JP2022140711A - 幹細胞からの有益因子の産生および送達のための方法およびデバイス - Google Patents

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Abstract

【課題】 幹細胞からの有益因子の産生および送達のための方法およびデバイスの提供。【解決手段】個体における疾患または障害の処置のための１つまたは複数の有益な因子を産生するための、自己再生または老化幹細胞の集団の誘導に関する方法およびデバイスが、本明細書に提供される。個体における疾患または障害の処置のための１つまたは複数の有益な因子を産生するための、幹細胞の集団における老化の誘導に有用な、老化を誘導するための組成物および方法も提供される。処置されている疾患または障害の要求に有益な因子の産生を制御およびカスタマイズするための方法およびデバイスについて記載されている。有益な因子の産生のための因子産生ユニット、およびそれを必要とする個体への有益な因子の送達のためのデバイスも提供される。【選択図】なし

Description

（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１５年６月３日に出願された米国仮出願第６２／１７０，６０４号、２０１５年６月３日に出願された米国仮出願番号第６２／１７０，６１９号、および２０１５年６月１２日に出願された米国仮出願番号第６２／１７５，２０３号に基づく優先権を主張しており、これら仮出願の各々は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
（発明の背景）
成体幹細胞、例えば、成体間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、生物の一生を通して多くの臓器内の分化した細胞型を生じることから、最終的に、多細胞生物の長寿命の原因となる。幹細胞は、３つの重要な特性を保持する：（１）幹細胞は、自己再生し、元の幹細胞集団の維持を可能にする；（２）幹細胞は、成体組織において代謝回転する成熟細胞を置き換えるために、複数の型の成熟細胞へと分化する；（３）幹細胞は、生涯を通して安定幹細胞プールを維持する（TollerveyおよびLunyak、２０１１年）。臨床背景においてこれらの
特性を利用して、幹細胞移植に基づく治療法は、例えば、隣接する細胞による神経栄養因子の放出を刺激することにより、神経細胞統合性を取り戻し、加齢によって引き起こされる認知機能低下を予防し、ＣＮＳおよび末梢の両方における傷害後の神経の回復を容易にする；再ミエリン化過程および神経細胞に対するグリア再生支持を刺激する；網膜損傷を予防し、網膜関門特性を維持する；酸化的侵襲を妨害し、炎症および自己免疫応答の強い抑制を生じ、免疫調節をもたらし、血管新生をガイドし、再生または臓器および組織修復を促す微小環境を作ることが示されてきた。
ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ｈＡＤＳＣまたはｈＡＭＳＣ）は現在、直接的な臨床関連性を有する幹細胞の主要供給源の１つである。しかし、移植された間葉系幹細胞は、発癌能および移植の際の不十分な保持等の課題を提起する。
幹細胞は、シグナル伝達能力を保持し、因子を産生および分泌することができることが公知であるが、このような産生は、移植にともなって制御することができない。よって、依然として、幹細胞からの治療因子の産生を制御およびカスタマイズし、これを産生し、それを必要とする個体へと送達する必要がある。この必要に取り組む方法およびデバイスが、本明細書に提供される。
（発明の簡単な要旨）
個体における疾患または障害の処置のための１つまたは複数の有益な因子を産生するように、自己再生（ＳＲ）または老化（ＳＥＮ）幹細胞の集団を誘導することに関する方法およびデバイスが、本明細書に提供される。個体における疾患または障害の処置のための１つまたは複数の有益な因子を産生するための、幹細胞の集団における老化の誘導に有用な、老化を誘導するための組成物および方法も提供される。処置されている疾患または障害の要求のために、有益な因子の産生をカスタマイズするための方法およびデバイスについても記載されている。有益な因子の産生のための因子産生ユニット（ＦＰＵ）、およびそれを必要とする個体への有益な因子の送達も提供される。
本発明の一態様では、個体における疾患または障害を処置する方法であって、幹細胞の集団によって産生された１つまたは複数の因子を、個体または個体由来の生体液に送達するステップを含む方法が、本明細書に提供される。一変形形態では、幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む。一部の変形形態では、幹細胞は、ＳＲおよびＳＥＮ細胞を含む。一部の特定の変形形態では、幹細胞の集団は、少なくとも５０％のＳＲ細胞を含むか、または少なくとも５０％のＳＥＮ細胞を含む。一部の変形形態では、幹細胞は、誘導剤への曝露の際に、因子を産生するように誘導されている。特定の変形形態では、誘導剤への細胞の集団の曝露は、約２４時間である。一部の変形形態では、誘導剤は、ＩＬ－２を含む。一部の変形形態では、幹細胞は、少なくとも５０％のＳＲ細胞を含む一方、他の変形形態では、幹細胞は、少なくとも５０％のＳＥＮ細胞を含む。一部の変形形態では、因子は、細胞から分泌される。本発明は、送達も企図するため、一部の変形形態では、因子は、誘導２４、４８または７２時間後に送達される。一部の変形形態では、送達は、経皮パッチ、プラスマフェレーシスシステム、マイクロニードルに基づくシステム、クリームまたはダーマローラー（dermaroller）の使用を含む。一部の変形形態では、疾患または障害は、がん、自己免疫性疾患、心血管疾患、糖尿病、皮膚疾患、神経変性疾患、骨粗鬆症、変形性関節症、脊髄傷害、肝臓の疾患、腎臓の疾患、加齢性病理、脱毛、熱傷、植皮を必要とする状態または皮膚病変である。一部の変形形態では、幹細胞は、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）である。一部の変形形態では、幹細胞は、小胞間質画分に由来する。一部の変形形態では、因子は、個体に対して自家である一方、他の変形形態では、因子は、個体に対して同種異系である。一部の変形形態では、因子は、因子産生ユニットにおいて産生される。一部の変形形態では、因子は、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１ｂ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ１３Ｒα２）、インターロイキン１受容体アルファ（ＩＬ１Ｒα）、プロベータセルリン（ＢＴＣ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ１）、線維芽細胞増殖因子６（ＦＧＦ６）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）、レプチン、血小板由来増殖因子Ｂベータ（ＰＤＧＦ ＢＢ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、骨形成タンパク質６（ＢＭＰ６）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、インスリン様増殖因子結合タンパク質－４（ＩＧＦＢＰ４）、幹細胞因子／ｃ－ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）、間質細胞由来因子－１アルファ（ＳＤＦ１ａ）、間質細胞由来因子－１ベータ（ＳＤＦ１ｂ）、アンジオテンシン（ＡＮＧ）、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ３（ＴＧＦｂ３）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド７（ＣＣＬ７）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド８（ＣＣＬ８）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１（ＣＣＬ１１）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＣＬ１３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２２（ＣＣＬ２２）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（ＣＣＬ２３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２４（ＣＣＬ２４）、ＣＸＣケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１３（ＢＬＣ）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（ＣＣＬ２３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２８（ＣＣＬ２８）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１（エオタキシン１）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド６（ＧＣＰ－２）、ＦＬＴ３ＬＧ（Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド）およびフラクタルカイン（ＣＸ３ＣＬ１）を含む。一部の変形形態では、因子は、個体由来の生体液に送達される。一部の変形形態では、因子は、個体由来の血漿に送達される。一部の変形形態では、血漿への因子の送達は、血液における調節性Ｔ細胞の産生を誘導する。一部の変形形態では、因子の送達は、個体への血液の再導入をさらに含む。
本発明の別の態様では、因子産生ユニットにおいて１つまたは複数の因子を産生する方法であって、因子産生ユニットにおける幹細胞の集団に誘導剤を添加するステップであって、因子の産生を誘導し、それによって、１つまたは複数の因子を産生するステップを含む方法が、本明細書に提供される。因子は、因子産生ユニットから単離することができる。一変形形態では、因子産生ユニットにおける幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む。別の変形形態では、因子産生ユニットにおける幹細胞は、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）を含む。別の変形形態では、因子産生ユニットにおける幹細胞は、小胞間質画分に由来する。因子産生ユニットにおける幹細胞は、ＳＲおよびＳＥＮ細胞を含むことができる。一変形形態では、幹細胞の集団は、少なくとも５０％のＳＲ細胞を含む；別の変形形態では、幹細胞の集団は、少なくとも５０％のＳＥＮ細胞を含む。一部の変形形態では、因子産生ユニットにおける幹細胞は、誘導剤への曝露に際し、因子を産生するように誘導されている。誘導剤は、タンパク質、小分子、または遺伝子に基づく誘導剤であり得る。一変形形態では、誘導剤は、ＩＬ－２を含む。一部の変形形態では、因子は、細胞から分泌される。一部の変形形態では、因子が得られ、誘導２４、４８または７２時間後に得ることができる。一部の変形形態では、幹細胞の集団は、単一の個体に由来し；他の変形形態では、幹細胞の集団は、複数の個体に由来する。特定の変形形態では、因子の収集が産生され、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１ｂ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ１３Ｒα２）、インターロイキン１受容体アルファ（ＩＬ１Ｒα）、プロベータセルリン（ＢＴＣ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ１）、線維芽細胞増殖因子６（ＦＧＦ６）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）、レプチン、血小板由来増殖因子Ｂベータ（ＰＤＧＦ ＢＢ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、骨形成タンパク質６（ＢＭＰ６）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、インスリン様増殖因子結合タンパク質－４（ＩＧＦＢＰ４）、幹細胞因子／ｃ－ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）、間質細胞由来因子－１アルファ（ＳＤＦ１ａ）、間質細胞由来因子－１ベータ（ＳＤＦ１ｂ）、アンジオテンシン（ＡＮＧ）、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ３（ＴＧＦｂ３）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド７（ＣＣＬ７）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド８（ＣＣＬ８）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１（ＣＣＬ１１）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＣＬ１３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２２（ＣＣＬ２２）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（ＣＣＬ２３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２４（ＣＣＬ２４）、ＣＸＣケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１３（ＢＬＣ）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（ＣＣＬ２３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２８（ＣＣＬ２８）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１（エオタキシン１）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド６（ＧＣＰ－２）、ＦＬＴ３ＬＧ（Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド）およびフラクタルカイン（ＣＸ３ＣＬ１）を含む。いくつかの変形形態では、因子は、がん、自己免疫性疾患、心血管疾患、糖尿病、皮膚疾患、神経変性疾患、骨粗鬆症、変形性関節症、脊髄傷害、肝臓の疾患、腎臓の疾患、加齢性病理、脱毛、熱傷、植皮を必要とする状態または皮膚病変の処置に有用である。特定の変形形態では、因子は、皮膚美容（derma-cosmetic）適用に有用である。
本発明の別の態様では、皮膚美容適用に適した１つまたは複数の因子を産生する方法であって、幹細胞の集団を１０％ＰＲＰと共にインキュベートするステップであって、それによって、皮膚美容適用に適した１つまたは複数の因子を産生するステップを含む方法が、本明細書に提供される。
本発明の別の態様では、試料における調節性Ｔ細胞の数を増加させる方法であって、Ｔ細胞を含む試料を因子組成物と接触させるステップを含み、因子組成物が、ＩＬ－２とのインキュベーションの７２時間後にＳＲ－ｈＡＤＳＣから収集された因子を含む、方法が、本明細書に提供される。一部の変形形態では、因子組成物と接触される試料は、血液である。他の変形形態では、因子組成物と接触される試料は、血漿である。
本発明の別の態様では、基材と、インプット幹細胞の集団とを含む因子産生ユニットが、本明細書に提供される。本発明の一部の変形形態では、基材は、三次元基材である。因子産生ユニットの基材は、ポリマー材料を含むことができ、例えば、一部の変形形態では、ポリマー材料は、生分解性ポリマーを含む一方；他の変形形態では、ポリマー材料は、生分解性でないポリマーを含む。一部の変形形態では、ポリマー材料は、ポリエチレンテレフタレート、ポリエステル、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリロニトリル、シリコーン、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリエーテルケトンケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリアミド、ポリスチレン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリグリセロールセバシン酸、ポリジオールクエン酸（polydiol citrate
）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリエーテルアミド、ポリジアキサノン（polydiaxanone）、
フィブロネクチン、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、キトサン、およびこれらの組合せ、ブレンドまたはコポリマーを含む。他の変形形態では、基材は、複数のエレクトロスピニングされた（electrospun）ナノファイバーまたは３－Ｄプリントされたナノファ
イバーを含む。特定の変形形態では、ナノファイバーは、幹細胞と共にエレクトロスピニングされている。一部の変形形態では、複数のエレクトロスピニングされたファイバーは、人工細胞外マトリックスとして構成される。一部の変形形態では、幹細胞の集団は、基材の表面上に配置される一方、一部の変形形態では、幹細胞の集団は、基材のポリマー材料内に配置される。一部の変形形態では、幹細胞は、ＳＲおよびＳＥＮ幹細胞、例えば、ＳＲ－ＭＳＣおよびＳＥＮ－ＭＳＣである。一部の変形形態では、幹細胞の集団は、少なくとも５０％のＳＲ細胞を含み、一部の変形形態では、ＳＲ細胞は、誘導されたＳＲ細胞である。一部の変形形態では、幹細胞の集団は、少なくとも５０％のＳＥＮ細胞を含み、一部の変形形態では、ＳＥＮ細胞は、誘導されたＳＥＮ細胞である。一部の変形形態では、因子産生ユニットは、アフェレーシス（aphereisis）システムの一部である。特定の変形形態では、アフェレーシスシステムは、プラスマフェレーシスシステムである。一部の変形形態では、因子は、因子産生ユニットから産生され、因子は、免疫細胞のモジュレーションに使用される。一部の変形形態では、因子が産生され、調節性Ｔ細胞の産生の増加に使用される。一部の変形形態では、因子が産生され、因子は、自己免疫性疾患、がん、糖尿病、皮膚疾患、神経変性疾患、骨粗鬆症、変形性関節症、肝臓の疾患、腎臓の疾患、加齢性病理、植皮を必要とする状態または皮膚病変の処置に使用される。
本発明の別の態様では、様々な疾患および障害の処置における使用のための特定の因子組成物が、本明細書に提供される。一変形形態では、本発明の因子組成物は、ＩＬ－２とのインキュベーションの７２時間後にＳＲ－ｈＡＤＳＣから収集された因子を含む。別の変形形態では、本発明の因子組成物は、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１ｂ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ１３Ｒα２）、インターロイキン１受容体アルファ（ＩＬ１Ｒα）、プロベータセルリン（ＢＴＣ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ１）、線維芽細胞増殖因子６（ＦＧＦ６）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）、レプチン、血小板由来増殖因子Ｂベータ（ＰＤＧＦ ＢＢ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、骨形成タンパク質６（ＢＭＰ６）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、インスリン様増殖因子結合タンパク質－４（ＩＧＦＢＰ４）、幹細胞因子／ｃ－ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）、間質細胞由来因子－１アルファ（ＳＤＦ１ａ）、間質細胞由来因子－１ベータ（ＳＤＦ１ｂ）、アンジオテンシン（ＡＮＧ）、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ３（ＴＧＦｂ３）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド７（ＣＣＬ７）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド８（ＣＣＬ８）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１（ＣＣＬ１１）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＣＬ１３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２２（ＣＣＬ２２）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（ＣＣＬ２３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２４（ＣＣＬ２４）、ＣＸＣケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１３（ＢＬＣ）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（ＣＣＬ２３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２８（ＣＣＬ２８）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１（エオタキシン１）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド６（ＧＣＰ－２）、ＦＬＴ３ＬＧ（Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド）およびフラクタルカイン（ＣＸ３ＣＬ１）を含む。一部の変形形態では、本発明の因子組成物は、クリームまたはローションの形態にさらに製剤化することができる。他の変形形態では、本発明の因子組成物は、マイクロニードルを含むパッチ上にさらに製剤化される。他の変形形態では、本発明の因子組成物は、ダーマローラーに基づく送達系と組み合わされるようにさらに製剤化される。本発明の別の態様では、本発明の因子組成物のうちいずれか１つを含むキットが、本明細書に提供される。
本発明の別の態様では、例えば、因子のある特定の群を誘導する目的で、ＳＲ－幹細胞における老化を誘導する方法であって、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉｒ－９２ａ１－５ｐ、ｍｉｒ－１９ａ－３ｐ、ｍｉｒ－１２５ｂ１－５ｐ、ｍｉｒ１００－５ｐおよびｍｉｒ－ｌｅｔ７ａ－２－３ｐからなる群から選択されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のうちの１つ（one or）を細胞にトランスフェ
クトするステップを含む方法が、本明細書に提供される。一変形形態では、ＳＲ－幹細胞は、ＳＲ－ｈＡＤＳＣである。
本明細書に記載されている様々な変形形態の特性のうちの１つ、一部または全てを組み合わせて、本発明の他の変形形態を形成することができることを理解されたい。本発明のこれらおよび他の態様は、当業者に明らかになる。
図１Ａは、本明細書に記載されている本発明の態様を実施するための例示的な方法を図示する。
図１Ｂは、ｈＡＤＳＣ（本明細書に記載されているように本明細書でｈＡＤＭＣと互換的に呼ばれる）の組成物を使用して個体を治療する例示的な方法を図示する。
図１Ｃは、個体からのｈＡＤＳＣの単離から、本明細書に記載されている例示的な因子産生ユニットへの配置までの、本発明の例示的な方法を図示する。
図２Ａおよび２Ｂは、因子および因子組成物を産生し、本明細書に記載されている本発明の態様を実施するための例示的な方法を示す。 図２Ａおよび２Ｂは、因子および因子組成物を産生し、本明細書に記載されている本発明の態様を実施するための例示的な方法を示す。 図２Ａおよび２Ｂは、因子および因子組成物を産生し、本明細書に記載されている本発明の態様を実施するための例示的な方法を示す。
図２Ｃは、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）産生に影響する免疫調節のための因子の例示的な使用のために、本明細書に記載されている本発明の態様を実施するための１つの例示的な方法を図示する。
図２Ｄは、本明細書に記載されている本発明の因子産生ユニット中のｈＡＤＳＣを絵によって図示する。
図３Ａ～３Ｄは、複製老化（ＳＥＮ）がヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ｈＡＤＳＣ、本明細書で互換的にｈＡＤＳＣとも呼ばれる）の遊走特性をどのように害するかを図示する。図３Ａは、ｈＡＤＳＣの成長曲線を示し、培養日数に対する累積集団倍加で表される。図３Ｂは、老化関連のβ－ガラクトシダーゼの検出を示す。図３Ｃは、ＳＲ（左）およびＳＥＮ（右）のｈＡＤＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ遊走アッセイを示す。図３Ｄは、ＳＲ－ｈＡＤＳＣ（左）およびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣ（右）の遊走を示す。 図３Ａ～３Ｄは、複製老化（ＳＥＮ）がヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ｈＡＤＳＣ、本明細書で互換的にｈＡＤＳＣとも呼ばれる）の遊走特性をどのように害するかを図示する。図３Ａは、ｈＡＤＳＣの成長曲線を示し、培養日数に対する累積集団倍加で表される。図３Ｂは、老化関連のβ－ガラクトシダーゼの検出を示す。図３Ｃは、ＳＲ（左）およびＳＥＮ（右）のｈＡＤＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ遊走アッセイを示す。図３Ｄは、ＳＲ－ｈＡＤＳＣ（左）およびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣ（右）の遊走を示す。
図４Ａ～４Ｃは、ＩＬ－２受容体アイソフォームの遺伝子発現およびＩＬ－２で誘導されるＳＲ－ｈＡＤＳＣおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣでの膜とのそれらの会合を図示する。図４Ａは、ＩＬ－２受容体組成物の概略図を示す。図４Ｂは、ＩＬ－２の存在下または非存在下で、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）ＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣによって評価されたＩＬ－２受容体α、βおよびγを示す。図４Ｃは、ＩＬ－２ＲａおよびＩＬ－２Ｒβの細胞膜に会合しているタンパク質レベルを示す。 図４Ａ～４Ｃは、ＩＬ－２受容体アイソフォームの遺伝子発現およびＩＬ－２で誘導されるＳＲ－ｈＡＤＳＣおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣでの膜とのそれらの会合を図示する。図４Ａは、ＩＬ－２受容体組成物の概略図を示す。図４Ｂは、ＩＬ－２の存在下または非存在下で、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）ＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣによって評価されたＩＬ－２受容体α、βおよびγを示す。図４Ｃは、ＩＬ－２ＲａおよびＩＬ－２Ｒβの細胞膜に会合しているタンパク質レベルを示す。 図４Ａ～４Ｃは、ＩＬ－２受容体アイソフォームの遺伝子発現およびＩＬ－２で誘導されるＳＲ－ｈＡＤＳＣおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣでの膜とのそれらの会合を図示する。図４Ａは、ＩＬ－２受容体組成物の概略図を示す。図４Ｂは、ＩＬ－２の存在下または非存在下で、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）ＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣによって評価されたＩＬ－２受容体α、βおよびγを示す。図４Ｃは、ＩＬ－２ＲａおよびＩＬ－２Ｒβの細胞膜に会合しているタンパク質レベルを示す。
図５は、ＩＬ－２によるＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣの刺激の効果を図示する。ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５ＢおよびＶＥＧＦＡのｍＲＮＡ発現は、定量的ＲＴ－ＰＣＲによって評価した。
図６Ａ～６Ｄは、ＩＬ－２処置の際のＳＲとＳＥＮ細胞の間の遺伝子発現レベルの比較を示す。 図６Ａ～６Ｄは、ＩＬ－２処置の際のＳＲとＳＥＮ細胞の間の遺伝子発現レベルの比較を示す。
図７Ａ～７Ｄは、機能的にコヒーレントなセットの遺伝子間の、ＩＬ－２処置の際のＳＲおよびＳＥＮ細胞の遺伝子発現レベルを図示する。 図７Ａ～７Ｄは、機能的にコヒーレントなセットの遺伝子間の、ＩＬ－２処置の際のＳＲおよびＳＥＮ細胞の遺伝子発現レベルを図示する。
図８Ａ～８Ｄは、ＩＬ－２処置に供したＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣのＲＮＡ－ｓｅｑプロファイリングの分析を図示する。図８Ａは、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析設計の概略図を提供する。図８Ｂは、ＡＣＴＢ正規化の前の各条件の遺伝子特異的ＲＮＡ－ｓｅｑ読み取りカウントデータの分布を示す。図８Ｃは、正規化のために使用されたＡＣＴＢの条件特異的ＲＮＡ－ｓｅｑ読み取りカウントデータを示す。図８Ｄは、ＡＣＴＢ正規化の後の各条件の遺伝子特異的ＲＮＡ－ｓｅｑ読み取りカウントデータの分布を示す。 図８Ａ～８Ｄは、ＩＬ－２処置に供したＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣのＲＮＡ－ｓｅｑプロファイリングの分析を図示する。図８Ａは、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析設計の概略図を提供する。図８Ｂは、ＡＣＴＢ正規化の前の各条件の遺伝子特異的ＲＮＡ－ｓｅｑ読み取りカウントデータの分布を示す。図８Ｃは、正規化のために使用されたＡＣＴＢの条件特異的ＲＮＡ－ｓｅｑ読み取りカウントデータを示す。図８Ｄは、ＡＣＴＢ正規化の後の各条件の遺伝子特異的ＲＮＡ－ｓｅｑ読み取りカウントデータの分布を示す。
図９は、ＲＮＡ－ｓｅｑ実験の品質管理のために使用されたＥｘｔｅｒｎａｌ ＲＮＡ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＥＲＣＣ、外部ＲＮＡ対照の一般的なセット）用量応答を示す。
図１０Ａ～１０Ｂは、ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣ（老化ｈＡＤＳＣ）およびＳＲ－ｈＡＤＳＣ（自己再生ｈＡＤＳＣ）でＩＬ－２処置後に差次的に発現された遺伝子の表を表す。図１０Ａは、ＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣでＩＬ－２処置の際に上方調節された遺伝子が濃縮された生物学的経路を示す。図１０Ｂは、ＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣでＩＬ－２処置の際に下方調節された遺伝子が濃縮された生物学的経路を示す。 図１０Ａ～１０Ｂは、ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣ（老化ｈＡＤＳＣ）およびＳＲ－ｈＡＤＳＣ（自己再生ｈＡＤＳＣ）でＩＬ－２処置後に差次的に発現された遺伝子の表を表す。図１０Ａは、ＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣでＩＬ－２処置の際に上方調節された遺伝子が濃縮された生物学的経路を示す。図１０Ｂは、ＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣでＩＬ－２処置の際に下方調節された遺伝子が濃縮された生物学的経路を示す。 図１０Ａ～１０Ｂは、ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣ（老化ｈＡＤＳＣ）およびＳＲ－ｈＡＤＳＣ（自己再生ｈＡＤＳＣ）でＩＬ－２処置後に差次的に発現された遺伝子の表を表す。図１０Ａは、ＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣでＩＬ－２処置の際に上方調節された遺伝子が濃縮された生物学的経路を示す。図１０Ｂは、ＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣでＩＬ－２処置の際に下方調節された遺伝子が濃縮された生物学的経路を示す。 図１０Ａ～１０Ｂは、ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣ（老化ｈＡＤＳＣ）およびＳＲ－ｈＡＤＳＣ（自己再生ｈＡＤＳＣ）でＩＬ－２処置後に差次的に発現された遺伝子の表を表す。図１０Ａは、ＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣでＩＬ－２処置の際に上方調節された遺伝子が濃縮された生物学的経路を示す。図１０Ｂは、ＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣでＩＬ－２処置の際に下方調節された遺伝子が濃縮された生物学的経路を示す。 図１０Ａ～１０Ｂは、ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣ（老化ｈＡＤＳＣ）およびＳＲ－ｈＡＤＳＣ（自己再生ｈＡＤＳＣ）でＩＬ－２処置後に差次的に発現された遺伝子の表を表す。図１０Ａは、ＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣでＩＬ－２処置の際に上方調節された遺伝子が濃縮された生物学的経路を示す。図１０Ｂは、ＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣでＩＬ－２処置の際に下方調節された遺伝子が濃縮された生物学的経路を示す。
図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。 図１１～９０は、インキュベーション培地単独（ＩＬ－２刺激がない）の後またはＩＬ－２による刺激の後に、因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの命名されたタンパク質（因子）の分泌の増加を図示する。
図９１～９６は、ｈＡＤＣＳの培養培地として使用された１０％血小板がリッチな血漿（ＰＲＰ）に基本的に存在する特定の命名された因子の存在を図示する。 図９１～９６は、ｈＡＤＣＳの培養培地として使用された１０％血小板がリッチな血漿（ＰＲＰ）に基本的に存在する特定の命名された因子の存在を図示する。 図９１～９６は、ｈＡＤＣＳの培養培地として使用された１０％血小板がリッチな血漿（ＰＲＰ）に基本的に存在する特定の命名された因子の存在を図示する。 図９１～９６は、ｈＡＤＣＳの培養培地として使用された１０％血小板がリッチな血漿（ＰＲＰ）に基本的に存在する特定の命名された因子の存在を図示する。 図９１～９６は、ｈＡＤＣＳの培養培地として使用された１０％血小板がリッチな血漿（ＰＲＰ）に基本的に存在する特定の命名された因子の存在を図示する。 図９１～９６は、ｈＡＤＣＳの培養培地として使用された１０％血小板がリッチな血漿（ＰＲＰ）に基本的に存在する特定の命名された因子の存在を図示する。
図９７は、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を識別するためのＦＡＣＳ分析ゲーティング戦略を図示する。 図９７は、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を識別するためのＦＡＣＳ分析ゲーティング戦略を図示する。
図９８は、本発明の例示的な因子産生ユニットで産生される因子がＴｒｅｇの産生に影響することを図示する。
図９９は、図９８に記載のＴｒｅｇ集団の識別のための例示的なゲーティング戦略を図示する。
図１００は、例示的な因子産生ユニットの模式図を示す。
図１０１は、概略的な形態の例示的な因子産生ユニットを示す。
図１０２は、複数のホローファイバーを含む概略的な形態の例示的な因子産生ユニットを示す。
図１０３は、図１０２に提供される因子産生ユニットの線Ａ－Ａでとった断面図である。
図１０４は、流体処理区画および細胞区画を含む概略的な形態の別の例示的な因子産生ユニットを示す。
図１０５は、膜またはファイバーマットとして形成されるエレクトロスピニングされたポリマーファイバーを含む別の例示的な因子産生ユニットを表す。
図１０６Ａ～Ｂは、逆透析システムまたはアフェーレス（血液装置分離装置）システムの一部であり得る例示的な因子産生ユニットを示す。具体的には、図１０６Ａは、複数のホローポリマーファイバー（チューブ）で形成されたカートリッジを含む因子産生ユニットを示す。図１０６Ｂは、ファイバー壁の中にトラップされた幹細胞を示す、図１０６Ａのホローポリマーチューブの１本の断面図を提供する。
図１０７は、閉鎖式システム内部の例示的な因子産生ユニットを示す。
図１０８は、老化関連のｍｉＲＮＡ（ＳＡ－ｍｉＲＮＡ）がｈＡＤＳＣ老化表現型を確立するよう機能することを図示する。
図１０９は、ＳＡ－β－Ｇａｌ陽性およびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣへのＳＲ－ｈＡＤＳＣの変換を描写する視野を図示する。
図１１０は、遺伝子転写に及ぼす（ＳＡ－ｍｉＲＮＡ標的遺伝子に及ぼす）ＳＡ－ｍｉＲＮＡの直接的影響を実証する。
図１１１は、遺伝子転写に及ぼすＳＡ－ＲＮＡの間接的影響を実証する。
図１１２は、ＳＡ－ｍｉＲＮＡをトランスフェクトしたＳＲ－ｈＡＤＳＣおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣでの平均の正規化タンパク質発現レベルを示す。
図１１３は、複製老化でのＳＡ－ｍｉＲＮＡの標的である新規遺伝子ならびにそれらの機能的関係および濃縮を図示する。
（発明の詳細な説明）
個体における疾患または障害の処置のための１つまたは複数の有益な因子を産生するように、幹細胞（ＳＣ）、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を誘導することに関する方法および組成物が、本明細書に記載されており、このような産生は、処置されている疾患または障害の要求のためにカスタマイズされる。個体における疾患または障害の処置のための１つまたは複数の有益な因子を産生するために、幹細胞の集団における老化の誘導に有用な、老化を誘導するための組成物および方法も提供される。有益な因子の産生のための因子産生ユニットも、これを作製および使用する方法と共に提供される。
Ｉ．因子の産生
Ａ．背景および全体的なシステム
本明細書に記載されている本発明は、誘導された幹細胞による１つまたは複数の有益な因子の産生のための、ならびにそれを必要とする個体へのこのような因子の送達および投与のための組成物、装置および方法を提供する。産生システムは、カスタマイズ可能であり、特定の臨床ニーズに有益な因子を産生するように個別調整される。因子は、個体自身の細胞（自家システム）を使用して、または別の個体由来の細胞（同種異系間システム）を使用して産生することができる。送達は、急性または慢性投与パラダイムを必要とする場合があり、実質的にいかなる送達系を利用することもできる。
本明細書に提供されている有益な因子は、ポリペプチド（全長タンパク質およびペプチド）であり得、創傷治癒因子、アポトーシス因子、抗アポトーシス因子、抗炎症因子、免疫調節因子、血管新生因子、ケモカイン因子、サイトカイン因子、インターロイキン、インターロイキン受容体、増殖因子、増殖因子受容体、ホルモン、接着促進因子、増殖誘導因子、シグナルトランスダクション刺激因子およびそれらの受容体、神経栄養因子、再生因子、ならびに修復誘発因子を含むことができる。有益な因子は、タンパク質に限定されず、小分子および代謝物も含む。
Ｂ．インプット細胞
本明細書に提供されている通り、幹細胞を含む哺乳動物細胞の集団は、１つまたは複数の所望の有益な因子を産生するように誘導される。産生に使用される細胞集団（すなわち、インプット細胞）は、純粋に幹細胞で構成されている必要はない。インプット細胞が、因子を分泌するように誘導または遺伝子（generically）改変され得る適した型の幹細胞
を含む限りにおいて、１つまたは複数の細胞型が、インプット細胞集団に含まれていてよい。例示的な幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および種々の方法を使用してＳＲとなるように誘導されたＳＥＮ細胞を限定することなく含む。より詳細には、成体幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を限定することなく含む。用いることができる他の型の細胞は、間質小胞画分、形質細胞、臍帯血細胞、胎盤細胞、骨髄由来細胞、上皮細胞、内皮細胞、免疫細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、肝細胞、抗原提示細胞、肥満細胞、筋肉細胞、抗体産生細胞、神経細胞およびグリア細胞である。
例示的な一変形形態では、ＭＳＣは、１つまたは複数の有益な因子の産生のために誘導される。細胞集団におけるＭＳＣの使用が、有益となり得る。ＭＳＣは、中胚葉に起源をもつ非造血成体幹細胞のサブセットであり、典型的には、自己再生能力を保持し、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞および筋肉細胞等、中胚葉系列のみならず、外胚葉細胞および内胚葉細胞にも多系列分化する。ＭＳＣは、ほぼ全ての組織に存在する。
ＭＳＣは、いずれか適した組織に由来し得る。一変形形態では、ＭＳＣは、脂肪組織（ＡＤＳＣ）に、特に、消化されたまたは機械的に分離された脂肪組織から得られる間質血管画分（ＳＶＦ）に由来する。本明細書において使用される場合、用語「脂肪」は、いずれかの脂肪性組織を指し、脂肪組織は、脂肪性組織を有するいずれかの生物に由来し得る。脂肪組織は、哺乳動物における皮下、網／内臓、乳房、性腺または他の脂肪組織部位に由来する褐色または白色脂肪組織であり得る。ある特定の変形形態では、脂肪は、皮下白色脂肪組織、内臓脂肪組織または吸引脂肪組織試料である。脂肪組織の簡便な供給源は、脂肪吸引外科手術に由来するが、脂肪組織の供給源は、そのように限定される必要はない。脂肪組織をいずれか適した酵素（例えば、コラゲナーゼ）で消化して、ＭＳＣを得ることができる、または機械的に分離することができる。一部の変形形態では、ヒトＭＳＣは、脂肪由来ＭＳＣ（ｈＡＤＭＣまたはｈＡＤＳＣまたはｈＡＤＭＳＣ）である。他の変形形態では、ＭＳＣは、非ヒト哺乳動物脂肪組織に由来する。
インプット細胞は、自家（因子を受ける個体由来の細胞）または同種異系（因子を受ける個体に由来しない細胞）であり得る。インプット細胞は、単一個体由来の細胞を含むことができるか、またはその代わりに、１つ超の個体由来の細胞の混合物を含むことができる。細胞は、純粋にＡＤＳＣであり得るか、または細胞の不均一混合物であり得る。当業者が、その後の因子産生を制御するためにインプット細胞をカスタマイズする能力を有することが理解される。
一部の変形形態では、インプット細胞は、幹細胞を含み、幹細胞は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはさらには９０％ＳＲ幹細胞（例えば、ＳＲ－ＡＤＳＣまたはＳＲ－ｈＡＤＳＣ）である。例示的な変形形態では、インプット細胞は、ＭＳＣであり、少なくとも５０％のＳＲ ＭＳＣを含む。ＳＲ幹細胞は、その形態、増殖指標および１つまたは多くのマーカーに関して定義することができる。
一部の変形形態では、インプット細胞は、幹細胞を含み、幹細胞は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはさらには９０％のＳＥＮ幹細胞（例えば、ＳＥＮ－ＡＤＳＣまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣ）である。例示的な変形形態では、インプット細胞は、ＭＳＣであり、少なくとも５０％のＳＥＮ ＭＳＣを含む。ＳＥＮ幹細胞は、その形態、増殖指標および１つまたは多くのマーカーに関して定義することができる。
１．老化の誘導
一部の変形形態では、特定のセットの所望の因子の産生を達成するために、老化したまたは老化しつつある（まとめてＳＥＮと称される）幹細胞を利用することが望ましい。本明細書において使用される場合、ＳＥＮ幹細胞は、複製的に老化した細胞である。複製老化は、成長停止、アポトーシス抵抗性、高レベルの代謝活性、形態学的および細胞サイズ変化、腫瘍サプレッサーのＰ１６、Ｐ２１、Ｐ５３および／またはＲＢの高レベルの発現、老化関連ベータガラクトシダーゼ（ＳＡ－β－ｇａｌ）の活性増加、ならびにＤＮＡを合成および修復する能力の喪失によって特徴付けられる。幹細胞の複製加齢は、その生物学的特性に影響を与え得る。
特定の変形形態では、幹細胞は、ＳＥＮ－ＡＤＳＣ、例えば、ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣである。幹細胞は、本来ＳＥＮであり得るか、または老化を起こすように誘導することができる。本文を通じてＳＥＮ細胞を参照する場合、この用語が、天然に存在するＳＥＮ幹細胞と、ＳＥＮとなるように誘導された幹細胞の両方を包含することを理解されたい。老化を起こすように幹細胞を誘導する例示的な方法として、非コードｍｉＲＮＡ（後述）の送達や、遺伝毒性物質、放射線、紫外線、腫瘍サプレッサー誘導因子、有糸分裂阻害剤、核酸損傷剤、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン阻害剤、増殖因子阻害剤またはＰＡＲＰ阻害剤への曝露が挙げられるがこれらに限定されない、ＷＯ２０１３／０７８３９２に記載されているもの等、老化誘導因子の送達が挙げられるがこれらに限定されない。
一変形形態では、老化を誘導する方法は、ＳＥＮ状態を達成するための誘導を必要とするＳＲ細胞の集団または少なくともいくつかのＳＲ細胞を含む幹細胞の集団への、老化関連ｍｉＲＮＡ模倣物のトランスフェクションを含む。この変形形態では、ＳＲ－ＡＤＳＣは、実施例１０および図１０８～１１２に記載されているような、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉｒ－９２ａ１－５ｐ、ｍｉｒ－１９ａ－３ｐ、ｍｉｒ－１２５ｂ１－５ｐ、ｍｉｒ１００－５ｐおよびｍｉｒ－ｌｅｔ７ａ－２－３ｐから選択されるｍｉＲＮＡをトランスフェクトされる。
