JP2022049715A - インスリン分泌促進ペプチド - Google Patents

インスリン分泌促進ペプチド Download PDF

Info

Publication number
JP2022049715A
JP2022049715A JP2019012945A JP2019012945A JP2022049715A JP 2022049715 A JP2022049715 A JP 2022049715A JP 2019012945 A JP2019012945 A JP 2019012945A JP 2019012945 A JP2019012945 A JP 2019012945A JP 2022049715 A JP2022049715 A JP 2022049715A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
peptide
amino acid
alanine
seq
insulin secretagogue
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2019012945A
Other languages
English (en)
Inventor
久美子 佐伯
Kumiko Saeki
雅子 岡
Masako Oka
和典 松村
Kazunori Matsumura
晃一 佐伯
Koichi Saeki
亜峰 朱
Aho Shu
豊隆 森
Toyotaka Mori
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Center for Global Health and Medicine
ID Pharma Co Ltd
Original Assignee
National Center for Global Health and Medicine
ID Pharma Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Center for Global Health and Medicine, ID Pharma Co Ltd filed Critical National Center for Global Health and Medicine
Priority to JP2019012945A priority Critical patent/JP2022049715A/ja
Priority to PCT/JP2020/001791 priority patent/WO2020158491A1/ja
Publication of JP2022049715A publication Critical patent/JP2022049715A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

【課題】本発明は、インスリンの分泌を促進するペプチドおよびその利用を提供する。【解決手段】ヒト多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞の培養上清(BA-SUP)中に存在するインスリン分泌促進因子の探索を通して、インスリン分泌を促進する生理活性ペプチドを同定した。また当該ペプチドを模倣するペプチドの開発を通して、αヘリックス構造を形成しうる短鎖線状ペプチドが強いインスリン分泌促進活性を示すことを見出した。また当該ペプチドは、酸性条件下での加熱処理、あるいは緩衝液への溶解後に凍結乾燥することで、インスリン分泌促進作用が上昇した活性体となることを発見した。当該ペプチドは、膵β細胞に作用してインスリン分泌を促進すると共に、インビボにおいて血糖値を低下させる作用を示した。本発明によるペプチド群は、糖代謝疾患に対する治療薬開発への応用が期待される。【選択図】図１５

Description

本発明は、インスリン分泌促進短鎖ペプチド、並びに、インスリン分泌不全による高血糖状態の是正を目的とした、内科療法に関する。
肥満および過体重を呈する人口は世界的に増加しており、2017年の「世界の疾病負担研究」では、世界の3人に1人は肥満または過体重である（非特許文献１）。肥満や過体重は、2型糖尿病・虚血性心疾患・脳血管障害・がんなど、生命を脅かす疾患群の発症リスクを上昇させる。さらに、過去に肥満や過体重を経験した人は、正常体重を維持している人よりも死亡リスクが高い（非特許文献２）。また、妊婦の血糖値が高いほど出生児への負担は際限なく大きくなり（非特許文献３）、妊娠初期に肥満や過体重であった母親の子は脳性麻痺の発症率が高く（非特許文献４）、肥満や過体重の妊婦の子は奇形になりやすいこと（非特許文献５）が報告されている。以上、肥満および過体重は、本人や次世代の健康に与える影響が深刻である。
肥満/過体重の罹患者の増加に伴い、最も大きな脅威となっているのが２型糖尿病の有病者の増大である。糖尿病の有病率は、日本で950万人、世界で4.2億人と推定される。2013年の中国の調査では、成人の糖尿病の有病率は10.9%、前糖尿病の有病率は35.7%と推定され（非特許文献６）、糖尿病患者の死亡リスクは非糖尿病者よりも2倍高いことが報告されている（非特許文献７）。また1983年から2011年の米国の調査では、虚血性心疾患の罹患者が約20%も低下したが、糖尿病の罹患者は増加している（非特許文献８）。またメキシコでは約4人に1人が糖尿病と診断されている（非特許文献９）。
２型糖尿病は合併症の発症率が高く、例えば、20歳までに糖尿病と診断された2018人の約8年間の追跡調査では、合併症有病率は1型糖尿病患者では32%、2型糖尿病患者では72%であった（非特許文献10）。
以上、肥満/過体重の罹患者の増大、それに伴う２型糖尿病の有病率の増加は、世界的な対策が必要な緊急課題である。
しかし、肥満/過体重の罹患者が、減量し、かつ減量した体重を維持することは容易ではない。また1988-2014年の米国での調査では「痩せようとする肥満/過体重の成人」の割合が低下していることも報告されている（非特許文献11）。
現行では２型糖尿病の治療は十分な効果を発揮しているとは言えず、患者の治療満足度も低い。2017年2月の米国の報告では、肥満手術を受けた糖尿病患者（胃バイパス群）の5年時点での糖化ヘモグロビン（HbA1c）6%以下の割合は29%であったが、内科治療のみの群ではわずか5%であり（非特許文献12）、糖尿病患者の血糖制御は肥満手術が内科治療を凌駕する。しかし、肥満手術は侵襲を伴う処置であり、現行治療薬を凌駕する優れた２型糖尿病治療薬の開発が望まれている。
また2016年に報告されたプロスペクティブ観察試験のメタ解析によると、心血管疾患リスクはHbA1c 5.7%から上昇することが示されており（非特許文献13）、２型糖尿病における合併症発症の完全阻止を目指す観点からは、現行の内科治療では95%の症例で不十分な対策しか講じられていないことを意味する。
現状では、合併症の早期診断と治療に高額な研究費と医療費が投じられているが、何よりも優先して行うべきは、HbA1c 5.7%以下の血糖制御を可能とする優れた治療薬を開発することである。
実際、2017年1月30日に、糖尿病治療薬の世界第１位の販売実績を誇る製薬企業が、英国のオックスフォード大学と提携して2型糖尿病の新しい治療法の発見を目指すことを発表した。同社は同大学敷地内に新しい研究センターを設立し、今後10年間に1億1500万ポンドを投じることも発表している。これは、現行の２型糖尿病の内科治療の不十分さを如実に物語る一例である。
WO 2012/147853
The GBD 2015 Obesity Collaborators、New England Journal of Medicine誌、第377巻、第13-27頁、2017年 Yuら、Annals of Internal Medicine誌、第166巻、第613-620頁、2017年 Farrar ら、BMJ 第354巻、i4694、2016年 Villamorら、JAMA誌、第317巻、第925-936頁、2017年 Perssonら、BMJ誌、第357巻、第j2563頁、2017年 Wang ら、JAMA 第317巻、第2515-2523頁、2017年 Bragg ら、JAMA 第317巻、第280-289頁、2017年 Navar ら、JAMA 第316巻、第2041-2043頁、2016年 Alegre-Diazら、New England Journal of Medicine 第375巻、第1961-1971頁、2016年 Dabelea ら、JAMA 第317巻、第825-835頁、2017年 Snookら、JAMA誌、第317巻、第971-973頁、2017年 Schauer ら、New England Journal of Medicine 第376巻、第641-651頁、2017年 Huang ら、BMJ 第355巻、i5953、2016年 van Marken Lichtenbelt ら、New England Journal of Medicine誌、第360巻、第1500-1508頁、2009年 Cypess ら、New England Journal of Medicine誌、第360巻、第1509-1517頁、2009年 Virtanenら、New England Journal of Medicine誌、第360巻、第1518-1525頁、2009年 Saitoら、Diabetes誌、第58巻、第1526-1531頁、2009年 Kobayashiら、Medical Research Archive誌、第４巻、2016年 Nishioら、Cell Metabolism誌、第16巻、第394-406頁、2012年 Nishioら、Methods in Enzymology誌、第537巻、第177-197頁、2014年 Yoneshiro ら、Obesity 第19巻、第1755-1760頁、2011年
本発明は、褐色脂肪細胞の培養上清（以下、BA-SUP）中に存在する「インスリン分泌促進性短鎖ペプチド」を提供することを課題とする。また本発明は、当該ペプチドのアミノ配列に関する情報を得るための手段を提供することを課題とする。
本発明は、また、このペプチドの有機化学合成品を提供することを課題とする。また本発明は、当該合成品がより高いインスリン分泌促進効果を発揮する「活性型構造異性体」に変換する物理化学的処理方法、および当該方法に関する情報を提供することを課題とする。
本発明は、また、インスリン分泌促進活性を安定に発揮する「活性型変異体ペプチド」を提供することを課題とする。
本発明は、また、糖尿病、具体的には例えば、既存のインスリン分泌促進薬では血糖制御が不良である２型糖尿病患者等への治療的使用を可能とするペプチド製剤を提供することを課題とする。
上述のとおり、２型糖尿病において厳格な血糖制御（HbA1c≦5.7%）を可能とする新規治療薬の開発は重要かつ緊急性の高い創薬事業である。しかし、従来の２型糖尿病の病態把握に立脚し、新規性のない戦略で創薬研究を繰り返しても、上記目標を達成する新薬は開発されない。安全性と有効性がともに高い優れた治療薬の開発には、２型糖尿病の病態理解そのものを根本から見直す必要がある。この観点から注目すべきは「褐色脂肪細胞（Brown adipose tissue: BAT）」である。
褐色脂肪細胞は、寒冷環境など体熱産生の需要が亢進した際に、細胞内に蓄えられた中性脂肪を燃焼して熱産生を行う。げっ歯類での研究が先行していたが、2009年にヒト成人にも褐色脂肪細胞があることが報告された（非特許文献14-17）。
遺伝子改変マウスを用いた研究から、褐色脂肪細胞には「肥満防止」「糖代謝改善」「脂質代謝改善」「レプチン感受性亢進」の作用があることが実証されている。またヒトのがん検診や人間ドックのデータを用いた疫学研究、健常人ボランティアが参加した研究から「中年太りの防止」と「糖代謝改善」への寄与が示されている。
当初、褐色脂肪細胞による糖代謝改善は、脂肪燃焼に伴う二次的効果と考えられたが、褐色脂肪細胞欠如マウスが高度肥満と糖尿病を呈したのに対して、褐色脂肪細胞の熱産生能だけを欠損させたマウスは肥満も糖代謝障害も呈さなかったことから、褐色脂肪細胞による糖代謝改善は「可溶性因子（ホルモン）を介した作用」であることが示唆された。以後、「褐色脂肪細胞が特異的に産生する糖代謝改善性ホルモン」の発見に向けて世界的に研究が推進されたが、現在に至るまでそのような因子は同定されていない。理由は２つ挙げられる。
１つは、遺伝子クローニング技術によりホルモン探索が行われたことである。この技術は、遺伝子発現と遺伝子がコードする蛋白の発現が１対１相関する場合は有効であるが、内分泌細胞が産生するペプチドホルモンの多くは、前駆体蛋白のプロセシング（特定のアミノ酸部位を特定のペプチダーゼで切断して前駆体から切り出す工程）により産生される短鎖ペプチド（アミノ酸３個から20個程度）である。このため、遺伝子クローニング技術の有効性が乏しい。
もう１つの理由は、マウス生体から褐色脂肪組織（brown adipose tissue: BAT）を採取し、ここから分離・回収した褐色脂肪細胞を材料としたことである。BATは膵外分泌腺細胞が産生する消化酵素である、キモトリプシン系蛋白分解酵素群、トリプシン系蛋白分解酵素群、核酸分解酵素RNase1、といった強力な分解酵素群を高発現するため、マウス体内からBATを取り出した瞬間から褐色脂肪細胞の品質は急速に劣化を始める。このため、BATが産生するホルモン群を非損傷状態で取得することは極めて困難となる（非特許文献18）。
一方、ヒト生体からBATを取得して研究に用いることは倫理的観点から不可能である。また、マウスBATであれ、ヒトBATであれ、そこから回収した褐色脂肪細胞の培養・凍結保存のための技術は存在しない。
以上、「褐色脂肪細胞が特異的に産生する糖代謝改善性ホルモン」の発見には、蛋白分解酵素群の攻撃を受けることなく「高品質な褐色脂肪細胞」を調製可能とする方策の確立が前提となる。かつ、材料となる「高品質な褐色脂肪細胞」は、熱産生能とは独立に糖代謝改善作用を発揮すること、安定かつ随時に調製可能であること、培養上清に糖代謝改善作用が認められること、が必要である。例えば、「ヒト多能性幹細胞からの褐色脂肪細胞の作製技術」を適用すれば、汎用の細胞培養技術のみで、高品質な褐色脂肪細胞の培養上清の安定調製が可能である。
本発明者らは、以前、「ヒト多能性幹細胞の褐色脂肪細胞分化誘導技術」を開発している（特許文献１、非特許文献19, 20）。本発明者らが、このヒト多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞から調製したBA-SUPをマウスに投与する実験を行ったところ、16時間後に測定した空腹時血糖値が低下することが判明した。この結果からは、BA-SUP中にインスリン分泌促進作用を持つ因子が存在することが示唆される。かつ、インスリンやGLP-1などの血糖降下作用を持つ既知のホルモンの血中半減期は３時間程度であることを鑑みると、投与16時間後にも生理効果が発揮されているBA-SUP中の因子は「新規な糖代謝改善ホルモン」であると考えられた。
