CN110461344A - 用于治疗新生儿hie的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预防或治疗新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)的药物组合物，其包含作为活性成分的经凝血酶处理的干细胞或由其衍生的外泌体，和涉及其制备方法。根据本发明，与未用经凝血酶处理的组相比，经凝血酶处理的干细胞或由其衍生的外泌体具有增加的生长因子、免疫调节因子、抗氧化因子或再生因子的表达，并且还增强神经元凋亡抑制作用，因此，其优点在于其对新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)的治疗效果优异。

Description

用于治疗新生儿HIE的组合物
技术领域
本发明涉及用于预防或治疗新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)的药物组合物，其包括作为活性成分的经凝血酶处理的干细胞或由其衍生的外泌体(exosome)，和涉及其制备方法。
背景技术
据报道，新生儿HIE占所有新生儿死亡原因的23％，在严重损伤的情况下，约50％至100％的患者死亡，而幸存者中的65％至75％在其一生中持续患有严重的运动/认知障碍、抽搐等。目前唯一的HIE治疗方法是治疗性低温疗法，但其效果微不足道，因此约44％的接受治疗性低温治疗的患者死亡或患有长期神经系统后遗症，而治疗性低温治疗没有改善效果，特别是对严重的类型没有改善效果。因此，由于难以治愈，新生儿HIE的有效且重要的治疗方法的开发是非常重要和迫切的要求。
此外，由于尽管有各种政府支持政策，韩国的低生育率并未增加，因此降低新生儿的疾病发病率将是增加未来有效经济人口的最有效和最可靠的方法。新生儿HIE占新生儿死亡总数的很大一部分并且在其一生中引起严重的并发症，因此，在低生育率国家迫切需要开发用于治疗新生儿HIE的下一代高效治疗剂。
同时，干细胞被认为是参与组织的再生、治疗和免疫应答以及它们的分化潜能的细胞，因此已经努力利用这些特征从脐带血或骨髓中分离和培养间充质干细胞，开发它们作为各种疾病和症状的治疗剂。然而，使用干细胞本身的这种方法具有以下限制和副作用。
首先，基本上，细胞治疗剂可能不排除由于DNA转移引起的致瘤性的可能性；其次，因为干细胞具有大的尺寸，可能发生血管阻塞或心肌梗塞；第三，在使用同种异体细胞(如脐带血)的移植(同种异体移植)中由于细胞表面抗原导致存在排斥问题；第四，细胞治疗剂通常难以制备，并且在储存和运输方面具有许多限制并且生产成本高。因此，由于干细胞的固有限制，已经开发了使用基因操作提高功效的方法作为减少副作用和改善治疗效果的方法(韩国未审查专利申请号10-2017-0099382等)，但是迄今没有明确的替代方案。
外泌体是由各种细胞分泌的膜结构的小囊泡(直径约30至100nm)，其不直接从质膜分离，而是源自称为多泡体(MVB)的特定细胞内区室并且被释放和分泌到细胞外，可在电子显微镜研究中观察到。换句话说，当MVB与质膜融合时，囊泡被释放到细胞外环境中，称为外泌体。尽管尚不清楚这些外泌体产生的分子机制，但已知各种类型的免疫细胞(包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、树突细胞、血小板和巨噬细胞以及红细胞、肿瘤细胞和干细胞)在存活状态下产生和分泌外泌体。
特别地，已知干细胞衍生的外泌体含有核组分以及受体和蛋白质，因此参与细胞间通讯。另外，干细胞来源的外泌体相对含有比干细胞少的动物血清，因此也可以排除由动物血清感染引起的症状(人畜共患病)的风险。考虑到这些外泌体的特征，使用外泌体的细胞疗法有望成为克服现有干细胞疗法局限性的新范例。
发明内容
[技术问题]
