CN112839667A - 褐色脂肪细胞上清、其制备法及使用 - Google Patents

Abstract

本发明提供包含褐色脂肪细胞的上清或其纯化物的具有代谢改善作用的组合物。另外本发明提供不使用含有高浓度葡萄糖的培养液而制备该上清的方法。本发明提供对于褐色脂肪细胞的上清的制备有用的，使用多能性干细胞的褐色脂肪细胞制造方法。在本发明中，成功从褐色脂肪细胞中取得了具有代谢改善作用的上清。该上清可以不使用含有高浓度葡萄糖的培养液而取得。另外本发明还成功使用无饲养层培养体系，在不添加细胞因子鸡尾酒的条件下从多能性干细胞生成了褐色脂肪细胞。本发明的褐色脂肪细胞上清可以期待应用于对糖代谢疾病的治疗药或美容品的开发。

Description

褐色脂肪细胞上清、其制备法及使用

技术领域

本发明涉及一种具有胰岛素分泌促进作用及胰岛β细胞·骨骼肌细胞·心肌细胞的葡萄糖吸收亢进作用、线粒体机能提高作用和/或皮肤损伤治愈促进作用等的褐色脂肪细胞上清的制备法，及包含褐色脂肪细胞上清的组合物和将使用其的代谢障碍的矫正等作为目的内科疗法等。

背景技术

表现出肥胖以及超重的人口正在世界范围内增加。根据2017年的“全球疾病、伤害和危险因素研究(Global Burdenof Diseases,Injuries,and Risk Fa ctors Study)”，世界上3人中有1人肥胖或超重(非专利文献1)。肥胖或超重会使得2型糖尿病，缺血性心脏疾病，脑血管障碍，癌等威胁生命的疾病群的发病风险上升。进一步而言，过去曾经历过肥胖或超重的人，比维持正常体重的人死亡风险更高(非专利文献2)。另外，孕妇的血糖值越高，对新生儿的负担越会无限增大(非专利文献3)，有报道称，怀孕初期肥胖或超重的母亲的孩子的脑性麻痹发病率高(非专利文献4)，肥胖或超重的孕妇的孩子容易畸形(非专利文献5)。如上所述，肥胖以及超重对本人自不必说，对下一代的健康的影响也很严重。

随着肥胖/超重的罹患者的增加，正成为最大的威胁的是2型糖尿病患者的增加。糖尿病的患病率在日本估计有950万人，全世界估计有4.2亿人。另外根据2013年在中国的调查，成人的糖尿病的患病率推测为10.9％，糖尿病前期的患病率推测为35.7％(非专利文献6)，且有报道称糖尿病患者的死亡风险比非糖尿病者高2倍(非专利文献7)。另外根据1983年至2011年的在美国的调查，相对于缺血性心脏疾病的罹患者下降约20％，糖尿病的罹患者正在增加(非专利文献8)。且在墨西哥约4人中就有1人被诊断为糖尿病(非专利文献9)。

糖尿病中的2型糖尿病有并发症发病率高的问题。例如，根据对20岁之前被诊断为糖尿病的2018人约8年的追踪调查，并发症患病率相对于1型糖尿病患者的32％，2型糖尿病患者为72％(非专利文献10)。

如上所述，肥胖/超重的罹患者的增加，随之产生的2型糖尿病的患病率的增加，是需要世界范围内对策的紧急课题。

但是，肥胖/超重的罹患者减重，进一步维持减重后的体重并不容易。并且，1988-2014年在美国的调查报道了“想瘦下来的肥胖/超重的成人”的比例正在下降(非专利文献11)。

现行2型糖尿病的治疗不能说发挥了充分的效果，患者的治疗满足度也较低。例如，根据2017年2月的美国的报道，接受肥胖手术的糖尿病患者(胃绕道组)的5年期的糖化血红蛋白(HbA1c)在6％以下的比例为29％，但只接受内科治疗的组只有5％(非专利文献12)。如上所述，就糖尿病患者的血糖控制而言，肥胖手术凌驾于内科治疗。然而，肥胖手术是伴随有侵袭的措施，所以人们希望开发一种凌驾于现行的治疗药的优异的2型糖尿病治疗药。

进一步而言，2016年报道的前瞻性观察试验的数据分析显示了心血管疾病风险从HbA1c5.7％开始上升(非专利文献13)。这意味着，从以完全阻止2型糖尿病中的并发症发病为目标的立场出发，现行的内科治疗在95％的病例中只采取了不充分的对策。

就现状而言，大量的研究费以及医疗费被投入于并发症的早期诊断以及治疗。但是，最应该优先进行的是开发可以将血糖控制在HbA1c5.7％以下的优秀的治疗药。

实际上，在2017年1月30日，拥有糖尿病治疗药的世界第1位的贩卖实绩制药企业，发表将与与英国的牛津大学合作开发2型糖尿病的新治疗方法。该社还发表了将在该大学校区内设立新的研究中心，在今后10年内投入1亿1500万镑。这是现行的2型糖尿病的内科治疗的不充分的写照的其中一个例子。

综上所述，在2型糖尿病中，可以实现严格的血糖控制(HbA1c≤5.7％)的新型治疗药的开发，是极其重要且紧急性高的新药开发事业。但是，立足于对2型糖尿病的病态生理传统的理解，只是基于没有新颖性的战略对新药开发研究进行重复，是无法开发出达成所述目标的新药的。为了进行安全性和有效性均优异的治疗药的开发，需要对2型糖尿病的病态生理的理解本身从根本开始重新探讨。

从此观点出发应该注意的是“褐色脂肪组织(Brownadiposetissue:BAT)”。

构成BAT的褐色脂肪细胞是在寒冷环境中，体温维持等体产热的需求被激发时，将储存在细胞内的多胞性脂肪滴中的中性脂肪快速分解，使用生成的脂肪酸，通过线粒体中的非偶联的呼吸放出热能，以此参与体热的维持。BAT在小型冬眠动物中，作为参与冬眠结束时快速产生体热的脂肪组织而被研究，而在2009年，有报道称人类成人中也存在BAT(非专利文献14-17)。

在使用基因编辑小鼠的研究中，证实了BAT具有“防止肥胖”“糖代谢的改善”“脂质代谢的改善”“瘦素敏感性亢进”的作用。另外在人中，使用了癌检查或短期综合体检的数据进行的疫学研究以及健康人志愿者参加的研究也显示了其参与“中年肥胖的防止”和“糖代谢的改善”。

当初，BAT的代谢改善作用被认为是通过脂肪燃烧消费卡路里引起的体重减少的次级效果。但是，从相对于褐色脂肪细胞缺陷小鼠表现高度肥胖和糖尿病，只使得褐色脂肪细胞的产热能力欠损的小鼠既不表现肥胖也不表现糖代谢障碍这点来看，褐色脂肪细胞的糖代谢改善效果并不是以产热介导的次级效果，而是“可溶性因子(激素)介导的作用”。“褐色脂肪细胞产生的糖代谢改善性激素”被统称为BATokine，面向其筛选的研究在全世界范围内正在被推进。但是，直至现在，褐色脂肪细胞特异产生的，或作为褐色脂肪细胞的主要的产生源的“真正的BATokine”还未被筛选到。例如，已知的具有代谢改善作用的白介素6(IL6)或成纤维细胞生长因子21(FGF21)等细胞因子虽然作为源自褐色脂肪细胞的糖代谢改善激素被报道，但它们主要的产生源，IL6的是巨噬细胞或肥大细胞等的自然免疫细胞，FGF21的是胰脏等的“褐色脂肪细胞以外的细胞”，褐色脂肪细胞只是产生所述细胞因子的一部分，将它们称为源自褐色脂肪细胞的糖代谢改善激素并不合适。

作为“真正的BATokines”未被筛选到的理由，可以举出从小鼠的体内回收的BAT作为用于BATokine探索的材料并不合适。由于作为小鼠BAT高表达胰脏外分泌腺产生的消化酶例如胰凝乳蛋白酶类蛋白分解酶组、胰蛋白酶类蛋白分解酶组、核酸分解酶Rnase1之类的强分解酶组，从自小鼠体内将BAT取出的瞬间褐色脂肪细胞的品质就开始快速劣化。因此，要在非损伤状态下取得BAT产生激素群极其困难(非专利文献18)。

另一方面，从人生物体取得BAT用于研究从伦理的观点出发是不可能的。另外，无论是小鼠BAT或人BAT，将回收的成熟褐色脂肪细胞维持培养的技术、扩增培养的技术、冻结保存的技术都不存在。即，用BAT检体筛选“真的BATokines”是不可能的。

综上所述，要取得面向以代谢改善为目的临床应用的，保持BATokine活性且含有充分量的BATokines褐色脂肪细胞的培养上清，需要在不受蛋白分解酶组的攻击，且不抵触伦理的问题的条件下，可以稳定且随时制备高品质的褐色脂肪细胞的技术。这里的“高品质褐色脂肪细胞”必须可以发挥与产热能力独立的糖代谢改善作用，且其上清具有糖代谢改善作用。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2012/147853

非专利文献

非专利文献1：The GBD 2015Obesity Collaborators，New England Journal ofMedicine杂志，第377卷，第13-27页，2017年

非专利文献2：Yu等，Annals of Internal Medicine杂志，第166卷，第613-620页，2017年

非专利文献3：Farrar等，BMJ第354卷，i4694，2016年

非专利文献4：Villamor等，JAMA杂志，第317卷，第925-936页，2017年

非专利文献5：Persson等，BMJ杂志，第357卷，第j2563页，2017年非专利文献6：Wang等，JAMA第317卷，第2515-2523页，2017年非专利文献7：Bragg等，JAMA第317卷，第280-289页，2017年

非专利文献8；Navar等，JAMA第316卷，第2041-2043页，2016年

非专利文献9：Alegre-Diaz等，New England Journal of Medicine第375卷，第1961-1971页，2016年

非专利文献10：Dabelea等，JAMA第317卷，第825-835页，2017年

非专利文献11：Snook等，JAMA杂志，第317卷，第971-973页，2017年

非专利文献12：Schauer等，New England Journal of Medicine第376卷，第641-651页，2017年

非专利文献13：Huang等，BMJ第355卷，i5953，2016年

非专利文献14：van Marken Lichtenbelt等，New England Journal of Medicine杂志，第360卷，第1500-1508页，2009年

非专利文献15：Cypess等，New England Journal of Medicine杂志，第360卷，第1509-1517页，2009年

非专利文献16：Virtanen等，New England Journal of Medicine杂志，第360卷，第1518-1525页，2009年

非专利文献17：Saito等，Diabetes杂志，第58卷，第1526-1531页，2009年

非专利文献18：Kobayashi等，Medical Research Archive杂志，第4卷，2016年

非专利文献19：Nishio等，Cell Metabolism杂志，第16卷，第394-406页，2012年

非专利文献20：Yoneshiro等，Obesity第19卷，第1755-1760页，2011年

非专利文献21：Beijer等，Oncol Rev第6卷，第e11项，2012年

非专利文献22：Carson等，Exerc Sport Sci Rev第38卷，第168-176页，2010年

非专利文献23：Galat等，Stem Cell Research&Therapy第8卷，第67项，2017年

非专利文献24：Bendall等，Nature第448卷，第1015-第1021页，2007年

发明内容

本发明所要解决的技术问题

本发明以提供包含褐色脂肪细胞的上清的，具有代谢改善能力的组合物为课题。另外本发明，以提供不使用包含氨基酸或维生素、高浓度的葡萄糖等的培养液，制备具有代谢改善能力的褐色脂肪细胞的上清的方法为课题。另外本发明以提供可用于褐色脂肪细胞自身以及其上清的制备的，源自多能性干细胞的褐色脂肪细胞的制造方法为课题。

本发明另外将用于制备具有代谢改善能力的上清成分(SUP)的技术为课题，上述具有代谢改善能力的上清成分(SUP)是通过在只含有盐类和低葡萄糖的缓冲液中对以不含外源性细胞因子的“最小需要培养基”从多能性干细胞制备的褐色脂肪细胞(BA)进行培养而得到的。

本发明另外以提供包含褐色脂肪细胞的上清的线粒体浓缩物为课题。

本发明另外以提供用于制备包含褐色脂肪细胞的上清的具有损伤治愈促进能力的上清成分(SUP)的技术为课题。

解决技术问题的技术手段

本发明的发明人已开发了用于从多能性干细胞制备褐色脂肪细胞的技术(专利文献1)，并确认了制得的源自多能性干细胞的褐色脂肪细胞在移植动物中发挥糖代谢改善作用(非专利文献19)。且，从在移植源自多能性干细胞的褐色脂肪细胞(以下，称为褐色脂肪细胞)16小时后发挥糖代谢改善作用来看，其作用不是随藉由产热消费卡路里而造成的体重减少的次级效果，而是基于移植的细胞进行的直接作用。如上所述，源自多能性干细胞的褐色脂肪细胞，即使以代谢改善为目的临床使用中，也满足作为有效材料应当具有的条件。

进一步而言，由于多能性干细胞具有无限增殖能力，可以稳定且随时地制备褐色脂肪细胞。另外，由于直到制备褐色脂肪细胞的全步骤，在细胞培养室中实施，可以完全回避从生物体中回收组织以及目的细胞的分离的步骤中不可避免的来自蛋白分解酶组的攻击。因此，通过应用从多能性干细胞制备褐色脂肪细胞的技术，只需使用通用的细胞培养技术，可以稳定且随时地取得高品质的褐色脂肪细胞。但是，褐色脂肪细胞的上清是否具有生理活性仍然不明，另外，如何取得具有活性的上清也尚未被探讨。

人BAT随着年龄增长会减少或消失。例如，PET-CT得到的BAT阳性率从25至29岁开始减少，在40至49岁为不足百分之三十，在50至59岁为略高于百分之十(非专利文献20)。但是，不中年肥胖，内脏脂肪量也不变化的人为BAT阳性(非专利文献20)。从此可以看出，肥胖/超重、代谢综合征、2型糖尿病的病态可以认为是“褐色脂肪细胞欠乏症”。即，对于肥胖/超重、代谢综合征、2型糖尿病等的代谢障碍性疾病，补充欠缺的褐色脂肪细胞的机能的疗法具有能为现行肥胖手术成绩较差的2型糖尿病的内科疗法带来革命性发展的可能性。如果不补充褐色脂肪细胞本身，而只补充褐色脂肪细胞的上清也可以发挥效果的话将会是划时代的发现。

为了确认褐色脂肪细胞的上清是否具有药理效果，本发明的发明人首先尝试了将在传统的培养层上进行了维持培养的多能性干细胞分化为褐色脂肪细胞，并采取其上清。褐色脂肪细胞的分化培养基中含有细胞生存所需要各种氨基酸或维生素类、脂质及高浓度的葡萄糖(约17.5mM)，另外，添加了褐色脂肪细胞的分化所需要的细胞因子鸡尾酒(IL6、VEGF、Flt-3L、SCF、BMP7)。本发明的发明人，为了排除这些成分，在只含有盐类和高浓度葡萄糖(16.8mM)的缓冲液(以下，盐类葡萄糖缓冲液)中培养褐色脂肪细胞，将其上清回收后测定了活性。

与细胞培养用培养基相比，盐类葡萄糖缓冲液为压倒性的低营养，不含细胞生存所需要的氨基酸或蛋白成分。因此在盐类葡萄糖缓冲液中孵育褐色脂肪细胞并回收的上清被预测为几乎无活性，但在将此上清给药到小鼠皮下并测定血糖值的变化时，发现空腹时血糖值显著降低(图1A，左)。另外胰岛素抵抗性指数HOMA-IR值也通过上清的给药而显著降低(图1A，中)。如上所述，确认了将褐色脂肪细胞在盐类葡萄糖缓冲液中培养而得到的上清具有使胰岛素敏感性亢进、并使血糖值降低的活性。

另一方面，尽管移植了源自多能性干细胞的褐色脂肪细胞的小鼠的空腹时中性脂肪(TG)值降低，但给药了上清的小鼠在空腹时TG值的显著的降低却未被观察到。因此，该结果教导了褐色脂肪细胞的上清具有发挥糖代谢改善作用的生理活性，另一方面脂质代谢的改善作用是褐色脂肪细胞的作用而不是上清的作用。

如上所述，确认了褐色脂肪细胞的上清独立于褐色脂肪细胞具有的通过脂肪燃烧进行的体产热，具有发挥糖代谢改善作用的作用。需要说明的是，从上清给药小鼠的经口葡萄糖负荷15分钟后的血中胰岛素值增加来看(图1B)，褐色脂肪细胞的上清不仅胰岛素敏感性亢进，还具有促进胰岛素分泌的作用。

另外，对在多种骨骼肌细胞中上清对于葡萄糖转运体基因Glut4的作用进行调查的结果，发现了褐色脂肪细胞的上清使Glut4的表达量显著提升(图2A，B)。另外，对上清对于胰岛β细胞的作用进行调查的结果，发现了通过上清的添加，胰岛素分泌量显著增加(图3A，B)。

如上所述，褐色脂肪细胞的上清具有降低血糖值、胰岛素敏感性亢进以及胰岛β细胞的胰岛素分泌促进、骨骼肌细胞中葡萄糖转运体-基因的表达提高等多种作用，且显示可以使用不含氨基酸或维生素等的营养成分的盐类葡萄糖缓冲液取得具有活性的上清。

本发明的发明人接下来，对使用不含高浓度葡萄糖的盐类缓冲液是否也能取得具有活性的上清进行了试验。使用含有将缓冲液中的葡萄糖浓度降低为1/6的低浓度葡萄糖(2.8mM)的盐类缓冲液培养褐色脂肪细胞，使用得到的上清调查对于胰岛β细胞的胰岛素分泌促进作用的结果，从胰岛素分泌显著增加来看，确认了即使使用低浓度葡萄糖缓冲液，也能从褐色脂肪细胞取得具有活性的上清。

但是源自多能性干细胞的褐色脂肪细胞是从在培养层细胞上维持培养的多能性干细胞分化而得到的。本发明的发明人，为了完全排除来自培养层细胞的影响，考虑用无饲养层培养体系培养多能性干细胞，从所述细胞生成褐色脂肪细胞并取得上清。因此以无饲养层系培养多能性干细胞，将得到的多能性干细胞分散为单细胞之后，通过使用有细胞凝聚物制备用培养基的浮游培养形成球体，将得到的球体回收，用褐色脂肪细胞诱导培养基进行了培养。其结果，细胞观察到褐色脂肪细胞特征性的多胞性脂肪滴(图5B左)，以OilRedO染色(图5B中)并确认了与褐色脂肪细胞的产热能力相关的UCP1蛋白的表达(图5B右)，其他的褐色脂肪细胞的标记物基因的表达也被观察到。如上所述，确认了从用无饲养层培养体系培养的多能性干细胞，也可以生成褐色脂肪细胞。

对通过用含低浓度葡萄糖(2.8mM)的盐类缓冲液培养从用无饲养层培养体系培养的多能性干细胞生成的褐色脂肪细胞后回收的上清的活性进行调查的结果，发现其可以发挥与用高浓度胰岛素刺激的情况下同程度的，极强的胰岛素分泌促进能力(图6)。如上所述，本发明的发明人，首次成功地取得了完全不含有来自培养层细胞的成分的褐色脂肪细胞的上清，该上清具有胰岛素分泌促进作用等。褐色脂肪细胞的上清可以进行脱盐处理，也可以在保持活性状态下制备为冻干物。

另外，在进行使用以无饲养层培养体系培养的多能性干细胞生成褐色脂肪细胞的所述的实验的过程中本发明的发明人惊讶地发现，在用无饲养层培养体系培养的多能性干细胞中，即使不添加传统上为生成褐色脂肪细胞需要添加的细胞因子鸡尾酒，只需在将多能性干细胞分散为单细胞后，通过使用不含细胞因子鸡尾酒的细胞凝聚物制备用培养基进行浮游培养使其形成球体，将得到的球体型的细胞，在不含细胞因子鸡尾酒的褐色脂肪细胞诱导培养基中培养，褐色脂肪细胞自发地进行分化(图7)。

