变化中，纳米纤维用于构建人造细胞外基质(ECM)。纳米纤维可以是或可以不是中空的。另外，纳米纤维可以包括在纳米纤维上或内部的各种形状、直径和/或分布的孔。
当用于构建合适的ECM环境，选择准确模拟天然ECM的机械性质的材料可为维持细胞群和为因子的产生提供最佳环境。包括的材料可以是不可生物降解的聚合物或设计为缓慢降解的聚合物。不可生物降解的聚合物可以包括聚氨基甲酸酯、聚碳酸盐/酯或聚酯对苯二甲酸酯。可生物降解的聚合物可以包含聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸、明胶、胶原或纤维连接蛋白。
C.基质的形成
基质可以通过任何合适的工艺形成。例如，它们可以通过挤压、注塑成型、真空热成型或压印聚合物材料而形成。当由纤维构成时，纤维也可以通过挤压和注塑成型而形成。然而，纳米纤维的制造由于其微小的直径而可能是具有挑战性的。传统的方法如多孔固体中或在层状晶体的台阶处的形成常常是无效的和昂贵的。另一种方法是静电纤维形成或静电纺丝或3-D激光打印。
在静电纺丝中，通常在靶(或收集器)和聚合物溶液或熔化物注射入的导电毛细管之间施加高压(例如，约0.3至约0.50kV)。如果毛细管是非导体如玻璃吸管，也可以通过导线将高电压施加到溶液或熔化物上。收集器可以是金属板或屏幕、旋转鼓，或者如果毛细管是垂直的，则甚至可以是液体浴。最初，通过电力和表面张力的相互作用，毛细管的开放端处的溶液被拉成锥形(所谓的“泰勒锥”)。在一定的电压范围内，在泰勒锥的尖端形成一股聚合物溶液(或熔化物)的细射流并射向靶标。来自电场的力加速和拉伸喷射。这种拉伸与溶剂分子的蒸发一起导致射流直径变小。随着射流直径的减小，电荷密度增加，直到聚合物内的静电力克服将射流保持在一起的内聚力(例如表面张力)，导致射流分裂或“喷射”成聚合物纤维复丝。纤维继续喷射直到其到达收集器，在这里将其收集成非织造纤维，并且任选地进行干燥。快速旋转的收集器收集排列的纤维，而固定的收集器收集随机定向的纤维垫。这些纤维和垫随后可以形成、成型等成为各种2D或3D结构。在一个变化中，纤维形成为类似于细胞外基质的结构。
可以调整静电纺丝过程的各种参数以改变纤维形态。例如，溶液参数、处理参数和如温度和湿度的参数可影响纤维形态，例如纤维直径和/或纤维的孔隙率。更具体地，可调整溶液参数如聚合物浓度、聚合物分子量和溶液粘度；和加工参数如施加的电压、溶液流速和收集器和喷嘴之间的距离。
在一些变化中，可以将不同聚合物的共混物电纺在一起，优选溶解一种聚合物以增加支架孔隙度。
可能会在制造对静电纺丝聚合物溶液中有用的聚合物可包括但不限于聚乙烯对苯二甲酸乙二酯、聚酯纤维、聚甲基丙烯酸甲酯,聚丙烯腈、硅酮、聚氨基甲酸酯、聚碳酸盐/酯、聚醚酮酮、聚醚醚酮、聚醚酰亚胺、聚酰胺、聚苯乙烯、聚醚砜、聚砜、聚己酸内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚醚酮酮(PEKK),、聚甘油癸二酸、聚二醇柠檬酸盐、多羟基丁酸酯、聚醚酰胺、聚二烷酮及其组合、共混物或共聚物。用于电纺丝的替代聚合物溶液可以包括天然聚合物如纤维连接蛋白、胶原、明胶、透明质酸、壳聚糖或其组合。在示例性的变化中，聚合物是聚己内酯。
可以理解，静电纺丝溶液可以包括任何组成比例的聚合物或聚合物组合。聚合物在溶剂或多种溶剂中的浓度范围可以是但不限于约5wt％至约50wt％。在溶液中的聚合物浓度的一些非限制性实例可包括约5wt％、约10wt％、约15wt％、约20wt％、约25wt％、约30wt％、约35wt％、约40wt％、约45wt％或约50wt％，或这些值中任何两个之间的浓度。
在一些非限制性实施例中，聚合物溶液可包含重量百分比为约10％至约90％的聚乙烯对苯二甲酸乙二酯和聚氨基甲酸酯。例如，重量百分比可以为约10％、约25％、约33％、约50％、约66％、约75％、约90％或这些值中任何两个之间的重量百分比。
聚合物溶液可以另外包含一种或多种溶剂，例如丙酮、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮、乙腈、己烷、乙醚、二恶烷、乙酸乙酯、吡啶、甲苯、二甲苯、四氢呋喃、三氟乙酸、六氟异丙醇、乙酸、二甲基乙酰胺、氯仿、二氯甲烷、水、醇、离子化合物或其组合。
聚合物溶液还可以含有其他材料。这些其他材料的非限制性实例可以包括不透射线材料、导电材料、荧光材料、发光材料、抗生素、生长因子、维生素、细胞因子、类固醇、消炎药、小分子、糖类、脂质、盐、肽、蛋白质、细胞因子或其任何组合。
颗粒如盐或蔗糖可包括在静电纺丝过程中并沉积在整个支架。这些颗粒稍后可以溶解以增加支架孔隙率。可以控制纤维的性质以优化纤维直径、纤维间距或孔隙率、每根纤维的形态如纤维的孔隙率或纵横比，形状从圆形到带状变化。可以控制溶液参数以定制每根纤维的模量或其他机械性质、纤维组成和/或降解速率。纤维还可以形成为药物洗脱纤维、抗细菌纤维或不透射线纤维以帮助在X射线、CT或其他扫描中定位(positioning)或定位(locating)纤维。
示例性的支架可以通过下述制成：首先通过将2-30wt％的聚乙烯对苯二甲酸乙二酯(PET)溶解在1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇(HFIP)和三氟乙酸的混合物中制备聚合物纳米纤维前体溶液，且随后将溶液加热至60℃，继续搅拌以溶解PET。可将溶液冷却至室温，并将溶液置于具有钝头针(例如20计)的注射器(例如60cc)中。通过使用高电压DC电源电纺丝形成纳米纤维，设置为1kV-40kV(例如+15kV)正极性或负极性，5-30cm(例如15cm)尖端到基质的距离和1μl/hr至100mL/hr(例如10ml/hr)流速。也可以使用包括大量针(例如>1000)的针阵列来增加系统输出。纤维直径可以通过前体溶液和使用的溶剂的粘度来控制，合适的示例性纤维在100纳米至30微米的范围内。随机取向的和/或高度排列的纤维的约0.2-3mm(例如，1mm)的厚度可以沉积在形式上，并添加聚合物环，随后在所述形式旋转时添加另外的大约0.2-3.0mm(例如2mm)的纤维。可以将支架放置在真空中过夜以确保除去残余溶剂(通常小于10ppm)并使用射频气体血浆处理1分钟以使纤维更亲水并促进细胞附着。样品可以储存在可重新密封的聚乙烯袋等中。
或者，基质纤维可以由陶瓷材料形成。示例性陶瓷材料包括但不限于二氧化钛(TiO2)、二氧化硅(SiO2)、二氧化锆(ZrO2)、氧化铝(Al2O3)、钛酸锂(Li4Ti5O12)、氮化钛(TiN)和铂(Pt)。在一些变化中，纳米纤维由作为与聚合物混合的颗粒提供的陶瓷材料制成。
当细胞群包含在基质材料内时，例如在纳米纤维的材料中时，可将其加入到聚合物溶液中，随后电纺成纳米纤维。或者，可以经由单独的喷嘴(纤维化尖端)将细胞群喷雾(例如电喷雾)同时电纺纳米纤维，使得细胞在干燥之前变成嵌入、包封或包含在纳米纤维内。
一旦制成，纳米纤维可以配置以形成各种尺寸、形状和几何形状的二维(2D)或三维(3D)基质。例如，纳米纤维可以用于构建如ECM的人造组织。纳米纤维也可以用来形成网眼或纤维垫。网状物、纤维垫或纳米纤维的集合可以结合到绷带、伤口敷料、垫、擦拭物等中。或者，如下文进一步描述的，纳米纤维可用于构建因子产生单元的过滤器或组件。
在某些变化中，通过在具有所需基质形状的预成型心轴(预成型件)上电纺纳米纤维来形成基质。心轴可以涂覆特氟隆或类似的材料以便于在沉积之后去除基质。在一个变化中，心轴形状基于天然组织或器官。纤维通常通过从纤维化尖端挤出聚合物和/或陶瓷溶液，在纤维化尖端附近形成电子场，并且在心轴内设置接地极性或相反极性来形成纤维。心轴可以旋转以使心轴上的纤维对准，或者第二接地或者极性可以放置在心轴上，使得可以完成电场的快速切换以对准纤维。纳米级聚合物纤维可以是随机排列的，或者可能基本平行或两者。
纳米纤维结构以及本文所述的其它基质(例如，膜、膜、网、片、植入物等)可以用包含一种或多种细胞类型的细胞群接种以形成因子生成单元。接种以将细胞应用至基质表面可通过喷雾、电喷雾、移液和打印等已知方法完成。在一些变化中，将细胞电喷雾到基质上。在其他变化中，细胞的电喷雾与纳米纤维的静电纺丝同时发生，以将细胞接种在纳米纤维上或者将细胞包封(或分布)在纳米纤维材料内。在另外的变化中，细胞可以与聚合物和/或陶瓷材料混合，随后挤压或注塑成型成具有预期尺寸、形状或几何形状的基质。细胞可以以任何合适的方式接种或分布在基质上或基质内。例如，细胞可以在基质上以图案提供(例如，对称或不对称图案)，或者均匀或不均匀地分布在基质材料内。
基质或纳米纤维也可以用至少一种有效促进细胞附着于基质的化合物涂布或以其他方式处理。所述至少一种化合物可以选自蛋白质、肽、细胞因子、生长因子、抗生素化合物、脂质、抗炎化合物及其组合。
中空纤维/纳米纤维也可以通过静电纺丝来制造。这里可以使用单个喷嘴系统静电纺丝两种溶液，通常是两种不同的聚合物溶液。第一种聚合物被认为是纤维的核心，第二种聚合物是纤维的外壳。核心材料通常是牺牲性聚合物，其被配置成在电纺丝之后去除(例如通过加热)以留下中空纤维。
D.细胞在基质上的设置
细胞群可以设置在基质的表面上或者基质的材料(例如基质的本体)内。在基质包含纤维或纳米纤维的变化中，细胞群可以布置在纤维或纳米纤维的表面上和/或由纤维或纳米纤维形成的结构的表面上，或纤维或纳米纤维本身的材料内。可通过移液、喷雾(包括电喷射)、打印或将细胞压印到基质表面上，或通过挤压、注塑成型聚合物-细胞悬浮液将细胞群置于基质表面上。可以采用其他方式将细胞群包括在基质上或基质内。在一些变化中，可以将细胞群添加到聚合物组合物中，并且将得到的聚合物-细胞悬浮液静电纺丝，使得细胞位于纤维的聚合物材料内。可以操纵所使用的基质和/或纤维的类型以及包含在基质和/或纤维内的细胞的类型，使得因子产生单元的因子产生可定制以用于特定适应症的使用。例如，当这些因子用于化妆品用途时，基质可以包含许多排列成人造细胞外基质的纳米纤维，例如脂肪细胞外基质，细胞群可以包含间充质干细胞。在另一个变化中，因子由包含许多排列成人造细胞外基质和hADSC的纳米纤维的因子产生单元产生。
E.示例性的因子产生单元
在一个示例性变化中，因子产生单元包括包含纳米纤维的3D基质，所述纳米纤维形成为基本上模仿在脂肪组织内发现的细胞外基质的结构。可将包含MSC以及内皮细胞、巨噬细胞、单核细胞、周细胞、成纤维细胞、肥大细胞和免疫细胞的基质血管部分置于该特定基质上并培养并诱导产生一种或多种因子。含有一种或多种因子的条件培养基可用于本文提供的任何一种或多种应用(例如化妆品组合物，例如用于皮肤复原、伤口愈合或用于治疗如肿瘤、心血管、自身免疫、神经退行性、炎症或年龄相关性疾病如骨质疏松症和关节炎)。
本发明的因子产生单元可以是独立的，或者可以是更大的系统的一部分，例如本文描述的单采或血浆单采系统任何一个的一部分。参照图107，因子产生单元可以是封闭系统的一部分。在图107中，因子产生单元(500)配置成连接到个体的循环系统以使个体暴露于由其释放的因子。可以包括本文描述的任何合适的因子单元作为封闭系统的一部分。在此，封闭系统包括容器(502)、容器(502)内的因子产生单元(500)、流体氧生成装置(504)、用于将流体例如血液或血浆引入因子产生单元(500)的含氧流体入口(506)、用于从因子产生单元(500)去除流体的流体出口(508)、温度支持室(512)、样本收集出口(514)和输注泵(516)用于肝素或其他药物的施用。蠕动泵(510)驱动通过封闭系统的流体流动。通过因子产生单元(500)的流体流动可以在约50ml/分钟至约500ml/分钟的范围内，并且在37℃的血浆粘度为约1.10-1.30mPA。在一些情况下，通过封闭系统的流体流动范围为约0.1ml/分钟至约50ml/分钟。因子产生单元(500)通常配置为耐受约37℃至约40℃的温度。温度支持室(512)通常将因子产生单元(500)的温度维持在37℃。
具体而言，图107中的封闭系统包括容纳至少6ml的流体体积的容器(502)。可以理解的是，容器可以容纳其他流体体积。因子产生单元(500)通常用非肝素结合(例如，肝素浓度为约41.5U/ml)且耐受DMSO(例如约7-13wt％)的医疗级聚合物和细胞例如间充质干细胞形成。因子产生单元(500)可以配置为对分子量范围为约1-3kD、约3-6kD或6-50kD的因子是可渗透的。因子产生单元也可以是分子量为50kD及以上的因子可渗透的。流过流体入口(506)的流体可首先通过向因子产生单元(500)提供例如约21％O2,，约5％CO2,和约74％N2的氧生成装置(504)以支持细胞活力。在样品站(514)收集的因子通常以约0.2ml至约1ml的体积收集。
在一些变化中，因子产生单元是由电纺聚合物纤维形成的膜或垫，例如，如PCT公开号WO 2015/153011中所公开的。例如，如图105所示，因子产生单元可包含形成为膜或纤维垫(基质)(302)的电纺聚合物纤维(300)。纤维含有干细胞(未显示)，其用于通过释放来自干细胞的指导性细胞因子、基质因子、营养因子、介导子、激素和/或跨膜和免疫细胞对接受体来训练患者特异性免疫细胞(例如T细胞)。如上所述，该示例性变化可用于免疫调节应用，例如增加Treg的产生，例如用于治疗自身免疫性疾病。例如，当纤维垫(因子产生单元)是封闭系统如血浆单采系统的一部分时，纤维垫可以接触或放置在含有免疫细胞的血浆附近。纤维垫内的细胞可将因子分泌到血浆中，用于调节免疫细胞或实现免疫细胞的变化。干细胞和/或免疫细胞也可以产生用于收集和随后使用的因子。
如上所述，包含纤维垫和干细胞的因子产生单元可以是有用的免疫调节处理。在此，通过单采免疫细胞群(例如T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞或抗原呈递细胞等)或冷冻保存或分离的细胞汇集的循环细胞置于所提供的培养基并附着到纤维垫上或紧邻纤维垫放置并暴露于从纤维垫离体分泌的因子以实现细胞的变化(实现细胞中的免疫调节)。随后可将这些增强的免疫细胞从垫释放到血浆中，并将含有改变的细胞例如成熟T细胞、活化的巨噬细胞、树突细胞、NK细胞等的血浆以剂量依赖的方式递送回至个体。递送回至个体可以通过注射免疫调节细胞，以及与药物和药物组合物组合递送入血液循环。
可以将免疫调节细胞以及本文所述的含因子的组合物递送到淋巴管内(淋巴内施用)，或通过其它途径，例如但不限于皮下施用或舌下施用、口服、经皮(局部接种疫苗)、皮内、髓内、鞘内、心室内、鼻内、结膜、支气管内、透皮、直肠内、腹膜内、肌内、肺内、阴道、直肠和眼内。免疫调节细胞和含有因子的组合物也可以通过可植入装置递送。
在一些变化中，因子产生单元可以用于递送用于产生Treg的因子。
在其它变化中，因子产生单元可以是反向透析型系统的一部分，该反渗透型系统包括至少一个由含有干细胞的中空聚合物纤维(管)形成的盒，所述干细胞包埋在纤维壁内。干细胞可以是自体的或异体的。参考图106A，示例性系统包括因子产生单元(400)，所述因子产生单元(400)包括盒(402)，所述盒(402)包括平行延伸的多个聚合物管(404)。在示例性的变化中，系统首先采集受试者的血液并通过盒(402)循环。如图106B所示，图106B是图106A中聚合物管(404)之一的横截面图，穿过盒(402)的中空管(404)的血液(406)渗透管壁(410)以与其中包埋的干细胞(408)接触，这使得能够释放因子进入管(404)的腔(L)并且返回到血液(406)中。有因子的血液可以送回患者。该循环将被重复直到达到所需的因子剂量。如下面进一步描述的，这些类型的盒也可以用于血浆单采系统，其中从血液中除去细胞以形成血浆，并且血浆通过盒循环。释放到血浆中的因子可以在引入患者之前与细胞重新结合。美国专利8,172,784中公开了一种类似的中空纤维盒。中空管可以在其壁内包含允许从干细胞释放因子的孔。孔可以以任何合适的方式排列在管壁中，例如均匀地遍布或以对称或不对称的图案。也可以使用任何合适的孔径。在其他情况下，中空纤维壁由可透过这些因子的材料制成。类似于孔，整个管壁可以是可渗透的或者只是其一部分。干细胞也可以被接种和/或粘附到纤维壁的内表面和/或外表面，而不是被截留在纤维壁内。