因此，发明人为克服现有干细胞治疗剂的局限性并提高新生儿HIE治疗功效而进行深入研究的结果证实了经凝血酶处理的干细胞/外泌体不仅维持现有幼稚干细胞的细胞稳定性以及通过分泌各种生长因子而具有增强的功效，而且与幼稚干细胞相比，还具有增强的抗神经细胞死亡的保护作用，因此完成了本发明。
因此，本发明涉及提供用于预防或治疗新生儿HIE的药物组合物，其包括经凝血酶处理的干细胞或由其衍生的外泌体。
然而，本发明要解决的技术问题不限于上述问题，本领域普通技术人员从以下描述中将充分理解本文未描述的其他问题。
[技术方案]
本发明提供用于预防或治疗新生儿HIE的药物组合物，其包括作为活性成分的经凝血酶处理的干细胞或由其衍生的外泌体。
在本发明的一示例性实施方案中，干细胞选自间充质干细胞，人组织来源的间充质基质细胞，人组织来源的间充质干细胞和多能干细胞。
在本发明的另一示例性实施方案中，间充质干细胞衍生自脐带，脐带血，骨髓，脂肪，肌肉，神经，皮肤，羊膜或胎盘。
在本发明的又一示例性实施方案中，新生儿HIE的治疗的特征在于抑制神经细胞死亡。
在本发明的又一示例性实施方案中，将药物组合物施用于受试者的脑室或血管中。
在本发明的又一示例性实施方案中，药物组合物还包含选自培养基，细胞因子，生长因子和基因的附加成分。
在本发明的另一示例性实施方案中，与未经凝血酶处理的组相比，经凝血酶处理的干细胞或由其衍生的外泌体增加表达生长因子、免疫调节因子、抗氧化因子或再生因子。
在本发明的另一示例性实施方案中，生长因子是脑源性神经营养因子(BDNF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，肝细胞生长因子(HGF)，神经生长因子(NGF)或血管内皮生长因子(VEGF)。
此外，本发明提供用于预防或治疗新生儿HIE的药物制剂，其含有该组合物。
在本发明的一示例性实施方案中，所述制剂为注射、输注或喷雾形式。
在本发明的另一示例性实施方案中，所述制剂还包含药学上可接受的载体。
此外，本发明提供了制备含有所述外泌体的药物组合物的方法，其包括：(a)培养干细胞，然后用凝血酶处理所述细胞；(b)从步骤(a)的培养液中分离外泌体；和(c)制备含有作为活性成分的在步骤(b)中分离的外泌体的组合物。
在本发明的一示例性实施方案中，步骤(a)的凝血酶以1至1000单位/mL的浓度包含在培养基中。
在本发明的另一示例性实施方案中，对步骤(c)中的外泌体进行离心。
在本发明的又一示例性实施方案中，离心在5000至500000g下进行10分钟至5小时。
此外，本发明提供预防或治疗新生儿HIE的方法，其包括将经凝血酶处理的干细胞或由其衍生的外泌体施用于受试者。
此外，本发明提供经凝血酶处理的干细胞或由其衍生的外泌体用于预防或治疗新生儿HIE的用途。
[有益效果]
根据本发明，与未经凝血酶处理的组相比，经凝血酶处理的干细胞或由其衍生的外泌体增加表达生长因子、免疫调节因子、抗氧化因子或再生因子，并且改善了对神经细胞死亡的抑制作用，因此，仅使用少量，对新生儿HIE的治疗效果极佳。因此，本发明可以显著降低治疗剂的生产成本。
由于本发明的基于外泌体的治疗剂是无细胞制剂，没有DNA，因此肿瘤发生的风险低，并且没有细胞表面抗原，因此不存在移植排斥的问题。另外，由于本发明的基于外泌体的治疗剂比细胞小，因此在全身给药中不存在阻塞微血管的风险，并且由于本发明的基于外泌体的治疗剂是分离的材料，而不是细胞，因此它可以作为现成的产品开发，从而可以降低生产成本。
因此，根据本发明，本发明的基于外泌体的治疗剂可以解决常规干细胞治疗剂的问题，并且显著提高治疗功效，因此可以用于治疗新生儿HIE。
附图简要说明
图1显示TEM成像分析的结果，证实了通过用凝血酶处理干细胞来激活外泌体分泌。
图2显示了蛋白质印迹结果，确认了作为外泌体标志物的CD63和CD9是否在经凝血酶处理的干细胞衍生的外泌体中正常表达。
图3显示免疫测定结果，证实由于凝血酶处理，干细胞和外泌体中生长因子(BDNF，FGF，HGF，NGF和VEGF)和抗炎细胞因子(IL-6)的表达增加。
