CN114306569B

CN114306569B - 一种棕色脂肪分泌肽在促进脂肪细胞能量代谢中的作用

Info

Publication number: CN114306569B
Application number: CN202111580630.7A
Authority: CN
Inventors: 季晨博; 崔县伟; 仲红
Original assignee: Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Current assignee: Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2041-12-22
Also published as: CN114306569A

Abstract

本发明公开了一种棕色脂肪细胞分泌肽，所述棕色脂肪细胞分泌肽的氨基酸序列为SEQIDNO:1。本发明通过Westernblot和qPCR检测到该分泌肽可促进棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞中UCP1蛋白的表达及Pparɑ、Pgc1ɑ、Cpt1ɑ、Cidea、Cyt‑c等代谢相关基因的表达；进一步通过Seahorse检测证实一定剂量的该多肽可以显著促进棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞的能量代谢。因此，该棕色脂肪细胞分泌肽及其衍生物或药物组合具备制备促进脂肪细胞能量代谢药物的潜质。

Description

一种棕色脂肪分泌肽在促进脂肪细胞能量代谢中的作用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种棕色脂肪分泌肽及其在脂肪细胞能量代谢激活中的作用。

背景技术

人和其他哺乳动物体内主要存在两种脂肪：白色脂肪（WAT）和棕色脂肪（BAT），而白色脂肪受外界因素（如寒冷、β肾上腺受体激动剂等）刺激后，可发生棕色化样变，产生一种新的脂肪：米色脂肪（Beige fat）。棕色脂肪和米色脂肪虽起源不同但具有相似特性，即可通过线粒体解偶联蛋白1（UCP1）将脂质以热量形式释放，这种特性不仅有助于新生儿保暖而且为成人肥胖防治提供了新策略。BAT含量与身体质量指数（BMI）呈负相关，约40-50 g活性BAT即可代谢掉每天20%的能量摄入，展示出BAT用于肥胖治疗的可能性。人体和动物实验已证实，提高机体产热脂肪细胞含量与活性能显著改善糖代谢和胰岛素敏感性，缓解高脂饮食或基因缺陷所致的肥胖、胰岛素抵抗。产热脂肪燃烧脂质、以热能发散、无毒副作用的特性，优于既往肥胖治疗药物，在研究者心目中已成为新型、健康、潜在的肥胖治疗手段。

脂肪不仅是能量存储组织，也是机体最大的内分泌器官，可分泌多种生物活性因子，如脂联素、抵抗素等，通过旁分泌、自分泌、远距分泌等多种方式影响机体生命活动。新近研究发现棕色脂肪组织也有分泌功能，可分泌 NGF、Ngr4等分子，影响大脑、肝脏等其他组织器官的能量代谢。此外，棕色脂肪组织分泌的 BMP7、BMP4和 FGF21也具有促进白色脂肪棕色化作用，提示“棕色脂肪不仅是代谢组织，更是分泌器官。本发明公布了一条棕色脂肪分泌的多肽并证实其在促进棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞能量代谢中的作用。

发明内容

为解决上述问题，本发明公开了一种棕色脂肪分泌肽在促进脂肪细胞能量代谢中的作用。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明的目的是提供了一种棕色脂肪细胞分泌肽，并公开了其在促进棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞能量代谢中的作用，所述棕色脂肪细胞分泌肽通过促进UCP1蛋白的表达及Pparɑ、Pgc1ɑ、Cpt1ɑ、Cidea、Cyt-c基因的表达提供细胞代谢能力，所述棕色脂肪细胞分泌肽的序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步地，所述棕色脂肪分泌肽发挥作用的浓度为10-50μM。

本发明还有一个目的是提供一种棕色脂肪细胞分泌肽衍生物在促进脂肪细胞能量代谢中的作用，所述脂肪细胞包括白色脂肪细胞、棕色脂肪细胞，所述棕色脂肪细胞分泌肽衍生物通过促进UCP1基因的表达及Pparɑ、Pgc1ɑ、Cpt1ɑ、Cidea、Cyt-c基因的表达提供细胞代谢能力。

进一步地，所述棕色脂肪细胞分泌肽衍生物为包含如SEQ ID NO.1所示的活性氨基酸序列的嵌合肽，所述嵌合肽由多肽与细胞穿膜肽连接形成，或棕色脂肪细胞分泌肽经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加形成的保有该肽活性的多肽衍生物。