在一些变化中，因子产生单元可以包括如美国专利4,929,354中所公开的包括褶皱圆柱膜的盒。因子产生单元可以包括具有其他合适几何形状的膜。
或者，因子产生单元可以包括基质，其中基质是具有沉积在孔表面上的至少一层聚合物纤维的单个或多个孔板，如U.S.9,074,172中所公开。聚合物纤维可能有利于其上的生物细胞的生长，因此可以用于细胞培养。聚合物纤维可以通过静电纺丝或3D打印沉积在孔的表面上。
在一些变化中，因子产生单元是血浆单采系统的一个组成部分，其中血液从个体中去除，在体外分离成血浆和血细胞(体外)，并且将产生/分泌自因子产生单元的一种或多种因子在使血浆和细胞返回到个体之前进入血浆。在此，分离的血浆可以通过各种因子产生单元(例如，包含多根纤维的过滤器)进行循环，以将一种或多种因子并入血浆中用于递送回个体。这些因子的递送也可能与药物或基因工程的生物制剂组合。
在一个变化中，用于体外循环的装置包括含有一个或多个隔室的盒或容器形式的因子产生单元，并且至少具有灌注入口和灌注出口。细胞群可以支持在盒的隔室内的基质上，其为活细胞提供了合适的环境，同时允许用合适的培养基灌注细胞以维持细胞。这种细胞室可以是例如中空纤维(其中血液或血浆在纤维外部循环)或平板；见例如U.S.6,759,245。
当因子产生单元用于免疫调节处理时，其可以设置在细胞收集单元的上游。在这种变化中，由单采免疫细胞群(例如T细胞，B细胞，巨噬细胞，NK细胞，树突状细胞或抗原呈递细胞等)或冷冻保存或分离的细胞汇集的循环细胞或血浆暴露于因子产生单元体外分泌的因子以实现细胞的变化。随后可以收集这些增强的免疫细胞并将其递送回受试者。
本文所述的因子产生单元可以包含任何类型的干细胞。在一些变化中，因子产生单元包括修饰的hADMSC。治疗个体的方法可以通过将其循环系统连接到这些因子生成单元上，由此使个体(通过血液)暴露于由输入细胞产生的因子来实现。
包含因子产生单元的装置也可以使用超滤生成器连续地将血浆与血液的细胞组分分离。超滤液(例如血浆)可以循环通过含有培养的干细胞的盒例如hADSC。或者，可以在因子产生单元处理全血。
因子产生单元通常可以包含由允许大分子和其他细胞来源的产品进出个体血浆的材料制成的半渗透屏障。在许多变化中，细胞本身并不离开因子产生单元，但是本发明不限于此。在循环并且一次或多次通过因子生成单元之后，经处理的血液或超滤液(例如血浆，其可以与个体的血液的细胞成分重组)可以通过静脉通路返回到个体。个体的血液或血浆可以补充肝素以防止凝血。这种循环可以连续维持例如2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时等疗程。血液或血浆可能将来自因子生成单元中干细胞的因子携带至个体。
因子产生单元还可以包括流体处理隔室和细胞隔室，并且任选包括分隔流体处理隔室和细胞隔室的选择性可渗透屏障。细胞容器可与因子生成单元的细胞室流体连通，其中细胞容器包含干细胞群，例如hADSC。来自个体的血液或超滤液可以进入流体处理室，其中干细胞分泌的作用剂通过干细胞与血液或超滤液直接接触直接进入血液或超滤液，或当存在时，通过使药剂通过任选的选择性渗透屏障。
图100阐释了示例性因子产生单元的示意图。因子产生单元可具有多个盒(1)和(2)含有如本文所述的修饰的(例如，复原和诱导的)hADSC。在该实例中，因子产生单元(1)包括用于从含氧流体供应装置(4)引入含氧流体的含氧流体入口(3)、含氧流体出口(3')、用于引入生物流体的流体入口(5)，其由泵(6)从免疫隔离单元(7)供应进入因子产生单元，和液体出口(5')，其用于从因子产生单元去除含有一种或多种因子的生物液体以返回到免疫隔离单元(7)。来自个体(9)的血液经由泵(6')流入血浆单采单元(8)，随后一部分血浆经由泵(6”)流入免疫分离单元(7)。处理的血浆(具有一种或多种因子)从免疫隔离单元(7)中流出，并在回流到个体(9)之前与来自血浆单采单元(8)的血液混合。
参照图101，示意性地示出了因子产生单元的另一个实例(参见U.S.7,160,719和U.S.8,172,784)。系统(10)由外部因子产生单元(FPU)(42)表示，其包括用于产生一种或多种因子的修饰的hADSC。血液或血浆可以通过生物流体入口通路(32)流经因子产生单元(42)，并且在引入一种或多种因子后，可以通过生物流体出口通路(33)排出。例如，可以使用导管将哺乳动物的血液经由生物流体入口路径(32)与EB(42)流体连通。在一些变化中，该装置包括超滤液(UF)生成器(41)。在那些情况下，来自哺乳动物(51)的血液沿着血液通路(31)流入UF生成器(41)，其中细胞成分与血浆分离。超滤的血浆随后沿路径(32)流入EB(42)，而细胞组分通过路径(34)重新结合经处理的UF。生物流体随后通过路径(35)返回到哺乳动物(51)或生物流体容器。
尽管图100和图101以特定的方向描绘了因子产生单元的各种组件，并且具有相似的尺寸，但组件可以处于任何方向、大小或形状。
通过反向透析系统或血浆截留系统的个体血浆的流速可以根据需要进行调整，例如达到约50-500ml/分钟的速率，例如50、100、200、300、400和500ml/分钟。在一些变化中，流速将调整以优化来自干细胞(例如hADSC)的分泌因子向超滤液的传递。在一些变化中，靶流速将是175毫升/分钟。治疗个体(例如，通过因子生成单元的个体血浆循环)可以持续治疗有效时间，例如1小时与72小时之间，例如约2、3、4、5、10、12、15，18、20或23小时。个体可以进行多轮修饰的hADSC疗法，每轮持续例如1小时至24小时。例如，可以继续该治疗，直到由个体或个体的医疗保健提供者决定达到所需的治疗因子剂量或效果。
在诱导后的其它预定时间点收集因子。或者，可以预先确定用于通过因子产生单元(例如中空纤维盒)的血浆或血液循环的预定持续时间，或通过因子产生单元的流动循环的次数，以定制个体接受因子的量(剂量)。
细胞产生的因子可以释放到血液、血浆或培养基中。这些因子可以释放到流过因子生成单元的血液、血浆或培养基中，例如中空纤维盒或释放到其中培养因子产生单元，例如电纺纳米纤维细胞外基质的培养基中。根据因子产生单元培养或因子产生单元暴露于流动的血液/血浆/培养基的时间，以及因子生成单元中包含的细胞类型，可以产生不同因子和/或不同因子量(剂量)。因此，可以根据因子产生单元的特定组成和其培养或暴露于流动的血浆/培养基的持续时间来控制或调整因子的制造。当因子产生单元暴露于流动的血液/血浆/介质时，因子的产生和剂量也可以根据流动周期的数量来调整。
在其他变化中，因子产生单元可整合(例如，具有整合的细胞室)，或配置成使用一个或多个可移除的盒来保持/培养干细胞。盒可以配置为单次使用(一次性)或重复使用。本领域已知多种合适的盒构造，参见例如美国专利5,270,192；7,160,719；6,858,146；6,582,955；6,759,245；8,172,784；Dixit and Gitnick,Eur.J.Surg.Suppl.(582):71-6(1998)；and Legallais et al.,J.Memb.Sci.181:81-95(2001)。这种盒可以包括例如中空纤维或平板。可以使用半渗透膜将待处理的生物流体与细胞分离，并且这种膜可以形成盒的一部分，例如盒的外壁。盒可配置成插入因子产生单元，例如作为因子产生单元的一部分或作为整个因子产生单元。因此，因子产生单元可能是更大系统的一部分。
图102是包含多个中空纤维(140)以及入口(110)和出口(120)的由中空纤维筒(100)表示的示例性因子产生单元的示意图。中空纤维是半渗透性的，允许干细胞分泌的因子例如hADSC进入血液或血浆中。
图103是图102中的线A-A处的因子产生单元(100)的横截面图，示出了具有由毛细管外空间(150)围绕的内部毛细管腔(130)的中空纤维(140)。在中空纤维因子产生单元中，干细胞可以在腔(130)中，而血液或血浆流过毛细管外空间(150)，反之亦然。
图104是由平板或双室因子产生单元(200)表示的另一个示例性因子产生单元的示意图，其包括流体处理隔室(210)和细胞隔室(220)，由半渗透膜(230)隔开。血液或血浆沿路径(250)流过流体处理隔室(210)。细胞区室(220)包括干细胞，例如复原和诱导的hADSC(240)。在U.S.6,759,254中进一步详细描述了类似类型的单元。
在一个示例性变化中，因子产生单元包括配置为递送来自修饰的hADSC的因子的装置，该装置包括：第一隔室；第二隔室；分隔第一隔室和第二隔室的选择性可渗透屏障；第二隔室内的hADSC群，其中所述hADSC中的SINE/ALU逆转录转座子转录物的水平或活性降低至足以诱导或恢复所述hADSC的增殖能力和/或多能性的量，其中所述hADSC已通过将hADSC暴露于白细胞介素-2(IL-2)诱导，从而增强细胞因子的产生；以及连接到第一隔室的流体入口和流体出口，其中流体入口和出口允许第一隔室和个体的血流之间的流体连通。
选择性渗透屏障可以包括一束中空纤维。可选地或另外地，该装置可以包括一个或多个过滤器，用于在与第一隔室连通之前过滤血液(或血浆)和/或用于过滤来自第二隔室的流体。第二隔室可以配置为可拆卸地连接到装置的盒。盒可以卡扣连接到装置的其余部分，其还可以包括在本文所述的治疗之前和期间维持hADSC存活和健康的支持。
这些装置中的任何一个还可以包括流体处理部件，包括泵、通道、过滤器等；例如，这些装置中的任何一个都可以包括构造成使血液或血浆通过第一隔室循环的泵。这些装置中的任何一个可以包括与第一隔室流体连通的过滤器。
或者，因子产生单元可以包括基质，其包含在其中的多个聚合物纤维。这些聚合物纤维可以通过静电纺丝来制造。本发明的纤维基质可与不同尺寸和形状的因子产生单元以及一次性或永久(即可重复使用)的因子产生单元一起使用。这些基质中的聚合物纤维也可以相对于彼此随机排列，或者可以彼此对齐。根据因子产生单元的几何形状，纤维基质可以粘附在因子产生单元壁或其他表面上，或者可以是分散的，在产生单元中所含细胞培养基中自由漂浮的单独纤维。为了将聚合物纤维粘合到因子产生单元，可以通过将带负电荷的基质放置在因子产生单元后面而将纤维直接沉积在表面上。这种技术允许带正电的纤维在因子产生单元表面上均匀沉积。或者，可以用粘合剂、热、激光焊接、超声波焊接或其他方法将纤维附着到因子产生单元壁上。
在示例性变化中，治疗方法包括使用hADSC，使用本文所述的任何因子产生单元。例如，治疗方法可以包括：降低提取的hADSC中SINE/Alu逆转录转座子转录物的水平或活性，其量足以诱导或恢复所述hADSC的增殖能力和/或多能性；并通过将hADSC暴露于白细胞介素-2(IL-2)以诱导hADSC(之前的SEN-hADSC或SR-hADSC或者两者都复原)以增强因子的产生；并通过将hADSC暴露于白细胞介素-2(IL-2)以诱导hADSC(之前的SEN-hADSC或SR-hADSC或者两者都复原)以增强因子的产生；以及将因子产生单元装置连接到个体，其中所述因子产生单元装置包括由选择性渗透膜隔开的第一隔室和第二隔室，其中所述第二隔室包括所述hADSC；并将个体的血液或血浆通过第一隔室，以将血液或血浆暴露于由第二隔室中的hADSC产生的因子。将装置连接到个体可包括通过因子产生单元装置的入口和出口将装置连接到个体的循环系统。
在又一些变化中，治疗方法可以包括：将因子产生单元连接到个体，其中因子产生单元包括由选择性渗透膜隔开的第一隔室和第二隔室，其中第二隔室包含hADSC群，其已经通过降低hADSC中SINE/Alu反转录转座子转录物的水平或活性以足以诱导或恢复所述hADSC的增殖能力和/或多能性的量复原，并且其中hADSC已经通过暴露于白细胞介素-2(IL-2)增强因子的产生；并使个体的血液或血浆通过第一隔室，以将血液或血浆暴露于第二隔室中的hADSC。
这些方法中的任何一种都可以包括从个体中提取hADSC，或者在冷冻保存后获得或恢复hADSC。个体可以是与hADSC或hADSC提取物所施用(例如，自体治疗)的相同的个体。
其他方法可以包括鉴定患有疾病的个体(例如，上文讨论的可以从MSC治疗中受益的任何疾病)，并且提供用于治疗来自个体的血液或血浆的因子产生单元，其包括流体处理隔室和细胞隔室，以及分离流体处理隔室和细胞隔室的选择性渗透屏障，其中所述细胞隔室包括复原的和诱导的hADSC群，并将个体的血浆或血液暴露于因子生成单元中的hADSC。
III.因子的使用和递送
本文还描述了递送因子的方法。一旦这些因子由输入细胞产生，例如在本文提供的因子产生单元中，它们可以以各种方式递送给个体。递送方法通常取决于已经用该因子配制的组合物的类型。一种或多种因子可常规途径递送，如舌下施用、口服、静脉注射、经由注射、局部、皮内、髓内、鞘内、心室内、鼻内、结膜、支气管内、透皮、直肠内、腹膜内、肌内、肺内、阴道、直肠或眼内，或通过CSF或淋巴管内施用。
在一个示例性变化中，使用单采类型的递送(例如血浆单采)来递送一种或多种因子。进行血浆单采时，将血液从个体中除去，在体外(体外)分离为血浆和血液细胞，并且在血浆和细胞返回到个体之前将一种或多种因子加入到血浆中。此处分离的血浆可以如本文所述通过因子产生单元循环，以将一种或多种因子并入血浆中以递送回个体。这些因子的递送也可与药物或生物制品相结合。
当这些因子配制成口服剂型时，它们可以作为片剂、胶囊或作为其上的涂层；作为可溶解的薄膜；作为口腔喷雾剂等口服递送。
当将这些因子配制成静脉内剂型时，这些因子可以作为溶液静脉内输送。可注射组合物可通过注射器、图像引导针或其他针装置(例如微针贴片)的递送用于局部施用因子，例如递送入皱纹、特定皮肤层或肿瘤块。在一些变化中，代替通过针内腔递送，因子涂覆在针上，并且当针放入组织时被释放。
在一些变化中，这些因子与植入物一起提供。如果组合物是植入物，则组合物可以植入/放置在特定的身体部位或组织内。可用可植入组合物以及本文所述的其它组合物实现所述因子的持续释放。
或者，所述因子可以配制成局部应用于皮肤或粘膜表面的组合物，并且包括但不限于水基凝胶或糊剂、软膏、皮肤病用霜剂(无水或含水的)、血清、洗剂(无水或含水的)、乳剂、喷雾剂、溶液、气雾剂、棒剂(固体乳膏)、薄膜、绷带、毛巾、粉末、皮肤喷雾剂、鼻或咽喉喷雾剂、口服滴剂、滴眼剂、滴耳剂、可涂抹成膜组合物和透皮贴剂。