图4显示MTT测定结果，其显示在体外HIE模型中经凝血酶处理的干细胞对神经细胞死亡的抑制作用。
图5显示MTT测定结果，其显示在体外HIE模型中经凝血酶处理的干细胞衍生的外泌体对神经细胞死亡的抑制作用。
图6a和6b显示使用动物模型证实经凝血酶处理的干细胞的HIE治疗效果的结果。
具体实施方式
本发明提供用于预防或治疗新生儿HIE的药物组合物，其包括作为活性成分的经凝血酶处理的干细胞或由其衍生的外泌体。
本文使用的“干细胞”是指具有自我复制能力和分化成两种或更多种不同类型细胞的能力的未分化细胞。本发明的干细胞可以是自体或同种异体干细胞，并且可以源自任何种类的动物，例如人或非人哺乳动物，或源自成人或胚胎，但是本发明不限于此。
本发明的干细胞可包括胚胎干细胞或成体干细胞，优选成体干细胞。成体干细胞可以是间充质干细胞，人组织来源的间充质基质细胞，人组织来源的间充质干细胞或多能干细胞，且优选为间充质干细胞，但本发明不限于此。间充质干细胞可以源自脐带，脐带血，骨髓，脂肪，肌肉，神经，皮肤，羊膜或胎盘，但是本发明不限于此。
本文使用的“脐带血”是指从连接胎盘和胎儿的脐静脉获得的血液。脐带血是出生时天然存在的副产品，比一般需要多次手术的间充质组织更容易获得，并且由于脐带血储存行业活跃且基础设施已经建立，因此相比于骨髓移植，更容易获得供体。此外，由于脐带血来源的细胞是不表达组织相容性抗原HLA-DR(II类)(其是组织或器官移植中排斥的最主要原因)的细胞，因此它不会引起或可以最小化免疫反应(如排斥，其是移植中的常见问题)，因此，也可以使用同种异体脐带血以及自体脐带血。
本文使用的“外泌体”是指由各种细胞分泌的膜结构的小囊泡(直径约30至100nm)，并且由于MVB和质膜的融合，囊泡释放到细胞外环境中。外泌体包括天然存在的外泌体或人工分泌的外泌体。
本文使用的“缺氧缺血性脑病(HIE)”是指大脑中由于严重缺氧而改变脑功能或结构的病症，尽管这种情况可能是暂时的并且患者可能从中恢复，但是有时发生不可逆转且永久性的损伤。
本文使用的“预防或治疗HIE”包括减轻、缓解和改善HIE的症状，以及降低HIE的发病率。
本文使用的“经凝血酶处理的干细胞”相比于未处理的干细胞，可以具有增强的干细胞功能/功效，这是由于(作为干细胞的主要作用机制的)旁分泌性能的增加，而细胞稳定性(如细胞活力，氧化功能等)没有发生变化。此外，凝血酶处理不仅增强了源自干细胞的外泌体的治疗功效，而且还增加了外泌体的分泌。
这里，旁分泌可以增加生长因子、免疫调节因子、抗氧化因子或再生因子，特别是，生长因子是指促进细胞分裂、生长或分化的蛋白质样生理活性物质，可以包括BDNF、FGF、HGF、NGF、VEGF和白细胞介素-6(IL-6)。
本发明的药物组合物可以通过各种途径施用于受试者，但不限于例如通过口服或胃肠外给药，并且优选施用于脑室或血管。
本发明的药物组合物可以进一步含有一种或多种具有HIE治疗效果的已知附加成分。例如，本发明的药物组合物可以进一步包括一种或多种附加成分，其选自在HIE治疗中有效的基因(例如，抗炎细胞因子基因、siRNA或用于炎性细胞因子的反义引物)或包含所述基因的表达载体、提供自分泌或旁分泌作用的细胞因子(例如白细胞介素-10)、生长因子(例如，角质形成细胞生长因子)及其组合。
本发明药物组合物的优选剂量可取决于受试者的状况和体重、疾病的严重程度、药物类型、给药途径和给药持续时间，并且可由本领域普通技术人员适当选择。所述组合物可以每天给药一次或以分剂量给药，但本发明不限于此。
对于HIE治疗，本发明的药物组合物可以独立使用，或与手术、放射疗法、激素疗法、化学疗法和使用生物反应调节剂的方法组合使用。
本发明的组合物可进一步包括常规用于制备药物组合物的合适载体。例如，在注射制剂的情况下，可以进一步包括防腐剂、止痛剂、增溶剂或稳定剂，并且在局部给药制剂的情况下，可以进一步包括基质(base)、赋形剂、润滑剂或防腐剂。