また、本発明者らは、BA-SUPを膵ベータ細胞株に添加すると、培養液のブドウ糖濃度に関係なく、すなわち、高ブドウ糖液(16.8 mM; 302 mg/dL)でも低ブドウ糖液（2.8 mM; 50 mg/dL）でも、インスリン分泌量が上昇することを見出した。このことは、BA-SUP中に膵ベータ細胞のインスリンの「基礎分泌」を促進する因子が存在することを意味しており、既存のインスリン分泌促進性ホルモン（インクレチン）が高血糖環境でのみインスリン分泌を促進することとは対照的である。
またBA-SUP中のインスリン分泌促進活性因子は、ペプチド分解酵素であるトリプシンでの処理で失活すること、ゲル濾過カラム（Superdex 75 5/150GL; GE社）を用いたHPLCにおいて約800 Daの分子量画分に検出されたことから、当該因子は「アミノ酸が10個以下の、ジペプチド，トリペプチドより大きい短鎖ペプチド」であることが判明した。このような特徴を持つ分子は既知の糖代謝改善ホルモンには存在しないことから、BA-SUP中に「新規なインスリン分泌促進ペプチド」が存在することが明らかとなった。
そこで、HPLCを適用して当該因子の純化を試みたが、以下に示すように、一般のペプチドにおいては想定が困難であった「特異な性質」を持つことが判明し、汎用のペプチド精製プロトコルが適用できないことが判明した。
ペプチド精製で汎用される逆相クロマトグラフィ（疎水カラムを用いたHPLC）を適用して当該因子の純化を試みたが、どのような種類の疎水カラムを用いても、またどのような移動相を用いても、調べた限りのすべての条件において、当該因子は大量の夾雑物とともにフロースルー（非結合分画）に回収された。
以上、逆相クロマトグラフィで当該因子を純化することは不可能と結論された。
前項の結果は同時に、試料の脱塩処理工程で汎用される、疎水性レジンが充填されたZipTip(Merck KGaA社、ドイツ)が、当該因子の純化を目的としたBA-SUPの脱塩濃縮に使用できないことも意味する。
イオン交換カラムを用いた順相クロマトグラフィにより当該因子の純化を試みたが、「強陽イオン交換カラム」「強陰イオン交換カラム」を用いた分画化作業では当該因子は失活し、「弱陽イオン交換カラム」「弱陰イオン交換カラム」を用いた分画化作業では、当該因子は大量の夾雑物とともにフロースルーに回収された。
以上、イオン交換カラムを用いた順相クロマトグラフィでも、当該因子を純化することは不可能と結論された。
以上より、当該因子の純化には「ゲル濾過カラム」を用いたHPLCのみが有効であると結論された。ゲル濾過カラムとは、分子篩の原理により分子量を目安とした順序で分子集団を稀釈溶出するものであり、疎水カラムやイオン交換カラムよりも分離能は低い。しかし、カラムに充填されるマトリックスは、Superdex 75 5/150GL(GE社）で使用されるアガロース/デキストラン系のもの以外にも化学合成ポリマーなどがあり、複数種のゲル濾過カラムを用いることで目的分子の純度を高めることは可能であると考えた。
また、当該因子はトリプシン処理で失活することから、ゲル濾過カラムでのHPLCの活性画分を質量分析する際に、トリプシン処理の前後で分析を行い、「トリプシン処理で消失するピーク（目的分子に該当するピーク）」「トリプシン処理で出現するピーク（目的分子のトリプシン処理断片に該当するピーク）」を同定することで、目的分子に由来するピークを夾雑物由来ピーク群から区別することを考えた。
また、上記のように、当該因子は疎水カラムに全く結合しないことから、親水性アミノ酸のみで構成されることが強く示唆された。
以上、BA-SUP中の「新規なインスリン分泌促進ペプチド」の純化には、一般的なペプチド精製プロトコルは有効ではないが、上記のように、イオン交換カラムでは純化が困難であるもののゲル濾過により純化しうること、また、トリプシン処理で失活することなどの事項に留意することで、本発明者らは目的ペプチドのアミノ酸配列の候補を得るべく、鋭意研究を行った。
また、前項で得られたアミノ酸配列の候補について、ヒト遺伝子/蛋白データベースを検索することで、ヒトゲノムにコードされる遺伝子産物に由来する可能性のあるものを選定した。選定された候補ペプチドが目的とするペプチドであるか否かは、そのアミノ酸配列を持つペプチドを有機化学的に合成してインスリン分泌促進活性を評価することで判断した。
夾雑物を大量に含有するBA-SUPから目的分子をHPLCで純化する際には、BA-SUPを「脱塩濃縮」する工程が必要となる。「脱塩」は、上述のとおりイオン交換カラムで実施するのは困難であることから、ゲル濾過担体を充填したカラム、例えば、PD-10カラム（GEヘルスケア社製）が有効である。PD-10カラムとは、デキストラン系ゲル濾過担体が充填されたディスポーザブルカラムであり、分子量の違いを利用して目的物質と塩類を分離する。「濃縮」に関しては、ペプチド濃縮に効力を発揮する汎用の凍結乾燥が有効である。
参考例１に記載した方法を用いて作製したヒトES細胞由来褐色脂肪細胞を、参考例２に記載の「塩類と低濃度のブドウ糖を含有するバッファー（KRTBバッファー）」で16時間培養してBA-SUPを調製し、PD-10カラムと凍結乾燥機で脱塩濃縮して後にKRTBバッファーに溶解し、Superdex 75 5/150GL（移動相：KRTBバッファー）を用いたHPLCで分画し、参考例２に記載の方法でインスリン分泌促進活性を測定し、最も活性が高い分画を回収し、脱塩濃縮後に0.05%アセトニトリル/0.1%酢酸に溶解し、GS-320 HQカラム(Shodex社）を用いたHPLCで分画し（移動相：0.05%アセトニトリル/0.1%酢酸）、これらを脱塩濃縮後にKRTBバッファーに溶解してインスリン分泌促進活性を測定したところ、最も活性が高い分画におけるペプチドに由来する260 nmの紫外線吸光度は検出限界以下となり、BA-SUP中に存在する夾雑物はほぼ除去された。
前項の分画の脱塩濃縮品の質量分析を行った（LC-TOF/MS、正イオンモードESI法）。なお、事前に２つ（A, B）に分け、Aはそのまま、Bはトリプシン処理後に質量分析を行い、１）Aで検出されるが、Bで検出されないピーク（a1,a2,a3, …）、２）Aで検出されないが、Bで検出されるピーク(b1, b2, b3, …)、を抽出し、これらに関して、an=bm+bl+19（線状）、またはan=bm+bl+37（環状）となる組み合わせ（an, bm, bl）を選出したところ、前者に適合するものは存在しなかったが、後者に適合するものが１組だけ得られた。そこで、ヒトゲノムデータベースを照合して、anを構成可能するアミノ酸配列がヒト遺伝子にコードされた蛋白に由来するペプチド断片であるという仮定のもとに抽出した。また、上述のとおり目的のペプチドは親水性アミノ酸で構成されることが示唆されることから、anを構成する全てのアミノ酸は親水性アミノ酸であるという条件も付加した。
結果、BA-SUP中に存在するインスリン分泌促進ペプチドの候補として「スレオニン-リジン-グルタミン酸-アスパラギン酸-グリシン-アルギニン-グルタミン（TKEDGRQ）」（配列番号1）のアミノ末端（N末端）とカルボキシル末端（C末端）がペプチド結合した「ラクタム環状ペプチド」が得られた。以下、これをcirc-TKEDGRQと記載する。
化学熱力学的観点からは、短鎖ペプチドは水溶液中で複数の「構造異性体」を形成し、それらが熱力学的な動的または静的な平衡状態にあることが想定される。しかし、目的とする生理活性を示す構造異性体はそれらの中の特定のものであると考えられる。このため、有機化学合成ペプチド品を用いた活性評価試験では、有機化学合成ペプチドが水溶液中で高確率かつ安定的に「活性型構造異性体」を形成しない場合、生理活性は検出されないことが想定される。
すなわち、有機化学合成品circ-TKEDGRQ水溶液を用いてインスリン分泌促進活性を評価しても、高い再現性を持って生理活性を検出することが困難となることも予想される。その場合、何らかの方法で「活性型構造異性体」の高次構造の特徴に関する情報を取得し、有機化学合成品circ-TKEDGRQを「活性型構造異性体」に変換するための処理技術を開発する、または活性型構造異性体の高次構造を模倣する「活性型変異体ペプチド」を作製する、ことが有効である。
「活性型構造異性体」の高次構造の特徴に関する情報を取得するには、短鎖ペプチドに様々な物理化学的処理を行い、短鎖ペプチドが形成する高次構造（αヘリックス、Piヘリックス、310ヘリックス、27リボン、ランダムコイル、βシートなど）のどれがインスリン分泌促進活性と相関するか、を示唆するデータを得ることが有用である。そして、得られた情報をもとに「活性型構造異性体」の高次構造を模倣する変異体ペプチドを作製することが「インスリン分泌促進性ペプチド」を取得する鍵となる。
なお、従来の変異体解析が特定のアミノ酸に注目して変異体が設計されていた（例：セリンをアラニンまたはグルタミン酸に置換することで、それぞれ非リン酸化型またはリン酸化を模倣させる）のに対して、「構造異性体」に着目した変異体解析では、特定のアミノ酸配列が形成する「高次構造」に着目して、複数のアミノ酸を同時に置換した変異体を設計することが有用である。
以上の知見を基に、本発明は、次の構成を備える。
(A) BA-SUPの分画サンプルの質量分析結果から予想されたインスリン分泌促進活性ペプチドのアミノ酸配列に関する情報
(B) (A)のアミノ酸配列を持つペプチドの有機化学合成品が、インスリン分泌促進作用を発揮するための「活性型構造異性体への変換」を誘導する物理化学的処理に関する情報
(C) (A) のアミノ酸配列を持つペプチドの活性型変異体ペプチド
(C）の「活性型変異体」としては、本明細書の実施例に示すものに留まらず、本明細書にて示す「活性型構造異性体」の高次構造の特徴を再現することが公知の情報から容易に類推可能である変異体を含む。
また本発明は、本発明のペプチドを用いた内科療法を提供する。本発明の、新規インスリン分泌促進ペプチドを用いた内科療法の一例は、従来のインスリン分泌促進剤を用いた内科療法では血糖制御不良の２型糖尿病を対象とした内科療法である。
また本発明の、新規インスリン分泌促進ペプチドを用いた内科療法の更なる一例は、初期（軽症）の２型糖尿病の症例、または未治療の２型糖尿病の症例を対象とした内科療法である。
また本発明の、新規インスリン分泌促進ペプチドを用いた内科療法の更なる一例は、前糖尿病の症例を対象とした内科療法である。
すなわち本発明は、インスリン分泌促進活性を発揮するペプチドおよびその利用等に関し、より具体的には請求項の各項に記載の発明を包含する。なお同一の請求項を引用する請求項に記載の発明の２つまたはそれ以上の任意の組み合わせからなる発明も、本明細書において意図された発明である。すなわち本発明は、以下の発明を包含する。
〔１〕 αへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列を含むペプチドであって、該ペプチドおよび/またはその活性型がインスリン分泌促進活性を持つ、ペプチド。
〔２〕 数個から十数個のアミノ酸からなる、〔１〕に記載のペプチド。
〔３〕 水酸基を持つアミノ酸および/または親水性アミノ酸に続き、該へリックスを形成しうる５残基以上のアミノ酸配列を含む、〔１〕または〔２〕に記載のペプチド。
〔４〕 該αヘリックス構造を形成する５残基以上のアミノ酸配列が、αヘリックス形成性アミノ酸で構成される、〔３〕に記載のペプチド。
〔５〕 該αヘリックス形成性アミノ酸が、メチオニン、アラニン、ロイシン、グルタミン酸、リジンからなる群より選択される、〔４〕に記載のペプチド。
〔６〕 該αヘリックス構造を形成する５残基以上のアミノ酸配列が５つのアラニン（AAAAA／配列番号3）を含む、〔５〕に記載のペプチド。
〔７〕 水酸基を持つアミノ酸および/または親水性アミノ酸が、スレオニン、セリン、チロシンから選択されるアミノ酸である、〔３〕から〔６〕のいずれかに記載のペプチド。
〔８〕 水酸基を持つアミノ酸および/または親水性アミノ酸が、スレオニンまたはセリンである、〔３〕から〔６〕のいずれかに記載のペプチド。
〔９〕 該αヘリックス構造を形成する５残基以上のアミノ酸配列に続き、親水性の中性アミノ酸を含む、〔３〕から〔８〕のいずれかに記載のペプチド。
〔１０〕 該親水性の中性アミノ酸がグルタミンである、〔９〕に記載のペプチド。
〔１１〕 スレオニン-アラニン-アラニン-アラニン-アラニン-アラニン-グルタミン（TAAAAAQ／配列番号4）、セリン-アラニン-アラニン-アラニン-アラニン-アラニン-グルタミン（SAAAAAQ／配列番号12）、またはスレオニン-アラニン-アラニン-アラニン-アラニン-アラニン-グルタミン-グリシン-グリシン（TAAAAAQGG／配列番号11）のアミノ酸配列を含むペプチドであって、該ペプチドおよび/またはその活性型がインスリン分泌促進活性を持つ、ペプチド。
〔１２〕 スレオニン-リジン-グルタミン酸-アスパラギン酸-グリシン-アルギニン-グルタミン（TKEDGRQ／配列番号1）のアミノ酸配列を含むペプチドであって、該ペプチドおよび/またはその活性型がインスリン分泌促進活性を持つ、ペプチド。
〔１３〕 スレオニン-リジン-グルタミン酸-アスパラギン酸-グリシン-アルギニン-グルタミン (TKEDGRQ／配列番号1)のアミノ末端とカルボキシル末端のアミノ酸がペプチド結合によりラクタム環を形成した環状ペプチドである、〔１２〕に記載のペプチド。
〔１４〕 活性型が、酸性条件下で加熱後冷却する工程、および/または緩衝液に溶解後に凍結乾燥する工程で処理されたペプチドである、〔１〕から〔１３〕のいずれかに記載のペプチド。
〔１５〕 他の化合物が分離可能に連結されている、〔１〕から〔１４〕のいずれかに記載のペプチド。
〔１６〕 〔１〕から〔１５〕のいずれかに記載のペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
〔１７〕 医薬組成物である、〔１６〕に記載の組成物。
〔１８〕 インスリン分泌促進および/または糖代謝促進のために用いられる、〔１６〕または〔１７〕に記載の組成物。
〔１９〕 糖尿病または前糖尿病の治療または予防のために用いられる、〔１６〕から〔１８〕のいずれかに記載の組成物。
〔２０〕 〔１〕から〔１５〕のいずれかに記載のペプチドを投与する工程を含む、糖尿病または前糖尿病の療法または予防方法。