所述棕色脂肪细胞分泌肽衍生物的序列如SEQ ID NO.2所示。

棕色脂肪细胞分泌肽FAQPEILIGTIPGAGGTQR的序列SEQIDNO:1如下：

Phe-Ala-Gln-Pro-Glu-Ile-Leu-Ile-Gly-Thr-Ile-Pro-Gly-Ala-Gly-Gly-Thr-Gln-Arg。

SEQIDNO:2如下：

GRKKRRQRRRPPQQFAQPEILIGTIPGAGGTQR。

进一步地，所述棕色脂肪细胞分泌肽衍生物发挥作用的浓度为1-50μM。

本发明还有一个目的是提供一种促进脂肪细胞能量代谢的组合物，包含上述的棕色脂肪细胞分泌肽和/或棕色脂肪细胞分泌肽衍生物，以及其他药学上可接受的载体或赋形剂。

进一步地，所述其他药学上可接受的载体包括纳米材料、脂质体、水凝胶、细胞外囊泡，所述其他药学上可接受的赋形剂包括甘露醇、乳糖、氯化钠。

进一步地，所述组合物的形式包括药物、保健品或食品添加物；所述组合物通过口服或注射的方式施用。

本发明的有益效果为：

本发明公开了一种具有促进棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞能量代谢的棕色脂肪细胞分泌肽，该多肽通过促进UCP1以及其他脂肪细胞代谢相关基因的表达提供细胞代谢能力。因此，该棕色脂肪细胞分泌肽及其药物组合具有制备激活脂肪能力代谢药物的潜能。

附图说明

图1为本发明FAQPEILIGTIPGAGGTQR肽对棕色脂肪和白色脂肪细胞UCP1蛋白表达的影响，其中，a为棕色脂肪细胞UCP1表达，b为棕色脂肪细胞UCP1 Western blot结果灰度值统计，c为白色脂肪细胞UCP1表达，d为白色脂肪细胞UCP1 Western blot结果灰度值统计；

图2为本发明FAQPEILIGTIPGAGGTQR肽对棕色和白色脂肪细胞代谢能力调节相关基因表达的影响，其中，a为棕色脂肪细胞，b为白色脂肪细胞；

图3为本发明FAQPEILIGTIPGAGGTQR肽对棕色脂肪和白色脂肪细胞能量代谢功能的影响，其中，a为棕色脂肪细胞代谢能力评估Seahorse检测，b为棕色脂肪细胞Seahorse结果分析，c为白色脂肪细胞代谢能力评估Seahorse检测，d为白色脂肪细胞Seahorse结果分析；

图4为本发明FAQPEILIGTIPGAGGTQR肽处理对棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞活力能力的影响，其中，a为棕色脂肪细胞，b为白色脂肪细胞。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

Western blot检测FAQPEILIGTIPGAGGTQR肽对棕色脂肪和白色脂肪细胞UCP1蛋白表达的影响

实验方法

取处于对数生长期的棕色和白色脂肪前体细胞均匀种植于细胞培养板内，采用PAM完全培养基（内含有配套的5%的FBS、1%的PAGS 和1%的P/S）培养至细胞长满培养板，继续接触融合培养24-48h后，弃去PAM完全培养基，用预热至37℃的PBS洗2遍后，加入适量脂肪细胞诱导分化剂Ⅰ持续诱导4天后更换为脂肪细胞诱导分化剂Ⅱ，后每隔2日更换一次新的脂肪细胞诱导分化剂Ⅱ，分别于棕色脂肪细胞及白色脂肪细胞诱导分化成熟后给予FAQPEILIGTIPGAGGTQR肽（浓度为10μM及50μM）刺激6h，后收取不同浓度肽处理6h后的棕色脂肪细胞及白色脂肪细胞样本。其中棕色脂肪细胞诱导分化剂Ⅰ内含有一定浓度的IBMX、地塞米松、罗格列酮、胰岛素、T3、泛酸、生物素、转铁蛋白及双抗，诱导分化剂Ⅱ内含有一定浓度的胰岛素、T3及双抗；白色脂肪细胞诱导分化剂Ⅰ内含有一定浓度的IBMX、地塞米松、罗格列酮、胰岛素及双抗，诱导分化剂Ⅱ内含有一定浓度的胰岛素及双抗。

收集脂肪细胞样本后，采用RIPA裂解液抽提细胞总蛋白：于细胞样本中加入适量4℃的RIPA裂解液（内含有蛋白酶抑制剂），转移至EP管中，混匀后冰上静置30min，后予以4℃、12000rpm离心30min，吸弃中层上清转移至新的EP管中，上清即为脂肪细胞蛋白样本，此步骤可获得棕色脂肪细胞蛋白及白色脂肪细胞蛋白。采用BCA定量法检测蛋白浓度，根据蛋白样本浓度，加入适量5*loading buffer及RIPA，配置成相同浓度、相同体积的蛋白样品，混匀后95℃加热变性10min。