本发明的组合物可以通过配制成单位剂量制剂来制备，适合用于根据制药领域中的常规方法施用至受试者的身体。用于上述目的的合适形式优选包括可注射制剂(例如注射用安瓿)，包含在输液袋中的输注制剂，和喷雾制剂(例如气雾剂)，作为肠胃外给药制剂。注射用安瓿可以通过在即将使用前与注射液混合来配制，并且可以使用生理盐水、葡萄糖或林格氏溶液作为注射液。另外，输液袋可以由聚氯乙烯或聚乙烯制成。在本发明中，施用(或给药)是指通过任何合适的方法向受试者提供本发明的预定组合物。
本发明药物组合物的优选剂量根据受试者的状况和体重、疾病的严重程度、药物类型、给药途径或给药持续时间而变化，并且可以由本领域普通技术人员适当选择。组合物的施用可以每天进行一次或分剂量进行，但是本发明不限于此。
此外，本发明提供了制备含有外泌体的药物组合物的方法，其包括：(a)培养干细胞，然后用凝血酶处理所述细胞；(b)从步骤(a)的培养液中分离外泌体；和(c)制备含有作为活性成分的在步骤(b)中分离的外泌体的组合物。
在本发明中，凝血酶处理的浓度可以足以增强干细胞/外泌体的功效而没有特别限制，并且优选在培养基中为1至1000单位/mL。
在本发明中，对分离外泌体的方法没有限制，从培养液中分离外泌体可以通过离心、超速离心、通过过滤器过滤、凝胶过滤色谱、自由流动电泳、毛细管电泳、使用聚合物分离或其组合进行，且优选通过离心/超速离心进行。这里，离心/超速离心可以在4℃和在5000至500000g下进行10分钟至5小时。
本文使用的“细胞培养中使用的培养基”是指用于细胞(例如干细胞)体外生长和增殖的混合物，该混合物包括细胞生长和增殖的必需因子，例如葡萄糖、氨基酸、各种营养素、血清、生长因子和矿物质。能够用于本发明的培养基可包括商业生产或人工合成的培养基，例如Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)，最低必需培养基(MEM)，Eagle基础培养基(BME)，RPMI1640，Dulbecco改良的Eagle培养基：营养混合物F-10(DMEM/F-10)，Dulbecco改良的Eagle培养基：营养混合物F-12(DMEM/F-12)，α-最小必需培养基(α-MEM)，格拉斯哥最小必需培养基(G-MEM)，Isocove改良Dulbecco培养基(IMDM)和KnockOutDMEM，但是本发明不限于此。
在下文中，为了帮助理解本发明，将提出示例性实施例。然而，仅提供以下实施例以更容易理解本发明，而不是限制本发明。
实施例
实施例1：通过用凝血酶处理干细胞诱导增强的功效
1-1.凝血酶诱导外泌体分泌
将人脐带血来源的间充质干细胞(3×105)接种在60-mm培养皿(OrangeScientific cat#4450200)上，培养1周。确认细胞在培养皿中饱和增殖后，培养基被替换成无血清培养基(MEMα培养基)(在无血清培养基中稀释50单位/mL凝血酶(REYONPharmaceutical.Co.，LTD))，将细胞再培养6小时，得到经凝血酶处理的干细胞。
然后，为了确认通过凝血酶处理是否激活间充质干细胞中的外泌体分泌，通过透射电子显微镜(TEM)图像确认了外泌体分泌的过程。结果如图1所示，可以看出凝血酶刺激诱导外泌体分泌。
另外，将培养液分配到离心管中，并在4℃和100000rpm下离心30分钟，并将上清液转移到新管中以除去细胞碎片。再次，将上清液在4℃和100000rpm下超速离心2小时，然后再次除去上清液，从而获得外泌体(终浓度：15μg/mL)。
这里，为了确认所得产物是否为外泌体，通过蛋白质印迹验证已知的外泌体标志物如CD63和CD9(System Biosciences，Mountain View，CA，USA)的表达。结果如图2所示，由经凝血酶处理的干细胞获得的外泌体正常表达CD63和CD9，从而确认了外泌体。