将如上生成的褐色脂肪细胞，用含低浓度葡萄糖(2.8mM)的盐类缓冲液培养而取得的上清可以发挥很强的胰岛素分泌促进能力。由此，首次成功地不使用细胞因子鸡尾酒而从多能性干细胞成功生成褐色脂肪细胞，并成功地取得该细胞的具有胰岛素分泌促进能力的上清(图8)。此方法由于不仅不使用培养层细胞，也不需要添加细胞因子鸡尾酒，因此可以制造不含异种细胞(褐色脂肪细胞以及源自其的细胞以外的细胞)，且不含外源性细胞因子(并非源自多能性干细胞或由此生成的褐色脂肪细胞的细胞因子)的、品质极高的褐色脂肪细胞以及其上清。

虽然从多能性干细胞生成褐色脂肪细胞时使用的培养基是无血清培养基，但含有具有担保细胞生存性效果的牛血清白蛋白(BSA)、α-硫代甘油(硫代甘油(α-MTG))、proteinfreehybridomamix(PFHMII,GibCO#12040-077,LifeTechnologies,Inc.)。为了调查在褐色脂肪细胞的分化诱导中这些是否是必须的，对用无饲养层培养体系维持的多能性干细胞通过与上述同样的单细胞分散操作进行褐色脂肪细胞的分化诱导，使用在不含细胞因子鸡尾酒的培养基中进一步除去BSA、α-MTG以及PFHMII的培养基(最少需要培养基)进行了培养。其结果，和使用含细胞因子培养基时同样形成了细胞凝聚体，且观察到了多胞性脂肪滴等的成熟褐色脂肪细胞特有的细胞形态，褐色脂肪细胞特有的标记物基因的表达也被确认到了(图9A～F)。

为了取得从用无饲养层培养体系维持的多能性干细胞用如上所述的最少需要培养基制得的褐色脂肪细胞的上清，用含低浓度葡萄糖(2.8mM)的盐类缓冲液培养后回收了其上清。如此制备的褐色脂肪细胞上清也显示了促进胰岛素分泌的活性(图10)。

另外，从用无饲养层培养体系维持的多能性干细胞，以如上所述的最少需要培养基制备褐色脂肪细胞，从制得的褐色脂肪细胞以含低浓度葡萄糖(2.8mM)的盐类缓冲液制备上清，将其添加到胰岛β细胞中，调查了其对葡萄糖吸收的影响的结果，发现了上清的添加使β细胞的葡萄糖吸收能力显著提高(图11)。

在不使用细胞因子鸡尾酒时，细胞凝聚物制备用培养基和褐色脂肪细胞诱导培养基可以使用相同组成的培养基(例如最小需要培养基)。将用无饲养层培养体系维持的多能性干细胞分散为单细胞后，在最小需要培养基中，使用生物反应器进行旋转培养，用1步培养进行了褐色脂肪细胞的制造的结果，得到的细胞的培养上清显示出了与用2步培养得到的褐色脂肪细胞的上清相同的胰岛素分泌促进活性(图12)。

另外，对褐色脂肪细胞的上清进行160000G超离心处理，将上清成分和沉淀物成分(颗粒)分别回收，使用胰岛β细胞调查了对胰岛素分泌的影响，结果显示胰岛素分泌促进活性的大部分在上清成分被回收，但极少量的颗粒成分(外泌体级分)也显示了胰岛素分泌促进活性(图13)。这显示了虽然褐色脂肪细胞的上清中的胰岛素分泌促进活性的主要的作用是来自可溶性因子，但也含有外泌体性的因子。

另外确认了将褐色脂肪细胞用含低浓度葡萄糖(2.8mM)的盐类缓冲液培养取得的上清可以发挥促进人骨骼肌细胞葡萄糖吸收的作用(图15)，且即使对褐色脂肪细胞的上清进行生物素化处理其作用也不会变化(图16)。另外，确认了褐色脂肪细胞的培养上清，能促进人心肌细胞的葡萄糖吸收(图17)。

另外，确认了，用含低浓度葡萄糖(2.8mM)的盐类缓冲液培养褐色脂肪细胞而取得的上清，进行离心处理回收的沉淀物中浓缩而存在线粒体(图18)。

另外，确认了，用最小需要培养基培养褐色脂肪细胞而取得的上清，在使用人血管内皮肤细胞的伤口愈合试验(wound-healing分析)中具有促进损伤的修复的作用(图19)。

由于褐色脂肪细胞含有大量具有高呼吸机能的线粒体，是高机能性线粒体的优异的供给源。对于由于线粒体呼吸功能障碍的而无法脱离体外式膜型人工心肺的重症小儿心力衰竭，线粒体移植疗法可以发挥极高的有效性(Emani等，胸外科与心血管外科(TheJournal of Thoracic and Cardiovascular Surgery)第154卷，第286第-289页,2017年)。另外，对于新生儿的心力衰竭病例，线粒体移植疗法的有效性也有被报道(GinaKolata，TheNewYorkTimes2018年7月10日，https://www.nytimes.com/2018/07/10/health/mitochondria-transplant-heart-attack.html)。但是，现行移植使用的是从自身肌肉等自身组织制备的线粒体，存在从组织回收到移植的作业要在手术室中在30分以内完成的时间限制。从本发明可以提供不抵触伦理问题，又可以稳定且随时地供给具有高呼吸机能的线粒体的手段来看，本发明有望可以对线粒体移植疗法的普及做出贡献。

另外，从线粒体含有大量具有消去活性氧作用的抗氧化性蛋白来看，因此可以预测：大量含有高机能性线粒体的褐色脂肪细胞的培养上清中有可能存在抗氧化性蛋白。从活性氧在组织损伤时浓度提高这点来看，可以预测：褐色脂肪细胞的培养上清有可能通过活性氧的消除作用来促进皮肤等组织损伤的恢复。本发明的褐色脂肪细胞的培养上清显示的促进损伤恢复的活性，有可能是由上清中包含的线粒体产生的活性氧的消除作用所贡献的结果。

如上所述，本发明的发明人使用由多能性干细胞制造的褐色脂肪细胞，成功地首次取得了具有糖代谢改善作用的上清。另外发现了通过使用不含氨基酸或维生素的盐类葡萄糖缓冲液培养细胞而不需要使用用于得到上清的培养基，也可以取得具有活性的上清。另外本发明首次提供由通过无饲养层培养体系培养的多能性干细胞制造的褐色脂肪细胞以及其上清。另外本发明首次提供通过使用通过无饲养层培养体系培养的多能性干细胞，在不添加细胞因子鸡尾酒的条件下从多能性干细胞制造褐色脂肪细胞的技术。使用通过无饲养层培养体系培养的多能性干细胞时，不仅不需要细胞因子鸡尾酒，也不需要添加BSA或α-MTG、PFHMII等的添加物。由此，可以获得异种细胞的影响或添加物的混入极少的褐色脂肪细胞的上清成分，在制备作为适于临床使用的制剂时有利。

本发明的上清，除了对胰岛β细胞显示了显著的胰岛素分泌促进作用以及葡萄糖吸收亢进作用，生物体中使血糖值显著降低，使胰岛素抵抗性指数(HOMA-IR值)显著降低。另外本发明的上清还使骨骼肌细胞以及心肌细胞这样的肌肉细胞等中的葡萄糖转运体基因的表达量显著提升，且，从显示出葡萄糖吸收亢进作用这一点来看，可以期待其作用于多脏器而发挥改善糖代谢的作用。

另外，从本发明的上清通过离心处理回收的沉淀物，也就是微粒部分中浓缩存在线粒体以及褐色脂肪细胞的线粒体具有高呼吸能力来看，可以期待其提供用于线粒体移植疗法的优异的材料。

另外，从本发明的上清在使用人血管内皮细胞的伤口愈合试验(Wound Healing分析)中被观察到具有促进损伤恢复的效果来看，可以期待其提供用于促进伴随血管损伤的皮肤损伤的治愈的优异的材料。

即本发明涉及包含褐色脂肪细胞的上清的组合物以及适于上清的制造的褐色脂肪细胞的制造方法以及上清的制造方法等，更具体而言，包含权利要求的各项中记载的发明。需要说明的是，包含引用同一权利要求的权利要求中记载的2个或以上的发明的任意组合的发明是本说明书作为目的的发明。即本发明，包含以下的发明。

〔1〕一种具有糖代谢改善作用的组合物，其包含褐色脂肪细胞的上清。

〔2〕如〔1〕所述的组合物，其中，

该褐色脂肪细胞的上清不包含含有BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6及IGF2的细胞因子鸡尾酒。

〔3〕如〔1〕或〔2〕所述的组合物，其中，

褐色脂肪细胞的上清不含外源性细胞因子。

〔4〕如〔1〕至〔3〕中的任一项所述的组合物，其中，

褐色脂肪细胞是从多能性干细胞制得的褐色脂肪细胞。

〔5〕如〔1〕至〔4〕中的任一项所述的组合物，褐色脂肪细胞是从无饲养层培养的多能性干细胞制得的褐色脂肪细胞。

〔6〕如〔1〕至〔5〕中的任一项所述的组合物，其中，

褐色脂肪细胞是不添加包含BMP4、VEGF、SCF、Flt3L、IL6以及IGF2的细胞因子鸡尾酒和/或包含BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6以及IGF2的细胞因子鸡尾酒而从多能性干细胞生成的褐色脂肪细胞。

〔7〕如〔1〕至〔6〕中的任一项所述的组合物，其中，

上清为通过使褐色脂肪细胞与盐类缓冲液一起孵育而制得的上清。

〔8〕如〔7〕所述的组合物，其中

盐类缓冲液含有葡萄糖。

〔9〕一种制造〔7〕或〔8〕所述的组合物的方法，其包含：

(1)通过无饲养层维持培养多能性干细胞的步骤，

(2)在无血清环境下非贴壁培养步骤(1)的细胞，使其形成细胞凝聚体的步骤，

(3)在无血清环境下培养步骤(2)的细胞，使其分化为褐色脂肪细胞的步骤，

(4)在盐类缓冲液中孵育步骤(3)的褐色脂肪细胞，并回收其上清的步骤。

〔10〕一种制造能用于〔1〕至〔9〕中的任一项所述的组合物或可以用于该组合物的制造的褐色脂肪细胞的制造方法，其包含：

(1)通过无饲养层维持培养多能性干细胞的步骤，

(2)不添加包含BMP4、VEGF、SCF、Flt3L、IL6及IGF2的细胞因子鸡尾酒，并在无血清环境下，使步骤(1)的细胞分散，并进行非贴壁培养，形成细胞凝聚体的步骤，，

(3)不添加包含BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6以及IGF2细胞因子鸡尾酒，在无血清环境下，培养步骤(2)的细胞的步骤。

〔11〕如〔10〕所述的方法，其进一步包括：

(4)在盐类缓冲液中孵育步骤(3)的褐色脂肪细胞，回收其上清的步骤。

〔12〕如〔9〕或〔11〕所述的方法，其中，

盐类缓冲液含有葡萄糖。

〔13〕如〔9〕至〔12〕中的任一项所述的方法，其中，

在步骤(2)和/或(3)中，不与外源性细胞因子一起进行培养。

〔14〕如〔9〕至〔13〕中的任一项所述的方法，其中，

在同样的培养容器中通过相同组分的培养基实施步骤(2)及(3)。

〔15〕如〔9〕至〔14〕中的任一项所述的方法，其进一步包括：

对得到的上清进行脱盐处理的步骤。

〔16〕一种通过〔9〕至〔15〕中的任一项所述的方法所制造的组合物。

〔17〕如〔1〕至〔8〕及〔16〕中的任一项所述的组合物，其是医药或美容用组合物。

〔18〕如〔17〕所述的医药组合物，其是预防或治疗代谢疾病或代谢异常的医药或美容用组合物。

〔19〕如〔17〕所述的医药组合物，其是用于治疗线粒体的功能障碍引起的疾病的医药组合物。

〔20〕如〔17〕所述的医药组合物，其为用于促进皮肤的损伤治愈的医药或美容用组合物。

〔21〕如〔18〕所述的医药或美容用组合物，其中，代谢疾病或代谢异常选自肥胖、超重、代谢综合征以及2型糖尿病。

〔22〕如〔19〕所述的医药组合物，其中，

线粒体的功能障碍选自线粒体病以及新生儿心脏疾病。

〔23〕如〔20〕所述的医药或美容用组合物，其中，

皮肤的损伤选自皮下出血、皮下出血引起的色素沉着、皮下的毛细血管扩张。

〔24〕一种代谢疾病或代谢异常的内科治疗或预防方法，其包含：

将〔18〕或〔21〕所述的医药组合物，向有需要的对象给药的步骤。

〔25〕一种显现线粒体的功能障碍的疾病的内科治疗或预防方法，其包括：

将〔19〕或〔22〕所述的医药组合物，向有需要的对象给药的步骤。

〔26〕一种显现皮肤损伤的疾病的内科治疗或预防方法，其包含：

将〔20〕或〔23〕所述的医药组合物，向有需要的对象给药的步骤。

〔27〕一种组合物，其包含〔1〕至〔8〕及〔16〕中的任一项所述的组合物的组合物，其用于选自降血糖、促进胰岛素分泌、胰岛素敏感性亢进、促进葡萄糖吸收、葡萄糖转运体基因表达亢进、提高线粒体机能、心机能提高及促进皮肤损伤治愈中的用途。

另外本发明还包含以下的发明。

〔28〕一种制造褐色脂肪细胞的方法，其包括：

(1)通过无饲养层维持培养多能性干细胞的步骤，

(2)使步骤(1)的细胞分散，不添加包含BMP4、VEGF、SCF、Flt3L、IL6及IGF2细胞因子鸡尾酒，并在无血清环境下进行非贴壁培养，形成细胞凝聚体的步骤，

(3)不添加包含BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6以及IGF2细胞因子鸡尾酒，在无血清环境下，培养步骤(2)的细胞的步骤。

〔29〕如〔28〕所述的方法，其是制造所述〔1〕至〔9〕中的任一项所述的组合物或可以用于该组合物的制造的褐色脂肪细胞的制造方法。

〔30〕〔28〕或〔29〕所述的方法，其为可以用于所述〔1〕至〔9〕中的任一项所述的组合物或该组合物的制造的褐色脂肪细胞的制造方法。

〔31〕如〔10〕及〔28〕至〔30〕中的任一项所述的方法，其进一步包括：

(4)将步骤(3)的褐色脂肪细胞的上清回收的步骤。

〔32〕如〔31〕所述的方法，其中，

步骤(4)是在盐类缓冲液中孵育步骤(3)的褐色脂肪细胞，并回收其上清的步骤。

〔33〕如〔32〕所述的方法，其中，

盐类缓冲液含有葡萄糖。

〔34〕如〔28〕至〔33〕中的任一项所述的方法，其中，

在步骤(2)和/或(3)中不与外源性细胞因子一起进行培养。

〔35〕如〔28〕至〔34〕中的任一项所述的方法，其中，

在同样的培养容器中通过相同组分的培养基实施步骤(2)及(3)。

〔36〕如〔28〕至〔35〕中的任一项所述的方法，其进一步包括：

对得到的上清进行脱盐处理的步骤。

〔37〕一种通过〔28〕至〔36〕中的任一项所述的方法所制造的组合物一种组合物。

〔38〕如〔37〕所述的组合物，其为医药或美容用组合物。

〔39〕如〔38〕所述的医药组合物，其是预防或治疗代谢疾病或代谢异常的医药或美容用组合物。

〔40〕如〔38〕所述的医药组合物，其用于治疗显现线粒体的功能障碍的疾病的治疗。

〔41〕如〔38〕所述的医药组合物，其是用于治疗皮肤的损伤的医药或美容用组合物。

〔42〕如〔39〕所述的医药或美容用组合物，其中，

代谢疾病或代谢异常选自肥胖、超重、代谢综合征以及2型糖尿病。

〔43〕如〔40〕所述的医药组合物，其中，

线粒体的功能障碍选自线粒体病以及新生儿心脏疾病。

〔44〕如〔41〕所述的医药或美容用组合物，其中，

皮肤的损伤选自皮下出血、皮下出血引起的色素沉着、皮下的毛细血管扩张。

〔45〕一种代谢疾病或代谢异常、显现线粒体的功能障碍的疾病、或伴随皮肤损伤的疾病的内科治疗或预防方法，其包括：

将〔39〕至〔44〕中的任一项所述的医药组合物，向有需要的对象给药的步骤。

〔46〕一种组合物，其包含〔37〕所述的组合物，其用于选自降血糖、促进胰岛素分泌、胰岛素敏感性亢进、促进葡萄糖吸收及葡萄糖转运体基因表达亢进中的用途。

〔47〕一种组合物，其包含〔37〕所述的组合物，其用于线粒体的移植、注入或添加的用途。

〔48〕一种组合物，其包含〔37〕所述的组合物，其用于选自促进皮下出血的治愈、促进皮下出血引起的色素沉着的治愈、促进皮下的毛细血管扩张的治愈中的用途。

需要说明的是，本说明书中记载的任意的技术事项以及其任意的组合，均是本说明书的目的。另外，在这些发明中，除去本说明书所述的任意的事项或其任意的组合外的发明也是本说明书的目的。另外关于本发明，说明书中记载的特定的方式，并不是只公开该方式，而是也公开了包含该方式的上位的本说明书公开的发明中，除去该方式外的发明。

作为糖代谢、肌肉量的调节因子，IL6、FGF2等细胞因子被解析，另一方面，也提出将12,13-diHOME等的脂质介体、miRNA-99b等microRNA以及搬运其的外泌体，理解为广义的调节因子。

如上所述，作为褐色脂肪细胞中生产的BATokine的可能性，可以认为是：除细胞因子等蛋白质以外，可以包含脂质/核酸的各种各样的分子种类、进一步包含细胞外微粒的多种多样的生理活性物质的集合体。即，在推进着眼于褐色脂肪细胞的代谢障碍疾病治疗的开发的基础上，在BATokines的探索、作用机制的解明之前，具有代谢提高作用的“作为多种多样的生理活性物质的集合体的BATokine”的制备技术的开发是重要的课题。

如本发明所示，褐色脂肪细胞的上清，正是可以用于制备作为“多种多样的生理活性物质的集合体”的BATokine的理想材料。但是，褐色脂肪细胞的上清是否具有有益的生理活性，另外，制备上清时，应当使用怎样的缓冲液，尚需进一步的解析或研究。考虑临床应用时，优选“只含有盐类和葡萄糖的缓冲液”(以下，盐类葡萄糖缓冲液)，但是与细胞培养用培养基相比为压倒性的低营养，通过不含细胞生存所需要的氨基酸或蛋白成分的盐类葡萄糖缓冲液培养褐色脂肪细胞并回收的上清，究竟是否具有代谢改善作用尚且不明。

另外，多能性干细胞的褐色脂肪细胞分化诱导培养基，含有高浓度(>17mM)的葡萄糖(参照参考例4)。因此，用通常的含有低浓度葡萄糖的盐类葡萄糖缓冲液制得的上清是否具有代谢改善作用尚且不明。但是，以代谢障碍性疾病的治疗为目的而考虑临床应用时，不优选使用含有高浓度的葡萄糖的缓冲液。

作为另一个问题，可以举出从多能性干细胞制备褐色脂肪细胞时使用的分化诱导培养基中，添加了含有多种合成细胞因子鸡尾酒(合成细胞因子鸡尾酒)(参照参考例4)。使用合成细胞因子等的外源性细胞因子(添加到细胞中，或通过将该细胞因子的基因导入细胞而表达的细胞因子)，在成本高的同时品质管理等操作非常繁杂。另外，该鸡尾酒中含有作为恶病质的原因的IL6或由于具有血管新生能力，促进“癌”的发展的VEGF等，在临床应用中希望这些物质的混入维持在尽可能低的水平。因此最好的方法，是开发一种从多能性干细胞制备褐色脂肪细胞但不使用合成细胞因子鸡尾酒的技术。

