CN107603949B - 干细胞培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种干细胞培养基及其应用，涉及干细胞培养技术领域，本发明提供的干细胞培养基包括作为基础培养基的高糖型培养基和作为添加剂的干细胞的培养上清，与其他干细胞培养基相比，本发明中提供的干细胞培养基配置简单，对干细胞的培养扩增效率高。同时，不含有胎牛血清成分，从而彻底杜绝了过敏反应，以及一些动物病毒的污染引入，安全性高。其中，所用到的基础培养基可通过商业化途径购买，所用到的添加剂可对绒毛干细胞培养废弃物进行重复利用，很大程度上降低了肿瘤干细胞培养在基础研究和临床应用中的成本，且操作无需特殊设备，简单可行。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其是涉及一种干细胞培养基及其应用。
背景技术
诸多研究表明干细胞不仅可以自我更新，在条件合适的情况下能分化成其他功能细胞，因此干细胞有望成为治疗人类疑难疾病的有效手段。然而，干细胞在正常成体组织中含量甚微，在体外如何快速扩增与培养干细胞培养是研究干细胞的作用机制和探索其在治疗人类疾病治疗方法的重要技术。
肿瘤干细胞是癌细胞的亚群(在肿瘤或血液肿瘤内发现)，就它们能够产生特定癌症中发现的所有细胞类型而言，它们类似于正常的干细胞。这包括诸如自我更新、癌症的播散或分化成多种类型的癌细胞的特征。这样的细胞据信能够在肿瘤中作为独特的群体持续存在，由于形成新的肿瘤而导致癌症复发和转移。
在癌症治疗中的一个关键挑战将是根除肿瘤干细胞。癌症患者的不良预后和高死亡率据信是由肿瘤干细胞的性质引起的，所述性质包括自我更新、转移、药物抗性和抗辐射性。常规的抗癌药物可以杀死大量肿瘤细胞但最终不能根除肿瘤干细胞。存活的肿瘤干细胞播散并再生出新的肿瘤细胞，这与患者的不良预后和复发密切相关。为了开发用于根除肿瘤干细胞并筛选新的抗癌药物的有效方法，需要对大量的肿瘤干细胞进行试验。然而，肿瘤干细胞含量甚微，且不稳定，使得对肿瘤干细胞的研究难度较大。大量研究表明，这些低含量的肿瘤干细胞在体外可以通过适当的方法进行进一步扩增，最常规的一种肿瘤干细胞培养基就是添加有10％胎牛血清的培养基。然而，采用这种培养基培养的肿瘤干细胞，不仅生长比较缓慢，而且多次传代之后其分化成功能细胞的潜能大大降低。
因此，开发一种能够支持对肿瘤干细胞的培养扩增效率高的干细胞培养基尤为重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种干细胞培养基，以缓解现有技术中存在的对肿瘤干细胞培养效率过低，且多次传代之后其分化成功能细胞的潜能大大降低的技术问题。
本发明的第二个目的在于提供上述干细胞培养基在干细胞悬浮培养中的应用。
本发明提供了一种干细胞培养基，所述干细胞培养基包括：
基础培养基和添加剂；
所述基础培养基为高糖型培养基，所述添加剂为干细胞的培养上清。
进一步地，所述基础培养基与所述添加剂的体积比为1:1-10:1。
进一步地，所述基础培养基与所述添加剂的体积比为2:1-8:1。
进一步地，所述基础培养基与所述添加剂的体积比为5:1。
进一步地，所述高糖型培养基为DMEM高糖培养基。
进一步地，所述干细胞的培养上清为人绒毛干细胞的培养上清。
进一步地，所述人绒毛干细胞为培养至P2-P4代的人绒毛干细胞。
进一步地，所述添加剂包括表皮细胞生长因子10-100ng/mL，成纤维细胞生长因子10-100ng/mL和胰岛素10-100ng/mL。
进一步地，所述添加剂包括表皮细胞生长因子60ng/mL，成纤维细胞生长因子60ng/mL和胰岛素40ng/mL。
另外，本发明还提供了上述的干细胞培养基在悬浮培养CD133+细胞中的应用。
优选地，所述细胞为肿瘤干细胞或循环肿瘤细胞。