待蛋白样本将在常温后，予以相同体积分别加入SDS-PAGE胶孔中，予以电泳60V，30min；120V，60min，再以350mA恒电流转膜1.5h，采用5%的脱脂奶粉室温缓慢摇晃封闭1h，TBST将奶粉清洗去除后，予以一抗UCP1或HSP904℃缓慢摇晃孵育过夜，第2日采用TBST快速摇晃清洗4遍（共计30min），后更换为二抗室温缓慢摇晃孵育1h，再次采用TBST快速摇晃清洗，用滤纸将膜上参余的液体弃去后，滴加显影液于蛋白样本面，采用化学发光法曝光成像，获得显色目的蛋白条带，并通过灰度值软件扫描并计算。同时采用t检验比较标注差异情况，当 P<0.05时被认为是有显著差异的。*表示 P<0.05；**表示 P<0.01；***表示 P<0.001。

实验结果

由图1可见，以HSP90作为蛋白条带内参，不同浓度的FAQPEILIGTIPGAGGTQR肽处理均可显著上调棕色脂肪和白色脂肪细胞中UCP1蛋白表达水平，并具有一定的剂量依赖性；灰度值统计分析显示上述表达差异均具有统计学意义，且50μM浓度处理效果更为显著，提示FAQPEILIGTIPGAGGTQR肽处理可显著提高棕色脂肪细胞及白色脂肪细胞产热耗能能力。其中，UCP1是脂肪线粒体发挥解偶联作用将多余能量转化为热量消耗掉的主要效应蛋白。

实施例2

荧光定量PCR检测FAQPEILIGTIPGAGGTQR肽对棕色和白色脂肪细胞代谢能力调节相关基因表达的影响

实验方法

参考上述方法培养、诱导分化及处理棕色脂肪细胞及白色脂肪细胞（肽浓度为50μM）后收集细胞样本，采用TRIZOL法提取细胞总RNA，使用NanodropND-1000分光光度计检测抽提所得RNA样本浓度、OD260/280以及OD230/260。利用Vazyme逆转录试剂盒（HiScriptIII Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper））通过两步法：1）去除基因组DNA、2）逆转录反应，将RNA逆转录为cDNA，利用SYBRGreen方法进行Realtime qPCR检测脂肪细胞能量代谢调控相关基因进行定量分析，以PPIA基因作为内参，采用ΔΔCT法计算mRNA相对表达差异。使用GraphPad Prism8进行数据分析，表示为平均值（average）±标准差（SD），采用t检验比较计算差异情况，当 P<0.05时被认为是有显著差异的。*表示 P<0.05；**表示 P<0.01；***表示 P<0.001。

实验结果

由图2可见，与对照组（Vehicle）相比，FAQPEILIGTIPGAGGTQR肽（50μM）处理后棕色和白色脂肪细胞中Ucp1 mRNA含量显著上调，Pparɑ、Pgc1ɑ、Cpt1ɑ、Cidea、Cyt-c这5种基因转录表达也有所增加，提示FAQPEILIGTIPGAGGTQR肽处理可显著提高棕色脂肪细胞及白色脂肪细胞能量代谢相关基因转录水平，促进棕色脂肪细胞及白色脂肪细胞能量代谢。

实施例3

Seahorse检测FAQPEILIGTIPGAGGTQR肽对棕色脂肪和白色脂肪细胞能量代谢功能的影响

实验方法

按照每孔5×10⁴细胞数量将棕色和白色脂肪前体细胞均匀种植于Seahorse细胞培养板中，参考上述方法培养、诱导分化及处理棕色脂肪细胞及白色脂肪细胞（肽浓度为50μM）6小时后，将脂肪细胞诱导分化液II换为seahorse检测液，于无CO₂、37℃的孵箱孵育1小时，同时将按说明书稀释好的oligomycin (OL)，FCCP，Rotenone/AntimycinA (Rot)分别配成10μM、10μM及5μM浓度，将三种药物加入seahorse探针板的A孔、B孔、C孔中，最后根据XF细胞通量分析仪使用说明书来完成两种脂肪细胞耗氧量的检测，以评估FAQPEILIGTIPGAGGTQR肽（50μM）处理对棕色脂肪细胞及白色脂肪细胞线粒体功能产生的影响。使用GraphPad Prism8进行数据分析，并表示为平均值±标准差（SD）。采用t检验比较计算差异情况，当 P<0.05时被认为是有显著差异的。*表示 P<0.05；**表示 P<0.01；***表示 P<0.001。

实验结果

由图3可见，与对照组（Vehicle）相比，FAQPEILIGTIPGAGGTQR肽在50μM展现出对棕色和白色脂肪细胞线粒体整体功能的促进作用，细胞基础代谢能力（Basal）、ATP生成（ATPproduction）、最大呼吸熵（Maximal respiration）、质子漏（Proton leak）4种线粒体产热功能的相关耗氧指标显著增强，其中线粒体产热功能的上调是提高脂肪细胞能量代谢的重要方式。