在人诱导性多能性干细胞(iPS细胞)的发明之后，面向使用人iPS细胞或其上清的治疗技术的开发的研究正在加速。并且，相对于大多的传统的分化诱导法使用合成细胞因子鸡尾酒，需要开发不使用合成细胞因子鸡尾酒，即，使用“不含外源性细胞因子的培养基”的分化诱导技术。但是，直到现在，使用“不含外源性细胞因子的培养基”成功分化诱导人多能性干细胞的报道只有1例，即只有2017年被报道的用“不含外源性细胞因子的培养基”将人iPS细胞分化诱导为血球产生性血管内皮细胞(hemogenic endothelium)的技术而已(非专利文献23)。在这里，作为外源性细胞因子的替代使用，添加了低分子化合物CHIR99021，其为具有作为强力细胞分化控制作用的蛋白的WNT的激动剂。但是，将源自人多能性干细胞的分化细胞的提取物或培养上清进行临床应用时，适用使用有添加了具有特定的生理作用的低分子化合物的培养基的分化诱导系，考虑可能存在由于低分子化合物的混入而产生的副作用不能认为是优选的分化诱导条件。

进一步而言，在前项的非专利文献23中，人iPS细胞是在与小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)的共培养体系中进行未分化维持培养。但是，众所周知，MEF具有强效的“分化诱导抑制作用”。其机制被认为是MEF分泌FGF2，FGF2在人多能性干细胞的无饲养层维持培养体系中也添加，其对人多能性干细胞起到作为旁分泌因子的作用(非专利文献24)。需要说明的是，有报道称，在用与MEF的共培养体系中未分化维持培养的人多能性干细胞的分化诱导中，在胚样体形成等的“分化诱导初期步骤”中，会混入相当量的MEF。且，由于MEF与人多能性干细胞相接触而存在，因此混入的MEF产生的FGF2会以高浓度对人多能性干细胞产生作用，其结果，会强效地阻止分化诱导。因此，为了超越混入的MEF产生的分化诱导阻止作用以推进分化诱导，需要作为强效的分化诱导的驱动因子的细胞因子鸡尾酒或低分子化合物。可以认为在传统的分化诱导系中，添加作为这些的“强效的分化诱导驱动因子”的细胞因子或低分子激动剂等理由也在于此。

面向源自人多能性干细胞的分化细胞或其提取物或培养上清的临床应用，使用不含外源性细胞因子或低分子化合物的培养基、将分化诱导系简单化，不止在成本面，从安全性的担保的观点出发也很重要。因此，其关键在于将“人多能性干细胞自身分泌的自分泌/旁分泌因子群”的信号发挥到最大，确立具有高指向性的分化诱导系而不使用外源性细胞因子或低分子化合物。并且，为此首先要从分化诱导系中完全排除培养层细胞(MEF)的混入，即，对未分化维持培养进行无饲养层化是必须的步骤。并且本发明不只实现了褐色脂肪细胞的制造的无饲养层化，并且确立了不使用外源性细胞因子等，而使多能性干细胞自动地分化为褐色脂肪细胞的技术。

在培养基开发中，偶尔会出现发现从前被认为是必须的成是非必须的。例如，作为通用的人多能性干细胞的无饲养层培养基Essential 8Medium(Thermo FisherScientific公司)，开发了由现有的无饲养层培养基mTeSR1medium(干细胞技术，Stem CellTechnologies)筛选“最小需求(minimal requirements)”，但是发现从前被认为是必须的牛血清白蛋白(BSA)只是为抵消作为还原剂的β-巯基乙醇(b-ME)的毒性而被需要的，而BSA本身对于人多能性干细胞的未分化状态的维持并不是必须的。进一步还发现了以防止空气引起的自然氧化为目的而在各种培养基中添加的b-ME对人多能性干细胞的未分化维持也不是必须的。即，虽然在添加了b-ME的条件下，BSA是必须的要素，在不存在b-ME的条件下BSA是非必须的。在本发明中被发现的褐色脂肪细胞的分化也可以认为是这样的偶尔会发生的事件之一。

在本发明的多能性干细胞的分化诱导中，去除了外源性细胞因子的添加的必要性，而成功取得了高品质的源自多能性干细胞的分化细胞以及其上清的其中一个理由有可能在于，本发明的培养体系通过以使分化为目标体系以外的细胞体系的细胞死灭为条件，由此赋予向褐色脂肪细胞的高分化指向性。

例如在作为将通过培养层细胞(MEF)维持培养的多能性干细胞向褐色脂肪细胞分化诱导的技术的参考例4中，作为第一步，进行细胞凝聚体形成步骤(步骤(A))。在与MEF的共同培养体系中，由于多能性干细胞是作为“单层的细胞集块(crop)”处理，若将未分化多能性干细胞从培养皿中剥离后直接进行浮游培养，则能简单地形成“球形的细胞集块(球体)”。另一方面，在通过无饲养层培养体系维持的多能性干细胞中，从培养皿剥离后时不时会分散为单细胞水平。但是，从分散为单细胞的状态再形成细胞凝聚体却不一定容易，要使用单细胞制备“球形的细胞集块(球体)”，需要特定的要素(营养成分或细胞因子等)，推测有可能只选择最终有可能分化为褐色脂肪细胞的细胞并使之形成球体。

将以上的论述进行综合考量，可以认为，1)未分化维持培养中的无饲养层化，而对随之得到的多能性干细胞分泌的自分泌/旁分泌因子群进行了最大活用，2)发现通过特意不添加在传统法(参考例4)中使用的细胞因子鸡尾酒，而在细胞集块(球体)形成过程中，对可能分化为褐色脂肪细胞以外系列的细胞进行积极的死灭/排除的条件，通过以上2个条件，在无饲养层/不添加细胞因子条件下成功制造了褐色脂肪细胞。

如上所述，本发明成功提供了可以从多能性干细胞制备适于临床适用的褐色脂肪细胞以及其上清的新技术。从本发明的细胞或上清具有胰岛素分泌促进作用以及胰岛β细胞/骨骼肌细胞/心肌细胞的葡萄糖吸收亢进作用、糖代谢改善效果这点来看，通过给药本发明的上清或其纯化物等，可以均衡且安全地补充在肥胖/超重、代谢综合征、2型糖尿病等的代谢障碍性疾病中缺乏的多样的BATokines。即，开发了使用褐色脂肪细胞或其上清的代谢障碍性疾病的新内科疗法。

另外，从本发明的褐色脂肪细胞或上清中可能含有大量的线粒体来看，对于线粒体病以及新生儿心脏疾病等显现线粒体的功能障碍诸多疾病的预防或治疗也是有效的。另外，从本发明的褐色脂肪细胞或上清具有促进损伤治愈的作用来看，对于表现皮下出血、皮下出血引起的色素沉着、皮下的毛细血管扩张等的皮肤的损伤的诸多疾病的预防或治疗也是有效的。

在褐色脂肪细胞及其上清的制备中，例如，在按照本发明的方法从多能性干细胞制备褐色脂肪细胞，并回收上清时，例如，用盐类葡萄糖缓冲液培养褐色脂肪细胞回收上清，评价代谢改善效果。此时，由于盐类葡萄糖缓冲液中的营养成分缺乏，因此在长时间的培养中褐色脂肪细胞的生存性降低，上清的代谢改善作用可能降低。另一方面，在短时间的培养中无法制备含有充分的活性的上清。因此，要确定用于回收具有代谢改善作用的上清的盐类葡萄糖缓冲液的基本组成(含，葡萄糖浓度)和最适宜的培养时间。

例如，确定使用不添加合成细胞因子鸡尾酒的分化诱导培养基而从多能性干细胞制备褐色脂肪细胞的培养条件。进一步而言，决定使用虽然不含有作为动物由来蛋白的牛血清白蛋白、细胞因子等，但是含有女性激素等的生理活性分子的PFHM-IIProtein-FreeHybridomaMedium(GibCO^TM)等除去了无血清培养基用添加物的培养基时从多能性干细胞制备褐色脂肪细胞的培养条件。并且，将使用决定的“最小需要培养基”制备的源自多能性干细胞的褐色脂肪细胞，用盐类葡萄糖缓冲液培养并回收上清。

由此制备的褐色脂肪细胞的上清中，也含有作为广义的BATokine的“源自褐色脂肪细胞的微粒(外泌体等)”。近年，外泌体等细胞分泌的微粒发挥多样的生理作用这点受到了关注。特别是，有报道称褐色脂肪细胞是循环血中存在的外泌体microRNA的主要的产生源，源自褐色脂肪细胞的外泌体microRNA对代谢改善具有贡献(Thomou等，Nature542:450-455,2017)。即，本发明中制备的褐色脂肪细胞的上清为广义的BATokine的探索研究，以及使用广义BATokine的，以肥胖/超重、代谢综合征、2型糖尿病等表现代谢障碍的疾病的治疗为目的的临床应用提供适宜的材料。

对于所述的制备的褐色脂肪细胞的上清，实行160,000G的加速度的超离心操作，回收使得褐色脂肪细胞分泌的微粒沉淀而得到的上清。通过此作业，上清中含有的外泌体等的细胞外微粒被除去，取得狭义的BATokine。此“狭义的BATokine”，在以肥胖/超重、代谢综合征、2型糖尿病等的显示代谢障碍的疾病的治疗为目的的临床应用中，对于被判断为并不优选细胞外微粒的给药的病例，可以提供更适宜的材料。

另外，本发明的褐色脂肪细胞的上清对于面向未被筛选的BATokine分子的探索的基础研究以及新药研发研究是有效的材料。

另外，本发明的褐色脂肪细胞的上清对于褐色脂肪细胞产生的细胞外微粒的研究是有效的材料。

另外本发明的褐色脂肪细胞的上清，在对于以预防或治疗显现肥胖/超重、代谢综合征、2型糖尿病等代谢异常的诸多疾病为目的的临床应用中，是有效的材料。

另外本发明的褐色脂肪细胞的上清，在对于以预防或治疗显现线粒体病以及新生儿心脏疾病等的线粒体的功能障碍的诸多疾病为目的的临床应用中，是有效的材料。

另外本发明的褐色脂肪细胞的上清，在对于以预防或治疗显现皮下出血、皮下出血引起的色素沉着、皮下的毛细血管扩张等皮肤损伤的诸多疾病为目的的临床应用中，是有效的材料。

发明的效果

本发明发现褐色脂肪细胞(BA)的上清(BA-SUP)具有代谢提高作用，以提供作为用于BATokine探索的新工具，且有可能成为肥胖或糖尿病等的代谢障碍疾病的治疗工具的高滴度BA-SUP以及该源自BA-SUP的干燥品等作为目的，提供BA-SUP以及其制造方法。进一步而言，本发明提供不添加细胞因子而制造BA的方法以及从该细胞回收BA-SUP的方法。特别是根据本发明，可以制备使用通过不含有合成细胞因子的“最小需要培养基”由多能性干细胞制得的BA，通过只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液制备得到的其上清的，保持代谢改善能力的脱盐浓缩品。

从人多能性干细胞具有无限增殖能力和多能性分化能力来看，可以制备人的各种细胞或组织，但在使用细胞本身的移植疗法中癌化的风险评价非常重要。另一方面，使用源自人多能性干细胞的分化细胞的培养上清的给药疗法，没有这样的风险。但是，在人多能性干细胞的分化过程使用的较多的来自动物的因子的混入，在临床使用中需要避免，另外优选尽可能回避合成细胞因子或具有特定的药理作用的低分子化合物等的添加物。根据本发明，可以通过除去这些的添加物的“最小培养基”对BA进行分化诱导。面向源自人多能性干细胞的分化细胞上清的临床使用需要开发：使用最小培养基的分化诱导技术的开发，以及通过只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液制备分化细胞的上清的技术。

使用通过本发明的方法制备的BA，通过只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液制备的上清(BA-SUP)，具有胰岛素分泌促进、胰岛素敏感性亢进(胰岛素标的细胞中的葡萄糖吸收亢进)的作用来看，表现了对于代谢障碍疾病的BA-SUP给药疗法的可能性。进一步而言，BA-SUP可以作为脱盐浓缩品、冻结干燥等的干固品而制备。这样的高活性型BA-SUP脱盐浓缩品是适合临床适用的材料。另外，从本发明的BA-SUP可以从“无饲养层多能性干细胞”通过不含有合成细胞因子等的成分的“最小需要培养基”制备，且可以通过只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液制备来看，可以在通用方法中进行GMP化，可以面向临床应用而开展应用。

以上，本发明提供，对于使用了本发明的上清具有的糖代谢改善作用的新药研发研究、代谢障碍疾病的新治疗工具的开发等有用的新技术。

通过本发明，将使用了褐色脂肪细胞以及其上清的，对显示肥胖/超重、代谢综合征、2型糖尿病等代谢异常的诸多疾病的新预防/治疗方法的开发为目的的，使用动物的研究(含前临床试验)。

通过本发明，以使用褐色脂肪细胞以及其上清的，对于显现线粒体病以及新生儿心脏疾病等线粒体的功能障碍的诸多疾病的新预防/治疗方法的开发为目的的，使用动物的研究(含前临床试验)会得到加速。

通过本发明，以使用褐色脂肪细胞以及其上清的，对于显现皮下出血、皮下出血引起的色素沉着、皮下的毛细血管扩张等皮肤损伤的诸多疾病的新预防/治疗方法的开发为目的的，使用动物的研究(含前临床试验)会得到加速。

通过本发明，以使用褐色脂肪细胞以及其上清的，对于显现肥胖/超重、代谢综合征、2型糖尿病等代谢异常的诸多疾病的新预防/治疗方法的开发会得到加速。

通过本发明，以使用褐色脂肪细胞以及其上清的，对于显现线粒体病以及新生儿心脏疾病等线粒体的功能障碍的诸多疾病的新预防/治疗方法的开发会得到加速。

通过本发明，以使用褐色脂肪细胞以及其上清的，对于显现皮下出血、皮下出血引起的色素沉着、皮下的毛细血管扩张等皮肤损伤的诸多疾病的新预防/治疗方法的开发会得到加速。

另外本发明的褐色脂肪细胞以及其上清可以用于各种美容目的。

附图说明

图1通过“只含有盐类和高浓度葡萄糖的缓冲液”制备的褐色脂肪细胞上清(BA-SUP)的，小鼠给药时的耐糖能力提高作用。将通过参考例4中记载的方法从人ESC制得的褐色脂肪细胞(BA)，以KRH缓冲液(含有葡萄糖16.8mM)培养16小时，由此制备BA-SUP。对10周龄的ICR系统小鼠的皮下给药KRH缓冲液(含有葡萄糖16.8mM)或BA-SUP500ml，在16小时的绝食后，测定了空腹时血糖值、空腹时血清胰岛素值、空腹时血中中性脂肪值(A)。作为胰岛素抵抗性指标的HOMA-IR值则从空腹时血糖值和空腹时胰岛素值计算得出。另外，经口给药葡萄糖液，测定了15分钟后的血糖值和血清胰岛素值(B)。

图2通过“分化培养基”制得的BA-SUP的对于肌小管细胞的Glut4/GLUT4表达诱导作用。对由小鼠肌肉芽细胞株C2C12分化诱导得到的成熟骨骼肌细胞(肌小管细胞)(A)或人骨骼肌细胞(B)，添加以参考例4记载的分化培养基(步骤(B)用)在明胶涂覆的皿上培养16小时后回收的上清(Control SUP)，或添加通过分化培养基培养16小时的源自人ESC的BA后制备的BA-SUP，在16小时后从细胞制备RNA，通过定量的RT-PCR法分别测定了Glut4、GLUT4基因的表达。

图3以“只含有盐类和高浓度葡萄糖的缓冲液”制备的BA-SUP的对胰岛β细胞的胰岛素分泌促进作用。将由人ESC(KhES-3株)(A)或人iPSC(源自HUVEC，专利文献1，非专利文献19)(B)制得的BA，以KRH缓冲液(16.8mM葡萄糖含有)培养16小时后制得的BA-SUP，或将KRH缓冲液(16.8mM葡萄糖含有)添加至MIN6细胞中，2小时后以ELISA法测定了细胞上清中的胰岛素浓度。需要说明的是，在ELISA测定中，由于样品是经过适当稀释后进行测定，使得数值落在定量性的某个区域，不同的实验间的胰岛素值(ng/ml)不能比较。

图4通过“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制得的BA-SUP的对胰岛β细胞的胰岛素分泌促进作用。将BA-SUP或KRH缓冲液(含有2.8mM葡萄糖)，添加至MIN6细胞中，2小时后以ELISA法测定了细胞上清中的胰岛素浓度，上述BA-SUP通过将由人ESC(KhES-3株)制得的BA，通过KRH缓冲液(含有2.8mM葡萄糖)培养16小时后制得。

图5“通过无饲养层培养体系维持的人多能性干细胞”的BA分化诱导技术。将通过使用了Essential 8培养基和Matrigel^TM Matrix涂覆皿的无饲养层培养体系维持的人ESC(KhES-3株)剥离回收，分散为单细胞后，向低吸附96孔培养皿中播种一定数量的细胞，通过参考例4的步骤(A)用培养基培养8天后制备了细胞凝聚体(A)。其后，通过参考例4的步骤(B)用培养基进一步培养2天制备了BA(B)。另外，对BA关连基因的表达诱导状况通过定量的RT-PCR进行了评价(C)。与使用了参考例4记载的在MEF上维持的KhES-3株时相比毫不逊色的BA分化被诱导，并且确认了其为藉由EN1阳性体节细胞、MYF5阳性肌肉芽细胞的“正确再现生物体中的BA发生过程的分化诱导体系”。

图6使用从“无饲养层培养人ESC”制得的BA，通过“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制得的BA-SUP的对于胰岛β细胞的胰岛素分泌促进作用。将BA-SUP或KRH缓冲液(含有2.8mM葡萄糖)添加至MIN6细胞中，在2小时后以ELISA法测定了细胞上清中的胰岛素浓度，上述BA-SUP是通过将StemFit^TMAK02N和玻连蛋白涂覆皿和无饲养层培养体系维持的人ESC(KhES-3株)与图5同样地制备的源自人ESC(KhES-3株)的BA，以KRH缓冲液(含有2.8mM葡萄糖)培养16小时后回收而得到。发现通过添加BA-SUP，即使在低葡萄糖环境(相当于50mg/dL)下，也产生了和高葡萄糖环境(相当于300mg/dL)同水平的胰岛素分泌。

图7“无饲养层人多能性干细胞”的使用“不含细胞因子鸡尾酒的培养基”的BA分化诱导。

图8由“无饲养层培养人ESC”通过“无细胞因子鸡尾酒培养基”制备的BA，使用该BA通过“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制备的BA-SUP的对胰岛β细胞的胰岛素分泌促进作用。纵轴表示作为胰岛素浓度的比例值得到的基于荧光共振能量转移(FRET)荧光强度。

图9-1“无饲养层人多能性干细胞”的使用“不含细胞因子鸡尾酒最小必须培养基”得到的BA分化诱导。A：分化诱导第3天的细胞凝聚体的相位差显微镜照片(4倍物镜)(KhES-3株)。B：BA关连基因的随时间的表达变化(用GAPDH修正的值)(KhES-3株)。C：以不含细胞因子鸡尾酒的培养基分化诱导的第10天的细胞形态(线粒体(绿)、脂肪滴(赤)、核(青))(KhES-3株)。

图9-2“无饲养层人多能性干细胞”的使用“不含细胞因子鸡尾酒最小必须培养基”得到的BA分化诱导。D：编码构成细胞因子鸡尾酒的各细胞因子的内源性基因的随时间的表达变化(KhES-3株)。E：BA关连基因的随时间的表达变化(用GAPDH修正的值)(KhES-1株)。F：以不含细胞因子鸡尾酒的培养基分化诱导的第10天的细胞形态(线粒体(绿)、脂肪滴(赤)、核(青))(KhES-1株)。

图10由无饲养层人ESC通过最小需要培养基制备得到的BA，以“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制备的BA-SUP的对胰岛β细胞的胰岛素分泌促进作用。