なお、本明細書に記載した任意の技術的事項およびその任意の組み合わせは、本明細書において意図されている。また、それらの発明において、本明細書に記載の任意の事項またはその任意の組み合わせを除外した発明も、本明細書において意図されている。また本発明に関して、明細書中に記載されたある特定の態様は、それを開示するのみならず、その態様を含むより上位の本明細書に開示された発明から、その態様を除外した発明も開示するものである。
本発明により、未同定のインスリン分泌機構の発見を含めた、膵β細胞の基礎研究のための材料を提供することができる。
本発明により、未同定の血糖制御機構の発見を含めた、糖代謝制御に関する動物を用いた研究のための材料を提供することができる。
本発明により、糖尿病および前糖尿病の症例、例えば、未治療の２型糖尿病の症例、初期（軽症）の２型糖尿病の症例、従来のインスリン分泌促進剤を用いた内科療法で血糖制御不良の２型糖尿病の症例、および１型糖尿病（特に緩徐進行型１型糖尿病）の症例に対して、有効な内科療法を提供することができる。
「circ-TKEDGRQ (配列番号1) のインスリン分泌促進作用：熱酸処理の効果」を示す図である。 「circ-TKEDGRQ (配列番号1) のインスリン分泌促進作用：凍結乾燥処置時の溶媒の影響」を示す図である。 「線状ペプチドの効果（凍結乾燥処理あり）」を示す図である。TKEDGRQ (配列番号1) のペプチドを用いた結果を示す。 「線状欠損変異ペプチドの効果（凍結乾燥処理あり）」を示す図である。KEDGRQ (配列番号1のアミノ酸2-7番目)、TKEDGR (配列番号1のアミノ酸1-6番目)、TKEDG (配列番号1のアミノ酸1-5番目)、TKEDGRQ (配列番号1) のペプチドを用いた結果を示す。 「アミノ酸配列 TKEDGRQ (配列番号1) の高次構造予測」を示す図である。 「アラニンストレッチの効果(１)：凍結乾燥処理なし」を示す図である。アラニンストレッチ（AAAAA／配列番号3）を含むTAAAAAQ (配列番号4) のペプチドを用いた結果を示す。 「アラニンストレッチの効果(２)：凍結乾燥処理あり」を示す図である。TAAAAAQ (配列番号4) のペプチドを用いた結果を示す。 「アラニンストレッチの効果(３)：凍結乾燥処理なし」を示す図である。TAAAAAQ (配列番号4)、AAAAAAA (配列番号5)、TKEDGRQ (配列番号1) のペプチドを用いた結果を示す。 「アラニンストレッチの効果(４)：凍結乾燥処理あり」を示す図である。TAAAAAQ (配列番号4)、AAAAAAA (配列番号5)、TKEDGRQ (配列番号1) のペプチドを用いた結果を示す。 「TAAAAAQ (配列番号4) のN末端ビオチン化の影響」を示す図である。比較対象としてTKEDGRQ (配列番号1) を用いた結果も示す。 「MAAAAAQ (配列番号7) の効果：凍結乾燥なし」を示す図である。比較対象としてTAAAAAQ (配列番号4) を用いた結果も示す。 「TAAAAAA (配列番号10) の効果：凍結乾燥処理なし」を示す図である。 「TAAAAAA (配列番号10) の効果：凍結乾燥処理あり」を示す図である。比較対象としてTAAAAAQ (配列番号4) および TKEDGRQ (配列番号1) を用いた結果も示す。 「TAAAAAQGG (配列番号11) の効果：凍結乾燥処理なし」を示す図である。比較対象としてTAAAAAQ (配列番号4) および AAAAAAA (配列番号5) を用いた結果も示す。 「SAAAAAQ (配列番号12) の効果：(1)凍結乾燥処理なし、(2)凍結乾燥処理あり」を示す図である。比較対象としてTAAAAAQ (配列番号4) および TAAAAAQGG (配列番号11) を用いた結果も示す。 「YAAAAAQ (配列番号13) , DAAAAAQ (配列番号14) , KAAAAAQ (配列番号15) , TAAAAAE (配列番号16) の効果：凍結乾燥処理なし」を示す図である。比較対象として TAAAAAQGG (配列番号11) を用いた結果も示す。 「YAAAAAQ (配列番号13) , DAAAAAQ (配列番号14) , KAAAAAQ (配列番号15) , TAAAAAE (配列番号16) の効果：凍結乾燥処理あり」を示す図である。比較対象として TAAAAAQGG (配列番号11) を用いた結果も示す。 「食餌誘発性肥満マウスへのTAAAAAQ (配列番号4) 投与による血糖値低下」を示す図である。比較対象として KEDGRQ (配列番号1のアミノ酸2-7番目) を用いた結果も示す。 「ob/obマウスへのTAAAAAQ (配列番号4) 投与による血糖値低下とインスリン分泌促進」を示す図である。比較対象として TKEDGRQ (配列番号1) を用いた結果も示す。
本発明は、αへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列を持つペプチドであって、該ペプチドおよび/またはその活性型がインスリン分泌促進活性を持つペプチドおよびその利用に関する。本発明において、αへリックス様のヘリックスを形成しうる短鎖ペプチドは、膵β細胞に作用してインスリンの分泌を促進させる作用を有することが判明した。また当該ペプチドは、高血糖状態のマウスに投与することにより血糖値を低下させる作用を発揮する。よって本発明のペプチドは、インスリン分泌の促進、血糖値の低下、および/または糖代謝促進等に有用である。
本発明においてαヘリックス構造とは、αヘリックスまたはそれと類似したヘリックス）（αへリックス様のヘリックス）の構造をいう。例えば本発明においてαヘリックス構造は、4残基離れたアミノ酸（すなわち3残基を挟んで位置する2つのアミノ酸）が相互作用することで形成されるヘリックス構造であってよい。本発明においてαヘリックス構造には、図5の上に示した典型的なαヘリックス、および図5の下に示したヘリックスが包含される。本発明においてαヘリックス構造には、例えばアミノ酸3.6残基程度、例えばアミノ酸3.2～4.0残基、3.3～3.9残基、3.4～3.8残基、または3.5～3.7残基、例えば平均約3.5残基または約3.6残基で一回転するらせん構造または環状構造が包含される。例えば7残基で約2回転、例えば1.5～2.5回転、好ましくは1.6～2.4回転、1.7～2.3回転、1.8～2.2回転、または1.9～2.1回転するらせん構造は、本発明においてαヘリックス構造に包含される。
ペプチドのインスリン分泌促進活性は、膵β細胞などのインスリン産生能を有する細胞にペプチドを投与することにより決定することができる。インスリン産生能を有する細胞は適宜選択してよいが、例えば膵ベータ細胞株であるMIN6細胞（Miyazakiら、Endocrinology 127: 126-132, 1990）やラット膵島等を用いることができる。当該細胞を培養し、ペプチドを添加して培養上清中のインスリン濃度を測定する。インスリン濃度が有意に上昇すれば、当該ペプチドはインスリン分泌促進活性を持つと判断される。
例えば本発明のペプチドとしては、BA-SUPの活性分画の質量分析から同定されたインスリン分泌促進活性ペプチドが挙げられる。本発明による「BA-SUPの活性分画の質量分析から同定されたインスリン分泌促進活性ペプチド」のアミノ酸配列とは、スレオニン-リジン-グルタミン酸-アスパラギン酸-グリシン-アルギニン-グルタミン（TKEDGRQ／配列番号1）の線状ペプチドがアミノ末端（N末端）とカルボキシル末端（C末端）がペプチド結合したラクタム環状ペプチド（以下、circ-TKEDGRQと記載）である。したがって、TKEDGRQ（配列番号1）のアミノ酸配列を含む環状ペプチドは、本発明のペプチドとして好適である。
また、上記のラクタム環状ペプチド「circ-TKEDGRQ」は、物理化学的処理に供することでインスリン分泌促進作用を強く発揮する「活性型構造異性体」に変換することができる。インスリン分泌促進作用を発揮する「活性型構造異性体」に変換する物理化学的処理とは、例えば、10 mM程度、pH7.6程度のHEPES緩衝液に溶解後に凍結乾燥させる工程が好適である。
また、上記のラクタム環状ペプチドが強いインスリン分泌促進作用を発揮する「活性型構造異性体」へ変換するための物理化学的処理としては、例えば、0.1%程度のギ酸、140 mM程度の塩化ナトリウム含む溶液にペプチドを溶解し、60℃程度で１時間程度加熱した後に室温程度に徐々に冷却させる工程も好適である。
また本発明は、上記のラクタム環状ペプチドが、安定にインスリン分泌促進作用を発揮するようアミノ酸置換を施された「活性型変異体ペプチド」にも関する。当該ペプチドは、上記の凍結乾燥工程および/または熱酸処理工程により形成されることが類推される３次元構造を形成し得るペプチドであり、環状ペプチドであっても、線状ペプチドであってもよい。
以下に本発明のポリペプチドについてより詳細に記載する。
本発明においてペプチドとは短鎖のポリペプチドをいい、その長さは特に制限されるものではないが、典型的には数個から十数個である。本発明においてペプチドは、オリゴペプチドまたはオリゴマーなどと呼ばれるようなものも包含される。また本発明においてペプチドには、線状、環状、分岐を有するものなどが包含される。
本発明において数個とは、2や3よりも多い数、例えば5～15個程度であってよく、好ましくは5～12個、5～11個、5～10個、5～9個、5～8個、5～7個、6～12個、6～11個、6～10個、6～9個、または6～8個であり、より好ましくは6～10個、7～10個、または7～9個である。また本発明において十数個とは、例えば11～19個程度であってよく、好ましくは12～18個、12～17個、12～16個、12～15個、12～14個、または12～13個であってよい。本発明のペプチドの長さは、以下に制限されるものではないが例えば5～19アミノ酸であり、好ましくは5～17アミノ酸、5～16アミノ酸、6～15アミノ酸、6～12アミノ酸、6～11アミノ酸、6～11アミノ酸、6～10アミノ酸、7～10アミノ酸、またはアミノ酸十個程度であり、より好ましくは9個以下、例えば6～9アミノ酸であり、より好ましくは7～9アミノ酸、例えば7アミノ酸、8アミノ酸、または9アミノ酸である。ヘプタペプチド、および当該ヘプタペプチドに1個または2個程度のアミノ酸を付加したペプチドは、本発明のペプチドとして特に好適である。アミノ酸は、例えばC末端に付加することができる。
本発明のペプチドに含まれるαへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列は、適宜選択することができる。当該アミノ酸配列には、αヘリックス構造を形成しやすいアミノ酸（これをαヘリックス形成性アミノ酸という）が含まれることが好ましいが、それ以外のアミノ酸が含まれていてもよい。αヘリックス構造を形成しにくいアミノ酸（例えばプロリン、グリシン、チロシン、セリン）は、本発明のペプチド自体には含まれていてもよいが、αへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列中には含まれないことが好ましい。αヘリックス形成性アミノ酸としては、メチオニン、アラニン、ロイシン、グルタミン酸、リジンなどが挙げられる。本発明においてαへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列中のアミノ酸は、αヘリックス形成性アミノ酸が例えば50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上を占めていてよい。より好ましくは、αへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列は、αヘリックス形成性アミノ酸のみで構成される。
αへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列の長さは適宜選択してよいが、例えば4アミノ酸以上、好ましくは5アミノ酸以上、より好ましくは6アミノ酸以上、より好ましくは7アミノ酸以上である。例えば、5、6、7、または8アミノ酸からなるαへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列を好適に用いることができる。例えば5アミノ酸からなるαへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列を含むペプチドは、本発明のペプチドとして好適である。
また本発明において当該アミノ酸配列により形成されるαヘリックス構造は、回転半径が比較的小さいことが好ましい。回転半径を小さくするためには、側鎖の小さなアミノ酸を選択することができる。例えば、αへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列を構成するアミノ酸の側鎖の平均分子量は、天然のアミノ酸20種の側鎖の平均的な分子量よりも小さいことが好ましく、例えば天然のアミノ酸20種の側鎖の平均的な分子量に比べ、80％以下、70％以下、60％以下、または50％以下であることが好ましい。より具体的には、αへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列を構成するアミノ酸の側鎖の分子量は、例えば74以下のものが過半（例えば50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは80％以上）を占めることが好ましく、例えば側鎖の分子量が73以下、72以下、70以下、68以下、65以下、62以下、60以下、40以下、30以下、または20以下のアミノ酸が、αへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列を構成するアミノ酸過半（例えば50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは80％以上）を占めることが好ましい。例えば5アミノ酸からなるαへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列を含む本発明のペプチドは、側鎖の分子量が74以下、73以下、72以下、70以下、68以下、65以下、62以下、60以下、40以下、30以下、または20以下のアミノ酸が、5アミノ酸中3個以上、4個以上、または5個含まれるものであってよい。
また本発明のペプチドにおいては、例えばαヘリックス構造を形成するアミノ酸配列中にアラニンを含むことが好ましい。アラニンの割合は適宜選択してよいが、例えば30％以上、好ましくは40％以上、50％以上、60％以上、より好ましくは80％以上、または100％である。例えば5アミノ酸からなるαへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列を含む本発明のペプチドは、5アミノ酸中、アラニンを3個以上、4個以上、または5個含んでいてよい。好ましくは本発明のペプチドは、αヘリックス構造を形成するアミノ酸配列として、連続する3残基またはそれ以上のアラニン、より好ましくは連続する4残基またはそれ以上のアラニンを含む。5つの連続するアラニン（AAAAA／配列番号3）は、αへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列として好適である。