本发明提供的干细胞培养基包括作为基础培养基的高糖型培养基和作为添加剂的干细胞的培养上清，与其他干细胞培养基相比，本发明中提供的干细胞培养基配置简单，对干细胞的培养扩增效率高。同时，不含有胎牛血清成分，从而彻底杜绝了过敏反应，以及一些动物病毒的污染引入，安全性高。其中，所用到的基础培养基可通过商业化途径购买，所用到的添加剂可对绒毛干细胞培养废弃物进行重复利用，很大程度上降低了肿瘤干细胞培养在基础研究和临床应用中的成本，且操作无需特殊设备，简单可行。
附图说明
图1A为本发明实验例1提供的VCaP细胞贴壁生长的显微镜下结果图；
图1B为本发明实验例1提供的VCaP细胞悬浮生长的显微镜下结果图；
图2A为本发明实验例1提供的应用本发明对比例5提供的干细胞培养基对VCaP细胞进行培养的生长状态结果图；
图2B为本发明实验例1提供的应用本发明实施例1提供的干细胞培养基对VCaP细胞进行培养的生长状态结果图；
图2C为本发明实验例1提供的应用本发明实施例2提供的干细胞培养基对VCaP细胞进行培养的生长状态结果图；
图3为本发明实验例2提供的VCaP细胞来源的肿瘤干细胞中分子标记物在不同培养基培养之后细胞中的表达差异结果图；
图4为本发明实验例3提供的不同培养体系下VCaP细胞的成瘤能力的结果图；
图5A为本发明实施例4提供的悬浮法培养CD133+的细胞的成球情况结果图；
图5B为本发明实施例4提供的悬浮法培养CD133-的细胞的成球情况结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种干细胞培养基，包括：
基础培养基和添加剂；
基础培养基为高糖型培养基，添加剂为干细胞的培养上清。
本发明中提供的干细胞培养基配置简单，对干细胞的培养扩增效率高。同时，不含有胎牛血清成分，从而彻底杜绝了过敏反应，以及一些动物病毒的污染引入，安全性高。
在一个优选的实施方式中，基础培养基与添加剂的体积比为1:1-10:1。
其中，基础培养基与添加剂的体积比例如可以为，但不限于1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。
在一个更优选的实施方式中，基础培养基与添加剂的体积比为5:1。
在一个优选的实施方式中，高糖型培养基为DMEM高糖培养基。
DMEM高糖培养基可通过市售渠道购买获得，来源广泛，成本低廉。
在一个优选的实施方式中，干细胞的培养上清为人绒毛干细胞的培养上清。
在一个更优选的实施方式中，人绒毛干细胞为培养至P2-P4代的人绒毛干细胞。
其中，人绒毛干细胞例如可以为，但不限于培养至P2代的人绒毛干细胞、培养至P3代的人绒毛干细胞或培养至P4代的人绒毛干细胞。
在人绒毛干细胞培养过程中，进行细胞传代或换液时弃用的培养基废弃物在进行离心及除菌操作后，可作为本发明提供的干细胞培养基的添加剂重复利用，很大程度上降低了肿瘤干细胞培养在基础研究和临床应用中的成本。
在一个优选的实施方式中，添加剂包括表皮细胞生长因子10-100ng/mL，成纤维细胞生长因子10-100ng/mL和胰岛素10-100ng/mL。
其中，表皮细胞生长因子的含量例如可以为，但不限于20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL；成纤维细胞生长因子的含量例如可以为，但不限于20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL；胰岛素的含量例如可以为，但不限于10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL或70ng/mL。
表皮细胞生长因子(EGF)是人体内存在的一种生长因子，它的主要功能是促进上皮细胞、成纤维细胞的增值；增强表皮细胞的活力；延缓表皮细胞的老化，使肌肤各组成成份保持最佳生理状态。此外，它还能刺激细胞外一些大分子(如透明质酸和胶原蛋白等)的合成与分泌，滋润皮肤，是决定皮肤活力和健康的关键因素。