图11通过从无饲养层人ESC用最小需要培养基制备的BA以“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制备的BA-SUP的，对于胰岛β细胞的葡萄糖吸收亢进作用。

图12]通过由“无饲养层人ESC”仅使用“最小需要培养基”进行浮游培养的“1步”制备得到的BA，通过“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制备的人BA上清的胰岛素分泌促进作用。

[图13将通过“最小需要培养基”由无饲养层人ESC制得的BA，以“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制备得到的BA-SUP的对胰岛素分泌促进活性的超离心的影响。

图14通过最小需要培养基分化诱导的BA的产热能力(生物体中评价)。A、C：向将事先将臀部脱毛的小鼠的皮肤切开的伤口处，仅移植凝胶(sham)或注入了BA包埋凝胶(BA移植)。48小时后拍摄的小鼠照片。B、D：异丙肾上腺素(异丙肾上腺素)给药6分钟后拍摄的红外线照相机照片。

图15是表示将由无饲养层人ESC通过“最小需要培养基”制得的BA以“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制备得到的BA-SUP的人骨骼肌细胞(SkMC)的葡萄糖吸收的促进作用的图。

图16是表示对由无饲养层人ESC通过“最小需要培养基”制得的BA以“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制备得到的BA-SUP进行生物素化时的对人骨骼肌细胞(SkMC)的葡萄糖吸收的促进作用的影响的图。

图17是表示由无饲养层人ESC制得的BA通过“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制备得到的BA-SUP的人心肌细胞(CMC)的葡萄糖转运体基因(GLUT1)表达诱导效果和葡萄糖吸收的促进作用的图。

图18是表示由无饲养层人ESC通过“最小需要培养基”制得的BA以“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制备得到的BA-SUP中存在的微粒(超离心沉淀样品)中的线粒体蛋白/基因的表达的图(2,000G＝细胞的碎片、10,000G＝微泡、160,000G＝外泌体部分、SUP＝培养上清)。

图19表示使用了由培养层人ESC通过“最小需要培养基”制得的BA以“最小需要培养基”制备得到的BA-SUP的伤口愈合实验(wound-healing分析)的图。

本发明的具体实施方式

以下，将对本发明的实施方式，基于附图所示的实施例等进行说明。需要说明的是，实施方式不限于后述的示例，在不脱离本发明的主旨的范围内，可以使用所述文献等传统公知的技术进行适宜的设计变更。

本发明提供包含褐色脂肪细胞的上清的组合物。该上清以及组合物具有糖代谢改善作用。需要说明的是，在本发明中，含有上清是指含有上清成分，也可以是含有从上清中除去水分或盐分钟后的部分的组合物。即，含有本发明的上清的组合物，包含含有上清或其脱盐纯化物的组合物。该组合物可以包含源自褐色脂肪细胞的含有具有糖代谢改善作用的至少一种，优选2种或3种以上的成分，并可以进一步含有药学上被许可的载体或介质。

本发明的褐色脂肪细胞上清，可以从期望的褐色脂肪细胞中取得，例如可以使用源自多能性干细胞的褐色脂肪细胞。在本发明中多能性干细胞只要是具有可以分化诱导为褐色脂肪细胞的多能性的细胞即可。典型的可以举出ES细胞以及iPS细胞等的ES样细胞。这样的细胞可以是表达作为ES样细胞的指标的碱性磷酸酶的细胞。这里的ES样细胞是指具有与ES细胞类似的性质和/或形态的多能性干细胞。另外多能性干细胞可以进行长期间的传代，例如通过每3天的传代15次以上，优选20次以上、25次以上、30次以上、35次以上或40次以上传代，仍不丧失增殖性来进行确认。另外多能性干细胞，优选表达内源性的OCT3/4或Nanog，更优选两者都表达。另外多能性干细胞，优选表达TERT、表现端粒酶活性(合成端粒重复序列的活性)。另外多能性干细胞优选具有分化为中胚叶的能力，优选具有分化为三胚叶(内胚叶、中胚叶、外胚叶)的能力(例如在畸胎瘤形成和/或胚样体形成中可以确认)。更优选多能性干细胞通过移植至囊胚中而生成生殖系嵌合体。可以进行生殖系传递(Germline transmission)的多能性干细胞，称为生殖系有活性(germline-competent)的多能性干细胞。这些的表现型的确认，可以通过周知的方法实施(WO2007/69666；IchisakaTetal.,Nature448(7151):313-7,2007)。

具体而言，例如多能性干细胞中的胚性干细胞(胚胎干细胞(embryonic stemcells):ES细胞)、诱导性多能性干细胞(inducedpluripotentstemcells:iPS细胞)、精巢干细胞、成体干细胞、Muse细胞等，包含具有可以分化诱导为褐色脂肪细胞的多能性的细胞。

作为ES细胞，可以使用可以分化诱导为褐色脂肪细胞的期望的ES细胞，例如可以举出KhES-1、KhES-2及KhES-3(Suemori等，Biochem Biophys Res Commun 345:926-932,2006；CellosaurusIDCVCL_B233；分别CellosaurusIDCVCL_B231、CVCL_B232、CVCL_B233；理研细胞银行IDHES0001、HES0002、HES0003)，更优选KhES-1以及KhES-3，最优选可以举出KhES-3，但不限于这些。作为ES细胞，可以使用已经制备的细胞以及不伴随胚破坏而制备的细胞等。

多能性干细胞的获得方法以及树立方法是公知的。例如，ES细胞时，在取得文部科学省的许可之后，可以从国内树立机关(京都大学、国立成育医疗研究中心)分得或，从国外施设(私企业，大学等)分得或购入。另外对于iPS细胞，可以用本领域技术人员所知的期望的方法制备。例如，如果是使用仙台病毒(SeV)载体的方法，可以通过将市售的人成纤维细胞等，用添加了搭载重编程因子表达单元的仙台病毒载体的培养基进行培养而树立。作为搭载重编程因子表达单元的仙台病毒载体，例如可以举出CytoTune^TM-iPS(IDPharmaCo.,Ltd.)等。使用逆转录病毒载体制备的人iPS细胞，可以从理化学研究所生物资源中心购入或从京都大学或国立成育医疗研究中心从分得。

作为iPS细胞，没有特别的制限，可以使用可以分化诱导为褐色脂肪细胞的期望的iPS细胞，来源可以是成纤维细胞、血管内皮细胞、肝细胞等，没有特别的限制，但不优选在基因组中插入外来基因。

褐色脂肪细胞(brownadipocyte:BA)脂肪细胞的种类之一，通过形态学上，生理学上和/或标记物基因的表达等进行筛选方法已经是周知的。典型的比如褐色脂肪细胞可以具有多胞性脂肪滴。多胞性脂肪滴是指细胞质中存在的复数的小球状的脂肪滴，通过光学显微镜的观察或电子显微镜的观察等可以确认其存在。脂肪滴的个数，在通过电子显微镜观察时，在包含核的截面中的细胞切片的照片中，例如检测出5个以上、优选10个以上、更优选15个以上是大概目标的数量。

另外，本发明的褐色脂肪细胞可以在多胞性脂肪滴的周围存在具有多个含有梯子状脊的纵向上较长地融合成绳状的线粒体。含有梯子状线粒体嵴的在纵向上长长地融合成绳状的线粒体是指线粒体彼此互相在长轴方向上融合而变长，一边表现为绳子一样形态，一边在线粒体内部，垂直于长轴方向扩展至整个周围的圆盘状的脊，从内膜的一端到另一端相互平行且紧密地排雷的线粒体。

另外，本发明的褐色脂肪细胞，可以表达褐色脂肪细胞标记物基因。作为褐色脂肪细胞标记物，例如周知的有UCP1、PRDM16、PGC1α、Cyt-c、CIDE-A、ELOVL3、PPARα、EVA1、NTRK3等。本发明的褐色脂肪细胞表达选自UCP1、PRDM16、PGC1α、Cyt-c、CIDE-A、ELOVL3、PPARα、EVA1、NTRK3中的任1个以上、2个以上、3个以上、4个以上、5个以上或全部的褐色脂肪细胞标记物基因。优选本发明的褐色脂肪细胞为UCP1和/或PRDM16阳性，更优选PPARγ也为阳性。标记物基因的表达诱导可以用RT-PCR等确认。

另外，本发明的褐色脂肪细胞，具有燃烧脂肪的机能。例如，褐色脂肪细胞通过将脂质成分作为细胞质内的多胞性脂肪滴储存，保持总表面积大的状态。在这些的脂肪滴的附近，通过电子传达系统而产生的氧化性磷酸化为高活性的线粒体以下述形态存在多个：沿长轴方向较长地融合，且内部具有发达的梯子状线粒体脊。且本发明制备的褐色脂肪细胞，表达用于将通过氧化性磷酸化得到的能量变换为热能量的基因组。

因此，本发明的褐色脂肪细胞，积极地吸收环境中的脂质成分，发挥使之燃烧、消失的效果。

另外褐色脂肪细胞，可以具有在添加作为肾上腺素β受体激动剂的异丙肾上腺素等时，提高PRDM16或UCP1等有关线粒体扩增或产热的基因的表达的作用。

褐色脂肪细胞的机能，可以通过在添加作为肾上腺素β受体激动剂的异丙肾上腺素等时细胞温度上升，或氧消费量增大，或将褐色脂肪细胞移植到小鼠等上，对此通过在进行作为肾上腺素β受体激动剂的异丙肾上腺素等的给药时，移植部的温度上升而确认。

[褐色脂肪细胞的通常的制备]

在本发明中，褐色脂肪细胞的来源无特别限制，可以是使用期望的提纯或制造方法而取得的。例如，可以使用从多能性干细胞制造的褐色脂肪细胞。从多能性干细胞制造褐色脂肪细胞的方法无特别限定，例如，可以用期望的体外制造方法等制备。例如，使用细胞因子制造源自多能性干细胞的褐色脂肪细胞时，可以通过包含以下所示的步骤(A)的方法，从多能性干细胞形成细胞凝聚体，通过包含步骤(B)的方法由细胞凝聚体分化为褐色脂肪细胞以制备。

(A)将多能性干细胞，在无血清环境下，在造血性细胞因子的存在下进行非贴壁培养，制备细胞凝聚体的步骤

(B)将细胞凝聚体，在造血性细胞因子的存在下，进行贴壁或非贴壁培养，制备褐色脂肪细胞的步骤

作为在所述的褐色脂肪细胞的制造中使用的培养基的基础成分，可以适当使用通用的基础培养基。需要说明的是，无血清的环境是指在不向培养基中添加牛胎仔血清等的血清的条件下进行培养。在所述的方法中，在全步骤中都不需要添加血清，可以在任一步骤中完全不添加血清而实施。例如，作为通用的基础培养基可以举出IMDM、IMDM/F12、DMEM、DMEM/F12、RPMI等，但不限于此。另外，作为无血清培养用培养基可以举出S-CloneSF-B(EIDIA Co.,Ltd.)、S-CloneSF-03(EIDIA Co.,Ltd.)、ASF-104(AJINOMOTOCO.,Inc.)、ASF-104N(AJINOMOTO CO.,Inc.)、X-VIVO10(Lonza group Ltd.)、X-VIVO15(Lonza groupLtd.)等。作为优选的基础培养基可以举出IMDM、IMDM/F12、DMEM、DMEM/F12、RPMI或它们的混合物等，特别是IMDM和Ham'sF12的混合物，例如将IMDM和Ham'sF12以1:1混合的培养基(IMDM/F12)可以优选使用。

另外培养基中也可以适当地添加维生素类(例如抗坏血酸)和/或氨基酸(例如L-谷氨酰胺)等进行培养，但可以不添加。另外培养基中，可以适当添加胰岛素、转铁蛋白、白蛋白等蛋白成分或血清代替品(GIBCO^TM PFHM-II无蛋白杂交瘤细胞培养基(Protein-FreeHybridoma Medium)，Life Technologies,Inc.等)培养，但可以不添加。特别是，可以不添加白蛋白等的蛋白成分或PFHM-II等的血清代替品。添加这些时，例如可以以5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)、1％体积合成脂质溶液(例如Life Technologies,Inc.)、1％体积×100胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS-A)(例如Life Technologies,Inc.)、450μMα-硫代甘油(MTG)(例如Sigma-Aldrich,Inc.)、2mML-谷氨酰胺(例如Life echnologies,Inc.)、5％体积GIBCO^TMPFHM-II无蛋白杂交瘤细胞培养基(PFHM-II Protein-FreeHybridoma Medium)(PFHII)(例如Life Technologies,Inc.)、50μg/ml抗坏血酸等浓度进行添加。可以添加这些中的任1种或多种，也可以全部添加。

在这里，作为步骤(A)中使用的造血性细胞因子可以举出BMP4、VEGF、SCF、Flt3L、IL6、IGF2，特别优选BMP4。单独使用BMP4等，可以只使用1种细胞因子，也可以将3种以上的细胞因子混合使用。进一步也可以混合使用全部6种的细胞因子。

使用浓度可以适当决定。例如可以举出BMP4(1～50ng/ml、优选10～30ng/ml)、VEGF(0.5～20ng/ml、优选1～10ng/ml)、SCF(1～50ng/ml、优选10～30ng/ml)、Flt3L(0.5～20ng/ml、优选1～5ng/ml)、IL6(0.5～20ng/ml、优选1～5ng/ml)、IGF2(0.5～20ng/ml、优选1～10ng/ml)，但不限于此。

作为具体的造血性细胞因子鸡尾酒的一例，可以举出BMP4(20ng/ml)、VEGF(5ng/ml)、SCF(20ng/ml)、Flt3L(2.5ng/ml)、IL6(2.5ng/ml)、IGF2(5ng/ml)。

作为步骤(A)中的非贴壁培养，可以举出使用通用的低吸附培养皿或半固形培养基、悬滴培养法、通过生物反应器旋转培养等，使细胞不贴壁在培养皿底面上，在培养基中保持浮游状态，在培养装置(例如，5％CO₂孵育器内37℃)中培养，但是不限于这些。作为用于浮游培养的低吸附培养容器，只需使多能性干细胞不在容器底面上贴壁即可，例如可以举出2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(2-methacryloxyethylphosphorylcholine)(MPC)涂覆培养皿(ThermoFisher ScientificInc.)、Hydro cell^TM(Cell Seed Inc.)等。

例如，在步骤(A)中，使用所述的细胞凝聚体制备用培养基，将多能性干细胞加入通用的低吸附培养容器等中，不在容器底面上贴壁而在培养基中保持浮游状态，例如，以5％CO₂孵育器内37℃的条件培养8～10天。其间，例如，可以每3天将培养基的一半量交换成新鲜的培养基。培养基交换的时间，例如，将低吸附培养容器倾斜30度左右放置1分钟左右，确认了细胞凝聚体完全沉淀后，只将培养上清的一半量以移液器轻轻地吸出后，添加相同量的新鲜的细胞凝聚体制备用培养基，一边将低吸附培养容器全体轻摇一边将细胞凝聚体均匀地分散。

需要说明的是，为了从多能性干细胞将培养层细胞分离、除去，例如，优选将通过剥离液处理回收的多能性干细胞的悬浊液，在离心管内静置30秒钟左右只将多能性干细胞选择性性沉淀后，使用细胞凝聚体制备用培养基将细胞再度悬浊后，在低吸附培养容器内浮游培养。

通过步骤(A)，形成了细胞凝聚体。细胞凝聚体是指将多能性干细胞等以在培养基中呈浮游状态进行培养而形成的球状(或不定形)的细胞集块，其大小或组织构造可以是多样的，另外它们也可以相互连结。

源自多能性干细胞的细胞凝聚体的大多数，呈内部充满的球状或与之相近的形态，但有时呈不定形，也有时相互融合。另外十分罕见的，也有内部是空洞状的情况。大小为各种各样的从要用光学显微镜确认的水平(直径100～300μm)到用肉眼可以容易地确认的水平(直径300～1000μm)。

对于步骤(A)中生成的细胞凝聚体的细胞，进行步骤(B)的培养。步骤(B)中使用的培养基与步骤(A)是同样的，关于基础培养基或添加剂是同样的。该培养，例如可以在无血清环境下进行。作为步骤(B)使用的造血性细胞因子，例如可以举出BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6、IGF2，特别优选BMP7。单独使用BMP7等，可以只使用1种细胞因子，也可以将3种以上的细胞因子混合使用，进一步也可以混合使用全部6种的细胞因子。

使用的浓度可以适当决定。例如，作为造血性细胞因子，可以举出BMP7(1～50ng/ml，优选5～20ng/ml)、VEGF(0.5～20ng/ml，优选1～10ng/ml)、SCF(1～50ng/ml，优选10～30ng/ml)、Flt3L(0.5～20ng/ml，优选1～5ng/ml)、IL6(0.5～20ng/ml，优选1～5ng/ml)、IGF2(0.5～20ng/ml，优选1～10ng/ml)但不限于此。

作为具体的造血性细胞因子鸡尾酒的一例，可以举出BMP7(10ng/ml)、VEGF(5ng/ml)、SCF(20ng/ml)、Flt3L(2.5ng/ml)、IL6(2.5ng/ml)、IGF2(5ng/ml)。

步骤(B)可以贴壁培养也可以非贴壁培养。细胞培养用容器只要是一般用于细胞培养的容器即可，可以使用通用的细胞培养用容器进行。作为步骤(B)中的贴壁或非贴壁培养，可以举出使用通用的细胞培养用容器，直接或在涂覆的基础上播种，进行培养。在步骤(B)中进行非接触培养时，可以在步骤(A)后继续进行培养，此时在步骤(A)后并不必需回收细胞。此时，步骤(A)和步骤(B)合为一个步骤。在移至别的培养容器中时，回收步骤(A)生成的凝聚体的细胞，移至别的容器即可。

分化诱导中的培养条件，可以根据使用的多能性干细胞的种类适当设定，例如，37℃、5％CO₂孵育器中培养1周左右。

进行贴壁培养时，为了提高细胞贴壁性，可以进行涂覆处理。涂覆处理例如，将0.1％猪明胶等的蛋白水溶液加入培养容器内在室温下放置10分钟左右。另外，可以使用通用的提高了细胞贴壁性的培养容器(Corning^TM CellBIND^TMSurface，CorningInc.等)。需要说明的是，培养中，优选每3天左右将培养基与新鲜的进行交换。

从典型而言，要从多能性干细胞获得源自多能性干细胞的褐色细胞，将多能性干细胞从小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)等的培养层细胞中分离后，使用添加了BMP4的细胞凝聚体制备用培养基，在通用的低吸附培养容器内使细胞保持浮游状态培养8～10天左右，将由此制备的细胞凝聚体，使用添加了BMP7的褐色脂肪细胞分化培养基，在通用的细胞培养容器或在将该容器用明胶等的蛋白成分涂覆的容器内培养。由此，从多能性干细胞制备源自多能性干细胞的褐色脂肪细胞可以在10～15天左右达成。

作为出发原料的多能性干细胞是指具有多能性的干细胞，例如可以举出ES细胞、iPS细胞、精巢干细胞、成体干细胞、Muse细胞等。多能性干细胞可以是人多能性干细胞。此时，多能性干细胞是来源于人，并保持多能性分化能的细胞群。它包含人ES细胞、人iPS细胞、人精巢干细胞、人成体干细胞、人Muse细胞等。

[褐色脂肪细胞的上清的制备]

在本发明中，从如上所述制造的源自多能性干细胞的褐色脂肪细胞等制备褐色脂肪细胞的上清。上清的制备可以通过适当的公知方法进行，本发明通过使用盐类缓冲液，开发了取得不含有培养液所含的氨基酸等的营养成分或细胞因子等的添加物的上清的方法。该方法包含以下的步骤。

(1)将褐色脂肪细胞的培养液，与盐类缓冲液置换的步骤，

(2)在盐类缓冲液中培养该褐色脂肪细胞的步骤，

(3)回收该盐类缓冲液的步骤。

由于盐类缓冲液中不含有氨基酸或维生素、蛋白质等，因此可以取得不含有外因性的杂质的褐色脂肪细胞上清。特别是，从如此得到的褐色脂肪细胞上清不含外源性细胞因子这点来看是优选的。