２．幹細胞性（若返り）の誘導
他の変形形態では、特定のセットの所望の因子の産生を達成するために、ＳＲであり、高い程度の幹細胞性を示す幹細胞を利用することが望ましい。特定の変形形態では、幹細胞は、ＳＲ－ＡＤＳＣ、例えば、ＳＲ－ｈＡＤＳＣである。幹細胞は、本来ＳＲであり得るか、またはＳＲであるように若返らせることができる。本文を通じてＳＲ細胞を参照する場合、この用語が、天然に存在するＳＲ幹細胞と、ＳＲとなるように誘導された幹細胞の両方を包含することを理解されたい。若返りを起こすように幹細胞を誘導する例示的な方法として、ＷＯ２０１２０５８０９７およびＷＯ２０１３１２６５６５（幹細胞の集団におけるＳＩＮＥ／ＡＬＵレトロトランスポゾン転写物のレベルまたは活性の低下）に記載されている方法が挙げられるがこれらに限定されない。
一変形形態では、例示的な方法は、幹細胞を含む試料の単離を含む。試料をアッセイして、上述の特定の特徴に注目することにより、ＳＥＮまたはＳＲであるか決定する。ＳＥＮである場合、細胞は、上に提示されている通りにＳＲとなるように若返らせることができる。若返ったＳＥＮ幹細胞によって放出される因子は、ＳＲ幹細胞と同じであっても異なっていてもよい。
一変形形態では、ＳＥＮ幹細胞の若返りには、ＳＩＮＥ／ＡＬＵレトロトランスポゾンのレベルまたは活性の低下が関与する。低下は、前記細胞への、ＳＩＮＥ／ＡＬＵレトロトランスポゾン転写物を標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）分子を含むまたはこれをコードするいずれかの構築物を導入することを含み得る。例えば、低分子干渉ＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ、対形成した二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびＰＩＷＩ ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）からなる群から選択される分子を含むことができる。構築物は、ＳＩＮＥ／ＡＬＵ転写物の安定した下方調節、または一部の変形形態では、一時的な下方調節を生じることができる。例えば、構築物は、プラスミドベクターまたはウイルスベクター等、ベクターを含むことができる。例えば、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ベクターからなる群から選択することができる。
構築物を導入するためのいずれか適切な機構、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションまたは感染を使用することができる。一部の変形形態では、方法は、脂質またはリポソームによる方法を含むことができる。加えて、ＳＩＮＥ／ＡＬＵレトロトランスポゾンを標的とする合成ｐｉＲＮＡの送達は、細胞にＤＮＡをトランスフェクトする物理的方法をもたらし、そして特異的リガンド－受容体またはいずれかの生化学的特色に依存しない、いずれかの種類の微粒子銃デバイスの使用により達成することができる（例えば、ＵＳ２００４００３３５８９を参照）。
一変形形態では、若返りは、ＨＥＲＶＨに基づく転写を駆動するための；または成体幹細胞のＬＢＰ９転写因子駆動若返りを駆動するためのＨＥＲＶＨの送達による、Wangら（Nature.２０１４年１２月１８日；５１６巻（７５３１号）：４０５～９頁）に記載され
ている方法によって達成することができる。
一部の変形形態では、増殖能の誘導または回復するに十分な量で、インプット幹細胞の集団におけるＳＩＮＥ／ＡＬＵレトロトランスポゾン転写物のレベルまたは活性を低下させるステップは、最初にＳＥＮと識別された細胞においてのみ行われる。例えば、細胞（新鮮または凍結保存した）は、本明細書に記載されている品質管理（ＱＣ）技法によってスクリーニングして、ＳＥＮ細胞を識別することができ、これらの細胞は、若返りのために標的にされ得る。よって、本明細書に記載されている方法のいずれかは、若返りおよび／または誘導に先立ち、細胞の老化状態を識別するためのＱＣステップを含むことができる。その代わりに、一部の変形形態では、若返りのための本明細書に記載されている方法のいずれかを使用して、ＳＥＮおよびＳＲ幹細胞の混合集団中の全細胞を若返りのために処理することができる。一旦若返ると、直前までＳＥＮであった若返った細胞の集団またはＳＲ／若返ったＳＥＮの混合集団の因子は、これらの細胞から直接的に使用することができる（例えば、誘導することなく）。その代わりにまたはその上、若返ったＳＥＮ細胞の集団、若返ったＳＥＮおよびＳＲ細胞の混合集団、または単なるＳＲ細胞の集団は、因子を産生するように誘導することができ、その結果生じる因子を本明細書に記載されるように使用することができる。一部の変形形態では、誘導および非誘導集団由来の因子（および／または細胞それ自体）は、組み合わせることができるか、または別々に使用することができる。一部の変形形態では、誘導または非誘導集団由来の抽出物が投与される。これは、図１Ａに模式的に記載されている。
若返った幹細胞の使用は、凍結保存または他の貯蔵方法が使用される状況において特に重要になり得る。延長された継代または凍結保存からの幹細胞の復活は、一般に、ＳＲ状態であり得る新鮮に単離された幹細胞と比較して、幹細胞の分裂能力を低下させる。
Ｃ．幹細胞の誘導および因子の産生
本明細書に提供されている通り、ＳＥＮおよびＳＲ幹細胞からの因子の産生は、広範囲の疾患および障害の処置のためにカスタマイズ可能である。誘導剤に応答して、特定化されたセットの条件下で、幹細胞は、因子の特定の組合せを産生または分泌するように誘導され得る。産生された因子の特定の組合せに対して貢献することは、どの型の幹細胞が誘導されるか、ＳＲまたはＳＥＮとしての幹細胞集団の特徴付け、使用に選択された誘導剤、誘導の持続時間、および誘導後の時間間隔を含む。
本明細書に提供される変形形態では、因子のコレクションは、一般に、例えば、複数の因子のコレクションであると特徴付けることができ、この場合、因子のうちの１つまたは複数は、創傷治癒因子、アポトーシス因子、抗アポトーシス因子、抗炎症因子、免疫調節因子、血管新生因子、ケモカイン因子、サイトカイン因子、インターロイキン、インターロイキン受容体、増殖因子、増殖因子受容体、ホルモン、接着促進因子、増殖誘導因子、シグナル－トランスダクション刺激因子およびその受容体、神経栄養因子、再生因子、ならびに修復誘発因子である。
１．誘導剤および条件
本発明の幹細胞は、本発明の誘導剤と接触させた状態で（例えば、これと組み合わせて）配置される。本明細書において使用される場合、誘導剤は、幹細胞と相互作用するか、またはこれに影響を与えることができる（例えば、受容体に特異的または非特異的に結合する；転写および翻訳を誘導する）いずれかの分子または遺伝子改変であり得、これは、幹細胞のゲノムに組み込むことにより誘導因子を産生するか、またはこれを異所的に発現し、幹細胞の遺伝子発現に影響もしくはこれを誘導し、幹細胞のシグナルトランスダクションに影響し、および／または幹細胞の転写、翻訳もしくは翻訳後の仕組みに影響して、１つまたは複数の因子の産生および分泌を誘導することができる。
誘導剤の非限定例として、小分子、タンパク質、ペプチド、抗体、オリゴヌクレオチド、アプタマー、核酸分子にコードされる因子、およびＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡまたは長鎖ｎｃＲＮＡが挙げられる。
遺伝子導入に使用されるウイルスベクターの代表例として、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターが挙げられる。解毒されたレトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０もしくはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）等、ＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスに標的遺伝子を導入し、このような組換えウイルスを細胞に感染させることにより、またはＣＲＩＳＰＲ技術の使用により、標的遺伝子を細胞に導入することができる。
一変形形態では、誘導剤は、サイトカイン、例えば、ＩＬ－２、レチノイド酸およびその誘導体、走化性因子、ケモカイン、ホルモン、増殖因子、ロイコトリエン、プロスタグランジン、トロンボキサンおよび血小板活性化因子（ＰＡＦ）、ならびに肥満細胞分泌メディエーターが例示されるがこれに限定されない、細胞によって分泌されるメディエーターを含む。
例示的な一変形形態では、誘導剤は、ＩＬ－２またはＩＬ－２のアイソフォームである。
誘導因子は、いずれかの種類の培地における細胞と組み合わせることができるか、または遺伝子操作の手段により送達することができる（例えば、誘導性因子が、核酸分子にコードされる場合）と共に、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、長鎖ｎｃＲＮＡとして送達することができる。
誘導により産生／分泌された因子を含む培地は、本明細書において、「馴化培地」と称することができる。
例示的な一変形形態では、細胞は、血小板リッチな血漿（ＰＲＰ、例えば、１０％ＰＲＰ）を含む培地において培養され、誘導剤は培地と混合される。
別の変形形態では、細胞は、血漿、血清、臍帯血血清、および血小板溶解物等の血小板派生物において培養される。一変形形態では、ＳＶＦは、ヒト血小板溶解物を使用して培養される。他の変形形態では、血小板リッチな血漿が、ＳＶＦ培養培地に含まれる。
別の例示的な変形形態では、間質小胞画分が、因子産生に使用される場合、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）－２が、培養培地において使用することができる物質である。
別の変形形態では、細胞は、無血清培地において培養される。無血清培地は、グルコース等のエネルギー源、無機塩、脂溶性成分、窒素源およびビタミンまたは脂質組成物を含む、標準無血清培地製剤に提供される要素等の成分を含むことができる。
一般に、幹細胞の誘導は、５分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、３日間、４日間よりも長い、またはさらには５日間よりも長い等、既定量の時間における、誘導剤への幹細胞の曝露（本明細書を通じて互換的に、誘導剤への幹細胞の曝露／誘導剤によるプライミング／誘導剤との接触／誘導剤による誘導／誘導剤とのインキュベート／誘導剤による刺激と称する）を含む。細胞は、一定レベルの誘導剤または変動するレベル（例えば、初期に高く、次いでより低いレベル、曝露時間にわたって増加するレベル、曝露時間にわたって減少するレベル、曝露時間にわたってランダムなレベル等）に曝露することができる。曝露後に、細胞によって産生された因子の使用に先立ち、細胞は、洗浄することができる、または他の仕方で処理して、誘導剤を除去することができる。変動するインキュベーション時間は、因子の産生に影響することから、特定の下流臨床適用のために産生をカスタマイズするために変動させることができる。一部の変形形態では、因子は、誘導剤の除去の直後に収集される；一部の変形形態では、誘導薬剤の除去から５分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、３日間、４日間またはさらには５日間より長い期間の後に、因子は、収集／除去／送達／使用される。一部の例示的な変形形態では、誘導剤の除去から２４、４８または７２時間後に、因子は、収集／除去／送達／使用される。他の例示的な変形形態では、細胞が、上述の所定の期間、誘導薬剤と組み合わされ、誘導薬剤が除去され（例えば、培地が交換され）、一（１）時間、六（６）時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間もしくは７２時間に及ぶ誘導後の既定の期間、またはこれらの誘導後期間のいずれかの組合せの期間、細胞が回復させられる。
２．因子産生の誘導
誘導および産生は、特異的な因子を産生するように個別調整することができる。これは、様々な仕方で、例えば、ある特定の細胞集団を選択することにより、細胞培養培地の組成を調整することにより、または特定の誘導薬剤を選択することにより、達成することができる。本明細書に提供されているように、また、後述するように、因子の産生は、本明細書に提供されている因子産生ユニットのうちいずれか１つで起こる。因子産生ユニットは、インプット幹細胞の集団と、細胞集団に支持を提供する基材とを含む。
培養（例えば、誘導後）の持続時間は、因子産生ユニットによる因子産生をカスタマイズするように調整または制御することができる。因子は、誘導後５分間～５日間に及ぶ既定の時間で収集することができ、これは、上に記載されている。
本明細書に記載されている方法において有益となり得る因子は、皮膚再生／若返り経路に関与するインターロイキン、インターロイキン受容体および結合タンパク質、増殖因子、増殖因子受容体、ケモカイン、サイトカイン、走化性因子、細胞接着をもたらす分子、細胞増殖を促進することができる因子、神経栄養因子、皮膚再生を促進することができる因子、創傷治癒を促進または抑制することができる因子、ヒアルロン酸合成を促進することができる因子、皮膚弾性を促進することができる因子、悪性病変形成を抑制する因子、ＵＶ誘導性皮膚損傷および色素沈着の阻害に関する因子、ならびに毛髪増殖を刺激する因子、代謝、内分泌機能を刺激し、インスリン感受性を改善する因子、一酸化窒素産生を促進する因子、抗アポトーシス因子、アポトーシス促進因子、抗壊死、抗炎症因子、ならびに喘息およびアレルギー反応の抑制に有用な因子、免疫調節性、血管新生、免疫調節物質、シグナルトランスダクションリガンドおよび受容体、脳炎症、脳外傷および神経筋疾患側面を抑制する神経栄養因子、神経堤（neurocrest）発生における異常を抑制する因子、脊髄運動神経細胞軸索の変性の反転を増強し、神経発生および神経細胞生存を刺激する因子、コラーゲン、エラスチンおよびヒアルロナンの産生による細胞外（extacellular）マトリックス（ＥＣＭ）の回復を促進する因子、殺菌、抗菌、抗真菌活性、ならびに細胞生存、組織修復、再生および細胞分化を促進する因子を限定することなく含む。
図１１～１７は、１０％ＰＲＰ（血小板リッチな血漿）を含有する培地単独（ＩＬ－２刺激なし）とのインキュベーション２４時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の分泌の増加を示す。分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。因子産生ユニットから産生される因子は、有益であり、熱傷における免疫応答の刺激、ならびに創傷治癒等の組織損傷後に炎症をもたらす疾患、クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎および強皮症、加齢したおよび光損傷した皮膚に関する皮膚美容適用、ならびに殺菌および抗真菌活性を有する抗菌タンパク質を必要とする処置のための治療利益をもたらし得る。
図１１は、インターロイキン５（ＩＬ５）およびインターロイキン６（ＩＬ６）の分泌の増加を示す。ＩＬ－６の制御された産生および送達は、抗炎症性状態、骨粗鬆症のための送達、および睡眠関連状態の改善に所望され得る。ＩＬ－５の制御された産生および送達は、Ｔｈ１細胞、マクロファージ、ＩＦＮ－ガンマおよび樹状細胞の産生の増加等、免疫の増強に所望され得る。
図１２は、インターロイキン１受容体４（ＩＬ１Ｒ４）の分泌の増加を示す。図１３は、ニューロトロフィン３（ＮＴ３）、血小板由来増殖因子Ａアルファ（ＰＤＧＦ ＡＡ）、血小板由来増殖因子Ａベータ（ＰＤＧＦ ＡＢ）および血小板前駆細胞塩基性タンパク質（ＰＰＢＰ）の分泌の増加を示す。図１４は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１８（ＣＣＬ１８）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２５（ＣＣＬ２５）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２７（ＣＣＬ２７）およびＣＸＣケモカインリガンド１１（ＣＸＣＬ１１）の分泌の増加を示す。図１５は、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ－１）およびメタロプロテイナーゼ阻害剤２（ＴＩＭＰ－２）の分泌の増加を示す。図１６は、メタロプロテイナーゼ阻害剤１（ＴＩＭＰ－１）の分泌の増加を示す。図１７は、血管上皮（ＶＥ）カドヘリン（カルシウム依存性細胞接着タンパク質）の分泌の増加を示す。
図１８～１９は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）２４時間後の、ＳＲ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の分泌の増加を示す。これらのタンパク質は、ＰＲＰに存在しないことが判明した。図１８は、インターロイキン４（ＩＬ４）の分泌の増加を示す。図１９は、インスリン様増殖因子結合タンパク質－１（ＩＧＦＢＰ１）の分泌の増加を示す。
この因子産生ユニットによって産生される因子（図１８～１９）は、活性化されたＢ細胞およびＴ細胞増殖の刺激、ならびにＢ細胞から形質細胞への分化のための治療利益をもたらすことができる。ＩＬ－４は、ＩｇＥへのＢ細胞クラススイッチングを誘導し、ＭＨＣクラスＩＩ産生を上方調節する。ＩＬ－４は、Ｔｈ１細胞、マクロファージ、ＩＦＮ－ガンマおよび樹状細胞の産生を減少させる。血管外組織におけるＩＬ－４の存在は、マクロファージからＭ２細胞への選択的活性化を促進し、マクロファージからＭ１細胞への古典的活性化を阻害する。ＩＧＦＢＰ１および２ならびにこれらのタンパク質分解断片は、ヒト歯肉線維芽細胞の増殖および遊走における効果により、炎症性状態下で組織修復を改善することが示された。
図２０～３１は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）４８時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の増加を示す。分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。
これらの条件下で因子産生ユニットから産生される因子は、毛髪成長および形態形成、皮膚創傷、皮膚科学的障害、皮膚科学的病変、皮膚炎、乾癬、コンジローマ、疣贅、血管腫、ケロイド、皮膚がん、アトピー性皮膚炎、ベーチェット病、慢性肉芽腫性疾患、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、潰瘍、線維症および機能喪失を含む慢性組織リモデリングをもたらす炎症および免疫調節不全を誘導する初期傷害によって特徴付けられる病理学的状態、感染からの皮膚防御、コラーゲン、エラスチンおよびヒアルロナンの新たな合成、メラノーマ成長の阻害、糖尿病性潰瘍、心筋梗塞（infraction）、粥状動脈硬化、セリアック病、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、喘息、脳炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性骨溶解症、アレルギー性障害、敗血症性ショック、肺線維症（例えば、特発性肺線維症）、炎症性血管炎（vacultides）（例えば、結節性多発動脈炎、ウェゲナー（Wegner）肉芽腫症、高安動脈炎、側頭動脈炎およびリンパ腫様肉芽腫症（granulomatosus））、外傷後血管形成（例えば、血管形成後の再狭窄）、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解症、慢性肝炎、および慢性ウイルスまたは細菌感染に起因する慢性炎症、慢性肝臓線維症、硬変、劇症肝不全、アレルギー性気道炎症、急性肺傷害、心筋梗塞、胎児母性寛容（fetal maternal tolerance）、変形性関節症、ＧＶＨＤ、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病、または脳卒中および大脳もしくは脊髄外傷等の外傷後等、神経変性病理の処置のための治療利益をもたらし得る。
図２０は、インターロイキン９（ＩＬ９）およびインターロイキン１８結合タンパク質アルファ（ＩＬ１８ＢＰａ）の分泌の増加を示す。図２１は、インターロイキン１受容体ＩＩ型（ＩＬ１Ｒ２）、インターロイキン２受容体ベータ（ＩＬ－２Ｒｂ）、インターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ－２Ｒｇ）、インターロイキン５受容体アルファ（ＩＬ５Ｒａ）、インターロイキン１０受容体ベータ（ＩＬ１０Ｒｂ）、インターロイキン１８受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１８Ｒｂ）およびインターロイキン２１受容体（ＩＬ－２１Ｒ）の分泌の増加を示す。図２２は、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ２）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦａ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１／潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）（ＴＧＦｂ１）およびトランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦｂ２）の分泌の増加を示す。図２３は、受容体チロシンタンパク質キナーゼＥｒｂＢ－３（ＥｒｂＢ３）、Ｆａｓリガンド（Ｆａｓ ＬＧ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、プロラクチン（ＰＲＬ）因子、血小板由来増殖因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲａ）、血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲｂ）、幹細胞因子ｋｉｔ受容体（ＳＣＦＲ）およびシアル酸結合Ｉｇ様レクチン５（シグレック５）の分泌の増加を示す。図２４は、ＣＸＣケモカインリガンド１６（ＣＸＣＬ１６）の分泌の増加を示す。図２５は、活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）、Ｅセレクチン（免疫接着における細胞表面糖タンパク質）、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ２）、Ｌセレクチン（リンパ球接着分子）および血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ１）の分泌の増加を示す。図２６は、アクチビンＡ（ＩＮＨＢＡ）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ－２）およびレプチン受容体（ＬＥＰＲ）の分泌の増加を示す。図２７は、骨形成タンパク質５（ＢＭＰ５）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ７）、マクロファージコロニー刺激因子１受容体（ＭＣＳＦＲ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ１）、マトリックスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ３）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ１３（ＭＭＰ１３）の分泌の増加を示す。図２８は、単球分化抗原（ＣＤ１４）、細胞分化抗原（ＣＤ８０）、カルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）および白血病阻害因子（ＬＩＦ）の分泌の増加を示す。図２９は、エンドグリン（ＥＮＧ）の分泌の増加を示す。図３０は、免疫グロブリン様およびＥＧＦ様ドメインを有するチロシンキナーゼ１（ＴＩＥ１）、ならびに免疫グロブリン様およびＥＧＦ様ドメインを有するチロシンキナーゼ２（ＴＩＥ２）の分泌の増加を示す。図３１は、アクチビンＡ（インヒビンベータＡ、ＩＮＨＢＡ）、レプチン受容体（レプチンＲ）およびトランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）の分泌の増加を示す。
図３２は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）４８時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＲ－ＭＳＣからの神経増殖因子受容体（ＮＧＦＲ）の分泌の増加を示す。ＮＧＦＲは、ＰＲＰに存在しないことが判明した。これらの条件下で因子産生ユニットから産生される因子は、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病、または脳卒中および大脳もしくは脊髄外傷等の外傷後等、神経変性病理の処置、ならびに筋骨格および心臓修復を必要とする状態のスタンドアロン型または組合せ型処置のための治療利益をもたらし得る。
図３３～３９は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）７２時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の分泌の増加を示す。因子産生ユニットから産生される因子は、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病、または脳卒中および大脳もしくは脊髄外傷等の外傷後等、神経変性病理の処置、ならびに筋骨格および心臓修復を必要とする状態のスタンドアロン型または組合せ型処置、皮膚創傷、皮膚科学的障害、皮膚科学的病変、皮膚炎、乾癬、コンジローマ、疣贅、血管腫、ケロイド、皮膚がん、アトピー性皮膚炎、ベーチェット病、慢性肉芽腫性疾患、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、潰瘍、線維症および機能喪失を含む慢性組織リモデリングをもたらす炎症および免疫調節不全を誘導する初期傷害によって特徴付けられる病理学的状態、感染からの皮膚防御、コラーゲン、エラスチンおよびヒアルロナンの新たな合成、メラノーマ成長の阻害、糖尿病性潰瘍、心筋梗塞、粥状動脈硬化、セリアック病、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、喘息、脳炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性骨溶解症、アレルギー性障害、敗血症性ショック、肺線維症（例えば、特発性肺線維症）、炎症性血管炎（例えば、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、高安動脈炎、側頭動脈炎およびリンパ腫様肉芽腫症）、外傷後血管形成（例えば、血管形成後の再狭窄）、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解症、慢性肝炎、および慢性ウイルスまたは細菌感染に起因する慢性炎症、慢性肝臓線維症、硬変、劇症肝不全、アレルギー性気道炎症、急性肺傷害、心筋梗塞、胎児母性寛容、変形性関節症、ＧＶＨＤのための治療利益をもたらし得る。
図３３～３９において、分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。図３３は、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１ｂ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ１３Ｒα２）およびインターロイキン１受容体アルファ（ＩＬ１Ｒα）の分泌の増加を示す。図３４は、プロベータセルリン（ＢＴＣ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ１）、線維芽細胞増殖因子６（ＦＧＦ６）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）、レプチンおよび血小板由来増殖因子Ｂベータ（ＰＤＧＦ ＢＢ）の分泌の増加を示す。図３５は、幹細胞因子／ｃ－ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）、間質細胞由来因子－１アルファ（ＳＤＦ１ａ）、間質細胞由来因子－１ベータ（ＳＤＦ１ｂ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ３（ＴＧＦｂ３）および腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）の分泌の増加を示す。図３６は、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）の分泌の増加を示す。図３７は、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）および血小板由来増殖因子Ｂベータ（ＰＤＧＦ ＢＢ）の分泌の増加を示す。図３８は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド７（ＣＣＬ７）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド８（ＣＣＬ８）およびケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１（ＣＣＬ１１）の分泌の増加を示す。図３９は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＣＬ１３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２２（ＣＣＬ２２）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（ＣＣＬ２３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２４（ＣＣＬ２４）およびＣＸＣケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）の分泌の増加を示す。
図４０～４２は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）７２時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の分泌の増加を示す。これらの因子は、ＰＲＰに存在しないことが判明した。図４０～４２は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）７２時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の分泌の増加を示す。これらの因子は、ＰＲＰに存在しないことが判明した。これらの条件下で因子産生ユニットから産生される因子は、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病、または脳卒中および大脳もしくは脊髄外傷等の外傷後等、神経変性病理、コンジローマ、疣贅、血管腫、ケロイド、皮膚がん、網膜色素変性症（retinoditis pigmentosa）、特発性肺線維症、慢性肝臓線維症、硬変、劇症肝不全、ア
レルギー性気道炎症、急性肺傷害、アトピー性皮膚炎、ベーチェット病、慢性肉芽腫性疾患、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、潰瘍、線維症および機能喪失を含む慢性組織リモデリングをもたらす炎症および免疫調節不全を誘導する初期傷害によって特徴付けられる病理学的状態、虚血性腎傷害、嚢胞性線維症、副鼻腔炎および鼻炎または整形外科的疾患、自己免疫性肝炎の処置、ならびに筋骨格および心臓修復を必要とする状態のスタンドアロン型または組合せ型処置のための治療利益をもたらし得る。
図４０は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、骨形成タンパク質６（ＢＭＰ６）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）およびインスリン様増殖因子結合タンパク質－４（ＩＧＦＢＰ４）の分泌の増加を示す。図４１は、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１３（ＢＬＣ）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（ＣＣＬ２３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２８（ＣＣＬ２８）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１（エオタキシン１）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド６（ＧＣＰ－２）、ＦＬＴ３ＬＧ（Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド）およびフラクタルカイン（ＣＸ３ＣＬ１）の分泌の増加を示す。図４２は、アンジオテンシン（ＡＮＧ）およびコロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）の分泌の増加を示す。エオタキシン１は、喘息およびアレルギー反応に対する薬物として作用する。Ｆｌｔ３ ＬＧは、造血細胞前駆体の増殖および分化を刺激し、フラクタルカインは、細胞傷害性エフェクターＴ細胞、誘導された遊走Ｔ＆Ｂ細胞リンパ球、ＮＫ細胞および単球をモジュレートし、ＢＬＣは、リンパ系組織におけるＢ細胞の組織化を制御する。ＣＣＬ２３は、肺および肝臓組織における免疫調節に関連し、ＡＮＧシグナル伝達は、心血管疾患における保護効果に関連し、ＣＳＦ２は、関節リウマチのための潜在的な治療法として使用され、マクロファージを刺激する。加えて、白血球の産生を刺激し、化学療法後の好中球減少症を予防する。これは、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ球性（lymphocutic）白血病、真菌感染およびホジキン病にお
ける処置に承認されている。
図４３は、ＩＬ－２による刺激２４時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣからの、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２７（ＣＣＬ２７）およびＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１Ｂ）の分泌の増加を示す。分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。
図４４～５３は、ＩＬ－２による刺激４８時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の増加を示す。分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。
図４４～５３は、ＩＬ－２による刺激４８時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の増加を示す。分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。これらの条件下で因子産生ユニットから産生される因子は、自己免疫性疾患の処置のための治療利益をもたらし得る。本明細書で参照される通り、「自己免疫性疾患」は、自分自身の細胞、組織および／または臓器に対する対象の免疫学的反応に起因する細胞、組織および／または臓器傷害によって特徴付けられる、対象における状態を指す。本発明の免疫調節性細胞で処置することができる自己免疫性疾患の実例としての非限定例として、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫性疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー・皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡（cicatrical pemphigoid）、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素病、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症－線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡニューロパチー、若年性関節炎、扁平苔癬、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、Ｉ型または免疫媒介性真性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー（Raynauld）現象、ライター症候群、サルコイドーシス、強皮症、進行性全身性硬化症、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候群、全身硬直症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎（arteristis）／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、疱疹状皮膚炎血管炎等の血管炎、白斑、ウェゲナー肉芽腫症、抗糸球体基底膜病、抗リン脂質症候群、神経系の自己免疫性疾患、家族性地中海熱、ランバート・イートン筋無力症症候群、交感性眼炎、多腺性内分泌障害、乾癬等、ならびに血管新生の増強を必要とする疾患および状態が挙げられる。
図４４は、インターロイキン９（ＩＬ９）、インターロイキン１１（ＩＬ１１）、インターロイキン１２アルファ（ＩＬ１２ａ）、インターロイキン１２ベータ（ＩＬ１２ｂ）およびインターロイキン１８結合タンパク質アルファ（ＩＬ１８ＢＰａ）の分泌の増加を示す。図４５は、インターロイキン１受容体Ｉ型（ＩＬ１Ｒ１）、インターロイキン１受容体ＩＩ型（ＩＬ１Ｒ２）、インターロイキン１受容体ＩＶ型（ＩＬ１Ｒ４）、インターロイキン２受容体ベータ（ＩＬ－２Ｒｂ）、インターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ－２Ｒｇ）、インターロイキン５受容体アルファ（ＩＬ５Ｒａ）、インターロイキン１０受容体ベータ（ＩＬ１０Ｒｂ）、インターロイキン１８受容体ベータ（ＩＬ１８Ｒｂ）およびインターロイキン２１受容体（ＩＬ－２１Ｒ）の分泌の増加を示す。図４６は、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）、ＦＧＦ９、ＭＳＰアルファ／ＨＧＦ様因子（ＨＧＦ様）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、ＩＧＦ２、インスリン様増殖因子結合タンパク質－６（ＩＧＦＢＰ６）、ＬＡＰ（ＴＧＦベータファミリー）および血小板由来増殖因子Ａアルファ（ＰＤＧＦＡＡ）の分泌の増加を示す。図４７は、血小板由来増殖因子Ａベータ（ＰＤＧＦＡＢ）、血小板由来増殖因子Ｂベータ（ＰＤＧＦＢＢ）、間質細胞由来因子－１アルファ（ＳＤＦ１ａ）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン５（シグレック５）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦａ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦｂ２）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦＤ）の分泌の増加を示す。図４７は、ＤＲ６、Ｄｔｋ、ＥＧＦＲ、エンドグリン、ＥｒｂＢ３、Ｆａｓ、Ｆａｓ ＬＧおよびＩＧＦ１ ｓＲの分泌の増加も示す。図４８は、レプチン（ＬＥＰ）、レプチン受容体（ＬＥＰＲ）、マクロファージコロニー刺激因子１受容体（ＭＣＳＦＲ）、ニューロトロフィン４（ＮＴ４）、オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）、血小板由来増殖因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲａ）、血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲｂ）およびプロラクチン（ＰＲＬ）の分泌の増加を示す。図４９は、幹細胞因子受容体（ＳＣＦＲ）、アンジオポエチン１受容体（ＴＩＥ１）、アンジオポエチン１受容体（ＴＩＥ２）、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー１０Ｃ（ＴＮＦＳＦ１０Ｃ）、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー１０Ｄ（ＴＮＦＳＦ１０Ｄ）、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）および血管内皮増殖因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ２）の分泌の増加を示す。図５０は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２５、ＣＸＣケモカインリガンド５（ＣＸＣＬ５）、ＣＸＣＬ１１およびＣＸＣＬ１６の分泌の増加を示す。図５１は、活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）、骨形成タンパク質５（ＢＭＰ５）、ＢＭＰ７、Ｅセレクチン（内皮細胞接着分子）、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ２）、ＩＣＡＭ３、Ｌセレクチン（リンパ球接着分子）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ１）の分泌の増加を示す。図５２は、マトリックスメタロプロテイナーゼ１３（ＭＭＰ１３）、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ１）、メタロプロテイナーゼ阻害剤ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ４および血管上皮（ＶＥ）カドヘリン（カルシウム依存性細胞接着タンパク質）の分泌の増加を示す。図５３は、単球分化抗原（ＣＤ１４）、細胞分化抗原（ＣＤ８０）、カルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、トロンボポエチン（ＴＨＰＯ）およびリンホタクチン（ＸＣＬ１）の分泌の増加を示す。
図４４に示す通り、ある特定の因子が増加される。ＩＬ１８ＢＰａは、インターロイキンＩＬ１８誘導性インターフェロンガンマ産生を遮断することができ、感染、外傷およびアレルギーによって惹起される炎症性応答の抑制に関連する。ＩＬ９は、メラノーマのアポトーシスおよび阻害を予防する。ＩＬ１１は、脂肪生成阻害因子に関連し、化学療法後の血小板回復を改善し、Ａｇ／Ａｂ応答をモジュレートする。ＩＬ９は、骨－細胞増殖分化に関与する。ＩＬ１２は、インターフェロンガンマを誘導し、強力な免疫調節物質であるＴｈ１およびＴｈ２の分化を刺激する。
図５４は、ＩＬ－２による刺激４８時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣからの、神経増殖因子受容体（ＮＧＦＲ）の分泌の増加を示す。図５４は、ＩＬ－２刺激２４時間後の、ＩＬ－２によるＩＬ８およびＴＮＦＲＳＦ１Ａの分泌の増加も示す。ＮＧＦＲ、ＩＬ８およびＴＮＦＲＳＦ１Ａは、ＰＲＰに存在しないことが判明した。
図５５～５７は、ＩＬ－２による刺激７２時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の分泌の増加を示す。分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。図５５は、インターロイキン１受容体アルファ（ＩＬ１Ｒａ）、インターロイキン６（ＩＬ６）およびインターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ１３Ｒａ２）の分泌の増加を示す。図５６は、線維芽細胞増殖因子６（ＦＧＦ６）、血小板前駆細胞塩基性タンパク質（ＰＰＢＰ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）および血管内皮増殖因子受容体－３（ＶＥＧＦＲ３）の分泌の増加を示す。図５７は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２２（ＣＣＬ２２）、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６およびＣＸＣケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）の分泌の増加を示す。
図５８は、ＩＬ－２による刺激７２時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣからの、アンジオテンシン（ＡＮＧ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ－７）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質－１（ＩＧＦＢＰ１）およびＩＧＦＢＰ２の分泌の増加を示す。これらの因子は、ＰＲＰに存在しないことが判明した。
図５９は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）２４時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの、線維芽細胞増殖因子６（ＦＧＦ６）、ＣＸＣケモカインリガンド１６（ＣＸＣＬ１６）および間質細胞由来因子－１アルファ（ＳＤＦ１ａ）の分泌の増加を示す。分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。
図６０は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）２４時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、Ｂリンパ球ケモカイン（ＣＸＣＬ１３；ＢＬＣ）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＣＬ１）、Ｆｌｔ－３ ＬＧ（Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド）、フラクタルカイン（Ｔ細胞ケモカインＣＸ３ＣＬ１）、顆粒球走化性タンパク質２（ＧＣＰ－２）／ＣＸＣＬ６、インターロイキン１アルファ（ＩＬ１ａ）、インターロイキン４（ＩＬ４）、ＩＬ１５およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の分泌の増加を示す。これらの因子は、ＰＲＰに存在しないことが判明した。