また本発明のペプチドは、αへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列のN末端側に、水酸基を持つアミノ酸および/または親水性アミノ酸が連結されていることが好ましい。すなわち本発明のペプチドは、水酸基を持つアミノ酸および/または親水性アミノ酸に続き、αへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列を含むペプチドが好適である。当該水酸基を持つアミノ酸および/または親水性アミノ酸は、ペプチドのN末端のアミノ酸であることが好ましい。
当該水酸基を持つアミノ酸および/または親水性アミノ酸として好ましいものとしてはスレオニン、セリン、およびチロシン等が挙げられるが、それに限定されるものではない。また当該アミノ酸は、親水性の中性アミノ酸（例えばスレオニン、セリン、アスパラギン、グルタミン）であってもよい。特に好ましいアミノ酸は、水酸基を持つ親水性アミノ酸であり、例えばスレオニンまたはセリンである。
また本発明のペプチドは、αへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列のC末端側に、親水性アミノ酸が連結されているものが好ましい。すなわち本発明のペプチドは、αへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列に続き、親水性アミノ酸を含むペプチドが好適である。当該アミノ酸は適宜選択してよいが、好ましくは親水性の中性アミノ酸、例えばスレオニン、セリン、グルタミン、アスパラギンなどが挙げられ、より好ましいアミノ酸としてはグルタミンが挙げられる。
すなわち本発明のペプチドは、N末端に水酸基を持つアミノ酸および/または親水性アミノ酸があり、それに続いてαへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列が連結され、それに続いて親水性の中性アミノ酸が連結された配列を含むペプチドが好ましい。より具体的には、N末端にスレオニン、セリン、およびチロシンなどの水酸基を持つアミノ酸および/または親水性アミノ酸があり、それに続いて、例えばアラニンを3個以上、4個以上、または5個含むαへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列が連結され、それに続いてグルタミンなどの親水性の中性アミノ酸が連結された配列を含むペプチドが、本発明のペプチドとして特に好適である。当該αへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列は、例えば5アミノ酸からなる配列であってよく、好ましい配列としては5つの連続するアラニン（AAAAA／配列番号3）を挙げることができる。
上記のグルタミンなどの親水性の中性アミノ酸は、ペプチドのC末端のアミノ酸であってもよいが、インスリン分泌促進活性を保持する限り、そのC末端側にさらにアミノ酸等を付加してもよい。例えば、活性を維持する限度において、数個のアミノ酸、具体的には、1個、2個、3個、4個、または5個程度のアミノ酸を付加することができる。付加するアミノ酸に特に制限はないが、例えばグリシンを挙げることができ、例えば1個のグリシン（G）、または2個のグリシン（GG）を付加したものも、本発明のペプチドとして好適である。
より具体的に本発明のペプチドを例示すれば、スレオニン-アラニン-アラニン-アラニン-アラニン-アラニン-グルタミン（TAAAAAQ／配列番号4）、セリン-アラニン-アラニン-アラニン-アラニン-アラニン-グルタミン（SAAAAAQ／配列番号12）、およびスレオニン-アラニン-アラニン-アラニン-アラニン-アラニン-グルタミン-グリシン-グリシン（TAAAAAQGG／配列番号11）のアミノ酸配列が挙げられ、さらにはTAAAAAQG（配列番号19）、SAAAAAQG（配列番号20）、およびSAAAAAQGG（配列番号21）などのアミノ酸配列も挙げられる。これらのアミノ酸配列を含むペプチドは、本発明において好適であり、当該アミノ酸配列からなるペプチドは、本発明において特に好適である。
また本発明は、上に具体的に例示したペプチドにおいて1または数個のアミノ酸を置換、欠失、付加、および/または挿入したペプチドであって、該ペプチドおよび/またはその活性型がインスリン分泌促進活性を持つペプチドに関する。改変されるアミノ酸の数は、例えば1～3個、好ましくは1～2個であり、最も好ましくは1個である。
また本発明は、上に具体的に例示したペプチドのアミノ酸を保存的に置換したペプチドであって、該ペプチドおよび/またはその活性型がインスリン分泌促進活性を持つペプチドに関する。このようなアミノ酸の保存的置換は、当業者にはよく知られている。保存的置換に相当するアミノ酸のグループとしては、例えば、塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸 (例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸 (例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸 (例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸 (例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸 (例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などが挙げられる。また、例えばBLOSUM62マトリックス（Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919）の値が２以下、より好ましくは１以下、より好ましくは０のアミノ酸に置換が挙げられる。アミノ酸の置換数は、例えば1～3個、好ましくは1～2個であり、最も好ましくは1個である。
本発明のペプチドには、インスリン分泌促進活性を持つことが知られている既知のペプチドが含まれないことは言うまでもない。本発明のペプチドには、例えばインスリン分泌促進活性を持つことが知られているペプチド、例えばインスリン分泌促進活性を持つことが知られているジペプチドやトリペプチド、具体的には特開2018-123065、特開2016-034930、およびWO2012/109561に記載されているようなジペプチドやトリペプチドは含まれない。また本発明のペプチドには、既知のインレクチン（GLP-1、GIP）、GLP-1アナログ（既知の糖尿病薬）は含まれない。すなわち本発明のペプチドは、インスリン分泌促進活性を持つことが既知のペプチドではないペプチドである。
本発明のペプチドは、天然のペプチドであっても、合成ペプチドであってもよい。また、ペプチドを構成するアミノ酸は、天然のアミノ酸であっても非天然のアミノ酸であってもよい。またペプチドやアミノ酸は修飾されていてもよく、修飾されていなくてもよい。修飾は、天然に修飾されていても、人工的に修飾されていてもよい。修飾には、ペプチドのバックボーン、アミノ酸側鎖、アミノ（N）末端、またはカルボキシル（C）末端などの修飾が含まれる。修飾には、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、環状化、ジスルフィド結合形成、メチル化、脱メチル化、ピログルタミン酸化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨード化、ミリストイル化、酸化、リン酸化、ユビキチン化などが含まれるが、これらに制限されない。また修飾は、フラビン、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、脂質、脂質誘導体、またはホスファチジルイノシトール等の化合物を付加するものであってもよい。
また、本発明のペプチドは、誘導体、修飾体、および類縁体が含まれる。このような誘導体等には、本発明のペプチドの官能基を修飾、付加、変異、置換、または削除などにより改変された形態を持つ分子が含まれる。官能基の改変は、例えば、ポリペプチドに存在する官能基の保護（例えば官能基の保護基による置換）、ペプチドの安定性または組織移行性の制御、あるいはペプチドの活性の制御等を目的として行われうる。例えば、本発明のペプチドには、そのN末端、C末端、およびポリペプチドを構成するアミノ酸の側鎖の官能基のいずれかが保護基等の他の置換基によって修飾されているものが含まれる。置換基としては、例えば各種のアルキル基、アシル基、アミド体、リン酸基、アミノ基、カルボキシル基、エステル基など挙げられるがこれらに制限されない。
また、本発明のペプチドには、ペプチド同士を結合させた二量体、三量体、四量体などの多量体、分枝状分子、環化分子が含まれる。また、ペプチドは担体に結合していてもよい。例えば、本発明のペプチドは、ポリエチレングリコール（PEG）、デキストラン（dextran）、あるいは他のポリマーなどと結合していてもよい。
また本発明のペプチドを構成するアミノ酸は、L体および／またはD体であることができる。D体のアミノ酸の使用は、ペプチダーゼによる分解を低下させるために有用である。また、アミノ酸は上述のとおり天然のアミノ酸に限定されず、非天然のアミノ酸でもよい。また、本発明のペプチドのペプチド結合は、適宜ペプチド結合以外の共有結合に置換することが考えられる。非ペプチド結合への置換により、ペプチダーゼによる感受性を下げ、薬効の持続性を向上させることができる。非ペプチド結合の例としては、イミノ結合、エステル結合、ケトメチレン結合、α-アザ結合、カルバ結合、ヒドロキシエチレン結合、チオアミド結合、オレフィン性二重結合などが挙げられるが、これらに制限されない。
また、本発明のポリペプチドには、その塩も含まれる。このような塩は酸または塩基から誘導される。具体的には、例えば、塩酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの無機酸との塩や、酢酸塩、乳酸塩、ギ酸塩、酪酸塩、グリコール酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩などの有機酸との塩、あるいはアンモニウム塩、ナトリウム塩やカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、有機塩基との塩、およびアルギニンやリジンなどのアミノ酸との塩などが挙げられる。
また本発明は、本発明のペプチドをコードする核酸、および当該核酸を保持するベクターに関する。本発明の核酸およびベクターは、本発明のペプチドを発現および/または産生するために有用である。本発明の核酸はDNAであってもRNAであってもよい。またベクターはプラスミド、ウイルスベクター、非ウイルスベクター（例えばリポソーム）など所望のベクターを使用することができる。ウイルスベクターとしてはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）、およびパラミクソウイルスベクター（センダイウイルスベクターを含む）などが挙げられるがそれらに限定されない。
例えば本発明のペプチドは、そのまま、および/または適当な処理により活性型に変換することによって、有意なインスリン分泌促進活性を示す。ペプチドは、その高次構造の変化により活性が変わりうることから、適当な処理によってペプチドを活性型に変換することによって、インスリン分泌促進活性を付与または上昇させることが可能である。一般に、ペプチドの高次構造を変化させる方法としては、酸処理、アルカリ処理、熱処理、遷移金属添加、それらの組み合わせなどが挙げられ、それらのいずれの処理によって活性化を行ってもよい。酸処理としては、例えば、ギ酸、酢酸、クエン酸、リン酸等の酸性溶媒で処理することが挙げられるが、それらに限定されるものではない。また酸処理におけるpHは適宜選択することができる。アルカリ処理としては、アンモニア液、塩化アンモニム液等のアルカリ性溶媒が挙げられる。添加する金属としては、ナトリウム、亜鉛、リチウム、マンガンなどが挙げられ、適宜、塩化ナトリウム、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、塩化リチウム、塩化マンガンなどの塩として添加することができる。
例えば本発明のペプチドが環状ぺプチドである場合は、酸処理と加熱処理を組み合わせることでインスリン分泌促進活性を付与または上昇させることが可能であることが判明した。特に、酸処理後に塩類を添加して加温する熱酸処理により活性を上昇させることが可能である。
すなわち本発明は、
（１）本発明のペプチドを酸処理する工程、
（２）本発明のペプチドに塩類を添加する工程、および
（３）本発明のペプチドを加熱する工程、
を含む熱酸処理により製造された、インスリン分泌促進活性が付与または上昇したペプチドに関する。また本発明は、上記の工程を含む、インスリン分泌促進活性が付与または上昇したペプチドの製造方法、ならびに、上記の工程を含む、本発明のペプチドにインスリン分泌促進活性を付与または上昇させる方法に関する。
酸処理としては、例えば pH 2.0～6.4程度の酸性溶媒で処理することであってよく、例えばpH 2.5～6.0、pH 2.8～5.5、pH 3.0～5.0、pH 3.0～4.5、pH 3.0～4.0、pH 3.2～3.8、例えば約pH 3.5とすることができる。ここで一般に「約」とは、例えば±10％を意味する。
酸性溶媒としては、上記のpHを達成できる限り特に制限はないが、例えばギ酸、酢酸、クエン酸、リン酸等の酸性溶媒が挙げられ、特に好ましくはギ酸、または酢酸で処理することが挙げられる。
ギ酸または酢酸の濃度は適宜調節してよいが、例えば0.01～1％（v/v）、好ましくは0.02～0.8％（v/v）、0.03～0.5％（v/v）、0.05～0.3％（v/v）、0.08～0.2％（v/v）、例えば約0.1％（v/v）とすることができる。処理時間は適宜調節してよい。
酸処理の後で、ペプチドに塩類が添加される。添加する塩類は適宜選択してよいが、例えばナトリウム塩や亜鉛塩が挙げられ、具体的には塩化ナトリウムや塩化亜鉛が挙げられるが、それに限定されない。
