WO2023200002A1 - 細胞外小胞集団の製造方法及び細胞外小胞集団 - Google Patents

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WO2023200002A1
WO2023200002A1 PCT/JP2023/015157 JP2023015157W WO2023200002A1 WO 2023200002 A1 WO2023200002 A1 WO 2023200002A1 JP 2023015157 W JP2023015157 W JP 2023015157W WO 2023200002 A1 WO2023200002 A1 WO 2023200002A1
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extracellular
extracellular vesicles
stem cells
vesicle population
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竜幸 山下
孝一 本家
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国立大学法人高知大学
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    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to an extracellular vesicle population containing extracellular vesicles in which phosphatidylserine on the membrane surface is poorly expressed, and a method for producing the same.
  • exosomes which are one type of extracellular vesicles (EVs) secreted by cells, and are particularly secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) present in bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord tissue. It has been reported that exosomes have therapeutic effects on various tissue damage and diseases (Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 1).
  • Patent Documents 3 and 4 It has been reported that when bone marrow-derived mesenchymal stem cells are stimulated with sulfated glycolipid sulfatide, secretion of exosomes, which are one type of extracellular vesicles, is promoted (Non-Patent Document 2).
  • the membranes that make up EVs such as exosomes are derived from the cell membranes that secrete them.
  • the membrane of EVs contains phosphatidylserine, which is a type of phospholipid, in a larger proportion than that of cells, and it is exposed on the outside of the membrane (Non-Patent Document 3).
  • phosphatidylserine is oriented inside the cell membrane by the action of an enzyme called flippase.
  • Non-Patent Documents 4 and 5 When cells undergo apoptosis, phosphatidylserine becomes oriented on the outside of the cell membrane, and microglia and macrophages recognize this and phagocytose the apoptotic cells (for example, Non-Patent Documents 4 and 5). Therefore, EVs with phosphatidylserine exposed on the outside of the membrane are captured by microglia and macrophages that recognize phosphatidylserine, similar to apoptotic cells, before they reach the site where they want to exert their therapeutic effect. , may be phagocytosed. Therefore, the therapeutic effect of EVs administration may be reduced.
  • the purpose of the present invention is to provide an extracellular vesicle that can reach a desired treatment site and exert a therapeutic effect, and a method for producing the same.
  • sulfated compounds e.g., sulfated glycolipids or cholesterol sulfate
  • they not only promoted the secretion of EVs but also almost completely released phosphatidylserine. It was discovered that EVs that do not contain
  • the EVs so obtained can exhibit a significant therapeutic effect on HIE model mice compared to EVs released in the absence of sulfated compounds. Based on these new findings, we have completed the present invention.
  • a method for producing an extracellular vesicle population containing extracellular vesicles with low expression of phosphatidylserine on the membrane surface comprising: (1) a step of culturing animal cells in a medium containing one or more sulfate compounds selected from the group consisting of sulfated glycolipids, cholesterol sulfate, and pharmaceutically acceptable salts thereof; and (2) the step (1). ) collecting the extracellular vesicle population contained in the medium after performing including methods.
  • the sulfated glycolipid is one or more selected from the group consisting of sulfatides and seminolipids.
  • the animal cell is a cell that highly expresses Growth Differentiation Factor-15 (GDF-15).
  • GDF-15 Growth Differentiation Factor-15
  • the GDF-15 highly expressing cells are mesenchymal cells, female germline cells, bone marrow-derived cells, endothelial cells, liver cells, renal cancer-derived cells, or neuroblastoma-derived cells. The method described in 3.
  • the GDF-15 highly expressing cells are mesenchymal stem cells.
  • the mesenchymal stem cells are obtained by inducing differentiation from mesenchymal stem cells and/or pluripotent stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, umbilical cord, dental pulp, synovium, placenta, and/or egg membrane.
  • the method according to item 5, wherein the mesenchymal stem cells are [7]
  • the method according to item 5, wherein the mesenchymal stem cells are umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
  • the content of phosphatidylserine is 0.5 times that of the extracellular vesicles secreted from the animal cells cultured in the absence of the sulfate compound.
  • GDF-15 Growth Differentiation Factor-15
  • the extracellular vesicle according to item 16 wherein the GDF-15 highly expressing cells are mesenchymal stem cells, female germline cells, bone marrow-derived cells, renal cancer-derived cells, or neuroblastoma-derived cells. group.
  • the extracellular vesicle population according to item 16, wherein the GDF-15 highly expressing cells are mesenchymal stem cells.
  • the mesenchymal stem cells are obtained by inducing differentiation from mesenchymal stem cells and/or pluripotent stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, umbilical cord, dental pulp, synovium, placenta, and/or egg membrane.
  • the extracellular vesicle population according to item 18, wherein the mesenchymal stem cells are umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
  • the phosphatidylserine content is a non-sulfated compound selected from one or more of the group consisting of sulfated glycolipids, cholesterol sulfate, and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • the extracellular vesicle population according to any one of items 15 to 20, which is 0.5 times or less as compared to the extracellular vesicles secreted from the animal cells cultured in the presence of the extracellular vesicles.