成纤维细胞生长因子(FGF)具有促进内皮细胞的游走和平滑肌细胞的增殖，不能使平滑肌细胞游走的作用。能够促进新血管形成，修复损害的内皮细胞。
胰岛素(Insulin)是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。
在一个更优选的实施方式中，添加剂包括表皮细胞生长因子60ng/mL，成纤维细胞生长因子60ng/mL和胰岛素40ng/mL。
另外，本发明还提供了上述的干细胞培养基在悬浮培养CD133+细胞中的应用。
应用本发明提供的干细胞培养基对干细胞进行悬浮培养，能够有效减少悬浮培养过程中干细胞微球贴附培养皿的情况。
在一个优选的实施方式中，细胞为肿瘤干细胞或循环肿瘤细胞。
为了有助于更清楚的理解本发明，下面将结合实施例和对比例对本发明的技术方案进行进一步地说明。
实施例1
本实施例提供了一种干细胞培养基，包括：
体积比为10:1的DMEM高糖培养基和人绒毛干细胞的培养上清；
其中，人绒毛干细胞的培养上清中包括表皮细胞生长因子60ng/mL，成纤维细胞生长因子60ng/mL和胰岛素40ng/mL。
实施例2
本实施例提供了一种干细胞培养基，包括：
体积比为5:1的DMEM高糖培养基和人绒毛干细胞的培养上清；
其中，人绒毛干细胞的培养上清中包括表皮细胞生长因子60ng/mL，成纤维细胞生长因子60ng/mL和胰岛素40ng/mL。
实施例3
本实施例提供了一种干细胞培养基，包括：
体积比为15:1的DMEM高糖培养基和人绒毛干细胞的培养上清；
其中，人绒毛干细胞的培养上清中包括表皮细胞生长因子60ng/mL，成纤维细胞生长因子60ng/mL和胰岛素40ng/mL。
实施例4
本实施例提供了一种干细胞培养基，包括：
体积比为8:1的DMEM高糖培养基和人绒毛干细胞的培养上清；
其中，人绒毛干细胞的培养上清中包括表皮细胞生长因子60ng/mL，成纤维细胞生长因子60ng/mL和胰岛素40ng/mL。
实施例5
本实施例提供了一种干细胞培养基，包括：
体积比为12:1的DMEM高糖培养基和人绒毛干细胞的培养上清；
其中，人绒毛干细胞的培养上清中包括表皮细胞生长因子60ng/mL，成纤维细胞生长因子60ng/mL和胰岛素40ng/mL。
实施例6
本实施例提供了一种干细胞培养基，包括：
体积比为10:1的DMEM高糖培养基和人绒毛干细胞的培养上清；
其中，人绒毛干细胞的培养上清中包括表皮细胞生长因子20ng/mL，成纤维细胞生长因子100ng/mL和胰岛素10ng/mL。
实施例7
本实施例提供了一种干细胞培养基，包括：
体积比为10:1的DMEM高糖培养基和人绒毛干细胞的培养上清；
其中，人绒毛干细胞的培养上清中包括表皮细胞生长因子100ng/mL，成纤维细胞生长因子20ng/mL和胰岛素70ng/mL。
对比例1
本对比例提供了一种干细胞培养基，包括：
体积比为4:1的DMEM高糖培养基和人绒毛干细胞的培养上清；
其中，人绒毛干细胞的培养上清中包括表皮细胞生长因子60ng/mL，成纤维细胞生长因子60ng/mL和胰岛素40ng/mL。
对比例2
本对比例提供了一种干细胞培养基，包括：
体积比为16:1的DMEM高糖培养基和人绒毛干细胞的培养上清；
其中，人绒毛干细胞的培养上清中包括表皮细胞生长因子60ng/mL，成纤维细胞生长因子60ng/mL和胰岛素40ng/mL。
对比例3
本对比例提供了一种干细胞培养基，包括：
体积比为10:1的DMEM高糖培养基和人绒毛干细胞的培养上清；
其中，人绒毛干细胞的培养上清中包括表皮细胞生长因子10ng/mL，成纤维细胞生长因子120ng/mL和胰岛素5ng/mL。
对比例4
本对比例提供了一种干细胞培养基，包括：
体积比为10:1的DMEM高糖培养基和人绒毛干细胞的培养上清；