図６１～７０は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）４８時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の分泌の増加を示す。分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。図６１は、インターロイキン２ベータ（ＩＬ－２ｂ）、ＩＬ３、ＩＬ５およびＩＬ６の分泌の増加を示す。図６２は、インターロイキン１受容体ＩＩ型（ＩＬ１Ｒ２）、インターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ－２Ｒｇ）、インターロイキン５受容体アルファ（ＩＬ５Ｒａ）、インターロイキン１０受容体ベータ（ＩＬ１０Ｒｂ）、インターロイキン１８受容体結合タンパク質アルファ（ＩＬ１８ＢＰａ）、インターロイキン１８受容体ベータ（ＩＬ１８Ｒｂ）およびインターロイキン２１受容体（ＩＬ－２１Ｒ）の分泌の増加を示す。図６３は、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、ＩＧＦ２、ＬＡＰ（ＴＧＦベータファミリー）、レプチン（ＬＥＰ）、レプチン受容体（ＬＥＰＲ）、血小板由来増殖因子Ａアルファ（ＰＤＧＦＡＡ）、血小板由来増殖因子Ａベータ（ＰＤＧＦＡＢ）および血小板由来増殖因子Ｂベータ（ＰＤＧＦＢＢ）の分泌の増加を示す。図６４は、血小板由来増殖因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲａ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、幹細胞因子受容体（ＳＣＦＲ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦ ｂ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦ ｂ２）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦａ）、血管内皮増殖因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ２）およびＶＥＧＦＲ３の分泌の増加を示す。図６５は、細胞死受容体６（ＤＲ６；ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー２１）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ３）、免疫グロブリン様およびＥＧＦ様ドメインを有するチロシンキナーゼ１（ＴＩＥ１）、ＴＩＥ２およびＴＮＦスーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）の分泌の増加を示す。図６６は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）、ＣＣＬ５、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８およびＣＣＬ２３の分泌の増加を示す。図６７は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２４（ＣＣＬ２４）、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＸＣケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）およびＣＸＣＬ１１の分泌の増加を示す。図６８は、活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）、骨形成タンパク質５（ＢＭＰ５）、ＢＭＰ７、Ｅセレクチン（内皮細胞接着分子）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）、ＩＣＡＭ２、Ｌセレクチン（リンパ球接着分子）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ１）の分泌の増加を示す。図６９は、マトリックスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ３）、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ１）、メタロプロテイナーゼ阻害剤ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２およびＴＩＭＰ４の分泌の増加を示す。図７０は、単球分化抗原（ＣＤ１４）、単球分化抗原（ＣＤ８０）、カルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）および白血病阻害因子（ＬＩＦ）の分泌の増加を示す。ＣＴ－１は、ｉｎ ｖｉｖｏで広範囲の生物学的活性を有する、例えば；これは、腎毒性を低下させることができ、傷害後の神経細胞死を予防することができ、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）における神経筋変性に保護を課す。
図７１～７２は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）４８時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の分泌の増加を示す。これらの因子は、ＰＲＰに存在しないことが判明した。図７１は、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１（ＣＣＬ１１）、ＣＣＬ２３、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、インスリン様増殖因子結合タンパク質－１（ＩＧＦＢＰ１）、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ４および神経増殖因子受容体（ＮＧＦＲ）の分泌の増加を示す。図７２は、インターロイキン７（ＩＬ７）、ＩＬ１０、ＩＬ１３およびＩＬ１６の分泌の増加を示す。
図７３は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）７２時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの、プロベータセルリン（ＢＴＣ）、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ１３Ｒａ２）および間質細胞由来因子－１ベータ（ＳＤＦ１ｂ）の分泌の増加を示す。分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。
図７４は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）７２時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン８（ＩＬ８）およびＴＮＦＲＳＦ１Ａ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１Ａ）の分泌の増加を示す。これらの因子は、ＰＲＰに存在しないことが判明した。
図７５は、ＩＬ－２による刺激２４時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（ＣＣＬ２３）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＣＣＬ１１（エオタキシン１）、ＩＬ４および神経増殖因子受容体（ＮＧＦＲ）の分泌の増加を示す。これらの因子は、ＰＲＰに存在しないことが判明した。
図７５は、ＩＬ－２刺激２４時間後の、ＣＸＣＬ１６、ＨＣＣ４、ｓｇｐ１３０およびＴＮＦＲＳＦ１Ｂの分泌の増加も示す。分泌レベルは、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。
図７６～８６は、ＩＬ－２による刺激４８時間後の、ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の分泌の増加を示す。分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。図７６は、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１ｂ）、ＩＬ３、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１２ｂおよびインターロイキン１８結合タンパク質アルファ（ＩＬ１８ＢＰａ）の分泌の増加を示す。図７７は、インターロイキン１受容体アルファ（ＩＬ１Ｒａ）、ＩＬ１Ｒ４、ＩＬ１０Ｒｂ、ＩＬ１８Ｒｂ、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ－２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒｂ、ＩＬ－２ＲｇおよびＩＬ５Ｒａの分泌の増加を示す。図７８は、線維芽細胞増殖因子６（ＦＧＦ６）、インスリン様増殖因子ＩＧＦ１およびＩＧＦ２、ＬＡＰ（ＴＧＦベータファミリー）、ニューロトロフィン３（ＮＴ３）、血小板由来増殖因子Ａアルファ（ＰＤＧＦＡＡ）、血小板由来増殖因子Ａベータ（ＰＤＧＦＡＢ）ならびに血小板由来増殖因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲａ）の分泌の増加を示す。図７９は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トランスフォーミング増殖因子２（ＴＧＦ２）、ＴＧＦａ、ＴＧＦｂ１、ＴＧＦｂ３、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦｂ）、血管内皮増殖因子受容体－２（ＶＥＧＦ Ｒ２）およびＶＥＧＦ Ｒ３の分泌の増加を示す。図８０は、ＤＲ６（ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー２１）、エンドグリン（ＥＮＧ）、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ－３（ＥｒｂＢ３）、Ｆａｓリガンド（Ｆａｓ ＬＧ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲ ＬＧ）およびレプチン受容体（ＬＥＰＲ）の分泌の増加を示す。図８１は、プロラクチン（ＰＲＬ）、幹細胞因子受容体（ＳＣＦＲ）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン５（シグレック５）、アンジオポエチン１受容体（ＴＩＥ１）およびアンジオポエチン１受容体（ＴＩＥ２）の分泌の増加を示す。図８２は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド８（ＣＣＬ８）、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８およびＣＣＬ２０の分泌の増加を示す。図８３は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２２（ＣＣＬ２２）、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、ＣＸＣケモカインリガンド９（ＣＸＣＬ９）およびＣＸＣＬ１１の分泌の増加を示す。図８４は、アクチビンＡ（ＩＮＨＢＡ）、骨形成タンパク質５（ＢＭＰ５）、Ｅセレクチン（内皮細胞接着分子）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）、ＩＣＡＭ２、Ｌセレクチン（リンパ球接着分子）およびマクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）の分泌の増加を示す。図８５は、マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ１）、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ１）およびメタロプロテイナーゼ阻害剤４（ＴＩＭＰ－４）の分泌の増加を示す。図８６は、単球分化抗原（ＣＤ１４）、リンホタクチン（ＸＣＬ１）、カルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）および血小板前駆細胞塩基性タンパク質（ＰＰＢＰ）の分泌の増加を示す。
図８７は、ＩＬ－２による刺激４８時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、インスリン様増殖因子結合タンパク質－２（ＩＧＦＢＰ２）、ＩＬ－２、ＩＬ１６およびインターフェロンガンマ（ＩＮＦガンマ）の分泌の増加を示す。これらの因子は、ＰＲＰに存在しないことが判明した。
図８８～８９は、ＩＬ－２による刺激７２時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の分泌の増加を示す。分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。図８８は、アディポネクチン（Ａｃｒｐ３０）、アグーチ関連タンパク質（ＡｇＲＰ）、ＡＮＧＰＴ２（アンジオポエチン２）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、プロベータセルリン（ＢＴＣ）、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ１３Ｒａ２）、レプチン（ＬＥＰ）、ニューロトロフィン４（ＮＴ４）および間質細胞由来因子－１アルファ（ＳＤＦ１ａ）の分泌の増加を示す。図８９は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２７、ＣＸＣケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）、間質細胞由来因子－１ベータ（ＳＤＦ１ｂ）、メタロプロテイナーゼ阻害剤１（ＴＩＭＰ１）、ＴＩＭＰ２および腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）の分泌の増加を示す。
図９０は、ＩＬ－２による刺激７２時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）およびＩＬ１３の分泌の増加を示す。これらの因子は、ＰＲＰに存在しないことが判明した。
一般に、本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムは、ＨＢ－ＥＧＦ；ＦＧＦ１、２および４；ＰＤＧＦ；ＩＧＦ－１；ＴＧＦ－β１およびβ２；ＴＧＦ－β３；ＩＬ－１αおよび－β；ＩＬ－１０；ＩＬ－４；ＩＬ－２、ＩＬ－１２；ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１７ａ；ＬＥＰおよびＬＥＰＲ；エンドグリン；Ａｄｉｐｏｑ；ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＰＢ３；ＣＳＦ１、ＣＳＦ３および受容体ＣＳＦＲ１；ＰＰＢＰ／ＮＡＰ－２；ＨＧＦ；ＮＧＲＦ；ＥＧＦ；ＴＮＦ－α；ならびにこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない、因子を産生することができる。
皮膚再生経路に関与する、本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して産生される例示的なインターロイキンは、ＩＬ１ｂ（インターロイキン１β）、ＩＬ２ｂ（インターロイキン２β）、ＩＬ３（インターロイキン３）、ＩＬ６（インターロイキン６）、ＩＬ６ＳＴ（インターロイキン６ＳＴ）、ＩＬ９（インターロイキン９）、ＩＬ１１（インターロイキン１１）、ＩＬ１２ａ（インターロイキン１２α）、ＩＬ１２ｂ（インターロイキン１２β）、ＩＬ１３（インターロイキン１３）およびＩＬ１７（インターロイキン１７）を限定することなく含む。
本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して産生される例示的なインターロイキン受容体および結合タンパク質は、ＩＬ１Ｒａ（インターロイキン１受容体α）、ＩＬ１Ｒ１（インターロイキン１受容体１型）、ＩＬ１Ｒ２（インターロイキン１受容体２型）、ＩＬ１Ｒ４（インターロイキン１受容体４）、ＩＬ２Ｒａ（インターロイキン２受容体α）、ＩＬ２Ｒｇ（インターロイキン２受容体γ）、ＩＬ５Ｒａ（インターロイキン５受容体α）、ＩＬ６Ｒ（インターロイキン６受容体）、ＩＬ１０Ｒｂ（インターロイキン１０受容体β）、ＩＬ１３Ｒａ（インターロイキン１３受容体α）、ＩＬ１８Ｒｂ（インターロイキン受容体β）、ＩＬ１８ＢＰ（インターロイキン１８結合タンパク質）、ＩＬ２１Ｒ（インターロイキン２１受容体）を限定することなく含む。
本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して産生される例示的な増殖因子は、ｂＦＧＦ２（塩基性線維芽細胞増殖因子２）、ｂＮＧＦ（ベータ－神経増殖因子）、ＦＧＦ４（線維芽細胞増殖因子４）、ＦＧＦ６（線維芽細胞増殖因子６）、ＦＧＦ９（線維芽細胞増殖因子９）、Ｆａｓリガンド、ＩＧＦＢＰ１（インスリン増殖因子結合タンパク質１）、ＩＧＦＢＰ３（インスリン増殖因子結合タンパク質３）、ＩＧＦＢＰ６（インスリン増殖因子結合タンパク質６）、ＬＡＰ（トランスフォーミング増殖因子様）、ＩＧＦ－１（インスリン様増殖因子１）、ＩＧＦ－２（インスリン様増殖因子２）、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＰＤＧＦＡＡ（血小板由来増殖因子Ａα）、ＰＤＧＦＡＢ（血小板由来増殖因子Ａβ）、ＰＤＧＦＢＢ（血小板由来増殖因子Ｂβ）、ＴＧＦＢ１（トランスフォーミング増殖因子β１）、ＡＮＧ（アンジオゲニン）、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）、ＢＭＰ４（骨形成（morphogenic）タンパク質４）、ＢＭＰ６（骨形成
タンパク質６）、ｂＮＧＦ（ベータ－神経増殖因子）、ＢＴＣ（プロベータセルリン）、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、肝細胞様増殖因子、ＮＴ３（ニューロトロフィン３）、ＮＴ４（ニューロトロフィン４）、ＯＰＧ（オステオプロテジェリン）、シグレック５（シアル酸結合Ｉｆ様レクチン５）およびＴＧＦＡ（トランスフォーミング増殖因子アルファ）、ＴＧＦｂ１（トランスフォーミング増殖因子ベータ１）、ＴＧＦｂ２（トランスフォーミング増殖因子ベータ３）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＶＥＧＦＤ（血管内皮増殖因子Ｄ）およびＰＬＧＦ（胎盤増殖因子）を限定することなく含む。
本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して産生される例示的な増殖因子受容体は、ＰＤＧＦＲＡ（血小板由来増殖因子受容体α）、ＶＥＧＦＲ２（血管内皮増殖因子受容体２）、ＶＥＧＦＲ３（血管内皮増殖因子受容体３）、ＮＧＦＲ（神経増殖因子受容体）、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）およびＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（腫瘍壊死因子受容体１０Ｄ）を限定することなく含む。
本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して産生される例示的なケモカインは、ＣＣＬ２（ケモカインリガンド２）、ＣＣＬ３（ケモカインリガンド３）、ＣＣＬ４（ケモカインリガンド４）、ＣＣＬ５（ケモカインリガンド５）、ＣＣＬ７（ケモカインリガンド７）、ＣＣＬ８（ケモカインリガンド８）、ＣＣＬ１３（ケモカインリガンド１３）、ＣＣＬ１５（ケモカインリガンド１６）、ＣＣＬ１７（ケモカインリガンド１７）、ＣＣＬ１８（ケモカインリガンド１８）、ＣＣＬ１９（ケモカインリガンド１９）、ＣＣＬ２０（ケモカインリガンド２０）、ＣＣＬ２２（ケモカインリガンド２２）、ＣＣＬ２３（ケモカインリガンド２３）、ＣＣＬ２４（ケモカインリガンド２４）、ＣＣＬ２５（ケモカインリガンド２５）、ＣＣＬ２６（ケモカインリガンド２６）、ＣＣＬ２７（ケモカインリガンド２７）、ＣＣＬ２８（ケモカインリガンド２８）、ＣＸＣＬ１（ケモカインリガンド１）、ＣＸＣＬ１／２／３（ケモカインリガンド１／２／３）、ＣＸＣＬ５（ＣＸケモカインリガンド５）、ＣＸＣＬ９（ＣＸケモカインリガンド９）、ＣＸＣＬ１０（ＣＸケモカインリガンド１０）、ＣＸＣＬ１３（ＣＸケモカインリガンド１３）およびＣＸＣＬ１６（ＣＸケモカインリガンド１６）を限定することなく含む。
本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して産生される、細胞接着シグナル伝達をもたらす例示的な分子は、ＡＬＣＡＭ（細胞接着分子）、Ｅ－セレクチンおよびＶＥカドヘリンを限定することなく含む。
本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して産生される、細胞増殖を促進することができる例示的な因子は、ＢＭＰ４（骨形成タンパク質４）、ＢＭＰ５（骨形成タンパク質５）、ＢＭＰ６（骨形成タンパク質６）、ＢＭＰ７（骨形成タンパク質７）、ＣＳＦ１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体）、ＩＣＡＭ２（細胞間接着分子２）、ＭＭＰ１（マトリックスメタロペプチダーゼ１）、ＭＭＰ３（マトリックスメタロペプチダーゼ３）、ＭＭＰ９（マトリックスメタロペプチダーゼ９）およびＴＩＭＰ４（メタロプロテイナーゼ阻害剤４）を限定することなく含む。
皮膚科学的加齢および皮膚の加齢に伴う生理学的変化は、乾燥症、バリア機能の喪失、コラーゲンおよびエラスチンファイバーへの損傷による弾性の喪失、しわ（rhytides）の改変、ならびに最終的に皮膚を薄くする上皮細胞の効率的代謝回転の喪失、頬骨脂肪性萎縮、ならびに色素性変化を含む。加齢は不可避であるが、一部の変形形態では、本明細書に記載されている組成物を使用して、これらの生理学的および解剖学的変化と闘うことができる。本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して産生される、皮膚再生を促進することができる例示的な因子は、ＣＸＣＬ１６（ケモカインリガンド１６）、ＩＧＦ－２（インスリン様増殖因子２）およびＴＩＥ２（免疫グロブリン（immunoglobin）／ＥＧＦ様ドメインを有するチロシンキナーゼ）を限定することなく含む。
本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して産生される、創傷治癒を促進することができる例示的な因子は、アクチビンＡ、ＩＧＦ－２（インスリン様増殖因子２）およびＬＥＰＲ（レプチン受容体）を限定することなく含む。
本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して産生される、皮膚におけるヒアルロン酸合成を促進することができる例示的な因子は、アクチビンＡ、ＬＥＰＲ（レプチン受容体、ＴＧＦＢ１（トランスフォーミング増殖因子β１）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）およびＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）を限定することなく含む。
本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して産生される、皮膚弾性を促進することができる例示的な因子は、ＩＧＦＢＰ１（インスリン様増殖因子結合タンパク質１）、ＩＧＦＢＰ２（インスリン様増殖因子結合タンパク質２）、ＩＧＦＢＰ４（インスリン様増殖因子結合タンパク質４）、ＴＩＭＰ１（メタロプロテイナーゼ阻害剤１）およびＴＩＭＰ２（メタロプロテイナーゼ阻害剤２）を限定することなく含む。
本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して産生される、悪性病変およびＵＶ誘導性皮膚加齢の抑制のための例示的な因子は、エンドグリンおよびＳＣＦＲ（ｃ－ＫＩＴ幹細胞因子受容体）を限定することなく含む。
本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して産生される、創傷治癒または炎症性応答を抑制するための例示的な因子は、ＣＤ１４（細胞分化抗原１４）、ＣＤ８０（細胞分化抗原８０）、ＩＦＮγ（インターフェロンガンマ）およびＬＩＦ（白血病阻害因子）を限定することなく含む。
例示的な変形形態では、本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して産生されるＮＧＦ（神経増殖因子受容体）は、脱毛の処置に有益な因子であり得る。
本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して産生され得る他の因子は、Ａｄｉｐｏｑ（アディポネクチン）、ＡｇＲＰ（アグーチ関連タンパク質）、ＡＮＧＰＴ２（アンジオポエチン２）、ＡＲＥＧ（アンフィレギュリン）、Ａｘ１（チロシンタンパク質キナーゼ受容体ＵＦＯ）、ＢＴＣ（ベータセルリン）、ＣＤ１４（細胞分化抗原１４）、ＣＤ８０（細胞分化抗原８０）、ＣＴ－１（カルジオトロフィン（cardiotropin）－１）、Ｄｔｋ（チロシンタンパク質キナーゼ受容体ＴＹＲＯ３）、ＥｒｂＢ３（受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒＢ－３）、ＯＰＧ（オステオプロテジェリン）、ＯＳＭ（オンコスタチンＭ）、ＰＰＢＰ（血小板塩基性タンパク質）、ＰＲＬ（プロラクチン）、ＴＨＰＯ（トロンボポエチン）およびＴＩＥ－１（アンジオポエチン１受容体）を限定することなく含む。
例示的な一変形形態では、ＳＲ－ｈＡＤＳＣは、ＩＬ－２誘導薬剤で２４時間刺激され、因子を２４時間産生させられる。図４３は、ＩＬ－２による誘導２４時間後に産生された因子の収集を示す。
別の例示的な変形形態では、ＳＲ－ｈＡＤＳＣは、ＩＬ－２誘導薬剤で２４時間刺激され、因子を４８時間産生させられる。図４３～５７は、ＩＬ－２による誘導４８時間後に産生された因子の収集を示す。
別の例示的な変形形態では、ＳＲ－ｈＡＤＳＣは、ＩＬ－２誘導薬剤で２４時間刺激され、因子を７２時間産生させられる。図４３～５８は、ＩＬ－２による誘導７２時間後に産生された因子の収集を示す。
別の例示的な変形形態では、ＳＲ－ｈＡＤＳＣは、２４時間の培地単独であり、因子を２４時間産生させられる。図１１～１９は、培地単独による誘導２４時間後に産生された因子の収集を示す。
別の例示的な変形形態では、ＳＲ－ｈＡＤＳＣは、２４時間の培地単独であり、因子を４８時間産生させられる。図１１～４２は、培地単独による誘導から４８時間後に産生された因子の収集を示す。
別の例示的な変形形態では、ＳＲ－ｈＡＤＳＣは、２４時間の培地単独であり、因子を７２時間産生させられる。図２０～４２は、培地単独による誘導７２時間後に産生された因子の収集を示す。
例示的な一変形形態では、ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣは、ＩＬ－２誘導薬剤で２４時間刺激され、因子を２４時間産生させられる。図７５は、ＩＬ－２による誘導２４時間後に産生された因子の収集を示す。
別の例示的な変形形態では、ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣは、ＩＬ－２誘導薬剤で２４時間刺激され、因子を４８時間産生させられる。図７５～９０は、ＩＬ－２による誘導４８時間後に産生された因子の収集を示す。
別の例示的な変形形態では、ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣは、ＩＬ－２誘導薬剤で２４時間刺激され、因子を７２時間産生させられる。図７５～９０は、ＩＬ－２による誘導７２時間後に産生された因子の収集を示す。
別の例示的な変形形態では、ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣは、培地単独で２４時間刺激され、因子を２４時間産生させられる。図５９～６０は、培地単独による誘導２４時間後に産生された因子の収集を示す。
別の例示的な変形形態では、ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣは、培地単独で２４時間刺激され、因子を４８時間産生させられる。図５９～７４は、培地単独による誘導４８時間後に産生された因子の収集を示す。
別の例示的な変形形態では、ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣは、培地単独で２４時間刺激され、因子を７２時間産生させられる。図５９～７４は、培地単独による誘導７２時間後に産生された因子の収集を示す。
例示的な変形形態では、因子産生ユニットにおける１つまたは複数の因子を産生するための方法は、少なくとも５０％のＳＥＮ－ｈＡＤＳＣを含むインプット細胞を使用するステップと、細胞の集団にＩＬ－２誘導剤を添加して、因子の産生を促進するステップと、因子を収集するステップとを含む。
３．例示的な誘導方法
図１Ａは、本明細書に記載されている本発明の態様を実施するための例示的な方法を描写する。
一般に、細胞のＳＥＮ状態に基づき、本明細書に記載されるように使用される幹細胞の複数のクラスおよびこれらのサブコンビネーションが存在し得る。各集団およびサブコンビネーションは、異なる栄養因子を産生し得る。例えば、細胞の集団は、完全ＳＲ、完全にＳＥＮまたは（より可能性が高いことには）ＳＲおよびＳＥＮ細胞の混合集団であり得る。完全にＳＲ細胞の集団は、本明細書に記載されている特定の因子を産生するように誘導することができ、栄養因子の第１のプロファイルを産生することができる（図１Ａ「表現型３」）。単なるＳＥＮ細胞の集団は、本明細書に記載されるように若返らせることができ、誘導なし（「表現型１」）または誘導あり（「表現型２」）のいずれかで因子を産生することができる。第４の表現型は、因子を産生するように誘導されていない単離されたＳＲ細胞であり得る（「表現型４」）。これらの異なる集団（若返った、以前にＳＥＮ細胞、誘導されたおよび誘導されていない、ならびに誘導された／誘導されたＳＲ細胞）は、単独でまたは様々なサブコンビネーションで使用して、本明細書に記載されている疾患／障害のいずれかを処置することができる。
図１Ａは、本発明の例示的なインプット細胞であるヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ｈＡＤＳＣ）の特性を改変して、すぐ上に言及されている表現型１～３のいずれかを産生するための方法を概略的に図解する。図１Ａに示す通り、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の抽出物は、脂肪組織から採取することができるか、または凍結保存した細胞の試料を使用することができる（１０１）。脂肪組織（よって、ＭＳＣ）は、自家または異種供給源（例えば、若返ったおよび／もしくは誘導されたｈＡＤＳＣおよび／もしくは抽出物で処置しようとする同患者、またはドナーＭＳＣ）に由来し得る。脂肪組織は、いずれか適切な手順に従って採取することができる。ＭＳＣは、脂肪組織から増幅および／または単離することができるが、一般に、ＭＳＣは培養される（１０３）。任意選択で、別のステップとしてまたは培養ステップの一部として、細胞を試験（ＱＣ）して、ＳＥＮ細胞の存在および／または同一性を決定することができる。その後、いずれかのＳＥＮ－ｈＡＤＳＣは、本明細書に記載されるように若返らせて、全細胞がＳＲ状態になり（以前にＳＥＮ細胞で、現在若返った状態を含む）、ＳＥＮ状態でなくなることができる。
一部の変形形態では、識別されたＳＥＮ細胞のみを、単なるＳＥＮ細胞の集団またはＳＥＮおよびＳＲ細胞の混合集団のいずれかにおいて若返らせる。例えば、ＳＥＮ細胞のみを若返らせる場合、ＳＥＮ細胞は、まずＳＲ細胞から単離することができる。その代わりに、ＳＥＮおよびＳＲ細胞の両方を含み得る混合集団の全細胞を若返らせる。
例えば、図１Ａにおいて、ＱＣステップは、単なるＳＥＮ細胞の集団（１１３）、ＳＥＮ／ＳＲ細胞の混合集団（１１５）および単なるＳＲ細胞の集団（１１７）を識別することができるか、または本方法は、手順においてＳＥＮおよびＳＲ細胞を分離するための細胞選別ステップを含むことができる。その後、細胞に、誘導ありまたはなしのいずれかで、栄養因子を産生させることができる。例えば、細胞の全てまたは一部は、この例では、これらをＩＬ－２に曝露することにより、「誘導」する（例えば、すぐに、所望のサブセットの因子を確実にかつ有効に産生することができるようにする）ことができる（１０７、１０７’、１０７’’）。細胞は、図１に図解されている通り、治療エンドポイントのために若返りありまたはなしでＩＬ－２により誘導することができる。図１Ａに示す通り、各亜集団（若返ったＳＥＮのみ（１１３）、ＳＲのみ（１１７）ならびに若返ったＳＥＮおよびＳＲの混合（１１５））は、任意選択で誘導することができ、異なるセットの栄養因子を産生することができる。これらの異なる集団は、本明細書に記載および示されている（indicateed）治療方法のいずれかにおける使用のために、いずれかのサブコンビネーション（非誘導ＳＲ細胞またはこれから得た栄養因子を含む）で組み合わせることができる。例えば、誘導されていない若返ったＳＥＮ細胞は、有益なセットの栄養因子を産生することができ（表現型１）、誘導された若返ったＳＥＮ細胞は、有益なセットの栄養因子を産生することができ（表現型２）、誘導されたＳＲ細胞は、有益なセットの栄養因子を産生することができる（表現型３）。既に記載されている通り、これらのいずれかの組合せを組み合わせて、治療用細胞（ｈＡＤＳＣ）および／またはそれから得られる抽出物のセットを形成することができる。
別の変形形態では、図１Ａ、１Ｂ、２Ａおよび２Ｂに図解されている通り、因子産生ユニットを使用した１つまたは複数の因子（または図２Ａのように因子組成物）の産生は、制御または個別調整することができる。例えばＩＬ－２による細胞集団の誘導／刺激により、１つまたは複数の因子が、細胞集団によって産生される。次いで、１つまたは複数の因子は、収集が望まれる因子に応じて、図面に示す通り、既定の時点で、例えば、２４時間、４８時間または７２時間目に収集することができる。例えば、誘導後２４時間目にインターロイキンが、４８時間目に増殖因子がおよび７２時間目にケモカインが産生され、皮膚若返りクリームへの製剤化に増殖因子が必要とされる場合、因子産生ユニットを培養し、誘導後４８時間目に因子を収集することができる。因子産生の制御は、因子産生ユニットに含まれる細胞の種類および基材の種類によって制御することもできる。因子収集の時点は、２４時間よりも早く、７２時間よりも遅くなってよいことが理解される。
図２Ｂは、因子の制御された産生のための、個体のｈＡＤＳＣを定植された５種の例示的な因子産生ユニット（Ａ～Ｅ）を示す模式図である。この例示的な態様では、各因子産生ユニットは、幹細胞の天然の成長環境を模倣するＥＣＭ様３－Ｄ足場を含有する。全５種の因子産生ユニットは、適した培地、例えば、１０％ＰＲＰ含有ＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ Ｘｅｎｏ不含培地に幹細胞を含有する（細胞なし対照の因子産生ユニットを表す因子産生ユニットＡを除いて）。因子産生ユニットは、ＳＲまたはＳＥＮ細胞を定植され、ＩＬ－２で２４時間刺激されるまたは刺激されない。
Ｄ．因子組成物
本明細書に記載されるように産生された因子は、いずれか適した組成物へと製剤化することができる。組成物は、本明細書に記載されている疾患および障害のいずれかのために、特定の使用適応に合わせて個別調整することができる。
因子は、いずれか適した担体および／または賦形剤（複数可）と共に、外用組成物、経口剤形、インプラント、注射用組成物または静脈内組成物へと製剤化することができる。場合により、因子または皮膚外観を増強する他の成分の皮膚浸透またはバイオアベイラビリティを増強するために追加的な薬剤を含める。１つまたは複数の因子を組成物に含めてよい。組成物は、１つまたは複数の因子の即時型、持続性または制御された放出のために製剤化することができる。
組成物に取り込まれる因子の量は、典型的には、所望の生物学的応答を誘導するための、所望の量の因子の有効量を構成する範囲内となるであろう。
一変形形態では、組成物は、ＩＬ－２で２４時間誘導されたＳＲ幹細胞（例えば、ＳＲ－ｈＡＤＳＣ）から産生された因子を含み、因子は、誘導完了から２４時間後に収集される。
一変形形態では、組成物は、ＩＬ－２で２４時間誘導されたＳＲ幹細胞（例えば、ＳＲ－ｈＡＤＳＣ）から産生された因子を含み、因子は、誘導完了から４８時間後に収集される。
一変形形態では、組成物は、ＩＬ－２で２４時間誘導されたＳＲ幹細胞（例えば、ＳＲ－ｈＡＤＳＣ）から産生された因子を含み、因子は、誘導完了から７２時間後に収集される。
一変形形態では、組成物は、ＩＬ－２で２４時間誘導されたＳＥＮ幹細胞（例えば、ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣ）から産生された因子を含み、因子は、誘導完了から２４時間後に収集される。
一変形形態では、組成物は、ＩＬ－２で２４時間誘導されたＳＥＮ幹細胞（例えば、ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣ）から産生された因子を含み、因子は、誘導完了から４８時間後に収集される。
一変形形態では、組成物は、ＩＬ－２で２４時間誘導されたＳＥＮ幹細胞（例えば、ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣ）から産生された因子を含み、因子は、誘導完了から７２時間後に収集される。
一変形形態では、組成物は、いかなる誘導剤でも誘導されていないＳＲ幹細胞（例えば、ＳＲ－ｈＡＤＳＣ）から産生された因子を含む。
一変形形態では、組成物は、いかなる誘導剤でも誘導されていないＳＥＮ幹細胞（例えば、ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣ）から産生された因子を含む。
Ｅ．疾患および障害の処置
本明細書に提供されている通り、１つもしくは複数の誘導された因子、１つもしくは複数の誘導された因子を含む馴化培地、または１つもしくは複数の因子を含む組成物は、種々の疾患および障害の処置に使用することができる。
処置することができる疾患および障害の非限定的なリストは、がん、自己免疫性疾患、心血管疾患、糖尿病、皮膚疾患、神経変性疾患、骨粗鬆症、変形性関節症、脊髄傷害、肝臓の疾患、腎臓の疾患、加齢性病理、脱毛、熱傷、植皮を必要とする状態および皮膚病変を含む。
因子産生方法の有益な態様は、処置しようとする特定の疾患、障害または状態に従って治療法をカスタマイズすることができることである。細胞の集団および基材は、産生しようとする所望の因子に応じて選択することができる。さらに、産生された因子は、既定の時点で収集することができる。特定の時点において選択された細胞集団によって産生される因子は、ある特定の疾患、障害または状態の処置において、他のものよりも有益となり得る。
処置のための因子の使用および送達の特定の機序は、より詳細に後述する。
本明細書にさらに詳細に記載されている通り、因子を産生し、いずれか適切な方法（例えば、クリーム組成物、注射、植え込み、プラスマフェレーシスによる等）を使用して、それを必要とする個体に直接的に送達することができる。
その代わりに、因子は、本発明の例示的な因子産生ユニットを使用して産生することができ、個体由来の免疫細胞のモジュレーションに使用することができる。この変形形態では、因子は、個体由来の試料（例えば、血液または血漿）における免疫細胞と接触し、免疫細胞のモジュレーション（免疫調節）をもたらす（例えば、Ｔｒｅｇの産生／分化を誘導する）ことができ、その後、試料は、個体に戻し送達される。この変形形態では、因子それ自体は、単に任意選択で送達される。むしろ、その使用は、ｅｘ ｖｉｖｏで為される。一変形形態では、本明細書に記載されている方法を使用して産生される他の因子組成物、他の活性薬剤または処置モダリティと組み合わせた、本明細書において産生される免疫調節された細胞（例えば、記載されるように産生されるＴｒｅｇ）を使用した併用療法が、本明細書に企図されている。これらの他の薬剤または処置は、このような障害の処置のための公知の薬物および治療法、例えば、これらに限定されないが、副腎皮質ステロイドおよび非ステロイド性抗炎症性化合物および刺激性薬物等を含むことができる。
本明細書に記載されている他の疾患または障害の処置に使用される因子は、自宅または診療所において、処置スケジュールに従って達成することができる。
図１Ｂは、例えば、若返り誘導されたｈＡＤＳＣにより対象を処置するための一般方法を図解する。この例示的な方法において、本方法は、処置しようとする対象から脂肪組織を抽出する初期ステップ（例えば、自家手順を行う場合）（２０１）と、次いでこの脂肪組織由来のＭＳＣを培養するステップ（２０３）とを含むことができる（図１Ａに示し、上述する通り）。対象自身の細胞の使用は、任意選択であり（２０１、２０３を囲む破線によって示す通り）、それは、その代わりにまたはそれに加えて異種細胞を使用することができるからであり（例えば、ドナー由来の）、これは、インタクトｈＡＤＳＣを含まない処理されたｈＡＤＳＣの抽出物を使用する場合に特に有用となり得る。
次いで、培養されたＭＳＣ（例えば、ｈＡＤＳＣ）を図１Ａの上述の通りに処理して、ＳＩＮＥ／ＡＬＵレトロトランスポゾンの活性（および／またはレベル）を低下または抑制することにより、これを若返らせることができる（２０５）、および／または次いで、これを誘導することができる（例えば、これをＩＬ－２に曝露することにより）（２０７）。ＩＬ－２等の誘導剤への曝露により細胞を誘導する場合、曝露の濃度および持続時間は、頑強な誘導応答を誘起するように選択することができる。このような処理の例は、後述する実施例に記載されている。
若返り誘導されたら、図１Ｂの２０９に記載されている通り、ｈＡＤＳＣ由来の因子または抽出物を使用して、患者を処置することができる。この例において、ＭＳＣ由来の抽出物は、局所的または全身性、例えば、注入による機構を含むいずれか適切な機構によって投与することができる。本明細書において使用される場合、若返り誘導されたＭＳＣ／ｈＡＤＳＣの投与は、実際の細胞および／または細胞の抽出物の投与を含むことができる。
１．皮膚美容および皮膚適用
一部の変形形態では、誘導された因子、１つもしくは複数の誘導された因子を含む馴化培地、または１つもしくは複数の因子を含む組成物は、皮膚への適用、例えば、美容適用、皮膚再生、皮膚若返り、創傷治癒または審美的処置のための組成物において使用することができる。因子を使用して、これらに限定されないが、皺、小皺、瘢痕（にきび瘢痕を含む）、皮膚変色、染み、皮膚弾性減少、日焼けによる損傷および脱毛等の美容状態を処置することができる。これらの美容状態は、１０％ＰＲＰ単独（誘導剤なし）にＡＤＳＣを含有する因子産生ユニットから分泌される因子によって処置することができる。一部の変形形態では、因子は、マイクロニードル適用と組み合わせて使用して、軽度の（light
）創傷を模造して、因子の送達および生理学的利益を容易にすることができる。
異なる時点（例えば、２４、４８、７２時間）で収集された、１０％ＰＲＰ単独の存在下で因子産生ユニットによって産生される因子を使用して、細胞レベルの皮膚加齢と有効に闘って、外因性および内因性加齢の両方に取り組むことができる。
一変形形態では、因子は、１０％ＰＲＰ単独にＳＲ ＡＤＳＣを含有する因子産生ユニットによって２４時間後に産生され、これらの因子を含む組成物を使用して、炎症の発生およびその急速な消散の間の均衡を達成することができる（ステージ１皮膚若返り治療法のための皮膚美容組成物）。この変形形態では、２４時間目に収集された因子の例示的な組成物は、インターロイキン５（ＩＬ５）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン４（ＩＬ４）、インターロイキン１受容体４（ＩＬ１Ｒ４）、ニューロトロフィン３（ＮＴ３）、血小板由来増殖因子Ａアルファ（ＰＤＧＦ ＡＡ）、血小板由来増殖因子Ａベータ（ＰＤＧＦ ＡＢ）および血小板前駆細胞塩基性タンパク質（ＰＰＢＰ）ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１８（ＣＣＬ１８）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２５（ＣＣＬ２５）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２７（ＣＣＬ２７）およびＣＸＣケモカインリガンド１１（ＣＸＣＬ１１）、（ＩＣＡＭ－１）、メタロプロテイナーゼ阻害剤２（ＴＩＭＰ－２）、メタロプロテイナーゼ阻害剤１（ＴＩＭＰ－１）、血管上皮（ＶＥ）カドヘリン（カルシウム依存性細胞接着タンパク質）およびインスリン様増殖因子結合タンパク質－１（ＩＧＦＢＰ１）を含む。
別の変形形態では、因子は、１０％ＰＲＰ単独にＳＲ ＡＤＳＣを含有する因子産生ユニットによって４８時間後に産生され、これらの因子を含む組成物（ステージ２皮膚若返り治療法のための皮膚美容組成物）を使用して、創傷治癒の炎症期から肉芽形成期（増殖性）への移行を容易にすることができる。この変形形態では、４８時間目に収集された因子の例示的な組成物は、インターロイキン９（ＩＬ９）、インターロイキン１８結合タンパク質アルファ（ＩＬ１８ＢＰａ）、インターロイキン１受容体ＩＩ型（ＩＬ１Ｒ２）、インターロイキン２受容体ベータ（ＩＬ－２Ｒｂ）、インターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ－２Ｒｇ）、インターロイキン５受容体アルファ（ＩＬ５Ｒａ）、インターロイキン１０受容体ベータ（ＩＬ１０Ｒｂ）、インターロイキン１８受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１８Ｒｂ）およびインターロイキン２１受容体（ＩＬ－２１Ｒ）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ２）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦａ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１／潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦｂ２）、受容体チロシンタンパク質キナーゼＥｒｂＢ－３（ＥｒｂＢ３）、Ｆａｓリガンド（Ｆａｓ ＬＧ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、プロラクチン（ＰＲＬ）因子、血小板由来増殖因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲａ）、血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲｂ）、幹細胞因子ｋｉｔ受容体（ＳＣＦＲ）およびシアル酸結合Ｉｇ様レクチン５（シグレック５）、ＣＸＣケモカインリガンド１６（ＣＸＣＬ１６）、活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）、Ｅセレクチン（免疫接着における細胞表面糖タンパク質）、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ２）、Ｌセレクチン（リンパ球接着分子）、血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ１）、アクチビンＡ（ＩＮＨＢＡ）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ－２）およびレプチン受容体（ＬＥＰＲ）、骨形成タンパク質５（ＢＭＰ５）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ７）、マクロファージコロニー刺激因子１受容体（ＭＣＳＦＲ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ１）、マトリックスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ３）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ１３（ＭＭＰ１３）、単球分化抗原（ＣＤ１４）、細胞分化抗原（ＣＤ８０）、カルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）および白血病阻害因子（ＬＩＦ）、エンドグリン（ＥＮＧ）、免疫グロブリン様およびＥＧＦ様ドメインを有するチロシンキナーゼ１（ＴＩＥ１）ならびに免疫グロブリン様およびＥＧＦ様ドメインを有するチロシンキナーゼ２（ＴＩＥ２）、レプチン受容体（レプチンＲ）、ならびに神経増殖因子受容体（ＮＧＦＲ）を含む。