1-2.通过凝血酶增强干细胞/外泌体功效
已经证实了通过凝血酶处理实施例1-1中获得的干细胞和外泌体是否增加生长因子或抗炎细胞因子(如IL-6)的表达。
具体地，使用裂解缓冲液裂解细胞膜以从细胞/外泌体中分离蛋白质，并使用Procarta免疫测定试剂盒(Affymetrix，USA)测定BDNF、FGF、HGF、NGF、VEGF和IL-6水平。
结果如图3所示，与未经经凝血酶处理的干细胞或由其获得的外泌体(对照；正常)相比，通过凝血酶处理增加了BDN、FGF、HGF、NGF、VEGF和IL-6的表达。
该结果表明，由于凝血酶处理，干细胞或由其衍生的外泌体的细胞再生、血管再生和抗炎功效增强。
实施例2：新生儿HIE的体外模型的构建
在怀孕18.5天后，解剖SD大鼠的下腹部以取出胎儿，然后小心地提取整个大脑。从提取的脑组织中小心地仅分离出大脑皮层，使用移液管分离成单个细胞，然后在神经细胞培养溶液中培养。培养10天后，将细胞在1％低氧条件下暴露于无葡萄糖培养基中(氧和葡萄糖剥夺(OGD))60分钟，从而构建新生儿HIE的体外模型。
实施例3：经凝血酶处理的干细胞对神经细胞死亡的体外抑制作用
用实施例1中获得的经凝血酶处理的干细胞处理实施例2中构建的体外新生儿HIE模型，然后通过MTT测定评估神经细胞活力。
结果如图4所示，与正常神经细胞(NC)相比，在体外HIE模型(OGD)中，神经细胞死亡由于氧/葡萄糖剥夺而显著增加，而与未经凝血酶处理的干细胞组(OGD+幼稚MSC)或缺氧预处理的干细胞组(OGD+MSC缺氧pre)相比，在“凝血酶预处理的干细胞处理的体外新生儿HIE组(OGD+MSC_凝血酶pre)”中，神经细胞死亡受到相当大的抑制，证明了经凝血酶处理的干细胞表现出最优异的神经细胞保护作用。
实施例4：经凝血酶处理的干细胞衍生的外泌体对神经细胞死亡的体外抑制作用
用实施例1中获得的经凝血酶处理的干细胞衍生的外泌体处理实施例2中构建的体外新生儿HIE模型，并通过MTT测定评估神经细胞活力。
结果如图5所示，与正常神经细胞(NC)相比，在体外HIE模型(OGD)中，由于氧/葡萄糖剥夺，神经细胞死亡显著增加，而与未经凝血酶处理的干细胞衍生的外泌体处理组(OGD+来自幼稚MSC的EV)或缺氧预处理的干细胞衍生的外泌体处理组(OGD+来自MSC_缺氧pre的EV)相比，在“凝血酶预处理的干细胞衍生的外泌体处理的新生儿HIE组(OGD+来自MSC_凝血酶pre的EV)”中证实了神经细胞死亡被显著抑制。
因此，与本发明的经凝血酶处理的干细胞一样，还证实由其衍生的外泌体显示出优异的神经细胞保护作用。
实施例5：验证经凝血酶处理的干细胞在HIE上的治疗活性(体内)
为了使用动物模型确认经凝血酶处理的干细胞对HIE的治疗活性，如下进行实验。
目前，治疗性低温疗法是临床上用于治疗HIE的唯一姑息疗法。因此，在动物实验中，与临床环境类似，在诱导HIE并且动物模型接受治疗性低温疗法后，确认疾病是否得到改善，同时进一步加入干细胞用于联合治疗，并且针对实验分组如下：
(1)NC：正常对照
(2)HIE+S：患病对照(诱导疾病后，用生理盐水治疗)
(3)HIE+H+WJ：HIE诱导并用低温治疗后用未经凝血酶处理的干细
胞治疗
(4)HIE+H+Th.WJ：HIE诱导并用低温治疗后用经凝血酶处理的干细
胞治疗
结果如图6a和6b所示，与正常NC组相比，证实在所有疾病诱导的HIE组中，脑损伤区域显著增加。在HIE诱导后进行低温预处理然后用未经凝血酶处理的干细胞处理的组中，受损区域趋于改善，但没有显著性。然而，在经凝血酶处理的干细胞治疗组中，受损区域趋于进一步改善，具有显著性。
本领域普通技术人员应该理解，本发明的上述描述是示例性的，并且在不脱离本发明的技术精神或本质特征的情况下，可以容易地将本文公开的示例性实施例修改为其他特定形式。因此，上述示例性实施例应被解释为说明性的而不限于任何方面。
[工业实用性]