当局部施用时，将因子传递到皮肤中可以预先进行的各种皮肤表面处理增强或辅助。皮肤表面处理可以在因子应用之前进行。例如，皮肤表面处理可以在之前至多一(1)小时，多达30分钟之前，多达15分钟之前，多达10分钟之前或多达5因子应用前的几分钟。皮肤表面处理可以包括但不限于磨皮，激光表面重建和化学剥离。在一些变化中，皮肤表面处理包括微针。可以用任何合适的真皮罗拉来完成微针。Derma罗拉是市场上可买到的装置，其通常包括一个鼓状辊子，其上布置有围绕罗拉排成行的微针，其中微针的长度约为0.5-1.5毫米，直径为0.1毫米。当在皮肤上滚动时，真皮滚轮在皮肤上形成开口，使局部施用的组合物更好地渗透。在这里，可以在局部使用因子组合物之前进行微针与真皮罗拉的微针穿刺，以促进因子渗入皮肤，并产生微小损伤，其引发炎症/愈合过程产生胶原蛋白和其它有益物质使皮肤复原，改善皮肤外观。反过来，所递送的因子可以诱导角质形成细胞产生生长因子，包括但不限于PDGF，IL-1，TGF-α和TGF-β，这些生长因子已被证明对皮肤的增殖和活化具有旁分泌作用成纤维细胞，导致皮肤复原和真皮细胞外基质的重塑。
如前所述，因子组合物可以是局部组合物。示例性局部用组合物包括但不限于水基凝胶或糊剂，软膏，乳膏(无水或含水)，血清，洗液(无水或含水)，乳液，喷雾剂，溶液，气雾剂，贴剂(固体霜剂)，绷带，毛巾，粉末，皮肤喷雾剂，鼻或喉咙喷雾剂，口服滴剂，滴眼剂，滴耳剂，可涂抹成膜组合物和透皮贴剂。
面霜是油/水乳液。它们由包含通常不挥发的油，烃等(如蜡，凡士林，矿物油等)的油相(内相)和包含水和任何水溶性有机溶剂的水相(连续相)可溶性物质，如加入的盐。两相通过使用乳化剂例如表面活性剂如十二烷基硫酸钠来稳定；亲水胶体如阿拉伯胶体粘土，硅酸铝等。在形成乳液时，通常以一定量加入活性成分(例如因子或条件培养基)以达到所需的浓度
凝胶包含选自油质基质，水或乳液-悬浮基质的基质。向基质中加入胶凝剂，在基质中形成基质，增加其粘度。胶凝剂的实例是羟丙基纤维素，丙烯酸聚合物等。通常，在添加胶凝剂之前的一点，将活性成分(例如因子或条件培养基)以所需浓度加入到制剂中。
通常使用(1)含油基质(即由固定油或烃如白凡士林或矿物油构成的基质)或(2)吸收性基质，即由无水物质组成的吸收性基质或可以吸收水分，例如无水羊毛脂。通常，在形成所述碱之后，以提供所需浓度的量加入含油或吸收剂，活性成分(例如因子或条件培养基)。
血清可能是含水或较稠的液体，通常颜色清晰。血清是以水为基础的，使其一致性较低。血清也可以分层在其他血清，以及霜或乳液，使他们成为一个非常灵活的产品纳入皮肤护理方案。只要个体对任何成分都不敏感，血清就可以被所有的皮肤所吸收。血清可能包括甘油或甘油。
本发明的一些组合物可以作为不需要闭塞的薄均匀膜，生物粘附剂或其它添加剂或装置来实现药理作用。该制剂可以通过物理机械手段施加，包括拭子，敷抹器垫，注射器扩张器，或用于将液体涂覆在薄膜中的类似装置。
所述组合物可以根据需要用制药学中常用的添加剂如渗透促进剂，表面活性剂，油和脂肪，多元醇，低级醇，增稠剂，紫外线吸收剂，光散射剂，防腐剂，抗氧化剂，抗生素，螯合剂试剂，pH调节剂，调味剂，颜料和水。
适用于因子组合物的渗透促进剂包括但不限于来自任何以下类别的增强剂：脂肪醇，脂肪酸(直链或支链)萜烯(例如，单，二和倍萜；烃，醇，酮)；脂肪酸酯，有机酸，醚，酰胺，胺，烃，醇，酚，多元醇，表面活性剂(阴离子，阳离子，非离子，胆汁盐)。
表面活性剂的非限制性实例包括聚氧乙烯(以下缩写为POE-支链烷基醚如POE-辛基十二烷基醇和POE-2-癸基十四烷基醇，POE-烷基醚如POE-油醇醚和POE-鲸蜡醇醚，脱水山梨糖醇酯例如山梨糖醇酐单油酸酯，脱水山梨糖醇单异硬脂酸酯和脱水山梨糖醇单月桂酸酯，POE-脱水山梨糖醇酯例如POE-脱水山梨糖醇单油酸酯，POE-脱水山梨糖醇单异硬脂酸酯和POE-失水山梨糖醇单月桂酸酯，甘油的脂肪酸酯例如单油酸甘油酯，单硬脂酸甘油酯和单肉豆蔻酸甘油酯，POE甘油单硬脂酸酯，POE甘油单肉豆蔻酸酯，POE甘油单肉豆蔻酸酯，POE-二氢胆甾醇酯，POE硬化蓖麻油，POE硬化蓖麻油脂肪酸酯，例如POE硬化蓖麻油异硬脂酸酯，POE-烷基芳基醚例如POE-辛基苯酚醚，甘油酯例如甘油单异硬脂酸酯和甘油单肉豆蔻酸酯，POE-甘油醚例如POE甘油单异硬脂酸酯和POE甘油单肉豆蔻酸酯，聚甘油脂肪酸酯如二甘油单硬脂酸酯，十甘油十二酸酯，十甘油十异硬脂酸酯和二甘油二异硬脂酸酯和其它非离子表面活性剂；钾盐，钠盐，二乙醇胺盐，三乙醇胺盐，高级脂肪酸如肉豆蔻酸，硬脂酸，棕榈酸，山ic酸，异硬脂酸和油酸的氨基酸盐和其它盐，上述醚羧酸的碱金属盐，N-酰基氨基酸的盐，N-酰基酒石酸盐，高级烷基磺酸盐和其它阴离子表面活性剂；烷基胺盐，聚胺，氨基醇脂肪酸，有机硅酮树脂，烷基季铵盐和其它阳离子表面活性剂；和卵磷脂，甜菜碱来源的物和其他两性表面活性剂。
油脂的实例包括植物油和脂肪如蓖麻油，橄榄油，可可油，山茶油，椰子油，木蜡，霍霍巴油，葡萄籽油和鳄梨油；动物油和脂肪如貂油和蛋黄油；蜡如蜂蜡，鲸蜡，羊毛脂，巴西棕榈蜡和小烛树蜡；烃如液体石蜡，角鲨烯，微晶蜡，地蜡，石蜡和凡士林；天然或合成脂肪酸如月桂酸，肉豆蔻酸，硬脂酸，油酸，异硬脂酸和山酸；天然或高级醇如十六烷醇，硬脂醇，己基癸醇，辛基癸醇和月桂醇；和酯如肉豆蔻酸异丙酯，棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸辛基十二烷基酯，油酸辛基十二烷基酯和油酸胆固醇酯。
多元醇的实例包括乙二醇，聚乙二醇，丙二醇，1,3-丁二醇，1,4-丁二醇，二丙二醇，甘油，二甘油，三甘油，四甘油和其他聚甘油，葡萄糖，麦芽糖，麦芽糖，蔗糖，果糖，木糖，山梨糖醇，麦芽三糖，苏糖醇和赤藓糖醇。
增稠剂的实例包括天然存在的高分子物质，例如海藻酸钠，x吨胶，硅酸铝，quseed籽提取物，黄蓍胶，淀粉，胶原和透明质酸钠；甲基纤维素，羟乙基纤维素，羧甲基纤维素，可溶性淀粉，阳离子化纤维素等半合成高分子物质；和合成的高分子物质如羧基乙烯基聚合物和聚乙烯醇。
紫外线吸收剂的实例包括对-氨基苯甲酸、2-乙氧基乙基对甲氧基、异丙基对甲氧基、丁基甲氧基苯甲酰基甲烷、甘油基单-2-乙基己酰基-二对甲氧基二苯酮、二没食子三油酸酯、2,2'-二羟基-4-2-乙基己基-2-氰基-3,3'-二苯基丙烯酸酯、对甲氧基肉桂酸乙基己酯、水杨酸2-乙基己酯、对氨基苯甲酸甘油酯、水杨酸高甲酯、邻氨基苯甲酸甲酯、2-羟基-4-甲氧基苯甲酸甲酯、4-甲氧基二苯甲酮、对二甲基氨基苯甲酸戊酯、2-苯基苯并咪唑-5-磺酸和2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸。
防腐剂的实例包括苯甲酸盐、水杨酸盐、山梨酸盐、脱氢乙酸盐、对羟基苯甲酸盐、2,4,4'-三氯-2'-羟基二苯基醚、3,4,4'-三氯碳酰替苯胺、苯扎氯铵、桧醇、间苯二酚和乙醇。
抗氧化剂的实例包括生育酚、抗坏血酸、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、去甲二氢愈创木酸和没食子酸丙酯。
螯合剂的实例包括依地酸钠和柠檬酸钠。
除了上述那些之外，合适的载体、载体和佐剂包括水、凡士林、凡士林、矿物油、植物油、动物油、有机和无机蜡、聚合物如黄原胶、明胶、纤维素、胶原、淀粉、高岭土、角叉菜胶、阿拉伯胶、合成聚合物、醇、多元醇等。载体还可以包括持续释放载体，例如lypizomes、微海绵、微球体或微胶囊、含水基础油膏、油包水或水包油乳剂，凝胶等。
可包含在因子组合物中的其它作用剂是维生素，抗氧化剂，矿物质，提取物，辅酶Q10，鱼子酱提取物，香菇提取物，三肽(SYN-AKE)，Matrixyl3000(棕榈酰寡肽和棕榈酰四肽-7)(Sederma，(维生素E)，黑色素，维生素C，维生素A，视黄酸丙酸酯，视黄酸，维生素D3，烟酰胺(维生素B)，烟酰胺(维生素B3)，维生素E d-泛醇，透明质酸，神经酰胺或海藻(藻类)提取物。
在一些情况下，当与诸如表面活性剂，油和/或其它赋形剂的物质组合时，这些因子是不稳定的。在这些情况下，可以将这些因子配制成可以在使用前冻干并溶解在10％透明质酸中的组合物。
IV.产品
本申请还提供了包含本文所述的任何一种装置或组合物的制造品。
示例性试剂盒可以在包装或容器中包含以下一种或多种：(1)因子产生单元盒；(2)一种或多种药学上可接受的缓冲剂；(3)安装因子产生单元盒的说明书，包括修改和/或添加干细胞如hADSC的说明书。
本文还提供了与递送本文提供的任何因子组合物一起使用的脱脂剂，微针，霜剂和透皮贴剂。
应该理解的是，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不意在限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求及其等同物限制。下面的实施例是为了说明的目的。这些意在表示本发明的某些方面和实施例，但并不意图以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1：材料和方法
这个实施例提供了实施例2-9中随后使用的材料和方法。
MSC的分离、培养和表征
本研究中使用的MSC是从年龄32岁和49岁的健康成年女性(在加利福尼亚州圣地亚哥的UCSD医疗中心进行常规吸脂手术)供体获得的人类脂肪组织中分离的。MSC分离方案经当地伦理委员会批准并按前述方式进行。分离的脂肪来源的干细胞系在DMEM/F12培养基(Life Technologies)中生长。根据国际细胞治疗协会设定的MSC最低定义标准，流式细胞术分析显示hADSC表达CD29、CD73、CD90和CD105但不表达CD11b、CD14、CD19、CD34、CD45、CD80、CD86(抗体来自eBiosciense，USA)。形态学分析显示，细胞呈现成纤维细胞样形态，是塑性粘附的，并且在使用市售分化培养基(Invitrogen，USA)的体外条件下能够脂肪形成、软骨形成和成骨分化。作为培养物生长天数的函数，在多次传代中累积群倍增(PD)计算为PD＝log(N/NO)x 3.33，其中NO是烧瓶中的细胞数，N是在该代收获的细胞数目。在所有实验中使用hADSC PD 4或PD 6SR群和SEN群的PD 41和45。如Deenick EK,Gett AV,Hodgkin PD(2003)Stochastic model of T cell pa calculus revealing IL-2regulation ofprecursor frequencies,cell cycle time,and survival.J Immunol 170:4963-4972。在37℃将20U/ml的IL-2加入到培养基中24小时。
衰老相关的SA-β半乳糖苷酶测定
如制造商试剂盒(BioVision)中和先前Wang J,Geesman GJ,Hostikka SL,Atallah M,Blackwell B,et al.(2011)Inhibition of activated pericentromericSINE/ALU repeat transcription in SEN human adult干细胞reinstates self-renewal.Cell cycle 10:3016-3030公开所述实施了检测pH依赖性衰老相关β-半乳糖苷酶活性(SA-(βGal)表达的测定。培养的hADSC用PBS在室温洗涤15分钟，用PBS洗涤2次，用含有X-Gal的补充液37℃过夜染色。用PBS洗涤细胞2次，使用显微镜(日本Nikon，TE300，DXM1200数码相机)拍摄图像。
迁移和侵入测定
Transwell过滤器来自Corning Incorporated(Acton，MA，USA)，并且使用的所有细胞因子均得自Peprotech Inc.(Rocky Hill，NJ，USA)。如Perez LM,Bernal A,SanMartin N,Galvez BG(2013),Arch Physiol Biochem 119:195-201中所述使用8mm厚的Transwell室进行迁移测定。对于Transwell迁移测定，将1.0×104细胞悬浮于80ul无血清α-MEM中，并接种在含有8mm孔径过滤器的24孔Transwell板的上室中(Corning，Costar，USA)。在下室中，加入600ul含有细胞因子的DMEM或培养基：添加了IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α、HMGβ1。使用的浓度是：50ng/ml IL-2、IL-6、IL-8和HMGβ1；30ng/ml TNF-α如(Perez etal.,2013,Arch Physiol Biochem 119:195-201)中所述。hADSC在37℃温育16h。保留在上室中的细胞通过拭子去除，并且已经迁移通过过滤器的那些在室温下用4％多聚甲醛固定20分钟，并用5％甲苯胺蓝染色过夜。细胞在下侧计数；在使用明视野显微镜(Nikons,TE300,DXM1200Digital Camera,Japan)的五个不同的随机选择的10x场视野中。这些实验由两位年龄分别为32岁和41岁的捐助者的hADSC完成，其中每个捐献者采样三次以上。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
如之前Deenick EK,Gett AV,Hodgkin PD(2003)Stochastic model of T cellproliferation:a calculus revealing IL-2regulation of precursor frequencies,cell cycle time,and survival.J Immunol 170:4963-4972中所述，将hADSC(SR或SEN)以105细胞每10cm2培养皿的密度铺板并用20U/mL的IL-2处理24小时，伴随未处理的对照。随后，使用Mem-PER Plus#89842(ThermoFisher Scientific)根据制造商的方案制备细胞膜相关蛋白部分。分别使用人IL-2Rα和人IL-2RβELISA试剂盒#ELH-IL-2Ra和#ELH-IL-2Rb(RayBiotech，Inc)获得IL-2受体α和β浓度的测量。通过SPECTRAMax Plus(MolecularDevices)在450nm下测量标准物(重组IL-2受体α和β)以及实验样品的光密度，并如制造商的方案中所述计算浓度。
实时定量聚合酶链式反应
使用RNeasy Mini Kit(Qiagen,Germany)从hADSC分离总RNA。随后使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒(Fermentas，USA)合成cDNA。使用TaqMan仪器进行实时定量聚合酶链式反应(qPCR)。表达水平计算为2-ΔΔCt，其中相对表达通过相对β-肌动蛋白基因表达进行标准化来确定。所有测定一式三份进行，使用不含cDNA的阴性对照样品。qPCR的引物如下：
IL-2受体α链(IL-2Rα)正向:5'-CTGCCACTCGGAACACAAC-3'和反向:5'-TGGTCCACTGGCTGCATT-3'.
IL-2受体β链(IL-2Rβ)正向:5'-ACTCGAGAGCCAACATCTCC-3'和反向:5'-TCCGAGGATCAGGTTGCAG-3'.
IL-2受体γ1链(IL-2Rγ1)正向：5'-TGGATGGGCAGAAACGCTA-3'和反向:5'-GGCTTCCAATGCAAACAGGA-3'.
STAT 5A正向:5'-ACGCAGGACACAGAGAATGA-3'和反向:5'-CTGGGCAAACTGAGCTTGG-3'.
STAT 5B正向:5'-ACACAGCTCCAGAACACGT-3'和反向:5'-TGTTGGCTTCTCGGACCAA-3'.