別の変形形態では、因子は、１０％ＰＲＰ単独にＳＲ ＡＤＳＣを含有する因子産生ユニットによって７２時間後に産生され、これらの因子を含む組成物（ステージ３皮膚若返り治療法のための皮膚美容組成物）を使用して、肉芽形成から創傷再上皮化（皮膚組織リモデリングの初期である皮膚のピーリング）への移行を容易にすることができる。このステージにおいて、ＥＣＭ産生期において産生される低強度の組織化されていないＩＩＩ型コラーゲンおよびエラスチン構造は、より強いＩＩＩ型コラーゲンおよび構造化エラスチンファイバーによって置き換えられて、真皮に強度および復元性をもたらす。この変形形態では、７２時間目に収集された因子の例示的な組成物は、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１ｂ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ１３Ｒα２）、インターロイキン１受容体アルファ（ＩＬ１Ｒα）、プロベータセルリン（ＢＴＣ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ１）、線維芽細胞増殖因子６（ＦＧＦ６）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）、レプチン、血小板由来増殖因子Ｂベータ（ＰＤＧＦ ＢＢ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、骨形成タンパク質６（ＢＭＰ６）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、インスリン様増殖因子結合タンパク質－４（ＩＧＦＢＰ４）、幹細胞因子／ｃ－ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）、間質細胞由来因子－１アルファ（ＳＤＦ１ａ）、間質細胞由来因子－１ベータ（ＳＤＦ１ｂ）、アンジオテンシン（ＡＮＧ）、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ３（ＴＧＦｂ３）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド７（ＣＣＬ７）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド８（ＣＣＬ８）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１（ＣＣＬ１１）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＣＬ１３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２２（ＣＣＬ２２）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（ＣＣＬ２３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２４（ＣＣＬ２４）、ＣＸＣケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１３（ＢＬＣ）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（ＣＣＬ２３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２８（ＣＣＬ２８）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１（エオタキシン１）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド６（ＧＣＰ－２）、ＦＬＴ３ＬＧ（Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド）およびフラクタルカイン（ＣＸ３ＣＬ１）等を含む。
別の変形形態では、上述の皮膚美容組成物の組合せを使用して、創傷治癒、例えば、切創および擦り傷、熱傷、植皮および褥瘡の治癒を促進することができる。
別の変形形態では、いずれかの皮膚障害を、本発明の因子産生ユニットによって産生される因子の組成物によって処置することができる。皮膚障害の例として、乾癬、乾癬性関節炎、皮膚炎（湿疹）、例えば、剥脱性皮膚炎またはアトピー性皮膚炎、毛孔性紅色粃糠疹、ばら色粃糠疹（pityriasis rosacea）、類乾癬、苔癬状粃糠疹（pityriasis lichenoiders）、扁平苔癬、光沢苔癬、魚鱗癬様皮膚症、角皮症、皮膚症、円形脱毛症、壊疽
性膿皮症、白斑、類天疱瘡（例えば、眼性瘢痕性類天疱瘡または水疱性類天疱瘡）、蕁麻疹、汗孔角化症（prokeratosis）、関節包を裏打ちする上皮関連の細胞の過剰増殖および炎症に関与する関節リウマチ；脂漏性皮膚炎および日光皮膚炎等の皮膚炎；脂漏性角化症、老人性角化症、光線性角化症、光誘導性角化症および毛包性角化症等の角化症；尋常性ざ瘡；ケロイドおよびケロイド形成に対する予防法；母斑；疣贅、コンジローマまたは尖圭コンジローマ、および性病性いぼ等のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染を含むいぼ；白板症；扁平苔癬；ならびに角膜炎が挙げられる。皮膚障害は、皮膚炎、例えば、アトピー性皮膚炎もしくはアレルギー性皮膚炎または乾癬であり得る。一変形形態では、これらの状態のいずれかは、７２時間、ＳＲ ｈＡＤＳＣを使用して因子産生ユニットによって産生される因子によって処置することができる。この実施形態において、組成物は、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１ｂ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ１３Ｒα２）、インターロイキン１受容体アルファ（ＩＬ１Ｒα）、プロベータセルリン（ＢＴＣ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ１）、線維芽細胞増殖因子６（ＦＧＦ６）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）、レプチン、血小板由来増殖因子Ｂベータ（ＰＤＧＦ ＢＢ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、骨形成タンパク質６（ＢＭＰ６）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、インスリン様増殖因子結合タンパク質－４（ＩＧＦＢＰ４）、幹細胞因子／ｃ－ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）、間質細胞由来因子－１アルファ（ＳＤＦ１ａ）、間質細胞由来因子－１ベータ（ＳＤＦ１ｂ）、アンジオテンシン（ＡＮＧ）、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ３（ＴＧＦｂ３）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド７（ＣＣＬ７）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド８（ＣＣＬ８）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１（ＣＣＬ１１）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＣＬ１３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２２（ＣＣＬ２２）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（ＣＣＬ２３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２４（ＣＣＬ２４）、ＣＸＣケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１３（ＢＬＣ）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（ＣＣＬ２３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２８（ＣＣＬ２８）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１（エオタキシン１）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド６（ＧＣＰ－２）、ＦＬＴ３ＬＧ（Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド）およびフラクタルカイン（ＣＸ３ＣＬ１）を含む。
これらの因子は、単独で、または異なる時点で産生される因子と組み合わせて送達することができ、例えば、１０％ＰＲＰにおけるＳＲ細胞によって産生される因子（ＰＲＰ単独とのインキュベーション２４、４８または７２時間後）は、ＳＲ細胞＋ＩＬ－２によって産生される因子（誘導７２時間後）と組み合わせることができる。
一部の変形形態では、段階的用量の因子を、皮膚関連の状態の処置のために送達することができる。
一部の変形形態では、段階的用量の因子を、後述する免疫調節性組成物と組み合わせて送達することができる。
本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して産生される、皮膚再生を促進することができる例示的な因子は、ＣＸＣＬ１６（ケモカインリガンド１６）、ＩＧＦ－２（インスリン様増殖因子２）およびＴＩＥ２（免疫グロブリン／ＥＧＦ様ドメインを有するチロシンキナーゼ）を限定することなく含む。
本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して産生される、創傷治癒を促進することができる例示的な因子は、アクチビンＡ、ＩＧＦ－２（インスリン様増殖因子２）およびＬＥＰＲ（レプチン受容体）を限定することなく含む。
本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して産生される、皮膚におけるヒアルロン酸合成を促進することができる例示的な因子は、アクチビンＡ、ＬＥＰＲ（レプチン受容体、ＴＧＦＢ１（トランスフォーミング増殖因子β１）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）およびＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）を限定することなく含む。
本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して産生される、皮膚弾性を促進することができる例示的な因子は、ＩＧＦＢＰ１（インスリン様増殖因子結合タンパク質１）、ＩＧＦＢＰ２（インスリン様増殖因子結合タンパク質２）、ＩＧＦＢＰ４（インスリン様増殖因子結合タンパク質４）、ＴＩＭＰ１（メタロプロテイナーゼ阻害剤１）およびＴＩＭＰ２（メタロプロテイナーゼ阻害剤２）を限定することなく含む。
本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して産生される、悪性病変およびＵＶ誘導性皮膚加齢の抑制のための例示的な因子は、エンドグリンおよびＳＣＦＲ（ｃ－ＫＩＴ幹細胞因子受容体）を限定することなく含む。
本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して産生される、創傷治癒または炎症性応答を抑制するための例示的な因子は、ＣＤ１４（細胞分化抗原１４）、ＣＤ８０（細胞分化抗原８０）、ＩＦＮγ（インターフェロンガンマ）およびＬＩＦ（白血病阻害因子）を限定することなく含む。
美容製品（美容または皮膚状態を処置するための）として使用される場合、因子は、処置スケジュールに従って送達することができる。因子送達の機序に応じて、処置は、自宅または診療所で完了することができる。マイクロニードル適用（後述）手順または他の皮膚表面手順後の因子の送達は、処置スケジュールの一部であり得る。
２．腫瘍学適用
一部の変形形態では、産生／分泌された因子、１つもしくは複数の因子を含む馴化培地、１つもしくは複数の因子を含む組成物、または免疫調節された免疫細胞（例えば、本明細書で産生されるＴｒｅｇ）を使用して、がん等、異常細胞分化に関する疾患または障害を処置することができる。細胞増殖性および／または分化障害の例として、いずれかの型のがん（例えば、癌腫、肉腫、転移性障害または造血器新生物障害、例えば、白血病）が挙げられる。本明細書に企図される通り、がんは、肺、乳房、甲状腺、リンパ腺およびリンパ系組織、胃腸臓器ならびに尿生殖器のがんであり得る。がんは、大部分の結腸がん、腎細胞癌、前立腺がんおよび／または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸のがん、ならびに食道のがん等、悪性病変を含むと一般に考えられる腺癌であり得る。
本発明の一変形形態では、ＩＬ－２で刺激され、刺激７２時間後に収集された、ＳＲ細胞によって産生される因子の組成物は、がんの処置のために個体に投与することができる。ＩＬ－２で刺激され、刺激７２時間後に収集され、血液または血漿と接触した、ＳＲ細胞によって産生される因子を使用して、ｅｘ ｖｉｖｏ免疫調節されたＴ細胞が産生される場合、養子Ｔ細胞療法のための因子の使用も本明細書に企図されている。
３．自己免疫性疾患
一部の変形形態では、産生／分泌された因子、１つもしくは複数の因子を含む馴化培地、１つもしくは複数の因子を含む組成物、または免疫調節された免疫細胞（例えば、本明細書で産生されるＴｒｅｇ）は、自己免疫性疾患の処置にまたはその徴候および症状の低下に使用することができる。
本発明の一変形形態では、ＩＬ－２で刺激され、刺激７２時間後に収集された、ＳＲ細胞によって産生される因子の組成物は、自己免疫性疾患の処置のために個体に投与することができる。このような組成物は、サイトカインおよびプロスタグランジンを含み、本発明に記載されているデバイスの使用により、このような因子は、個体への送達後に、血液または罹患組織へと放出され得る。
一変形形態では、エフェクターＴ細胞（ある特定の自己免疫性疾患において数が増加）および機能的Ｔｒｅｇ（ある特定の自己免疫性疾患において数が減少）細胞の間に不均衡が存在することが多い場合、投与後に、エフェクターＴ細胞／Ｔｒｅｇ細胞均衡のリセットに使用して、Ｔ細胞依存性炎症性自己免疫性疾患を処置することができる因子が、本明細書に提供される。よって、ＩＬ－２薬物それ自体の送達がない、エフェクターＴ細胞／Ｔｒｅｇ均衡のリセットに有用な方法および因子産生ユニットが、本明細書に提供される。このアプローチは、自己免疫性血管炎、円形脱毛症、糖尿病、慢性移植片対宿主病、アルツハイマー病および加齢性神経変性、脳脊髄炎、多発性硬化症、ＡＬＳ、歯根膜感染、関節リウマチ、ＣＡＲ－Ｔ等のがん免疫療法に伴う可変的重症度の自己免疫性炎症、ループスおよび強直性脊椎炎が挙げられるがこれらに限定されない、本明細書に収載されているいずれかの自己免疫性疾患に適する（Smigielら、Immunol Rev.２０１４年：４０～５９頁）。このような産生は、創傷治癒および創傷修復に有用となる場合もある。
一変形形態では、Ｔｒｅｇの産生のための因子は、ＳＲ細胞（またはＳＲとなるように若返ったＳＥＮ細胞）において産生され、ＳＲ細胞は、ＩＬ－２により因子を産生するように誘導される（約２４時間の期間、ＩＬ－２と組み合わされる）。これらの条件下で産生された因子は、Ｔｒｅｇ産生をブーストすることができる（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋および／またはＣＤ４＋ＣＤ２５－ＦｏｘＰ３＋であるＴｒｅｇを増加させる）。一変形形態では、ＳＲ細胞は、ＩＬ－２と共に約２４時間インキュベートされ、それに続いて、ＳＲ細胞由来の馴化培地は、血液、血漿または血液の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と約７２時間の期間接触させられ、これにより、血液、血漿またはＰＢＭＣ中のナイーブＴ細胞を免疫調節する。
図２Ｃは、免疫調節に有用な因子の産生および検査を含む本発明の例示的な態様を示し、Ｔｒｅｇの産生を例証する。
４．神経変性疾患および脳卒中
一部の変形形態では、産生／分泌された因子、１つもしくは複数の因子を含む馴化培地、１つもしくは複数の因子を含む組成物、または免疫調節された免疫細胞（例えば、本明細書で産生されるＴｒｅｇ）は、アルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（amyolateral sclerosis）（ＡＬＳ）およびハンチントン病が挙げられるがこれらに限定されない神経変性疾患の処置にまたはその徴候および症状の低下に使用すると共に、傷害後の神経細胞死を予防することができる。本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して、神経変性疾患の処置に役立つことができる例示的な因子は、ＳＥＮ ｈＡＤＳＣ＋ＩＬ－２によって産生され、誘導２４～７２時間後に収集された因子；または誘導４８時間後にＳＲ ｈＡＤＳＣ＋ＩＬ－２によって産生された因子を含む。刺激の４８時間後に収集されたＳＥＮ ＡＤＳＣ＋ＩＬ－２を使用して因子産生ユニットから得られる因子を送達して、必要に応じて細胞遊走および血行再建の増強およびアポトーシスの予防のための治療効果を達成することができる。一部の変形形態では、これら２種の条件から得られる因子が組み合わされ、それを必要とする個体に送達される。
５．加齢性疾患
一部の変形形態では、産生／分泌された因子、１つもしくは複数の因子を含む馴化培地、１つもしくは複数の因子を含む組成物、または免疫調節された免疫細胞（例えば、本明細書で産生されるＴｒｅｇ）は、加齢性疾患の処置にまたはその徴候および症状の低下に使用することができる。このような加齢性疾患は、骨粗鬆症、変形性関節症および関節炎を限定することなく含む。本明細書に提供されるインプット細胞およびシステムを使用して、加齢性疾患の処置に役立つことができる例示的な因子は、インターロイキン９（ＩＬ９）、インターロイキン１８結合タンパク質アルファ（ＩＬ１８ＢＰａ）、インターロイキン１受容体ＩＩ型（ＩＬ１Ｒ２）、インターロイキン２受容体ベータ（ＩＬ－２Ｒｂ）、インターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ－２Ｒｇ）、インターロイキン５受容体アルファ（ＩＬ５Ｒａ）、インターロイキン１０受容体ベータ（ＩＬ１０Ｒｂ）、インターロイキン１８受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１８Ｒｂ）およびインターロイキン２１受容体（ＩＬ－２１Ｒ）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ２）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦａ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１／潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦｂ２）、受容体チロシンタンパク質キナーゼＥｒｂＢ－３（ＥｒｂＢ３）、Ｆａｓリガンド（Ｆａｓ ＬＧ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、プロラクチン（ＰＲＬ）因子、血小板由来増殖因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲａ）、血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲｂ）、幹細胞因子ｋｉｔ受容体（ＳＣＦＲ）およびシアル酸結合Ｉｇ様レクチン５（シグレック５）、ＣＸＣケモカインリガンド１６（ＣＸＣＬ１６）、活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）、Ｅセレクチン（免疫接着における細胞表面糖タンパク質）、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ２）、Ｌセレクチン（リンパ球接着分子）および血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ１）、アクチビンＡ（ＩＮＨＢＡ）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ－２）、レプチン受容体（ＬＥＰＲ）、骨形成タンパク質５（ＢＭＰ５）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ７）、マクロファージコロニー刺激因子１受容体（ＭＣＳＦＲ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ１）、マトリックスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ３）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ１３（ＭＭＰ１３）、単球分化抗原（ＣＤ１４）、細胞分化抗原（ＣＤ８０）、カルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）および白血病阻害因子（ＬＩＦ）、エンドグリン（ＥＮＧ）、免疫グロブリン様およびＥＧＦ様ドメインを有するチロシンキナーゼ１（ＴＩＥ１）ならびに免疫グロブリン様およびＥＧＦ様ドメインを有するチロシンキナーゼ２（ＴＩＥ２）、レプチン受容体（レプチンＲ）、ならびに神経増殖因子受容体（ＮＧＦＲ）を限定することなく含む。
例示的な変形形態では、加齢性疾患の処置のための因子が望まれる場合、ＳＲ幹細胞（例えば、ｈＡＤＳＣ）の集団は、１０％ＰＲＰを含有する培地における因子産生ユニット中に配置することができ、因子は、４８時間目に収集することができる。
６．心血管疾患
一部の変形形態では、産生／分泌された因子、１つもしくは複数の因子を含む馴化培地、１つもしくは複数の因子を含む組成物、または免疫調節された免疫細胞（例えば、本明細書で産生されるＴｒｅｇ）は、心血管疾患の処置にまたはその徴候および症状の低下に使用することができる。このような心血管疾患は、心筋梗塞、および幹細胞関連の治療法の増強を限定することなく含む。１０％ＰＲＰ単独における配置してから４８時間後にＳＲ ＡＤＳＣを含む因子産生ユニットから得られる因子、または刺激の４８時間後に収集されたＳＥＮ ＡＤＳＣ＋ＩＬ－２を使用して因子産生ユニットから得られる因子と組み合わせた因子を送達して、筋細胞分化、細胞遊走および血管新生の増強のための治療効果を達成することができる。因子の同様の組成物は、血行再建の増強およびアポトーシスの予防が要求される場合の状態の処置に使用することができる。
一部の変形形態では、増強された細胞生存およびＨＧＦによるパラクリン刺激が、心筋梗塞における心保護の促進に要求される場合、ＩＬ－２刺激なしの（ＰＲＰ単独における）ＳＥＮ ＡＤＳＣを含有する因子産生ユニットを使用して因子を産生することができ、因子は、ＰＲＰに配置してから７２時間後に収集される。
７．他の疾患
一部の変形形態では、産生／分泌された因子、１つもしくは複数の因子を含む馴化培地、１つもしくは複数の因子を含む組成物、または免疫調節された免疫細胞（例えば、本明細書で産生されるＴｒｅｇ）は、糖尿病、脊髄傷害、クローン病、再生不良性貧血、関節リウマチ、脳傷害、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、腎臓疾患、肝臓硬変および脳卒中、神経系の疾患および脊髄傷害を限定することなく含む、他の疾患の処置にまたはその徴候および症状の低下に使用することができる。
ＩＩ．因子産生ユニット
上述の種々の疾患および障害に有益な、様々な因子を産生するためのシステムが、本明細書に記載されている。システムは、インプット幹細胞の集団と、細胞集団に支持をもたらす基材とを含む因子産生ユニットを含むことができる。適切な誘導薬剤との接触後に、因子産生ユニットの細胞集団は、１つまたは複数の因子を産生／分泌するように刺激される。特定の種類の因子の産生は、誘導薬剤の選択、細胞の選択、基材の選択および／または刺激／誘導後の細胞培養の持続時間によって個別調整することができる。
図２Ｄは、本明細書に記載されている、本発明の例示的な因子産生ユニットにおけるｈＡＤＳＣを図画により図解する。図解した因子産生ユニットは、幹細胞（例えば、ＭＳＣ）が天然に存する３－Ｄ細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を模倣するポリマーマトリックス／ファイバーで作製された３－Ｄ足場を含有する。因子産生ユニットは、細胞が、その天然の環境中に維持され、これにより、幹細胞の形態および分泌特性を維持することを可能にする。幹細胞は、因子産生ユニットの局所的環境の維持および調節、ならびに因子産生ユニット空間の外側での生理活性分子の分泌において重要な増殖因子、サイトカインおよび他の栄養因子を産生する。左下２枚のパネルは、細胞がない３－Ｄ足場により示されており、右下２枚のパネルは、１０×および４０×拡大率で、健康な４９歳の患者由来のＧＦＰを発現するｈＡＤＳＣ細胞を示す（ＰＤ ８）。ＧＦＰを発現するＡＤＳＣは、マトリックス中の細胞の可視化のために、患者ＡＤＳＣのレンチウイルス形質導入によって作製した。ＧＦＰを発現するｈＡＤＳＣは、ＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ Ｘｅｎｏ不含培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の１０％ＰＲＰにおける因子産生ユニット中に１２日間維持した。ＧＦＰは、因子産生ユニットにおける細胞形態および細胞生存率を実証する。
Ａ．細胞
本明細書に提供されている通り、インプット細胞集団は、因子を産生／分泌するように誘導することができるいずれか適した型の幹細胞を含むことができる。産生された因子は、種々の疾患および障害の処置にまたはその徴候および症状の低下に使用することができる。
因子産生ユニットは、個体への送達のための、因子を産生するように誘導されたインプット細胞の集団を含むことができる。インプット細胞は、自家（因子を受ける個体に由来する細胞）または同種異系間（因子を受ける個体に由来しない細胞）であり得る。
因子産生ユニットは、ＳＲ細胞（ＳＲとなるように若返ったＳＥＮ細胞を含む）、ＳＥＮ細胞（ＳＥＮとなるように誘導されたＳＲ細胞を含む）、ＳＲ細胞のみ、ＳＥＮ細胞のみ、ＳＲおよびＳＥＮ細胞の混合物、ならびにこれらのいずれかの変形形態を含むことができる。
Ｂ．基材
細胞集団に加えて、因子産生ユニットは、細胞集団に支持をもたらす基材も含む。
細胞集団のためのマトリックスもしくは足場となり得る、または細胞集団を保持もしくは保有することができるいずれか適した構造を基材として用いることができる。例えば、集団の細胞は、フィルム、膜、シート、メッシュ、ディスク、ロッド、ファイバー、ナノファイバー等、基材の表面上に配置および支持することができる、または基材材料それ自体の内に配置することができる（例えば、材料内に被包または包埋することができる）。
因子産生ユニットは、ある体積、例えば、マルチウェルプレート、チューブ、チャンバーまたは他の容器内に細胞を保持することができる。一部の変形形態では、因子産生ユニットは、様々な区画および／またはフィルタリング機構を含むアセンブリーである。さらなる変形形態では、因子産生ユニットは、体組織または内腔内に配置することができるインプラントである。その代わりに、因子産生ユニットは、別の構造、例えば、マルチウェルプレートのウェルの上に配置されたまたはその上に層形成されたコーティングを含むことができる。
一部の変形形態では、因子産生ユニットは、アフェレーシスシステムの一部である。用語「アフェレーシス」は、血液の成分を除去する過程またはシステムに与えられた一般用語である。この過程またはシステムは、除去される特定の血液成分によってより特異的に定義される。例えば、血漿が除去される場合、この過程またはシステムは、「プラスマフェレーシス」または「プラスマフェレーシス型システム」と称される。アフェレーシスシステムを使用して、細胞型を交換することができる（例えば、鎌状赤血球症のために行われる赤血球アフェレーシス）、血漿（例えば、抗体、パラプロテイン、コレステロールを除去するため）もしくは血液（疾患状態に貢献すると考えられる成分を除去するため）を処理することができる、または血液成分を改変することができる（例えば、フォトフェレーシス）。
基材の形成に使用されるポリマーは、生体適合性であり、生分解性または非生分解性であり得る。例示的なポリマーは、ポリアミド、ポリ（シロキサン）、ポリ（シリコーン）、ポリ（エチレン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（ビニルアセテート）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレン－ｃｏ－ビニルアセテート）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メタクリル酸）、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリ（カーボネート）、ポリ（アクリロニトリル）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリアニリン、ポリビニルカルバゾール、ポリスチレン、ポリ（ビニルフェノール）、ポリヒドロキシ酸、ポリ（カプロラクトン）、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリウレタン、コラーゲン、アルブミン、アルギネート、キトサン、フィブロネクチン、ゼラチン、デンプン、ヒアルロン酸、ならびにこれらのブレンドおよびコポリマーを限定することなく含む。
基材は、１本または複数のファイバーを含むことができる。ファイバーは、ミリメートル、マイクロメートルまたはナノメートル範囲内であり得る。本明細書において使用される場合、「ファイバー」は、ナノファイバー（１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の直径）およびマイクロファイバー（５０マイクロメートル（μｍ）未満の直径）を含む、いずれかの直径を有するファイバーを指す。本明細書に記載されている基材を作製するために使用されるファイバーの直径は、約５０ｎｍ～約２０μｍに及び得る。例えば、ファイバー直径は、約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約２００ｎｍ、約３００ｎｍ、約４００ｎｍ、約５００ｎｍ、約６００ｎｍ、約７００ｎｍ、約８００ｎｍ、約９００ｎｍ、約１μｍ、約２μｍ、約５μｍ、約６μｍ、約７μｍ、約８μｍ、約９μｍ、約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、約４５μｍまたは約５０μｍであり得る。
場合により、基材が、１本または複数のナノファイバーを含むことが有益となり得る。これらのナノファイバーは、様々なサイズ、形状および幾何的形状の二次元（２Ｄ）または三次元（３Ｄ）基材を形成するように構成することができる。一変形形態では、ナノファイバーは、人工細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を構築するために使用される。ナノファイバーは、中空であってもそうでなくてもよい。その上、ナノファイバーは、ナノファイバー上にまたはその中に様々な形状、直径および／または分布のポアを含むことができる。
適切なＥＣＭ環境を構築するために使用される場合、ネイティブのＥＣＭの機械的特性を正確に模倣する材料の選択は、細胞集団の維持および因子の産生に最適な環境をもたらすことができる。含まれる材料は、生分解性でないポリマーまたはゆっくり分解するように設計されたポリマーであり得る。生分解性でないポリマーは、ポリウレタン、ポリカーボネートまたはポリエステルテレフタレートを含むことができる。生分解性ポリマーは、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ゼラチン、コラーゲンまたはフィブロネクチンを含むことができる。
Ｃ．基材の形成
基材は、いずれか適した過程によって形成することができる。例えば、基材は、ポリマー材料の押し出し、射出成形、真空熱成形またはエンボス加工によって形成することができる。ファイバーで構成されている場合、ファイバーを押し出しおよび射出成形によって形成することもできる。しかし、ナノファイバーの製作は、その微小な直径のため、困難な課題となり得る。多孔性固体におけるまたは積層結晶のステップ端における形成等、伝統的な方法は多くの場合、無効かつ高価である。代替方法は、静電ファイバー形成またはエレクトロスピニングまたは３－Ｄレーザープリンティングである。
エレクトロスピニングにおいて、高電圧（例えば、約０．３～約０．５０ｋＶ）が、典型的には、標的（またはコレクタ）と、ポリマー溶液または融液が注入される導電キャピラリとの間に印加される。キャピラリが、ガラスピペット等の不導体である場合、高電圧は、ワイヤを介して溶液または融液に印加することもできる。コレクタは、金属プレートもしくはスクリーン、回転ドラム、またはさらには、キャピラリが垂直である場合は液体槽であり得る。最初に、キャピラリの開口先端における溶液が、電気力および表面張力の相互作用により円錐形（いわゆる「テイラーコーン（Taylor cone）」）内に引き入れられる。ある特定の電圧範囲で、ポリマー溶液（または融液）の微細なジェットが、テイラーコーンの先端に生じ、標的に向けて吹き出す。電場からの力は、ジェットを加速および伸展する。この伸展は、溶媒分子の蒸発と共に、ジェット直径をより小さくする。ポリマー内の静電力が、ジェットを一体に保持する凝集力（例えば、表面張力）を克服するまで、ジェット直径が減少するにつれて、電荷密度が増加し、ジェットを、ポリマーファイバーのマルチフィラメントに分割するまたは「広げる」。ファイバーは、コレクタに達するまで広がり続け、コレクタにおいて、不織ファイバーとして収集され、任意選択で乾燥される。急速に回転するコレクタは、整列されたファイバーを収集する一方、静止したコレクタは、ランダムに配向されたファイバーのマットを収集する。次いで、これらのファイバーおよびマットは、様々な２Ｄまたは３Ｄ構造に形成する、形作る等ができる。一変形形態では、ファイバーは、細胞外マトリックスの構造に似せて形成される。
エレクトロスピニング過程の様々なパラメータを調整して、ファイバーの形態を改変することができる。例えば、溶液パラメータ、加工パラメータ、ならびに温度および湿度等のパラメータは、ファイバーの形態、例えば、ファイバー直径および／またはファイバーの多孔度に影響を与えることができる。より詳細には、ポリマー濃度、ポリマー分子量および溶液粘度等、溶液パラメータ；ならびに印加電圧、溶液の流速およびコレクタとノズルとの間の距離等、加工パラメータを調整することができる。
一部の変形形態では、異なるポリマーのブレンドを一緒にエレクトロスピニングすることができ、１つのポリマーが優先的に溶解して、足場多孔度を増加させる。
エレクトロスピニングのためのポリマー溶液の作製において有用となり得るポリマーは、ポリエチレンテレフタレート、ポリエステル、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリロニトリル、シリコーン、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリエーテルケトンケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリアミド、ポリスチレン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリエーテルケトンケトン（ＰＥＫＫ）、ポリグリセロールセバシン酸、ポリジオールクエン酸、ポリヒドロキシ酪酸、ポリエーテルアミド、ポリジアキサノン、およびこれらの組合せ、ブレンドまたはコポリマーを限定することなく含むことができる。エレクトロスピニングに使用される代替ポリマー溶液は、フィブロネクチン、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、キトサンまたはこれらの組合せ等、天然ポリマーを含むことができる。例示的な変形形態では、ポリマーは、ポリカプロラクトンである。
エレクトロスピニング溶液が、いずれかの組成比で、いずれかのポリマーまたはポリマー組合せを含むことができることが理解される。溶媒（単数または複数）におけるポリマー（単数または複数）の濃度範囲は、限定することなく、約５ｗｔ％～約５０ｗｔ％であり得る。溶液におけるポリマー濃度のいくつかの非限定例として、約５ｗｔ％、約１０ｗｔ％、約１５ｗｔ％、約２０ｗｔ％、約２５ｗｔ％、約３０ｗｔ％、約３５ｗｔ％、約４０ｗｔ％、約４５ｗｔ％もしくは約５０ｗｔ％、またはこれらの値のうちいずれか２つの間の濃度を挙げることができる。
いくつかの非限定例では、ポリマー溶液は、約１０％～約９０％の、ポリウレタンに対するポリエチレンテレフタレートの重量パーセント比を含むことができる。例えば、重量パーセント比は、約１０％、約２５％、約３３％、約５０％、約６６％、約７５％、約９０％、またはこれらの値のうちいずれか２つの間の重量パーセント比であり得る。
ポリマー溶液は、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ－メチルピロリドン、アセトニトリル、ヘキサン、エーテル、ジオキサン、酢酸エチル、ピリジン、トルエン、キシレン、テトラヒドロフラン、トリフルオロ酢酸、ヘキサフルオロイソプロパノール、酢酸、ジメチルアセトアミド、クロロホルム、ジクロロメタン、水、アルコール、イオン性化合物またはこれらの組合せ等、１つまたは複数の溶媒を含むこともできる。
ポリマー溶液は、追加的な材料を含むこともできる。このような追加的な材料の非限定例として、放射線不透過性材料、導電性材料、蛍光材料、発光材料、抗生物質、増殖因子、ビタミン、サイトカイン、ステロイド、抗炎症性薬物、小分子、糖、脂質、塩、ペプチド、タンパク質、細胞因子またはこれらのいずれかの組合せを挙げることができる。
塩またはスクロース等、粒子をエレクトロスピニング過程に含めて、足場の至るところに沈着させてもよい。これらの粒子は、後に、足場多孔度の増加のために溶解されてよい。ファイバーの特性は、ファイバー直径、ファイバースペーシングまたは多孔度、ファイバーの多孔度または円形からリボン様へと形状を変動させるアスペクト比等の各ファイバーの形態を最適化するために制御され得る。溶液パラメータは、各ファイバーの係数または他の機械的特性、ファイバー組成および／または分解速度をカスタマイズするために制御され得る。ファイバーは、薬物溶出ファイバー、抗細菌ファイバー、またはｘ線、ＣＴもしくは他のスキャンにおけるファイバーの設置もしくは位置づけに役立つ放射線不透過性ファイバーとして形成することもできる。
例示的な足場は、まず、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）およびトリフルオロ酢酸の混合物に２～３０ｗｔ％ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）を溶解することによりポリマーナノファイバー前駆体溶液を調製し、次いで、この溶液を６０℃まで加熱し、続いて連続的に撹拌して、ＰＥＴを溶解することにより作製することができる。溶液を室温まで冷却し、先端が尖っていない針（例えば、２０ゲージ）を備えるシリンジ（例えば、６０ｃｃ）に溶液を配置することができる。１ｋＶ～４０ｋＶ（例えば、＋１５ｋＶ）の正または負の極性、５～３０ｃｍ（例えば、１５ｃｍ）の先端から基材への距離、および１μｌ／時間～１００ｍＬ／時間（例えば、１０ｍｌ／時間）の流速に設定された、高電圧ＤＣ電源（Ｇｌａｓｓｍａｎ Ｈｉｇｈ Ｖｏｌｔａｇｅ，Ｉｎｃ．、Ｈｉｇｈ Ｂｒｉｄｇｅ、Ｎ．Ｊ．）を使用したエレクトロスピニングによって、ナノファイバーを形成することができる。多数の針（例えば、＞１０００本）を含む針アレイを使用して、システムアウトプットを増加させることも可能である。ファイバー直径は、使用される前駆体溶液および溶媒の粘度によって制御することができ、適した例示的なファイバーは、１００ナノメートル～３０ミクロンの範囲内である。およそ０．２～３ｍｍ（例えば、１ｍｍ）の厚さのランダムに配向されたおよび／または高度に整列されたファイバーを型に置き、ポリマー環（ring）を添加し、続いて型を回転させつつ、追加的なおよそ０．２～３．０ｍｍ（例えば、２ｍｍ）のファイバーを添加することができる。足場を真空中に一晩配置して、残渣溶媒（典型的には１０ｐｐｍ未満）の除去を確実にし、高周波ガスプラズマを使用して１分間処理して、ファイバーをより親水性にし、細胞付着を促進することができる。試料は、再閉鎖可能な（re-closeable）ポリエチレンバッグまたは同様のものに貯蔵することができる。
その代わりに、基材ファイバーは、セラミック材料から形成することができる。例示的なセラミック材料は、二酸化チタン（ＴｉＯ２）、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、二酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、チタン酸リチウム（Ｌｉ４Ｔｉ５Ｏ１２）、窒化チタン（ＴｉＮ）および白金（Ｐｔ）を限定することなく含む。一部の変形形態では、ナノファイバーは、ポリマーと混合された粒子として用意されたセラミック材料から作製される。
細胞集団が、基材材料内に、例えば、ナノファイバーの材料に含有される場合、これをポリマー溶液に添加し、次いで溶液をナノファイバーとなるようにエレクトロスピニングすることができる。その代わりに、細胞が、乾燥前にナノファイバー内に包埋、被包または他の仕方で含有されるように、ナノファイバーをエレクトロスピニングしつつ、細胞集団を別のノズル（繊維化先端）を介してスプレー（例えば、エレクトロスプレー）することができる。
作製されたら、ナノファイバーは、様々なサイズ、形状および幾何的形状の二次元（２Ｄ）または三次元（３Ｄ）基材を形成するように構成することができる。例えば、ナノファイバーを使用して、ＥＣＭ等の人工組織を構築することができる。ナノファイバーを使用して、メッシュまたはファイバーマットを形成することもできる。メッシュ、ファイバーマットまたはナノファイバーの収集物は、絆創膏、創傷包帯材、パッド、布巾（wipe）等に取り込むことができる。その代わりに、ナノファイバーを使用して、さらに後述する通り、フィルターまたは因子産生ユニットの成分を構築することができる。
ある特定の変形形態では、基材は、所望の基材形状を有する予め形作ったマンドレル（プレフォーム）におけるナノファイバーのエレクトロスピニングによって形成される。マンドレルをテフロン（登録商標）または同様の材料でコーティングして、沈着後の基材の除去を容易にすることができる。一変形形態では、マンドレル形状は、ネイティブの組織または臓器に基づく。ファイバーは典型的には、繊維化先端からポリマーおよび／またはセラミック溶液を押し出し、繊維化先端に近接して電場（electronic field）を生じ、
マンドレル内にアース端子または逆の極性を設置することにより形成される。マンドレルを回転させて、マンドレル上にファイバーを整列することができる、または第２のアース端子もしくは極性をマンドレルに配置して、電場の急速なスイッチングを行って、ファイバーを整列することができる。ナノスケールポリマーファイバーは、ランダムに整列することができる、もしくは実質的に平行にすることができる、またはその両方である。
ナノファイバー構造および本明細書に記載されている他の基材（例えば、フィルム、膜、メッシュ、シート、インプラント等）に、１つまたは複数の細胞型を含む細胞集団を播種して、因子産生ユニットを形成することができる。基材表面に細胞をアプライするための播種は、スプレー、エレクトロスプレー、ピペッティングおよびプリンティング等の公知方法によって達成することができる。一部の変形形態では、細胞は、基材上にエレクトロスプレーされる。他の変形形態では、細胞のエレクトロスプレーは、ナノファイバーのエレクトロスピニングと同時に行われて、ナノファイバー上に細胞を播種する、またはナノファイバー材料内に細胞を被包する（または分布させる）。なおさらなる変形形態では、細胞をポリマーおよび／またはセラミック材料と混合し、次いで、所望のサイズ、形状または幾何的形状の基材中に押し出すまたは射出成形することができる。細胞は、いずれか適した様式で、基材上またはその内に播種または分布させることができる。例えば、細胞は、基材上にあるパターンで配置することができる（例えば、対称または非対称パターンで）、または基材材料内に均一にもしくは不均一に分布させることができる。
基材またはナノファイバーは、基材への細胞付着の促進に効力がある少なくとも１つの化合物でコーティングまたは他の仕方で処理することもできる。この少なくとも１つの化合物は、タンパク質、ペプチド、サイトカイン、増殖因子、抗生物質化合物、脂質、抗炎症性化合物およびこれらの組合せからなる群から選択することができる。
ホローファイバー／ナノファイバーは、エレクトロスピニングによって作製することもできる。そこで、単一ノズルシステムを使用して、２種の溶液、典型的には、２種の異なるポリマー溶液をエレクトロスピンすることができる。第１のポリマーは、ファイバーのコアとみなされ、第２のポリマーは、ファイバーのシェルとみなされる。コア材料は一般に、エレクトロスピニング後に除去（例えば、加熱によって）されて、ホローファイバーを後に残すように構成された犠牲ポリマーである。