  • Outer vesicle population [23] The extracellular vesicle population according to any one of items 15 to 22, wherein the extracellular vesicle population is used for treating a nervous system disease. [24] The extracellular vesicle population according to item 23, wherein the nervous system disease is ischemic encephalopathy or traumatic brain injury. [25] The method according to any one of items 15 to 24, wherein the extracellular vesicle population contains extracellular vesicles highly containing microRNA selected from the group consisting of miR-17 and miR-106. Extracellular vesicle population.
  • the present invention has made it possible to provide extracellular vesicles that express low levels of phosphatidylserine on the membrane surface, unlike EVs known so far. This has made it possible to provide extracellular vesicles that can reach desired sites and exert their effects without being captured by phagocytic cells such as microglia and macrophages. Furthermore, the present invention has made it possible to provide an extracellular vesicle population capable of curing nervous system diseases that have hitherto been difficult to treat, such as intractable central nervous system disorders.
  • FIG. 1 shows the results of comparing the effects of the presence or absence of sulfatide on the amount of extracellular vesicles (EVs) secreted from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
  • FIG. 2 shows the results of comparing the effects of different amounts of sulfatide added on the amount of extracellular vesicles (EVs) secreted from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
  • FIG. 3 shows the results of comparing the effects of different added sulfuric compounds on the amount of extracellular vesicles (EVs) secreted from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
  • Figure 4 shows extracellular vesicles obtained by culturing human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in the presence or absence of sulfatide and purifying the culture supernatant using ultracentrifugation or Mag Capture (trademark) Exosome Isolation Kit PS. The results of comparing the expression of marker proteins of (EVs) are shown.
  • Figure 5 shows extracellular vesicles obtained by culturing human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in the presence or absence of sulfatide and purifying the culture supernatant using ultracentrifugation or Mag Capture (trademark) Exosome Isolation Kit PS.
  • FIG. 6 shows a fluorescently stained image of a tissue section of the coronal surface of the lateral ventricle of a HIE model mouse to which extracellular vesicles (EVs) obtained from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells supplemented with sulfatide were administered through the tail vein.
  • Green GFAP (damage site (glial scar) marker
  • red pKH26-labeled EVs.
  • FIG. 7 shows a fluorescently stained image of a tissue section of the coronal hippocampus of a HIE model mouse to which extracellular vesicles (EVs) obtained from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells supplemented with sulfatide were administered through the tail vein.
  • Green GFAP (damage site (glial scar) marker
  • red pKH26-labeled EVs.
  • FIG. 8 shows a fluorescently stained image of a tissue section of the coronal surface of the lateral ventricle of a normal mouse to which extracellular vesicles (EVs) obtained from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells supplemented with sulfatide were administered through the tail vein.
  • Figure 9 shows a fluorescent staining image of a tissue section of the coronal surface of the lateral ventricle of a HIE model mouse to which extracellular vesicles (EVs) obtained from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells supplemented with sulfatide were intranasally administered. .
  • FIG. 10 shows a fluorescently stained image of a tissue section of the coronal surface of the lateral ventricle of a HIE model mouse to which extracellular vesicles (EVs) obtained from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells without the addition of sulfatide were intranasally administered. show. Green: GFAP (damage site (glial scar) marker), red: pKH26-labeled EVs.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing changes in the properties of extracellular vesicles (EVs) obtained from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells depending on the presence or absence of sulfatide.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing changes in the properties of extracellular vesicles (EVs) obtained from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells depending on the presence or absence of sulfatide.
  • FIG. 12 shows the motor function recovery effect (Rotarod test) of extracellular vesicles (EVs) on normal mice or HIE model mice.
  • FIG. 13 shows the neural differentiation-promoting effect of extracellular vesicles (EVs) obtained from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells cultured in a medium with or without sulfatide on mouse neural stem cells.
  • FIG. 14 shows the results of quantifying microRNA contained in extracellular vesicles (EVs) obtained from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells cultured in a medium with or without sulfatide.
  • FIG. 15 shows the inhibition of miR-17/106a target molecules in neuroblastoma cells SHSY5Y by the addition of extracellular vesicles (EVs) obtained from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells cultured in medium with or without sulfatide. Showing the effects of expression.
  • FIG. 16 shows the results of detecting GDF-15 protein contained in extracellular vesicles (EVs) obtained from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells cultured in a medium with or without sulfatide.