塩類の濃度は適宜調節してよいが、例えばナトリウム塩については、終濃度10 mM～1 M、好ましくは20～800 mM、30～600 mM、50～500 mM、80～300 mM、100～200 mM、110～180 mM、例えば約140 mMとすることができる。また、亜鉛塩については、終濃度1 μM～1 M、好ましくは10 μM ～100 mM、300 μM～30 mM、例えば約10 mMとすることができる。
塩類を添加後、ペプチドを加熱する。加熱温度は適宜選択してよいが、例えば、酸性溶媒として0.1%ギ酸を使用する場合は、37～90℃であり、好ましくは45～80℃、50～75℃、55～70℃、58～65℃、例えば約60℃である。また、0.1%酢酸を使用する場合は、37～90℃であり、好ましくは45～85℃、50～85℃、60～85℃、例えば約80℃である。加熱時間は適宜調節してよい。具体的には、例えば10分～一晩の間で適宜選択することができ、例えば20分～10時間、30分～5時間、40分～3時間、または50分～2時間の範囲で適宜選択することができ、例えば約1時間とすることができる。しかしこれらは例示に過ぎず、当業者であれば、用いる塩類等にあわせて、適宜最適な条件を設定してよい。加熱後は、例えば緩徐に冷却することができる。
また本発明のペプチドは、その形態、例えば環状ぺプチドか線状ペプチドであるかを問わず、凍結乾燥の工程によりインスリン分泌促進活性を付与または上昇させることが可能であることが判明した。特に、緩衝液に溶解後に凍結乾燥する処理により、その活性を上昇させることが可能である。
緩衝液のpHは適宜選択してよいが、例えばpH 6.2～8.2、pH 6.5～8.0、pH 6.7～7.9、pH 6.8～7.9、pH 7.0～7.8、pH 7.2～7.8、pH 7.3～7.8、またはpH 7.5～7.8の範囲で適宜選択することができ、例えば約pH 7.6とすることができる。緩衝剤も適宜選択されるが、例えばHEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid) やTRIS（tris(hydroxymethyl)aminomethane）などが挙げられる。本発明においては、好ましくはHEPESが用いられる。
緩衝溶液中の緩衝剤の濃度も適宜選択されるが、例えば0.1～500 mM、好ましくは0.2～300 mM、0.5～200 mM、1～100 mM、2～80 mM、5～50 mM、または8～30 mMの範囲で適宜選択することができ、例えば約10 mMとすることができる。
また本発明のペプチドにインターカレーターを添加してもよい。ペプチド鎖にインタカレートする物質を添加することにより、本発明のペプチドの構造を活性型に変換し、インスリン分泌促進活性を付与または上昇させることができる。インターカレーターを添加した後で、本発明のペプチドを凍結乾燥してもよい。凍結乾燥は、周知の手順にしたがって実施すればよい。なお本発明においてαへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列を持つペプチドには、熱酸処理や緩衝溶液に溶解後に凍結乾燥する処理、あるいはインターカレーターの添加によりαへリックス構造を形成するペプチドも包含される。
また本発明は、本発明の上記ペプチドであって、所望の他の化合物が切断可能に連結されたペプチドに関する。当該化合物は、切断してペプチドから分離できる限り、本発明のペプチドが持つインスリン分泌促進活性を阻害するものであっても、阻害しないものであってもよい。すなわち、当該化合物が結合したペプチドは、インスリン分泌促進活性を持っているもの、および持たないものが含まれる。インスリン分泌促進活性を持たないペプチドは、当該化合物をペプチドから切り離すことによって、ペプチドを活性型に変換することができる。
化合物としては特に制限はないが、他の化合物としてアミノ酸やポリペプチド（ペプチドと呼ばれるような短鎖のポリペプチドであってもよい）を採用し、これを本発明のペプチドと融合させた融合ペプチド（または融合ポリペプチド）とすることもできる。融合した境界部分を切断することにより両者が分離できるようにしておけば、切断によって（インスリン分泌促進活性を発揮しうる）本発明のペプチドを生成させることができる。そのためには、例えば境界部分がプロテアーゼ切断部位となるように他のポリペプチドを付加するとよい。融合させる他のペプチドに特に制限はなく、例えばタグのような数残基の短いペプチドから、蛋白質のような長いポリペプチドまで任意のポリペプチドが挙げられる。具体的には、Hisタグ、HAタグ、Mycタグ、FLAG、GFP、マルトース結合蛋白質、グルタチオン S-トランスフェラーゼ (GST)、アルカリホスファターゼ、HRP等の酵素などが挙げられるが、それらに限定されない。また、抗体断片（Fc断片）などを融合させてもよい。さらに、リーダー配列、分泌シグナル、プレ蛋白質またはプロ蛋白質の配列などを融合させてもよい。
また本発明は、インスリン分泌を促進するため、および/または糖代謝促進のための、本発明のペプチドの使用を提供する。また本発明は、インスリン分泌を促進するため、および/または糖代謝促進のための医薬または試薬の製造における、本発明のペプチドの使用を提供する。また本発明は、本発明のペプチドを含むインスリン分泌促進剤および糖代謝促進剤を提供する。また本発明は、糖尿病または前糖尿病の治療または予防のための本発明のペプチドの使用、糖尿病または前糖尿病の治療または予防のための医薬の製造における、本発明のペプチドの使用、および本発明のペプチドを含む糖尿病または前糖尿病の治療剤および予防剤を提供する。
本発明のペプチドは、膵β細胞に作用してインスリン分泌を促進する作用を有し、これにより糖代謝を促進し、血糖値を下げる効果を発揮する。したがって本発明のペプチドは、膵β細胞のインスリン分泌制御機構に関する研究ツールとして、更には肥満や高脂血症などに対する療法ツールとしての使用が可能である。そのような利用には、インビトロにおける使用およびインビボにおける使用、エクスビボにおける使用が含まれる。特に本発明のペプチドは、糖代謝改善が必要な各種病態や症状に対する治療および予防のために用いることができる。
また本発明のペプチドは、体重や体脂肪の増加の防止や減少、痩せ（部分痩せを含む）、体形改善等を目的とする各種美容目的にも有用である。
例えば本発明は、肥満の予防または治療のための内科的療法または美容方法であって、ペプチドを投与することを含む療法または方法を提供する。
同様に、本発明は、インスリン抵抗性の改善、および/または、糖尿病または前糖尿病の予防または治療のための内科的療法であって、本発明のペプチドを投与することを含む療法を提供する。
また本発明の内科療法は、肥満の予防または治療、インスリン抵抗性の改善、糖尿病の予防または治療、高脂血症の予防または治療、造血を促進させるための治療、冠動脈のバイパス血行路を作製する手術のいずれかと併用する内科療法であって、本発明のペプチドを投与することを含む療法を包含する。
また本発明は、本発明のペプチドを有効成分とする、肥満および/または過体重、代謝症候群、２型糖尿病、１型糖尿病などの代謝異常を示す諸疾患への予防および/または治療用組成物を提供する。また本発明は、本発明のペプチドを有効成分とする、体重や体脂肪の増加の防止や減少、痩せ（部分痩せを含む）、体形改善等を目的とする美容用組成物を提供する。
特に本発明のペプチドは、随時血糖値が高い状態（糖尿病型）ではインスリン分泌を促進して血糖値を低下させる強い作用を発揮し、随時血糖が高くない状態（正常型）ではインスリン分泌の促進活性は相対的に低いことが期待される（実施例１１参照）。したがって本発明のペプチドは、インビボでは高血糖状態でのみ効果が発揮されること、すなわち、低血糖を誘発しない安全性の高いものである点で有利だと考えられる。
また本発明のペプチドによってインスリン基礎分泌を亢進させることで、随時血糖を低下させ、食事に伴う糖負荷への対応能力（耐糖能）を向上させることができる。また２型糖尿病の進行とともにインスリン基礎分泌能が低下した病態に対して、本発明のペプチドを用いてインスリン基礎分泌を亢進させることも考えられる。また本発明のペプチドを用いて、１型糖尿病における残存膵β細胞のインスリン分泌機能を向上させることも可能である。このように本発明のペプチド薬は、幅広い２型糖尿病、および１型糖尿病（特に緩徐進行型１型糖尿病）の症例に対して有効な血糖コントロールの方策を提供する。
本発明のペプチドは、適宜組成物とすることができる。すなわち本発明は、本発明のペプチド（上記の融合ポリペプチド等を包含する）および薬学的に許容される担体もしくは媒体を含む組成物に関する。当該組成物は、特に医薬組成物として有用であり、例えばインスリン分泌促進、糖代謝促進、および/または糖代謝改善のために、また、糖尿病または前糖尿病の治療または予防のために使用することができる。また、本発明の組成物は美容用組成物としても有用である。製剤化は、公知の製剤学的方法により実施することができる。薬理学上許容される担体もしくは媒体は適宜選択されるが、例えば、水（例えば滅菌水）、生理食塩水（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、グリコール、エタノール、グリセロール、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、オリーブオイル、ピーナッツ油、ゴマ油などのオイル等が挙げられ、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、緩衝剤、香味剤、希釈剤、保存剤、安定剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、徐放剤等も挙げられる。
注射剤として製剤化するためには、注射用蒸留水等の担体を用いて処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムなどのその他の成分を含む水溶液が挙げられる。また、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤等を含んでもよい。
本発明の医薬組成物および美容用組成物は、好ましくは非経口投与により投与される。例えば、注射剤、経鼻投与剤、経肺投与剤、経皮投与剤等として製剤化することができる。投与は、例えば静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与してよい。投与方法の詳細は、患者の年齢、症状により適宜選択され得る。投与量は、例えば、ペプチドの乾燥物に換算して、一回につき体重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲、例えば体重1 kgあたり0.0005～500 mg、0.001～400 mg、0.002～300 mg、0.005～200 mgに設定され得るが、これに限定されない。または、例えば、患者あたり0.001～100000 mgの投与量例えば0.002～70000 mg、0.003～50000 mg、0.005～40000 mg、0.01～20000 mgに設定され得るが、これに限定されない。当業者であれば、患者の体重、年齢、症状などを考慮し、適宜適当な投与量及び投与方法を決定することが可能である。
本発明のペプチドは、所望の対象に投与することができる。投与対象は適宜選択することができるが、例えば哺乳動物、具体的にはマウス、ラット、モルモットなどのげっ歯類、ウシ、ブタ、ヤギ、ウサギなどの非げっ歯類動物、所望の霊長類、例えばサルなどの非ヒト霊長類、およびヒトが含まれる。
以下に、本発明の実施形態を、図面に示す実施例を基に説明する。なお、実施形態は下記の例示に限らず、本発明の趣旨から逸脱しない範囲で、前記文献など従来公知の技術を用いて適宜設計変更可能である。
なお本明細書において引用された文献は、すべて参照として本明細書に組み入れられる。
[実施例1] circ-TKEDGRQの物理化学的処理とインスリン分泌促進活性との関連：
アミノ酸配列が「スレオニン-リジン-グルタミン酸-アスパラギン酸-グリシン-アルギニン-グルタミン」（配列番号１）であるペプチドのN末端とC末端がペプチド結合したラクタム環状ペプチドcirc-TKEDGRQを有機化学的に合成した（ユーロフィンジェノミクス株式会社）。これを純水に溶解して5 mg/ml（6.1 mM）のストック溶液を作製した。これをマウス膵ベータ細胞株MIN6（Miyazakiら、Endocrinology 127: 126-132, 1990）に種々の濃度で添加し、参考例2に記載の方法でインスリン分泌促進活性を評価した。
結果、期待されたほど高いレベルのインスリン分泌促進活性は検出されなかった（図１A, N=1）。実験を繰り返しても高レベルの活性が検出されることはなかったことから、有機化学合成品circ-TKEDGRQをそのまま水溶しただけでは「活性型構造異性体」は高い割合では形成されないと結論された。
次に、有機化学合成品circ-TKEDGRQを活性型構造異性体に高い割合で変換するための方法につき検討した。一般に、短鎖ペプチドの高次構造を変化させる方法として、「酸処理」「アルカリ処理」「熱処理」「遷移金属添加」が知られる。そこで、「pH」「温度」「共存する金属塩の種類と濃度」をパラメータとして条件検討を行った。具体的には、ギ酸、酢酸、クエン酸、リン酸を用いて酸性溶媒（pH 3.5- pH 7.4）、塩化アンモニム液を用いてアルカリ性溶媒(pH 10-11)、酢酸アンモニウム液を用いて中性溶媒を作製し、ここに塩化ナトリウム、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、塩化リチウム、または塩化マンガンを添加し、ヒートブロック、PCR機器、ウォーターバス、または恒温培養器を用いて40℃～90℃、10分～60分の加温処理を行い、PD-10カラムで脱塩後に濃縮したサンプルのインスリン分泌促進活性を評価した。
結果、1μLの有機化学合成品circ-TKEDGRQの水溶液 (1 mM)を、0.1%ギ酸で希釈して1000μLにしたもの（最終濃度1μM）に、最終濃度140 mMの塩化ナトリウムを添加したのち、60℃のヒートブロックで１時間反応させてから室温放置により除熱後にPD-10カラムで脱塩濃縮したものにおいて、マウス膵ベータ細胞株MIN6に種々の濃度で添加した際に、用量依存的にインスリン分泌促進活性を認めた（図１B, N=1）。なお、実験を繰り返してインスリン分泌促進活性の検出に関する頑強性を調べたところ、活性の検出に成功する確率は２割程度であった。すなわち「酸処理」「アルカリ処理」「熱処理」「金属塩」というパラメータに注目した処理では、構造異性体変換における実験系の安定性は極めて高いとまでは言えないと考えられた。その理由として、短鎖ペプチドの高次構造変換は上記パラメータのもとでは確率的事象にとどまること（注：複数種の構造異性体が化学熱力学的な平衡状態で共存するため活性型構造異性体を高純度に形成することができないこと）、上記パラメータ以外の未同定の要素により構造異性体変換の効率は大きく影響を受けること、が考えられた。