VEGF A正向:5'-GGAGGAGGGCAGAATCATCA-3'和反向:5'-ATCAGGGGCACACAGGATG-3'。
转录组分析
如之前Deenick EK,Gett AV,Hodgkin PD(2003)Stochastic model of T cellproliferation:a calculus revealing IL-2regulation of precursor frequencies,cell cycle time,and survival.J Immunol 170:4963-4972中所述，用IL-2处理的和未处理的(对照组)SR和SEN-hADSC进行转录组分析。图3A中显示的两种基因型分别用于分析四种不同的条件：SR或SEN细胞，具有或不具有IL-2刺激。对于每个实验条件，将相同量的(106)细胞接种于DMEM F12培养基中，并通过将20U/m1的重组IL-2(Peprotech,USA)直接添加入培养基24小时实施IL-2处理，如之前Deernick et al.2003中所述。根据制造商的说明使用TRIzol试剂(Invitrogen，USA)从样品中分离总RNA。将来自两个不同患者的样品组合在一起以获得相关条件，并使用RNAHS测定试剂盒(Invitrogen，Life technologies，USA)，用Qubit 2.0荧光计测量RNA浓度。
按照制造商的说明，使用每个样品100ng的总RNA构建在Ion ProtonTM系统(Lifetechnologies，USA)上进行测序的文库。在rRNA去除和RNA-seq文库构建之前，将ERCCRNASpike-In对照混合物(Ambion，Life Technologies)加入总RNA用于质量控制分析。ERCCRNASpike-In对照混合物含有长度为250-2000nt的92个转录物，其模拟天然的真核mRNA。根据制造商提供的方案，将100ng总RNA加入2u1Mix1，其中以1：1000稀释加标。之后，用LowInput Ribominus Eukaryote System v2(Ambion,Life technologies,USA).进行rRNA消耗。用Ion total RNA-seq kit v2(Ambion,Life technologies,USA)构建cDNA文库，并用Ion Xpress RNA-seq条码(Ambion，Life technologies)进行条码化。在Bioanalyzer 2100(Agilent technologies,USA)上进行文库的大小分布和定量。用P1芯片在Ion ProtonTM系统上进行文库测序，每个文库测序3次。
RNA-seq数据分析
针对四个条件的每一种组合来自单独的Ion ProtonTM系统测序运行的RNA-seq读取。使用Torrent Mapping Alignment Program(TMAP,Life technologies)将序列读取映射到参照人类基因组组件hg19(GRCh37)。通过将从制造商的网站获得的ERCC加标RNA序列的预期计数与映射到相同序列的RNA-seq的观察到的计数进行比较，评估了四个条件特异性组合的RNA-seq允许的质量。将初始基因表达水平作为单个NCBI RefSeq基因模型(c)的外显子映射读取的总和，并且从随后的分析中去除低表达基因(每百万读数计数<1)。对于每个文库，使用β-肌动蛋白(ACTB)表达水平(cACTB)和每个基因的总外显子长度l对单个基因表达水平进行标准化。对于文库j，β肌动蛋白标准化因子sj计算为：
且用于在文库j中基因i中的最终标准化的表达值计算为
使用程序GFOLD v1.1.3,Feng J,Meyer CA,Wang Q,Liu JS,Shirley Liu X,etal.(2012)GFOLD:a generalized fold change for ranking differentially expressedgenes from RNA-seq data.Bioinformatics 28:2782-2788进行了成对文库之间的差异基因表达分析。选择GFOLD是基于其在没有重复数据集合的情况下在表征差异表达基因方面表现出的优越性能。GFOLD分析产生的一个分数可以衡量不同条件间基因表达差异的程度；此处推荐的±0.01的GFOLD分数界限用于定义差异表达的基因。使用GSEA v2.1.0程序对文库对之间的差异表达基因进行功能富集分析。具体而言，以这种方式鉴定了SR、SEN或两者中IL-2处理时含有多个上调或下调的基因的单独的途径。对于差异调节基因的特定集合(SR和/或SENIL-2+上调的和SR和/或SENIL-2+下调的)的单独途径使用网络相关，其中节点对应于通路且边对应于通路之间共享的基因的存在。
图9显示用于RNA-seq实验质量控制的外部RNA控制联合体(ERCC，一组常见的外部RNA对照)剂量响应。对于四个条件特异性RNA-seq集合中的每一个，ERCC加标RNA序列的预期计数针对映射到相同序列的RNA-seq标签观察到的计数回归。观察到与预期的计数高度相关，如回归形状和Pearson相关性r值所示，与高质量RNA-seq结果一致。.
实施例2：MSC衰老表型的表征
在该实施例中描述了进行评估复制衰老对响应于IL-2信号传导的人脂肪来源的MSC(hADSC)的转录活性的影响的研究。
IL-2通过特异性受体发出信号，具有由三种IL-2R亚基(IL-2Rα(CD25)，IL-2Rβ(CD122)和IL-2Rg(CD132))的各种组合形成的三类细胞表面受体。实验结果表明，hADSC转录表达全部三种受体，然而hADSC中IL-2Rα的蛋白表达低于IL-2Rβ所见。这些观察结果表明由IL-2Rβ和IL-2Rδ同种型组成的IL-2受体组合物可以介导hADSC对IL-2细胞因子识别的主要形式。随着hADSC的复制老化，受体组成仅轻微改变，表明hADSC对IL-2的响应性在其衰老时不发生改变。
如上所述分离和培养hADSC。体外复制衰老导致细胞增殖减少，DNA损伤积聚和形态学改变：hADSC变大，形状不规则，形态扁平，相差显微镜观察到细胞核变得更加明显，胞浆内有许多内含物和累积。图3A显示了来自两个不同患者的hADSC的生长曲线。在线性生长速率SR中，或者当细胞系停止其增殖时，SEN，典型的衰老相关的SA-β半乳糖苷酶活性染色显示在图3B中。
实施例3：SEN-MSC表现出迁移倾向较高
使用一系列细胞因子和生长因子，使用Transwell系统进行迁移测定，如下文的材料和方法部分所述。观察到经历复制性衰老的脂肪来源的MSC表现出更高的迁移倾向。据观察，SEN-hADSC显示出与其SR对应物相比显着更高的基础迁移能力(图3C)。图3C显示SR(左)和SEN(右)hADSC的离体迁移测定。黑线表示中值，晶须表示值的范围。如所描绘的，通过具有p值(p)的T检验来评估统计学差异。
另外，测量了SEN-hADSC对不同细胞因子化学引诱剂的响应。据观察，与早期传代相比，hADSC具有提高的迁移能力(图3D)，表明复制衰老增加了hADSC响应于测试的化学引诱剂的迁移特性。在这些实验中IL-2是SEN-MSC上最有效的化疗-出租车兴奋剂，而在这些实验中，TNF-α在测试化疗-引诱剂中效力较弱(图3D)。图3D显示自我更新SR(左)和衰老SEN(右)hADSC的迁移。在不同细胞因子(50ng/ml IL-2，IL-6，IL-8，HMGB1；30ng/ml TNF)存在下诱导hADSC迁移。图形代表十个独立实验的平均值(n＝10)。图中列出了与实验测量相关的P值(p)。
总的来说，这些数据表明复制性衰老改变了hADSC的迁移特性，并可能影响MSC对炎症环境的反应并影响其免疫调节输出。
实施例4：在复制性衰老时对来自人脂肪来源的MSC的Il-2刺激的不同应答
通过qPCR评估IL-2受体同种型表达显示，与在离体复制性衰老时IL-2Rg和IL-2Rβ相比，IL-2Rα同种型的表达显着改变(图4B)。图4B显示了在未刺激的(IL-2)SR细胞(第一条)和SEN细胞(第三条)中以及用20ug/ml刺激时通过定量PCR(qPCR)评估的IL-2受体α，β和γ的重组IL-2(IL-2+)(SR细胞，第二条形；SEN细胞，第四条形)。数据显示为倍数变化(CT)。显示了来自三个独立实验的平均值±SD。值得注意的是，在SR和SEN-hADSC中IL-2处理后，记录到IL-2Rβ和IL-2Ra转录物的积累增加，而当SEN细胞进行类似处理时，IL-2Ra的表达被消除(图4B)。
然而，数据表明细胞膜相关的IL-2Rα受体的蛋白质水平表达显示出相反的模式(图4C)。图4C显示了IL-2Rα和IL-2Rβ的细胞膜相关的水平。通过ELISA在未刺激的(IL-2-)SEN(第三条)和SR(第一条)hADSC中并且用20ug/ml的重组IL-2(IL-2+)SEN(第四条)和SR(第二栏)。数据表示为每毫升的象形图。结果是三次独立实验的平均值(平均值±SD)。统计显着性通过t检验估计，其中***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。
尽管IL-2受体同种型的转录状态在两种不同的细胞状态(SR和SEN)之间确实不同，但它似乎不依赖于通过ELISA测定法测量的IL-2暴露(诱导)(描述于材料和方法，上面)。数据还表明，编码IL-2α受体链的蛋白质比IL-2Rβ同种型的丰度低(比较120pg/ml的IL-2Rα与350pg/ml的IL-2Rβ对150pg/ml的IL-2Rα和440pg/ml IL-2Rβ在体外复制衰老时)，如图4C所示。这些数据表明hADSC对IL-2刺激的应答通过由IL-2Rβ(CD122)和普通IL-2Rg(CD132)组成的中间亲和性受体二聚体发生。
IL-2通过JAK1和JAK3信号来激活STAT5A和STAT5B，并另外使用Ras-MAP激酶和磷酸肌醇3-激酶依赖性信号传导途径。IL-2，STAT5下游靶标的表达见图5,7A和7B以及图10A和10B的表。在hADSC中，STAT5A和STAT5B基因转录遵循IL-2/STAT5信号轴。
图5说明用IL-2刺激SR和SEN-hADSC的效果。IL-2上调IL-2信号转导STAT5基因的介质的mRNA。通过定量RT-PCR在未刺激的(IL-2)SR(第一条)和SEN细胞(第三条)和用20ug/ml的重组IL-2(IL-2)刺激时评估STAT5A和STAT5B mRNA表达+)(SR+IL-2，第二条形；SEN+IL-2，第三条形)。数据显示为倍数变化(CT)。显示了来自三个独立实验的平均值±SD。图形描绘了qPCR引物的位置。统计显着性通过t检验估计，其中***p<0.001，**p<0.01。
接下来研究了IL-2及其下游靶点STAT5如何影响hADSC的转录结果，其体外复制衰老。
在复制性衰老时，暴露于IL-2导致人MCS中的基因表达改变。为了说明离体hADSC复制性老化后对IL-2/STAT5轴的转录响应如何变化，使用Ion ProtonTM系统进行RNA-seq转录组分析，如实施例1所述，并在图8A中显示。在四个条件下(文库)对hADSC中的基因表达水平进行比较：正常离体培养(SR IL-2)时的自我更新，24小时重组IL-2刺激(SR IL-2+)时的自我更新，正常离体培养(SEN IL-2)的复制性衰老和24小时重组IL-2刺激(SEN IL-2+)的复制衰老。在图8B中示出了代表每个条件的四个条件的总读取计数的分布。
β-肌动蛋白表达水平用于使条件之间的基因表达水平正常化(如实施例1所述)。采取这种方法是为了考虑到在IL-2处理后总体基因表达水平可能改变的事实。β-肌动蛋白标准化的基因表达分布揭示了在SR和SEN状态下IL-2处理后基因表达的总体上调(图8D)。然而，在四种条件中个体基因表达水平的比较表明与SR-hADSC相比，IL-2处理更显着地影响SEN-(图6A)。图6A示出了基于条件特异性基因表达谱的比较显示条件之间的配对距离的分层聚类。当单独的基因表达水平被比较，随后是SEN IL-2条件时，SR IL-2和SR IL-2+条件组紧密地结合在一起。SEN IL-2+条件是显示个别基因表达水平的基本不同模式的四个条件中的异常值。这表明hADSC对衰老细胞中IL-2处理的生物学应答可能通过IL-2反应的全局转录失调而显着阻碍MSC功能。
在条件之间进一步比较表达水平，以便鉴定响应于SR和SEN状态中的IL-2处理而差异表达，上调和下调的单个基因(图6B)。图6B是显示在IL-2处理后上调和下调的基因数目的维恩图。在SR和SEN-hADSC中，与IL-2处理下调(2,296)相比，还有几个上调的基因(8,866)。与两种状态下调的基因(4％)相比，在SR和SEN-hADSC中上调的基因比例(35％)也显着更高。对于IL-2治疗后SEN-hADSC下调的基因，可见最大的不对称性(1,739)；除了SR IL-2+条件外，还有更多这样的基因(649)。这种差异表明SEN IL-2+条件的总体分歧很大程度上归因于IL-2处理下调的基因，这是由于SR和SEN两者总体上调至IL-2治疗(图6B和图8D)。
图6C-6D显示了显示在IL-2处理后上调(图6C)和下调(图6D)的基因的表达水平的热图。标准化的基因表达水平显示为灰度热图。组对应于在仅SR，仅SEN或两种条件下上调或下调的基因。
总之，这些数据表明，SEN-hADSC已经失去了产生响应于IL-2处理的协调调节变化的能力，这与SR细胞的活跃增殖存在相同的程度。与SEN IL-2相比，SR IL-2+所见到的上调基因的数量更多与这种解释是一致的。
图10A显示了表示SR和SEN-hADSC中IL-2处理后上调的基因富集的生物途径的表格(图10A)。在图10A中，显示了富集的途径以及属于途径和途径富集显着性水平的单个IL-2+上调基因。在SR中上调基因成员的通路显示在左栏中，并且在SEN中上调基因成员的通路显示在右栏中。在SR和SEN中上调的基因成员的通路显示在第一排，随后是仅在SEN中上调基因成员的通路，并且最终通路仅在SR中上调基因成员。显示的网络是SR(左列)上调的通路和SEN(右列)上调的通路。网络节点表示途径，并且节点的大小对应于该途径中上调基因的数目。如果通路共享上调基因，则通路节点通过边缘连接，并且边权重对应于通路之间共享的上调基因的数量。
图10B显示了在SR和SEN-hADSC中对IL-2处理下调的基因富集的生物途径。显示富含的途径以及属于途径和途径富集显着性水平的单独的IL-2+下调的基因。在SR中下调基因成员的通路显示在左栏中，并且在SEN中下调基因成员的通路显示在右栏中。在SR和SEN中下调基因成员的途径显示在第一行，其次是仅在SEN中下调基因成员的途径，最后是仅在SR中下调基因成员的途径。显示了一个网络与SEN(左列)下调的路径有关。网络节点表示途径，并且节点的大小对应于该途径中SEN下调基因的数目。如果通路共享SEN下调的基因，则通路节点通过边缘连接，并且边权重对应于通路之间共享的下调基因的数量。
实施例5：Il-2刺激后hADSC的营养特性对体外复制老化敏感
图7A-7D图解说明在功能上一致的基因集合中，在IL-2处理下SR和SEN细胞的基因表达水平。显示表达(在图7A中)营养因子(在图7B中)抗炎和免疫调节(如图7C中所示)抗凋亡和转移促进的基因集合的表达水平，并且(如图7 7D)迁移和血管生成促进。标准化的基因表达水平显示为灰度热图。
表1显示了在SEN和SR细胞中IL-2处理后营养因子的差异表达。SR GFold值表示用IL-2处理的SR细胞相对于未用IL-2处理的SR细胞的倍数差异；SEN GFold值表示用IL-2处理的SEN细胞相对于未用IL-2处理的SEN细胞的倍数差异。
表1:IL-2治疗后营养因子的差异表达
数据表明用IL-2刺激hADSC中生长因子的表达在离体复制衰老时经历显着变化。当活性增殖的(SR)hADSC暴露于IL-2导致促有丝分裂蛋白例如基质细胞来源的因子2(SDF2)和SDFL2以及前列腺素E合成酶2(PTGES2)的表达增加时，SR和SEN-hADSC(TGFα，TGFβ1和TGFβ2)，转化生长因子β受体TGFBR2和转化生长因子β受体相关蛋白TGFBRAP1以及转化生长因子β诱导的(TGFBI)显着增加(图7A和表6A-6D)。
另外，SR和SEN IL-2刺激的hADSC均以集落刺激因子1(CSF-1)，LIF，IL-11，IL-17D，IL-1β和肿瘤坏死因子(配体)超家族TNFSF13B，刺激B细胞和T细胞功能的细胞因子编码基因(图7A，7B和图10A-10B)。
考虑到旁分泌IL-17D诱导内皮细胞表达IL-6，IL-8和GM-CSF基因，IL-1β刺激成纤维细胞生长因子活性(TGFα，TGFβ1和TGFβ2基因显着上调在IL-2暴露的hADSC中，以自分泌和旁分泌的方式，通过从这些细胞中诱导释放IL-2，胸腺细胞和B细胞增殖和成熟，数据表明SR和SEN-hADSC的转录状态可能指出通过复杂的调节性反馈回路在IL-2暴露后这些细胞增强的免疫调节性质。
转化生长因子β受体TGFBR2和转化生长因子β受体相关蛋白TGFBRAP1的表达显着增加，表明转化生长因子α和β(TGFα，TGFβ1和TGFβ2)转化生长因子β诱导(TGFBI)基因(图7A)。
此外，还注意到在SR细胞中尚未观察到的hADSC衰老时生长因子的IL-2依赖性表达的本质差异。这包括上调成纤维细胞生长因子家族成员(FGF1，FGF11，FGF14)的一个子集并伴随着其他成员如FGF2，FGF5，FGF7(图7A，表1和表6A-6D)。
暴露于IL-2的SEN-hADSC由EGF mRNA上调标记，但mRNA下调至其受体EGFR，同时血清应答因子SRF和WNT信号转导分子调节因子SFRP1的表达降低。与受IL-2暴露的SR细胞相比，在促进伤口愈合的间充质细胞来源的促细胞因子PDGFA及其受体PDGFRA方面均显着受到抑制(图7A，图10A，表1，和表6A-6D)。