  • FIG. 17 shows the relationship between the amount of sulfatide added to the medium and the amount of GDF-15 contained in extracellular vesicles (EVs) obtained from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
  • Figure 18 shows the relationship between the culture time after addition of sulfatide into the medium and the amount of GDF-15 contained in extracellular vesicles (EVs) obtained from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
  • FIG. 19 shows the results of comparing the effects of different sulfate compounds added on the amount of GDF-15 contained in extracellular vesicles (EVs) from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
  • FIG. 20 shows the results of comparing the effects of sulfated glycolipid seminolipid on the amount of GDF-15 contained in extracellular vesicles (EVs) from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
  • FIG. 19 shows the results of comparing the effects of different sulfate compounds added on the amount of GDF-15 contained in extracellular vesicles (EVs) from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
  • FIG. 20 shows the results of comparing the effects of sulfated glyco
  • FIG. 21 shows the results of a search using a database ("THE HUMAN PROTEIN ATLAS") for cells that highly express GDF-15.
  • FIG. 22 shows the results of investigating whether sulfatide was added to the medium and its effect on the amount of GDF-15 contained in extracellular vesicles (EVs) obtained from K562 cells.
  • FIG. 23 shows the results of investigating whether sulfatide was added to the medium and its effect on the amount of GDF-15 contained in extracellular vesicles (EVs) obtained from multiple cancer cells.
  • FIG. 24 shows the results of comparing the amount of GDF-15 contained in extracellular vesicles (EVs) obtained from each cell.
  • the present invention provides a method for producing an extracellular vesicle population comprising extracellular vesicles with low expression of phosphatidylserine on the membrane surface (low PS extracellular vesicles),
  • the method is (1) culturing mesenchymal stem cells in a medium containing one or more sulfate compounds selected from the group consisting of sulfated glycolipids, cholesterol sulfate, and pharmaceutically acceptable salts thereof; (2) collecting the extracellular vesicle population contained in the medium after carrying out the step (1); including.
  • extracellular vesicles are particles covered with a lipid bilayer membrane secreted from cells, such as exosomes and microvesicles (MVs). , apoptotic bodies, etc.
  • extracellular vesicle population refers to a population of extracellular vesicles that includes a plurality of extracellular vesicles, and is used to distinguish it from individual extracellular vesicles.
  • Exosomes are vesicles of about 20 to about 200 nm derived from the endocytic pathway, and their constituent components are known to include proteins, nucleic acids (mRNA, miRNA, uncoated RNA, etc.), and are used for intercellular communication. It may have functions such as controlling. As there are many unknowns about the production and secretion mechanism of exosomes, it is difficult to strictly distinguish them from microvesicles (MVs), but there are some commonly known exosome marker molecules, such as Alix. , Tsg101, tetraspanins (eg, CD81, CD63, CD9), flotillin, phosphatidylserine, etc. Exosomes may be identified by using antibodies, binding proteins, etc. against these marker molecules. Note that the constituent components of exosomes are summarized in ExoCarta (http://www.exocarta.org/), and the presence or absence of the constituent components listed there may be used as an index for identification.
  • Microvesicles are vesicles of about 50 to about 1000 nm originating from the cytoplasmic membrane, and their constituent components are proteins, nucleic acids (mRNA, miRNA, non-coated RNA, etc.), and they are It can have functions such as controlling communication.
  • marker molecules for microvesicles include integrins, selectins, CD40, and CD154, and microvesicles (MVs) can be identified by using antibodies and binding proteins for these marker molecules. .
  • Apoptotic bodies are vesicles of about 500 to about 2000 nm originating from the cytoplasmic membrane, and their constituent components are known to include fragmented nuclei and organelles, which induce phagocytosis. It can have functions, etc.
  • Marker molecules for apoptotic bodies include, for example, Annexin V, phosphatidylserine, etc., and apoptotic bodies can be identified by using antibodies, binding proteins, etc. against these marker molecules.
  • the extracellular vesicles included in the present invention preferably include exosomes.
  • exosomes the distinction between types of extracellular vesicles (exosomes, microvesicles, apoptotic bodies, etc.) is not necessarily academically clarified, and it is difficult to selectively isolate specific types of extracellular vesicles. Since this is technically not easy, no matter which method is used to isolate the extracellular endoplasmic reticulum, it will usually contain exosomes. Therefore, in carrying out the present invention, the mode and conditions for isolating extracellular vesicles are not limited to those that strictly differentiate the types of extracellular vesicles and target specific ones. do not have.
  • animal cells can be cultured in a medium containing one or more sulfate compounds selected from the group consisting of sulfated glycolipids, cholesterol sulfate, and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • conventional culture methods e.g., methods of culturing animal cells in a medium that does not contain a sulfate compound selected from one or more of the group consisting of sulfated glycolipids, cholesterol sulfate, and pharmaceutically acceptable salts thereof
  • the population of extracellular vesicles provided by the present invention includes conventional extracellular vesicles (e.g., a group consisting of sulfated glycolipids, cholesterol sulfate, and pharmaceutically acceptable salts thereof).
  • conventional extracellular vesicles e.g., a group consisting of sulfated glycolipids, cholesterol sulfate, and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • the extracellular vesicle population provided by the present invention is characterized by containing extracellular vesicles in which phosphatidylserine on the membrane surface is expressed at a low level.