以上、有機化学合成品circ-TKEDGRQはインスリン分泌促進活性を持っており、酸処理後に塩類を添加して加温する熱酸処理により、その活性を上昇させることが可能であることが判明した。但しこの方法では、有機化学合成品circ-TKEDGRQを、極めて高い再現性を持って「活性型構造異性体」に変換することができたとまでは言えなかった。
しかし、上記の条件検討を行う過程で、「凍結乾燥」という作業工程に活性型構造異性体への変換効率を上昇させる傾向が見られることに気づいた。そこで、さまざまな水系緩衝液（TRIS緩衝液, HEPES緩衝液, BIS-TRIS緩衝液, MES緩衝液、リン酸緩衝液）や有機性溶媒（メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジエチルエーテル、アセトニトリル）に有機化学合成品circ-TKEDGRQを溶解し、塩を含有する溶媒を用いた場合はPD-10カラムでの脱塩操作を行った後に、凍結乾燥したものを用いてインスリン分泌促進活性を評価した。
結果、有機化学合成品circ-TKEDGRQの水溶液(6.1 mM)を100μMに希釈したもの2μlを、10 mM のTRIS緩衝液（pH 8.0）、または10 mMのHEPES緩衝液 (pH7.4) で100倍に希釈して200μlにしたのち凍結乾燥し、それぞれ200μlのKRTBに溶解したものを用いてインスリン分泌促進能を評価したところ（最終濃度 1μM）、インスリン分泌促進活性が検出された（図２, N=1）。実験を繰り返してインスリン分泌促進活性の検出に関する頑強性を調べたところ、活性の検出に成功する確率は６割程度であり、緩衝液による処理によって頑強性も向上できることが判明した。
なお、circ-TKEDGRQがラクタム環状構造を持つことのインスリン分泌促進活性における重要性を評価するため、線状ペプチド（スレオニン-リジン-グルタミン酸-アスパラギン酸-グリシン-アルギニン-グルタミン: TKEDGRQ）（配列番号1）を有機化学的に合成し、HEPES 緩衝液(pH7.6)を用いて上記の方法で凍結乾燥処理を行い、インスリン分泌促進活性を評価した。
結果、高濃度(240μM)の線状ペプチドを用いても環状ペプチドほどの高い活性は検出されなかった（図３, N=3）。実験を繰り返しても結果が変わることはなく、circ-TKEDGRQが高いインスリン分泌促進活性を発揮するにはラクタム環構造が重要であると結論された。
前項の結果を確認するため、さらに「スレオニン-リジン-グルタミン酸-アスパラギン酸-グリシン-アルギニン-グルタミン(TKEDGRQ)」（配列番号1）より短い線状ペプチドである「リジン-グルタミン酸-アスパラギン酸-グリシン-アルギニン-グルタミン(KEDGRQ)」（配列番号1の2-7）、「スレオニン-リジン-グルタミン酸-アスパラギン酸-グリシン-アルギニン(TKEDGR）」（配列番号1の1-6）、「スレオニン-リジン-グルタミン酸-アスパラギン酸-グリシン(TKEDG）」（配列番号1の1-5）を有機化学的に合成し、HEPES 緩衝液(pH7.6)を用いて上記の方法で凍結乾燥処理を行い、インスリン分泌促進活性を評価した。
結果、どの線状ペプチドを用いても環状ペプチドほどの高レベルの活性は検出されず（図４, N=3）、circ-TKEDGRQが高レベルのインスリン分泌促進活性を発揮するためには、ラクタム環構造が鍵となると判断された。
以上、TKEDGRQ（配列番号1）のN末端とC末端がラクタム環を形成したペプチドであるcirc-TKEDGRQは、ある特定の高次構造を形成した際に高レベルのインスリン分泌促進活性を発揮し、熱酸処理および/または緩衝液による処理により頑強性が向上した活性型ペプチドを取得することが可能であることが示された。但し、「pH」「温度」「金属塩」をパラメータとした処理により、極めて安定かつ高確率に「活性型構造異性体」に変換することは困難であることが示唆された。
[実施例２] TAAAAAQ（配列番号4）の膵β細胞のインスリン分泌促進作用：
実施例１から、７つのアミノ酸配列「TKEDGRQ」（配列番号1）は、１）N末端とC末端がペプチド結合することでラクタム環状ペプチドを形成させ、かつ２）HEPES緩衝液中で凍結乾燥する、という２つの工程により高レベルのインスリン分泌促進活性を発揮するよう高次構造が変化することが示唆された。しかし、ラクタム環状ペプチドは合成に時間と費用がかかるため、同様の活性を発揮する線状ペプチドが取得できれば大きなアドバンテージとなる。どのような線状ペプチドであればインスリン分泌促進活性を持つかを考察するに際して、線状ペプチドは環状化することで分子サイズが小さくなることを鑑みれば、まず、側鎖がより小さいアミノ酸を構成員として選択することは有効である。次に、環状ペプチドTKEDGRQに「HEPES緩衝液中で凍結乾燥する」との工程を賦与した際にどのような高次構造変化が生じるかを考察した。
TKEDGRというペプチドが形成しうる高次構造に考察するために、フリーソフトウェア（QARRK ONLINE, https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/QUARK2/）（D. Xu and Y. Zhang., Proteins, 2012, 80, 1715-1735; D. Xu and Y. Zhang., Proteins, 2013, 81: 229-239）にTKEDGRをタンデムにつなげた配列を入力して高次構造を予測したところ、αヘリックス（図５上、安定にαヘリックスを形成することが報告されているDDAAAAAAAAAAKK (配列番号17) (Perutz、PNAS誌 99: 5596-5600, 2002)を入力した結果）よりもピッチが小さいと思われる構造が得られた（図５下）。ここで、HEPES分子は、Z型DNA二重らせんにインタカレートしてhelical stackingの角度を広げることが知られており（de Rosaら、PNAS誌 107: 9088-9092, 2010）、ペプチド分子にHEPESがインタカレートした際にはヘリックスのピッチを大きくすることが想定される。
以上より、線状ペプチドTKEDGR（配列番号1）に、１）環状化、２）HEPES緩衝液中での凍結乾燥、という２つの工程を賦与すると、側鎖の小さいアミノ酸が形成するαヘリックスに類似した高次構造をとる確率が高くなることが推測された。
αヘリックスを形成しやすいアミノ酸は例えばアラニンとメチオニンであるが（Scholtzら、Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct誌、第21巻、第95-118頁、1992年）、このうち側鎖の小さいのは、すなわち、半径の小さいαヘリックスを形成すると考えられるのはアラニンである。すなわち「活性型circ-TKEDGRQの高次構造を模倣する線状ペプチド」の候補として、アラニンが連続した短鎖ペプチド（アラニンストレッチペプチド）を想定した。ただし、アラニンは疎水性アミノ酸であるため、アラニンストレッチペプチドはβシートを形成して自己凝集しやすいことも知られている（Ma B & Nussinov R. Protein Science 11:2335-2350, 2002）。
そこで、TKEDGRQの７つのアミノ酸のうち、N末端(スレオニン)とC末端（グルタミン）はそのままに、内部の５つのアミノ酸をアラニン（AAAAA／配列番号3）に置換したペプチドであるTAAAAAQ（配列番号4）を「活性型circ-TKEDGRQの高次構造を模倣する線状ペプチド」の候補と考え、これを有機化学合成してインスリン分泌促進活性を評価した。
具体的には、有機化学合成品TAAAAAQを純水に溶解し(5 mg/ml; 8.32 mM)、膵β細胞株MIN6を用いたアッセイ系50μl に種々の量で添加してインスリン分泌促進能を評価した（最終濃度5.6μM, 90μM, 350μM）。結果、用量依存性にインスリン分泌促進作用が検出された（図６）。さらにHEPES緩衝液中での凍結乾燥によりTAAAAAQのインスリン分泌促進作用が増強されるかを検討した。具体的には、2μlの有機化学合成品TAAAAAQの水溶液(5 mg/ml)を、10 mM HEPES緩衝液(pH7.6) で1/100に希釈して200μlにしたものを凍結乾燥し、200μlの KRTB に再溶解したものを用いてインスリン分泌促進評価を行なった（最終濃度83μM）。結果、未処理の場合（図６）よりも低い濃度でインスリン分泌促進活性が検出された（図７）。これらの結果は、実験を繰り返しても高い頑強性をもって再現された。
以上、TAAAAAQは、未処理でもインスリン分泌促進活性を発揮すること、HEPES緩衝液中での凍結乾燥処理後には、より低濃度でインスリン分泌促進活性を発揮すること、が明らかとなった。
[実施例３] AAAAAAAのインスリン分泌促進作用に関する評価：
実施例２からTAAAAAQ（配列番号4）がインスリン分泌促進活性を持つことが確認されたが、N末端のT（スレオニン）、C末端のQ（グルタミン）が活性に必須であるかは不明である。そこで、７つのアミノ酸の全てをアラニンにした線状ペプチドAAAAAAA（配列番号5）を有機化学的に合成し、インスリン分泌促進活性を評価した。
結果、2μlの有機化学合成品AAAAAAAの水溶液(5 mg/ml)を、膵β細胞株MIN6を用いてインスリン分泌促進能を評価したが（最終濃度 10μg/50μl）、有意なインスリン分泌促進活性は検出されなかった（図８, N=3）。実験を繰り返しても有意なインスリン分泌促進活性が検出されることはなく、AAAAAAAはそのままでは有意なインスリン分泌促進活性をもたないことが判明した。
次に、HEPES緩衝液中での凍結乾燥処理により活性型構造異性体に変換される可能性につき検討した。すなわち、2μlの有機化学合成品AAAAAAAの水溶液(5 mg/ml)を、10 mM HEPES緩衝液(pH 7.6) で100倍に希釈して200μlにしたものを凍結乾燥し、200μlのKRTBに再溶解したものを用いてインスリン分泌促進活性を評価した（最終濃度 2.5μg/50μl; 97μM）。結果、顕著なインスリン分泌促進活性が検出された（図９, N=3）。ただし実験を繰り返して活性型構造異性体変換の成功率を評価したところ６割程度であったことから、AAAAAAAのHEPES緩衝液中での凍結乾燥による活性型構造異性体への変換は極めて高い頑強性をもって再現される現象とまでは言えないと判断された。
以上、AAAAAAAは、未処理では有意なインスリン分泌促進活性を認めないものの、HEPES緩衝液中での凍結乾燥処理後に高レベルのインスリン分泌促進活性を発揮しうることから、実施例２におけるペプチドのN末端のT、C末端のQは活性に必須ではないことが確認されるとともに、その活性型には若干の不安定性を認めること、が明らかとなった。
[実施例４] biotin-TAAAAAQのインスリン分泌促進作用に関する評価：
Avidinに特異的に結合するbiotinは、ペプチドのN末端への修飾因子として様々な目的に汎用されている。実施例３から、N末端のアミノ酸（スレオニン）はインスリン分泌促進活性の活性型構造異性体の形成に寄与していることが示唆されたが、ペプチドN末端へのbiotin修飾がインスリン分泌促進活性にどのような影響を与えるかを知ることは、TAAAAAQ（配列番号4）の受容体や結合パートナーの同定作業を実行するうえで重要な情報となる。そこでTAAAAAQ のN末端のT（スレオニン）のアミノ基にbiotinを付加したペプチドbiotin-TAAAAAQを有機化学的に合成し、実施例２（図４）と同様にしてインスリン分泌促進活性を評価した。
結果、biotin-TAAAAAQには有意なインスリン分泌促進活性がないことが判明した（図10, N=3）。また実験を繰り返しても有意なインスリン分泌促進活性が検出されることはなかったことから、biotin-TAAAAAQは有意なインスリン分泌促進活性をもたないことが明らかとなった。
以上より、TAAAAAQのN末端はインスリン分泌促進活性に重要である可能性があり、TAAAAAQの結合パートナーの同定にはN末端にビオチン付加したプローブを用いることは好ましくないことが示された。
[実施例５] AAAAAAQ,MAAAAAQ,GAAAAAQ,CAAAAAQのインスリン分泌促進作用に関する評価：
線状へプタペプチドがインスリン分泌促進活性を持つためには、アラニンストレッチAAAAA（配列番号3）を挟んで、N末端に例えばT（スレオニン）などのアミノ酸が存在し、C末端に例えばQ（グルタミン）などのアミノ酸が存在することが有効であること、N末端のアミノ基は修飾を受けないことが好ましいことが示唆された。
次に、N末端がどのようなアミノ酸であればインスリン分泌促進活性が発揮されるを検討する目的で、N末端のT（スレオニン）を、αヘリックスを構成しやすいアミノ酸であるA（アラニン）またはM（メチオニン）に置換したペプチド（AAAAAAQ (配列番号6), MAAAAAQ (配列番号7)）、分子量が最も小さいアミノ酸であるG（グリシン）に置換したペプチドGAAAAAQ (配列番号8)、二量体形成に関与するアミノ酸であるC（システイン）に置換したペプチドCAAAAAQ (配列番号9)、のインスリン分泌促進活性を調べた。
有機化学的合成品AAAAAAQは、純水に溶解（5 mg/ml）した際に沈殿が形成され、超音波処理を施しても沈殿は消失しなかった。このため、膵β細胞株MIN6を用いたインスリン分泌促進能を適切に評価することができなかった。
有機化学的合成品MAAAAAQは、純水に溶解（5 mg/ml）が可能であった。そこで、実施例３と同様にしてインスリン分泌促進能を評価した（最終濃度 10μg/50μl）。しかし、有意なインスリン分泌促進活性は検出されなかった（図11, N=3）。この結果は実験を繰り返しても同様であった。
有機化学的合成品GAAAAAQは、純水に溶解（5 mg/ml）した際に沈殿が形成された。一方、有機化学的合成品CAAAAAQは、純水に溶解（5 mg/ml, 8.26 mM）が可能であったが、4℃で保存中に沈殿が形成された。このため、両者ともに膵β細胞株MIN6を用いたインスリン分泌促進能を適切に評価することができなかった。
以上、AAAAAAQ, GAAAAAQ, CAAAAAQは水に不溶または難溶であること、MAAAAAQは水に可溶であるが有意なインスリン分泌促進活性を認めないこと、が判明した。すなわち、TAAAAAQのインスリン分泌促進活性には、ペプチドがαへリックスを形成しうることが重要であるが、ペプチドが可溶性を保持することも重要であることが示唆された。したがって、N末端のアミノ酸はT（スレオニン）などの親水性アミノ酸または水酸基を持つアミノ酸であることが好ましいと考えられる。