这些数据揭示了hADSC中IL-2介导的转录反应的性质与衰老有关的差异，其可能阻碍这些细胞免疫调节性质在体外和最终在体内。
显示了一组用于IL-2治疗的抗炎和免疫调节标记物，IL-2与其他药物和IL-2暴露的人MSC的组合(表2)。
差异基因表达分析，比较IL-2处理与未处理的SR和SEN细胞，允许鉴定在IL-2刺激时上调或下调的单个基因。用IL-2处理的SR和SEN-hADSC中指定为上调或下调的基因进行分析，使用集成的基因组富集和途径网络方法试图捕获对IL-2刺激的协调的细胞应答的生物学现实。为此，鉴定出上调或下调基因统计学上富集的途径，随后基于它们共有的差异表达的基因进行选择(图10A-10B)。根据每个途径中差异表达基因的数目以及不同途径共享差异表达基因集合的程度对通路网络表示进行加权。这种方法允许识别高度连接的网络结构，具有许多功能相关的路径以及功能相关的网络子结构。
当hADSC衰老时，IL-2对促进增殖的基因途径(细胞周期途径，q值＝1.54e-5)刺激较少，施加G2关卡(G2途径，q值＝5.94e-4)，p53通路(q值＝1.18e-2)，主要信号转导MAPK通路(MAPK，q值＝2.42e-4)及其主要亚群ERK通路(ERK，q值＝2.62e-2)，其调节诸如存活，迁移和增殖的重要细胞功能。该分析进一步证实了先前的发现，即PDGF诱导的AKT和ERK途径调节增殖和分化的相反命运决定以促进MSC自我更新。代表这些途径的基因的活化仅在离体IL-2暴露于活性SR-hADSC而不是它们的SEN对应物之后才被观察到(图10A，左侧)。
这些数据还提供了关于MSC在致癌环境中的功能的信息。转化生长因子β受体TGFBR2和转化生长因子β受体相关蛋白TGFBRAP1在转化生长因子α和β(TGFα，TGFβ1和TGFβ2)，转化生长因子β受体TGFBRAP1表达显着增加的同时，表明SR和SEN-作为转化生长因子β诱导的(TGFBI)基因(图7A)。据信分泌型TGFβ通过促进CD+4T细胞的分化和抑制免疫监视从而施加免疫抑制而在调节免疫系统中是重要的。然而，在接触IL-2之后，脂肪来源的人MSC中TGFβ的高水平表达可能促进癌发生。由于部分TGFβ信号通路在癌细胞中显示突变，这使得癌细胞逃避TGFβ诱导的细胞周期阻滞，分化或凋亡，而周围的基质，免疫，内皮和平滑肌细胞仍然读取TGFP信号传导作为增殖的抑制剂和引起分化的诱因，导致癌细胞微环境中的免疫抑制和血管生成。
在IL-2处理的SEN-hADSC中，富含与炎症相关的途径(IL-6途径，q值＝5.55e-3)和EGF信号传导(q值＝2.33e-4)的显着上调基因被证明为MSC提供了生存优势。暴露于IL-2的SEN-hADSC也通过已知从淋巴细胞刺激IL-17的IL-1R'IL-6和IL-12(图7B)的表达增加而被标记。数据还表明，淋巴细胞是IL-17产生的唯一来源，并且那些MSC，特别是在其衰老时，在受到促炎环境时显示出高的IL-17转录活性(图7A)。
观察到的与血管生成性VEGF途径(q值＝5.24e-3)的连接(图10A，右侧和图7D)和SEN-hADSC迁移的增强能力(图3A，3B)可以表明IL-暴露的SEN-MSC可以获得支持致瘤环境和转移所必需的特性。此外，上调包括在一氧化氮合酶途径的基因(iNOS)的NOSl途径(q值＝8.32e-2)在hADSC在复制衰老再次支持MSC经历衰老可以获取通过免疫转移促进性能。
细胞周期途径(q值＝2.52e-5)，MCM途径(q值＝1.62e-8)，RB途径(q图10b所示的ATM途径(q值＝3.28e-2)，p53途径(q值＝1.86e-2)。总体而言，数据表明，受到IL-2的生物途径在衰老中触发下调，随后在自我更新中并且这些生物途径相互连接(图10B)，进一步在hADSC复制性老化时将IL-2应答的生理学损伤连接在一起。
表2显示了在SEN和SR细胞中抗炎和免疫调节因子对IL-2处理的差异表达。SRGFold值表示用IL-2处理的SR细胞相对于未用IL-2处理的SR细胞的倍数差异；SEN GFold值表示用IL-2处理的SEN细胞相对于未用IL-2处理的SEN细胞的倍数差异。
表2:IL-2治疗后抗炎和免疫调节因子的差异表达
实施例6：IL-2刺激的人MSC的抗炎和免疫调节性质
接下来，研究了当对复制性老化施加IL-2促炎症环境时如何影响指定用于提供hADSC的免疫调节性质的基因的表达(例如，IL-2的抗炎和免疫调节性质暴露人MSC)。数据表明，免疫调节的能力受体外传代过程中人脂肪来源的MCS的复制老化的影响(图7B和表2)。
SR-hADSC中的IL-2暴露激活了归因于T细胞调节的不同组的基因。SR-hADSC的IL-2暴露导致基因如TNFRSF21(参与T细胞分化)，IL12A(T细胞活化剂)，ILF2(IL-2基因转录过程中有效的IL-2基因转录调节因子)细胞活化)，IL33(T辅助细胞2型相关细胞因子的旁分泌诱导剂)和CCL28(CD+4，CD+8T细胞的趋化因子)的下调，CD320(具有自分泌和旁分泌功能的受体分子)图7B，表2和表6A-6D中所示的血浆细胞的增殖)。
与此相反，IL-2暴露的SEN-hADSC的特征在于CD320(可能参与调节T细胞功能的ITG 11，ITGA V，ITFG 1)和基因中的许多整联蛋白的显着转录上调编码重要的调节分子，如：T细胞粘附受体(CD99)，一种归因于维持初始T细胞(CHST3)的因子，T细胞激活剂(HIVEP1和HIVEP2)，一种参与T细胞的基因信号通路(CMIP)和参与抑制CD+细胞增殖的自分泌/旁分泌因子PTGER1(图7B，表2和表6A-6D)。
数据还表明暴露于IL-2的SR-hADSC触发编码在B细胞增殖和分化(CD72)和有角巨噬细胞(CD68)中发挥作用的表面受体的基因的转录活性的下调。在类似的处理下，这两种基因在SEN细胞中显着上调(图7B，表2，表6A-6D)。此外，IL-2处理的SEN-hADSC与类似处理的SR细胞分开，通过转录下调促进B前-B转换所需的基因，LRRC8A和PEAR1基因，调节一些非粘附的骨髓祖细胞。相反，涉及淋巴细胞活化和稳态的基因(CD83和TNFRSF25)以及白细胞迁移(CERCAM)和负责内皮细胞-白细胞相互作用的基因(ESM1)以及对于控制单核细胞/巨噬细胞介导的免疫过程(TNFSF13)在SEN-hADSC(图7B，表2和表6A-6D)中上调。
IL-2暴露导致许多细胞因子和趋化性关键因子的差异表达(如图7B和表2所示)。
SR-hADSC以IL-33，IL-12A，IL10RB，IL1RAP，IL7R，ILF2和NOS3基因表达上调，而IL-16和CSF1R基因表达下调。
在与IL-2类似的条件下处理的SEN-hADSC中，编码细胞因子IL-32，IL-6，IL1RN，IL-20RB，IL-21R和炎症诱导剂TNFSF13和TNFSF12的基因，以及编码细胞外基质重塑PLAU上调。
同时，MYL9，KIF14，IRAC3等细胞因子所必需的多种因子，以及吸引单核细胞和嗜碱性粒细胞的趋化因子基因(CCL2)和调控造血前体细胞增殖分化的CLEC11A基因，(图7B)。
白细胞介素受体编码基因IL7R，IL1R1，IL15RA和白细胞介素增强子结合因子ILF2和ILF3也有类似的下调。
这些观察结果与SEN-hADSC中细胞因子的IL-2依赖的差异转录表达(IL-32，IL-6，PLAU基因的上调；CCL2，CLEC11A，ILF3，IRAK3，KIF14，MYL9基因的下调))和SR-hADSC(IL12A，IL7R，IRAK1，NOS3基因的上调；IL16，CSF1R基因的下调)表明hADSC的免疫调节性能易受衰老的影响。
观察到的与血管生成性VEGF途径(q值＝5.24e-3)(图10A，右侧和图7D)的连接和SEN-hADSC迁移的增强能力(图4A，B)表明暴露的IL-2SEN-MSC可以获得支持致瘤环境和转移所必需的特性。另外，复制衰老时hADSC中一氧化氮合酶途径(iNOS)NOS1途径(q值＝8.32e-2)中包括的基因的上调也表明经历衰老的MSC可以通过免疫抑制获得转移促进特性.
实施例7：复制衰老时IL-2刺激的hADSC的抗凋亡和转移促进特性
这些实验也用于检查在复制衰老时IL-2暴露的MSC的抗凋亡和转移促进特性。
表3显示了用于IL-2治疗的抗凋亡和转移促进标志物组，IL-2与其他药物的组合，或IL-2与MSC的组合。数据提供了对于评估抗凋亡和转移促进事件(例如，用于本发明的SEN和SR干细胞的QC)。
表3显示了在SEN和SR细胞中IL-2处理后抗凋亡和转移因子的差异表达。SR GFold值表示用IL-2处理的SR细胞相对于未用IL-2处理的SR细胞的倍数差异；SEN GFold值表示用IL-2处理的SEN细胞相对于未用IL-2处理的SEN细胞的倍数差异。
表3:IL-2处理后抗凋亡和转移因子的差异表达
例如，已经证明MSC辅助逆转缺血后心肌细胞的细胞凋亡，以及受损的神经元和肺成纤维细胞。Stanniocalcin1(STC1)已经被鉴定为能够在由UV和酸性损伤的成纤维细胞中有效的凋亡逆转的基本因子。
数据表明，IL-2暴露转录上调STC1和STC2基因，并且这种激活至少在体外不依赖于hADSC的复制老化(表6A-6D)。此外，VEGF和TGFB1等旁分泌效应也参与了内皮细胞凋亡的逆转。在IL-2处理时，编码这两种因子的基因的表达在SR和SEN-hADSC中上调(图7C，图5，表3和表6A-6D)。
图5的第三幅图显示，当hADSC复制衰老时，IL-2上调VEGFA基因的转录。通过定量qPCR在未刺激的(IL-2-)SEN(黑暗)和SR(亮)hADSC中并且用20ug/ml的重组IL-2(IL-2+)刺激来评估VEFGA基因表达。数据显示为来自三个独立实验的倍数变化ΔΔCT平均值±SD。图形描绘了q-PCR引物的位置。统计显着性通过t检验估计，其中***p<0.001，**p<0.01。
然而，通过图7C中所示的qPCR分析进一步验证，VEGFA的转录活性在衰老中显着高于活跃增殖的细胞。值得注意的是，与增殖的hADSC相比，在IL-2处理的SEN细胞中编码促细胞凋亡因子的SIVA1基因和有效的T淋巴细胞凋亡诱导剂显着下调(图7C，表3和表6A和6D)。SIVA1不是严格的促凋亡因子，而且是肿瘤转移的有效抑制因子。重要的是，与同样处理的SR细胞(图7C和表3)相比，在与IL-2接触的SEN-hADSC中，与侵袭性生长和转移有关的许多因子显着上调。这包括RACKI，PLEKHA1，PLEKHA6，CTSB，CRMP1，FERMT1基因。这些数据表明用IL-2预处理/暴露hADSC可以增强这些细胞的抗细胞凋亡特性，并且这种增强受到复制性衰老的影响。
结果表明，在IL-2处理的SEN-hADSC中，显着上调的基因富集与炎症相关的途径(IL-6途径，q值＝5.55e-3)和EGF信号传导(q值＝2.3 3e-4)已被证明为MSC提供了生存优势。暴露于IL-2的SEN-hADSC也被IL-1β，IL-6和IL-12(图7B)的已知刺激淋巴细胞中IL-17的细胞因子表达增加所标记。
数据还表明，淋巴细胞是IL-17产生的唯一来源，并且那些MSC，特别是在其衰老时，在受到促炎环境时显示出高的IL-17转录活性(图7A)。
实施例8：转录谱分析表明在复制性衰老时调节IL-2刺激的hADSC中增强的迁移和血管生成的基因靶标
显示了在老化后IL-2处理中指示增强的迁移和血管生成的标记组(表4)
转录谱分析表明调控复制衰老时IL-2刺激的ADSC中增强的迁移和血管生成的基因靶标。对转录应答的进一步分析表明，SEN-hADSC的IL-2刺激增强参与与血管生成相关的血管发育和重塑的基因的表达。观察到VEGFA，VEGFB，FBLNS，FBLN7，PGF，ANGPT1，ANGPT2，ANGPTL2，ANGPTL6，TNFSF12，PRKCA，PIK3CA，HRAS基因以及编码内皮细胞-白细胞粘着的有效调节剂的基因的显着上调，ESM1(图7D，图10A-10B，表4和表6A-6D)。
表4显示了在SEN和SR细胞中IL-2处理后迁移和血管生成因子的差异表达。SRGFold值表示用IL-2处理的SR细胞相对于未用IL-2处理的SR细胞的倍数差异；SEN GFold值表示用IL-2处理的SEN细胞相对于未用IL-2处理的SEN细胞的倍数差异。
表4：IL-2处理后迁移和血管生成促进因子的差异表达
由MCSs释放的血管内皮生长因子VEGF，使得内皮谱系细胞的募集和血管生成的启动如先前报道的那样。进一步证明，通过定量RT-PCR分析可以检测到SEN-hADSC中VEGFA基因表达的上调，并且IL-2暴露导致SR和SEN-hADSC中VEGFA基因转录的统计学显着增加(图7D和表4)。
进一步观察到，响应于IL-2暴露，仅在负责复制衰老的hADSC中负责细胞运动性，迁移和侵袭性生长的一组基因显着上调：CGNL1，CGREF1，CRMP1，FGD6，TNK2，PTGS1，TNFAIP8，CTSB，CTSO，FAP，FERMT1，PLEKHA1，PLEKHA6，ROCK1，ROCK2。下调了一组促进细胞粘附的基因，如CHD24，CYR61，ILK，NEDD9，MYL9，PPAP2B，RELN和TLN2(图7D，表4和表6A-6D)。这些数据进一步支持了图3B所示的SEN-hADSC迁移能力增强的实验证据。
实施例9：蛋白质组抗体阵列数据
表7提供了所有蛋白质组抗体阵列数据的原始值。
图2B显示了用于收集这些数据的五个因子产生单元。所有5个因子产生单元都含有除了A(无细胞对照)之外的含有StemPro MSC SFM无Xeno培养基的10％PRP的38岁患者的干细胞。在含有StemPro MSC SFM无Xeno培养基的10％PRP的700ul/cm 3中，因子产生单元填充有SR或SEN-hADSC 2500细胞/cm 3。参考图2B，因子产生单元C和E，将因子产生单元的细胞用IL-2刺激24小时，之后将培养基交换到含有StemPro MSC SFM无Xeno培养基的10％PRP。将因子产生单元保持在37℃和5％CO2下24,48和72小时，随后收集并分析培养基。
在RayBio C系列人细胞因子抗体阵列AAH-CYT-2000(RayBiotech，Inc)上分析来自因子产生单元的等体积培养基。C系列人类细胞因子抗体阵列AAH-CYT-2000基于化学发光检测原理，含有目的蛋白174的抗体。使用LI-COR Biosciences密度测定软件(Li-COR)从膜中提取数据。原始数据通过采用给定蛋白质信号的平均强度/平均强度阴性对照之间的比率来标准化，以说明暴露和阵列到阵列变异的差异。
表示为A的因子产生单元不包含细胞，作为对照。该子因子产生单元用含有StemPro MSC SFM Xeno-free培养基的700ul/cm 2的10％PRP进行设置。在24,48和72小时收集培养基，通过Qubit荧光定量使用Qubit 2.0(Thermofisher)定量总蛋白，将其应用于RayBio C系列人细胞因子抗体阵列AAH-CYT-2000，并如上所述提取数据并且分析。
标记为B的因子产生单元含有未用IL-2处理的SR-hADSC。该子因子产生单元在700ul/cm 3含有StemPro MSC SFM无Xeno培养基的10％PRP中填充患者特异性hADSC 2500细胞/cm 3。样品在24小时，48小时或72小时收集。
标记为C的因子产生单元是含有用IL-2处理的SR-hADSC的因子产生单元。该子因子产生单元在700ul/cm 3含有StemPro MSC SFM无Xeno培养基的10％PRP中含有2500细胞/cm 3患者特异性SR-hADSC。因子产生单元中的细胞用IL-2处理。对于IL-2处理，将子因子产生单元在20％/ml IL-2(Peprotech)中，在StemPro MSC SFM Xeno-free培养基中于10％PRP中于37℃处理24小时。用2次PBS-cmf洗涤后去除IL-2。新鲜培养基以700ul/cm 3加入。样品收集24小时，48小时或72小时后。
标记为D的因子产生单元含有衰老hADSC(SEN-hADSC)。该子因子产生单元在700ul/cm 3含有StemPro MSC SFM无Xeno培养基的10％PRP中含有2500细胞/cm 3的SEN-hADSC。样品在24小时，48小时或72小时收集。
标记为E的因子产生单元含有用IL-2处理的SEN-hADSC，如上面对于标记为C的因子产生单元所述。在24小时，48小时或72小时收集样品。
下面详细描述了图2B所示的因子产生单元A-E收集的因子。
图11-17显示了在与单独含有10％PRP(富血小板血浆)的培养基温育24小时后，保持在本发明的因子产生单元中的来自SR-hADSC的下述命名蛋白质(因子)的分泌增加(无IL-2刺激)。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。图11显示白细胞介素5(IL5)和白细胞介素6(IL6)的分泌增加。图12显示白细胞介素1受体4(IL1R4)的分泌增加。图13显示神经营养因子3(NT3)、血小板来源的生长因子Aα(PDGF AA)、血小板来源的生长因子Aβ(PDGF AB)和原血小板碱性蛋白(pro-platelet basic protein，PPBP)的分泌增加。图14显示趋化因子(C-C基序)配体18(CCL18)、趋化因子(C-C继续)配体25(CCL25)、趋化因子(C-C基序)配体27(CCL27)和CXC趋化因子配体11(CXCL11)的分泌增加。图15显示细胞间粘附分子1(ICAM-1)和金属蛋白酶抑制剂2(TIMP-2)的分泌增加。图16显示了金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)的分泌增加。图17显示了血管上皮(VE)钙粘蛋白(钙依赖性细胞粘附蛋白)的分泌增加。