作为盐类缓冲液没有特别限制，可以使用能使细胞悬浊的期望的盐类缓冲液。具体而言，例如期望的Krebs-Ringer液，例如可以举出Krebs-Ringer-Hepes(KRH)、Krebs-Ringer-Tris(KRT)、Krebs-Ringer Bicarbonate、Krebs-Ringer-Hepes-Bicarbonate(KRHB)、Krebs-Ringer-TrisBicarbonate(KRTB)等。

另外，优选盐类缓冲液中含有葡萄糖等的糖(盐类葡萄糖缓冲液)。本发明发现，不只是在使用含有高浓度的葡萄糖的盐类葡萄糖缓冲液时，在使用含有低浓度的葡萄糖的盐类葡萄糖缓冲液时，可以取得具有显著的代谢改善能力的褐色脂肪细胞的上清。在这里高浓度的葡萄糖是指，例如10mM以上，优选11mM以上、12mM以上、13mM以上、14mM以上、15mM以上或16mM以上。另外高浓度葡萄糖，例如可以为16.8mM或以下。另外，低浓度的葡萄糖是指，例如不足10mM，优选不足9mM、不足8mM、不足7mM、不足6mM、不足5mM、不足4mM、或不足3mM。另外低浓度葡萄糖，例如可以为2.8mM或以上。本发明的盐类葡萄糖缓冲液，优选含有低浓度葡萄糖的盐类葡萄糖缓冲液，具体而言，为含有约2.8mM的葡萄糖的盐类葡萄糖缓冲液。在这里的“约”是指，例如在±10％的范围内，优选在±7％、±5％、或±3％的范围内。

在步骤(2)中与盐类葡萄糖缓冲液等一起培养的时间，可以适当决定。由于盐类葡萄糖缓冲液缺乏营养成分，在长时间的培养中褐色脂肪细胞的生存性会降低，存在上清的代谢改善作用降低的可能性。另一方面，在短时间的培养中无法制备含有充分浓度的可溶性因子的上清。因此，为了回收具有代谢改善作用的上清，要决定盐类葡萄糖缓冲液的基本组成(含葡萄糖浓度)和最适培养时间。例如，步骤(2)的培养时间可以为3小时以上、4小时以上、5小时以上、8小时以上、10小时以上、12小时以上、15小时以上、16小时以上、20小时以上、24小时以上、36小时以上、48小时以上、60小时以上、72小时以上、84小时以上、96小时以上、100小时以上、108小时以上、或120小时以上，例如可以为10天以内、9天以内、8天以内、7天以内、6天以内、或5天以内。例如可以为5～72小时、6～60小时、7～48小时、8～36小时、9～24小时、12～24小时、13～20小时、或约16小时，但不限于此。

在本发明中，褐色脂肪细胞的上清的回收步骤，无论是浮游培养或贴壁培养，只要是可以从培养物中分离细胞成分和上清成分的方法即可，可以举出自然沉淀、离心沉淀、过滤处理等。

在优选的方式中，本发明的褐色脂肪细胞的上清是从褐色脂肪细胞中分离的上清。例如本发明的褐色脂肪细胞的上清是不含活细胞的上清，进一步而言，优选不含细胞(包含活细胞及死细胞)的上清。

另外本发明的褐色脂肪细胞的上清，可以含有线粒体等细胞器，或者也可以通过超离心等将它们提纯或浓缩(沉淀级分)、或者除去(上清部分)。含有线粒体的本发明的褐色脂肪细胞上清，具有高呼吸能力或活性氧的消除作用，具有损伤治愈的促进作用。另外，从本发明的褐色脂肪细胞或其上清中，可以高效地取得线粒体。线粒体的分离可以使用适当的公知方法，例如，可以如上述通过超离心等分离。离心处理时的加速度可以适当调整，例如可以为50KG以下、30KG以下、20KG以下、10KG以下、7KG以下、6KG以下、5KG以下、4KG以下、3KG以下、或2KG以下。例如可以在0.1～30KG、0.2～20KG、或0.3～10KG的范围内适当调整，但不限于此。

[无饲养层多能性干细胞培养体系]

另外本发明提供从以无饲养层系维持培养的多能性干细胞制造的褐色脂肪细胞。由于通过无饲养层系由多能性干细胞制备褐色脂肪细胞，而无需担心培养层细胞及源自培养层细胞的成分的混入，可以制备更纯粹的褐色脂肪细胞及其上清。如此制备的褐色脂肪细胞或其上清适用于临床应用。

在本发明中，用于维持多能性干细胞的未分化的无饲养层培养体系，只要是能使多能性干细胞维持未分化状态而传代增殖培养培养体系即可，没有制限。例如，作为培养基，可以举出Essential 8Medium(Thermo Fisher Scientific公司)或StemFit^TM(味之素Healthysupply株式会社)等，培养皿的涂覆剂可以举出GibCO^TM重组人Vitronectin蛋白(VitronectinHumanProtein)、Natural(Thermo Fisher Scientific公司)或iMatrix-511(株式会社nippi)等。

虽然不限于此，如果对通过无饲养层维持培养多能性干细胞的步骤进行具体的举例说明的话，则如下(“StemFit^TMAK02N培养层培养iPS细胞向无饲养层培养的转变”((株)iPSPortal；ips-guide.com/wp-content/themes/ips-guide/pdf/products/ak02n/AK02N_protocol04.pdf)；TakahashiK,etal.Cell,2007Nov.30；131(5):861-72；NakagawaM,etal.ScientificReports4:3594(2014)；京都大学iPS研究所(CiRA)HP：“通过无饲养层的人iPS细胞的树立以及维持培养”(www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/images/protocol/pdf/hipsprotocolFf_140311.pdf))。

I.培养基的准备

向必要量的StemFit^TMAK02N(Ajinomoto Co.,Inc.)中加入培养基的1/1000量的10mMY-27632(Rho激酶抑制剂)充分混合(最终浓度10μM)(以下记为AK02N+Y)。

II.6-孔板的涂覆

1.将用PBS(-)稀释至3.2μg/mL的Laminin-511E8溶液(iMatrix-511)，向涂覆后的孔中分别加入1.5mL(涂覆量为4.8μg/well(0.5μg/cm²))。此时，首先将必要量的PBS(-)加入到50mL离心管等中，向其中加入Laminin-511E8至达到3.2μg/mL的浓度，马上充分混合后，立刻向各孔中以1.5mL分别分装。

2.在37℃、CO₂5％孵育器中反应60min以上，反应后从孵育器中取出，将StemFit^TMAK02N以0.75mL/well加入充分混匀后，除去上清。其后，将AK02N+Y培养基以1.5mL/well加入，放入孵育器15min以上(最长60min)。

III.传代

1.用相位差显微镜确认细胞后，除去培养基，加入PBS(-)1mL清洗，除去PBS(-)。将CTK溶液(将2.5％胰蛋白酶5.0mL，1.0mg/mL胶原酶IV型，5.0mL，0.1MCaCl₂，0.5mL以及KSR10mL添加至蒸馏水30mL而制备)以600μL/well加入并充分混合，室温下反应1～2分钟，将培养层细胞从板上剥落。加入PBS(-)1mL清洗后，除去PBS，将0.5XTrypLE^TMSelect以300μL/well加入并充分混合，在37℃、CO₂5％孵育器中反应(确认群落中心部的透过度充分上升后，进入下一步作业(确认细胞间粘结被破坏的细胞1个1个呈圆形的状态)。其后，除去0.5XTrypLE^TMSelect(此时如果细胞被剥离时则进入2.)。

通过2mL/well的PBS(-)进行清洗，除去PBS(-)，将StemFit^TMAK02N+Y以1mL/well加入，用细胞刮刀剥落细胞。用相位差显微镜确认细胞被剥落，进行10次左右吸液/排液(Pipetting)后回收至新的离心管中(加入培养基使总量达到1.5mL。总量可以适当变更)。其后，进行细胞计数，将13,000个的活细胞播种至Laminin涂覆的6-孔板的1孔中(由于细胞的附着非常强，因此播种后立刻摇晃板，使之均匀地分散)。在37℃、CO₂5％孵育器中培养，翌日，交换为不添加Y-27632的StemFit^TMAK02N。

2.(中途细胞剥落时的继续)

加入StemFit^TMAK02N700μL(总计1000μL)、吸液/排液(Pipetting)10次左右将细胞将打散。以800rpm(160xg)、22℃、5min离心，除去上清，将颗粒以轻敲打散，将StemFit^TMAK02N以1mL/孔加入，进行6次吸液/排液(Pipetting)将细胞打散，进行细胞计数。其后，将13,000个的活细胞播种到涂覆了Laminin的6-孔板的1孔中，由于细胞的附着非常强，因此播种后立刻摇晃板，使之均匀地分散)(根据使用的株调整播种量)。37℃、CO₂5％孵育器中培养，翌日，交换为不添加Y-27632的StemFit^TMAK02N。

培养基交换在传代的翌日、其之后优选在细胞密度低时为隔天或隔2天，细胞密度高时每天进行培养基交换。细胞的传代以大概8天±1天为目标进行。

本发明的由无饲养层培养的多能性干细胞制造褐色脂肪细胞的方法，包含以下的步骤。

(1)通过无饲养层条件维持培养多能性干细胞的步骤，

(2)在无血清环境下，非贴壁培养步骤(1)的细胞，形成细胞凝聚体的步骤，

(3)在无血清环境下培养步骤(2)的细胞，使其分化为褐色脂肪细胞的步骤。

另外，本发明的由无饲养层培养得到的多能性干细胞制造褐色脂肪细胞上清的方法，除所述步骤外还包含：

(4)在盐类缓冲液中孵育步骤(3)的褐色脂肪细胞，并回收其上清的步骤。

即，从本发明的无饲养层培养的多能性干细胞制造褐色脂肪细胞上清的方法包含以下的步骤：

(1)通过无饲养层维持培养多能性干细胞的步骤，

(2)在无血清环境下非贴壁培养步骤(1)的细胞，形成细胞凝聚体的步骤，

(3)在无血清环境下培养步骤(2)的细胞，使其分化为褐色脂肪细胞的步骤，

(4)在盐类缓冲液中孵育步骤(3)的褐色脂肪细胞，并回收其上清的步骤。

盐类缓冲液，如上所述没有特别限制，可以使用KRH、KRT、KRHB、KRTB等可以使细胞悬浊的期望的盐类缓冲液。另外，盐类缓冲液中含有优选葡萄糖等的糖。葡萄糖的浓度如上所述。另外，步骤(4)中的与缓冲液一起的培养时间也如上所述。

在由无饲养层培养的多能性干细胞制造所述的褐色脂肪细胞上清的方法中，在步骤(2)(形成细胞凝聚体的步骤)以及(3)(分化褐色脂肪细胞的步骤)中，可以分别与如上述的步骤(A)及(B)同样地添加细胞因子鸡尾酒。此时，作为步骤(2)中添加的细胞因子，和步骤(A)同样地，例如可以举出BMP4、VEGF、SCF、Flt3L、IL6、IGF2等细胞因子，特别优选BMP4。单独使用BMP4等，可以只使用1种细胞因子，也可以将3种以上的细胞因子混合使用。进一步也可以混合使用全部6种的细胞因子。另外作为步骤(3)中添加的细胞因子，和步骤(B)同样，例如可以举出BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6、IGF2，特别优选BMP7。单独使用BMP7等，可以只使用1种细胞因子，也可以将3种以上的细胞因子混合使用，进一步也可以混合使用全部6种的细胞因子。特别是对于优选的细胞因子的组合或细胞因子的浓度与步骤(A)以及步骤(B)是同样的。

在步骤(2)中，将步骤(1)的细胞分散至单细胞，或与其近似的水平，可以由这些细胞形成凝聚体。这里的近似单细胞的水平，例如，是指细胞悬浊液中所含的包含细胞或细胞块的粒子含有的平均细胞数在几个以下，优选2、3个以下、2个以下或不足2个，例如，是指在细胞悬浊液中，单细胞的比例在2成以上、3成以上、4成以上、5成以上、6成以上、7成以上、8成以上、或9成以上。

培养时间可以适当调节，但在步骤(2)中例如可以通过培养8～10天，生成细胞凝聚体。和所述的步骤(A)同样，培养基可以定期地交换为适当的新的培养基。另外步骤(3)与所述的步骤(B)同样，可以贴壁培养也可以非贴壁培养，时间可以适当调节，例如可以培养1周左右。

和所述的步骤(B)同样，步骤(3)可以是接触培养也可以是非接触培养。进行非接触培养时，可以在步骤(2)后继续培养，此时未必一定在步骤(2)后回收细胞。此时，步骤(1)和步骤(2)合为一个步骤。在移至别的培养容器时，回收步骤(2)生成的凝聚体的细胞，移至别的容器即可。

需要说明的是，接下来如上所述，使用以无饲养层培养的多能性干细胞时，可以不添加培养层培养的多能性干细胞所必须的细胞因子而生成褐色脂肪细胞。

[无细胞因子鸡尾酒的褐色脂肪细胞的制造]

例如，由本发明的无饲养层培养得到的多能性干细胞制造褐色脂肪细胞方法包含以下的步骤：

(1)通过无饲养层维持培养多能性干细胞的步骤，

(2)不添加包含BMP4、VEGF、SCF、Flt3L、IL6及IGF2细胞因子鸡尾酒，将步骤(1)的细胞分散，并在无血清环境下进行非贴壁培养的步骤，

(3)不添加包含BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6以及IGF2细胞因子鸡尾酒，在无血清环境下培养步骤(2)的细胞的步骤。

[步骤1]

首先在步骤(1)中，准备无饲养层培养的多能性干细胞。无饲养层中的多能性干细胞的维持培养可以如上所述适当实施。

[步骤2]

接下来，不添加包含BMP4、VEGF、SCF、Flt3L、IL6以及IGF2细胞因子鸡尾酒，将步骤(1)的多能性干细胞分散，并在无血清环境下非贴壁培养，使其形成细胞凝聚体。

在本发明中，源自多能性干细胞的细胞凝聚体的制备只要是将多能性干细胞从培养皿上剥离分散为单细胞，或与之近似的水平后再凝聚的步骤即可，使用低吸附培养皿的培养、悬滴培养法、生物反应器通过旋转培养等，只要是形成细胞凝聚体的方法即可。

虽然在使用培养层培养得到的多能性干细胞，形成细胞凝聚体时，要添加包含BMP4、VEGF、SCF、Flt3L、IL6及IGF2细胞因子鸡尾酒，但是在使用无饲养层培养的多能性干细胞时，不需要添加包含BMP4、VEGF、SCF、Flt3L、IL6以及IGF2细胞因子鸡尾酒。因此，在所述的步骤(2)中，不添加包含BMP4、VEGF、SCF、Flt3L、IL6以及IGF2细胞因子鸡尾酒(即，细胞不与外因性的BMP4、VEGF、SCF、Flt3L、IL6及IGF2共培养)。

为了维持细胞的高生存性或提高细胞凝聚体的生成效率，可以添加所述的细胞因子中的几种，但在优选的方式中，步骤(2)中不添加选自BMP4、VEGF、SCF、Flt3L、IL6及IGF2中的2种或以上、更优选3种或以上、4种或以上、5种或以上、更优选不添加全部6种细胞因子。特别是可以不添加能成为恶病质的原因的IL6和/或具有血管新生能力的VEGF。

即，作为步骤(2)的培养基，可以使用不添加血清和细胞因子的最少需要培养基。在本发明中，构成多能性干细胞的褐色脂肪细胞分化诱导中使用的“最小需要培养基”的基础培养基，只要是能使源自多能性干细胞的细胞凝聚体形成，制备褐色脂肪细胞的培养基即可，可以是任意培养基。使用的培养基与上述同样，可以适当使用通用的基础培养基，例如，作为通用的基础培养基，可以举出IMDM、IMDM/F12、DMEM、DMEM/F12、RPMI等，但不限于此。作为优选的基础培养基，可以举出IMDM、IMDM/F12、DMEM、DMEM/F12、RPMI或这些混合物等，特别是IMDM和Ham’sF12的混合物，例如优选使用将IMDM和Ham’sF12以1:1混合得到的培养基(IMDM/F12)。另外在本方法中，在全步骤中都不需要添加血清，可以在任意步骤中均不添加血清而实施。

需要说明的是培养基中，可以添加被认为具有提高细胞生存性的效果的牛血清白蛋白(BSA)、α-硫代甘油(α-MTG)和/或无蛋白杂交瘤混合物(protein free hybridomamix)(PFHMII,GibCO#12040-077,LifeTechnologies,Inc.)等，但是使用不添加这些的最少需要培养基也形成细胞凝聚体，且形成的细胞凝聚体的细胞具有分化为褐色脂肪细胞的能力。因此，不使用作为源自动物的蛋白的BSA或含有生理活性分子的PFHM-II等，而使用最少需要培养基制造褐色脂肪细胞是可能的。需要说明的是培养基中，可以添加胰岛素、转铁蛋白和/或丝氨酸。例如可以添加胰岛素和/或转铁蛋白。另外培养基中，可以添加ITS-A(胰岛素-Transferrin-Selenium-SodiumPyruvate)。添加量可以适当调节。

培养时间可以适当调节，例如可以通过培养8～10天，使细胞凝聚体生成。与所述的步骤(A)同样，培养基可以定期与交换为适当的新的培养基。

[步骤3]

接下来关于步骤(2)中形成的细胞凝聚体的细胞，在无血清环境下培养。本步骤中的培养，不需要是贴壁培养，可以贴壁培养，也可以非贴壁培养。进行非接触培养时，可以在步骤(2)后继续培养，此时由于不需要在步骤(2)后回收细胞，步骤(2)和(3)可以作为同一步骤实施，可以用1步从多能性干细胞制备褐色脂肪细胞。在步骤(3)中移至别的培养容器时，将步骤(2)中生成的凝聚体的细胞回收，移至别的容器即可。

即本发明是用1步从多能性干细胞制造褐色脂肪细胞的方法，涉及包含将通过无饲养层维持培养的多能性干细胞分散，并在无血清环境下非贴壁培养的步骤的方法。该步骤之后，可以包含进行贴壁培养的步骤，也可以不包含。不包含进行贴壁培养的步骤时，只需持续非贴壁培养即可。另外，在这些任一的步骤中，均不添加包含BMP4、VEGF、SCF、Flt3L、IL6以及IGF2细胞因子鸡尾酒，也不添加包含BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6及IGF2细胞因子鸡尾酒。优选不添加BMP4、BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6及IGF2中任一种的细胞因子。更优选的方式是，在这些的任意步骤中，均不添加细胞因子。即本发明提供使用无饲养层培养体系，不添加细胞因子(即不使用外源性细胞因子)用1步从多能性干细胞制造褐色脂肪细胞的方法。

用1步从多能性干细胞制备褐色脂肪细胞时，使用的无血清培养基没有特别制限，但例如，优选添加了脂质的无血清培养基。另外，为了促进向褐色脂肪细胞的分化，可以对生成的细胞凝聚体的大小进行适当的调整。例如，优选的凝聚体的尺寸为1500μm以下，例如可以是1200μm以下、1000μm以下、900μm以下、800μm以下、700μm以下、600μm以下、500μm以下、400μm以下、300μm以下或200μm以下。凝聚体的尺寸可以通过调整培养器材的穴或洼的尺寸进行控制。

细胞培养用容器，可以适当使用一般细胞培养中使用的的容器。进行贴壁培养时，为了提高细胞贴壁性，可以进行涂覆处理。涂覆处理，例如可以如所述的，用0.1％猪明胶等蛋白水溶液进行。另外，也可以使用通用的提高了细胞贴壁性的培养容器(Corning^TMCellBIND^TM Surface，Corning Inc.等)。