  • the "extracellular vesicles with low expression of phosphatidylserine on the membrane surface" are: extracellular secreted from animal cells under conventional culture conditions (e.g., in the absence of a sulfate compound selected from one or more of the group consisting of sulfated glycolipids, cholesterol sulfate, and pharmaceutically acceptable salts thereof)
  • extracellular secreted from animal cells under conventional culture conditions e.g., in the absence of a sulfate compound selected from one or more of the group consisting of sulfated glycolipids, cholesterol sulfate, and pharmaceutically acceptable salts thereof
  • the expression level of phosphatidylserine on the membrane surface is lower than that of vesicles, preferably 0.5 times or less, for example, 0.25 times or less, 0.1 times or less, 0.
  • the extracellular vesicles may express 0.05 times or less, or 0.01 times or less of phosphatidylserine.
  • the expression level of phosphatidylserine may be appropriately determined using a known method (eg, ELISA method, Western blot method, chromatography method, etc.) and is not particularly limited.
  • the "expression level" of a certain substance may also be referred to as the "content" of the substance; for example, the content of the substance may be directly measured, or any
  • the content (or expression level) of the substance in the sample to be measured may be calculated by comparison with a standard sample containing a known amount of the substance using a detection method.
  • the amount relative to that of the comparison object e.g., under conventional culture conditions (e.g., non-sulfated compounds selected from one or more of the group consisting of sulfated glycolipids, cholesterol sulfate, and pharmaceutically acceptable salts thereof) It may also be a relative expression amount (content) derived by comparison with the "expression amount" (content) of the target substance contained in extracellular vesicles secreted from animal cells in the presence of the target substance.
  • the extracellular vesicle population provided by the present invention may include extracellular vesicles in which phosphatidylserine on the membrane surface is highly expressed (high PS extracellular vesicles).
  • the extracellular vesicle population provided by the present invention includes extracellular vesicles with low expression of phosphatidylserine on the membrane surface and extracellular vesicles with high expression of phosphatidylserine on the membrane surface. vesicles (high PS extracellular vesicles).
  • the extracellular vesicle population provided by the present invention has a uneven distribution of phosphatidylserine content on the membrane surface, and a low content of phosphatidylserine on the membrane surface. (or no phosphatidylserine) and extracellular vesicles with a high content of phosphatidylserine on the membrane surface.
  • Extracellular vesicles in which phosphatidylserine is highly expressed on the membrane surface are defined as compared to extracellular vesicles secreted from animal cells (in the absence of one or more sulfate compounds selected from the group consisting of lipids, cholesterol sulfate, and pharmaceutically acceptable salts thereof). It refers to extracellular vesicles that express a high amount of phosphatidylserine, preferably 1.5 times or more, for example, 2 times or more, 3 times or more, or 4 times or more of phosphatidylserine. It may also be a vesicle.
  • the extracellular vesicle population provided by the present invention includes extracellular vesicles with high content of microRNA selected from the group consisting of miR-17 and miR-106. Additionally, in one embodiment, the extracellular vesicle population provided by the present invention can be used to treat neurological diseases.
  • the animal cells applicable to the present invention are preferably cells that highly express Growth Differentiation Factor-15 (GDF-15), for example.
  • GDF-15 Growth Differentiation Factor-15
  • Cells that highly express GDF-15 can be investigated using a known database such as "THE HUMAN PROTEIN ATLAS" (URL: https://www.proteinatlas.org/).
  • TEE HUMAN PROTEIN ATLAS URL: https://www.proteinatlas.org/.
  • tissues that highly express GDF-15 refer to the normalized expression (nTPM) value registered in the database.
  • nTPM normalized expression
  • tissues with nTPM of 50 or more (e.g., 100 or more, or 150 or more) or cells or cell lines derived from the tissues (e.g., cancer cell lines) may be selected and used. good.
  • Such cells include, for example, female germline cells (e.g., BEWO cells), bone marrow-derived cells (e.g., K562 cells, etc.), mesenchymal cells (e.g., HHSteC cells, etc.), endothelial cells (e.g., TIME cells, HUVEC cells, etc.), hepatic cells (eg, HepG2, etc.) may be used (eg, see FIG. 21). Furthermore, it may be a renal cancer-derived cell (eg, KMRC-20, etc.) or a neuroblastoma-derived cell (eg, SHSY-5Y, etc.) (see, eg, FIG. 23). Particularly preferred animal cells applicable to the present invention are mesenchymal stem cells.
  • BEWO cells e.g., BEWO cells
  • bone marrow-derived cells e.g., K562 cells, etc.
  • mesenchymal cells e.g., HHSteC cells, etc.
  • meenchymal stem cells refer to undifferentiated cells, including various types of cells such as adipocytes, chondrocytes, osteocytes, myoblasts, fibroblasts, stromal cells, and/or tendon cells.