图18-19显示了与单独的10％PRP温育24小时后(无IL-2刺激),来自SR-hADSC的以下命名的蛋白质(因子)的分泌增加。发现这些蛋白质不存在于PRP中。图18显示白细胞介素4(IL4)的分泌增加。图19显示胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP1)的分泌增加。
图18-19显示了与单独的10％PRP温育24小时后(无IL-2刺激),来自SR-hADSC的以下命名的蛋白质(因子)的分泌增加。发现这些蛋白质不存在于PRP中。图18显示白细胞介素4(IL4)的分泌增加。图19显示胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP1)的分泌增加。图20显示白细胞介素9(IL9)和白细胞介素18结合蛋白α(IL18BPa)的分泌增加。图21显示白细胞介素1受体II型(IL1R2)、白细胞介素2受体β(IL-2Rb)、白细胞介素2受体γ(IL-2Rg)、白细胞介素5受体α(IL5Ra)、白细胞介素10受体β(IL10Rb)、白细胞介素18受体辅助蛋白(IL18Rb)和白细胞介素21受体(IL-21R)的分泌增加。图22显示胰岛素样生长因子2(IGF2)、转化生长因子α(TGFa)、转化生长因子β1/潜伏相关肽(LAP)(TGFb1)和转化生长因子β2(TGFb2)的分泌增加。图23显示受体酪氨酸蛋白激酶ErbB-3(ErbB3)、Fas配体(Fas LG)、白血病抑制因子(LIF)、催乳素(PRL)因子、血小板来源的生长因子受体αPDGFRα)、血小板来源的生长因子受体β(PDGFRb)、干细胞因子试剂盒受体(SCFR)和唾液酸结合Ig样凝集素5(Siglec 5)的分泌增加。图24显示CXC趋化因子配体16(CXCL16)的分泌增加。图25显示活化的白细胞粘附分子(ALCAM)、E选择蛋白(免疫粘附中的细胞表面糖蛋白)、细胞间粘附分子2(ICAM2)、L选择素(淋巴细胞粘附分子)和血小板内皮细胞粘附分子(PECAM 1)的分泌增加。图26显示活化素A(INHBA)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)和瘦素受体(LEPR)的分泌增加。图27显示骨形态发生蛋白5(BMP5)、骨形态发生蛋白7(BMP7)、巨噬细胞集落刺激因子1受体(MCSFR)、基质金属蛋白酶1(MMP1)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、基质金属蛋白酶9(MMP9)和基质金属蛋白酶13(MMP13)的分泌增加。图28显示单核细胞分化抗原(CD14)、细胞分化抗原(CD80)、心肌营养素-1(CT-1)和白血病抑制因子(LIF)的分泌增加。图29显示内皮因子(ENG)的分泌增加。图30显示了具有免疫球蛋白样和EGF样结构域的酪氨酸激酶1(TIE1)和具有免疫球蛋白样和EGF样结构域的酪氨酸激酶2(TIE2)分泌的增加。图31显示活化素A(抑制素βA、INHBA)、瘦素受体(瘦素R)和转化生长因子β1(TGFb1)的分泌增加。
图32显示了在与单独的10％PRP温育48小时(无IL-2刺激)后，本发明的因子产生单元保持的从SR-MSC分泌的神经生长因子受体(NGFR)的增加。发现NGFR不存在于PRP中。
图33-39显示了在与单独的10％PRP温育72小时后(无IL-2刺激)，本发明的因子产生单元保持的从SR-hADSC分泌的以下命名蛋白质(因子)的增加。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。图33显示了白细胞介素1β(IL1b)、白细胞介素3(IL3)、白细胞介素-13受体亚单元α-2(IL13Rα2)和白细胞介素1受体α(IL1Rα)的分泌增加。图34显示促β细胞素(BTC)、集落刺激因子(CSF1)、成纤维细胞生长因子6(FGF6)、神经胶质细胞来源的神经营养因子(GDNF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、瘦素和血小板来源的生长因子Bβ(PDGF BB)的分泌增加。图35显示了干细胞因子/c-kit配体(SCF)、基质细胞来源的因子-1α(SDF1a)、基因细胞来源的因子-1β(SDF1b)、转化生长因子β1(TGFb1)、转化生长因子β3(TGFb3)和肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)的分泌增加。图36显示胰岛素样生长因子1(IGF1)的分泌增加。图37显示了转化生长因子β1(TGFb1)和血小板来源的生长因子Bβ(PDGF BB)的分泌增加。图38显示了趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、趋化因子(C-C基序)配体5(CCL5)、趋化因子(C-C基序)配体7(CCL7)、趋化因子(C-C基序)配体8(CCL8)和趋化因子(C-C基序)配体11(CCL11)的分泌增加。图39显示了趋化因子(C-C基序)配体13(CCL13)、趋化因子(C-C基序)配体22(CCL22)、趋化因子(C-C基序)配体23(CCL23)、趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)和CXC趋化因子配体10(CXCL10)的分泌增加。
图40-42显示了在与单独的10％PRP温育72小时后(无IL-2刺激)，本发明的因子产生单元保持的从SR-hADSC分泌的以下命名蛋白质(因子)的增加。发现这些因子被不在PRP中。图40显示了脑源性神经营养因子(BDNF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、骨形态发生蛋白6(BMP6)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)和胰岛素样生长因子结合蛋白-4(IGFBP4)的分泌增加。图41显示了趋化因子(CXC基序)配体13(BLC)、趋化因子(C-C基序)配体23(CCL23)、趋化因子(C-C基序)配体28(CCL28)、趋化因子(C-C基序)配体11(嗜铬细胞活化趋化因子1)、趋化因子(CXC基序)配体6(GCP-2)、FLT3LG(Fms相关的酪氨酸激酶3配体)和Fractalkine(CX3CL1)的分泌增加。图42显示基血管紧张素(ANG)和集落刺激因子2(CSF2)的分泌增加。
图43显示用IL-2刺激24小时后，本发明的因子产生单元中保持的来自SR-hADSC的趋化因子(C-C基序)配体27(CCL27)和TNFRSF1B(肿瘤坏死因子受体超家族成员1B)的分泌增加。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。
图44-53显示了用IL-2刺激48小时后，在本发明的因子产生单元中保持的来自SR-hADSC的以下命名的蛋白质(因子)的增加。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。图44显示了白细胞介素9(IL9)、白细胞介素11(IL11)、白细胞介素12α(IL12a)、白细胞介素12β(IL12b)和白细胞介素18结合蛋白α(IL18BPa)的分泌增加。图45显示了白细胞介素1受体I型(IL1R1)、白细胞介素1受体II型(IL1R2)、白细胞介素1受体IV型(IL1R4)、白细胞介素2受体β(IL-2Rb)、白细胞介素受体γ(IL-2Rg)、白细胞介素5受体α(IL5Ra)白细胞介素10受体β(IL10Rb)、白细胞介素18受体β(IL18Rb)和白细胞介素21受体(IL-21R)的分泌增加。图46显示了成纤维细胞生长因子4(FGF4)、FGF9、MSPα/HGF样因子(HGF样)、胰岛素样生长因子1(IGF1)、IGF2、胰岛素样生长因子结合蛋白-6(IGFBP6)、LAP(TGFβ家族)和血小板来源的生长因子αα(PDGFAA)的分泌增加。图47显示了血小板来源的生长因子Aβ(PDGFAB)、血小板来源的生长因子Bβ(PDGFBB)、基质细胞来源的因子-1α(SDF1a)、结合唾液酸的Ig样凝集素5(Siglec 5)、转化生长因子α(TGFa)、转化生长因子β2(TGFb2)、血管内皮生长因子(VEGF)和血管内皮生长因子D(VEGFD)的分泌增加。图47还显示DR6、Dtk、EGFR、内皮因子、ErbB3、Fas、Fas LG和IGF1sR的分泌增加。图48显示了瘦素(LEP)、瘦素受体(LEPR)、巨噬细胞集落刺激因子1受体(MCSFR)、神经营养因子4(NT4)、骨保护素(OPG)、血小板来源的生长因子受体α(PDGFRα)、血小板来源的生长因子受体β(PDGFRb)和催乳素(PRL)的分泌增加。图49显示干细胞因子受体(SCFR)、血管生成素1受体(TIE1)、血管生成素1受体(TIE2)、TNF超家族成员10C(TNFSF10C)、TNF超家族成员10D(TNFSF10D)、TNF超家族成员14(TNFSF14)、尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)和血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)的分泌增加。图50显示了趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、CCL3、CCL5、CCL8、CCL17、CCL20、CCL25、CXC趋化因子配体5(CXCL5)、CXCL11和CXCL16的分泌增加。图51显示活化的白细胞粘附分子(ALCAM)、骨形态发生蛋白5(BMP5)、BMP7、E选择素(内皮细胞粘附分子)、细胞间粘附分子2(ICAM2)、ICAM3、L选择素(淋巴细胞粘附分子)和基质金属蛋白酶1(MMP1)的分泌增加。图52显示了基质金属蛋白酶13(MMP13)、MMP3、MMP9、血小板内皮细胞粘附分子(PECAM1)、金属蛋白酶抑制剂TIMP1、TIMP2、TIMP4和血管上皮(VE)钙粘蛋白(钙依赖性细胞粘附蛋白)的分泌增加。图53显示了单核细胞分化抗原(CD14)、细胞分化抗原(CD80)、心肌营养素-1(CT-1)、白血病抑制因子(LIF)、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、血小板生成素(THPO)和淋巴细胞趋化蛋白(XCL1)的分泌增加。
图54显示用IL-2刺激48小时后在本发明的因子产生单元中保持的来自SR-hADSC的神经生长因子受体(NGFR)的分泌增加。图54还显示使用IL-2在IL-2刺激后24小时IL8和TNFRSF1A的分泌增加。发现NGFR、IL8和TNFRSF1A不存在于PRP中。
图55-57显示了用IL-2刺激72小时后本发明的因子产生单元中保持的来自SR-hADSC的以下命名的蛋白质(因子)的分泌增加。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。图55显示了白细胞介素1受体α(IL1Ra)、白细胞介素6(IL6)和白细胞介素-13受体亚单元α-2(IL13Ra2)的分泌增加。图56显示了成纤维细胞生长因子6(FGF6)、原血小板碱性蛋白(PPBP)、干细胞因子(SCF)和血管内皮生长因子受体-3(VEGFR3)的分泌增加。图57显示了趋化因子(C-C基序)配体22(CCL22)、CCL23、CCL24、CCL26和CXC趋化因子配体10(CXCL10)的分泌增加。
图58显示了用IL-2刺激72小时后本发明的因子产生单元中保持的来自SR-hADSC的血管紧张素(ANG)、脑源性神经营养因子(BDNF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、集落刺激因子2(CSF2)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF-7)、干扰素γ(IFNγ)，胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP1)和来自SR-hADSC的IGFBP2的分泌增加。发现这些因子不存在于PRP中
图59显示近与10％PRP(无IL-2刺激)温育24小时后本发明的因子产生单元中保持的来自SEN-hADSC的成纤维细胞生长因子6(FGF6)、CXC趋化因子配体16(CXCL16)和基质细胞来源的因子-1α(SDF1a)的分泌增加。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。
图60显示了仅与10％PRP(无IL-2刺激)温育24小时后本发明的因子产生单元中保持的来自SEN-hADSC的脑源性神经营养因子(BDNF)、B淋巴细胞趋化因子(CXCL13；BLC)、趋化因子(C-C基序)配体1(CCL1)、Flt-3LG相关的酪氨酸激酶3配体)、Fractalkine(T细胞趋化因子CX3CL1)、粒细胞趋化蛋白2(GCP-2)/CXCL6、白细胞介素1α(IL1a)、白细胞介素4(IL4)、IL15和干扰素γ(IFNγ)的分泌增加。发现这些因子不存在于PRP中。
图61-70显示了仅与10％PRP(无IL-2刺激)温育48小时后本发明的因子产生单元中保持的来自SEN-hADSC的下述命名蛋白(因子)的分泌增加。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。图61显示白细胞介素2β(IL-2b)、IL3、IL5和IL6的分泌增加。图62显示白细胞介素1受体II(IL1R2)、白细胞介素2受体γ(IL-2Rg)、白细胞介素5受体α(IL5Ra)、白细胞介素10受体β(IL10Rb)、白细胞介素18受体结合蛋白α(IL18BPa)、白细胞介素18受体β(IL18Rb)和白细胞介素21受体(IL-21R)的分泌增加。图63显示了胰岛素样生长因子1(IGF1)、IGF2、LAP(TGFβ家族)、瘦素(LEP)、瘦素受体(LEPR)、血小板来源的生长因子Aα(PDGFAA)、血小板来源的生长因子Aβ(PDGFAB)和血小板衍生生长因子Bβ(PDGFBB)的分泌增加。图64显示了血小板来源的生长因子受体α(PDGFRα)、干细胞因子(SCF)、干细胞因子受体(SCFR)、转化生长因子β1(TGFb1)、转化生长因子β2(TGF b2)、转化生长因子α(TGFa)、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)和VEGFR3的分泌增加。图65显示了死亡受体6(DR6；TNF受体超家族成员21)、神经胶质细胞系衍生物的神经营养因子(GDNF)、神经营养因子3(NT3)、具有免疫球蛋白样和EGF-样结构域1的酪氨酸激酶(TIE1)、TIE2和TNF超家族成员14(TNFSF14)的分泌增加。图66显示了趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、CCL5、CCL8、CCL17、CCL18和CCL23的分泌增加。图67显示了趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)、CCL25、CCL26、CCL27、CXC趋化因子配体10(CXCL10)和CXCL11的分泌增加。图68显示了活化的白细胞粘附分子(ALCAM)、骨形态发生蛋白5(BMP5)、BMP7、E选择素(内皮细胞粘附分子)、细胞间粘附分子1(ICAM1)、ICAM2、L选择素(淋巴细胞粘附分子)和基质金属蛋白酶1(MMP1)的分泌增加。图69显示基质金属蛋白酶3(MMP3)、MMP9、MMP13、血小板内皮细胞粘附分子(PECAM1)、金属蛋白酶抑制剂TIMP1、TIMP2和TIMP4的分泌增加。图70显示了单核细胞分化抗原(CD14)、单核细胞分化抗原(CD80)、心肌营养素-1(CT-1)和白血病抑制因子(LIF)的分泌增加。CT-1在体内具有广谱的生物活性，其可以减轻肾毒性，预防损伤后神经元死亡，对肌萎缩侧索硬化症(ALS)神经肌肉变性起到保护作用。
图71-72显示了仅与10％PRP(无IL-2刺激)温育48小时后保持在本发明的因子产生单元中的来自SEN-hADSC的以下命名的蛋白质(因子)的分泌增加。发现这些因子不存在于PRP中。图71显示了骨形态发生蛋白4(BMP4)、趋化因子(C-C基序)配体11(CCL11)、CCL23、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP1)、IGFBP2、IGFBP4和神经生长因子受体(NGFR)的分泌增加。图72显示白细胞介素7(IL7)、IL10、IL13和IL16的分泌增加。
图73显示仅与10％PRP(无IL-2刺激)温育72小时后保持在本发明的因子产生单元中的来自SEN-hADSC的促β细胞素(BTC)、白细胞介素-13受体亚单元α-2(IL13Ra2)和基质细胞衍生因子-1β(SDF1b)的分泌增加。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。
图74显示仅与10％PRP(无IL-2刺激)温育72小时后保持在本发明的因子产生单元中的来自SEN-hADSC的肝细胞生长因子(HGF)、白细胞介素8(IL8)和TNFRSF1A(肿瘤坏死因子受体超家族1A成员)的分泌增加。发现这些因子不存在于PRP中。