根据本发明的经凝血酶处理的干细胞或由其衍生的外泌体，即使是少量，对新生儿HIE的治疗效果也是优异的，可以解决传统干细胞治疗剂的问题，并且它们的治疗效果可以得到显著改善。因此，根据本发明的经凝血酶处理的干细胞或由其衍生的外泌体可有效地治疗新生儿HIE。

Claims (17)

1.一种用于预防或治疗新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)的药物组合物，其包含作为活性成分的经凝血酶处理的干细胞或由其衍生的外泌体。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述干细胞选自间充质干细胞、人组织来源的间充质基质细胞、人组织来源的间充质干细胞和多能干细胞。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述间充质干细胞衍生自脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜或胎盘。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中新生儿HIE的治疗的特征在于抑制神经细胞死亡。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其被施用于脑室或血管中。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，还包含选自培养基、细胞因子、生长因子和基因的附加成分。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中与未经凝血酶处理的组相比，所述经凝血酶处理的干细胞或由其衍生的外泌体增加生长因子、免疫调节因子、抗氧化因子或再生因子的表达。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述生长因子是脑源性神经营养因子(BDNF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、神经生长因子(NGF)或血管内皮生长因子(VEGF)。
9.一种用于预防或治疗新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)的药物制剂，其包含如权利要求1所述的组合物。
10.根据权利要求9所述的药物制剂，其为注射、输注或喷雾形式。
11.根据权利要求9所述的药物制剂，还包含药学上可接受的载体。
12.一种制备如权利要求1所述的含外泌体的药物组合物的方法，其包括：
(a)培养干细胞，然后用凝血酶处理所述细胞；
(b)从步骤(a)的培养液中分离外泌体；和
(c)制备含有在步骤(b)中分离的所述外泌体作为活性成分的组合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(a)中的所述凝血酶以1至1000单位/mL的浓度包含在培养基中。
14.根据权利要求12所述的方法，其中将步骤(c)中的所述外泌体进行离心。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述离心在5000至500000g下进行10分钟至5小时。
16.一种预防或治疗新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)的方法，其包括将经凝血酶处理的干细胞或由其衍生的外泌体施用于受试者。
17.经凝血酶处理的干细胞或由其衍生的外泌体用于预防或治疗新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)的用途。
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