进行非贴壁培养时，可以使用通用的低吸附培养皿或半固形培养基等，使细胞不在培养皿底面上贴壁，而在培养基中保持浮游状态进行培养。作为浮游培养使用的低吸附培养容器，只要可以使细胞不在容器底面上贴壁即可，例如可以举出用低吸附培养皿的培养、悬浮培养法、基于生物反应器的旋转培养等。

虽然在使用通过培养层培养得到的多能性干细胞并形成细胞凝聚体时，在此步骤中添加包含BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6及IGF2的细胞因子鸡尾酒，但在使用通过无饲养层培养得到的多能性干细胞进行本步骤时，不需要添加包含BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6及IGF2细胞因子鸡尾酒。因此，在本步骤(3)中，不添加包含BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6及IGF2细胞因子鸡尾酒(即，细胞不与外因性的BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6及IGF2共培养)。

为了保持细胞的高生存性，提高褐色脂肪细胞的生成效率，可以添加所述的细胞因子中的几种，但在优选的方式中，本步骤(3)中不添加选自BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6以及IGF2中的2种或以上、更优选3种或以上、4种或以上、5种或以上、更优选不添加全部6种细胞因子。特别是可以不添加成为恶病质的原因的IL6和/或具有血管新生能力的VEGF。

在步骤(2)以及(3)的任一者中均不添加细胞因子时，或在步骤(2)以及(3)中添加的细胞因子相同时，步骤(2)以及(3)可以使用组成完全相同的培养基(最少需要培养基)。此时，步骤(2)以及(3)可以作为一个步骤(步骤(2’))实施。此时，从本发明的无饲养层培养得到的多能性干细胞制造褐色脂肪细胞方法包含以下的步骤：

(1)通过无饲养层维持培养多能性干细胞的步骤，

(2’)不添加包含BMP4、VEGF、SCF、Flt3L、IL6及IGF2细胞因子鸡尾酒，并且不添加包含BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6及IGF2细胞因子鸡尾酒，将步骤(1)的细胞分散，在无血清环境下进行非贴壁培养的步骤。

所述的步骤(2’)可以是例如，不添加任一的细胞因子，将步骤(1)的细胞分散，在无血清环境下进行非贴壁培养的步骤。

通过所述的一系列的步骤，可以从多能性干细胞生成褐色脂肪细胞。褐色脂肪细胞的比例，可以如上所述通过脂肪滴的染色或标记物基因的表达测定等进行测定。

如上所述而制造的无饲养层系从多能性干细胞生成的褐色脂肪细胞，由于在其生成过程中，不与饲养层细胞等的异种细胞或外源性细胞因子接触，是没有异种细胞或外因性的混入或影响的品质极高的褐色脂肪细胞。并且，通过使用此褐色脂肪细胞制备上清，可以取得同样完全不含源自异种细胞的因子、外因性的混入物的高品质褐色脂肪细胞上清。

[步骤4]

使用盐类缓冲液取得该褐色脂肪细胞的上清的方法包含以下的步骤。

(4)在盐类缓冲液中孵育步骤(3)(或所述步骤(2’))的褐色脂肪细胞，并回收其上清的步骤。

盐类缓冲液如上所述没有特别限制，可以使用可以将KRH、KRT、KRHB、KRTB等细胞悬浊的期望的盐类缓冲液。另外，盐类缓冲液含有优选葡萄糖等的糖。葡萄糖的浓度可以是高浓度或低浓度，优选含有低浓度葡萄糖。具体的浓度如上所述，例如0.5～5mM，优选0.5～5mM、0.8～4mM、0.9～3.5mM、1～3.2mM、1.5～3.0mM、2～3mM，例如，含有约2.8mM的葡萄糖的盐类葡萄糖缓冲液可以优选使用。

另外，与缓冲液的培养时间如上所述，例如所述步骤(4)的培养时间可以为3小时以上、4小时以上、5小时以上、8小时以上、10小时以上、12小时以上、15小时以上、16小时以上、20小时以上、24小时以上、36小时以上、48小时以上、60小时以上、72小时以上、84小时以上、96小时以上、100小时以上、108小时以上、或120小时以上，例如可以是10日以内、9日以内、8日以内、7日以内、6日以内、或5日以内。例如可以是5～72小时、6～60小时、7～48小时、8～36小时、9～24小时、12～24小时、13～20小时或约16小时，但不限于此。

在本发明中，褐色脂肪细胞的上清的回收步骤，无论步骤(3)是浮游培养、贴壁培养，只要是可以从培养物中分离细胞成分和上清成分的方法即可，可以举出自然沉淀、离心沉淀、过滤处理等。所述步骤(2’)也是同样。

另外，褐色脂肪细胞的一系列的培养中使用的培养装置可以以任意条件使用，培养装置的种类、温度、湿度、氧浓度、二氧化碳气体浓度等没有制限。

褐色脂肪细胞的上清可以适当进行脱盐处理、纯化、浓缩等处理。

本发明中褐色脂肪细胞的上清，在制备后可以任意保存，对冷藏保存、冷冻保存、冻结干燥等保存法没有制限。

另外，本发明中褐色脂肪细胞的上清，在制备后可以加入任意溶质、任意溶剂。例如，可以将冻结干固物用KRTB缓冲液溶解后使用，对此没有限定。

另外本发明中褐色脂肪细胞的上清可以进行适当的化学修饰。这样的修饰可以以例如标识物、tag的附加、稳定性的提高、活性的提高等为目的而实施，具体而言可以举出生物素化等。本发明的褐色脂肪细胞的上清的活性即使进行修饰也可以维持(实施例16)。例如进行化学修饰时，可以修饰上清成分的期望的官能基，具体而言可以修饰氨基。

如此得到的褐色脂肪细胞以及其上清以及其纯化物，实质上，具有不含源自异种动物细胞的混入物的优异的性质。如上所述而得到的褐色脂肪细胞以及其上清以及其纯化物，作为关于其含有的活性因子的基础研究的工具，进一步而言，可以作为对于肥胖或高脂血症等疗法的工具使用。

例如本发明的褐色脂肪细胞或其上清具有对胰岛β细胞的胰岛素分泌促进作用，对胰岛β细胞或肌肉细胞的促进葡萄糖吸收作用及提高葡萄糖转运体-基因表达的作用，在生物体中的降血糖作用，胰岛素分泌促进作用，胰岛素敏感性亢进作用等。特别是在生物体中除了降低血糖值外，作为胰岛素抵抗性指数的HOMA-IR值可以通过上清的给药而降低，从而胰岛素敏感性提高。如上所述，从本发明的褐色脂肪细胞或其上清以及其脱盐纯化物具有糖代谢改善作用来看，可以用于治疗以及预防需要糖代谢改善的各种病态或症状。

另外本发明的褐色脂肪细胞或其上清，可以用于以体重或体脂肪的增加的防止或减少、瘦身(包括部分瘦身)、体形改善等为目的的各种美容目的中

例如，本发明提供用于肥胖的预防或治疗的内科疗法或美容方法，其包含给药前述的褐色脂肪细胞或其上清或其纯化物的步骤。

同样的，本发明提供胰岛素抵抗性的改善和/或用于糖尿病或糖尿病前期的预防或治疗的内科疗法，其包含给药前述的褐色脂肪细胞或其上清或其纯化物的步骤。

本发明的内科疗法是与肥胖的预防或治疗、胰岛素抵抗性的改善、糖尿病的预防或治疗、高脂血症的预防或治疗、用于促进造血的治疗，制备冠动脉的旁路血通路的手术中的任一项组合使用的内科疗法，其包含给药前述的褐色脂肪细胞或其上清或其纯化物的疗法。

另外本发明提供以本发明的褐色脂肪细胞或其上清或其纯化物为有效成分的，对于肥胖和/或超重、代谢综合征、2型糖尿病、1型糖尿病(特别是缓慢进展型1型糖尿病)等表现代谢异常的诸多疾病的预防和/或治疗用组合物。另外本发明提供以本发明的褐色脂肪细胞或其上清或其纯化物为有效成分的，以体重或体脂肪的增加的防止或减少、瘦身(包含部分瘦身)、体形改善等为目的的美容用组合物。

另外本发明提供以本发明的褐色脂肪细胞或其上清或其纯化物为有效成分的，对于显示线粒体的功能障碍的诸多疾病的医药用组合物。具体而言，本发明提供以本发明的褐色脂肪细胞或其上清或其纯化物为有效成分的，对于显现线粒体病以及新生儿心脏疾病等线粒体的功能障碍的诸多疾病的预防和/或治疗用组合物。

另外，本发明提供以本发明的褐色脂肪细胞或其上清或其纯化物为有效成分的，对于显现皮肤损伤的诸多疾病的医药用组合物。具体而言，本发明提供以本发明的褐色脂肪细胞或其上清或其纯化物为有效成分的，对于显现皮下出血、皮下出血引起的色素沉着、皮下的毛细血管扩张等皮肤损伤的诸多疾病的预防和/或治疗用组合物。

包含本发明的褐色脂肪细胞、其上清和/或其纯化物的组合物可以适当含有药学上容许的载体或介质。本发明的组合物作为医药组合物，例如，作为用于糖代谢改善的医药组合物使用之外，可以用作作为美容用组合。载体以及介质没有特别的制限，例如，可以举出水(例如灭菌水)、生理食盐水(例如磷酸缓冲生理食盐水)、乙二醇、乙醇、甘油、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、寒天、果胶、橄榄油、花生油、蓖麻油等油、乳化剂、悬浊剂、表面活性剂、缓冲剂、香味剂、稀释剂、保存剂、稳定剂、赋形剂、载体、防腐剂等。

例如，本发明的褐色脂肪细胞，可以在生理食盐水、培养液或盐类缓冲液等中悬浊而制成组合物。另外细胞组合物可以包埋或附着于凝胶、果胶或固体等的基质/基材。作为这样的基质/基材可以举出水性凝胶、明胶、胶原蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸肝素、半乳糖胺葡糖醛酸葡萄糖硫酸、糖胺聚糖、粘多糖类、琼脂糖、寒天或这些衍生物等，可以含有骨粘连蛋白、纤维蛋白原或骨钙素等的生物体分子等。与固体的基材组合时，其形状没有特别制限，可以使用珠、多孔质、海绵、网、丝或中空丝或片状的素材。

例如，可以在纤维蛋白凝胶中包埋细胞，以作为向生物体移植或注入用的组合物。纤维蛋白凝胶，例如可以通过向纤维蛋白原水溶液中加入凝血酶而制备。纤维蛋白原水溶液中，例如可以加入I型胶原蛋白或抑肽酶。I型胶原蛋白可以使用适当中和后的物质。

另外关于包含本发明的上清或其纯化物的组合物，可以适当作为水溶液或冻结干燥物等制剂化。

为了作为注射剂制剂化，可以使用注射用蒸馏水等的载体进行处方。作为注射用的水溶液，例如可以举出包含生理食盐水，葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠等其他的成分的水溶液。另外可以包含乙醇、丙二醇、聚乙二醇、非离子性表面活性剂等。

本发明的医药组合物以及美容用组合物，优选通过非经口给药。例如，可以作为注射剂、经鼻给药剂、经肺给药剂、经皮给药剂等制剂化。给药例如可以通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等进行全身或局部给药。具体的给药方法，可以根据患者的年龄、症状适当选择。给药量，例如，换算成上清的干燥物，可以一次对应于体重每1kg设定为0.0001mg到1000mg的范围内。或，例如，给药量可以对应于患者设定为0.001～100000mg的范围内，但不限于此。另外给药细胞时，例如对应于注入部位为1×10²～1×10⁸细胞，另外关于注入部位，可以对一处到几处、十几处或几十处进行给药，但不限于此。如果是本领域技术人员，可以考虑患者的体重、年龄、症状等，决定适当的给药量以及给药方法。

本发明的细胞以及上清可以对期望的对象进行给药。给药对象可以适当选择，例如哺乳动物，具体而言小鼠、大鼠、豚鼠等的啮齿类，牛、猪、山羊、兔子等的非啮齿类动物，期望的灵长类，例如包含猴子等的非人类灵长类以及人。

实施例

以下，将通过实施例对本发明进一步进行详细的说明，但本发明不限于这些实施例。另外，本说明书中引用的文献以及其他的参照，全部均作为本说明书的一部分引入。

[实施例1]将源自通过“只含有盐类和高浓度葡萄糖的缓冲液”制得的人ESC的褐色脂肪细胞上清，给药到小鼠皮下时的降血糖作用：

使用在小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)上维持培养的人ESC的KhES-3株(Suemori等，Biochem Biophys Res Commun345:926-932,2006)，使用[参考例4]所述的方法进行了向褐色脂肪细胞(brownadipocyte:BA)的分化诱导。从分化诱导第10天(8天的浮游后，在半径6cm培养皿上进行贴壁培养的第2天)的成熟BA中除去分化培养基，添加含有16.8mM葡萄糖的Krebs-Ringer-HEPES(KRH)缓冲液(NaCl:128mM,KCl:5mM,CaCl₂2.7mM,MgSO₄1.2mM,Na₂HPO₄:1mM,HEPES(pH7.4):20mM,葡萄糖16.8mM)2ml，在二氧化碳气体培养装置(37℃、5％CO₂)内培养16小时后，回收上清(BA-SUP)。将之注射到6只10周龄的ICR系统小鼠的皮下(12.5μl/g体重)。以后使小鼠绝食，16小时后从尾静脉采血，测定了空腹时的，血糖值、胰岛素值、中性脂肪(TG)值。其后，使用饲管将1g/kg的葡萄糖液经口给药，测定了15分钟后的血中胰岛素值。需要说明的是作为对照组，将添加了提高体重换算后为等量(12.5μl/g体重)的16.8mM葡萄糖的KRH缓冲液向6只小鼠给药，进行了同样的实验。

结果，BA-SUP给药小鼠组与对照组小鼠组比较，空腹时血糖值显著降低了(图1A，左)。另外，作为胰岛素抵抗性指数HOMA-IR值(空腹时胰岛素值(μU/ml)×空腹时血糖值(mg/dl)/405)的值也显著降低(图1A，中)。以上，显示了通过BA-SUP给药胰岛素敏感性亢进。另一方面，空腹时TG值在两组之间没有显著差异(图1A，右)。从将源自人ESC(KhES-3株)的BA移植至小鼠皮下时，空腹时的血糖值和空腹时的TG值两者均降低来看(非专利文献19)，可以认为BA发挥的代谢改善作用中，糖代谢的改善效果是BA分泌的可溶性因子BATokine的作用，脂质代谢的改善效果是BA从血中吸收中性脂肪，将之燃烧的结果。

综上所述，可以认为BA与基于脂肪燃烧的体产热相独立，通过BATokine发挥糖代谢改善的作用。需要说明的是，从经口葡萄糖负荷15分钟后的血中胰岛素值在BA-SUP给药小鼠中增加这点来看(图1B)，教导了BA-SUP不仅具有胰岛素敏感性亢进，还具有胰岛素分泌促进作用。

[实施例2]通过“BA分化培养基”制得的源自人ESC的BA上清的向骨骼肌细胞中添加时的葡萄糖转运体基因Glut4/GLUT4的表达诱导作用：

使用在小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)上维持培养中的人ESC(KhES-3株)，用[参考例4]所述的方法制备BA。并且从第10天的成熟BA中除去分化培养基，添加了新鲜的分化培养基(培养基交换)。接下来，在二氧化碳气体培养装置(37℃、5％CO₂)内培养16小时后回收了上清(BA-SUP)。对于对照组，将新鲜的分化培养基，用明胶涂覆皿在二氧化碳气体培养装置(37℃、5％CO₂)内培养，将16小时后回收的上清作为对照组上清使用(ControlSUP)。

使用从美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection)(ATCC)获得的小鼠肌肉芽细胞株C2C12，依照ATCC推荐的方法，用96孔板制备肌小管细胞，接下来除去培养基，添加BA-SUP或ControlSUP，在二氧化碳气体培养装置(37℃、5％CO2)内培养16小时。其后，回收细胞，对在骨骼肌细胞中发挥机能的葡萄糖转运体基因Glut4、修正用对照组基因的Actin\beta(ACTB)的表达，通过定量的RT-PCR法进行了测定。

结果，通过添加BA-SUP，Glut4的表达量显著上升(图2A，左)。另外，在独立进行的实验中，使用作为修正用对照组基因的3-磷酸甘油醛脱氢酶(3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase))(GAPDH)对Glut4表达量进行测定时也得到了同样的结果(图2A，右)。

将用前段所述的方法制得的BA-SUP，向人骨骼肌细胞(SkMC,TAKARABIO株式会社)中添加，在二氧化碳气体培养装置(37℃、5％CO₂)内培养16小时后，回收细胞，测定了GLUT4基因以及作为修正用对照组基因的GAPDH基因的表达。

结果，通过BA-SUP的添加GLUT4的表达显著上升(图2B)。

[实施例3]通过“只含有盐类和高浓度葡萄糖的缓冲液”制得的源自人ESC/iPSC的BA上清的对胰岛β细胞的胰岛素分泌促进作用：

与[实施例1]同样地操作，制备了源自人ESC的BA的SUP。即，从在MEF上维持培养的人ESC向BA分化诱导(非专利文献19)，从第10天的成熟BA中除去分化培养基后，添加含有16.8mM葡萄糖的KRH缓冲液，在二氧化碳气体培养装置(37℃、5％CO₂)内培养16小时后回收上清。另一方面，将作为小鼠胰岛β细胞株的MIN6细胞(从宫崎纯一大阪大学产学连携本部特任教授(现在)处分得)以推荐方法(Miyazaki等，Endocrinology127:126-132,1990)在96孔板中培养。其用PBS缓冲液清洗后，用含有2.8mM葡萄糖KRH缓冲液培养了1小时(低葡萄糖处理)，除去细胞上清后，添加将BA-SUP用对照组SUP(含有16.8mM葡萄糖的KRH缓冲液)稀释为1/10得到的BA-SUP，或添加对照组SUP，在二氧化碳气体培养装置(37℃、5％CO₂)内培养了2小时。其后，回收MIN6细胞的上清，通过ELISA法(超高灵敏度小鼠胰岛素测定试剂盒，株式会社森永生科学研究所)测定了胰岛素浓度。

结果，BA-SUP添加组与对照SUP添加组相比，胰岛素分泌量显著增加(图3A)。

在使用由人iPSC(人脐带静脉内皮细胞HUVEC制得的株，专利文献1、非专利文献19)制得的BA实施的研究中也得到了同样的结果(图3B)。

[实施例4]通过“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制备的源自人ESC的BA上清的对胰岛β细胞的胰岛素分泌促进作用：

通过和[实施例1]同样的步骤，制备了葡萄糖浓度低的源自人ESC的BA-SUP。即，从在MEF上维持培养的KhES-3株制备BA，从Day10的成熟BA中除去分化培养基后，添加含有2.8mM葡萄糖的Krebs-Ringer-TRIS-Bicarbonate(KRTB)缓冲液(NaCl:119mM,KCl:4.74mM,CaCl₂1.19mM,MgCl₂1.19mM,KH₂PO₄:1.19mM,NaHCO₃:25mM,TRIS(pH7.4):10mM,葡萄糖2.8mM)，在二氧化碳气体培养装置(37℃、5％CO₂)内培养16小时后回收上清(BA-SUP)。作为对照组，使用含有2.8mM葡萄糖KRHB缓冲液，通过和[实施例3]同样的步骤，使用MIN6细胞评价了对胰岛素分泌的影响。