其中，人绒毛干细胞的培养上清中包括表皮细胞生长因子120ng/mL，成纤维细胞生长因子10ng/mL和胰岛素80ng/mL。
对比例5
DMEM高糖培养基(GibcoTM11995065)。
对比例6
DMEM高糖培养基+10％胎牛血清(GibcoTM11995065)。
本发明实施例1至实施例7和对比例1至对比例4提供的干细胞培养基中所用的人绒毛干细胞的培养上清，制备方法如下：
将P2-P4代生长良好的人绒毛干细胞传代前的培养上清转入15mL离心管中，3000rpm/min，离心10分钟。取上清，以0.22μm滤器(MiliporeSLGP033R)在超净工作台中过滤除菌，5mL每支分装。冻存于-80℃，或立即使用。
为了对本发明提供的干细胞培养基的有益效果进行进一步的说明，进行如下实验：
人绒毛干细胞培养上清的获取
将P2-P4代生长良好的人绒毛干细胞传代前的培养上清转入15mL离心管中，3000rpm/min，离心10分钟。取上清，以0.22μm滤器(Milipore SLGP033R)在超净工作台中过滤除菌，5mL每支分装。冻存于-80℃，或立即使用。
培养基的配置
取DMEM培养基(GibcoTM 11995065)和分装好的干细胞培养上清，在超净工作台中无菌环境下按实施例1至实施例7和对比例1至对比例4提供的比例混匀，置于4℃备用。
实验例1不同培养基对肿瘤干细胞微球培养的影响
相同数量VCaP细胞分别接种于装有本发明实施例1至7和对比例1至6提供的干细胞培养基的软琼脂包被的培养皿中，培养14天后，比较不同培养基对VCaP细胞微球培养的影响。结果如表1所示。
表1不同培养基对肿瘤干细胞微球培养的影响
从表1的结果可以看出，应用本发明实施例1至实施例7提供的干细胞培养基对VCaP细胞进行培养，VCaP细胞微球贴壁的占比均小于11％，其中以本发明实施例1提供的干细胞培养基对VCaP细胞进行培养的效果最好，无任何VCaP细胞微球贴附。而应用本发明对比例1至对比例6提供的干细胞培养基对VCaP细胞进行培养，VCaP细胞微球贴壁的占比均大于应用本发明实施例中提供干细胞培养基对VCaP细胞进行培养的贴壁占比，其中以对比例5提供的市售的细胞培养基培养体系培养VCaP细胞效果最差，有35％的VCaP细胞微球贴附培养皿中。说明本发明提供的干细胞培养基通过合理的组分和配比，对肿瘤干细胞微球的培养达到了较好的效果。
其中，从VCaP细胞中筛选到的VCaP细胞的基本形态成球如图1A和图1B所示。选择观察本发明实施例1，实施例2和对比例5提供的干细胞培养基对VCaP细胞进行培养的生长状态，结果如图2A、图2B和图2C所示，从结果图中可以看出从VCaP细胞中筛选到的在不同肿瘤干细胞培养基中的生长状态，其中5：1混合的培养基中细胞成球生长状态最佳。
实验例2RT-PCR检测肿瘤干细胞微球中肿瘤干细胞分子标记物的表达
选择应用本发明实施例1、对比例5和对比例6提供的干细胞培养基培养得到的肿瘤干细胞，收集细胞离心得到肿瘤干细胞微球后，加入1mL TRI
同时收集贴壁培养的肿瘤细胞，分别抽提肿瘤干细胞微球和贴壁培养细胞中的总RNA，反转录合成cDNA(PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit，TAKARA)。所得cDNA进行荧光实时定量PCR检测肿瘤干细胞分子标记物的表达(SYBR Green Master Mix，TAKARA)。以β-actin为内参，采用2△△ct方法计算CD44，CD133，CD24，CK5，CK14，OCT4，SOX2，BMI1，Nanog等基因的相对表达量，比较贴壁培养和悬浮培养后表达量的差异。结果如图3所示，从图中可以看出，应用本发明实施例1提供的干细胞培养基悬浮培养后富集所得的微球细胞中的肿瘤干细胞分子标记物表达均高于本发明实施例5和实施例6提供的干细胞培养基贴壁培养，说明了本发明实施例1提供的干细胞培养基对肿瘤干细胞的富集效应更强。