Ｄ．基材上における細胞の配置
細胞集団は、基材の表面にまたは基材の材料（例えば、基材の本体）内に配置することができる。基材がファイバーまたはナノファイバーを含む変形形態では、細胞集団は、ファイバーもしくはナノファイバーの表面および／またはファイバーもしくはナノファイバーによって形成された構造の表面に、またはファイバーもしくはナノファイバーそれ自体の材料内に配置することができる。基材表面に細胞をピペッティング、スプレー（エレクトロスプレーを含む）、プリンティングもしくはエンボス加工することにより、またはポリマー－細胞懸濁液を押し出す、射出成形するもしくは熱成形することにより、細胞集団を基材表面に配置することができる。基材上またはその内に細胞集団を含める他の仕方を用いることができる。一部の変形形態では、細胞集団をポリマー組成物に添加し、その結果得られるポリマー－細胞懸濁液をエレクトロスピニングして、細胞をファイバーのポリマー材料内に配置することができる。使用する基材および／またはファイバーの型、ならびに基材および／またはファイバー上またはその内に含まれる細胞の型を操作して、特定の使用適応のために因子産生ユニットによる因子産生をカスタマイズすることができる。例えば、因子が、美容用途に使用される場合、基材は、人工細胞外マトリックス、例えば、脂肪細胞外マトリックスとして配置された複数のナノファイバーを含むことができ、細胞集団は、間葉系幹細胞を含むことができる。別の変形形態では、因子は、人工細胞外マトリックスとして配置された複数のナノファイバーと、ｈＡＤＳＣとを含む因子産生ユニットによって産生される。
Ｅ．例示的な因子産生ユニット
例示的な一変形形態では、因子産生ユニットは、脂肪組織内に見出される細胞外マトリックスの構造を実質的に模倣するように形成されたナノファイバーを含む３Ｄ基材を含む。ＭＳＣならびに内皮細胞、マクロファージ、単球、周皮細胞、線維芽細胞、肥満細胞および免疫細胞を含有する間質血管画分は、この特定の基材上に配置し、培養し、１つまたは複数の因子を産生するように誘導することができる。１つまたは複数の因子を含有する馴化培地は、本明細書に提供される適用（例えば、美容組成物、例えば、皮膚若返り、創傷治癒のための美容組成物、または骨粗鬆症および関節炎等の腫瘍学、心血管、自己免疫性、神経変性、炎症性もしくは加齢性疾患等、医学的状態を処置するため）のうちいずれか１つまたは複数において使用することができる。
本発明の因子産生ユニットは、スタンドアロン型であり得る、またはより大型のシステムの一部、例えば、本明細書に記載されているアフェレーシスまたはプラスマフェレーシスシステムのうちいずれか１つの一部であり得る。図１０７を参照すると、因子産生ユニットは、閉鎖式システムの一部であり得る。図１０７において、因子産生ユニット（５００）は、個体の循環器系に接続して、この単位から放出された因子に個体を曝露するように構成されている。本明細書に記載されているいずれか適した因子単位は、閉鎖式システムの一部として含まれ得る。ここで、閉鎖式システムは、導管（５０２）と、導管（５０２）内の因子産生ユニット（５００）と、流体酸素負荷デバイス（５０４）と、流体、例えば、血液または血漿を因子産生ユニット（５００）に導入するための酸素負荷された流体入口（５０６）と、因子産生ユニット（５００）から流体を除去するための流体出口（５０８）と、温度支持チャンバー（５１２）と、試料収集出口（５１４）と、ヘパリンまたは他の薬物の投与のための注入ポンプ（５１６）とを含む。蠕動ポンプ（５１０）は、閉鎖式システムを巡る流体流動を駆動する。因子産生ユニット（５００）を巡る流体流動は、３７℃における約１．１０～１．３０ｍＰＡの血漿粘度で、約５０ｍｌ／分～約５００ｍｌ／分に及ぶことができる。場合により、閉鎖式システムを巡る流体流動は、約０．１ｍｌ／分～約５０ｍｌ／分に及ぶ。因子産生ユニット（５００）は一般に、約３７℃～約４０℃の間の温度を許容するように構成されている。温度支持チャンバー（５１２）は一般に、因子産生ユニット（５００）の温度を３７℃に維持する。
具体的には、図１０７における閉鎖式システムは、少なくとも６ｍｌの流体容量を収容する導管（５０２）を含む。導管は、他の流体容量を収容し得ることが理解される。因子産生ユニット（５００）は一般に、非ヘパリン結合性（例えば、約４１．５Ｕ／ｍｌのヘパリン濃度で）であり、ＤＭＳＯを許容する（例えば、重量で約７～１３％）医療グレードポリマー；および細胞、例えば、間葉系幹細胞で形成される。因子産生ユニット（５００）は、約１～３ｋＤに及ぶ、約３～６ｋＤに及ぶまたは６～５０ｋＤに及ぶ分子量を有する因子に対し透過性となるように構成され得る。因子産生ユニットは、５０ｋＤおよびそれを超える分子量を有する因子に対し透過性となることもできる。流体入口（５０６）を通って流動する流体はまず、例えば、約２１％Ｏ２、約５％ＣＯ２および約７４％Ｎ２を因子産生ユニット（５００）に提供する酸素負荷デバイス（５０４）を通過して、細胞生存率を支持することができる。試料ステーション（５１４）において収集される因子は典型的には、約０．２ｍｌ～約１ｍｌに及ぶ容量で収集される。
一部の変形形態では、因子産生ユニットは、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／１５３０１１に開示されている、エレクトロスピニングされたポリマーファイバーから形成された膜またはマットである。例えば、また、図１０５に示す通り、因子産生ユニットは、膜またはファイバーマット（基材）（３０２）として形成されたエレクトロスピニングされたポリマーファイバー（３００）を含むことができる。ファイバーは、幹細胞からの指導的サイトカイン、マトリカイン（matrikine）、栄養因子、メディエーター、ホルモ
ン、ならびに／または膜貫通および免疫細胞ドッキング受容体の放出による患者特異的免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の訓練のために、幹細胞（図示せず）を含有する。この例示的な変形形態を、例えば、免疫調節適用に使用して、例えば、上述の自己免疫性疾患の処置のためのＴｒｅｇの産生を増加させることができる。例えば、ファイバーマット（因子産生ユニット）が、プラスマフェレーシスシステム等、閉鎖式システムの一部である場合、ファイバーマットは、免疫細胞を含有する血漿に接触させるまたはその近くに配置することができる。ファイバーマット内の細胞は、免疫細胞をモジュレートするのにまたは免疫細胞に変化をもたらすのに有用な因子を血漿中に分泌することができる。幹細胞および／または免疫細胞は、収集および後の使用のために因子を産生することもできる。
ファイバーマットおよび幹細胞を含む因子産生ユニットは、上に記す通り、有用な免疫調節処置となり得る。そこでは、免疫細胞集団（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、樹状細胞または抗原提示細胞等）のアフェレーシスによってプールされた循環細胞、または凍結保存もしくは単離された細胞を、用意された培地内に配置し、ファイバーマットに付着させ、またはファイバーマットのごく近くに配置し、ｅｘ－ｖｉｖｏでファイバーマットから分泌された因子に曝露させて、細胞に変化をもたらす（細胞における免疫調節をもたらす）。次いで、これらの増強された免疫細胞が、マットから血漿へと放出され得、変化した細胞、例えば、成熟Ｔ細胞、活性化マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞等を含有する血漿を、用量依存性様式で個体に戻し送達することができる。個体への戻し送達は、免疫調節性細胞の注射によって行うことができ、血液循環に送達される医薬および医薬組成物と組み合わせて行うこともできる。
免疫調節性細胞および本明細書に記載されている因子含有組成物は、リンパ管に送達することができる（リンパ内投与）、またはこれらに限定されないが、皮下投与もしくは舌下投与、経口、経皮的（外用ワクチン接種）、真皮内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、鼻腔内、結膜、気管支内、経皮、直腸内、腹腔内、筋肉内、肺内、腟、直腸および眼球内等、他の経路によって送達することができる。免疫調節性細胞および因子含有組成物は、植え込み型デバイスによって送達することもできる。
一部の変形形態では、因子産生ユニットを使用して、Ｔｒｅｇの産生のための因子を送達することができる。
他の変形形態では、因子産生ユニットは、ファイバー壁内に捕捉された幹細胞を含有するホローポリマーファイバー（チューブ）によって形成された少なくとも１個のカートリッジを含む、逆向き（reverse）透析型システムの一部であり得る。幹細胞は、自家また
は同種異系間であり得る。図１０６Ａを参照すると、例示的なシステムは、平行して並ぶ複数のポリマーチューブ（４０４）を含むカートリッジ（４０２）を含む因子産生ユニット（４００）を含む。例示的な変形形態では、システムはまず、カートリッジ（４０２）を巡る循環のために、対象の血液を取り入れる。図１０６Ａにおけるポリマーチューブ（４０４）の１本の断面図である図１０６Ｂに示す通り、カートリッジ（４０２）のホローチューブ（４０４）を通過する血液（４０６）は、チューブ壁（４１０）を透過して、その中の捕捉された幹細胞（４０８）に接触し、これにより、チューブ（４０４）の内腔（Ｌ）へと因子を放出し血液（４０６）中に戻すことを可能にする。次いで、因子を有する血液を患者に戻すことができる。所望の因子投薬量が達成されるまで、このサイクルが反復されるであろう。これらの型のカートリッジは、さらに後述するプラスマフェレーシス型システムにおいて使用することもでき、その場合、細胞が血液から除去されて、血漿を形成し、血漿がカートリッジを循環する。血漿中に放出された因子は、患者への再導入に先立ち細胞と再度組み合わせることができる。同様の型のホローファイバーカートリッジは、Ｕ．Ｓ．８，１７２，７８４に開示されている。ホローチューブは、その壁内にポアを含むことができ、これにより、幹細胞からの因子の放出が可能になる。ポアは、チューブ壁内にいずれか適した様式で、例えば、至るところに均一に、または対称もしくは非対称パターンで配置することができる。いずれか適したポア直径を使用することもできる。他の事例では、ホローファイバー壁は、因子に対し透過性の材料で作製される。ポアと同様に、チューブ壁全体が透過性であっても、その部分のみが透過性であってもよい。ファイバー壁内に捕捉される代わりに、幹細胞は、ファイバー壁の内側および／または外側表面に播種および／または接着させることもできる。
一部の変形形態では、因子産生ユニットは、米国特許第４，９２９，３５４号に開示されている通り、プリーツのある円柱状膜を含むカートリッジを含むことができる。因子産生ユニットは、他の適した幾何的形状を有する膜を含むことができる。
その代わりに、因子産生ユニットは、基材を含むことができ、この基材は、Ｕ．Ｓ．９，０７４，１７２に開示される、ウェル（複数可）の表面に沈着した少なくとも１層のポリマーファイバーを有する単一またはマルチウェルプレートである。ポリマーファイバーは、その上での生物学的細胞の成長を促すことができ、よって、細胞培養に使用することができる。ポリマーファイバーは、エレクトロスピニングまたは３Ｄ－プリンティングによってウェル（複数可）の表面に沈着させることができる。
一部の変形形態では、因子産生ユニットは、プラスマフェレーシス型システムの成分であり、そこでは、血液が個体から除去され、身体の外側（体外）で血漿および血液細胞に分離され、血漿および細胞が個体に戻る前に、１つまたは複数の因子が、因子産生ユニットから血漿へと産生／分泌される。そこで、分離された血漿は、様々な因子産生ユニット、例えば、複数のファイバーを含むフィルターを巡って循環させて、個体への戻し送達のための血漿に１つまたは複数の因子を取り込むことができる。因子の送達は、薬物または遺伝子操作された生物製剤と組み合わせることもできる。
一変形形態では、体外循環のための装置は、１個または複数の区画を含むカートリッジまたは導管の形態の因子産生ユニットを含み、少なくとも灌流入口および灌流出口を有する。細胞集団は、細胞の維持に適した培地と細胞の灌流を可能にしつつ、生細胞に適した環境をもたらすカートリッジの区画内のマトリックス上に支持することができる。このような細胞区画は、例えば、ファイバーの外側での血液または血漿の循環によるホローファイバーまたは平坦なプレートであり得る；例えば、Ｕ．Ｓ．６，７５９，２４５を参照されたい。
因子産生ユニットが、免疫調節処置に使用される場合、これは、細胞収集単位の上流に配置することができる。この変形形態では、免疫細胞集団（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、樹状細胞または抗原提示細胞等）のアフェレーシスによってプールされた循環細胞もしくは血漿、または凍結保存もしくは単離された細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで因子産生ユニットによって分泌された因子に曝露させて、細胞に変化をもたらす。次いで、これらの増強された免疫細胞は、収集し、対象に戻し送達することができる。
本明細書に記載されている因子産生ユニットは、いずれかの型の幹細胞を含むことができる。一部の変形形態では、因子産生ユニットは、改変されたｈＡＤＭＳＣを含む。個体を処置する方法は、その循環器系をこれらの因子産生ユニットに接続し、これにより、インプット細胞によって産生された因子に個体（血液を介して）を曝露することにより達成することができる。
因子産生ユニットを含む装置は、限外濾過液発生器を使用して、血液の細胞成分から血漿を連続的に分離することもできる。限外濾過液（例えば、血漿）は、培養された幹細胞、例えば、ｈＡＤＳＣを含有するカートリッジを巡って循環させることができる。その代わりに、因子産生ユニットにおいて全血を処理することができる。
因子産生ユニットは、一般に、個体の血漿に向かうおよびそこから来る巨大分子および他の細胞由来産物の通過を可能にする材料でできた、半透性の関門を含有することができる。多くの変形形態では、細胞それ自体は、因子産生ユニットから出ないが、本発明は、そのように限定されてはいない。因子産生ユニットを巡る循環および１または複数の通過後に、処理された血液または限外濾過液（例えば、個体の血液の細胞成分と再度組み合わせることができる血漿）は、静脈アクセス経由で個体に戻すことができる。個体の血液または血漿は、ヘパリンを補充して、凝固を予防することができる。この循環は、例えば、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間等の治療期間において、連続的に維持することができる。血液または血漿は、因子産生ユニットにおける幹細胞から個体へと因子を運ぶことができる。
因子産生ユニットは、液体処理区画および細胞区画、ならびに任意選択で、液体処理区画および細胞区画を隔てる選択的透過性関門を含むこともできる。細胞リザーバは、因子産生ユニットの細胞区画と流体連絡することができ、細胞リザーバは、幹細胞、例えば、ｈＡＤＳＣの集団を含む。個体由来の血液または限外濾過液は、液体処理区画に入ることができ、ここで、幹細胞によって分泌された薬剤が、幹細胞および血液もしくは限外濾過液の間の直接的接触、または存在する場合は任意選択の選択的透過性関門を越えた薬剤の通過のいずれかによって、血液または限外濾過液に入る。
図１００は、例示的な因子産生ユニットの模式図を図解する。複数のカートリッジ（２）を有し、改変された（例えば、若返り誘導された）ｈＡＤＳＣを含有し得る因子産生ユニット（１）が、本明細書に記載されている。この例において、因子産生ユニット（１）は、酸素負荷された流体供給部（４）から酸素負荷された流体を導入するための酸素負荷された流体入口（３）と、酸素負荷された流体出口（３’）と、ポンプ（６）によって免疫単離単位（７）から因子産生ユニットへと供給される生物学的液体を導入するための液体入口（５）と、免疫単離単位（７）に戻るために１つまたは複数の因子を含有する生物学的液体を因子産生ユニットから除去するための液体出口（５’）とを含む。個体（９）由来の血液は、ポンプ（６’）を経由してプラスマフェレーシス単位（８）へと流動し、次いでここから、血漿の部分が、ポンプ（６’’）を経由して免疫単離単位（７）へと流動する。個体（９）へと流動して戻る前に、処理された血漿（１つまたは複数の因子により）は、免疫単離単位（７）から流動し、プラスマフェレーシス単位（８）由来の血液と混合される。
図１０１を参照すると、因子産生ユニットの別の例が、模式的形態で示されている（Ｕ．Ｓ．７，１６０，７１９およびＵ．Ｓ．８，１７２，７８４を参照）。システム（１０）は、１つまたは複数の因子の産生のための改変されたｈＡＤＳＣを含む外部因子産生ユニット（ＦＰＵ）（４２）によって表される。血液または血漿は、生体液入口経路（３２）を経由して因子産生ユニット（４２）を巡って流動することができ、１つまたは複数の因子の導入後に、生体液出口経路（３３）を経由して出ることができる。例えば、カテーテルを使用して、哺乳動物の血流を、生体液入口通路（３２）を経由してＥＢ（４２）と流体連絡するように配置することができる。一部の変形形態では、装置は、限外濾過液（ＵＦ）発生器（４１）を含む。これらの場合、哺乳動物（５１）由来の血液は、血液通路（３１）に沿ってＵＦ発生器（４１）へと流動し、ここで、細胞成分が血漿から分離される。次いで、限外濾過された血漿は、通路（３２）に沿ってＥＢ（４２）へと流動する一方、細胞成分は、通路（３４）を経由して処理されたＵＦに再び加わる。次いで、生体液は、通路（３５）を経由して哺乳動物（５１）または生体液リザーバに戻る。
図１００および１０１は、因子産生ユニットの様々な成分を、特異的な配向および同様の寸法で描写しているが、成分は、いずれの配向、サイズまたは形状であってもよい。
逆向き透析システムまたはプラスマフェレーシスシステムを巡る個体の血漿の流速は、必要に応じて、例えば、約５０～５００ｍｌ／分、例えば、５０、１００、２００、３００、４００および５００ｍｌ／分の速度に調整することができる。一部の変形形態では、流速は、分泌された因子の、幹細胞（例えば、ｈＡＤＳＣ）から限外濾過液への通過を最適化するために調整されるであろう。一部の変形形態では、標的流速は、１７５ｍｌ／分となるであろう。個体の処置（例えば、因子産生ユニットを巡る個体の血漿の循環）は、治療的に有効な時間、例えば、１時間～７２時間の間、例えば、約２、３、４、５、１０、１２、１５、１８、２０または２３時間続けることができる。個体は、複数ラウンドの改変されたｈＡＤＳＣ治療法を受けることができ、各ラウンドは、例えば、１時間～２４時間の間持続する。この治療法は、例えば、個体または個体の医療提供者によって決断される、所望の治療因子の用量または効果が達成されるまで続けることができる。
因子は、誘導後の他の既定の時点で収集することができる。その代わりに、因子産生ユニット、例えば、ホローファイバーカートリッジを巡る血漿もしくは血液の循環のための既定の持続時間、または因子産生ユニットを巡る流動サイクルの数は、個体が受ける因子の量（用量）をカスタマイズするために予め決定することができる。
細胞によって生成された因子は、血液、血漿または培養培地へと放出され得る。因子は、因子産生ユニット、例えば、ホローファイバーカートリッジを巡って流動する血液、血漿もしくは培養培地へと放出され得る、または因子産生ユニット、例えば、エレクトロスピニングされたナノファイバー細胞外マトリックスが培養されている培地へと放出され得る。因子産生ユニット培養または流動血液／血漿／培地への因子産生ユニットの曝露の持続時間および因子産生ユニットに含まれる細胞の型に応じて、異なる因子および／または異なる量（用量）の因子が産生され得る。したがって、因子の製造は、因子産生ユニットの特定の組成およびその培養または流動血漿／培地への曝露の持続時間に基づき制御または個別調整することができる。因子産生ユニットが、流動血液／血漿／培地に曝露される場合、因子の産生および投薬は、流動サイクル数に基づき個別調整することもできる。
他の変形形態では、因子産生ユニットは、組み込むことができる（例えば、組み込まれた細胞チャンバーにより）、または幹細胞を保持／培養するための１個もしくは複数の取り外し可能なカートリッジを使用するように構成することができる。カートリッジは、単回使用（使い捨て）または反復使用のために構成することができる。いくつかの適したカートリッジ構成が、本技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，２７０，１９２号；同第７，１６０，７１９号；同第６，８５８，１４６号；同第６，５８２，９５５号；同第６，７５９，２４５号；同第８，１７２，７８４号；DixitおよびGitnick、Eur. J.
Surg. Suppl.（５８２巻）：７１～６頁（１９９８年）；ならびにLegallaisら、J. Memb. Sci.１８１巻：８１～９５頁（２００１年）を参照されたい。このようなカート
リッジは、例えば、ホローファイバーまたは平坦なプレートを含むことができる。半透膜を使用して、処理しようとする生体液を細胞から分離することができ、このような膜は、カートリッジの一部、例えば、カートリッジの外部壁を形成することができる。カートリッジは、因子産生ユニットに挿入されるように、例えば、因子産生ユニットの一部または因子産生ユニット全体として構成することができる。したがって、因子産生ユニットは、より大型のシステムの一部であり得る。
図１０２は、いくつかのホローファイバー（１４０）と、入口（１１０）と、出口（１２０）とを含有するホローファイバーカートリッジ（１００）によって表される、例示的な因子産生ユニットの模式的図解である。ホローファイバーは、半透性であり、幹細胞、例えば、ｈＡＤＳＣによって分泌された因子の血液または血漿への通過を可能にする。
図１０３は、図１０２の線Ａ－Ａにおける因子産生ユニット（１００）の断面図であり、キャピラリ外部（extracapillary）空間（１５０）に囲まれた内部キャピラリ内腔（１３０）を有するホローファイバー（１４０）を図解する。ホローファイバー因子産生ユニットにおいて、血液もしくは血漿がキャピラリ外部空間（１５０）を巡って流動しながら、幹細胞が内腔（１３０）に存在し得る、または逆もまた同じである。
図１０４は、半透膜（２３０）によって隔てられた液体処理区画（２１０）および細胞区画（２２０）を含む、平坦なプレートまたは２区画因子産生ユニット（２００）によって表される、別の例示的な因子産生ユニットの模式的図解である。血液または血漿は、通路（２５０）に沿って液体処理区画（２１０）を巡って流動する。細胞区画（２２０）は、幹細胞、例えば、若返り誘導されたｈＡＤＳＣ（２４０）を含む。同様の型の単位は、Ｕ．Ｓ．６，７５９，２５４にさらに詳細に記載されている。
例示的な一変形形態では、因子産生ユニットは、改変されたｈＡＤＳＣに由来する因子を送達するように構成された装置であって、第１の区画と；第２の区画と；第１の区画および第２の区画を隔てる選択的透過性関門と；第２の区画内のｈＡＤＳＣの集団であって、ｈＡＤＳＣにおけるＳＩＮＥ／ＡＬＵレトロトランスポゾン転写物のレベルまたは活性が、前記ｈＡＤＳＣに対する増殖能および／または多分化能の誘導または回復に十分な量まで低下され、さらに、細胞における因子の産生が増強されるように、ｈＡＤＳＣが、インターロイキン－２（ＩＬ－２）にｈＡＤＳＣを曝露することにより誘導されている、集団と；第１の区画に接続された流体入口および流体出口であって、第１の区画および個体の血流の間の流体連絡を可能にする流体入口および出口とを含む装置を含む。
選択的透過性関門は、ホローファイバーの束を含むことができる。その代わりにまたはその上、装置は、血液（または血漿）を濾過するため、および／または第１の区画と連絡する前に第２の区画からの流体を濾過するための１個または複数のフィルターを含むことができる。第２の区画は、装置に取り外し可能に接続することができるカートリッジとして構成され得る。カートリッジは、本明細書に記載されている処置の前およびその最中にｈＡＤＳＣを生きた健康な状態で維持するための支持を含むこともできる、装置の残り部分に即時（snap）接続され得る。
これらの装置のいずれかは、ポンプ、チャネル、フィルター等を含む流体取扱い成分を含むこともできる；例えば、これらの装置のいずれかは、第１の区画を巡って血液または血漿を循環させるように構成されたポンプを含むことができる。これらの装置のいずれかは、第１の区画と流体連絡したフィルターを含むことができる。
その代わりに、因子産生ユニットは、その内に複数のポリマーファイバーを含有する基材を含むことができる。これらのポリマーファイバーは、エレクトロスピニングによって作製することができる。本発明のファイバー基材は、異なるサイズおよび形状の、ならびに使い捨てまたは永続的な（すなわち、再利用可能な）因子産生ユニットと共に使用することができる。これらの基材におけるポリマーファイバーは、互いと比べてランダムに配置することもできる、または互いに整列することができる。因子産生ユニットの幾何的形状に応じて、ファイバー基材は、因子産生ユニット壁もしくは他の表面に接着していても、または因子産生ユニットに含有された細胞培養培地中に浮遊している分散した個々のファイバーであってもよい。因子産生ユニットにポリマーファイバーを接着させるために、ファイバーは、因子産生ユニットの裏に負の電荷を持つ基材を配置することにより、表面に直接的に沈着させることができる。この技法は、因子産生ユニット表面における正の電荷を持つファイバーの均一な沈着を可能にする。その代わりに、ファイバーは、接着剤、熱、レーザー溶接、超音波溶接または他の方法により因子産生ユニット壁に付着させることができる。
例示的な変形形態では、処置方法は、本明細書に記載されている因子産生ユニットのいずれかを使用して、ｈＡＤＳＣを使用するステップを含む。例えば、処置方法は、前記ｈＡＤＳＣに対する増殖能および／または多分化能の誘導または回復に十分な量で、抽出されたｈＡＤＳＣにおけるＳＩＮＥ／Ａｌｕレトロトランスポゾン転写物のレベルまたは活性を低下させるステップと；インターロイキン－２（ＩＬ－２）にｈＡＤＳＣを曝露して、因子の産生を増強することにより、ｈＡＤＳＣ（若返った、以前にＳＥＮ－ｈＡＤＳＣであったまたはＳＲ－ｈＡＤＳＣのいずれかまたは両方）を誘導するステップと；インターロイキン－２（ＩＬ－２）にｈＡＤＳＣを曝露して、因子の産生を増強することにより、ｈＡＤＳＣ（若返った、以前にＳＥＮ－ｈＡＤＳＣであったまたはＳＲ－ｈＡＤＳＣのいずれかまたは両方）を誘導するステップと；因子産生ユニット装置を個体に接続するステップであって、因子産生ユニット装置が、選択的透過膜によって隔てられた第１の区画および第２の区画を含み、第２の区画が、ｈＡＤＳＣを含む、ステップと；個体の血液または血漿に、第１の区画を通過させて、第２の区画におけるｈＡＤＳＣによって産生された因子に血液または血漿を曝露するステップとを含むことができる。個体への装置の接続は、因子産生ユニット装置の入口および出口を介した、個体の循環器系への装置の接続を含むことができる。
なおさらなる変形形態では、処置方法は、個体に因子産生ユニットを接続するステップであって、因子産生ユニットが、選択的透過膜で隔てられた第１の区画および第２の区画を含み、第２の区画が、前記ｈＡＤＳＣに対する増殖能および／または多分化能の誘導または回復に十分な量で、ｈＡＤＳＣにおけるＳＩＮＥ／Ａｌｕレトロトランスポゾン転写物のレベルまたは活性を低下させることにより若返ったｈＡＤＳＣの集団を含み、さらに、ｈＡＤＳＣが、因子の産生を増強するようにインターロイキン－２（ＩＬ－２）への曝露によって誘導されているステップと；個体の血液または血漿に、第１の区画を通過させて、第２の区画におけるｈＡＤＳＣに血液または血漿を曝露するステップとを含むことができる。
これらの方法のいずれかは、個体からｈＡＤＳＣを抽出するステップ、または凍結保存後のｈＡＤＳＣを得るもしくは復活させるステップを含むことができる。個体は、ｈＡＤＳＣまたはｈＡＤＳＣの抽出物が投与される同じ個体であり得る（例えば、自家処置）。
他の方法は、疾患（例えば、ＭＳＣ処置の恩恵を被ることができる上述の疾患のいずれか）を有する個体を識別するステップと、液体処理区画および細胞区画、ならびに液体処理区画および細胞区画を隔てる選択的透過性関門を含む、個体由来の血液または血漿を処理するための因子産生ユニットを用意するステップであって、細胞区画が、若返り誘導されたｈＡＤＳＣの集団を含むステップと、因子産生ユニットにおけるｈＡＤＳＣに個体の血漿または血液を曝露するステップとを含むことができる。
ＩＩＩ．因子の使用および送達
因子を送達する方法についても本明細書に記載されている。インプット細胞によって、例えば、本明細書に提供される因子産生ユニットにおいて因子が産生されたら、因子を種々の仕方で個体に送達することができる。送達方法は一般に、因子により製剤化された組成物の種類に依存する。１つまたは複数の因子は、舌下投与、経口、静脈内、注射による、外用、経皮、経皮的（外用ワクチン接種）、真皮内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、鼻腔内、結膜、気管支内、経皮、直腸内、腹腔内、筋肉内、肺内、腟、直腸もしくは眼球内による、またはＣＳＦもしくはリンパ内投与による等、従来の経路によって送達することができる。
例示的な変形形態では、１つまたは複数の因子は、プラスマフェレーシス等、アフェレーシス型の送達を使用して送達される。プラスマフェレーシスが行われる場合、血液は、個体から除去され、身体の外側（体外）で血漿および血液細胞に分離され、１つまたは複数の因子が、血漿および細胞が個体に戻る前に、血漿に添加される。そこで、分離された血漿は、本明細書に記載されている因子産生ユニットを巡って循環して、個体に戻し送達するための血漿に１つまたは複数の因子を取り込むことができる。因子の送達は、薬物または生物製剤と組み合わせることもできる。
因子は、経口剤形へと製剤化される場合、錠剤、カプセルまたはそれを覆うコーティングとして；溶解性フィルムとして；経口スプレー；等として経口送達することができる。
因子が、静脈内剤形へと製剤化される場合、因子は、溶液として静脈内送達することができる。注射用組成物は、例えば、皺、特定の皮膚層または腫瘍塊への因子の局所的投与のために、シリンジ、イメージガイド針または他の有針（needled）デバイス（例えば、
マイクロニードルパッチ）により送達することができる。一部の変形形態では、針内腔を通って送達される代わりに、因子は、針（複数可）にコーティングされ、針（複数可）が組織内に配置されたときに放出される。
一部の変形形態では、因子は、インプラントと併せて与えられる。組成物がインプラントである場合、組成物は、特定の身体部位または組織内に植え込む／配置することができる。因子の持続放出は、植え込み型組成物および本明細書に記載されている他の組成物により達成することができる。
その代わりに、因子は、皮膚または粘膜表面に外用適用される組成物へと製剤化することができ、水ベースのゲルまたはペースト、軟膏、皮膚科学的使用のためのクリーム（無水または含水）、セラム、ローション（無水または含水）、エマルション、スプレー、溶液、エアロゾル、スティック（固体クリーム）、フィルム、絆創膏、タオレット（towellete）、粉末、皮膚スプレー、鼻または喉スプレー、経口点滴薬、点眼薬、点耳薬、塗布
可能なフィルム形成組成物、および経皮パッチを限定することなく含む。
外用適用される場合、皮膚への因子の送達は、事前に行われる（preformed）様々な皮
膚表面処置によって増強または支援され得る。皮膚表面処置は、因子適用に先立ち行うことができる。例えば、皮膚表面処置は、因子適用の二（２）時間前までに、一（１）時間前までに、３０分前までに、１５分前までに、１０分前までに、または５分前までに行うことができる。皮膚表面処置は、皮膚剥離、レーザーリサーフェシングおよびケミカルピールを限定することなく含むことができる。一部の変形形態では、皮膚表面処置は、マイクロニードル適用を含む。マイクロニードル適用は、いずれか適したダーマローラーにより達成することができる。ダーマローラーは、ローラーの周りに列を成して配置されたマイクロニードルが散りばめられたドラム形のローラーを一般に含む市販のデバイスであり、このマイクロニードルは、約０．５～１．５ｍｍの長さおよび０．１ｍｍの直径である。皮膚の上を転がすと、ダーマローラーは、外用適用された組成物のより優れた浸透を可能にする開口部を皮膚に作る。そこで、ダーマローラーによるマイクロニードル適用は、皮膚内への因子の浸透を増強するために、また、微小な傷害を作るために、因子組成物の外用適用に先立ち行うことができ、これは、炎症性／治癒過程を誘発して、皮膚の若返りおよび皮膚外観の改善において有益なコラーゲンおよび他の物質を産生する。次いで、送達された因子は、ケラチノサイトを誘導して、ＰＤＧＦ、ＩＬ－１、ＴＧＦ－αおよびＴＧＦ－βが挙げられるがこれらに限定されない、増殖因子を産生することができ、これは、皮膚線維芽細胞の増殖および活性化においてパラクリン効果を発揮し、皮膚再生および皮膚細胞外マトリックスのリモデリングをもたらすことが示された。
因子組成物は、以前に記述した通り、外用組成物であり得る。例示的な外用組成物として、水ベースのゲルまたはペースト、軟膏、クリーム（無水または含水）、セラム、ローション（無水または含水）、エマルション、スプレー、溶液、エアロゾル、スティック（固体クリーム）、フィルム、絆創膏、タオレット、粉末、皮膚スプレー、鼻または喉スプレー、経口点滴薬、点眼薬、点耳薬、塗布可能なフィルム形成組成物、および経皮パッチが挙げられるがこれらに限定されない。
クリームは、油／水エマルションである。クリームは、典型的には、ワックス、ペトロラタム、鉱油その他等の固定油、炭化水素その他を含む油相（内相）、ならびに水および添加された塩等のいずれかの水溶性物質を含む水相（連続相）からなる。この２相は、乳化剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等の表面活性剤；アカシアコロイド粘土、ビーガム（veegum）その他等の親水性コロイドの使用によって安定化される。エマルションの形成後に、活性成分（例えば、因子（複数可）または馴化培地）が通例、所望の濃度を達成する量で添加される。
ゲルは、油質基剤、水またはエマルション懸濁液基剤から選択される基剤を含む。基剤へと、基剤にマトリックスを形成するゲル化剤が添加され、その粘度を増加させる。ゲル化剤の例は、ヒドロキシプロピルセルロース、アクリル酸ポリマーその他である。通例、活性成分（例えば、因子（複数可）または馴化培地）は、ゲル化剤の添加に先行する時点において、所望の濃度で製剤に添加される。
軟膏は一般に、（１）油質基剤、すなわち、白色ワセリンもしくは鉱油等の固定油もしくは炭化水素からなる基剤、または（２）吸収（absorbant）基剤、すなわち、無水物質
もしくは水を吸収することができる物質、例えば、無水ラノリンからなる基剤のいずれかを使用して調製される。通例、油質であれ吸収剤であれ、基剤の形成後に、活性成分（例えば、因子（複数可）または馴化培地）が、所望の濃度をもたらす量で添加される。
セラムは、色が鮮やかなことが多い、水様性またはより粘度がある液体であり得る。セラムは、水ベースであり、その稠度を軽くする。セラムは、他のセラムおよびクリームまたはローションの下に層形成することができ、皮膚ケアレジメンに取り込むために非常に柔軟な製品となる。個体が、成分のいずれかに対し感受性がない限りにおいて、セラムは、あらゆる皮膚型により十分に耐容される。セラムは、グリセロールまたはグリセリンを含むことができる。
本発明の一部の組成物は、閉塞、生体接着剤または薬理学的作用をもたらす他の添加物もしくはデバイスを必要としない薄い均一なフィルムとして適用することができる。製剤は、スワブ、アプリケーターパッド、シリンジ延展器、または薄いフィルムにおける液体の適用を意図する同様のデバイスを含む物理的機械的手段により適用することができる。
組成物は、浸透賦活薬、界面活性物質、油脂、多価アルコール、低級アルコール、増粘剤、ＵＶ吸収剤、光散乱剤、保存料、抗酸化剤、抗生物質、キレート化剤、ｐＨ調節薬、調味料、色素および水等、薬科学で一般的に使用される添加物と共に所望の通りに製剤化することができる。
因子組成物における使用に適した浸透賦活薬として、次のクラスのいずれかに由来する賦活薬が挙げられるがこれらに限定されない：脂肪アルコール、脂肪酸（直鎖状または分枝鎖状）；テルペン（例えば、モノ、ジおよびセスキ（sequi）テルペン；炭化水素、ア
ルコール、ケトン）；脂肪酸エステル、有機酸、エーテル、アミド、アミン、炭化水素、アルコール、フェノール、ポリオール、界面活性物質（アニオン性、カチオン性、非イオン性、胆汁酸塩）。
界面活性物質の非限定例として、ポリオキシエチレン（以降、ＰＯＥ－オクチルドデシルアルコールおよびＰＯＥ－２－デシルテトラデシルアルコール等のＰＯＥ－分枝鎖アルキルエーテルと省略）、ＰＯＥ－オレイルアルコールエーテルおよびＰＯＥ－セチルアルコールエーテル等のＰＯＥ－アルキルエーテル、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノイソステアレートおよびソルビタンモノラウレート等のソルビタンエステル、ＰＯＥ－ソルビタンモノオレエート、ＰＯＥ－ソルビタンモノイソステアレートおよびＰＯＥ－ソルビタンモノラウレート等のＰＯＥ－ソルビタンエステル、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレートおよびグリセリルモノミリステート等のグリセロールの脂肪酸エステル、ＰＯＥ－グリセリルモノオレエート、ＰＯＥ－グリセリルモノステアレートおよびＰＯＥ－グリセリルモノミリステート等のグリセロールのＰＯＥ－脂肪酸エステル、ＰＯＥ－ジヒドロコレステロールエステル、ＰＯＥ－硬化ヒマシ油、ＰＯＥ－硬化ヒマシ油イソステアレート等のＰＯＥ－硬化ヒマシ油脂肪酸エステル、ＰＯＥ－オクチルフェノールエーテル等のＰＯＥ－アルキルアリールエーテル、グリセロールモノイソステアレートおよびグリセロールモノミリステート等のグリセロールエステル、ＰＯＥ－グリセロールモノイソステアレートおよびＰＯＥ－グリセロールモノミリステート等のＰＯＥ－グリセロールエーテル、ジグリセリルモノステアレート、デカグリセリルデカステアレート、デカグリセリルデカイソステアレートおよびジグリセリルジイソステアレート等のポリグリセロール脂肪酸エステルならびに他の非イオン性界面活性物質；ミリスチン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ベヘン酸、イソステアリン酸およびオレイン酸等の高級脂肪酸のカリウム塩、ナトリウム塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、アミノ酸塩および他の塩、エーテルカルボン酸の上述のアルカリ塩、Ｎ－アシルアミノ酸の塩、Ｎ－アシルサルコネート（salconate）、高級アルキルスルホネートならびに他のアニ
オン性界面活性物質；アルキルアミン塩、ポリアミン、アミノアルコール脂肪酸、有機シリコーン樹脂、アルキル四級アンモニウム塩および他のカチオン性界面活性物質；ならびにレシチン、ベタイン誘導体および他の両性界面活性物質が挙げられる。
油脂の例として、ヒマシ油、オリーブ油、カカオ油、ツバキ油、ココナツ油、ウッドワックス（wood wax）、ホホバ油、ブドウ種子油およびアボカド油等の植物性油脂；ミン
ク（mink）油および卵黄油等の動物性油脂；蜜ろう、鯨ろう（whale wax）、ラノリン、カルナウバろうおよびカンデリラろう等のワックス；液体パラフィン、スクアレン、微結晶性ワックス、セレシンワックス、パラフィンワックスおよびワセリン等の炭化水素；ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸およびベヘン酸等の天然または合成脂肪酸；セタノール、ステアリルアルコール、ヘキシルデカノール、オクチルデカノールおよびラウリルアルコール等の天然または高級アルコール；ならびにイソプロピルミリステート、イソプロピルパルミテート、オクチルドデシルミリステート、オクチルドデシルオレエートおよびコレステロールオレエート等のエステルが挙げられる。
多価アルコールの例として、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、１，３－ブチレン（butyrene）グリコール、１，４－ブチレン（butyrene）グリコール、ジプロピレングリコール、グリセロール、ジグリセロール、トリグリセロール、テトラグリセロールおよび他のポリグリセロール、グルコース、マルトース、マルチトース（maltitose）、スクロース、フルクトース、キシリトース（xylitose）、ソル
ビトール、マルトトリオース、トレイトール（threitol）ならびにエリスリトールが挙げられる。
増粘剤の例として、アルギン酸ナトリウム、キサンテンガム、ケイ酸アルミニウム、マルメロ種子エキス、トラガカントゴム、デンプン、コラーゲンおよびヒアルロン酸ナトリウム等の天然起源の高分子物質；メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、可溶性デンプンおよびカチオン化セルロース等の半合成高分子物質；ならびにカルボキシビニルポリマーおよびポリビニルアルコール等の合成高分子物質が挙げられる。
ＵＶ吸収剤の例として、ｐ－アミノ安息香酸、２－エトキシエチルｐ－メトキシシンナメート、イソプロピルｐ－メトキシシンナメート、ブチルメトキシベンゾイルメタン、グリセリル－モノ－２－エチルヘキサノイル－ジ－ｐ－メトキシベンゾフェノン、ジガロイルトリオレエート、２，２’－ジヒドロキシ－４－メトキシベンゾフェノン、エチル－４－ビスヒドロキシプロピルアミノベンゾエート、２－エチルヘキシル－２－シアノ－３，３’－ジフェニルアクリレート、エチルヘキシルｐ－メトキシシンナメート、２－エチルヘキシルサリシレート、グリセリルｐ－アミノベンゾエート、ホモメチルサリシレート、メチルｏ－アミノベンゾエート、２－ヒドロキシ－４－メトキシベンゾフェノン、アミルｐ－ジメチルアミノベンゾエート、２－フェニルベンゾイミダゾール－５－スルホン酸および２－ヒドロキシ－４－メトキシベンゾフェノン－５－スルホン酸が挙げられる。
保存料の例として、ベンゾエート、サリシレート、ソルベート、デヒドロアセテート、ｐ－オキシベンゾエート、２，４，４’－トリクロロ－２’－ヒドロキシジフェニルエーテル、３，４，４’－トリクロロカルバニリド、塩化ベンザルコニウム、ヒノキチオール、レゾルシノールおよびエタノールが挙げられる。
抗酸化剤の例として、トコフェロール、アスコルビン酸、ブチルヒドロキシアニソール、ジブチルヒドロキシトルエン、ノルジヒドログアイアレチン酸（guaiaretic acid）およびプロピルガレートが挙げられる。
キレート化剤の例として、エデト酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムが挙げられる。
上述に加えて、適した媒体、担体およびアジュバントは、水、ワセリン、ペトロラタム、鉱油、植物油、動物油、有機および無機ワックス、キサンタン、ゼラチン、セルロース、コラーゲン、デンプン等のポリマー、カオリン、カラゲナン、アラビアゴム、合成ポリマー、アルコール、ポリオールその他を含む。担体は、リポソーム（lypizome）、マイクロスポンジ、マイクロスフェアもしくはマイクロカプセル等の持続放出担体、水性ベースの軟膏、油中水型もしくは水中油型エマルション、ゲルまたは同様のものを含むこともできる。
因子組成物中に含まれ得る追加的な薬剤は、ビタミン、抗酸化剤、ミネラル、エキス、コエンザイムＱ１０、キャビアエキス、シイタケエキス、トリペプチド（ＳＹＮ－ＡＫＥ）、Ｍａｔｒｉｘｙｌ ３０００（パルミトイルオリゴペプチドおよびパルミトイル－テトラペプチド－７）（Ｓｅｄｅｒｍａ，Ｉｎｃ．、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）、ならびにアルファ－トコフェロール（ビタミンＥ）、メラニン、ビタミンＣ、ビタミンＡ、レチニルプロピオネート（proprionate）、レチノイン酸、ビタミンＤ３、ニコチンアミド（ビタミ
ンＢ）、ナイアシンアミド（niacinaminde）（Ｖｉｔ Ｂ３）、ｄ－パンテノール、ヒアルロン酸、セラミドまたは海藻（藻類）エキス等の他の化合物である。
場合により、界面活性物質、油および／または他の賦形剤等の物質と組み合わせた場合、因子は不安定になる。これらの場合、因子は、凍結乾燥し、使用前に１０％ヒアルロン酸に溶解することができる組成物へと製剤化することができる。
ＩＶ．製造品
本願は、本明細書に記載されているデバイスまたは組成物のうちいずれか１つを含む製造品も提供する。
例示的なキットは、パッケージまたは容器内に次のうちの１つまたは複数を含有することができる：（１）因子産生ユニットカートリッジ；（２）１つまたは複数の薬学的に許容されるバッファー；ならびに（３）ｈＡＤＳＣ等の幹細胞を改変および／または添加するための説明書を含む、因子産生ユニットカートリッジを設置するための説明書。
本明細書に提供される因子組成物のいずれかの送達による使用のための、ダーマローラー、マイクロニードル、クリームおよび経皮パッチも、本明細書に提供される。
本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその均等物によってのみ限定されることから、本明細書に用いられている用語法が、単に特定の実施形態を説明する目的で使用されており、限定を意図しないことを理解されたい。次の実施例は、説明を目的とする。これらは、本発明のある特定の態様および実施形態を示すことを意図するが、いかなる様式においても本発明を限定することを意図しない。
（実施例１）
材料および方法
この実施例は、実施例２～９で後に使用される材料および方法を提供する。
ＭＳＣの単離、培養および特徴付け
この研究で使用されたＭＳＣは、ＵＣＳＤ医療センター、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、でルーチンの脂肪吸引手技を受けた３２歳および４９歳の健康な成人女性ドナーから得られたヒト脂肪組織から単離した。ＭＳＣ単離プロトコールは現地の倫理委員会の承認を得、前述の通りに実行した。単離した脂肪由来幹細胞株は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で成長させた。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙによって設定されたＭＳＣ最小定義基準により、フローサイトメトリー分析は、ｈＡＤＳＣがＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現するが、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｓｅ、ＵＳＡからの抗体）を発現しないことを示した。形態学的分析は、細胞が線維芽細胞様形態を示し、プラスチック粘着性であり、市販の分化培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で脂肪生成、軟骨形成および骨形成分化が可能なことを示した。累積集団倍加（ＰＤ）は、培養での成長日数の関数としての複数の継代にわたるＰＤ＝ｌｏｇ（Ｎ／ＮＯ）×３．３３として計算し、ここで、ＮＯはフラスコに平板培養した細胞の数であり、Ｎはこの継代で回収された細胞の数である。全ての実験で、ｈＡＤＳＣのＰＤ４またはＰＤ６のＳＲ集団ならびにＳＥＮ集団のＰＤ４１および４５が使用された。組換えＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＵＳＡ）による処置は、Deenick EK、Gett AV、Hodgkin PD（２００３年）Stochastic model of T cell proliferation: a calculus revealing IL-2 regulation of precursor frequencies, cell cycle time, and survival. J Immunol１７０巻：４９６３～４９７２頁に記載されるように実行した。２０Ｕ／ｍｌの