  • adipocytes chondrocytes
  • osteocytes osteocytes
  • myoblasts fibroblasts
  • stromal cells stromal cells
  • tendon cells stromal cells
  • mesenchymal stem cells (1) ability to adhere to and culture on plastic under standard culture conditions; (2) immunological Characteristics include positive for CD105, CD73, and CD90, negative for CD45, CD34, CD14, or CD11b, CD79a or CD19, and HLA-DR; (3) osteoblasts, adipocytes, and chondroblasts in an in vitro differentiation system.
  • immunological Characteristics include positive for CD105, CD73, and CD90, negative for CD45, CD34, CD14, or CD11b, CD79a or CD19, and HLA-DR
  • osteoblasts, adipocytes, and chondroblasts in an in vitro differentiation system.
  • CD29, CD44, CD106 and STRO-1 are also mentioned as positive markers indicating mesenchymal stem cells.
  • mesenchymal stem cells are interpreted in the broadest possible manner.
  • Mesenchymal stem cells are cells isolated in vivo from tissues such as bone marrow, adipose tissue, umbilical cord, dental pulp, synovium, placenta, and ovarian membrane (e.g., amniotic membrane), and can be isolated using known methods. can be released.
  • tissues such as bone marrow, adipose tissue, umbilical cord, dental pulp, synovium, placenta, and ovarian membrane (e.g., amniotic membrane), and can be isolated using known methods. can be released.
  • bone marrow-derived mesenchymal stem cells can be obtained by separating blood cells from bone marrow fluid collected from the bone marrow using density gradient centrifugation, seeding them on plastic culture dishes, and culturing them at 37°C in a 5% CO 2 environment. can be isolated as adherent cells.
  • Adipose derived stem cells are obtained by subdividing the collected adipose tissue (mince) and treating the tissue with collagenase type II at 37°C for 1 hour. Digest, add medium and centrifuge. Thereafter, the precipitated cells were washed with basal medium, filtered through a mesh such as a cell strainer, seeded on a plastic culture dish, and cultured at 37°C in a 5% CO2 environment to isolate them as adherent cells. It is possible to do so.
  • umbilical cord-derived mesenchymal stem cells are obtained by collecting umbilical cord tissue, cutting it into small pieces, placing it on a petri dish, immersing it in a culture medium containing 10% bovine serum albumin, culturing it for 10 to 20 days, and collecting the proliferating cells. It can be isolated by doing so.
  • the method for isolating mesenchymal stem cells derived from other tissues is not limited and may be any known method. Further, the purity may be increased by using a known mesenchymal stem cell marker, for example, by FACS method or magnetic bead method.
  • the mesenchymal stem cells may be mesenchymal stem cells obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells.
  • a pluripotent stem cell is a cell that has self-renewal ability and multipotency, and refers to a cell that has the ability (pluripotent) to form all the cells that make up the body.
  • Self-renewal ability refers to the ability of one cell to produce two identical undifferentiated cells.
  • Pluripotent stem cells used in the present invention include embryonic stem cells (ES cells), embryonic carcinoma cells (EC cells), trophoblast stem cells (TS cells), shrimp Blast stem cell (EpiS cell), embryonic germ cell (EG cell), multipotent germline stem cell (mGS cell), induced pluripotency Sexual stem cells (induced pluripotent stem cells: iPS cells).
  • ES cells embryonic stem cells
  • EC cells embryonic carcinoma cells
  • TS cells trophoblast stem cells
  • EpiS cell embryonic germ cell
  • mGS cell multipotent germline stem cell
  • iPS cells induced pluripotency Sexual stem cells
  • pluripotent stem cells From pluripotent stem cells, known methods (for example, JP 2012-120486, Fukuta M., et al., Derivation of mesenchymal stromal cells from pluripotents) tem cells through a neural crest lineage using small molecule compounds with defined media.PLOS ONE , 2014; 9(12): e112291., etc.) may be used.
  • mesenchymal stem cells to be induced to differentiate may be confirmed by a known method.
  • induction of differentiation from mesenchymal stem cells into adipocytes can be confirmed by culturing in a medium supplemented with insulin and dexamethasone, and by Oil Red O staining.
  • ascorbic acid, ⁇ -glycerophosphoric acid, and dexamethasone may be added to the culture medium, and the differentiation may be confirmed by alkaline phosphatase staining.
  • differentiation induction from mesenchymal stem cells may be performed using any known method and is not particularly limited. The presence or absence of differentiation induction may be confirmed using a known method. For example, a gene or protein that is expressed only after differentiation induction may be detected by real-time PCR, a flow cytometer, or the like.
  • mesenchymal stem cells used in the present invention is not limited, but from the viewpoint of ease of acquisition and therapeutic effect on nervous system diseases, mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, or umbilical cord are used. Mesenchymal stem cells derived from the umbilical cord are preferred.
  • Animals used in the present invention include mammals such as humans, rats, mice, guinea pigs, marmosets, rabbits, dogs, cats, sheep, pigs, goats, monkeys, chimpanzees, and immunodeficient animals thereof, birds, and reptiles. , amphibians, amphibians, fish, insects, etc.