结果，BA-SUP添加组与对照SUP添加组相比，胰岛素分泌量显著增加(图4)。

[实施例5]“通过无饲养层培养体系维持的人多能性干细胞”的BA分化诱导：

将用Essential 8Flex Medium Kit(Thermo Fisher Scientific公司，美国)以及以30倍稀释的Corning^TM Matrigel^TM Matrix(Corning公司，美国)涂覆的培养皿维持培养中的人ESC(KhES-3株)，用剥离液(0.25％胰蛋白酶,1mg/mlTypeIV Collagenase；1ml,20％Knockout血清替代物(Serum Replacement)(KSR)^TM；0.01mMCaCl₂/PBS)回收，在作为ROCK抑制剂的Revita Cell^TM Supplement(x100)(Thermo Fisher Scientific公司)的存在下使用TripLE^TM Express Enzyme(Thermo Fisher Scientific公司)将细胞分散为单细胞后，向Prime Surface^TM 96孔细胞培养板(住友Bakelite株式会社)的各孔中，以2×10⁴cells-6×10⁴cells/well播种细胞，通过使用[参考例4]所述的细胞凝聚物制备用培养基培养制备了球体(图5A)。在第8天回收球体，使用以胶原蛋白I涂覆皿(AGC Techno Grass株式会社)涂覆的培养皿，以[参考例4]记载的褐色脂肪细胞诱导培养基进行了培养。在第10天，在相位差显微镜下观察到成熟BA特有的多胞性脂肪滴(图5B左)，它们被脂肪染色剂Oil Red O染色(图5B中)，与BA的产热能力相关的UCP1蛋白的表达被免疫染色所确认(图5B右)。另外，在分化过程中随时间回收细胞并进行定量的RT-PCR的结果，确认了作为BA前体的背侧伸肌肉群肌肉芽细胞标记物的MYF在第6天(肌肉芽细胞的分化阶段，非专利文献19)被诱导至顶峰，且确认了从具有BA和骨骼肌细胞2方向性分化能的肌肉芽细胞向BA的分化定型所需要的转录因子EBF2以及转录调节因子PRDM16在分化后半段中的表达诱导以及脂肪细胞的成熟化(脂肪滴形成)所需要的转录因子PPARγ在分化后期中的表达诱导(图5C)。

[实施例6]使用从“通过无饲养层培养体系维持的人多能性干细胞”制备的BA，将其通过“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制得的人BA上清的胰岛素分泌促进作用：

使用以StemFit^TM AK02N(味之素Healthysupply株式会社)及用玻连蛋白(Vitronectin(VTN-N)重组人蛋白，Vitronectin(VTN-N)Recombinant Human Protein,Truncated,A14700,Thermo Fisher Scientific公司)涂覆的培养皿维持培养中的人ESC(KhES-3株)，用和[实施例5]同样的步骤进行了向BA的分化诱导。使用制得的成熟BA，用与[实施例4]相同的步骤，通过“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制备SUP(BA-SUP)。使用此BA-SUP，和[实施例4]同样地操作，使用MIN6细胞测试了对胰岛素分泌的影响。

结果，发现了BA-SUP(图6，黑柱)发挥与高浓度胰岛素刺激(图6，灰色柱)同程度的胰岛素分泌促进能力(图6)。

[实施例7]从“通过无饲养层培养体系维持的人多能性干细胞”的使用“不含细胞因子鸡尾酒的培养基”的BA分化诱导：

使用通过StemFit^TM AK02N(味之素Healthysupply株式会社)，以及用玻连蛋白(同上,Thermo Fisher Scientific公司)涂覆的培养皿维持培养中的人ESC(KhES-3株)，通过与[实施例5]同样的步骤进行剥离回收以及单细胞分散，将其向96孔型的EZSPHERE^TM(AGCTechno Grass株式会社)中以1×10⁵cells/well播种，制备细胞凝聚体，并进行了向BA的分化诱导。此时，使用从[参考例4]所述的细胞凝聚物制备用培养基以及褐色脂肪细胞诱导培养基中除去细胞因子鸡尾酒的培养基进行分化诱导，验证了：在从分散为单细胞的人ESC制备的球体中，通过人ESC自身分泌的自分泌/旁分泌因子群的信号，具有高指向性地，BA分化自发地被诱导的可能性。

结果，在使用不含细胞因子鸡尾酒的细胞凝聚物制备用培养基以及褐色脂肪细胞诱导培养基时，从KhES-3株，细胞凝聚体与传统方法同样地形成，且作为标记物的PRDM16、PPARγ、CEBPB的基因表达被充分诱导(图7)。同样使用从人iPSC(源自BJ细胞)除去细胞因子鸡尾酒的培养基进行分化诱导的结果，形成了细胞凝聚体。分化第8天的细胞中的作为BA标记物PRDM16基因表达提高为未分化iPSC的155倍。

[实施例8]使用由“通过无饲养层培养体系维持的人多能性干细胞”通过“不含细胞因子鸡尾酒的培养基”诱导的BA，通过“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制得的人BA上清的对胰岛素分泌促进作用：

与[实施例7]同样地制备hESC(KhES-3株)BA，与[实施例6]同样地操作，使用作为“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”的Krebs-Ringer-Tris-Bicarbonate(KRTB)缓冲液(NaCl:119mM,KCl:4.74mM,CaCl₂1.19mM,MgCl₂1.19mM,KH₂PO₄:1.19mM,NaHCO₃:25mM,Tris(pH7.4):10mM,葡萄糖2.8mM)制备了BA-SUP。使用该BA-SUP，与[实施例4]同样地操作，在向MIN6细胞添加2小时后，使用Infinite^TM M1000 PRO(TecanJapan株式会社)，以NewHTRF^TMHigh Range胰岛素分析法测定了上清中的胰岛素量。需要说明的是，作为阴性对照组，使用了含有低葡萄糖(2.8mM葡萄糖)的KRTB缓冲液、含有高葡萄糖(16.8mM葡萄糖)的KRTB缓冲液。

结果，由“通过无饲养层培养体系维持的人多能性干细胞通过不含细胞因子鸡尾酒的培养基诱导得到的褐色脂肪细胞”，通过“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制得的上清(BA-SUP)也被确认到具有胰岛素分泌促进活性(图8)。

[实施例9]由“通过无饲养层培养体系维持的人多能性干细胞”使用“不含细胞因子鸡尾酒的最小需要培养基”的BA分化诱导：

关于分化培养基中含有的诸成分，是在通用的“无血清培养基”中为了替代血清的效果而添加的，被认为具有担保细胞生存性的效果的牛血清白蛋白(BSA)\α-硫代甘油(α-MTG)\无蛋白杂交瘤混合物(protein free hybridoma mix)(PFHMII,GibCO#12040-077,Life Technologies,Inc.)，在褐色脂肪细胞分化诱导中是否是必须的，通过除去它们是否可以使分化为褐色脂肪细胞以外的细胞系的细胞死灭进行了探讨。即，与[实施例7]同样地操作，从用无饲养层培养体系维持的人ESC(KhES-3,KhES-1株)，通过单细胞分散操作，进行BA分化诱导，使用了[实施例7]中记载的“不含细胞因子鸡尾酒的培养基”，和从其中进一步除去BSA、α-MTG、PFHMII的培养基，并比较了BA分化诱导的状况。

结果，关于KhES-3株，即使使用将这些成分全部除去的培养基(最小需要培养基)进行BA分化诱导，也与使用含细胞因子培养基时同样地形成细胞凝聚体(图9A)，作为BA标记物的PRDM16、PPARγ的表达也毫不逊色于使用含细胞因子培养基时(图9B)。另外，在分化诱导第10天，作为成熟BA特有的细胞形态的丰富的线粒体(图9C，绿)、多胞性脂肪滴(图9C，赤)也被观察到。需要说明的是，在[参考例4]的方法中，编码分化诱导培养基中添加的细胞因子(IL6、VEGF、BMP4、Flt-3L、SCF)的基因的表达以定量的RT-PCR法进行测定的结果，发现了在分化过程中这些基因的表达被诱导(图9D)。从此结果来看，使用“最小需要培养基”进行分化诱导时，编码细胞因子鸡尾酒中含有的细胞因子的内源性基因的表达被诱导，可以认为是由于它们对autocrine/paracrine发挥机能，使得在不添加外源性细胞因子的条件下，BA分化被诱导。

接下来，关于KhES-1株，进行了使用最小需要培养基的BA分化诱导。结果，作为BA标记物的PRDM16、PPARγ的表达，毫不逊色于使用含细胞因子培养基时地被诱导(图9E)，在分化诱导第10天，作为成熟BA特有的细胞形态的丰富线粒体(图9F，绿)、多胞性脂肪滴(图9F，赤)被观察到。

以上，在进行试验的2株的人ESC(KhES-3株，khES-1株)的两者中，即使是不含细胞因子的最小需要培养基，也达成了与使用在先申请的技术中使用的含有细胞因子鸡尾酒的培养基时相同的BA分化诱导。

需要说明的是，本项使用的最小需要培养基的组成如同下述。

IMDM(I3390,Sigma Chemical公司)和Ham’sF12(087-08335,富士film光纯药株式会社)的1对1混合培养基,1:100Chemically Defined Lipid Concentrate(Gibco#11905-031,Thermo Fisher Scientific公司),1:100胰岛素-transferrin-selenium(ITS-A,Thermo Fisher Scientific公司),2mM GlutamaxII(L-丙氨酸-L-谷氨酰胺二肽；GibCO#35050-061,Thermo Fisher Scientific公司),50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸盐(A-8960,SigmaChemical公司)

[实施例10]由“无饲养层人ESC”通过“最小需要培养基”制得的BA，使用其以“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制得的人BA上清的胰岛素分泌促进作用：

与[实施例9]同样地操作，从通过无饲养层培养体系维持的人ESC(KhES-3株)，以最小需要培养基进行BA分化诱导，与[实施例8]同样地操作使用“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制备了BA-SUP。将如此制备的BA-SUP添加至MIN6细胞中，与[实施例8]同样地操作，以New HTRF^TM HighRange胰岛素分析法测定了胰岛素分泌量。

结果，用该方法制得的BA-SUP也被观察到具有胰岛素分泌促进活性(图10)。

[实施例11]由“无饲养层人ESC”通过“最小需要培养基”制得的BA，使用其以“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制得的人BA上清的胰岛β细胞的葡萄糖吸收促进作用：

与[实施例10]同样地操作，使用由通过无饲养层培养体系维持的人ESC(KhES-3株)，通过最小需要培养基制得BA，将该BA以“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制备了BA-SUP。将其添加至MIN6细胞中，使用葡萄糖Uptake-Glo^TM分析(Promega社)解析了对葡萄糖吸收的影响。具体而言，向96孔板中播种1.2×10⁵的MIN6细胞，在72小时的培养后，用含有低葡萄糖的KRTB缓冲液(葡萄糖2.8mM)培养2小时后，除去培养基，添加BA-SUP或对照组SUP，3小时后用PBS清洗3次将葡萄糖洗去后，添加1mM的2-脱氧葡萄糖(2-DG)50μl，75分钟后添加终止液，接下来添加中和液(neutra lizing solution)，在添加发光测定基质60分钟后用光度计测定了发光量。

结果，通过添加BA-SUP，MIN6细胞的葡萄糖吸收能力提高了(图11A)。

[实施例12]由“无饲养层人ESC”通过“最小需要培养基”只用“1步”浮游培养制得的BA，使用其通过“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制得的人BA上清的胰岛素分泌促进作用：

使用StemFit^TMAK02N(味之素Healthysupply株式会社)，以及以用玻连蛋白涂覆的培养皿，使用维持培养中的人ESC(KhES-3株)，通过与[实施例7]同样的步骤，进行剥离回收以及单细胞分散后，使之在最小需要培养基中以3×10⁵cells/ml的密度浮游，使用30mL一次性生物反应器(BWV-S03A，Able株式会社)，在设置于二氧化碳气体培养装置(37℃、5％CO₂)内部6通道磁力搅拌器(BWS-S03N0S-6，Able株式会社)上，以55转/分钟的速度进行了旋转培养。培养基(最小需要培养基)每2天将一半的量与新鲜培养基交换，如此培养10天后，用10ml的[实施例8]中记载的“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”清洗后，使之在[实施例8]中记载的“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”7.5ml悬浊，向5片Nunclon60mm皿(无涂敷)上播种(1.5ml/dish)后在二氧化碳气体培养装置(37℃、5％CO₂)内培养16小时后，将细胞离心分离，以此制备了BA-SUP。使用此BA-SUP，与[实施例4]同样地，使用MIN6细胞调查了其对胰岛素分泌的影响。另一方面，与[实施例7]同样地，将使用EZSPHERE^TM(AGC Techno Grass社)以最小需要培养基制得的细胞凝聚体在胶原蛋白I涂覆皿(AGCTechno Grass社)上贴壁培养，进行BA分化诱导，制备[实施例8]中记载的通过“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制得的BA-SUP，与[实施例4]同样地操作，使用MIN6调查了对细胞胰岛素分泌的影响。

结果，使用生物反应器，在所有步骤中通过浮游培养制备的BA-SUP和通过浮游培养和贴壁培养2种培养步骤制得的BA-SUP之间，未观察到胰岛素分泌促进活性的差异(图12)。

[实施例13]将由无饲养层人ESC通过“最小需要培养基”制得的BA，使用其通过“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制得的BA-SUP的胰岛素分泌促进活性的相关的超离心的影响：

与[实施例12]同样地，由通过无饲养层培养体系维持的人ESC(KhES-3株)，通过最小需要培养基进行BA分化诱导，并通过“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制备了BA-SUP。另外，对一部分的BA-SUP，以160,000G进行超离心处理，将上清成分和沉淀物成分(颗粒)分别回收，使用MIN6细胞调查了对胰岛素分泌的影响。

结果，BA-SUP的胰岛素分泌促进活性的大部分，在160,000G超离心处理后于其上清成分被回收(图13)。但是，虽然是极少量，160,000G超离心处理后的颗粒成分(外泌体部分)中也被观察到具有胰岛素分泌促进活性(图13)。从上述结果来看，BA-SUP中的胰岛素分泌促进活性的主要的作用是通过可溶性因子BATokine(狭义的BATokine)产生的，但少量的外泌体性BATokine(广义的BATokine)也存在于BA-SUP。另外此结果还显示了在BA-SUP中存在具有代谢改善作用的多个的不同生理活性因子。

[实施例14]从无饲养层人ESC以“最小需要培养基”制备的BA的生物体中的产热能力的评价：

将使用StemFit^TM和iMatrix-511涂覆皿，回收以无饲养层培养体系维持的人ESC(KhES-1株)以及人iPS(201B7株)，并在最小需要培养基中进行悬浊。将此，以Elplasia^TM 3DDiscovery tool(株式会社kuraray)中以1.8×10⁵cells/well(i.e.2×10³cells/spheroid)的密度进行了播种。此后，将培养基每2天与新鲜的最小需要培养基以一半量交换，以“1步”贴壁培养，进行了BA分化诱导。在第11天回收细胞，用PBS洗涤1次后，在颗粒沉淀的状态下用冰冷却，包埋至纤维蛋白凝胶30μl中。这里的纤维蛋白凝胶是如下制备而得到的：89.3μl的纤维蛋白原(牛血纤维蛋白原I-S型(Fibrinogen from bovine plasmaTypeI-S)，Sigma-Aldrich社，商品号F8630)的水溶液(2.8mg/ml)中，加入中和后的I型胶原蛋白液(3.0mg/ml)(鼠尾胶原蛋白I型(Collagen TypeI Rat Tail)，Corning社，商品号354236)6.7μl和抑肽酶液(来自牛肺盐水中的抑菌肽酶(Aprotinin from bovinelungsaline solution)，Sigma-Aldrich社，商品号A6279)3μl的溶液99μl后，加入50U/ml的凝血酶溶液(来自牛血浆冻干粉凝血酶(Thrombin from bovine plasma lyophilizedpowder)，Sigma-Aldrich社，商品号T4648)1μl。需要说明的是，中和I型胶原蛋白液是，在5.55μl的胶原蛋白液中混合1.15μl的中和液(0.67μl 10XPBS+0.13μl 1N NaOH+0.35μl蒸馏水)的溶液。通过将此纤维蛋白凝胶液30μl加入放入有细胞颗粒的冰冷离心管中充分悬浊而制备了“BA包埋的凝胶”。需要说明的是，作为对照组，向无细胞颗粒的离心管中加入纤维蛋白凝胶液30μl而制备了凝胶。将这些凝胶，依据非专利文献19中记载的方法移植至小鼠，对生物体中的产热能力进行了评价。具体而言，对事前进行了臀部脱毛处理ICR系统小鼠，将“纤维蛋白凝胶”或“BA包埋的纤维蛋白凝胶”，在右臀部切开的5mm的皮肤切开部(图14A,14C，箭头)处用P1000吸头进行了注入(注：根据纤维蛋白凝胶的特性，凝胶会从切开创口向皮下组织传递，在臀部皮下组织广泛展开)，48小时后将交感神经受体激动剂异丙肾上腺素向腹腔内给药，6分钟后以臀部为中心，用红外线照相机对小鼠进行了拍摄。

结果，移植了BA包埋凝胶的小鼠，与只移植了凝胶小鼠相比，异丙肾上腺素给药后臀部的皮肤温度显著上升(图14B,14D)。

综上所述，确认了以“最小需要培养基”制备的BA，是可以在生物体中发挥产热能力的“机能性BA”。

[实施例15]使用由无饲养层人ESC通过“最小需要培养基”制得的BA，使用其通过“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制得的BA-SUP的人骨骼肌细胞(SkMC)的葡萄糖吸收的促进作用：

与[实施例10]同样地操作，由通过无饲养层培养体系维持的人ESC(KhES-3株)，通过细胞必要培养基进行BA分化诱导，使用只含有“盐类和低浓度(2.8mM)葡萄糖的缓冲液(KRTB)”制备了BA-SUP。并且，关于对人骨骼肌细胞(SkMC)(CC-2561，Lonza公司)的葡萄糖吸收的影响，使用专用的试剂盒(葡萄糖Uptake-Glo^TM分析,J1342，Promega社)进行了评价。具体的步骤如下。

将传代数4的SkMC用SkGM-2^TM BulletKit^TM(Lonza公司)向24孔板播种(10⁵cells/well)、在5％二氧化碳气体培养装置内于37℃下进行了培养。8天后，将细胞用PBS0.5ml清洗，用KRTB或BA-SUP 500μl置换培养基培养了3小时。其后，将细胞用PBS 0.5ml清洗，添加溶解在PBS中的1mM2-脱氧葡萄糖(2-DG,040-06481,富士film光纯药株式会社)0.25ml，进一步培养10分钟后，添加125μl的终止液(试剂盒自带)。其后，回收细胞并溶解，依照说明书测定了葡萄糖吸收能力。葡萄糖吸收能力通过用细胞溶解液的蛋白量对通过用细胞溶解液和试剂盒处理而产生的萤光素的荧光值进行修正后的值(Luminescence/protein)进行评价。需要说明的是，蛋白量是用BCA分析(T9300A，TAKARABIO株式会社)测定的。另外，作为葡萄糖吸收促进作用有关的阳性对照组实验，是向不含葡萄糖的DMEM培养基(09891-25，Nacalai Tesque株式会社)以及不含葡萄糖的DMEM培养基中添加了1mM胰岛素(I9278,Sigma-Aldrich社)的组使用葡萄糖Uptake-Glo^TM分析而进行的。

结果，用BA-SUP培养SkMC时，与用KRTB培养时相比，葡萄糖吸收得到促进，其程度与1mM胰岛素的效果是相同的(图15)。从上述结果来看，BA-SUP具有对人骨骼肌细胞的葡萄糖吸收能力促进作用。

[实施例16]由无饲养层人ESC通过“最小需要培养基”制得的BA，将其通过“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制得的BA-SUP进行生物素化时的对人骨骼肌细胞(SkMC)的葡萄糖吸收的促进作用：