ＩＬ－２を、３７℃で２４時間培養培地に加えた。
老化関連のＳＡ－βガラクトシダーゼアッセイ
ｐＨ依存性の老化関連β－ガラクトシダーゼ活性（ＳＡ－（βＧａｌ）の発現をモニタリングするアッセイを、製造業者のキット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）に記載されるように、およびWang J、Geesman GJ、Hostikka SL、Atallah M、Blackwell Bら（２０１１年）Inhibition of activated pericentromeric SINE/ALU repeat transcription in SEN human adult stem cells reinstates self-renewal. Cell cycle１０巻
：３０１６～３０３０頁で以前に公開されている通りに実行した。培養されたｈＡＤＳＣをＰＢＳで室温で１５分間洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄し、３７℃で一晩Ｘ－Ｇａｌ含有補助剤で染色した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、顕微鏡（Ｎｉｋｏｎｓ、ＴＥ３００、ＤＸＭ１２００デジタルカメラ、Ｊａｐａｎ）を使用して画像を捕捉した。
遊走および浸潤アッセイ
トランスウェルフィルターはＣｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ａｃｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）からのものであり、使用した全てのサイトカインはＰｅｐｒｏｔｅｃｈ
Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ、ＵＳＡ）から得た。遊走アッセイは、８ｍｍ厚のトランスウェルチャンバーを使用して、Perez LM、Bernal A、San Martin N、Galvez BG（２０１３年）、Arch Physiol Biochem１１９巻：１９５～２０１頁に記載されるように実行した。トランスウェル遊走アッセイのために、１．０×１０４個の細胞を８０ｕｌの無血清アルファ－ＭＥＭに懸濁し、８ｍｍ孔径フィルターを含有する２４ウェルトランスウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳＡ）の上部チャンバーに播種した。下部チャンバーに、６００ｕｌのＤＭＥＭまたはサイトカイン：ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α、ＨＭＧβ１を含有する培地を加えた。使用濃度は：５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８およびＨＭＧβ１；（Perezら、２０１３
年、Arch Physiol Biochem１１９巻：１９５～２０１頁）に記載されているように３０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ－αであった。ｈＡＤＳＣを３７℃で１６時間インキュベートした。上部チャンバーに保持された細胞はスワブによって除去し、フィルターを通して遊走したものは室温で２０分間４％パラホルムアルデヒドで固定し、５％トルイジンブルーで一晩染色した。細胞は、下側で数えた；明視野顕微鏡（Ｎｉｋｏｎｓ、ＴＥ３００、ＤＸＭ１２００デジタルカメラ、Ｊａｐａｎ）を使用して、５つの異なるランダムに選択された１０×視野で。これらの実験は、ＳＲまたはＳＥＮ集団のいずれかの３２歳および４１歳の２名のドナーのｈＡＤＳＣで行い、各ドナーは３回を超えて試料採取した。
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）
ｈＡＤＳＣ（ＳＲまたはＳＥＮ）を１０ｃｍ２のシャーレあたり１０５個の細胞密度で平板培養し、ＩＬ－２の２０Ｕ／ｍＬで２４時間処置し、未処置対照は、Deenick EK、Gett AV、Hodgkin PD（２００３年）Stochastic model of T cell proliferation:
a calculus revealing IL-2 regulation of precursor frequencies, cell cycle time, and survival. J Immunol１７０巻：４９６３～４９７２頁に既述の通
りである。次に、ＭｅｍＰＥＲ Ｐｌｕｓ＃８９８４２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者のプロトコールに従って使用して、細胞膜に会合しているタンパク分画を調製した。ヒトＩＬ－２ＲアルファおよびヒトＩＬ－２ＲベータＥＬＩＳＡキット＃ＥＬＨ－ＩＬ－２Ｒａおよび＃ＥＬＨ－ＩＬ－２Ｒｂ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）をそれぞれ使用して、ＩＬ－２受容体アルファおよびベータの濃度の測定を得た。標準（組換えＩＬ－２受容体アルファおよびベータ）ならびに実験試料の光学密度はＳＰＥＣＴＲＡ Ｍａｘ Ｐｌｕｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって４５０ｎｍで測定し、濃度は製造業者のプロトコールに記載されるように計算した。
リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ｈＡＤＳＣから全ＲＮＡを単離した。ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ＵＳＡ）を使用して、ｃＤＮＡを次に合成した。リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）は、ＴａｑＭａｎ装置を使用して実行した。発現レベルは２－ΔΔＣｔとして計算し、ここで、相対発現はベータ－アクチン遺伝子発現への正規化によって決定した。全てのアッセイを３反復で実行し、ｃＤＮＡのない陰性対照試料を使用した。ｑＰＣＲのためのプライマーは、以下の通りだった：
Figure 2022140711000001
Figure 2022140711000002
Figure 2022140711000003
Figure 2022140711000004
Figure 2022140711000005
Figure 2022140711000006
 転写分析
Deenick EK、Gett AV、Hodgkin PD（２００３年）Stochastic model of T cell proliferation: a calculus revealing IL-2 regulation of precursor frequencies, cell cycle time, and survival. J Immunol１７０巻：４９６３～４９７２頁に既述の通りに、ＩＬ－２処置および未処置（対照群）のＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣで転写分析を実行した。４つの異なる条件：それぞれＩＬ－２刺激の有る無しのＳＲまたはＳＥＮ細胞の分析のために、図３Ａに示す２つの遺伝子型を使用した。各実験条件のためにＤＭＥＭ Ｆ１２培地に同じ量（１０６個）の細胞を播種し、Deernickら２００３年に既述の通り、２０Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＵＳＡ）を２４時間培地に直接的に加えることによってＩＬ－２処置を実行した。製造業者の説明書に従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用して、全ＲＮＡを試料から単離した。２名の異なる患者からの試料を関連する条件のために一緒に合わせ、ＲＮＡ ＨＳアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を使用してＲＮＡ濃度をＱｕｂｉｔ２．０蛍光計で測定した。
製造業者の説明書に従って、Ｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）システム（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）の上で配列決定のためのライブラリーを構築するために、各試料の全ＲＮＡの１００ｎｇを使用した。ｒＲＮＡ消去およびＲＮＡ－ｓｅｑライブラリー構築の前に、品質管理分析のためにＥＲＣＣ ＲＮＡ Ｓｐｉｋｅ－Ｉｎ対照ミックス（Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を全ＲＮＡに加えた。ＥＲＣＣ ＲＮＡ Ｓｐｉｋｅ－Ｉｎ対照ミックスは、天然の真核生物ｍＲＮＡを模倣する長さ２５０～２０００ｎｔの９２個の転写物を含有する。製造業者によって提供されるプロトコールに従って、全ＲＮＡの１００ｎｇをｓｐｉｋｅ－ｉｎの１：１０００の希釈で２ｕｌのＭｉｘｌに加えた。その後、Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ Ｒｉｂｏｍｉｎｕｓ真核生物システムｖ２（Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）でｒＲＮＡ消去を実行した。ｃＤＮＡライブラリーをＩｏｎ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ－ｓｅｑキットｖ２（Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）で構築し、Ｉｏｎ Ｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡ－ｓｅｑバーコード（Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でバーコード化した。ライブラリーのサイズ分布および数量化は、バイオアナライザー２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）で実行した。ライブラリーの配列決定はＰ１チップを有するＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）システムで実行し、各ライブラリーは３回配列決定をした。
ＲＮＡ－ｓｅｑデータ分析
個々のＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）システムの配列決定実行からのＲＮＡ－ｓｅｑ読み取りデータを、４つの条件の各々のために合わせた。配列読み取りデータは、Ｔｏｒｒｅｎｔ Ｍａｐｐｉｎｇ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔプログラム（ＴＭＡＰ、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、参照ヒトゲノムアセンブリーｈｇｌ９（ＧＲＣｈ３７）にマッピングした。４つの条件特異的な合わせたＲＮＡ－ｓｅｑ実行の品質は、製造業者のウェブサイトから得たＥＲＣＣ ｓｐｉｋｅ－ｉｎ ＲＮＡ配列の予想されたカウントを、同じ配列にマッピングされるＲＮＡ－ｓｅｑタグの観察されたカウントに対して比較することによって評価した。初期の遺伝子発現レベルは、個々のＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ遺伝子モデル（ｃ）のためのエクソンマッピング読み取りデータの合計としてとり、低発現遺伝子（１００万あたりの読み取りカウントデータが＜１）は以降の分析から除去した。各ライブラリーについて、個々の遺伝子発現レベルを、ベータ－アクチン（ＡＣＴＢ）発現レベル（ｃＡＣＴＢ）および各遺伝子の全エクソン長ｌを使用して正規化した。ライブラリーｊのために、ベータ－アクチン（beta-acting）正規化因子ｓｊを、
Figure 2022140711000007
 として計算し、ライブラリーｊの遺伝子ｉの最終正規化発現値を、
Figure 2022140711000008
 として計算した。
ライブラリーの対の間の差次的遺伝子発現分析を、プログラムＧＦＯＬＤ ｖ１．１．３、Feng J、Meyer CA、Wang Q、Liu JS、Shirley Liu Xら、（２０１２年）GFOLD: a generalized fold change for ranking differentially expressed genes
from RNA-seq data. Bioinformatics２８巻：２７８２～２７８８頁を使用して実行した。複製データセットの非存在下で差次的に発現された遺伝子の特徴付けにおいて実証されたその優れた性能に基づいて、ＧＦＯＬＤを選択した。ＧＦＯＬＤ分析は、条件間の差次的遺伝子発現の程度を測定するスコアを与える；差次的に発現された遺伝子をここで規定するために、推奨された±０．０１のＧＦＯＬＤスコアカットオフを使用した。ライブラリーの対の間の差次的に発現された遺伝子に関する、機能の濃縮についての分析（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）は、プログラムＧＳＥＡ ｖ２．１．０を使用して実行した。具体的には、ＳＲ、ＳＥＮまたは両方でのＩＬ－２処置の後に上方調節または下方調節される複数の遺伝子を含有する個々の経路は、このように識別した。ノードが経路に対応し、端が経路間で共有される遺伝子の存在に対応するネットワークを使用して、差次的に調節された遺伝子（ＳＲおよび／またはＳＥＮで上方調節されたＩＬ－２＋とＳＲおよび／またはＳＥＮで下方調節されたＩＬ－２＋）の特異的セットのための個々の経路を関連付けた。
図９は、ＲＮＡ－ｓｅｑ実験の品質管理のために使用されたＥｘｔｅｒｎａｌ ＲＮＡ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＥＲＣＣ、外部ＲＮＡ対照の一般的なセット）用量応答を示す。４つの条件特異的ＲＮＡ－ｓｅｑプールの各々について、ＥＲＣＣ
ｓｐｉｋｅ－ｉｎ ＲＮＡ配列の予想されたカウントを、同じ配列にマッピングされるＲＮＡ－ｓｅｑタグの観察されたカウントに対して回帰させた。回帰およびピアソン相関ｒ値の形状によって示されるように、観察されたカウント対予想されたカウントは非常に相関しており、高品質ＲＮＡ－ｓｅｑ結果と一致していた。
（実施例２）
ＭＳＣ老化表現型の特徴付け
この実施例で、ＩＬ－２シグナル伝達に応答したヒト脂肪由来ＭＳＣ（ｈＡＤＳＣ）の転写活性に及ぼす複製老化の影響を評価するために実行された試験を記載する。
ＩＬ－２は、３つのＩＬ－２Ｒサブユニット：ＩＬ－２Ｒａ（ＣＤ２５）、ＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２）およびＩＬ－２Ｒｇ（ＣＤ１３２）の様々な組合せによって形成される細胞表面受容体の３つのクラスにより、特異的受容体を通してシグナル伝達する。実験結果は、ｈＡＤＳＣが全３つの受容体を転写により発現するが、ｈＡＤＳＣでのＩＬ－２Ｒａのタンパク質発現はＩＬ－２Ｒβで見られるより低いことを示す。これらの観察は、ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２ＲγアイソフォームからなるＩＬ－２受容体組成物が、ｈＡＤＳＣによる支配的な形態のＩＬ－２サイトカインの認識を媒介することができることを示す。ｈＡＤＳＣの複製加齢により受容体組成物はわずかに変化するだけであり、ＩＬ－２へのｈＡＤＳＣの応答性はそれらの老化により変化しないことを示す。
ｈＡＤＳＣを単離し、上記のように培養した。ｅｘ ｖｉｖｏ複製老化は、減少した増殖、ＤＮＡ傷害および形態学的変化の蓄積につながった：ｈＡＤＳＣは不規則で平らな形状を伴って大いにより大きくなり、核は、位相差顕微鏡法において多くの封入体および埋積の顆粒状細胞質外観を伴ってより限局性になった。２名の異なる患者から得られたｈＡＤＳＣの成長曲線を、図３Ａに示す。線形成長速度、ＳＲ、または細胞株がそれらの増殖を停止するとき、ＳＥＮ、のいずれかのｈＡＤＳＣについての老化関連のＳＡ－βガラクトシダーゼ活性についての一般的な染色を、図３Ｂに示す。
（実施例３）
ＳＥＮ－ＭＳＣは、遊走のより高い傾向を示す
下の材料および方法のセクションに記載されている通り、トランスウェルシステムを使用しサイトカインおよび増殖因子のセットを使用して、遊走アッセイを実行した。複製老化を経た脂肪由来ＭＳＣが、遊走のより高い傾向を示すことが観察された。ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣが、それらのＳＲ対応物より有意に高い基底遊走能力を示すことが観察された（図３Ｃ）。図３Ｃは、ＳＲ（左）およびＳＥＮ（右）のｈＡＤＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ遊走アッセイを示す。黒線は中央値を示し、ひげは値の範囲を示す。表されるように、統計的差はｐ値（ｐ）によるＴ検定によって評価した。
さらに、異なるサイトカイン化学誘引物質へのＳＥＮ－ｈＡＤＳＣの応答を測定した。ｈＡＤＳＣは、初期の継代と比較して後期の継代で遊走する能力が増加することが観察され（図３Ｄ）、複製老化が、試験した化学誘引物質に応答してｈＡＤＳＣの遊走特性を増加させることを示す。ＩＬ－２はＳＥＮ－ＭＳＣに対して最も強力な化学走性刺激剤であったが、ＴＮＦ－αはこれらの実験で試験した化学誘引物質の間でより強力でなかった（図３Ｄ）。図３Ｄは、自己再生ＳＲ（左）および老化ＳＥＮ（右）ｈＡＤＳＣの遊走を示す。ｈＡＤＳＣは、異なるサイトカイン（５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＨＭＧＢｌ；３０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ）の存在下で遊走するように誘導された。グラフは、１０件の独立実験（ｎ＝１０）の平均を表す。実験測定に関するＰ値（ｐ）は、グラフの下に列挙する。
総合すると、これらのデータは、複製老化がｈＡＤＳＣの遊走特性を改変し、炎症性環境へのＭＳＣの応答に影響して、それらの免疫調節出力に影響することができることを示した。
（実施例４）
複製老化の際のヒト脂肪由来ＭＳＣにおけるＩｌ－２刺激への差次的応答
ｑＰＣＲによるＩＬ－２受容体アイソフォーム発現の評価は、ｅｘ ｖｉｖｏ複製老化の際のＩＬ－２ＲｇおよびＩＬ－２Ｒβと比較してＩＬ－２Ｒαアイソフォームの発現の有意な変化を実証した（図４Ｂ）。図４Ｂは、非刺激（ＩＬ－２－）ＳＲ細胞（第１のバー）およびＳＥＮ細胞（第３のバー）における、ならびに２０ｕｇ／ｍｌの組換えＩＬ－２（ＩＬ－２＋）による刺激の際（ＳＲ細胞、第２のバー；ＳＥＮ細胞、第４のバー）の、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって評価したＩＬ－２受容体α、βおよびγを示す。データは、変化倍率（ΔΔＣＴ）として示す。３件の独立実験からの平均±ＳＤを示す。注目すべきことに、ＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣの両方で、ＩＬ－２処置の後にＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒａ転写物の蓄積の増加が記録されたが、ＳＥＮ細胞を類似の処置に供したときにＩＬ－２Ｒａ発現は抑止された（図４Ｂ）。
しかし、細胞膜に会合しているＩＬ－２Ｒα受容体のタンパク質レベル発現は反対のパターンを示すことをデータは示した（図４Ｃ）。図４Ｃは、ＩＬ－２ＲαおよびＩＬ－２Ｒβの細胞膜に会合しているレベルを示す。レベルは、非刺激（ＩＬ－２－）ＳＥＮ（第３のバー）およびＳＲ（第１のバー）ｈＡＤＳＣ、ならびに２０ｕｇ／ｍｌの組換えＩＬ－２（ＩＬ－２＋）による刺激の後のＳＥＮ（第４のバー）およびＳＲ（第２のバー）において、ＥＬＩＳＡによって数量化した。データは、ミリリットルあたりのピクトグラムで表す。結果は、３件の独立実験の平均である（平均±ＳＤ）。統計的有意性はｔ検定によって推定し、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊はｐ＜０．０１、＊はｐ＜０．０５であった。
ＩＬ－２受容体アイソフォームの転写状態は２つの異なる細胞状態（ＳＲおよびＳＥＮ）の間で異なるが、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定したときにそれはＩＬ－２曝露（誘導）に依存しないようである（上の材料および方法で記載されている）。図４Ｃに示すように、データは、ＩＬ－２α受容体鎖をコードするタンパク質が、ＩＬ－２Ｒβアイソフォームほど豊富でないことも実証した（１２０ｐｇ／ｍｌのＩＬ－２Ｒαを、ｅｘ ｖｉｖｏ複製老化の際の３５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ－２Ｒβと、ｌ５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ－２Ｒαおよび４４０ｐｇ／ｍｌのＩＬ－２Ｒβと比較する）。これらのデータは、ＩＬ－２刺激へのｈＡＤＳＣ応答が、ＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２）および一般的なＩＬ－２Ｒｇ（ＣＤ１３２）で構成される中間体親和性受容体ダイマーを通して起こることを示す。
ＩＬ－２は、ＳＴＡＴ５ＡおよびＳＴＡＴ５Ｂを活性化するためにＪＡＫ１およびＪＡＫ３を通してシグナル伝達し、さらにＲａｓ－ＭＡＰキナーゼおよびホスホイノシトール３－キナーゼ依存性シグナル伝達経路を使用する。ＩＬ－２の下流標的ＳＴＡＴ５の発現は、図５、７Ａおよび７Ｂならびに図１０Ａおよび１０Ｂの表に示す。ｈＡＤＳＣでは、ＳＴＡＴ５Ａ遺伝子転写とＳＴＡＴ５Ｂ遺伝子転写の両方は、ＩＬ－２／ＳＴＡＴ５シグナル伝達軸をたどる。
図５は、ＩＬ－２によるＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣの刺激の効果を図示する。ＩＬ－２は、ＩＬ－２シグナル伝達ＳＴＡＴ５遺伝子のメディエーターのｍＲＮＡを上方調節する。ＳＴＡＴ５ＡおよびＳＴＡＴ５ＢのｍＲＮＡ発現は、非刺激（ＩＬ－２－）ＳＲ（第１のバー）およびＳＥＮ細胞（第３のバー）において、ならびに２０ｕｇ／ｍｌの組換えＩＬ－２（ＩＬ－２＋）による刺激の際（ＳＲ＋ＩＬ－２、第２のバー；ＳＥＮ＋ＩＬ－２、第３のバー）に、定量的ＲＴ－ＰＣＲによって評価した。データは、変化倍率（ΔΔＣＴ）として示す。３件の独立実験からの平均±ＳＤを示す。ｑＰＣＲプライマーの位置を、図式で表す。統計的有意性はｔ検定によって推定し、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊はｐ＜０．０１であった。
ＩＬ－２およびその下流標的ＳＴＡＴ５がｅｘ ｖｉｖｏでそれらの複製老化の際にｈＡＤＳＣで転写転帰にどのように影響するかについて、次に調査した。
ＩＬ－２への曝露は、複製老化の際にヒトＭＣＳで遺伝子発現の改変をもたらした。ＩＬ－２／ＳＴＡＴ５軸への転写応答がｅｘ ｖｉｖｏでｈＡＤＳＣの複製加齢の際にどのように変化するかについて対処するために、実施例１に記載し、図８Ａに示した通りにＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）システムを使用してＲＮＡ－ｓｅｑトランスクリプトーム分析を実行した。４つの条件（ライブラリー）にわたるｈＡＤＳＣでの遺伝子発現レベルを比較した：正常なｅｘ ｖｉｖｏ培養の際の自己再生（ＳＲ ＩＬ－２－）、２４時間の組換えＩＬ－２刺激の際の自己再生（ＳＲ ＩＬ－２＋）、正常なｅｘ ｖｉｖｏ培養の際の複製老化（ＳＥＮ ＩＬ－２－）および２４時間の組換えＩＬ－２刺激の際の複製老化（ＳＥＮ ＩＬ－２＋）。各状態を表す４つの条件のための全読み取りカウントデータの分布を、図８Ｂに示す。
条件間で遺伝子発現レベルを正規化するために、ベータ－アクチン発現レベルを使用した（実施例１に記載されるように）。ＩＬ－２処置の後に全体の遺伝子発現レベルが変化することができるという事実を認めるために、このアプローチがとられた。ベータ－アクチン正規化遺伝子発現分布は、ＳＲ状態とＳＥＮ状態の両方でのＩＬ－２処置の後の遺伝子発現の全体的上方調節を明らかにする（図８Ｄ）。しかし、４つの条件の間の個々の遺伝子発現レベルの比較は、ＩＬ－２処置がＳＲ－ｈＡＤＳＣと比較してＳＥＮ－により有意に影響することを示す（図６Ａ）。図６Ａは、条件特異的遺伝子発現プロファイルの比較に基づく条件間のペアワイズの距離を示す階層的クラスタリングを示す。個々の遺伝子発現レベルを比較したとき、ＳＲ ＩＬ－２－およびＳＲ ＩＬ－２＋条件は緊密な集団になり、ＳＥＮ ＩＬ－２－条件が後に続く。ＳＥＮ ＩＬ－２＋条件は、個々の遺伝子発現レベルの実質的に発散したパターンを示す、４つの条件の間の外れ値である。これは、老化の後のｈＡＤＳＣでのＩＬ－２処置への生物学的応答が、ＩＬ－２に応答した広域の転写脱調節を通してＭＳＣ機能を有意に妨害することができることを示す。
ＳＲ状態とＳＥＮ状態の両方でＩＬ－２処置に応答して差次的に発現され、上方および下方調節される個々の遺伝子を識別するために、発現レベルを条件間でさらに比較した（図６Ｂ）。図６Ｂは、ＩＬ－２処置の際に上方調節および下方調節される遺伝子の数を示すベン図である。ＳＲとＳＥＮ－ｈＡＤＳＣの両方において、ＩＬ－２処置の際に下方調節される遺伝子（２，２９６個）と比較していくつかのより多くの遺伝子（８，８６６個）が上方調節される。両方の状態で下方調節される遺伝子（４％）と比較して、ＳＲとＳＥＮ－ｈＡＤＳＣの両方で上方調節される遺伝子の割合（３５％）は実質的により高い。ＩＬ－２処置の際のＳＥＮ－ｈＡＤＳＣで下方調節される遺伝子（１，７３９個）で最も大きな非対称が見られる；そのような遺伝子は、ＳＲ ＩＬ－２＋条件で見られるよりずっと多い（６４９個）。ＳＥＮ ＩＬ－２＋条件の全体的発散がＩＬ－２処置の際に下方調節される遺伝子に大きく起因することをこの差は示し、これは、ＩＬ－２処置の際のＳＲとＳＥＮの両方にわたる全体的上方調節を考慮すると予想外の結果である（図６Ｂおよび図８Ｄ）。
図６Ｃ～６Ｄは、ＩＬ－２処置の後に上方調節（図６Ｃ）および下方調節（図６Ｄ）される遺伝子の発現レベルを示すヒートマップを示す。正規化された遺伝子発現レベルは、グレイスケールでヒートマップとして示す。群は、ＳＲだけで、ＳＥＮだけで、または両条件で上方または下方調節される遺伝子に対応する。
まとめると、これらのデータは、活発に増殖するＳＲ細胞で存在するのと同じ程度に、ＩＬ－２処置に応答して協調調節変化を生成する能力をＳＥＮ－ｈＡＤＳＣが失ったことを示す。ＳＥＮ ＩＬ－２－と比較してＳＲ ＩＬ－２＋で見られる上方調節された遺伝子の数がより多いことは、この解釈と整合する。
図１０Ａは、ＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣでＩＬ－２処置の際に上方調節される遺伝子が濃縮された生物学的経路を示す表（図１０Ａ）を示す。図１０Ａで、濃縮された経路を、経路に属する個々のＩＬ－２＋上方調節された遺伝子および経路濃縮有意レベルと一緒に示す。ＳＲで上方調節される遺伝子メンバーの経路は左の欄に示し、ＳＥＮで上方調節される遺伝子メンバーの経路は右の欄に示す。ＳＲとＳＥＮの両方で上方調節される遺伝子メンバーの経路を上の列に、続いてＳＥＮだけで上方調節される遺伝子メンバーの経路を、および最後にＳＲだけで上方調節される遺伝子メンバーの経路を示す。ＳＲで上方調節される経路（左の欄）およびＳＥＮで上方調節される経路（右の欄）を関連付けるネットワークを示す。ネットワークノードは経路を表し、ノードのサイズはその経路で上方調節された遺伝子の数に対応する。経路が上方調節された遺伝子を共有する場合には経路ノードは端で接続し、端重量は経路間で共有される上方調節された遺伝子の数に対応する。
図１０Ｂは、ＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣでＩＬ－２処置の際に下方調節された遺伝子が濃縮された生物学的経路を図示する。濃縮された経路を、経路に属する個々のＩＬ－２＋下方調節された遺伝子および経路濃縮有意レベルと一緒に示す。ＳＲで下方調節される遺伝子メンバーの経路は左の欄に示し、ＳＥＮで下方調節される遺伝子メンバーの経路は右の欄に示す。ＳＲとＳＥＮの両方で下方調節される遺伝子メンバーの経路を上の列に、続いてＳＥＮだけで下方調節される遺伝子メンバーの経路を、および最際にＳＲだけで下方調節される遺伝子メンバーの経路を示す。ＳＥＮで下方調節される経路（左の欄）を関連付けるネットワークを示す。ネットワークノードは経路を表し、ノードのサイズはその経路でのＳＥＮ下方調節された遺伝子の数に対応する。経路がＳＥＮ下方調節された遺伝子を共有する場合には経路ノードは端で接続し、端重量は経路間で共有される下方調節された遺伝子の数に対応する。
（実施例５）
Ｉｌ－２刺激後のｈＡＤＳＣの栄養特性は、ｅｘ ｖｉｖｏ複製加齢に感受性である
図７Ａ～７Ｄは、機能的にコヒーレントなセットの遺伝子の間の、ＩＬ－２処置の際のＳＲおよびＳＥＮ細胞の遺伝子発現レベルを図示する。（図７Ａで）栄養因子、（図７Ｂで）抗炎症性および免疫調節性、（図７Ｃに示すように）抗アポトーシス性および転移促進性、ならびに（図７Ｄに示すように）遊走および血管新生促進性であると特徴付けられる遺伝子のセットについて、発現レベルを示す。正規化された遺伝子発現レベルは、グレイスケールでヒートマップとして示す。
表１は、ＳＥＮおよびＳＲ細胞でのＩＬ－２処置の際の栄養因子の差次的発現を示す。ＳＲ ＧＦｏｌｄ値は、ＩＬ－２で処置されていないＳＲ細胞と比較して、ＩＬ－２で処置したＳＲ細胞での差異倍率を表す；ＳＥＮ ＧＦｏｌｄ値は、ＩＬ－２で処置されていないＳＥＮ細胞と比較して、ＩＬ－２で処置したＳＥＮ細胞での差異倍率を表す。
Figure 2022140711000009
Figure 2022140711000010
ＩＬ－２による刺激の際のｈＡＤＳＣでの増殖因子の発現が、ｅｘ ｖｉｖｏで複製老化の後に有意な変化に供されることを、データは示した。活発に増殖する（ＳＲ）ｈＡＤＳＣのＩＬ－２への曝露は間質細胞由来因子２（ＳＤＦ２）およびＳＤＦＬ２ならびにプロスタグランジンＥシンテターゼ２（ＰＴＧＥＳ２）などの分裂誘起タンパク質の発現増加をもたらしたが、ＳＲとＳＥＮ－ｈＡＤＳＣの両方は、トランスフォーミング増殖因子アルファおよびベータ（ＴＧＦａ、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２）、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体ＴＧＦＢＲ２およびトランスフォーミング増殖因子ベータ受容体関連タンパク質ＴＧＦＢＲＡＰｌ、ならびにトランスフォーミング増殖因子ベータ誘導（ＴＧＦＢＩ）の有意な増加が特徴である（図７Ａおよび表６Ａ～６Ｄ）。
さらに、ＳＲとＳＥＮ ＩＬ－２刺激ｈＡＤＳＣの両方は、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ－１）、ＬＩＦ、ＩＬ－１１、ＩＬ－１７Ｄ、ＩＬ－１βおよび腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーＴＮＦＳＦ１３Ｂ、Ｂ細胞およびＴ細胞機能を刺激するサイトカインコード遺伝子の上方調節が特徴であった（図７Ａ、７Ｂおよび図１０Ａ～１０Ｂ）。
パラクリンＩＬ－１７Ｄが内皮細胞でＩＬ－６、ＩＬ－８およびＧＭ ＣＳＦ遺伝子の発現を誘導すること、ならびに、ＩＬ－１βが線維芽細胞増殖因子活性（ＴＧＦａ、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２遺伝子はＩＬ－２曝露ｈＡＤＳＣで顕著に上方調節される）をオートクリンおよびパラクリン様式で刺激すること、加えてこれらの細胞からＩＬ－２の放出を誘導することによる胸腺細胞およびＢ細胞の増殖および成熟を刺激することを考慮すると、ＳＲとＳＥＮ－ｈＡＤＳＣの両方の転写状態が、複雑な調節フィードバックループを通したＩＬ－２曝露の後のこれらの細胞の強化された免疫調節特性を指し示すことができることを、データは示す。
ＩＬ－２に曝露させたＳＲとＳＥＮ－ｈＡＤＳＣの両方は、トランスフォーミング増殖因子アルファおよびベータ（ＴＧＦａ、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２）、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体ＴＧＦＢＲ２およびトランスフォーミング増殖因子ベータ受容体関連タンパク質ＴＧＦＢＲＡＰｌ、ならびにトランスフォーミング増殖因子ベータ誘導（ＴＧＦＢＩ）遺伝子の発現の有意な増加が特徴である（図７Ａ）。
さらに、ＳＲ細胞で観察されなかったｈＡＤＳＣの老化の後の増殖因子のＩＬ－２依存的発現における本質的な差も注目された。これは、ＦＧＦ２、ＦＧＦ５、ＦＧＦ７などの他のメンバーの下方調節を伴う、線維芽細胞増殖因子ファミリーメンバー（ＦＧＦ１、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１４）のサブセットの上方調節を含む（図７Ａ、表１および表６Ａ～６Ｄ）。
ＩＬ－２に曝露させたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣは、ＥＧＦ ｍＲＮＡの上方調節を特徴とするが、その受容体ＥＧＦＲへのｍＲＮＡの下方調節も、血清応答因子ＳＲＦおよびＷＮＴシグナル伝達ＳＦＲＰ１の分泌されるモジュレーターの発現の低下とともにその特徴とする。創傷治癒を促進する間葉系起源の細胞のための強力な分裂促進因子ＰＤＧＦＡとその受容体ＰＤＧＦＲＡの発現の両方は、ＩＬ－２の曝露に供したＳＲ細胞と比較してＳＥＮ－ｈＡＤＳＣで有意に抑制される（図７Ａ、図１０Ａ、表１および表６Ａ～６Ｄ）。
これらの細胞免疫調節特性をｅｘ ｖｉｖｏで、および最終的にｉｎ ｖｉｖｏで妨害し得るｈＡＤＳＣでのＩＬ－２媒介転写応答の性質における老化関連の差を、これらのデータは明らかにした。
ＩＬ－２処置、他の薬物と組み合わせたＩＬ－２およびＩＬ－２に曝露させたヒトＭＳＣのための抗炎症性および免疫調節性マーカーのパネルを示す（表２）。
ＩＬ－２処置と未処置のＳＲおよびＳＥＮ細胞を比較した差次的遺伝子発現分析は、ＩＬ－２刺激の際に上方または下方調節される個々の遺伝子の識別を可能にした。ＩＬ－２刺激に対する協調細胞性応答の生物学的な現実を捕捉しようとして、統合した遺伝子セット濃縮および経路ネットワークアプローチを使用して、ＩＬ－２処置のＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣで上方または下方調節されると指定された遺伝子を分析した。これを行うために、上方または下方調節された遺伝子について統計学的に濃縮された経路を識別し、それらが共通する差次的に発現された遺伝子に基づいて次に選択した（図１０Ａ～１０Ｂ）。各経路で差次的に発現された遺伝子の数および異なる経路が差次的に発現された遺伝子のセットを共有する程度に基づいて、経路ネットワーク表示に重み付けした。このアプローチは、多数の機能的に関係のある経路ならびに機能的に関連するネットワーク下部構造を有する高度に接続したネットワーク構造の識別を可能にした。
ｈＡＤＳＣの老化の後、生存、遊走および増殖などの重要な細胞性機能を調節する、増殖を促進する（細胞周期経路、ｑ値＝ｌ．５４ｅ－５）、Ｇ２チェックポイントを課す（Ｇ２経路、ｑ値＝５．９４ｅ－４）遺伝子経路、ｐ５３経路（ｑ値＝ｌ．１８ｅ－２）、主なシグナル伝達ＭＡＰＫ経路（ＭＡＰＫ、ｑ値＝２．４２ｅ－４）およびその主サブグループＥＲＫ経路（ＥＲＫ、ｑ値＝２．６２ｅ－２）に対して、ＩＬ－２は刺激性がより低い。分析は、ＰＤＧＦ誘導ＡＫＴおよびＥＲＫ経路が、ＭＳＣ自己再生を促進するために増殖および分化の対立する運命決定を調節するとの以前の知見に対するさらに確証となる。これらの経路を代表する遺伝子の活性化は、活発なＳＲ－ｈＡＤＳＣのｅｘ ｖｉｖｏでのＩＬ－２曝露の後だけに観察されたが、それらのＳＥＮ対応物では観察されなかった（図１０Ａ、左側）。
データは、発癌性状況でのＭＳＣの機能性に関する情報も提供する。ＩＬ－２に曝露させたＳＲとＳＥＮ－ｈＡＤＳＣの両方は、トランスフォーミング増殖因子アルファおよびベータ（ＴＧＦ□、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２）、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体ＴＧＦＢＲ２およびトランスフォーミング増殖因子ベータ受容体関連タンパク質ＴＧＦＢＲＡＰｌ、ならびにトランスフォーミング増殖因子ベータ誘導（ＴＧＦＢＩ）遺伝子の発現の有意な増加が特徴である（図７Ａ）。分泌されたＴＧＦＰは、ＣＤ＋４Ｔ細胞の分化を促進し、免疫サーベイランスを阻害し、それによって免疫抑制を課すことによって、免疫系の調節において重要であると考えられている。しかし、ＩＬ－２への曝露の後の脂肪由来ヒトＭＳＣでのＴＧＦＰ発現のより高いレベルは、発癌を促進し得る。ＴＧＦＰシグナル伝達経路の一部はがん細胞で突然変異していることが示されているので、これは、ＴＧＦＰによって誘導される細胞周期ブロック、分化またはアポトーシスからがん細胞が逃避することを可能にし、一方で、周囲の間質、免疫、内皮および平滑筋細胞は、がん細胞微小環境において増殖の強力なサプレッサーならびに免疫抑制および血管新生を引き起こす分化のトリガーとしてＴＧＦＰシグナル伝達を依然として読み取る。
ＩＬ－２処置ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣでは、ＭＳＣに生存有利性を提供することが証明されている、炎症（ＩＬ－６経路、ｑ値＝５．５５ｅ－３）およびＥＧＦシグナル伝達（ｑ値＝２．３３ｅ－４）と関連する経路のために、顕著な上方調節された遺伝子が濃縮される。ＩＬ－２に曝露させたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣは、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－６およびＩＬ－１２（図７Ｂ）、リンパ球からのＩＬ－１７を刺激することが公知のサイトカインの発現の増加も特徴とする。データは、リンパ球がＩＬ－１７産生の唯一の供給源であること、および炎症誘発性環境に供したとき、特にそれらの老化の後のＭＳＣがＩＬ－１７の高い転写活性を示すことも示す（図７Ａ）。
血管新生ＶＥＧＦ経路（ｑ値＝５．２４ｅ－３）（図１０Ａ、右側および図７Ｄ）との観察された関係およびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣの遊走能力の強化（図３Ａ、３Ｂ）は、ＩＬ－２に曝露させたＳＥＮ－ＭＳＣが、腫瘍形成環境および転移を支持するのに必要な特性を獲得し得ることを示すことができる。さらに、複製老化の後のｈＡＤＳＣでの一酸化窒素合成酵素経路（ｉＮＯＳ）ＮＯＳｌ経路（ｑ値＝８．３２ｅ－２）に含まれる遺伝子の上方調節は、老化を経るＭＳＣが、免疫抑制を通して転移促進特性を獲得することができることを再び支持する。
増殖およびＤＮＡ修復の支持にとって重要な経路は、老化の後のｈＡＤＣＳで下方調節される：図ｌ０Ｂに示す細胞周期経路（ｑ値＝２．５２ｅ－５）、ＭＣＭ経路（ｑ値＝１．６２ｅ－８）、ＲＢ経路（ｑ値＝６．９７ｅ－５）、ＡＴＭ経路（ｑ値＝３．２８ｅ－２）、ｐ５３経路（ｑ値＝１．８６ｅ－２）。全体として、データは、自己再生よりも老化において、ＩＬ－２誘発下方調節に供する多くの生物学的経路があること、および、これらの生物学的経路は相互に関係し（図ｌ０Ｂ）、ｈＡＤＳＣの複製加齢の後のＩＬ－２応答の生理的障害をさらに関連付けることを示した。
表２は、ＳＥＮおよびＳＲ細胞でのＩＬ－２処置後の抗炎症性および免疫調節因子の差次的発現を示す。ＳＲ ＧＦｏｌｄ値は、ＩＬ－２で処置されていないＳＲ細胞と比較して、ＩＬ－２で処置したＳＲ細胞での差異倍率を表す；ＳＥＮ ＧＦｏｌｄ値は、ＩＬ－２で処置されていないＳＥＮ細胞と比較して、ＩＬ－２で処置したＳＥＮ細胞での差異倍率を表す。
Figure 2022140711000011
 （実施例６）
ＩＬ－２刺激ヒトＭＳＣの抗炎症および免疫調節特性
次に、複製加齢に課されるとき、ＩＬ－２炎症誘発性環境への曝露が、ｈＡＤＳＣの免疫調節特性（例えば、ＩＬ－２に曝露させたヒトＭＳＣの抗炎症および免疫調節特性）を提供すると指定された遺伝子の発現にどのように影響するかを調査した。免疫調節のための能力が、ｅｘ ｖｉｖｏでの継代の間にヒト脂肪由来ＭＣＳの複製加齢によって影響を受けることを、データは実証した（図７Ｂおよび表２）。
ＳＲ－ｈＡＤＳＣでのＩＬ－２曝露は、Ｔ細胞調節に起因する異なるセットの遺伝子を活性化する。ＳＲ－ｈＡＤＳＣのＩＬ－２曝露は、図７Ｂ、表２および表６Ａ～６Ｄに示した遺伝子、例えばＴＮＦＲＳＦ２１（Ｔ細胞分化に関与する）、ＩＬ１２Ａ（Ｔ細胞活性化因子）、ＩＬＦ２（Ｔ細胞活性化の間のＩＬ－２遺伝子の転写の強力な調節因子）、ＩＬ３３（ヘルパーＴ２型関連のサイトカインのパラクリン誘導因子）の上方調節、およびＣＣＬ２８（ＣＤ＋４、ＣＤ＋８Ｔ細胞の走化因子）、ＣＤ３２０（プラズマ細胞の増殖を増強するオートクリンおよびパラクリン機能を有する受容体分子）の下方調節をもたらす。
それに反して、ＩＬ－２に曝露させたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣは、ＣＤ３２０、Ｔ細胞機能のモジュレーションに関与し得るいくつかのインテグリン（ＩＴＧ１１、ＩＴＧＡ Ｖ、ＩＴＦＧ１）、ならびに、重要な調節分子をコードする遺伝子、例えば：Ｔ細胞接着受容体（ＣＤ９９）、ナイーブＴ細胞の維持に帰される因子（ＣＨＳＴ３）、Ｔ細胞活性化因子（ＨＩＶＥＰ１およびＨＩＶＥＰ２）、Ｔ細胞シグナル伝達経路に関与する遺伝子（ＣＭＩＰ）、およびＣＤ＋細胞増殖の阻害に関与するオートクリン／パラクリン因子、ＰＴＧＥＲｌの有意な転写上方調節によって特徴付けられた（図７Ｂ、表２および表６Ａ～６Ｄ）。
データは、ＩＬ－２に曝露させたＳＲ－ｈＡＤＳＣが、Ｂ細胞増殖および分化（ＣＤ７２）ならびにマクロファージホーニング（ＣＤ６８）で役割を果たす表面受容体をコードする遺伝子の転写活性の下方調節を誘発することも実証した。これらの遺伝子の両方とも、類似の処置の後にＳＥＮ細胞で有意に転写的に上方調節される（図７Ｂ、表２、表６Ａ～６Ｄ）。さらに、ＩＬ－２処置ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣは、いくつかの非粘着性の骨髄性前駆細胞を調節する、プロ－Ｂからプレ－Ｂへの移行のために必要とされる遺伝子、ＬＲＲＣ８ＡおよびＰＥＡＲｌ遺伝子、の転写下方調節によって、同様に処置されるＳＲ細胞から区別される。対照的に、リンパ球の活性化およびホメオスタシス（ＣＤ８３およびＴＮＦＲＳＦ２５）ならびに白血球遊出（ＣＥＲＣＡＭ）に関与する遺伝子、ならびに内皮細胞－白血球相互作用の役割を担う遺伝子（ＥＳＭ１）、ならびに対照単球／マクロファージ媒介免疫学的プロセスにとって重要な遺伝子（ＴＮＦＳＦ１３）は、ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣで上方調節される（図７Ｂ、表２および表６Ａ～６Ｄ）。
ＩＬ－２曝露は、化学走性のために重大ないくつかのサイトカインおよび因子の差次的発現をもたらす（図７Ｂおよび表２に示す）。
ＳＲ－ｈＡＤＳＣは、ＩＬ－３３、ＩＬ－１２Ａ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬＦ２およびＮＯＳ３遺伝子の上方調節を特徴とするが、ＩＬ－１６およびＣＳＦ１Ｒ遺伝子はこれらの細胞で下方調節される。
ＩＬ－２により類似の条件下で処置されたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣでは、サイトカインＩＬ－３２、ＩＬ－６、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ－２０ＲＢ、ＩＬ－２１Ｒをコードする遺伝子、ならびに炎症誘導因子ＴＮＦＳＦ１３およびＴＮＦＳＦ１２、ならびに細胞外マトリックスリモデラーＰＬＡＵをコードする遺伝子は、上方調節される。
同時に、ＭＹＬ９、ＫＩＦ１４、ＩＲＡＣ３などの細胞質分裂のために必須のいくつかの因子、ならびに単球および好塩基球（ＣＣＬ２）を誘引する走化因子をコードする遺伝子および造血前駆体細胞の増殖および分化を調節するＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子は、下方調節される（図７Ｂ）。
類似の下方調節は、いくつかのインターロイキン受容体コード遺伝子ＩＬ７Ｒ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１５ＲＡ、およびインターロイキンエンハンサー結合性因子ＩＬＦ２およびＩＬＦ３でも見出される。
これらの観察は、ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣ（ＩＬ－３２、ＩＬ－６、ＰＬＡＵ遺伝子の上方調節；ＣＣＬ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＩＬＦ３、ＩＲＡＫ３、ＫＩＦ１４、ＭＹＬ９遺伝子の下方調節）およびＳＲ－ｈＡＤＳＣ（ＩＬ１２Ａ、ＩＬ７Ｒ、ＩＲＡＫ１、ＮＯＳ３遺伝子の上方調節；ＩＬ１６、ＣＳＦ１Ｒ遺伝子の下方調節）でのサイトカインのＩＬ－２依存性差次的転写性発現とともに、ｈＡＤＳＣの免疫調節特性が老化によって強いられる変化に感受性であることを示す。
血管新生ＶＥＧＦ経路（ｑ値＝５．２４ｅ－３）（図１０Ａ、右側および図７Ｄ）との観察された関係、およびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣの遊走能力の強化（図４Ａ、Ｂ）は、ＩＬ－２に曝露させたＳＥＮ－ＭＳＣが、腫瘍形成環境および転移を支持するのに必要な特性を獲得し得ることを示す。さらに、複製老化の後のｈＡＤＳＣでの一酸化窒素合成酵素経路（ｉＮＯＳ）ＮＯＳｌ経路（ｑ値＝８．３２ｅ－２）に含まれる遺伝子の上方調節は、老化を経るＭＳＣが、免疫抑制を通して転移促進特性を獲得することができることも示す。
（実施例７）
複製老化の際のＩＬ－２刺激ｈＡＤＳＣの抗アポトーシスおよび転移促進特性
これらの実験は、複製老化の際のＩＬ－２曝露ＭＳＣの抗アポトーシスおよび転移促進特性を調べるためにも使用された。
ＩＬ－２処置、他の薬物と組み合わせたＩＬ－２、またはＭＳＣと組み合わせたＩＬ－２のための抗アポトーシスおよび転移促進マーカーのパネルを表３に示す。データは、抗アポトーシスおよび転移促進事象の評価にとって重要な分子マーカー標的のリストを提供する（例えば、本発明で使用するためのＳＥＮおよびＳＲ幹細胞のＱＣのために）。
表３は、ＳＥＮおよびＳＲ細胞でのＩＬ－２処置の際の抗アポトーシスおよび転移因子の差次的発現を示す。ＳＲ ＧＦｏｌｄ値は、ＩＬ－２で処置されていないＳＲ細胞と比較して、ＩＬ－２で処置したＳＲ細胞での差異倍率を表す；ＳＥＮ ＧＦｏｌｄ値は、ＩＬ－２で処置されていないＳＥＮ細胞と比較して、ＩＬ－２で処置したＳＥＮ細胞での差異倍率を表す。