图75显示用IL-2刺激24小时后保持在本发明的因子产生单元中的来自SEN-hADSC的趋化因子(C-C基序)配体23(CCL23)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、表皮生长因子(EGF)、CCL11(嗜酸细胞活化趋化因子1)、IL4和神经生长因子受体(NGFR)的分泌增加。发现这些因子不存在于PRP中。
图75还显示了在IL-2刺激24h后CXCL16、HCC4、sgp130和TNFRSF1B的分泌增加。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。
图76-86显示了在用IL-2刺激48小时后保持在本发明的因子产生单元中的来自SEN-hADSC的以下命名的蛋白(因子)的分泌增加。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。图76显示了白细胞介素1β(IL1b)、IL3、IL5、IL6、IL9、IL10、IL12b和白细胞介素18结合蛋白α(IL18BPa)的分泌增加。图77显示白细胞介素1受体α(IL1Ra)、IL1R4、IL10Rb、IL18Rb、IL1R2、IL-21R、IL-2Rb、IL-2Rg和IL5Ra的分泌增加。图78显示了成纤维细胞生长因子6(FGF6)、胰岛素样生长因子IGF1和IGF2、LAP(TGFβ家族)、神经营养因子3(NT3)、血小板来源的生长因子r Aα(PDGFAA)、血小板来源的物生长因子Aβ(PDGFAB)和血小板来源的生长因子受体α(PDGFRα)的分泌增加。图79显示干细胞因子(SCF)、转化生长因子2(TGF2)、TGFa、TGFb1、TGFb3、肿瘤坏死因子β(TNFb)、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)和VEGF R3的分泌增加。图80显示了DR6(TNF受体超家族成员21)、内皮因子(ENG)、受体酪氨酸蛋白激酶erbB-3(ErbB3)、Fas配体(FasLG)、神经胶质细胞系来源的物的神经营养因子(GDNF)、GITR配体(GITR LG)和瘦素受体(LEPR)的分泌增加。图81显示催乳素(PRL)、干细胞因子受体(SCFR)、结合唾液酸的Ig样凝集素5(Siglec 5)、血管生成素1受体(TIE1)和血管生成素1受体(TIE2)的分泌增加。图82显示了趋化因子(C-C基序)配体8(CCL8)、CCL13、CCL15、CCL17、CCL18和CCL20的分泌增加。图83显示了趋化因子(C-C基序)配体22(CCL22)、CCL24、CCL26、CXC趋化因子配体9(CXCL9)和CXCL11的分泌增加。图84显示活化素A(INHBA)、骨形态发生蛋白5(BMP5)、E选择素(内皮细胞粘附分子)、细胞间粘附分子1(ICAM 1)、ICAM 2、L选择素(淋巴细胞粘附分子)和巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)的分泌增加。图85显示基质金属蛋白酶1(MMP1)、MMP13、MMP3、MMP9、血小板内皮细胞粘附分子(PECAM1)和金属蛋白酶抑制剂4(TIMP-4)的分泌增加。图86显示了单核细胞分化抗原(CD14)、淋巴细胞分泌素(XCL1)、心肌营养素-1(CT-1)、白血病抑制因子(LIF)、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)和原血小板碱性蛋白(PPBP)的分泌增加。
图87显示了在用IL-2刺激48小时后保持在本发明的因子产生单元中的来自SEN-hADSC的脑源性神经营养因子(BDNF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP2)、IL-2、IL16和干扰素γ(INFγ)的分泌增加。发现这些因子不存在于PRP中。
图88-89显示了在用IL-2刺激72小时后保持在本发明的因子产生单元中的来自SEN-hADSC的下述蛋白质(因子)的分泌增加。显示了相对于用于hADSC支持的含有10％PRP的培养基中基础水平存在的相应蛋白质的量的分泌水平。图88显示了脂联素(Acrp30)、刺鼠相关蛋白(AgRP)、ANGPT2(血管生成素2)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、促β细胞素(BTC)、白细胞介素-13受体亚单元α-2(IL13Ra2)、瘦素(LEP)、神经营养因子4(NT4)和基质细胞来源的因子-1α(SDF1a)的分泌增加。图89显示了趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、CCL4、CCL5、CCL23、CCL25、CCL27、CXC趋化因子配体10(CXCL10)、基质细胞来源的因子-1β(SDF1b)、金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)、TIMP2和肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)的分泌增加。
图90显示了在用IL-2刺激72小时后保持在本发明的因子产生单元中的来自SEN-hADSC的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL13的分泌增加。发现这些因子不存在于PRP中。
实施例10：使用微小RNA诱导衰老
SEN表型可通过转染衰老相关微RNA(SA-miRNA)或SA-miRNA模拟物的一系列浓度(1pm至1000uM)来实现。
这个实施例表明源自MIRG17HG和MIR100HG簇的SA-miRNA可以协调地调节基因靶以诱导衰老。SA-miRNA向SR-ADSC的瞬时递送足以诱导SEN表型。分别从MIR100HG或MIR17HG簇中分别传递SA-miRNA的miRNA模拟物不会导致SA-βgal检测到的SEN表型(图108，图A)。当两个簇中的SA-miRNA转染到SR-hADSC中时，约40％的细胞通过衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-βgal)的表达被标记。在所有这些实验中使用FITC标记的随机RNA作为转染效率的对照，其范围为50至60％(图108，图B)。SEN表型是通过一系列浓度(5pM或10pM结合SA-miRNA模拟物)实现的。
细胞培养
转染前一天将SR-hADSC以约1×104个细胞/孔的密度接种在4孔载玻片上。使用转染试剂如Fugene 6(Promega)，用5pmol或10pmol的一个或多个衰老相关的microRNA模拟物进行转染。
RT-PCR
根据制造商的说明使用TRIzol试剂TM(Life Technologies)从细胞提取总细胞RNA。使用mirPremier microRNA分离试剂盒(Sigma-Aldrich)分离微小RNA，用NanoDropND-2000分光光度计(Thermo Scientific)定量RNA和microRNA。通过使用上标III逆转录酶(Life Technologies)加入纯化的RNA和寡聚(dT)引物合成cDNA。引物由primer3软件设计，见表S1。对于miRNA cDNA合成，使用神秘微小RNA cDNA合成混合试剂盒(Sigma-Aldrich)。所有的微RNA分析引物均购自Sigma-Aldrich。
PCR实时定量PCR
使用LightCycler？480实时PCR系统(Roche)，通过实时定量PCR(qRT-PCR)对候选基因的mRNA和微RNA表达进行定量。使用高容量上标III逆转录酶(Life Technologies)和Mystic microRNA cDNA合成混合试剂盒(Sigma-Aldrich)分别逆转录总RNA和microRNA。引物由引物3软件设计，序列提供于下表5中。所有的微RNA分析引物均购自Sigma-Aldrich。在MicroAmp光学96孔反应板中用功能绿色PCR主混合物和神秘微小RNA SYBR绿色qPCR ReadyMix进行qRT-PCR反应。总RNA的PCR扩增在LightCycler？480实时PCR系统(Roche)中使用以下程序进行：循环1,95℃10分钟。循环2,40个循环的95℃15秒，60℃60秒。CT值自动获得。通过使用CT方法将mRNA基因的CT值与内源性对照(β-肌动蛋白)的CT值相比较来获得RNA的相对表达值。使用以下程序在LightCycler？480实时PCR系统(Roche)中进行微RNA的PCR扩增：循环1,95℃2分钟。循环2,40个循环的95℃5秒，60℃30秒。通过使用CT方法将微RNA基因的CT值与内源对照(U6)的CT值相比较来获得微RNA的相对表达值。
表5:qPCR引物
结果
可用于诱导衰老的SA-miRNA模拟物包括mir-17-5p，mir-18a-5p，mir-19a-3p，mir-20a-5p和mir-92a1-5p，mir-125b1-5p，mir-1let7a-2-3p和mir-100-5p(在本实施例中称为一组SA-miRNA模拟物)。
图108说明来自致癌MIR17HG和抑瘤MIR100HG簇的衰老相关miRNA起到建立hADSCSEN表型的作用。图A显示SA-miRNA的模拟物从MIR17HG(mir-17-5p，mir-18a-5p，mir-19a-mir-18a-5p)瞬时转染后计数的细胞总数中SA-β-Gal阳性细胞的百分比。3p，mir-20a-5p和mir-92a1-5p)或MIR100HG(mir-125b1-5p，mir-1let7a-2-3p，mir-100-5p)分别聚簇或同时转染后，来自SR hADSC中的两个簇的miRNA模拟物。如实验程序中所述，用FITC标记的对照转染SA-miRNA模拟物以解释转染效率。(B)中显示各组合的转染效率，并表示为在荧光显微镜下计数的细胞总数(n)中绿色细胞的百分比。
图109示出了在用5pM或10pM SA-miRNA模拟物转染SR-hADSC后，描绘SA-β-Gal阳性和SR-hADSC向SEN-hADSC转化的区域。
在这些条件下诱导的SEN表型与复制衰老类似，如通过下调少数选择的基因所证明的(图110-112)。在用全套SA-miRNA模拟物转染的SR-hADSC中，从代表SA-miRNA靶基因如SUZ12，NAP1L1，SMARCD2，SAP18，IGF2BP3，CHD2和CHD4的富集的功能网络中下调内源mRNA(图110和图113)，以及许多未被SA-miRNA靶向的基因，但是在复制性衰老时表现出下调，如SMARCA1，CHD8，HDAC3，HDAC5和HDAC9(图111和图113)被观测到。
图110显示了SA-miRNA对基因转录的直接影响。SA-miRNA靶基因的表达通过SR-hADSC(SR，光条)和用SA-miRNA模拟物(SR+miRNA，暗条)组瞬时转染的SR-hADSC中的qPCR分析来测量。)。
图111显示了SA-RNAs对基因转录的间接影响。先前显示在SEN-hADSC中下调而未鉴定为SA-miRNA靶标的基因的表达通过SR-hADSC(SR，光条)和用SA-miRNA模拟物组瞬时转染的SR-hADSC中的qPCR分析来测量(SR+miRNA，黑条)。从转染后的细胞48h分离RNA。样品针对β-肌动蛋白标准化。平均表达水平±SEM(n＝3)显示为倍数变化评估统计学差异，其中***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。
图112显示用SA-miRNA转染的SR-hADSC(光条)和SEN-hADSC(黑条)中的平均归一化蛋白质表达水平±SEM(n＝3)。显示SA-miRNA直接和间接靶基因的结果。统计学差异通过学生t检验评估，其中***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。
图113显示了SA-miRNA在复制衰老中的新靶基因及其功能关系和富集。如上所述，使用基于网络的方法评估了四种功能类别的基因的关系和功能富集。网络节点代表基因，并根据其功能类别进行分类。基因节点被标记为关于靶向的miRNA。边缘表示来自STRING数据库的注释蛋白质关系。黑色实线边表示子网最小生成树(即斯坦纳树)的连接，深灰色虚线表示附加子网连接，浅灰色虚线表示特定于功能的子网之间的连接。P值表示每个功能特异性子网络丰富来自该特定功能类别的基因的程度。斯坦纳节点显示为灰色。根据其功能类别显示下调的基因，其不被SA-miRNA靶向。
实施例11：人PBMC的因子依赖性免疫刺激以增加Treg细胞的产生
发明人在此(在图98中)示出了在本发明的示例性因子产生单元中由SRMSC+IL-2产生的因子具有调节Treg细胞产生的能力。Treg细胞在此由CD4+CD25+FoxP3+(Forkheadbox P3(FoxP3)+表达)和CD4+CD25-FoxP3+定义。表达转录因子FoxP3的CD4+调节性T细胞(Treg细胞)具有高度免疫抑制性，在维持自身耐受和免疫稳态方面发挥重要作用。
以下描述了用于产生可影响Treg分化和产生的因子的材料和方法。
hADSC的分离，培养和表征
在本实施例中使用的MSC分离自38岁，45岁和49岁的健康成年女性供体的人类脂肪组织，在加州圣地亚哥的UCSD医疗中心进行常规吸脂手术。MSC分离方案经当地伦理委员会批准并如先前所述进行(Wang等，Cell Cycle，2011)。分离的脂肪来源的干细胞系在DMEM/F12培养基(Life Technologies)中生长。根据国际细胞治疗协会(Dominiciet.al.2006，Cytotherapy 8：315-317)设定的MSC最低定义标准，流式细胞术分析显示hADSC表达CD29，CD73，CD90和CD105，但不表达CD11b，CD14，CD19，CD34，CD45，CD80，CD86(来自eBiosciense，USA的抗体)。形态学分析显示，细胞呈现成纤维细胞样形态，是塑料粘附的，并且在使用市售分化培养基(Invitrogen，USA)的体外条件下能够成脂肪，软骨形成和成骨分化。如所述，累积群倍增(PD)在多次传代中作为PD＝log(N/NO)x 3.33计算，作为培养物生长天数的函数(Wang等，Cell Cycle，2011；Niu等2015，Oncotarget)，其中N0是烧瓶中铺板的细胞数量，N是在这个通道中收获的细胞数目。hADSC PD 4或PD 6用于SR群。
使用遗传毒性剂诱导衰老
为了诱导基因毒性衰老，将细胞用基因毒性剂博来霉素(开曼化学公司(一种抗癌化疗药))处理。将含有患者hADSC的因子产生单元(含有模拟3-D ECM的聚己酸内酯(PCL)基质/纤维制成的3-D支架)用50ug/ml博莱霉素在含有StemPro MSC的10％PRP SFM无异种培养基37℃温育2h(Niu等，Oncotarget，2015)。遗传毒性暴露后，因子产生单元用PBS-cmf洗涤两次，并更换新鲜培养基。将因子产生单元维持5天以达到完全遗传毒性诱导的衰老，随后将具有SEN细胞的因子产生单元(SEN)或用20U/ml IL-2处理24小时(SEN+IL-2)如下所述。如制造商的试剂盒(BioVision)中所述和先前发表的用于监测pH依赖性衰老相关β-半乳糖苷酶活性(SA-βGal)表达的测定法(Wang等，2011，Cell Cycle 10：3016-3030)。培养的hADSC在室温下用PBS洗涤15分钟，并在37℃下用含X-Gal的补充物过夜染色。将细胞用PBS洗涤2次，使用显微镜(日本Nikon，TE300，DXM1200数码相机)拍摄图像。
IL-2刺激/治疗
如(Deenick等，2003，J Immunol 170：4963-4972；Niu等，2015，Oncotarget)所述进行用重组IL-2(Peprotech，USA)刺激。在37℃下将20U/ml的IL-2加入到培养基中24小时。对于IL-2处理，将含有hADSC的因子产生单元在37℃下用10％PRP中的20U/ml IL-2(Peprotech)在StemPro MSC SFM无异源培养基中处理24小时。在用PBS-cmf洗涤2次后去除IL-2，并将细胞与PBMC在含10％PRP的StemPro MSC SFM无异养培养基中共培养。
与PBMCs共同培养免疫调节
图2C：未处理的SR-hADSC，未经处理的基因毒性诱导的SEN-hADSC，用IL-2处理的SR-hADSC和用IL-2处理的SEN-hADSC，四个因子产生单元用细胞填充四种条件。用细胞产生的因子来指导PBMC群中的Treg产生。对于每种条件，50,000个hADSC与500,000个活的正常外周血单核细胞(PBMC)共培养72小时。来自单个健康的32岁男性供体的PBMC购自加利福尼亚州阿拉米达的AllCells。将新鲜的小瓶解冻用于每个实验，并在用台盼蓝染色后使用Biorad TC20细胞计数器进行细胞活性和细胞计数。对照用单独的PBMC进行(图2C)，在24小时或72小时的时间点通过胰蛋白酶消化收集细胞，使用含有FoxP3Alexa Fluor 647，PE小鼠抗人CD25的抗人FoxP3染色试剂盒(BD Biosciences)对Treg进行染色，FITC小鼠抗人CD4，同种型FITC-小鼠IgG1，同种型PE-小鼠IgG1，同种型Alexa 647-小鼠IgG1k，如图97和图99所示。
FACS数据分析策略-Treg产生分析