与[实施例15]同样地操作，由无饲养层培养体系维持的人ESC(KhES-3株)通过细胞必要培养基进行BA分化诱导，使用只含有“盐类和低浓度(2.8mM)葡萄糖的缓冲液(KRTB)”制得了BA-SUP。并且将1ml的BA-SUP或1ml的KRTB(含有2.8mM葡萄糖)冻结干燥，用蒸馏水900μl溶解后，使其通过了作为脱盐柱的PDMiniTrapG-10(GE Healthcare Japan株式会社)。并且用500μl PBS溶出后，在用BCA分析测定了蛋白量的基础上，使用作为氨基生物素化试剂盒的EZ-Link^TMSulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit(Thermo Fisher Scientific公司)，依照说明书的指示进行了生物素化反应。其后，从反应样品中回收300μl并上样于PDMiniTrapG-10后，用500μl的不含葡萄糖的DMEM培养基(09891-25，Nacalai Tesque株式会社)溶出，对其中200μl进行了冻结干燥。并且，和实施例15同样地操作，评价其对SkMC的葡萄糖吸收产生的影响进行了评价。需要说明的是，分析中的用量相当于BA-SUP 480μl，条件与实施例15中所述的实验几乎相同。

结果，通过链霉亲和素印迹确认了BA-SUP中的大部分的蛋白被生物素化(图16A)。另外，也确认了即使在进行了生物素化之后，对于SkMC而言，也表现出了与1mM胰岛素相同的葡萄糖吸收促进作用(图16B)。从上述结果来看，确认了即使对BA-SUP中存在的蛋白进行生物素化操作，葡萄糖吸收促进作用也可以被保持。

[实施例17]使用由无饲养层人ESC制备的BA，将其通过“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制得的BA-SUP的对人心肌细胞的葡萄糖吸收的促进作用：

与[实施例6]同样地操作，由无饲养层培养体系维持的人ESC(KhES-3株)通过必要培养基进行BA分化诱导，使用“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液(KRTB)”制备了BA-SUP。并且，其对人心肌细胞(Human Cardiac Myocytes；HCM)的葡萄糖吸收的影响，使用专用的试剂盒(葡萄糖Uptake-Glo^TM分析,J1342，Promega社)进行了评价。具体的步骤如下。

将HCM(C-12810，Promocell社)用Myocyte Growth Medium Kit(C-22170，Promocell社)向12孔板中播种(5×10⁴cells/well)，在5％二氧化碳气体培养装置内、37℃下培养。7天后，将培养基置换为不含葡萄糖的DMEM培养基(09891-25，Nacalai Tesque株式会社)1ml，在5％二氧化碳气体培养装置内、37℃下培养3.5小时后，用KRTB(含2.5m葡萄糖)清洗3次后，使用1)KRTB(含2.5m葡萄糖)1ml、2)向KRTB(含2.5m葡萄糖)添加了100nM胰岛素的培养液1ml或3)将KRTB(含2.5m葡萄糖)0.5ml和BA-SUP0.5ml混合的培养液，在5％二氧化碳气体培养装置内、37℃下、2.5小时，对HCM进行了培养。其后，向各组细胞中添加10μl的1mM 2-DG培养0.5小时后，用PBS3ml清洗3次后，回收细胞，与实施例15同样地对HCM的葡萄糖吸收能力进行了评价。

结果，发现了BA-SUP促进HCM的葡萄糖吸收的效果与100nM胰岛素相同或在其以上(图17A)。另外，使用回收的HCM，用定量的RT-PCR对心肌细胞中主要的葡萄糖转运体GLUT1的表达进行了测定。结果，发现了BA-SUP提升GLUT1的表达的效果与100nM胰岛素相同或在其以上(图17B)。从上述结果来看，BA-SUP对于心肌细胞，可以认为具有诱导GLUT1表达的效果和促进葡萄糖吸收的效果。

[实施例18]使用由无饲养层人ESC通过“最小需要培养基”制

地的BA，从将其通过“只含有盐类和低浓度葡萄糖的缓冲液”制得的BA-SUP中回收含有线粒体微粒：

与[实施例15]同样地操作，由通过无饲养层培养体系维持的人ESC(KhES-3株)用细胞必要培养基进行BA分化诱导，使用只含有“盐类和低浓度(2.8mM)葡萄糖的缓冲液(KRTB)”制备了BA-SUP。将BA-SUP中含有的微粒，通过分阶段的超离心操作进行回收，调查了其是否含有线粒体。具体的步骤如下。

将BA-SUP在2KG(G是重力加速度)离心力下进行超离心处理，将其上清再在10KG下超离心处理，将其上清再在160KG的离心力下超离心处理。回收各超离心处理的沉淀级分，用Human Mitochondrial DNA Monitoring Primer Set(TAKARABIO株式会社)，通过qPCR对是否含有线粒体进行了评价。

结果，在2KG、10KG的超离心处理中的沉淀的级分中确认到了线粒体的存在(图18A,18B)。另外，用0.3KG、2KG、10KG、160KG阶段的超离心处理中回收的沉淀部级分，使用外泌体标记物(CD9、CD81)、作为微粒而在细胞外分泌的已知的HSP70和β-肌动蛋白、作为线粒体标记物蛋白ATP5A的抗体进行了蛋白质印迹法(Westernblotting)。结果，在0.3KG、2KG、10KG的超离心处理中的沉淀级分中确认了源自线粒体的蛋白ATP5A的存在(图18C)。

从上述结果来看，通过将BA-SUP用10KG以下的加速度进行离心处理并回收沉淀级分，可以高效地回收含有线粒体的微粒。

[实施例19]通过伤口愈合分析评价使用由无饲养层人ESC以“最小需要培养基”制得的BA而制备的BA-SUP的损伤治愈能力：

与[实施例15]同样地由从通过无饲养层培养体系维持的人ESC(KhES-3株)通过最小需要培养基进行了BA分化诱导。在分化诱导第8天转为贴壁培养，交换新鲜的最小需要培养基。进一步在5％二氧化碳气体孵育器内37℃下培养2天后，在分化诱导第10天培养回收了上清。将其在300G下离心除去细胞碎片后，进一步在160,000G下进行超离心处理，将除去沉淀物(微粒部分)后得到的上清作为BA-SUP。作为阴性对照组，使用将最小需要培养基在300G下离心后，进一步在160,000G下进行超离心处理，除去沉淀物(微粒级分)后得到的上清。

另一方面，将人脐带静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein EndothelialCells:HUVEC)用专用培养基(EGM^TM-2Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit^TM，TAKARABIO株式会社)在12孔板中进行了培养。细胞如果达到融合，就用1000μl塑料将板中央部的细胞剥离为线状(损伤(Wound)的形成)。用PBS清洗后，用相位差显微镜拍摄细胞照片，将最小需要培养基或BA-SUP(都用超离心处理除去微粒级分)各600μl添加至细胞。在5％二氧化碳气体孵育器内、37℃下培养16小时后，再次拍摄损伤(wound)形成处的照片，将培养前后的未被细胞覆盖的板底面部(损伤部)的面积进行了比较。

结果，通过用塑料吸头刮挠而形成的剥离部，在用最小需要培养基或通过BA-SUP培养后会缩小(图19左)，但缩小率(损伤治愈能力)通过BA-SUP添加样品而明显提高(图19右)，从以上的结果来看，BA-SUP可以提高血管内皮肤细胞的损伤治愈能力。

[参考例1]使用仙台病毒载体的人人工多能性干细胞的诱导：

将人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)(Lonza groupLtd.)以2.5×10⁵个/well，播种到用0.1％猪明胶涂覆的6孔型培养板上，用EGM-2培养基(Lonza groupLtd.)，在37℃、5％CO₂孵育器内进行了培养。培养后，用MOI＝3的浓度的下记(a)～(d)的载体对培养的细胞进行了感染(WO2010/008054)。

(a)SeV18+OCT3/4/TSΔF载体

(b)SeV18+SOX2/TSΔF载体

(c)SeV18+KLF4/TSΔF载体

(d)SeV(HNL)c-MYC/TS15ΔF载体

感染载体后，翌日用含有10％FBS的DMEM进行了培养基交换。其后在37℃、5％CO₂孵育器中培养了6天。接下来，在明胶涂覆10cm培养皿上准备的X线照射处理后的小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)6.0×10⁵(个)，在其上培养了用Accutase(InnovativeCellTechnologies,Inc.)剥离的导入细胞9.0×10⁵～1.5×10⁶(个)。翌日，将含有10％FBS的DMEM交换为灵长类ES细胞用培养基(ReproCELLInc.)(添加FGF2以达到5ng/ml)，在3％CO₂孵育器中进行了培养。培养基交换每天进行。

培养数天后出现群落，通过培养20天左右，出现了人胚性干细胞样的群落。可以观察到与诱导前的HUVEC明显不同的人胚性干细胞和相同的扁平群落。此人胚性干细胞样的群落，与现有报道的外观相同。

将这些群落，用微移液器进行分离后，在新的MEF上进行了培养。并且，介由使用人多能性干细胞用剥离液(0.25％胰蛋白酶(LifeTechnologies,Inc.)，1mg/ml胶原酶IV型(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)20％KnockOut^TM血清替代物(SerumReplacement)(Life Technologies,Inc.)1mMCaCl₂)的剥离操作，可以进行稳定的传代、增殖培养。

[参考例2]源自SeV载体的外来基因的除去：

为了获得从参考例1中得到的SeV-iPS细胞中除去源自SeV载体的外来基因的株而进行了克隆。

作为源自SeV载体的外来基因的除去的大概范围，通过抗SeV抗体(DNAVECCorporation)进行了免疫染色。将SeV-iPS细胞用10％Mildform(WakoPure ChemicalIndustries,Ltd.)固定，一次抗体使用抗SeV抗体，二次抗体使用Alexa Fluor 488标识抗兔IgG抗体(Life Technologies,Inc.)进行染色后，通过荧光显微镜进行了观察。

另外，为了检测出转基因(transgenes)(OCT3/4,SOX2,KLF4,cMYC)以及SeV基因组而进行了RT-PCR。其结果，参考例1中得到的SeV-iPS细胞株为SeV抗原阴性，确认了其不含有源自SeV载体的外来基因。

[参考例3]人胚性干细胞以及人人工多能性干细胞的维持培养：人胚性干细胞(KhES-3)使用了由京都大学再生医科学研究所提供的细胞。将KhES-3以及参考例1所述的SeV-iPS细胞株，在X线照射处理后的MEF上，用含有20％Knock out血清替代物(SerumReplacement)(KSR)(Life Technologies,Inc.)，5ng/mlFGF2、1％非必需氨基酸溶液、100μM2-巯基乙醇、2mML-谷氨酰胺的DMEM/F12(Life Technologies,Inc.)培养基进行了维持培养。

[参考例4]从人胚性干细胞以及人人工多能性干细胞出发的褐色脂肪细胞诱导：

在向褐色脂肪细胞的分化诱导中，首先为了从KhES-3及SeV-iPS细胞株中分离、除去MEF，将通过剥离液处理回收的多能性干细胞的浮游液，在离心管内静置30秒钟左右使多能性干细胞选择性沉淀。

向褐色脂肪细胞的分化诱导分为以下2个阶段的步骤进行。

(1)步骤A

使包含从参考例2中的多能性干细胞的沉淀物，在4ml的细胞凝聚物制备用培养基(含有5mg/mlBSA、1％体积合成脂质溶液、1％体积×100ITS-A、450μM MTG、2mML-谷氨酰胺、5％体积PFHII、50μg/ml抗坏血酸的IMDM/F12培养基，且是含有20ng/ml BMP4、5ng/mlVEGF、20ng/ml SCF、2.5ng/ml Flt3L、2.5ng/ml IL6、5ng/ml IGF2的培养基)中浮游，将其移入6孔型的MPC涂覆培养皿中，在37℃下、5％CO₂孵育器内进行了培养。之后，每3天交换一半量的培养基，进行了8～10天的培养。需要说明的是，培养基交换，是将MPC涂覆培养皿全体倾斜30度程放置1分钟左右，在确认细胞凝聚物完全沉淀之后，只将培养上清的一半量用移液器轻轻地吸出后，添加相同量的新鲜的细胞凝聚物制备用培养基，一边将MPC涂覆培养皿整体轻摇，一边将细胞凝聚物均匀地分散。

(2)步骤B

将上述制备的源自多能性干细胞的细胞凝聚物，移入10ml左右的离心管，静置30秒钟～1分钟左右使细胞成分沉淀，除去上清，加入3ml的褐色脂肪细胞诱导培养基(含有5mg/ml BSA、1％体积合成脂质溶液、1％体积×100ITS-A、450μM MTG、2mML-谷氨酰胺、5％体积PFHII、50μg/ml抗坏血酸的IMDM/F12培养基，含有10ng/ml BMP7、5ng/ml VEGF、20ng/ml SCF、2.5ng/ml Flt3L、2.5ng/ml IL6、5ng/mlI GF2的培养基)，进行1100rpm离心5分钟。将其移入事先用0.1％猪明胶水溶液在室温下反应10分钟的细胞培养皿中，在37℃下、5％CO₂孵育器内进行了培养。之后，每3天交换培养基，培养了1周。

其结果，获得了细胞质中具有多胞性脂肪滴(多数的卵黄状具有光泽的球形物)的细胞。需要说明的是，通过oil red O染色(使中性脂肪变为红色的试验)，已确认此球形物是脂肪滴。

另外通过RT-PCR和电泳确认了褐色脂肪细胞特有的基因群(UCP1、PRDM16、PGC1α、Cyt-c、CIDE-A、ELOVL3、PPARα、EVA1、NTRK3)的表达被诱导。进一步也确认了作为褐色脂肪细胞和白色脂肪细胞的共通标记物PPARγ以及脂连蛋白(adiponectin)的表达被诱导。另一方面，确认了作为白色脂肪细胞的标记物的抵抗素(Resistin)、重组人磷酸丝氨酸氨基转换酶1(PSAT1)、内皮素受体α(EDNRA)的表达未被诱导。

需要说明的是，抵抗素不仅引发胰岛素抵抗性，且是与癌化或动脉硬化相关的基因。在源自人多能性干细胞的褐色脂肪细胞中抵抗素的表达未被诱导，当然对于使用源自人多能性干细胞的褐色脂肪细胞的新药研发研究很重要，在考虑使用源自人多能性干细胞的褐色脂肪细胞的细胞疗法的安全性时也是极其重要的点。

另外通过电子显微镜观察，确认了作为褐色脂肪细胞特有的微结构的多胞性脂肪滴、在纵向上较长地融合的线粒体的存在。并且，在线粒体内部确认到了褐色脂肪细胞中特有的以梯子状发达的线粒体脊的存在。

工业可利用性

本发明提供由多能性干细胞制得的褐色脂肪细胞的上清以及其脱盐纯化物。另外本发明提供了不使用含有氨基酸或维生素、高浓度的葡萄糖等的培养液而制备具有代谢改善能力的褐色脂肪细胞的上清的方法。另外本发明提供了对褐色脂肪细胞的上清的制备有用的，源自多能性干细胞的褐色脂肪细胞的制造方法。根据本发明的方法，可以不添加细胞因子而生成褐色脂肪细胞，并取得其上清。

根据本发明，可以稳定地提供到现在为止毫无取得手段的保证了“糖代谢提高作用”且无“合成细胞因子”混入的脱盐浓缩的高滴度的“褐色脂肪细胞的上清”。另外，可以稳定地提供在基础研究或新药研发研究的领域中用于BATokine探索的材料，进一步而言，可以提供作为对肥胖或2型糖尿病等的代谢障碍性疾病的治疗工具，且作为具有多样的生理活性(促进胰岛素分泌、葡萄糖吸收促进)的BATokine鸡尾酒的高滴度BA-SUP干固品。

通过本发明，高滴度BA-SUP干固品的制备在世界上任何国家和地域中均可实施，因此可以展开巨大的产业树，故其具有实用性，在产业上的利用价值极高。

Claims (27)

1.一种具有糖代谢改善作用的组合物，其包含褐色脂肪细胞的上清。

2.如权利要求1所述的组合物，其中，

所述褐色脂肪细胞的上清不包含含有BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6及IGF2的细胞因子鸡尾酒。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其中，

褐色脂肪细胞的上清不含外源性细胞因子。

4.如权利要求1至3中的任一项所述的组合物，其中，

褐色脂肪细胞是由多能性干细胞制得的褐色脂肪细胞。

5.如权利要求1至4中的任一项所述的组合物，其中，

褐色脂肪细胞是由无饲养层培养的多能性干细胞制得的褐色脂肪细胞。

6.如权利要求1至5中的任一项所述的组合物，其中，

褐色脂肪细胞是不添加包含BMP4、VEGF、SCF、Flt3L、IL6及IGF2的细胞因子鸡尾酒和/或包含BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6及IGF2的细胞因子鸡尾酒而从多能性干细胞生成的褐色脂肪细胞。

7.如权利要求1至6中的任一项所述的组合物，其中，

上清为通过使褐色脂肪细胞与盐类缓冲液一起孵育而制得的上清。

8.如权利要求7所述的组合物，其中，

盐类缓冲液含有葡萄糖。

9.一种制造权利要求7或8所述的组合物的方法，其包括：

(1)通过无饲养层维持培养多能性干细胞的步骤，

(2)在无血清环境下非贴壁培养步骤(1)的细胞，使其形成细胞凝聚体的步骤，

(3)在无血清环境下培养步骤(2)的细胞，使其分化为褐色脂肪细胞的步骤，

(4)在盐类缓冲液中孵育步骤(3)的褐色脂肪细胞，并回收其上清的步骤。

10.一种能够用于权利要求1至9中的任一项所述的组合物或该组合物的制造中的褐色脂肪细胞的制造方法，其包括：

(1)通过无饲养层维持培养多能性干细胞的步骤，

(2)使步骤(1)的细胞分散，不添加包含BMP4、VEGF、SCF、Flt3L、IL6及IGF2的细胞因子鸡尾酒，并在无血清环境下进行非贴壁培养，形成细胞凝聚体的步骤，

(3)不添加包含BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6及IGF2细胞因子鸡尾酒，在无血清环境下，培养步骤(2)的细胞的步骤。

11.如权利要求10所述的方法，其进一步包括：

(4)在盐类缓冲液中孵育步骤(3)的褐色脂肪细胞，并回收其上清的步骤。

12.如权利要求9或11所述的方法，其中，

盐类缓冲液含有葡萄糖。

13.如权利要求9至12中的任一项所述的方法，其中，

在步骤(2)和/或(3)中，不与外源性细胞因子一起进行培养。

14.如权利要求9至13中的任一项所述的方法，其中，

在同样的培养容器中通过相同组分的培养基实施步骤(2)及(3)。

15.权利要求9至14中的任一项所述的方法，其进一步包括：

对得到的上清进行脱盐处理的步骤。

16.一种通过权利要求9至15中的任一项所述的方法制造的组合物。

17.如权利要求1至8及16中的任一项所述的组合物，其是医药或美容用组合物。

18.如权利要求17所述的医药组合物，其是用于预防或治疗代谢疾病或代谢异常的医药或美容用组合物。

19.如权利要求17所述的医药组合物，其是用于治疗线粒体的功能障碍引起的疾病的医药组合物。

20.如权利要求17所述的医药组合物，其是用于促进皮肤的损伤治愈的医药或美容用组合物。

21.如权利要求18所述的医药或美容用组合物，其中，

代谢疾病或代谢异常选自肥胖、超重、代谢综合征及2型糖尿病。

22.如权利要求19所述的医药组合物，其中

线粒体的功能障碍选自线粒体病及心脏疾病。

23.如权利要求20所述的医药或美容用组合物，其中，

皮肤的损伤选自皮下出血、皮下出血引起的色素沉着、皮下的毛细血管扩张。

24.一种代谢疾病或代谢异常的内科治疗或预防方法，其包含：

将权利要求18或21所述的医药组合物，向有需要的对象给药的步骤。

25.一种呈现线粒体功能障碍的疾病的内科治疗或预防方法，其包括：

将权利要求19或22所述的医药组合物，向有需要的对象给药的步骤。

26.一种呈现皮肤损伤的疾病的内科治疗或预防方法，其包括：

将权利要求20或23所述的医药组合物，向有需要的对象给药的步骤。

27.一种组合物，其包含权利要求1至8及16中的任一项所述的组合物，其用于选自降血糖、促进胰岛素分泌、胰岛素敏感性亢进、促进葡萄糖吸收、葡萄糖转运体基因表达亢进、提高线粒体机能、提高心机能及促进皮肤损伤治愈中的用途。

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