Figure 2022140711000012
例えば、ＭＳＣは、虚血後の心臓筋芽細胞ならびに傷害を受けたニューロンおよび肺線維芽細胞でのアポトーシスの反転を支援することが証明された。スタンニオカルシン１（ＳＴＣ１）が、ＵＶおよび酸度によって傷害を受けた線維芽細胞で強力なアポトーシス反転が可能な必須の因子として識別された。
ＩＬ－２曝露がＳＴＣ１遺伝子とＳＴＣ２遺伝子の両方を転写的に上方調節することをデータは示し、そのような活性化は、少なくともｅｘ ｖｉｖｏで、ｈＡＤＳＣの複製加齢に依存性でない（表６Ａ～６Ｄ）。さらに、ＶＥＧＦおよびＴＧＦＢ１などのパラクリンエフェクターが、内皮細胞でのアポトーシスの反転と結びつけられた。これらの因子の両方をコードする遺伝子の発現は、ＩＬ－２処置後のＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣで上方調節される（図７Ｃ、図５、表３および表６Ａ～６Ｄ）。
図５の第３のグラフは、ｈＡＤＳＣの複製老化の際にＩＬ－２がＶＥＧＦＡ遺伝子の転写を上方調節することを示す。ＶＥＦＧＡ遺伝子発現は、非刺激（ＩＬ－２－）ＳＥＮ（暗色）およびＳＲ（明色）ｈＡＤＳＣで、ならびに２０ｕｇ／ｍｌの組換えＩＬ－２による刺激の後に（ＩＬ－２＋）、定量的ｑＰＣＲによって評価した。３件の独立実験からの変化倍率ΔΔＣＴ平均±ＳＤとして示されるデータを示す。ｑ－ＰＣＲプライマーの位置は、図式で表される。統計的有意性はｔ検定によって推定し、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊はｐ＜０．０１であった。
しかし、図７Ｃに示すｑＰＣＲ分析によってさらに検証される通り、ＶＥＧＦＡの転写活性は、活発に増殖する細胞より老化で著しく高い。注目すべきことに、アポトーシス促進因子をコードするＳＩＶＡ１遺伝子およびＴリンパ球アポトーシスの強力な誘導因子は、増殖するｈＡＤＳＣと比較してＩＬ－２処置後のＳＥＮ細胞で有意に下方調節される（図７Ｃ、表３および表６Ａ～６Ｄ）。ＳＩＶＡ１は、厳密にアポトーシス促進性の因子でなく、腫瘍転移の強力なサプレッサーでもない。重要なことに、浸潤性成長および転移の役割を担ういくつかの因子は、同様に処置されたＳＲ細胞と比較してＩＬ－２に曝露させたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣで有意に上方調節される（図７Ｃおよび表３）。これには、ＲＡＣＫＩ、ＰＬＥＫＨＡ１、ＰＬＥＫＨＡ６、ＣＴＳＢ、ＣＲＭＰ１、ＦＥＲＭＴｌ遺伝子が含まれる。これらのデータは、ＩＬ－２によるｈＡＤＳＣの前処置／曝露が、これらの細胞一般の抗アポトーシス特性を強化することができること、およびそのような強化が複製老化によって影響を受けることを示した。
ＩＬ－２処置ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣでは、ＭＳＣに生存有利性を提供することが証明されている、炎症（ＩＬ－６経路、ｑ値＝５．５５ｅ－３）およびＥＧＦシグナル伝達（ｑ値＝２．３３ｅ－４）と関連する経路のために、顕著な上方調節された遺伝子が濃縮されることが実証された。ＩＬ－２に曝露させたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣは、ＩＬ－１β、ＩＬ－６およびＩＬ－１２（図７Ｂ）、リンパ球からのＩＬ－１７を刺激することが公知のサイトカインの発現の増加も特徴とする。
データは、リンパ球がＩＬ－１７産生の唯一の供給源であること、および炎症誘発性環境に供されるとき、特にそれらの老化の後のＭＳＣがＩＬ－１７の高い転写活性を示すことも示した（図７Ａ）。
（実施例８）
転写プロファイリングは、複製老化の際にＩＬ－２刺激ｈＡＤＳＣで強化された遊走および血管新生を調節する遺伝子標的を示す
加齢に際しＩＬ－２処置で強化された遊走および血管新生を示すマーカーのパネルを示す（表４）。
転写プロファイリングは、複製老化に際しＩＬ－２刺激ＡＤＳＣで強化された遊走および血管新生を調節する遺伝子標的を示す。転写応答のさらなる分析は、ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣのＩＬ－２刺激が、血管発生、および血管新生に関するリモデリングに関与する遺伝子の発現を強化することを示す。ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＦＢＬＮＳ、ＦＢＬＮ７、ＰＧＦ、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＮＧＰＴＬ６、ＴＮＦＳＦ１２、ＰＲＫＣＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＨＲＡＳ遺伝子、ならびに内皮細胞－白血球接着の強力なモジュレーターをコードする遺伝子ＥＳＭ１の有意な上方調節が観察された（図７Ｄ、図１０Ａ～１０Ｂ、表４および表６Ａ～６Ｄ）。
表４は、ＳＥＮおよびＳＲ細胞でのＩＬ－２処置後の遊走および血管新生因子の差次的発現を示す。ＳＲ ＧＦｏｌｄ値は、ＩＬ－２で処置されていないＳＲ細胞と比較して、ＩＬ－２で処置したＳＲ細胞での差異倍率を表す；ＳＥＮ ＧＦｏｌｄ値は、ＩＬ－２で処置されていないＳＥＮ細胞と比較して、ＩＬ－２で処置したＳＥＮ細胞での差異倍率を表す。
Figure 2022140711000013
Figure 2022140711000014
以前に報告されたように、ＭＣＳによって放出される血管内皮増殖因子ＶＥＧＦは、内皮系統細胞の動員および血管新生の開始を可能にする。ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣでのＶＥＧＦＡ遺伝子発現の上方調節は定量的ＲＴ－ＰＣＲ分析によって検出することができること、ならびに、ＩＬ－２曝露がＳＲおよびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣでＶＥＧＦＡ遺伝子転写の統計的に有意な増加をもたらすことがさらに実証される（図７Ｄおよび表４）。
ＩＬ－２曝露に応答して、細胞運動性、遊走および浸潤性成長の役割を担う一群の遺伝子が、複製老化を経たｈＡＤＳＣだけで有意に上方調節されることがさらに観察された：ＣＧＮＬ１、ＣＧＲＥＦ１、ＣＲＭＰ１、ＦＧＤ６、ＴＮＫ２、ＰＴＧＳ１、ＴＮＦＡＩＰ８、ＣＴＳＢ、ＣＴＳＯ、ＦＡＰ、ＦＥＲＭＴ１、ＰＬＥＫＨＡ１、ＰＬＥＫＨＡ６、ＲＯＣＫ１、ＲＯＣＫ２。細胞接着を促進する遺伝子のセット、例えばＣＨＤ２４、ＣＹＲ６１、ＩＬＫ、ＮＥＤＤ９、ＭＹＬ９、ＰＰＡＰ２Ｂ、ＲＥＬＮおよびＴＬＮ２が下方調節された（図７Ｄ、表４および表６Ａ～６Ｄ）。これらのデータは、図３Ｂに示すＳＥＮ－ｈＡＤＳＣの強化された遊走能力の実験証拠をさらに支持する。
（実施例９）
プロテオーム抗体アレイデータ
表７は、全てのプロテオーム抗体アレイデータの生の値を提供する。
図２Ｂは、これらのデータの収集のために使用される５つの因子産生ユニットを示す。全ての５つの因子産生ユニットは、Ａ（無細胞対照）以外は１０％ＰＲＰ含有ＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ Ｘｅｎｏ不含培地中の３８歳の患者からの幹細胞を含有した。因子産生ユニットには、７００ｕｌ／ｃｍ３の１０％ＰＲＰ含有ＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ Ｘｅｎｏ不含培地中の１ｃｍ３あたりＳＲまたはＳＥＮ－ｈＡＤＳＣの２５００個の細胞を接種した。図２Ｂ、因子産生ユニットＣおよびＥに関し、因子産生ユニットの細胞をＩＬ－２で２４時間刺激し、その後培地を１０％ＰＲＰ含有ＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ Ｘｅｎｏ不含培地に交換した。因子産生ユニットを３７℃および５％ＣＯ２に２４、４８および７２時間保った後、培地を収集し、分析した。
因子産生ユニットからの等量の培地を、ＲａｙＢｉｏ Ｃシリーズヒトサイトカイン抗体アレイＡＡＨ－ＣＹＴ－２０００（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）で分析した。Ｃシリーズヒトサイトカイン抗体アレイＡＡＨ－ＣＹＴ－２０００は、ケミルミネッセンスアッセイ原理に基づき、目的の１７４個のタンパク質に対する抗体を含有する。ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓデンシトメトリーソフトウェア（Ｌｉ－ＣＯＲ）を使用して、膜からデータを抽出した。曝露の差およびアレイ間の変動について調整するために、所与のタンパク質シグナルの平均強度／平均強度陰性対照の間の比をとることによって、生データを正規化した。
対照として、Ａで表される因子産生ユニットは、細胞を含有しなかった。この因子産生ユニットは、７００ｕｌ／ｃｍ２の１０％ＰＲＰ含有ＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ Ｘｅｎｏ不含培地でセットアップした。培地を２４、４８および７２時間でに収集し、ＲａｙＢｉｏＣシリーズヒトサイトカイン抗体アレイＡＡＨ－ＣＹＴ－２０００に適用した、Ｑｕｂｉｔ２．０（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用してＱｕｂｉｔ蛍光数量化によって総タンパクを数量化し、データを上記のように抽出し、分析した。
Ｂと標識した因子産生ユニットは、ＩＬ－２で処置していないＳＲ－ｈＡＤＳＣを含有した。この因子産生ユニットには、７００ｕｌ／ｃｍ３の１０％ＰＲＰ含有ＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ Ｘｅｎｏ不含培地中の１ｃｍ３あたり患者特異的ｈＡＤＳＣの２５００個の細胞を接種した。試料は、２４時間、４８時間または７２時間で収集した。
Ｃと標識した因子産生ユニットは、ＩＬ－２で処置したＳＲ－ｈＡＤＳＣを含有する因子産生ユニットであった。この因子産生ユニットは、７００ｕｌ／ｃｍ３の１０％ＰＲＰ含有ＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ Ｘｅｎｏ不含培地中の患者特異的ＳＲ－ｈＡＤＳＣを１ｃｍ３あたり２５００個の細胞で含有した。因子産生ユニット中の細胞は、ＩＬ－２で処置した。ＩＬ－２処置のために、因子産生ユニットは、ＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ Ｘｅｎｏ不含培地中の１０％ＰＲＰにおいて２０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）により３７℃で２４時間処置した。ＩＬ－２は、ＰＢＳ－ｃｍｆの２回の洗浄で処置後に除去した。新鮮な培地を７００ｕｌ／ｃｍ３で加えた。試料は、２４時間、４８時間または７２時間後に収集した。
Ｄと標識した因子産生ユニットは、老化ｈＡＤＳＣ（ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣ）を含有した。この因子産生ユニットは、７００ｕｌ／ｃｍ３の１０％ＰＲＰ含有ＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ Ｘｅｎｏ不含培地中に１ｃｍ３あたり２５００個の細胞のＳＥＮ－ｈＡＤＳＣを含有した。試料は、２４時間、４８時間または７２時間で収集した。
Ｅと標識した因子産生ユニットは、Ｃと標識した因子産生ユニットについて上に記載したように、ＩＬ－２で処置したＳＥＮ－ｈＡＤＳＣを含有した。試料は、２４時間、４８時間または７２時間で収集した。
図２Ｂに表した因子産生ユニットＡ～Ｅから収集された因子を、以下に詳細に特徴付ける。
図１１～１７は、１０％ＰＲＰ（血小板リッチな血漿）を含有する培地単独（ＩＬ－２刺激なし）とのインキュベーション２４時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の分泌の増加を示す。分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。図１１は、インターロイキン５（ＩＬ５）およびインターロイキン６（ＩＬ６）の分泌の増加を示す。図１２は、インターロイキン１受容体４（ＩＬ１Ｒ４）の分泌の増加を示す。図１３は、ニューロトロフィン３（ＮＴ３）、血小板由来増殖因子Ａアルファ（ＰＤＧＦ ＡＡ）、血小板由来増殖因子Ａベータ（ＰＤＧＦ ＡＢ）および血小板前駆細胞塩基性タンパク質（ＰＰＢＰ）の分泌の増加を示す。図１４は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１８（ＣＣＬ１８）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２５（ＣＣＬ２５）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２７（ＣＣＬ２７）およびＣＸＣケモカインリガンド１１（ＣＸＣＬ１１）の分泌の増加を示す。図１５は、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ－１）およびメタロプロテイナーゼ阻害剤２（ＴＩＭＰ－２）の分泌の増加を示す。図１６は、メタロプロテイナーゼ阻害剤１（ＴＩＭＰ－１）の分泌の増加を示す。図１７は、血管上皮（ＶＥ）カドヘリン（カルシウム依存性細胞接着タンパク質）の分泌の増加を示す。
図１８～１９は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）２４時間後の、ＳＲ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の分泌の増加を示す。これらのタンパク質は、ＰＲＰに存在しないことが判明した。図１８は、インターロイキン４（ＩＬ４）の分泌の増加を示す。図１９は、インスリン様増殖因子結合タンパク質－１（ＩＧＦＢＰ１）の分泌の増加を示す。
図２０～３１は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）４８時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の増加を示す。分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。図２０は、インターロイキン９（ＩＬ９）およびインターロイキン１８結合タンパク質アルファ（ＩＬ１８ＢＰａ）の分泌の増加を示す。図２１は、インターロイキン１受容体ＩＩ型（ＩＬ１Ｒ２）、インターロイキン２受容体ベータ（ＩＬ－２Ｒｂ）、インターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ－２Ｒｇ）、インターロイキン５受容体アルファ（ＩＬ５Ｒａ）、インターロイキン１０受容体ベータ（ＩＬ１０Ｒｂ）、インターロイキン１８受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１８Ｒｂ）およびインターロイキン２１受容体（ＩＬ－２１Ｒ）の分泌の増加を示す。図２２は、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ２）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦａ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１／潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）（ＴＧＦｂ１）およびトランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦｂ２）の分泌の増加を示す。図２３は、受容体チロシンタンパク質キナーゼＥｒｂＢ－３（ＥｒｂＢ３）、Ｆａｓリガンド（Ｆａｓ ＬＧ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、プロラクチン（ＰＲＬ）因子、血小板由来増殖因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲａ）、血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲｂ）、幹細胞因子ｋｉｔ受容体（ＳＣＦＲ）およびシアル酸結合Ｉｇ様レクチン５（シグレック５）の分泌の増加を示す。図２４は、ＣＸＣケモカインリガンド１６（ＣＸＣＬ１６）の分泌の増加を示す。図２５は、活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）、Ｅセレクチン（免疫接着における細胞表面糖タンパク質）、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ２）、Ｌセレクチン（リンパ球接着分子）および血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ１）の分泌の増加を示す。図２６は、アクチビンＡ（ＩＮＨＢＡ）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ－２）およびレプチン受容体（ＬＥＰＲ）の分泌の増加を示す。図２７は、骨形成タンパク質５（ＢＭＰ５）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ７）、マクロファージコロニー刺激因子１受容体（ＭＣＳＦＲ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ１）、マトリックスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ３）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ１３（ＭＭＰ１３）の分泌の増加を示す。図２８は、単球分化抗原（ＣＤ１４）、細胞分化抗原（ＣＤ８０）、カルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）および白血病阻害因子（ＬＩＦ）の分泌の増加を示す。図２９は、エンドグリン（ＥＮＧ）の分泌の増加を示す。図３０は、免疫グロブリン様およびＥＧＦ様ドメインを有するチロシンキナーゼ１（ＴＩＥ１）、ならびに免疫グロブリン様およびＥＧＦ様ドメインを有するチロシンキナーゼ２（ＴＩＥ２）の分泌の増加を示す。図３１は、アクチビンＡ（インヒビンベータＡ、ＩＮＨＢＡ）、レプチン受容体（レプチンＲ）およびトランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）の分泌の増加を示す。
図３２は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）４８時間後の、本発明の因子産生ユニットで維持されたＳＲ－ＭＳＣからの神経増殖因子受容体（ＮＧＦＲ）の分泌の増加を示す。ＮＧＦＲは、ＰＲＰ中に存在しないことが見出された。
図３３～３９は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）７２時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の分泌の増加を示す。分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。図３３は、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１ｂ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ１３Ｒα２）およびインターロイキン１受容体アルファ（ＩＬ１Ｒα）の分泌の増加を示す。図３４は、プロベータセルリン（ＢＴＣ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ１）、線維芽細胞増殖因子６（ＦＧＦ６）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）、レプチンおよび血小板由来増殖因子Ｂベータ（ＰＤＧＦ ＢＢ）の分泌の増加を示す。図３５は、幹細胞因子／ｃ－ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）、間質細胞由来因子－１アルファ（ＳＤＦ１ａ）、間質細胞由来因子－１ベータ（ＳＤＦ１ｂ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ３（ＴＧＦｂ３）および腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）の分泌の増加を示す。図３６は、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）の分泌の増加を示す。図３７は、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）および血小板由来増殖因子Ｂベータ（ＰＤＧＦ ＢＢ）の分泌の増加を示す。図３８は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド７（ＣＣＬ７）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド８（ＣＣＬ８）およびケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１（ＣＣＬ１１）の分泌の増加を示す。図３９は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＣＬ１３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２２（ＣＣＬ２２）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（ＣＣＬ２３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２４（ＣＣＬ２４）およびＣＸＣケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）の分泌の増加を示す。
図４０～４２は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）７２時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の分泌の増加を示す。これらの因子は、ＰＲＰに存在しないことが判明した。図４０は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、骨形成タンパク質６（ＢＭＰ６）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）およびインスリン様増殖因子結合タンパク質－４（ＩＧＦＢＰ４）の分泌の増加を示す。図４１は、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１３（ＢＬＣ）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（ＣＣＬ２３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２８（ＣＣＬ２８）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１（エオタキシン１）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド６（ＧＣＰ－２）、ＦＬＴ３ＬＧ（Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド）およびフラクタルカイン（ＣＸ３ＣＬ１）の分泌の増加を示す。図４２は、アンジオテンシン（ＡＮＧ）およびコロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）の分泌の増加を示す。
図４３は、ＩＬ－２による刺激２４時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣからの、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２７（ＣＣＬ２７）およびＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１Ｂ）の分泌の増加を示す。分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。
図４４～５３は、ＩＬ－２による刺激４８時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の増加を示す。分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。図４４は、インターロイキン９（ＩＬ９）、インターロイキン１１（ＩＬ１１）、インターロイキン１２アルファ（ＩＬ１２ａ）、インターロイキン１２ベータ（ＩＬ１２ｂ）およびインターロイキン１８結合タンパク質アルファ（ＩＬ１８ＢＰａ）の分泌の増加を示す。図４５は、インターロイキン１受容体Ｉ型（ＩＬ１Ｒ１）、インターロイキン１受容体ＩＩ型（ＩＬ１Ｒ２）、インターロイキン１受容体ＩＶ型（ＩＬ１Ｒ４）、インターロイキン２受容体ベータ（ＩＬ－２Ｒｂ）、インターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ－２Ｒｇ）、インターロイキン５受容体アルファ（ＩＬ５Ｒａ）、インターロイキン１０受容体ベータ（ＩＬ１０Ｒｂ）、インターロイキン１８受容体ベータ（ＩＬ１８Ｒｂ）およびインターロイキン２１受容体（ＩＬ－２１Ｒ）の分泌の増加を示す。図４６は、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）、ＦＧＦ９、ＭＳＰアルファ／ＨＧＦ様因子（ＨＧＦ様）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、ＩＧＦ２、インスリン様増殖因子結合タンパク質－６（ＩＧＦＢＰ６）、ＬＡＰ（ＴＧＦベータファミリー）および血小板由来増殖因子Ａアルファ（ＰＤＧＦＡＡ）の分泌の増加を示す。図４７は、血小板由来増殖因子Ａベータ（ＰＤＧＦＡＢ）、血小板由来増殖因子Ｂベータ（ＰＤＧＦＢＢ）、間質細胞由来因子－１アルファ（ＳＤＦ１ａ）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン５（シグレック５）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦａ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦｂ２）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦＤ）の分泌の増加を示す。図４７は、ＤＲ６、Ｄｔｋ、ＥＧＦＲ、エンドグリン、ＥｒｂＢ３、Ｆａｓ、Ｆａｓ ＬＧおよびＩＧＦ１ ｓｒの分泌の増加も示す。図４８は、レプチン（ＬＥＰ）、レプチン受容体（ＬＥＰＲ）、マクロファージコロニー刺激因子１受容体（ＭＣＳＦＲ）、ニューロトロフィン４（ＮＴ４）、オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）、血小板由来増殖因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲａ）、血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲｂ）およびプロラクチン（ＰＲＬ）の分泌の増加を示す。図４９は、幹細胞因子受容体（ＳＣＦＲ）、アンジオポエチン１受容体（ＴＩＥ１）、アンジオポエチン１受容体（ＴＩＥ２）、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー１０Ｃ（ＴＮＦＳＦ１０Ｃ）、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー１０Ｄ（ＴＮＦＳＦ１０Ｄ）、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）および血管内皮増殖因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ２）の分泌の増加を示す。図５０は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２５、ＣＸＣケモカインリガンド５（ＣＸＣＬ５）、ＣＸＣＬ１１およびＣＸＣＬ１６の分泌の増加を示す。図５１は、活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）、骨形成タンパク質５（ＢＭＰ５）、ＢＭＰ７、Ｅセレクチン（内皮細胞接着分子）、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ２）、ＩＣＡＭ３、Ｌセレクチン（リンパ球接着分子）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ１）の分泌の増加を示す。図５２は、マトリックスメタロプロテイナーゼ１３（ＭＭＰ１３）、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ１）、メタロプロテイナーゼ阻害剤ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ４および血管上皮（ＶＥ）カドヘリン（カルシウム依存性細胞接着タンパク質）の分泌の増加を示す。図５３は、単球分化抗原（ＣＤ１４）、細胞分化抗原（ＣＤ８０）、カルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、トロンボポエチン（ＴＨＰＯ）およびリンホタクチン（ＸＣＬ１）の分泌の増加を示す。
図５４は、ＩＬ－２による刺激４８時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣからの、神経増殖因子受容体（ＮＧＦＲ）の分泌の増加を示す。図５４は、ＩＬ－２刺激２４時間後の、ＩＬ－２によるＩＬ８およびＴＮＦＲＳＦ１Ａの分泌の増加も示す。ＮＧＦＲ、ＩＬ８およびＴＮＦＲＳＦ１Ａは、ＰＲＰに存在しないことが判明した。
図５５～５７は、ＩＬ－２による刺激７２時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の分泌の増加を示す。分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。図５５は、インターロイキン１受容体アルファ（ＩＬ１Ｒａ）、インターロイキン６（ＩＬ６）およびインターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ１３Ｒａ２）の分泌の増加を示す。図５６は、線維芽細胞増殖因子６（ＦＧＦ６）、血小板前駆細胞塩基性タンパク質（ＰＰＢＰ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）および血管内皮増殖因子受容体－３（ＶＥＧＦＲ３）の分泌の増加を示す。図５７は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２２（ＣＣＬ２２）、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６およびＣＸＣケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）の分泌の増加を示す。
図５８は、ＩＬ－２による刺激７２時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＲ－ｈＡＤＳＣからの、アンジオテンシン（ＡＮＧ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ－７）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質－１（ＩＧＦＢＰ１）およびＩＧＦＢＰ２の分泌の増加を示す。これらの因子は、ＰＲＰに存在しないことが判明した。
図５９は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）２４時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの、線維芽細胞増殖因子６（ＦＧＦ６）、ＣＸＣケモカインリガンド１６（ＣＸＣＬ１６）および間質細胞由来因子－１アルファ（ＳＤＦ１ａ）の分泌の増加を示す。分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。
図６０は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）２４時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、Ｂリンパ球ケモカイン（ＣＸＣＬ１３；ＢＬＣ）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＣＬ１）、Ｆｌｔ－３ ＬＧ（Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド）、フラクタルカイン（Ｔ細胞ケモカインＣＸ３ＣＬ１）、顆粒球走化性タンパク質２（ＧＣＰ－２）／ＣＸＣＬ６、インターロイキン１アルファ（ＩＬ１ａ）、インターロイキン４（ＩＬ４）、ＩＬ１５およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の分泌の増加を示す。これらの因子は、ＰＲＰに存在しないことが判明した。
図６１～７０は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）４８時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の分泌の増加を示す。分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。図６１は、インターロイキン２ベータ（ＩＬ－２ｂ）、ＩＬ３、ＩＬ５およびＩＬ６の分泌の増加を示す。図６２は、インターロイキン１受容体ＩＩ型（ＩＬ１Ｒ２）、インターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ－２Ｒｇ）、インターロイキン５受容体アルファ（ＩＬ５Ｒａ）、インターロイキン１０受容体ベータ（ＩＬ１０Ｒｂ）、インターロイキン１８受容体結合タンパク質アルファ（ＩＬ１８ＢＰａ）、インターロイキン１８受容体ベータ（ＩＬ１８Ｒｂ）およびインターロイキン２１受容体（ＩＬ－２１Ｒ）の分泌の増加を示す。図６３は、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、ＩＧＦ２、ＬＡＰ（ＴＧＦベータファミリー）、レプチン（ＬＥＰ）、レプチン受容体（ＬＥＰＲ）、血小板由来増殖因子Ａアルファ（ＰＤＧＦＡＡ）、血小板由来増殖因子Ａベータ（ＰＤＧＦＡＢ）および血小板由来増殖因子Ｂベータ（ＰＤＧＦＢＢ）の分泌の増加を示す。図６４は、血小板由来増殖因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲａ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、幹細胞因子受容体（ＳＣＦＲ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦ ｂ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦｂ２）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦａ）、血管内皮増殖因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ２）およびＶＥＧＦＲ３の分泌の増加を示す。図６５は、細胞死受容体６（ＤＲ６；ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー２１）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ３）、免疫グロブリン様およびＥＧＦ様ドメインを有するチロシンキナーゼ１（ＴＩＥ１）、ＴＩＥ２およびＴＮＦスーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）の分泌の増加を示す。図６６は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）、ＣＣＬ５、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８およびＣＣＬ２３の分泌の増加を示す。図６７は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２４（ＣＣＬ２４）、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＸＣケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）およびＣＸＣＬ１１の分泌の増加を示す。図６８は、活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）、骨形成タンパク質５（ＢＭＰ５）、ＢＭＰ７、Ｅセレクチン（内皮細胞接着分子）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）、ＩＣＡＭ２、Ｌセレクチン（リンパ球接着分子）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ１）の分泌の増加を示す。図６９は、マトリックスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ３）、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ１）、メタロプロテイナーゼ阻害剤ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２およびＴＩＭＰ４の分泌の増加を示す。図７０は、単球分化抗原（ＣＤ１４）、単球分化抗原（ＣＤ８０）、カルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）および白血病阻害因子（ＬＩＦ）の分泌の増加を示す。
図７１～７２は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）４８時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の分泌の増加を示す。これらの因子は、ＰＲＰに存在しないことが判明した。図７１は、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１（ＣＣＬ１１）、ＣＣＬ２３、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、インスリン様増殖因子結合タンパク質－１（ＩＧＦＢＰ１）、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ４および神経増殖因子受容体（ＮＧＦＲ）の分泌の増加を示す。図７２は、インターロイキン７（ＩＬ７）、ＩＬ１０、ＩＬ１３およびＩＬ１６の分泌の増加を示す。
図７３は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）７２時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの、プロベータセルリン（ＢＴＣ）、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ１３Ｒａ２）および間質細胞由来因子－１ベータ（ＳＤＦ１ｂ）の分泌の増加を示す。分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。
図７４は、１０％ＰＲＰ単独とのインキュベーション（ＩＬ－２刺激なし）７２時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン８（ＩＬ８）およびＴＮＦＲＳＦ１Ａ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１Ａ）の分泌の増加を示す。これらの因子は、ＰＲＰに存在しないことが判明した。
図７５は、ＩＬ－２による刺激２４時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（ＣＣＬ２３）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＣＣＬ１１（エオタキシン１）、ＩＬ４および神経増殖因子受容体（ＮＧＦＲ）の分泌の増加を示す。これらの因子は、ＰＲＰに存在しないことが判明した。これらの因子は、ＰＲＰに存在しないことが判明した。
図７５は、ＩＬ－２刺激２４時間後の、ＣＸＣＬ１６、ＨＣＣ４、ｓｇｐ１３０およびＴＮＦＲＳＦ１Ｂの分泌の増加も示す。分泌レベルは、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。
図７６～８６は、ＩＬ－２による刺激４８時間後の、ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の分泌の増加を示す。分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。図７６は、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１ｂ）、ＩＬ３、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１２ｂおよびインターロイキン１８結合タンパク質アルファ（ＩＬ１８ＢＰａ）の分泌の増加を示す。図７７は、インターロイキン１受容体アルファ（ＩＬ１Ｒａ）、ＩＬ１Ｒ４、ＩＬ１０Ｒｂ、ＩＬ１８Ｒｂ、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ－２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒｂ、ＩＬ－２ＲｇおよびＩＬ５Ｒａの分泌の増加を示す。図７８は、線維芽細胞増殖因子６（ＦＧＦ６）、インスリン様増殖因子ＩＧＦ１およびＩＧＦ２、ＬＡＰ（ＴＧＦベータファミリー）、ニューロトロフィン３（ＮＴ３）、血小板由来増殖因子Ａアルファ（ＰＤＧＦＡＡ）、血小板由来増殖因子Ａベータ（ＰＤＧＦＡＢ）ならびに血小板由来増殖因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲａ）の分泌の増加を示す。図７９は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トランスフォーミング増殖因子２（ＴＧＦ２）、ＴＧＦａ、ＴＧＦｂ１、ＴＧＦｂ３、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦｂ）、血管内皮増殖因子受容体－２（ＶＥＧＦ Ｒ２）およびＶＥＧＦ Ｒ３の分泌の増加を示す。図８０は、ＤＲ６（ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー２１）、エンドグリン（ＥＮＧ）、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ－３（ＥｒｂＢ３）、Ｆａｓリガンド（Ｆａｓ ＬＧ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲ ＬＧ）およびレプチン受容体（ＬＥＰＲ）の分泌の増加を示す。図８１は、プロラクチン（ＰＲＬ）、幹細胞因子受容体（ＳＣＦＲ）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン５（シグレック５）、アンジオポエチン１受容体（ＴＩＥ１）およびアンジオポエチン１受容体（ＴＩＥ２）の分泌の増加を示す。図８２は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド８（ＣＣＬ８）、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８およびＣＣＬ２０の分泌の増加を示す。図８３は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２２（ＣＣＬ２２）、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、ＣＸＣケモカインリガンド９（ＣＸＣＬ９）およびＣＸＣＬ１１の分泌の増加を示す。図８４は、アクチビンＡ（ＩＮＨＢＡ）、骨形成タンパク質５（ＢＭＰ５）、Ｅセレクチン（内皮細胞接着分子）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）、ＩＣＡＭ２、Ｌセレクチン（リンパ球接着分子）およびマクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）の分泌の増加を示す。図８５は、マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ１）、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ１）およびメタロプロテイナーゼ阻害剤４（ＴＩＭＰ－４）の分泌の増加を示す。図８６は、単球分化抗原（ＣＤ１４）、リンホタクチン（ＸＣＬ１）、カルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）および血小板前駆細胞塩基性タンパク質（ＰＰＢＰ）の分泌の増加を示す。
図８７は、ＩＬ－２による刺激４８時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、インスリン様増殖因子結合タンパク質－２（ＩＧＦＢＰ２）、ＩＬ－２、ＩＬ１６およびインターフェロンガンマ（ＩＮＦガンマ）の分泌の増加を示す。これらの因子は、ＰＲＰに存在しないことが判明した。
図８８～８９は、ＩＬ－２による刺激７２時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの、図の下に記すタンパク質（因子）の分泌の増加を示す。分泌レベルは、ｈＡＤＳＣ支持に使用される、１０％ＰＲＰ含有培地における基底レベルで存在する対応するタンパク質の量と比べて示される。図８８は、アディポネクチン（Ａｃｒｐ３０）、アグーチ関連タンパク質（ＡｇＲＰ）、ＡＮＧＰＴ２（アンジオポエチン２）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、プロベータセルリン（ＢＴＣ）、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ１３Ｒａ２）、レプチン（ＬＥＰ）、ニューロトロフィン４（ＮＴ４）および間質細胞由来因子－１アルファ（ＳＤＦ１ａ）の分泌の増加を示す。図８９は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２７、ＣＸＣケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）、間質細胞由来因子－１ベータ（ＳＤＦ１ｂ）、メタロプロテイナーゼ阻害剤１（ＴＩＭＰ１）、ＴＩＭＰ２および腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）の分泌の増加を示す。