在24小时和72小时的时间点通过胰蛋白酶消化收集细胞，并用含有FoxP3AlexaFluor 647，PE小鼠抗人CD25，FITC小鼠抗人CD4，同种型FITC标记的抗人FoxP3染色试剂盒(BD Biosciences)小鼠IgG1，同种型PE-小鼠IgG1，同种型Alexa 647-小鼠IgG1k按照制造商的建议。简而言之，将细胞与在染色缓冲液(BD Biosciences，CA)中1:50稀释的人Fc-受体阻断(BD Biosciences)在冰上温育10分钟以阻断非特异性受体结合。将细胞在冰上温育30分钟，每种表面抗20μl抗CD4(FITC)或CD25(PE)或两种抗体和同种型匹配的对照抗体。随后用1ml染色缓冲液洗涤细胞，并在4℃在黑暗中用提供于FoxP3染色试剂盒(BDBiosciences)中的固定缓冲液固定10分钟。使用透化缓冲液(BD Biosciences)在室温下透化细胞30分钟，随后用1ml染色缓冲液洗涤。洗涤后，将细胞与20ul FoxP3-Alexa Fluor647抗体在室温在黑暗中温育30分钟。在培养期结束时，将PBMCS洗涤并重新悬浮于500ul的固定缓冲液中，并在FACS Canto II流式细胞仪(BD Biosciences。
在UCSF核心设施的FACS Canto II流式细胞仪(BD Biosciences)上收集数据。Onecomp ebeads(eBioscience)被用于补偿制造商协议。简而言之，将1滴珠子加入到单独的管中，并将单一抗体以用于PBMC的浓度加入到每个管中。将样品在4℃下温育15分钟，随后用2ml染色缓冲液洗涤，重悬于染色缓冲液中，用于设置用于PBMCs染色的PE，FITC和Alexa-647荧光染料的最佳荧光检测器(PMT)电压。
如图97B中使用FlowJo软件(Tree Star Inc)的FACS分析门控策略所概述的那样进行Treg分析。从总PBMC群向前和侧向分散淋巴细胞。随后，将表达CD4-FITC群的淋巴细胞群门控以鉴定CD25-PE T细胞：CD4+CD25+T细胞或CD4+CD25-T细胞。表达FoxP3蛋白的群被鉴定为Treg(如图97所示)。Treg群可定义为CD4+CD25-FoxP3+和三阳性CD4+CD25+FoxP3+淋巴细胞。
图98说明本发明的示例性因子产生单元中产生的因子影响Treg的产生。该图显示，在用IL-2刺激72小时(24小时)后从SR hADSC收集的因子对于测试条件之外的Tregs产生的增加是最佳的。
图99显示了来自FACS分析的代表性数据。图中的数字表示表达标记的群中的细胞数目。该表格提供了在A-D组上表达标记的细胞数的总结。在该门控中，基于光散射图分布(SSC-A对FSC-A)(A)门控淋巴细胞。基于结合的CD4FITC进一步分析来自图A的淋巴细胞群的CD4+淋巴细胞，并显示为直方图(B)。随后顺序分析CD4+淋巴细胞的CD25表达(D)，随后基于阳性Alexa-Fluor 647抗-FoxP3抗体结合分析表达Foxp3的Treg。图E-H显示了2个标志物表达的淋巴细胞的点图。在x轴上显示CD4+淋巴细胞，在y轴上显示CD25表达(E)。CD4+CD25+淋巴细胞在Q2。表示表达CD25+或CD25阴性的Foxp3+阳性T-Regs(图F和G)。在图H中绘制了总CD4+CD25+FoxP3+Tregs。
从上述可以理解的是，尽管为了说明的目的在这里描述了本发明的具体变化，但是在不偏离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，除了所附权利要求之外，本发明不受限制。

Claims (74)

1.在个体中治疗疾病或病症的方法，其包括将由干细胞群产生的一种或多种因子递送至所述个体或来自所述个体的生物流体。
2.权利要求1的方法，其中所述该细胞包含间充质干细胞(MSC)。
3.权利要求1的方法，其中所述干细胞包含自我更新(SR)细胞和衰老(SEN)细胞。
4.权利要求1的方法，其中所述干细胞群包含至少50％SR细胞。
5.权利要求1的方法，其中所述干细胞群包含至少50％SEN细胞。
6.权利要求1的方法，其中所述干细胞在暴露至诱导剂时已诱导产生所述因子。
7.权利要求6的方法，其中所述暴露为约24小时。
8.权利要求6的方法，其中所述诱导剂包含IL-2。
9.权利要求6的方法，其中所述干细胞包含至少50％SR细胞。
10.权利要求6的方法，其中所述干细胞包含至少50％SEN细胞。
11.权利要求1的方法，其中所述因子分泌自所述细胞。
12.权利要求7的方法，其中所述因子在诱导后24、48或72小时递送。
13.权利要求1的方法，其中所述疾病或病症是癌症、自身免疫性疾病、心血管疾病、糖尿病、皮肤病、神经退行性疾病、骨质疏松症、骨关节炎、脊髓损伤、肝脏疾病、肾脏疾病、与年龄相关的病理学、脱发、烧伤、需要皮肤移植的病况或皮肤损伤。
14.权利要求1的方法，其中所述干细胞是脂肪来源的干细胞(ADSC)。
15.权利要求1的方法，其中所述干细胞源自小泡基质部分。
16.权利要求1的方法，其中所述递送包括使用透皮贴剂、单采系统、基于微针的系统、乳剂或dermaroller。
17.权利要求1的方法，其中所述因子对所述个体是自体的。
18.权利要求1的方法，其中所述因子对所述个体是异源的。
19.权利要求1的方法，其中所述因子在因子产生单元中产生。
20.权利要求1的方法，其中所述因子包括白细胞介素1β(IL1b)、白细胞介素3(IL3)、白细胞介素-13受体亚单元α-2(IL13Rα2)、白细胞介素1受体α(IL1Rα)、促β细胞素(Probetacellulin，BTC)、集落刺激因子(CSF1)、成纤维细胞生长因子6(FGF6)、神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、瘦素、血小板来源的生长因子Bβ(PDGF BB)、脑源性神经营养因子(BDNF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、骨形态发生蛋白6(BMP6)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、胰岛素样生长因子结合蛋白-4(IGFBP4)、干细胞因子/c-kit配体(SCF)、基质细胞来源的因子-1α(SDF1a)、基质细胞来源的因子-1β(SDF1b)、基血管紧张素(ANG)、集落刺激因子2(CSF2)、转化生长因子β1(TGFb1)、转化生长因子β3(TGFb3)、肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)、趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、趋化因子(C-C基序)配体5(CCL5)、趋化因子(C-C基序)配体7(CCL7)、趋化因子(C-C基序)配体8(CCL8)、趋化因子(C-C基序)配体11(CCL11)、趋化因子(C-C基序)配体13(CCL13)、趋化因子(C-C基序)配体22(CCL22)、趋化因子(C-C基序)配体23(CCL23)、趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)、CXC趋化因子配体10(CXCL10)、趋化因子(C-X-C基序)配体13(BLC)、趋化因子(C-C基序)配体23(CCL23)、趋化因子(C-C基序)配体28(CCL28)、趋化因子(C-C基序)配体11(嗜酸细胞活化趋化因子1)、趋化因子(C-X-C基序)配体6(GCP-2)、FLT3LG(Fms相关的酪氨酸激酶3配体)和Fractalkine(CX3CL1)。
21.权利要求1的方法，其中将所述因子递送至来自所述个体的生物流体。
22.权利要求21的方法，其中将所述因子递送至来自所述个体的血浆。
23.权利要求21的方法，其中将所述因子递送至所述血浆诱导血液中调节性T细胞的产生。
24.权利要求23的方法，其进一步包括将所述血液引回入所述受试者。
25.在因子产生单元中产生一种或多种因子的方法，其包括将诱导剂添加至干细胞群以诱导因子的产生，由此产生所述一种或多种因子。
26.权利要求25的方法，其中所述干细胞包含间充质干细胞(MSC)。
27.权利要求25的方法，其中所述干细胞为脂肪来源的干细胞(ADSC)。
28.权利要求25的方法，其中所述干细胞来自小泡基质部分。
29.权利要求25的方法，其中所述干细胞包含自我更新(SR)细胞和衰老(SEN)细胞。
30.权利要求25的方法，其中所述干细胞群包含至少50％SR细胞。
31.权利要求25的方法，其中所述干细胞群包含至少50％SEN细胞。
32.权利要求25的方法，其中所述干细胞在暴露至诱导剂时已诱导产生所述因子。
33.权利要求32的方法，其中所述诱导剂包含IL-2。
34.权利要求25的方法，其中所述因子分泌自所述细胞。
35.权利要求32的方法，其中所述因子在诱导后24、48或72小时获得。
36.权利要求25的方法，其中所述干细胞群来自单独个体。
37.权利要求25的方法，其中所述干细胞群来自多个个体。
38.权利要求25的方法，其中所述因子包含白细胞介素1β(IL1b)、白细胞介素3(IL3)、白细胞介素-13受体亚单元α-2(IL13Rα2)、白细胞介素1受体α(IL1Rα)、促β细胞素(BTC)、集落刺激因子(CSF1)、成纤维细胞生长因子6(FGF6)、神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、瘦素、血小板来源的生长因子Bβ(PDGF BB)、脑源性神经营养因子(BDNF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、骨形态发生蛋白6(BMP6)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、胰岛素样生长因子结合蛋白-4(IGFBP4)、干细胞因子/c-kit配体(SCF)、基质细胞来源的因子-1α(SDF1a)、基质细胞来源的因子-1β(SDF1b)、基血管紧张素(ANG)、集落刺激因子2(CSF2)、转化生长因子β1(TGFb1)、转化生长因子β3(TGFb3)、肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)、趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、趋化因子(C-C基序)配体5(CCL5)、趋化因子(C-C基序)配体7(CCL7)、趋化因子(C-C基序)配体8(CCL8)、趋化因子(C-C基序)配体11(CCL11)、趋化因子(C-C基序)配体13(CCL13)、趋化因子(C-C基序)配体22(CCL22)、趋化因子(C-C基序)配体23(CCL23)、趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)、CXC趋化因子配体10(CXCL10)、趋化因子(C-X-C基序)配体13(BLC)、趋化因子(C-C基序)配体23(CCL23)、趋化因子(C-C基序)配体28(CCL28)、趋化因子(C-C基序)配体11(嗜酸细胞活化趋化因子1)、趋化因子(C-X-C基序)配体6(GCP-2)、FLT3LG(Fms相关的酪氨酸激酶3配体)和Fractalkine(CX3CL1)。
39.权利要求38的方法，其中所述因子用于皮肤美容应用。
40.权利要求25的方法，其中所述因子用于癌症、自身免疫疾病、心血管疾病、糖尿病、皮肤病、神经退行性疾病、骨质疏松症、骨关节炎、脊髓损伤、肝脏疾病、肾脏疾病、与年龄相关的病理学、脱发、烧伤、需要皮肤移植的病况或皮肤损伤的治疗。
41.产生一种或多种适于皮肤美容应用的因子的方法，其包括将干细胞群与10％PRP温育，由此产生一种或多种适于皮肤美容应用的因子。
42.因子组合物，其包含收集自与IL-2温育72小时后的SR-hADSC的因子。
43.在样品中增加调节性T细胞数目的方法，其包括将包含T细胞的样品与因子组合物接触，其中所述因子组合物包含收集自与IL-2温育72小时后的SR-hADSC的因子。
44.权利要求43的方法，其中所述样品包含血液。
45.权利要求43的方法，其中所述样品包含血浆。
46.因子产生单元，其包含基质和输入的干细胞群。
47.权利要求42的因子产生单元，其中所述基质包含聚合物材料。
48.权利要求42的因子产生单元，其中所述输入的干细胞包含MSC。
49.权利要求42的因子产生单元，其中所述基质是三维基质。
50.权利要求47的因子产生单元，其中所述聚合物材料包含生物可降解聚合物。
51.权利要求47的因子产生单元，其中所述聚合物材料包含非生物可降解聚合物。
52.权利要求47的因子产生单元，其中所述聚合物材料包含聚乙烯对苯二甲酸乙二酯、聚酯纤维、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯腈、硅酮、聚氨基甲酸酯、聚碳酸盐/酯、聚醚酮酮、聚醚醚酮、聚醚酰亚胺、聚酰胺、聚苯乙烯、聚醚砜、聚砜、聚己酸内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚甘油癸二酸、聚二醇柠檬酸盐、多羟基丁酸酯、聚醚酰胺、聚二烷酮、纤维连接蛋白、胶原、明胶、透明质酸、壳聚糖及其组合、共混物或共聚物。
53.权利要求42的因子产生单元，其中所述基质包含多种电纺纳米纤维或三维打印的纳米纤维。
54.权利要求53的因子产生单元，其中所述纳米纤维与干细胞电纺。
55.权利要求53的因子产生单元，其中所述多种电纺纤维配置为人工细胞外基质。
56.权利要求42的因子产生单元，其中所述干细胞群设置在所述基质表面上。
57.权利要求42的因子产生单元，其中所述干细胞群设置在所述基质的聚合材料内。
58.权利要求42的因子产生单元，其中所述干细胞包含自我更新(SR)细胞和衰老细胞(SEN)。
59.权利要求42的因子产生单元，其中所述干细胞群包含至少50％SR细胞。
60.权利要求59的因子产生单元，其中所述干细胞为诱导的SR细胞。
61.权利要求42的因子产生单元，其中所述干细胞群包含至少50％SEN细胞。
62.权利要求61的因子产生单元，其中所述干细胞为诱导的SR细胞。
63.权利要求42的因子产生单元，其中所述因子产生单元是单采系统的一部分。
64.权利要求63的因子产生单元，其中所述单采系统是血浆单采系统。
65.权利要求42的因子产生单元，其中产生因子且所述因子用于调节免疫细胞。
66.权利要求65的因子产生单元，其中产生因子并用于增加调节T细胞的产生。
67.权利要求42的因子产生单元，其中产生因子且所述因子用于治疗自身免疫疾病、癌症、糖尿病、皮肤病、神经退行性疾病、骨质疏松症、骨关节炎、肝脏疾病、肾脏疾病、与年龄相关的病理学、需要皮肤移植的病况或皮肤损伤。
68.因子组合物，其包含白细胞介素1β(IL1b)、白细胞介素3(IL3)、白细胞介素-13受体亚单元α-2(IL13Rα2)、白细胞介素1受体α(IL1Rα)、促β细胞素(BTC)、集落刺激因子(CSF1)、成纤维细胞生长因子6(FGF6)、神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、瘦素、血小板来源的生长因子Bβ(PDGF BB)、脑源性神经营养因子(BDNF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、骨形态发生蛋白6(BMP6)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、胰岛素样生长因子结合蛋白-4(IGFBP4)、干细胞因子/c-kit配体(SCF)、基质细胞来源的因子-1α(SDF1a)、基质细胞来源的因子-1β(SDF1b)、基血管紧张素(ANG)、集落刺激因子2(CSF2)、转化生长因子β1(TGFb1)、转化生长因子β3(TGFb3)、肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)、趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、趋化因子(C-C基序)配体5(CCL5)、趋化因子(C-C基序)配体7(CCL7)、趋化因子(C-C基序)配体8(CCL8)、趋化因子(C-C基序)配体11(CCL11)、趋化因子(C-C基序)配体13(CCL13)、趋化因子(C-C基序)配体22(CCL22)、趋化因子(C-C基序)配体23(CCL23)、趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)、CXC趋化因子配体10(CXCL10)、趋化因子(C-X-C基序)配体13(BLC)、趋化因子(C-C基序)配体23(CCL23)、趋化因子(C-C基序)配体28(CCL28)、趋化因子(C-C基序)配体11(嗜酸细胞活化趋化因子1)、趋化因子(C-X-C基序)配体6(GCP-2)、FLT3LG(Fms相关的酪氨酸激酶3配体)和Fractalkine(CX3CL1)。
69.权利要求68的因子组合物，其进一步以乳剂或洗剂的形式配制。
70.权利要求68的因子组合物，其进一步在包含微针的贴剂上配制。
71.权利要求68的因子组合物，其进一步配制以与基于dermaroller的递送系统组合。
72.试剂盒，其包含权利要求68的因子组合物。
73.在SR干细胞中诱导衰老的方法，其包括转染入所述细胞一种或多种选自下组的微小RNA(miRNA)：miR-17-5p、miR-18a-5p、miR-20a-5p、mir-92a1-5p、mir-19a-3p、mir-125b1-5p、mir100-5p和mir-let7a-2-3p。
74.权利要求73的方法，其中所述SR-干细胞是SR-hADSC。
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