  • human-derived mesenchymal stem cells are used; when used to treat pigs, the mesenchymal stem cells are derived from pigs; when used to treat monkeys, the mesenchymal stem cells are derived from monkeys; and when used to treat chimpanzees, mesenchymal stem cells derived from chimpanzees are used. is preferred.
  • the subject to be treated is a human
  • cells collected from the patient himself/herself may be used, cells collected from someone else (allogeneic cells) may be used, or commercially available cell lines may be used. It may be.
  • mesenchymal stem cells refer to any cell population containing mesenchymal stem cells.
  • the cell population is at least 20%, preferably 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 93%, 96%, 97%, 98%. % or 99% are mesenchymal stem cells.
  • the medium used in step (1) of the present invention is not particularly limited as long as it is a medium that can culture animal cells, but for example, serum is added to a basal medium, and/or albumin, transferrin, fatty acids, etc. It may be made by adding one or more serum substitutes such as insulin, sodium selenite, cholesterol, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol, etc. Substances such as lipids, amino acids, proteins, polysaccharides, vitamins, growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvic acid, buffers, and inorganic salts are added to these media as necessary. It's okay.
  • serum substitutes such as insulin, sodium selenite, cholesterol, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol, etc.
  • Substances such as lipids, amino acids, proteins, polysaccharides, vitamins, growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics,
  • Basal media that can be used for animal cells include, for example, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham' Examples include, but are not limited to, sF12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, MCDB201 medium, and a mixed medium thereof.
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • Ham' Examples include, but are not limited to, sF12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, MCDB201 medium, and a mixed medium thereof.
  • serum added to the culture medium examples include human serum, fetal bovine serum (FBS), bovine serum, calf serum, goat serum, horse serum, pig serum, sheep serum, rabbit serum, and rat serum. but not limited to. When using serum, it may be added in an amount of 5 v/v% to 15 v/v%, preferably 10 v/v%, to the basal medium.
  • FBS fetal bovine serum
  • bovine serum bovine serum
  • calf serum goat serum
  • horse serum pig serum
  • sheep serum sheep serum
  • rabbit serum and rat serum.
  • fatty acids that can be added to the medium include, but are not limited to, linoleic acid, oleic acid, linoleic acid, arachidonic acid, myristic acid, palmitoic acid, palmitic acid, and stearic acid.
  • lipids that can be added to the medium include, but are not limited to, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, and the like.
  • Amino acids that can be added to the medium include, for example, L-alanine, L-arginine, L-aspartic acid, L-asparagine, L-cysteine, L-cystine, L-glutamic acid, L-glutamine, L-glycine, etc. Not limited to these.
  • proteins that can be added to the medium include, but are not limited to, ecotin, reduced glutathione, fibronectin, and ⁇ 2-microglobulin.
  • polysaccharides that can be added to the medium include glycosaminoglycans, and among the glycosaminoglycans, hyaluronic acid, heparan sulfate, and the like are particularly exemplified, but the polysaccharides are not limited thereto.
  • Growth factors that may be added to the medium include, for example, platelet-derived growth factor (PDGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), transforming growth factor beta (TGF- ⁇ ), hepatocyte growth factor (HGF), epithelial Examples include, but are not limited to, growth factor (EGF), connective tissue growth factor (CTGF), and vascular endothelial growth factor (VEGF).
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • TGF- ⁇ transforming growth factor beta
  • HGF hepatocyte growth factor
  • epithelial Examples include, but are not limited to, growth factor (EGF), connective tissue growth factor (CTGF), and
  • composition containing the extracellular vesicle population obtained in the present invention may be prepared using a (xeno-free) medium that does not contain foreign components such as serum.
  • a medium is provided as a pre-prepared medium for mesenchymal stem cells (stromal cells) by, for example, PromoCell, Lonza, Biological Industries, Veritas, R&D Systems, Corning, and Rohto. and is available.
  • sulfuric acid compounds selected from one or more of the group consisting of sulfated glycolipids, cholesterol sulfuric acid, and pharmaceutically acceptable salts thereof
  • sulfated glycolipid for example, sulfatide, seminolipid, and pharmaceutically acceptable salts thereof may be used.
  • the pharmaceutically acceptable salt of sulfated glycolipid or cholesterol sulfate used in the present invention may be an extract from a natural product or one synthesized by a known method.
  • Pharmaceutically acceptable salts include, for example, inorganic acid salts such as hydrochlorides, hydrobromides, sulfates, nitrates, phosphates, such as acetates, tartrates, citrates, fumarates, maleates, etc.
  • acid salts organic acid salts such as toluenesulfonates, methanesulfonates, metal salts such as sodium salts, potassium salts, calcium salts, aluminum salts, such as triethylamine salts, guanidine salts, ammonium salts, hydrazine salts, quinine salts. , salts with bases such as cinchonine salt, and the like.