図９０は、ＩＬ－２による刺激７２時間後の、本発明の因子産生ユニット中に維持されたＳＥＮ－ｈＡＤＳＣからの、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）およびＩＬ１３の分泌の増加を示す。これらの因子は、ＰＲＰに存在しないことが判明した。
（実施例１０）
マイクロＲＮＡを使用した老化の誘導
ＳＥＮ表現型は、老化関連のマイクロＲＮＡ（ＳＡ－ｍｉＲＮＡ）またはＳＡ－ｍｉＲＮＡ模倣物の一定範囲の濃度（１ｐｍから１０００ｕＭ）のトランスフェクションによって達成することができる。
この実施例は、ＭＩＲＧ１７ＨＧおよびＭＩＲ１００ＨＧクラスターを起源とするＳＡ－ｍｉＲＮＡが、老化を誘導するために遺伝子標的を協調的に調節することができることを示す。ＳＲ－ＡＤＳＣへのＳＡ－ｍｉＲＮＡの一時的送達は、ＳＥＮ表現型を誘導するのに十分である。ＭＩＲ１００ＨＧまたはＭＩＲ１７ＨＧクラスターからのＳＡ－ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物の別々の送達は、ＳＡ－βｇａｌによって検出されるようなＳＥＮ表現型をもたらさない（図１０８、パネルＡ）。両クラスターからのＳＡ－ｍｉＲＮＡをＳＲ－ｈＡＤＳＣにトランスフェクトさせたとき、細胞の約４０％は老化関連のβ－ガラクトシダーゼ（ＳＡ－βｇａｌ）の発現によって区別されるようになった。ＦＩＴＣ標識ランダムＲＮＡは、これらの実験の全てにおいて、５０から６０％の範囲内のトランスフェクション効率のための対照として使用された（図１０８、パネルＢ）。ＳＥＮ表現型は、一定範囲の濃度（ＳＡ－ｍｉＲＮＡ模倣物と組み合わせた５ｐＭまたは１０ｐＭ）によって達成された。
細胞培養
トランスフェクションの１日前に、４ウェルスライドの上にＳＲ－ｈＡＤＳＣを細胞約１×１０４個／ウェルの密度で播種する。トランスフェクションは、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ）などのトランスフェクション試薬を使用して、５ｐｍｏｌまたは１０ｐｍｏｌの１つまたは複数の老化関連のマイクロＲＮＡ模倣物で実行する。
ＲＴ－ＰＣＲ
ＴＲＩｚｏｌ試薬（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の説明書に従って使用して、細胞から全細胞性ＲＮＡを抽出した。マイクロＲＮＡをｍｉｒＰｒｅｍｉｅｒマイクロＲＮＡ単離キット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して単離し、ＲＮＡおよびマイクロＲＮＡをＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ－２０００分光計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で数量化した。スーパースクリプトＩＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して精製されたＲＮＡおよびオリゴ（ｄＴ）プライマーを加えることによって、ｃＤＮＡを合成した。プライマーはｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェアによって設計し、表Ｓ１に示す。ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ合成のために、ＭｙｓｔｉｃマイクロＲＮＡ ｃＤＮＡ合成ミックスキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。全てのマイクロＲＮＡアッセイプライマーは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
リアルタイム定量的ＰＣＲ
候補遺伝子のためのｍＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ発現の数量化は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって実行した。高能力スーパースクリプトＩＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＭｙｓｔｉｃマイクロＲＮＡ ｃＤＮＡ合成ミックスキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をそれぞれ使用して、全ＲＮＡおよびマイクロＲＮＡを逆転写した。プライマーはｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェアによって設計し、配列は下の表５に提供する。全てのマイクロＲＮＡアッセイプライマーは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ｑＲＴ－ＰＣＲ反応は、ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学式９６ウェルリアクションプレートでのパワーＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＰＣＲマスターミックスおよびｍｙｓｔｉｃマイクロＲＮＡ ＳＹＢＲグリーンｑＰＣＲ
ＲｅａｄｙＭｉｘで実行した。全ＲＮＡのＰＣＲ増幅は、以下のプログラムを使用して、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）で実行した：サイクル１、９５℃で１０分間。サイクル２、９５℃で１５秒間、６０℃で６０秒間を４０サイクル。ＣＴ値は、自動的に得た。ＲＮＡの相対発現値は、ＣＴ方法を使用して、内在性対照（ベータ－アクチン）のＣＴ値と比較してｍＲＮＡ遺伝子のＣＴ値を正規化することにより得た。マイクロＲＮＡのＰＣＲ増幅は、以下のプログラムを使用して、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）で実行した：サイクル１、９５℃で２分間。サイクル２、９５℃で５秒間、６０℃で３０秒間を４０サイクル。マイクロＲＮＡの相対発現値は、ＣＴ方法を使用して、内在性対照（Ｕ６）のＣＴ値と比較してマイクロＲＮＡ遺伝子のＣＴ値を正規化することにより得た。
Figure 2022140711000015
 結果
老化を誘導するために使用することができるＳＡ－ｍｉＲＮＡ模倣物には、ｍｉｒ－１７－５ｐ、ｍｉｒ－１８ａ－５ｐ、ｍｉｒ－１９ａ－３ｐ、ｍｉｒ－２０ａ－５ｐおよびｍｉｒ－９２ａ１－５ｐ、ｍｉｒ－１２５ｂ１－５ｐ、ｍｉｒ－１ｌｅｔ７ａ－２－３ｐおよびｍｉｒ－１００－５ｐが含まれる（この実施例では、ＳＡ－ｍｉＲＮＡ模倣物のセットと呼ばれる）。
図１０８は、腫瘍形成性ＭＩＲ１７ＨＧおよび腫瘍（tumori）抑制性ＭＩＲ１００ＨＧクラスターからの老化関連ｍｉＲＮＡが、ｈＡＤＳＣ ＳＥＮ表現型を確立する働きをすることを図示する。パネルＡは、ＭＩＲ１７ＨＧ（ｍｉｒ－１７－５ｐ、ｍｉｒ－１８ａ－５ｐ、ｍｉｒ－１９ａ－３ｐ、ｍｉｒ－２０ａ－５ｐおよびｍｉｒ－９２ａ１－５ｐ）もしくはＭＩＲ１００ＨＧ（ｍｉｒ－１２５ｂ１－５ｐ、ｍｉｒ－１ｌｅｔ７ａ－２－３ｐ、ｍｉｒ－１００－５ｐ）クラスターからの別々のＳＡ－ｍｉＲＮＡの模倣物の一時的トランスフェクションの後に、またはＳＲ ｈＡＤＳＣでの両クラスターからのＳＡ－ｍｉＲＮＡ模倣物のセットによる同時トランスフェクションの後にカウントされた細胞の全量の間での、ＳＡ－β－Ｇａｌ陽性細胞の百分率を示す。実験手順に記載したように、トランスフェクション効率について調整するために、ＳＡ－ｍｉＲＮＡ模倣物をＦＩＴＣ標識対照と共にトランスフェクトした。各組合せのトランスフェクション効率は（Ｂ）に示し、蛍光顕微鏡下でカウントした細胞の全量（ｎ）の間の緑色の細胞の百分率で表される。
図１０９は、ＳＡ－β－Ｇａｌ陽性、および５ｐＭまたは１０ｐＭのＳＡ－ｍｉＲＮＡの模倣物によるＳＲ－ｈＡＤＳＣへのトランスフェクションの後のＳＥＮ－ｈＡＤＳＣへのＳＲ－ｈＡＤＳＣの変換を表す視野を図示する。
これらの条件下で誘導されるＳＥＮ表現型は、少数の選択された遺伝子の下方調節によって実証される複製老化と類似する（図１１０～１１２）。ＳＡ－ｍｉＲＮＡ模倣物の完全セットをトランスフェクトしたＳＲ－ｈＡＤＳＣでは、ＳＡ－ｍｉＲＮＡ標的遺伝子、例えばＳＵＺ１２、ＮＡＰ１Ｌ１、ＳＭＡＲＣＤ２、ＳＡＰ１８、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＣＨＤ２、およびＣＨＤ４（図１１０および図１１３）、ならびに、ＳＡ－ｍｉＲＮＡの標的ではないが、それにもかかわらず、複製老化の後に下方調節されることが示されたいくつかの遺伝子、例えばＳＭＡＲＣＡ１、ＣＨＤ８、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ５およびＨＤＡＣ９（図１１１および図１１３）に相当する濃縮された機能的ネットワークからの内在性ｍＲＮＡの下方調節が観察された。
図１１０は、遺伝子転写に及ぼすＳＡ－ｍｉＲＮＡの直接的影響を実証する。ＳＡ－ｍｉＲＮＡ標的遺伝子の発現は、ＳＲ－ｈＡＤＳＣ（ＳＲ、明色のバー）およびＳＡ－ｍｉＲＮＡ模倣物のセットを一時的にトランスフェクトしたＳＲ－ｈＡＤＳＣ（ＳＲ＋ｍｉＲＮＡ、暗色のバー）でのｑＰＣＲ分析によって測定した。
図１１１は、遺伝子転写に及ぼすＳＡ－ＲＮＡの間接的影響を実証する。ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣで下方調節されると以前に示されたが、ＳＡ－ｍｉＲＮＡ標的と識別されなかった遺伝子の発現は、ＳＲ－ｈＡＤＳＣ（ＳＲ、明色のバー）およびＳＡ－ｍｉＲＮＡ模倣物のセットを一時的にトランスフェクトしたＳＲ－ｈＡＤＳＣ（ＳＲ＋ｍｉＲＮＡ、暗色のバー）でのｑＰＣＲ分析によって測定した。トランスフェクションの４８時間後に、細胞からＲＮＡを単離した。試料は、β－アクチンに対して正規化した。平均発現レベル±ＳＥＭ（ｎ＝３）は、変化倍率（ΔΔＣτ）で示す。統計的差を評価し、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊はｐ＜０．０１、＊はｐ＜０．０５であった。
図１１２は、ＳＡ－ｍｉＲＮＡをトランスフェクトしたＳＲ－ｈＡＤＳＣ（明色のバー）およびＳＥＮ－ｈＡＤＳＣ（暗色のバー）での平均の正規化タンパク質発現レベル±ＳＥＭ（ｎ＝３）を示す。結果は、ＳＡ－ｍｉＲＮＡの直接的および間接的標的遺伝子について示す。統計的差はスチューデントのｔ検定によって評価し、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊はｐ＜０．０１、＊はｐ＜０．０５であった。
図１１３は、複製老化でのＳＡ－ｍｉＲＮＡの標的である新規遺伝子ならびにそれらの機能的関係および濃縮を図示する。上記のネットワークベースのアプローチを使用して、遺伝子の４つの機能的カテゴリーをそれらの関係および機能の濃縮について評価した。ネットワークノードは遺伝子を表し、それらの機能的カテゴリーに基づいて分類される。遺伝子ノードは、標的化ｍｉＲＮＡに関して標識する。端は、ＳＴＲＩＮＧデータベースからの注釈をつけたタンパク質関係を表す。黒べたの端はサブネットワーク最小スパニングツリー（すなわち、Ｓｔｅｉｎｅｒツリー）の接続を表し、暗灰色の破線の端は追加のサブネットワーク接続を示し、薄灰色破線の端は機能特異的サブネットワーク間の接続を表す。Ｐ値は、各機能特異的サブネットワークが、その特定の機能的カテゴリーからの遺伝子が濃縮される程度を示す。Ｓｔｅｉｎｅｒノードは、灰色で示す。ＳＡ－ｍｉＲＮＡの標的でない下方調節された遺伝子は、それらの機能的カテゴリーに基づいて示す。
（実施例１１）
Ｔｒｅｇ細胞の産生を増加させるためのヒトＰＢＭＣの因子依存的免疫促進
発明者らは、ここで（図９８で）、本発明の例示的な因子産生ユニットでＳＲ ＭＳＣ＋ＩＬ－２によって産生される因子がＴｒｅｇ細胞の産生をモジュレートする能力を有することを示す。Ｔｒｅｇ細胞は、ここでは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋（フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）＋発現）およびＣＤ４＋ＣＤ２５－ＦｏｘＰ３＋によって規定される。転写因子ＦｏｘＰ３を発現するＣＤ４＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は高度に免疫抑制性であり、自己寛容および免疫ホメオスタシスの維持において中心的役割を果たす。
Ｔｒｅｇの分化および産生に影響することができる因子の産生のための材料および方法は、下に記載されている。
ｈＡＤＳＣの単離、培養および特徴付け
この実施例で使用したＭＳＣは、ＵＣＳＤ医療センター、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、でルーチンの脂肪吸引手技を受けた３８歳、４５歳および４９歳の健康な成人女性ドナーから得られたヒト脂肪組織から単離した。ＭＳＣ単離プロトコールは現地の倫理委員会の承認を得、前述の通りに実行した（Wangら、Cell Cycle、２０１１年）。単離した脂肪
由来幹細胞株は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で成長させた。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙによって設定されたＭＳＣ最小定義基準（Dominiciら、２００６年、Cytotherapy８巻：３１５～３１７頁）により、フローサイトメトリー分析は、ｈＡＤＳＣがＣ
Ｄ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現するが、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｓｅ、ＵＳＡからの抗体）を発現しないことを示した。形態学的分析は、細胞が線維芽細胞様形態を示し、プラスチック粘着性であり、市販の分化培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で脂肪生成、軟骨形成および骨形成分化が可能なことを示した。累積集団倍加（ＰＤ）は、記載のように（Wangら、Cell Cycle、２０１１年；Niuら、２０１５年、Oncotarget）培養での成長日数の関数としての複数の継代にわたるＰＤ＝ｌｏｇ（Ｎ／Ｎ０）×３．３３として計算し、ここで、Ｎ０はフラスコに平板培養した細胞の数であり、Ｎはこの継代で回収された細胞の数である。ＳＲ集団のためのｈＡＤＳＣ
ＰＤ４またはＰＤ６。
遺伝毒性物質を使用した老化の誘導
遺伝毒性老化を誘導するために、細胞を遺伝毒性物質、ブレオマイシン（Ｃａｙｍａｎ
ｃｈｅｍｉｃａｌ）抗がん化学療法薬で処置した。患者のｈＡＤＳＣを接種した因子産生ユニット（３－Ｄ ＥＣＭを模倣するポリカプロラクトン（ＰＣＬ）マトリックス／ファイバーから作製された３－Ｄ足場を含有する）を、１０％ＰＲＰ含有ＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ ｘｅｎｏ不含培地中の５０ｕｇ／ｍｌのブレオマイシンにより、３７℃で２時間処置した（Niuら、Oncotarget、２０１５年）。遺伝毒性曝露の後、因子産生ユ
ニットをＰＢＳ－ｃｍｆで２回洗浄し、新鮮な培地と交換した。完全な遺伝毒性誘導老化を達成するために因子産生ユニットを５日間維持し、その後、ＳＥＮ細胞を有する因子産生ユニットは未処置のまま放置したか（ＳＥＮ）、または下記のように２０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２で２４時間処置した（ＳＥＮ＋ＩＬ－２）。ｐＨ依存性の老化関連β－ガラクトシダーゼ活性（ＳＡ－βＧａｌ）の発現をモニタリングするためのアッセイを、製造業者のキット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）に記載されているように、および（Wangら、２０１１年、Cell Cycle１０巻：３０１６～３０３０頁）で以前に公開されているように実行した。
培養したｈＡＤＳＣをＰＢＳで室温で１５分間洗浄し、３７℃で一晩Ｘ－Ｇａｌ含有補助剤で染色した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、顕微鏡（Ｎｉｋｏｎｓ、ＴＥ３００、ＤＸＭ１２００デジタルカメラ、Ｊａｐａｎ）を使用して画像を捕捉した。
ＩＬ－２刺激／処置
組換えＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＵＳＡ）による刺激を、記載されているように実行した（Deenickら、２００３年、J Immunol１７０巻：４９６３～４９７２頁；Niuら、２０１５年、Oncotarget）。２０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を３７℃で２４時間、培養培地に加えた。ＩＬ－２処置のために、ｈＡＤＳＣを含有する因子産生ユニットを、ＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ ｘｅｎｏ不含培地中の１０％ＰＲＰにおいて２０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）により３７℃で２４時間処置した。ＰＢＳ－ｃｍｆの２回の洗浄により処置後にＩＬ－２を除去し、細胞をＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ ｘｅｎｏ不含培地中の１０％ＰＲＰ中のＰＢＭＣと共培養した。
免疫調節のためのＰＢＭＣとの共培養
４つの因子産生ユニットに４つの条件のために細胞を接種し、図２Ｃに示す：未処置のＳＲ－ｈＡＤＳＣ、未処置の遺伝毒性誘導ＳＥＮ－ｈＡＤＳＣ、Ｉｌ－２で処置したＳＲ－ｈＡＤＳＣ、およびＩＬ－２で処置したＳＥＮ－ｈＡＤＳＣ。ＰＢＭＣ集団でＴｒｅｇ産生を誘導するために、細胞によって産生された因子を使用した。各条件のために、５０，０００個のｈＡＤＳＣを５００，０００個の生存能力のある正常な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と７２時間共培養した。１人の健康な３２歳の男性ドナーからのＰＢＭＣを、ＡｌｌＣｅｌｌｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ、から購入した。各実験のために新鮮なバイアルを解凍し、トリパンブルーでの染色の後にＢｉｏｒａｄ ＴＣ２０細胞カウンターを使用して生存度および細胞数を実行した。対照は、ＰＢＭＣ単独で実行した（図２Ｃ）。２４時間または７２時間の時点でトリプシン処理によって細胞を収集し、図９７および図９９で説明されているように製造業者の推奨に従って、ＦｏｘＰ３ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、ＰＥマウス抗ヒトＣＤ２５、ＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ４、アイソタイプＦＩＴＣ－マウスＩｇＧ１、アイソタイプＰＥ－マウスＩｇＧ１、アイソタイプＡｌｅｘａ６４７－マウスＩｇＧ１ｋを含有する抗ヒトＦｏｘＰ３染色キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、Ｔｒｅｇを染色した。
ＦＡＣＳデータ分析戦略－Ｔｒｅｇ産生の分析
２４時間または７２時間の時点でトリプシン処理によって細胞を収集し、製造業者の推奨に従って、ＦｏｘＰ３ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、ＰＥマウス抗ヒトＣＤ２５、ＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ４、アイソタイプＦＩＴＣ－マウスＩｇＧ１、アイソタイプＰＥ－マウスＩｇＧ１、アイソタイプＡｌｅｘａ６４７－マウスＩｇＧ１ｋを含有する抗ヒトＦｏｘＰ３染色キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＴｒｅｇを染色した。簡潔には、非特異的受容体結合をブロックするために、細胞を染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）で１：５０に希釈したヒトＦｃ－受容体ブロック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と氷上で１０分間インキュベートした。ＣＤ４（ＦＩＴＣ）またはＣＤ２５（ＰＥ）または両方に対する各表面抗体およびアイソタイプをマッチさせた対照抗体の２０ｕｌと３０分間、細胞を暗所の氷上でインキュベートした。次に１ｍｌの染色緩衝液で細胞を洗浄し、ＦｏｘＰ３染色キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で供給された固定緩衝液により暗所の４℃で１０分間固定した。透過化緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して細胞を室温で３０分間透過化処理し、次に１ｍｌの染色緩衝液で洗浄した。洗浄の後、暗所の室温で３０分間、細胞を２０ｕｌのＦｏｘＰ３－Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ６４７抗体とインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、ＰＢＭＣを洗浄して５００ｕｌの固定剤緩衝液に再懸濁させ、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でフローサイトメトリーを実行した。
データは、ＵＣＳＦコア施設においてＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で収集した。補償のために、Ｏｎｅｃｏｍｐ ｅｂｅａｄｓ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を製造プロトコールに従って使用した。簡潔には、１滴のビーズを別個のチューブに加え、単一の抗体をＰＢＭＣのために使用された濃度で各チューブに加えた。試料を４℃で１５分間インキュベートし、次に２ｍｌの染色緩衝液で洗浄し、染色緩衝液に再懸濁させ、ＰＢＭＣ染色のために使用したＰＥ、ＦＩＴＣおよびＡｌｅｘａ－６４７蛍光色素のための最適な蛍光検出器（ＰＭＴ）電圧をセットアップするために使用した。
Ｔｒｅｇのための分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ）を使用して、図９７ＢにおいてＦＡＣＳ分析ゲーティング戦略で概説される通りに実行した。リンパ球は、全ＰＢＭＣ集団からの前方および側方散乱にゲーティングした。次に、ＣＤ２５－ＰＥ Ｔ細胞：ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞またはＣＤ４＋ＣＤ２５－ Ｔ細胞を識別するために、ＣＤ４－ＦＩＴＣ集団を発現するリンパ球集団をゲーティングした。ＦｏｘＰ３タンパク質を発現する集団は、Ｔｒｅｇとして識別した（図９７に示す）。Ｔｒｅｇ集団は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－ＦｏｘＰ３＋および三重陽性のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋リンパ球と規定することができる。
図９８は、本発明の例示的な因子産生ユニットで産生される因子がＴｒｅｇの産生に影響することを図示する。この図は、試験した条件の中で、ＩＬ－２による刺激（２４時間）の７２時間後にＳＲ ｈＡＤＳＣから収集された因子が、Ｔｒｅｇの産生の増加に最適だったことを示す。
図９９は、ＦＡＣＳ分析からの代表的データを示す。プロットの中の数字は、マーカーを発現する集団中の細胞の数を表す。表は、パネルＡ～Ｄでマーカーを発現する細胞の数の要約を提供する。このゲーティングでは、リンパ球は光散乱プロット分布（ＳＳＣ－Ａ対ＦＳＣ－Ａ）に基づいてゲーティングした（Ａ）。パネルＡからのリンパ球集団は、結合したＣＤ４ ＦＩＴＣに基づいてＣＤ４＋リンパ球についてさらに分析し、ヒストグラムプロットとして示す（Ｂ）。次にＣＤ２５発現（Ｄ）についてＣＤ４＋リンパ球を逐次的に分析し、その後、陽性Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ６４７抗ＦｏｘＰ３抗体結合に基づいてＦｏｘｐ３を発現するＴｒｅｇを分析した。パネルＥ～Ｈは、２つのマーカーの発現についてのリンパ球のドットプロットを示す。ＣＤ４＋リンパ球はｘ軸に示し、ＣＤ２５発現はｙ軸に示す（Ｅ）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋リンパ球は、Ｑ２にある。ＣＤ２５＋またはＣＤ２５陰性を発現するＦｏｘｐ３＋陽性Ｔ－Ｒｅｇを表す（パネルＦおよびＧ）。全ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋ Ｔｒｅｇは、パネルＨにプロットする。
Figure 2022140711000016
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前述のことから、本発明の具体的な変形形態が例示のために本明細書に記載されているが、本発明の精神および範囲からそれることなく様々な改変を加えることができることが理解される。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて限定されない。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
個体における疾患または障害を処置する方法であって、幹細胞の集団によって産生された１つまたは複数の因子を、前記個体または前記個体由来の生体液に送達するステップを含む方法。
（項目２）
前記幹細胞が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記幹細胞が、自己再生（ＳＲ）細胞および老化（ＳＥＮ）細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記幹細胞の集団が、少なくとも５０％のＳＲ細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
幹細胞の前記集団が、少なくとも５０％のＳＥＮ細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記幹細胞が、誘導剤への曝露により、前記因子を産生するように誘導されている、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記曝露が、約２４時間である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記誘導剤が、ＩＬ－２を含む、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記幹細胞が、少なくとも５０％のＳＲ細胞を含む、項目６に記載の方法。
（項目１０）
前記幹細胞が、少なくとも５０％のＳＥＮ細胞を含む、項目６に記載の方法。
（項目１１）
前記因子が、前記細胞から分泌される、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記因子が、誘導２４、４８または７２時間後に送達される、項目７に記載の方法。
（項目１３）
前記疾患または障害が、がん、自己免疫性疾患、心血管疾患、糖尿病、皮膚疾患、神経変性疾患、骨粗鬆症、変形性関節症、脊髄傷害、肝臓の疾患、腎臓の疾患、加齢性病理、脱毛、熱傷、植皮を必要とする状態または皮膚病変である、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記幹細胞が、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）である、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記幹細胞が、小胞間質画分に由来する、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記送達が、経皮パッチ、プラスマフェレーシスシステム、マイクロニードルに基づくシステム、クリームまたはダーマローラーの使用を含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記因子が、前記個体に対して自家である、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記因子が、前記個体に対して同種異系である、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記因子が、因子産生ユニットにおいて産生される、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記因子が、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１ｂ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ１３Ｒα２）、インターロイキン１受容体アルファ（ＩＬ１Ｒα）、プロベータセルリン（ＢＴＣ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ１）、線維芽細胞増殖因子６（ＦＧＦ６）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）、レプチン、血小板由来増殖因子Ｂベータ（ＰＤＧＦ ＢＢ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、骨形成タンパク質６（ＢＭＰ６）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、インスリン様増殖因子結合タンパク質－４（ＩＧＦＢＰ４）、幹細胞因子／ｃ－ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）、間質細胞由来因子－１アルファ（ＳＤＦ１ａ）、間質細胞由来因子－１ベータ（ＳＤＦ１ｂ）、アンジオテンシン（ＡＮＧ）、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ３（ＴＧＦｂ３）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド７（ＣＣＬ７）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド８（ＣＣＬ８）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１（ＣＣＬ１１）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＣＬ１３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２２（ＣＣＬ２２）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（ＣＣＬ２３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２４（ＣＣＬ２４）、ＣＸＣケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１３（ＢＬＣ）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（ＣＣＬ２３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２８（ＣＣＬ２８）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１（エオタキシン１）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド６（ＧＣＰ－２）、ＦＬＴ３ＬＧ（Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド）およびフラクタルカイン（ＣＸ３ＣＬ１）を含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記因子が、前記個体由来の生体液に送達される、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記因子が、前記個体由来の血漿に送達される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
血漿への前記因子の前記送達が、血液における調節性Ｔ細胞の産生を誘導する、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記血液を前記個体に再導入するステップをさらに含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
因子産生ユニットにおいて１つまたは複数の因子を産生する方法であって、誘導剤を幹細胞の集団に添加するステップであって、因子の前記産生を誘導し、それによって、前記１つまたは複数の因子を産生するステップを含む方法。
（項目２６）
前記幹細胞が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記幹細胞が、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）である、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記幹細胞が、小胞間質画分に由来する、項目２５に記載の方法。
（項目２９）
前記幹細胞が、自己再生（ＳＲ）細胞および老化（ＳＥＮ）細胞を含む、項目２５に記載の方法。
（項目３０）
幹細胞の前記集団が、少なくとも５０％のＳＲ細胞を含む、項目２５に記載の方法。
（項目３１）
幹細胞の前記集団が、少なくとも５０％のＳＥＮ細胞を含む、項目２５に記載の方法。
（項目３２）
前記幹細胞が、誘導剤への曝露により、前記因子を産生するように誘導されている、項目２５に記載の方法。
（項目３３）
前記誘導剤が、ＩＬ－２を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記因子が、前記細胞から分泌される、項目２５に記載の方法。
（項目３５）
前記因子が、誘導２４、４８または７２時間後に得られる、項目３２に記載の方法。
（項目３６）
幹細胞の前記集団が、単一の個体に由来する、項目２５に記載の方法。
（項目３７）
幹細胞の前記集団が、複数の個体に由来する、項目２５に記載の方法。
（項目３８）
前記因子が、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１ｂ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ１３Ｒα２）、インターロイキン１受容体アルファ（ＩＬ１Ｒα）、プロベータセルリン（ＢＴＣ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ１）、線維芽細胞増殖因子６（ＦＧＦ６）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）、レプチン、血小板由来増殖因子Ｂベータ（ＰＤＧＦ ＢＢ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、骨形成タンパク質６（ＢＭＰ６）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、インスリン様増殖因子結合タンパク質－４（ＩＧＦＢＰ４）、幹細胞因子／ｃ－ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）、間質細胞由来因子－１アルファ（ＳＤＦ１ａ）、間質細胞由来因子－１ベータ（ＳＤＦ１ｂ）、アンジオテンシン（ＡＮＧ）、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ３（ＴＧＦｂ３）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド７（ＣＣＬ７）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド８（ＣＣＬ８）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１（ＣＣＬ１１）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＣＬ１３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２２（ＣＣＬ２２）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（ＣＣＬ２３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２４（ＣＣＬ２４）、ＣＸＣケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１３（ＢＬＣ）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（ＣＣＬ２３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２８（ＣＣＬ２８）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１（エオタキシン１）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド６（ＧＣＰ－２）、ＦＬＴ３ＬＧ（Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド）およびフラクタルカイン（ＣＸ３ＣＬ１）を含む、項目２５に記載の方法。
（項目３９）
前記因子が、皮膚美容適用に有用である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記因子が、がん、自己免疫性疾患、心血管疾患、糖尿病、皮膚疾患、神経変性疾患、骨粗鬆症、変形性関節症、脊髄傷害、肝臓の疾患、腎臓の疾患、加齢性病理、脱毛、熱傷、植皮を必要とする状態または皮膚病変の処置に有用である、項目２５に記載の方法。
（項目４１）
皮膚美容適用に適した１つまたは複数の因子を産生する方法であって、１０％ＰＲＰと共に幹細胞の集団をインキュベートするステップであって、それによって、皮膚美容適用に適した１つまたは複数の因子を産生するステップを含む方法。
（項目４２）
ＩＬ－２とのインキュベーションの７２時間後にＳＲ－ｈＡＤＳＣから収集された因子を含む因子組成物。
（項目４３）
試料における調節性Ｔ細胞の数を増加させる方法であって、Ｔ細胞を含む試料を因子組成物と接触させるステップを含み、前記因子組成物が、ＩＬ－２とのインキュベーションの７２時間後にＳＲ－ｈＡＤＳＣから収集された因子を含む、方法。
（項目４４）
前記試料が、血液を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記試料が、血漿を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
基材と、インプット幹細胞の集団とを含む因子産生ユニット。
（項目４７）
基材が、ポリマー材料を含む、項目４２に記載の因子産生ユニット。
（項目４８）
インプット幹細胞が、ＭＳＣを含む、項目４２に記載の因子産生ユニット。
（項目４９）
基材が、三次元基材である、項目４２に記載の因子産生ユニット。
（項目５０）
前記ポリマー材料が、生分解性ポリマーを含む、項目４７に記載の因子産生ユニット。（項目５１）
前記ポリマー材料が、生分解性でないポリマーを含む、項目４７に記載の因子産生ユニット。
（項目５２）
前記ポリマー材料が、ポリエチレンテレフタレート、ポリエステル、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリロニトリル、シリコーン、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリエーテルケトンケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリアミド、ポリスチレン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリグリセロールセバシン酸、ポリジオールクエン酸、ポリヒドロキシ酪酸、ポリエーテルアミド、ポリジアキサノン、フィブロネクチン、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、キトサン、およびこれらの組合せ、ブレンドまたはコポリマーを含む、項目４７に記載の因子産生ユニット。
（項目５３）
基材が、複数のエレクトロスピニングされたナノファイバーまたは３－Ｄプリントされたナノファイバーを含む、項目４２に記載の因子産生ユニット。
（項目５４）
前記ナノファイバーが、幹細胞と共にエレクトロスピニングされている、項目５３に記載の因子産生ユニット。
（項目５５）
前記複数のエレクトロスピニングされたファイバーが、人工細胞外マトリックスとして構成されている、項目５３に記載の因子産生ユニット。
（項目５６）
幹細胞の集団が、基材の表面上に配置されている、項目４２に記載の因子産生ユニット。
（項目５７）
幹細胞の集団が、基材のポリマー材料内に配置されている、項目４２に記載の因子産生ユニット。
（項目５８）
幹細胞が、自己再生（ＳＲ）細胞および老化細胞（ＳＥＮ）を含む、項目４２に記載の因子産生ユニット。
（項目５９）
幹細胞の集団が、少なくとも５０％のＳＲ細胞を含む、項目４２に記載の因子産生ユニット。
（項目６０）
前記幹細胞が、誘導されたＳＲ細胞である、項目５９に記載の因子産生ユニット。
（項目６１）
幹細胞の集団が、少なくとも５０％のＳＥＮ細胞を含む、項目４２に記載の因子産生ユニット。
（項目６２）
前記幹細胞が、誘導されたＳＲ細胞である、項目６１に記載の因子産生ユニット。
（項目６３）
アフェレーシスシステムの一部である、項目４２に記載の因子産生ユニット。
（項目６４）
前記アフェレーシスシステムが、プラスマフェレーシスシステムである、項目６３に記載の因子産生ユニット。
（項目６５）
因子が産生され、前記因子が、免疫細胞のモジュレーションに使用される、項目４２に記載の因子産生ユニット。
（項目６６）
因子が産生され、そして使用されて、調節性Ｔ細胞の産生を増加させる、項目６５に記載の因子産生ユニット。
（項目６７）
因子が産生され、前記因子が、自己免疫性疾患、がん、糖尿病、皮膚疾患、神経変性疾患、骨粗鬆症、変形性関節症、肝臓の疾患、腎臓の疾患、加齢性病理、植皮を必要とする状態または皮膚病変の処置に使用される、項目４２に記載の因子産生ユニット。
（項目６８）
インターロイキン１ベータ（ＩＬ１ｂ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ１３Ｒα２）、インターロイキン１受容体アルファ（ＩＬ１Ｒα）、プロベータセルリン（ＢＴＣ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ１）、線維芽細胞増殖因子６（ＦＧＦ６）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）、レプチン、血小板由来増殖因子Ｂベータ（ＰＤＧＦ ＢＢ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、骨形成タンパク質６（ＢＭＰ６）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、インスリン様増殖因子結合タンパク質－４（ＩＧＦＢＰ４）、幹細胞因子／ｃ－ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）、間質細胞由来因子－１アルファ（ＳＤＦ１ａ）、間質細胞由来因子－１ベータ（ＳＤＦ１ｂ）、アンジオテンシン（ＡＮＧ）、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ３（ＴＧＦｂ３）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド７（ＣＣＬ７）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド８（ＣＣＬ８）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１（ＣＣＬ１１）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＣＬ１３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２２（ＣＣＬ２２）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（ＣＣＬ２３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２４（ＣＣＬ２４）、ＣＸＣケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１３（ＢＬＣ）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（ＣＣＬ２３）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２８（ＣＣＬ２８）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１（エオタキシン１）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド６（ＧＣＰ－２）、ＦＬＴ３ＬＧ（Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド）およびフラクタルカイン（ＣＸ３ＣＬ１）を含む、因子組成物。
（項目６９）
クリームまたはローションの形態にさらに製剤化される、項目６８に記載の因子組成物。
（項目７０）
マイクロニードルを含むパッチ上にさらに製剤化される、項目６８に記載の因子組成物。
（項目７１）
ダーマローラーに基づく送達系と組み合わされるようにさらに製剤化される、項目６８に記載の因子組成物。
（項目７２）
項目６８に記載の因子組成物を含むキット。
（項目７３）
ＳＲ－幹細胞における老化を誘導する方法であって、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉｒ－９２ａ１－５ｐ、ｍｉｒ－１９ａ－３ｐ、ｍｉｒ－１２５ｂ１－５ｐ、ｍｉｒ１００－５ｐおよびｍｉｒ－ｌｅｔ７ａ－２－３ｐからなる群から選択されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のうちの１つを前記細胞にトランスフェクトするステップを含む方法。
（項目７４）
前記ＳＲ－幹細胞が、ＳＲ－ｈＡＤＳＣである、項目７３に記載の方法。

Claims (1)

  1. 本願明細書に記載の発明。
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