[実施例６] TAAAAAAのインスリン分泌促進作用に関する評価：
実施例３から、インスリン分泌促進活性の活性型ペプチドの効率的な形成にはN末端のT（スレオニン）などのアミノ酸とC末端のQ（グルタミン）などのアミノ酸の重要性が、実施例４、実施例５からはN末端の親水性アミノ酸または水酸基を持つアミノ酸の重要性が示唆された。
続いて、C末端のQ の重要性を検討すべく、これをA（アラニン）に置換したペプチドTAAAAAA（配列番号10）のインスリン分泌促進活性を評価した。具体的には、有機化学的合成したTAAAAAAを純水に溶解（5 mg/ml）したもの 2μlを、膵β細胞株MIN6を用いたアッセイ系に添加してインスリン分泌促進能を評価した（最終濃度 10μg/50μl）。
結果、TAAAAAAにはインスリン分泌促進活性を認めた（図12, N=3）。但し、TAAAAAQと比べて活性は低かった。実験を繰り返しても結果が変わることはなかった。
次に、HEPES緩衝液中での凍結乾燥により活性型構造異性体に変換される可能性を検討した。すなわち、2μlの有機化学合成品TAAAAAAの水溶液(5 mg/ml)を、10 mM HEPES緩衝液(pH 7.6) で100倍に希釈して200μlにしたものを凍結乾燥し、200μlのKRTBに再溶解したものを用いてインスリン分泌促進活性を評価した（最終濃度 2.5μg/50μl）。
結果、有意なインスリン分泌促進活性は検出されなかった（図13, N=3）。実験を繰り返しても有意なインスリン分泌促進活性が検出されることはなかった。
以上、TAAAAAAはインスリン分泌促進活性を持つものの、その活性はTAAAAAQに比べて低いと結論された。この結果は、TAAAAAQにおけるC末端のQ（グルタミン）などの親水性アミノ酸の重要性を示すものである。なお、実施例１より、末端のQ（グルタミン）ペプチドであるTKEDGRQ（配列番号1）（図３、図４）やKEDGRQ（配列番号1のアミノ酸2-7番目）（図４）は高いインスリン分泌促進活性を持たなかったことから、C末端のQ（グルタミン）は、それよりN末側に存在する特定のアミノ酸配列を持つペプチドにおいてインスリン分泌促進活性に重要であると考えられた。
[実施例７] TAAAAAQGGの膵ベータ細胞のインスリン分泌促進効果：
TAAAAAQの受容体や結合パートナーの同定に向けては、TAAAAAQにタグを付加することが有用であるが、実施例４で示したように、N末端へのbiotin付加はインスリン分泌促進活性を消失させる。そこで、C末端への付加についてさらに検討すべく、タグを連結するためのスペーサーとして汎用される「グリシルグリシン（GG）」をC末端に付加したペプチドTAAAAAQGG（配列番号11）を有機化学的に合成し、図11と同様にしてインスリン分泌促進活性を評価した。
結果、TAAAAAQGGはTAAAAAQと同等のインスリン分泌促進活性を示した（図14）。この結果は実験を繰り返しても再現された。以上、C末端へのスペーサー配列GGの付加はインスリン分泌促進活性に影響を与えないことが判明した。またこの結果は、C末端のアミノ酸はQ（グルタミン）であることは必須ではないことも示している。
[実施例８] SAAAAAQの膵β細胞のインスリン分泌促進作用：
実施例４～実施例７から、高レベルのインスリン分泌促進活性にはN末端のT（スレオニン）などのアミノ酸が重要であることが示されたが、Tは特に「水酸基を持つ親水性アミノ酸」であることから、同じく「水酸基を持つ親水性アミノ酸」であるS（セリン）にも同様の効果がある可能性が想定される。そこで、N末端をTをSに置換したペプチドSAAAAAQ（配列番号12）を有機化学的に合成し、図12, 図13と同様にしてインスリン分泌促進活性を評価した。
結果、SAAAAAQ は、無処理の場合も（図15 (1)、N=3）、HEPES緩衝液中での凍結乾燥無処理を行った場合も（図15 (2), N=3）、TAAAAAQ及びTAAAAAQGGと同様にインスリン分泌促進活性を示した。これらの結果は実験を繰り返しても再現された。
以上、SAAAAAQはインスリン分泌促進活性を持つことが判明した。これはN末端のアミノ酸としては、TやSと類似した性質を持つアミノ酸、例えばTやSなどの水酸基を持つ親水性アミノ酸が特に好ましいことを示唆している。
[実施例９] YAAAAAQ, 及び、DAAAAAQ, KAAAAAQ, TAAAAAEのインスリン分泌促進作用に関する評価：
実施例２および実施例８から、インスリン分泌促進活性にはN末端が「水酸基を持つアミノ酸」であることが好ましいことが示唆されたが、水酸基を持つアミノ酸には、親水性アミノ酸に分類されるT（スレオニン）やS（セリン）以外にも、疎水性アミノ酸に分類されるY（チロシン）がある。そこで、TAAAAAQのTをYに置換したペプチドYAAAAAQ（配列番号13）を有機化学的に合成し、図12, 図13と同様にしてインスリン分泌促進活性を評価した。
結果、無処理のYAAAAAQは高いインスリン分泌促進活性を示さなかった（図16）。一方、HEPES緩衝液中での凍結乾燥無処理後には比較的高いインスリン分泌促進活性が検出されたが（図17）、力価はTAAAAAQGGよりも低かった。
以上より、TAAAAAQのインスリン分泌促進活性には、N末端が「水酸基を持つアミノ酸」であることが好ましいが、「水酸基を持つ親水性アミノ酸」であることがより好ましいことが判明した。
次に、TAAAAAQがインスリン分泌促進活性を発揮するためには、N末端は「水酸基を持つ親水性アミノ酸」である必要があるのか、または「親水性アミノ酸」でも同様の効果を持つのかを明らかにするために、「荷電側鎖を持つアミノ酸（酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸）」の効果を調べた。具体的には、N末端のTをカルボキシ基側鎖を持つ親水性アミノ酸のD（アスパラギン酸）に置換したペプチドDAAAAAQ（配列番号14）、アミノ基側鎖を持つ親水性アミノ酸のK（リジン）に置換したペプチドKAAAAAQ（配列番号15）を有機化学的に合成し、図11, 図12と同様にしてインスリン分泌促進活性を評価した。
さらに、C末端のQ（グルタミン）に関しても、これがQである必要があるのか、または類似の構造を持つ「親水性アミノ酸」である E(グルタミン酸)にも同様の効果があるのかを調べるために、TAAAAAQのC末端のQをEに置換したペプチドTAAAAAE（配列番号16）を有機化学的に合成し、図11, 図12と同様にしてインスリン分泌促進活性を評価した。
結果、無処理ではKAAAAAQは高いインスリン分泌促進活性を示さなかったものの、DAAAAAQやTAAAAAEは比較的高いインスリン分泌促進活性を示すことが確認された（図16）。また、HEPES緩衝液中での凍結乾燥無処理を行うことでYAAAAAQ、DAAAAAQ、KAAAAAQ、およびTAAAAAEはいずれもインスリン分泌促進活性の回復が見られた（図17）。但し、いずれのペプチドもTAAAAAQGGと比べればその活性は低かった。
以上、線状ヘプタペプチドがインスリン分泌促進活性を発揮するためには、１）N末端は水酸基を持つ親水性アミノ酸(T, S)であること、２）中央部は５つのアラニンなどのαヘリックスを形成し得るアミノ酸からなるストレッチであること、３）そのC末端側は荷電側鎖を持たないQなどの親水性の中性アミノ酸であること、が好ましいことが判明した。また、実施例７により、C末端にはさらにアミノ酸を付加し得ることも判明した。
[実施例１０] 食事誘発性肥満マウスおけるTAAAAAQ投与による血糖降下
７週齢のC57BL/6マウスに19週間の高脂肪食(D12492、Research Diets社)を負荷した。26週齢の段階において、2μl のTAAAAAQ水溶液(8.32 mM)を200μl の10mM HEPES緩衝液(pH7.6)に希釈して（100倍希釈）凍結乾燥したサンプルを、150μlの生食に溶解して腹腔内に投与した(10μg/匹)。以後は摂食させず、2時間後に採血して血糖値と血清インスリン値を測定した。コントロールとして、インビトロ試験で高いインスリン分泌促進活性が検出されなかったTKEDGRQ（図３、図４）を用いて同様の処置を行なった。なお、TKEDGRQ (配列番号1)、TAAAAAQ (配列番号4) ともに、３匹ずつのC57BL/6マウスに投与実験を行い、「投与前」「投与２時間後」の血糖値を比較した。
結果、図18に示すように、TKEDGRQ投与マウスは「２時間の絶食」に伴って血糖値の低下傾向を認め、TAAAAAQ投与マウスでは血糖値は顕著に低下した。
以上、食事誘発性肥満マウスに対してTKEDGRQおよびTAAAAAQはどちらも血糖降下傾向を示すものの、特にTAAAAAQは顕著な血糖降下作用を発揮することが示された。
[実施例１１] ob/obマウスにおけるTAAAAAQ投与による血糖降下
13週齢のob/obマウスに12週間の高脂肪食(D12492、Research Diets社)を負荷した。25週齢の段階において、2μl のTAAAAAQ水溶液(8.32 mM)を200μl の10mM HEPES緩衝液(pH7.6)に希釈して（100倍希釈）凍結乾燥したサンプルを、150μlの生食に溶解して腹腔内に投与した(10μg/匹)。以後は摂食させず、2時間後に採血して血糖値と血清インスリン値を測定した。コントロールとして、インビトロ試験で高いインスリン分泌促進活性が検出されなかったKEDGRQ (配列番号1のアミノ酸2-7番目)（図４）を用いて同様の処置を行なった。なお、KEDGRQ、TAAAAAQ (配列番号4) ともに、２匹ずつのob/obマウスに投与実験を行い、「投与前」「投与２時間後」の血糖値と血清インスリン値を比較した。
結果は図19に示すように、KEDGRQ投与マウスは、随時血糖（投与前血糖）の値に関係なく、２匹とも血糖値は変化は乏しいものの低下傾向を示し（160 mg/dL→149 mg/dL, 126 mg/dL→119 mg/dL）、血清インスリン値は２時間の非摂食状態を反映して約半分に減少した（2.22 OD450nm → 1.10 OD450nm, 1.27 OD450nm → 0.61 OD450nm）。一方、TAAAAAQ投与マウスは、１匹は随時血糖（投与前血糖）が199 mg/dLと高値であったが（糖尿病型）、TAAAAAQ投与により血糖値は131 mg/dLまで顕著に低下した。また、血清インスリン値は２時間の非摂食状態にも関わらず減少率は低く（2.47 OD450nm → 1.92 OD450nm）、摂食時の78%の値を示した。もう１匹は、随時血糖値（投与前血糖値）が134 mg/dLと正常型であり、TAAAAAQ投与後も125 mg/dLであり、血清インスリンも非摂食状態を反映して減少した（1.88 OD450nm → 0.53 OD450nm）。
以上より、TAAAAAQは、随時血糖値が高い状態（糖尿病型）ではインスリン分泌を促進して血糖値を低下させる作用があること、しかし、随時血糖が高くない状態（正常型）ではインスリン分泌を促進しないこと、が示された。この結果は、TAAAAAQのインスリン分泌促進作用はインビボでは高血糖状態でのみ効果が発揮されること、すなわち、低血糖を誘発しない安全性の高いものであることが強く示唆された。
[参考例１] ヒト胚性幹細胞からの褐色脂肪細胞誘導：
ヒト胚性幹細胞（KhES-3, Suemoriら、Biochem Biophys Res Commun 345:926-932,2006；Cellosaurus ID CVCL_B233；Cellosaurus ID CVCL_B233；理研細胞バンク ID HES0003））は京都大学・再生医科学研究所より供与されたものを用いた。KhES-3は、X線照射処理済みのMEF上で、20% Knockout Serum Replacement（KSR）（Life Technologies, Inc.）、5ng/ml FGF2、1% non-essential amino acids solution、100μM 2-mercaptethanol、2mM L-glutamine含有DMEM/F12（Life Technologies, Inc.）培地を用いて維持培養を行った。
褐色脂肪細胞への分化誘導にあたっては、まずKhES-3からMEFを分離・除去するため、剥離液処理により回収された多能性幹細胞の浮遊液を、遠沈管内で30秒程度静置することで多能性幹細胞のみを選択的に沈降させた。
褐色脂肪細胞への分化誘導は次の2段階の工程で行った。
（1）工程A
多能性幹細胞からなる沈降物を、4 mlの細胞凝集物作製用培地（5 mg/ml BSA、1%体積 合成脂質溶液、1%体積 x100 ITS-A、450μM MTG、2mM L-Glutamine、5%体積 PFHII、50μg/ml ascorbic acidを含有するIMDM/F12培地であって、20ng/ml BMP4、5ng/ml VEGF、20ng/ml SCF、2.5ng/ml Flt3L、2.5ng/ml IL6、5ng/ml IGF2を含む培地）に浮遊させ、これを6穴型のMPCコート培養皿に移し入れて、37℃で5% CO2インキュベータ内で培養した。以後、3日ごとに半量の培地を交換しながら8～10日間培養した。なお培地交換は、MPCコート培養皿全体を30度程傾けて1分ほど放置し、細胞凝集物が完全に沈むのを確認した上で、培養上清のみを半量ピペットで静かに吸い出した後、同量の新鮮な細胞凝集物作製用培地を添加し、MPCコート培養皿全体を軽く揺すりながら細胞凝集物を均一に分散させることで行った。
（2）工程B
上述で作製された多能性幹細胞由来細胞凝集物を、10 ml程度の遠沈管に移し入れ、30秒～1分ほど静置して細胞成分を沈降させてから、上清を除去して3mlの褐色脂肪細胞誘導培地（5 mg/ml BSA、1%体積 合成脂質溶液、1%体積x100 ITS-A、450μM MTG、2mM L-Glutamine、5%体積 PFHII、50μg/ml ascorbic acid を含有するIMDM/F12培地であって、10ng/ml BMP7、5ng/ml VEGF、20ng/ml SCF、2.5ng/ml Flt3L、2.5ng/ml IL6、5ng/ml IGF2を含む培地）を加えて、1100rpmで5分間遠心をした。これを、あらかじめ0.1%ブタゼラチン水溶液で室温で10分間反応させた細胞培養皿に移し入れ、37℃で5% CO2インキュベータ内で培養した。以後、3日ごとに培地を交換しながら1週間培養した。
その結果、細胞質に多胞性脂肪滴（多数の黄身がかった光沢のある球形物）を持つ細胞が得られた。なお、この球形物が脂肪滴であることは、oil red O染色（中性脂肪を紅色に発色させる試験）により確認された。