实验例3肿瘤干细胞微球细胞小鼠成瘤能力的检测
雄性裸鼠18只，随机分成3组，每组6只。贴壁VCaP细胞分别用本发明实施例1、实施例2和对比例5提供的干细胞培养基培养，收集细胞离心富集到肿瘤干细胞微球消化成细胞后，重悬于DMEM基础培养液，计数，梯度稀释，分别皮下接种至裸鼠腹部两侧。3组裸鼠接种细胞数量104/只。每周监测肿瘤生长，游标卡尺检测肿瘤大小，其计算公式为：长×宽2。
经过不同时间检测不同干细胞培养基培养的肿瘤干细胞体外成瘤能力，结果如图4所示，从图中可以看出，在不同培养体系下肿瘤干细胞成瘤能力不一，其中5:1混合体系培养的肿瘤干细胞成瘤能力最高，说明此混合培养体系适合肿瘤干细胞的生长。
实施例4干细胞培养基在悬浮培养CD133+细胞中的应用
选择应用本发明实施例1、对比例5和对比例6提供的干细胞培养基培养得到的循环肿瘤细胞，通过磁珠分选得到CD133+和CD133-两类细胞，同时用悬浮法培养CD133+的和CD133-的细胞，悬浮法培养到14天左右在显微镜下观察细胞成球情况。结果如图5所示，从图中比较可以看出，CD133+的细胞在此培养体系下成球能力较CD133-的细胞更强，说明此干细胞培养基更适合悬浮培养CD133+的细胞。
综上所述，本发明提供的干细胞培养基与其他干细胞培养基相比，配置简单，对干细胞的培养扩增效率高。同时，不含有胎牛血清成分，从而彻底杜绝了过敏反应，以及一些动物病毒的污染引入，安全性高。其中，所用到的基础培养基可通过商业化途径购买，所用到的添加剂可对绒毛干细胞培养废弃物进行重复利用，很大程度上降低了肿瘤干细胞培养在基础研究和临床应用中的成本，且操作无需特殊设备，简单可行。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种干细胞培养基，其特征在于，所述干细胞培养基包括：
基础培养基和添加剂；
所述基础培养基为高糖型培养基，所述添加剂为干细胞的培养上清，所述干细胞的培养上清为人绒毛干细胞的培养上清。
2.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基与所述添加剂的体积比为1:1-10:1。
3.根据权利要求2所述的干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基与所述添加剂的体积比为2:1-8:1。
4.根据权利要求3所述的干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基与所述添加剂的体积比为5:1。
5.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，所述高糖型培养基为DMEM高糖培养基。
6.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，所述人绒毛干细胞为培养至P2-P4代的人绒毛干细胞。
7.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，所述添加剂包括表皮细胞生长因子10-100ng/mL，成纤维细胞生长因子10-100ng/mL和胰岛素10-100ng/mL。
8.根据权利要求7所述的干细胞培养基，其特征在于，所述添加剂包括表皮细胞生长因子60ng/mL，成纤维细胞生长因子60ng/mL和胰岛素40ng/mL。
9.如权利要求1-8任一项所述的干细胞培养基在悬浮培养CD133+细胞中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述细胞为肿瘤干细胞或循环肿瘤细胞。
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