  • the extracellular vesicle population provided by the present invention is provided as a composition (e.g., a pharmaceutical composition) containing a pharmacologically acceptable carrier, diluent, or excipient in addition to the above-mentioned extracellular vesicle population. may be done.
  • the composition can be administered locally (on the skin, inhalation, enema, eye drops, ear drops, nasally, intravaginally, etc.), enterally (orally, tubeally, intravaginally, etc.), and parenterally (intravenously, intravenously, etc.).
  • the drug may be provided in a dosage form suitable for intraarterial, transdermal, intramuscular injection, etc., but the administration route is not limited to these.
  • the extracellular vesicle population provided by the present invention includes extracellular vesicles with low expression of phosphatidylserine on the membrane surface, for example, when administered nasally, microglia targeting phosphatidylserine It is possible to reach a desired site (for example, an injured part of the brain) without being trapped in the olfactory bulb, where the molecules accumulate.
  • composition provided by the present invention can be formulated by selecting a dosage form suitable for its administration route.
  • dosage forms such as capsules and liquid preparations can be designed, and for parenteral administration, dosage forms such as injections and infusion preparations can be designed.
  • These preparations also contain various auxiliaries used for pharmaceutical purposes, such as carriers and other auxiliaries, such as stabilizers, preservatives, soothing agents, flavoring agents, corrigents, fragrances, emulsifiers, and fillers.
  • auxiliaries used for pharmaceutical purposes such as carriers and other auxiliaries, such as stabilizers, preservatives, soothing agents, flavoring agents, corrigents, fragrances, emulsifiers, and fillers.
  • a pH adjuster, etc. may be included, and can be blended within a range that does not impair the effects of the composition of the present invention.
  • any known method may be used to collect and/or purify the extracellular vesicle population, such as ultracentrifugation, density gradient separation, ultrafiltration, immunoprecipitation, chromatography, etc.
  • the particles may be recovered and/or purified using various microparticle separation kits.
  • a method of recognizing and isolating phosphatidylserine for example, a method using magnetic beads immobilized with Tim4 (T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4), which binds in a calcium ion-dependent manner (for example , MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS (Fuji Film Wako Pure Chemicals, Japan)) may be enriched, for example, by performing negative selection using an anti-tetraspanin antibody (e.g., anti-CD9 antibody, anti-CD81 antibody, The concentration may be performed using magnetic beads immobilized with antibodies (or anti-CD63 antibodies), and can be carried out using appropriately known techniques.
  • Tim4 T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4
  • the extracellular vesicle population provided by the present invention includes extracellular vesicles with high content of microRNA selected from the group consisting of miR-17 and miR-106.
  • the nucleic acid sequences of "miR-17” and “miR-106” can be specified using known databases (eg, NCBI, HGNC, etc.).
  • "miR-17” or “miR-106" contained in extracellular vesicles that can be applied to the present invention include their orthologs (eg, miR-106a and miR-106b, etc.).
  • MicroRNA generally refers to a single-stranded non-coding RNA that does not code for proteins and is approximately 21 to 25 bases in length, and is a complementary or partially complementary messenger RNA (mRNA). and induce expression suppression. It is said that one type of miRNA is involved in regulating the expression of multiple genes. This miRNA-related gene expression regulation mechanism is associated with various biological phenomena, biological functions, diseases, and the like.
  • extracellular vesicles highly containing microRNA selected from the group consisting of miR-17 and miR-106 refer to, for example, under conventional culture conditions (i.e., in the absence of sulfate compounds).
  • extracellular vesicles that have a higher content of each microRNA than the extracellular vesicles secreted from mesenchymal stem cells preferably 1.5 times or more, for example, 2 times or more, or 3 times or more.
  • the content of microRNA may be appropriately determined using a known method and is not particularly limited.
  • the population of extracellular vesicles provided by the invention includes Growth Differentiation Factor (GDF) family proteins, such as GDF-1, GDF-2, GDF-3, GDF-5, GDF-9, Extracellular vesicles high in GDF proteins selected from the group consisting of GDF-11, and GDF-15, particularly GDF-15, may be included.
  • GDF Growth Differentiation Factor
  • GDF-15 is a member of the transforming growth factor ⁇ (TGF- ⁇ ) superfamily, and is known to be secreted by macrophages, adipocytes, cardiomyocytes, vascular endothelial cells, vascular smooth muscle cells, etc. .
  • TGF- ⁇ transforming growth factor ⁇
  • GDF-15 is involved in neural differentiation and neogenesis of neural stem cells, and is associated with therapeutic effects on Alzheimer's disease (for example, Dong Hyun Kim et al. STEM CELLS AND DEVELOPMENT Volume 24, Num. ber 20 , 2015; Yuelin Zhang et al. Scientific Reports, 5:11235, 2015; Wen-Ping Xiong et al.