实施例4

CCK8检测FAQPEILIGTIPGAGGTQR肽处理对棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞活力的影响

实验方法

取处于对数生长期的棕色和白色脂肪前体细胞均匀种植于96孔细胞培养板中（细胞数大致为10³个细胞数），细胞培养板四周不种植细胞（减少温度影响），加入预热至37℃的PAM完全培养基（已提前按说明书加入1%的P/S、1%的PAGS及5%的FBS）培养细胞，37℃、5%CO₂培养箱培育12小时，后将PAM完全培养基换成含有浓度为50μM的FAQPEILIGTIPGAGGTQR肽的PAM完全培养基干预细胞，多肽干预12h、24h、48h及72h后加入CCK8试剂（10μl/孔），1-4小时后使用酶标仪检测在450nm处的细胞吸光度，以0h 数据作为标准化参照，绘制细胞的生长曲线，获得肽对细胞增值能力的影响。使用GraphPad Prism8进行数据分析，并表示为平均值±标准差（SD）。采用t检验比较计算差异情况，当 P<0.05时被认为是有显著差异的。*表示 P<0.05；**表示 P<0.01；***表示 P<0.001。

实验结果

由图4可见，与对照组（Vehicle）相比，不同时间点（12h、24h、48h及72h），FAQPEILIGTIPGAGGTQR肽以50μM浓度处理棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞后的吸光度值没有明显差异，肽对棕色脂肪前体细胞及白色脂肪前体细胞增值速率没有影响。

需要说明的是，以上内容仅仅说明了本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

序列表

<110> 南京市妇幼保健院

<120> 一种棕色脂肪分泌肽在促进脂肪细胞能量代谢中的作用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Phe Ala Gln Pro Glu Ile Leu Ile Gly Thr Ile Pro Gly Ala Gly Gly

1 5 10 15

Thr Gln Arg

<210> 2

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gln Phe Ala

1 5 10 15

Gln Pro Glu Ile Leu Ile Gly Thr Ile Pro Gly Ala Gly Gly Thr Gln

20 25 30

Arg

Claims

1.一种棕色脂肪细胞分泌肽制备促进脂肪细胞能量代谢的药物的用途，其特征在于，所述脂肪细胞包括白色脂肪细胞、棕色脂肪细胞，所述棕色脂肪细胞分泌肽通过促进UCP1蛋白的表达及Pparɑ、Pgc1ɑ、Cpt1ɑ、Cidea、Cyt-c基因的表达提供细胞代谢能力，所述棕色脂肪细胞分泌肽的序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的一种棕色脂肪细胞分泌肽制备促进脂肪细胞能量代谢的药物的用途，其特征在于，所述棕色脂肪细胞分泌肽发挥作用的浓度为10-50μM。

3.一种棕色脂肪细胞分泌肽衍生物制备促进脂肪细胞能量代谢的药物的用途，其特征在于，所述脂肪细胞包括白色脂肪细胞、棕色脂肪细胞，所述棕色脂肪细胞分泌肽衍生物通过促进UCP1基因的表达及Pparɑ、Pgc1ɑ、Cpt1ɑ、Cidea、Cyt-c基因的表达提供细胞代谢能力；

所述棕色脂肪细胞分泌肽衍生物为包含如SEQ ID NO.1所示的活性氨基酸序列的嵌合肽，所述嵌合肽由棕色脂肪细胞分泌肽与细胞穿膜肽连接形成。

4.根据权利要求3所述的一种棕色脂肪细胞分泌肽衍生物制备促进脂肪细胞能量代谢的药物的用途，其特征在于，所述棕色脂肪细胞分泌肽衍生物发挥作用的浓度为1-50μM。

5.一种促进脂肪细胞能量代谢的组合物，其特征在于，包含如权利要求1-4任一项所述的棕色脂肪细胞分泌肽和/或棕色脂肪细胞分泌肽衍生物，以及其他药学上可接受的载体或赋形剂。

6.根据权利要求5所述的一种促进脂肪细胞能量代谢的组合物，其特征在于，所述其他药学上可接受的载体包括纳米材料、脂质体、水凝胶、细胞外囊泡，所述其他药学上可接受的赋形剂包括甘露醇、乳糖、氯化钠。

7.根据权利要求6所述的一种促进脂肪细胞能量代谢的组合物，其特征在于，所述组合物的形式包括药物、保健品或食品添加物。

8.根据权利要求6所述的一种促进脂肪细胞能量代谢的组合物，其特征在于，所述组合物通过口服或注射的方式施用。