またRT-PCRにより、褐色脂肪細胞に特徴的な遺伝子群（UCP1、PRDM16、PGC1α、Cyt-c、CIDE-A、ELOVL3、PPARα、EVA1、NTRK3）の発現が誘導されていることが電気泳動により確認された。さらに、褐色脂肪細胞と白色脂肪細胞の共通マーカーであるPPARγ及びadiponectinの発現が誘導されていることも確認された。一方、白色脂肪細胞のマーカーであるresistin、ホスホセリントランスアミナーゼ1（PSAT1）、エンドセリン受容体アルファ（EDNRA）の発現は誘導されていないことも確認された。
なお、resistinはインスリン抵抗性を惹起するのみならず、癌化や動脈硬化とも関連する遺伝子である。ヒト多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞においてresistinの発現が誘導されていないことは、ヒト多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞を用いた創薬研究はもちろんのこと、ヒト多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞を用いた細胞療法における安全性を考える上で極めて重要な点である。
また電子顕微鏡観察により、褐色脂肪細胞に特徴的な微細構造である多胞性脂肪滴、縦に長く融合したミトコンドリアの存在が確認された。更に、褐色脂肪細胞に特徴的な梯子状に発達したクリステがミトコンドリア内部に確認された。
[参考例２] 「塩類と低濃度ブドウ糖のみを含有するバッファー」で調製したヒトESC由来BA上清または合成ペプチドの、膵ベータ細胞に対するインスリン分泌促進作用：
以下のとおり、ヒトESC由来BAのSUPを調製した。即ち、MEF上で維持培養しているヒトESCから参考例１に記載の方法によりBAを分化誘導し、Day 10の成熟BAから分化培地を除去した後、2.8 mMブドウ糖を含有するKrebs-Ringer-TRIS-Bicarbonate (KRTB)バッファー（NaCl:119 mM, KCl:4.74 mM, CaCl2 1.19 mM, MgCl2 1.19 mM, KH2PO4:1.19 mM, NaHCO3:25 mM, TRIS(pH7.4):10 mM, Glucose 2.8 mM）を添加し、炭酸ガス培養装置（37℃、5% CO2）内で16時間培養後に上清を回収した（以下、ここで回収した上清をBA-SUPと記載）。一方、マウス膵ベータ細胞株であるMIN6細胞（宮崎純一大阪大学産学連携本部特任教授(現在)より分与）を推奨法（Miyazakiら、Endocrinology 127: 126-132, 1990）にて96穴プレートで培養した。これをPBSバッファーでwashした後、2.8 mMブドウ糖含有KRHバッファーで１時間培養し（低ブドウ糖処理）、細胞上清を除去した後、BA-SUPまたは、コントロールSUP、を添加して、炭酸ガス培養装置（37℃、5% CO2）内で２時間培養した。ペプチド添加実験では、BA-SUPに代えて合成ペプチドを上記KRTBに溶解して添加した（コントロールはKRTB）。その後、MIN6細胞の上清中を回収し、インスリン濃度をELISA法（超高感度マウスインスリン測定キット、株式会社森永生科学研究所）で測定した。
本発明によると、これまで全く手段がなかったインスリン基礎分泌促進作用を有する短鎖ペプチド薬の提供が可能となる。インスリン基礎分泌が亢進すると、随時血糖が低下するため、食事に伴う糖負荷への対応能力（耐糖能）も向上する。さらに、インスリン基礎分泌能の低下は２型糖尿病の進行例で見られる病態であるため、病気の進行とともに従来のインスリン分泌促進剤が無効となった症例にも有効な血糖降下作用を発揮することが期待される。すなわち、幅広い２型糖尿病の症例に対して、有効な血糖コントロールの方策を提供することが可能となる。また、１型糖尿病の約1/3の症例では膵β細胞が残存しており、残存膵β細胞のインスリン分泌機能の向上は１型糖尿病の新しい治療戦略として注目されている。このため、本発明による短鎖ペプチド薬は、１型糖尿病（特に緩徐進行型１型糖尿病）の症例に対しても有効な血糖コントロールの方策を提供する。
本発明による、インスリン分泌促進性短鎖ペプチドの合成は、世界の多くの国と地域において実施が可能であるので、巨大プラント産業に展開し得て、実用的であり産業上利用価値が高い。

Claims (20)

  1. αへリックス構造を形成しうるアミノ酸配列を含むペプチドであって、該ペプチドおよび/またはその活性型がインスリン分泌促進活性を持つ、ペプチド。
  2. 数個から十数個のアミノ酸からなる、請求項１に記載のペプチド。
  3. 水酸基を持つアミノ酸および/または親水性アミノ酸に続き、該へリックスを形成しうる５残基以上のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のペプチド。
  4. 該αヘリックス構造を形成する５残基以上のアミノ酸配列が、αヘリックス形成性アミノ酸で構成される、請求項３に記載のペプチド。
  5. 該αヘリックス形成性アミノ酸が、メチオニン、アラニン、ロイシン、グルタミン酸、リジンからなる群より選択される、請求項４に記載のペプチド。
  6. 該αヘリックス構造を形成する５残基以上のアミノ酸配列が５つのアラニン（AAAAA／配列番号3）を含む、請求項５に記載のペプチド。
  7. 水酸基を持つアミノ酸および/または親水性アミノ酸が、スレオニン、セリン、チロシンから選択されるアミノ酸である、請求項３から６のいずれかに記載のペプチド。
  8. 水酸基を持つアミノ酸および/または親水性アミノ酸が、スレオニンまたはセリンである、請求項３から６のいずれかに記載のペプチド。
  9. 該αヘリックス構造を形成する５残基以上のアミノ酸配列に続き、親水性の中性アミノ酸を含む、請求項３から８のいずれかに記載のペプチド。
  10. 該親水性の中性アミノ酸がグルタミンである、請求項９に記載のペプチド。
  11. スレオニン-アラニン-アラニン-アラニン-アラニン-アラニン-グルタミン（TAAAAAQ／配列番号4）、セリン-アラニン-アラニン-アラニン-アラニン-アラニン-グルタミン（SAAAAAQ／配列番号12）、またはスレオニン-アラニン-アラニン-アラニン-アラニン-アラニン-グルタミン-グリシン-グリシン（TAAAAAQGG／配列番号11）のアミノ酸配列を含むペプチドであって、該ペプチドおよび/またはその活性型がインスリン分泌促進活性を持つ、ペプチド。
  12. スレオニン-リジン-グルタミン酸-アスパラギン酸-グリシン-アルギニン-グルタミン（TKEDGRQ／配列番号1）のアミノ酸配列を含むペプチドであって、該ペプチドおよび/またはその活性型がインスリン分泌促進活性を持つ、ペプチド。
  13. スレオニン-リジン-グルタミン酸-アスパラギン酸-グリシン-アルギニン-グルタミン (TKEDGRQ／配列番号1)のアミノ末端とカルボキシル末端のアミノ酸がペプチド結合によりラクタム環を形成した環状ペプチドである、請求項１２に記載のペプチド。
  14. 活性型が、酸性条件下で加熱後冷却する工程、および/または緩衝液に溶解後に凍結乾燥する工程で処理されたペプチドである、請求項１から１３のいずれかに記載のペプチド。
  15. 他の化合物が分離可能に連結されている、請求項１から１４のいずれかに記載のペプチド。
  16. 請求項１から１５のいずれかに記載のペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
  17. 医薬組成物である、請求項１６に記載の組成物。
  18. インスリン分泌促進および/または糖代謝促進のために用いられる、請求項１６または１７に記載の組成物。
  19. 糖尿病または前糖尿病の治療または予防のために用いられる、請求項１６から１８のいずれかに記載の組成物。
  20. 請求項１から１５のいずれかに記載のペプチドを投与する工程を含む、糖尿病または前糖尿病の療法または予防方法。
JP2019012945A 2019-01-29 2019-01-29 インスリン分泌促進ペプチド Pending JP2022049715A (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019012945A JP2022049715A (ja) 2019-01-29 2019-01-29 インスリン分泌促進ペプチド
PCT/JP2020/001791 WO2020158491A1 (ja) 2019-01-29 2020-01-21 インスリン分泌促進ペプチド

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019012945A JP2022049715A (ja) 2019-01-29 2019-01-29 インスリン分泌促進ペプチド

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2022049715A true JP2022049715A (ja) 2022-03-30

Family

ID=71842109

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019012945A Pending JP2022049715A (ja) 2019-01-29 2019-01-29 インスリン分泌促進ペプチド

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2022049715A (ja)
WO (1) WO2020158491A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114306569B (zh) * 2021-12-22 2023-04-25 南京市妇幼保健院 一种棕色脂肪分泌肽在促进脂肪细胞能量代谢中的作用
CN113956334B (zh) * 2021-12-22 2022-03-18 南京市妇幼保健院 一种棕色脂肪细胞分泌肽及其衍生物在肥胖防治中的应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090087878A9 (en) * 1999-05-06 2009-04-02 La Rosa Thomas J Nucleic acid molecules associated with plants
ES2929047T3 (es) * 2016-06-24 2022-11-24 Scripps Research Inst Transportador de nucleósido trifosfato novedoso y usos del mismo
US20200165309A1 (en) * 2017-05-11 2020-05-28 Los Angeles Biomedical Research Institute at Flarbor-UCLA Medical Center Antimicrobial peptides with alpha-core helices
WO2020036184A1 (ja) * 2018-08-14 2020-02-20 国立研究開発法人国立国際医療研究センター 褐色脂肪細胞上清、その調製法、及び、使用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020158491A1 (ja) 2020-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5902679B2 (ja) ＩＬ−４Ｒαに結合する涙液リポカリンムテイン
JP6267190B2 (ja) 悪液質の予防用または治療用組成物
US6235716B1 (en) Multivalent ligands which modulate angiogenesis
EP1196450B1 (fr) Derives citrullines de la fibrine et leur utilisation pour le diagnostic ou le traitement de la polyarthrite rhumato de
WO2020158491A1 (ja) インスリン分泌促進ペプチド
JP2009523157A (ja) 虚血および神経変性の処置のための化合物
JP2024056762A (ja) Ｃ末端ｃｄｎｆ断片、それらを含む医薬組成物、並びにそれらの使用
JP2019503341A (ja) 植物細胞に生物学的に封入された、治療用タンパク質の、疾患の治療のための関心のある細胞型への標的化された送達
KR101064914B1 (ko) 자가면역질환, 알러지성 질환 및 염증성 질환 치료용 약제 조성물 및 이의 전달 방법
EP1567545B1 (en) Peptides and their use in the treatment of central nervous system damage
JP6548126B2 (ja) Ｉｉｉ型コラーゲン産生促進剤
JP2003521865A (ja) １４８個のヒト分泌タンパク質
US20220340629A1 (en) Myosin Derived Peptides and Related Compounds with Anticoagulant Activities
JP2013071904A (ja) 抗インフルエンザウイルス活性を有するペプチド
US20030077757A1 (en) Method of treating aging-related disorders
US20050192221A1 (en) Methods and compositions related to plunc polypeptides
JP2020529845A (ja) Ｗｎｔ組成物および無血清培養条件からの処理の方法
Xu et al. Expression, purification, and characterization of recombinant lumbrokinase PI239 in Escherichia coli
JP2019512216A (ja) カルシウムチャネルのペプチド阻害剤
Walker Primary structures
JP2006503553A (ja) 神経保護ポリペプチドとその使用法
JP7341451B2 (ja) タンパク質性化合物とその利用
CA2421258C (fr) Proteine bard1 tronquee, et ses applications diagnostiques et therapeutiques
JP2002509693A (ja) カドヘリン由来成長因子及びその使用
JP2004518410A5 (ja)