  • GDF-15 becomes Pro-GDF-15 (immature type) of approximately 34 kDa when mRNA is transcribed and translated into protein, and is a member of the Proprotein convertase, Subtilisin/kexin-type (PCSK) family, PCSK-3, PCSK- It is known that it is cleaved by GDF-15 or PCSK-6 to become the mature form of GDF-15 of approximately 13 kDa (for example, Molecular and Cellular Biology, November 2018 Volume 38 Issue 21) see e00249-18).
  • GDF-15 may be Pro-GDF-15 (immature type) or mature GDF-15, and may be used in a meaning that includes both.
  • the nucleic acid sequence or amino acid sequence of GDF-15 can be specified using known databases (e.g., NCBI, HGNC, ExoCarta, etc.), and is not particularly limited to, for example, GDF-15 can be easily identified by accession numbers such as NM_004864 and NP_004855 for human GDF-15, NM_001330687 and NP_001317616 for mouse GDF-15, and NM_019216 and NP_062089 for rat GDF-15. be.
  • human GDF-15 can be specified by IDs such as Entrez Gene_9518, ExoCarta_9518, UniProt_Q99988, etc.
  • Extracellular vesicles highly containing GDF-15 are those that are prepared under conventional culture conditions (for example, one or more vesicles selected from the group consisting of sulfated glycolipids, cholesterol sulfate, and pharmaceutically acceptable salts thereof).
  • vesicles that express GDF-15 at a higher level than the extracellular vesicles secreted from mesenchymal stem cells (in the absence of sulfate compounds) for example, 1.5 times or more, 2 times or more , 3 times or more, 4 times or more, or 5 times or more of GDF-15.
  • the expression level of GDF-15 may be appropriately determined using a known method (eg, ELISA method, Western blot method, chromatography method, etc.) and is not particularly limited.
  • the extracellular vesicle population provided by the present invention may be applied in diseases where mesenchymal stem cells can exert a therapeutic effect, for example osteochondral diseases such as knee osteoarthritis; Liver diseases such as decompensated cirrhosis, autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus, acute graft-versus-host disease, inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease, ischemic heart diseases such as myocardial infarction, arteriosclerosis obliterans, It may be applied to severe limb ischemia due to Buerger's disease or collagen disease, severe lung disease due to COVID-19, etc., but is not limited thereto.
  • osteochondral diseases such as knee osteoarthritis
  • Liver diseases such as decompensated cirrhosis
  • autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus
  • acute graft-versus-host disease acute graft-versus-host disease
  • inflammatory bowel diseases such as Cr
  • the extracellular vesicle population provided by the present invention may be used in the treatment of neurological diseases.
  • "nervous system disease” refers to damage to a specific group of nerve cells (e.g., nerve cells related to cognitive function or cells related to motor function) among the nerve cells in the brain or spinal cord.
  • a disease that causes functional impairment For example, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, multiple system atrophy, amyotrophic lateral sclerosis, frontotemporal lobar degeneration, Huntington's disease, Alexander's disease, cerebrovascular disorders.
  • the extracellular vesicle population provided by the present invention is preferably applicable to ischemic encephalopathy or traumatic brain injury, more preferably neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE).
  • HIE neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy
  • Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy one of the main causes of cerebral palsy, is caused by brain tissue damage that occurs during the fetal period or after birth, and is an intractable disease whose main symptoms include movement disorders and developmental disorders. It is a sexual disease, and although much treatment research has been carried out, no radical cure has yet been found.
  • HIE hypoxic-ischemic encephalopathy
  • stem cells for various intractable central nervous system disorders, and many therapeutic effects have been reported.
  • clear therapeutic effects on HIE have not yet been demonstrated.
  • the group that includes the inventors of the present application has previously created HIE model mice and verified the therapeutic effects of cord blood stem cells (Non-Patent Documents 6 to 7).
  • the extracellular vesicle population that can be provided by the present invention can exert a therapeutic effect on traumatic brain injury or ischemic encephalopathy. Therefore, in one embodiment, the extracellular vesicle population provided by the present invention is preferably applied to traumatic brain injury or ischemic encephalopathy, such as neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE). It may be.
  • HIE neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy
  • the invention provides a method for treating or preventing a neurological disease in a subject in need thereof, comprising: administering the extracellular vesicle population described above to the subject.
  • Example 1 Effects of the presence or absence of sulfate compounds on extracellular vesicles (EVs) secreted from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (1)
  • Umbilical cord tissues were collected from subjects who gave informed consent, cut into small pieces, placed on a Petri dish, and cultured for 10 to 20 days in a medium ( ⁇ -MEM) containing 10% bovine serum albumin to allow for growth. The cells were collected (in vitro tissue culture method).
  • the collected cells were passaged at 5 x 10 3 /cm 2 , and some of the cells at the second passage were confirmed to be mesenchymal stem cells (MSC) by flow cytometry using an MSC marker and evaluated. .
  • MSC mesenchymal stem cells
  • Cells at the third passage were cultured until confluence, sulfatide was added (22 ⁇ M) or the medium was replaced with a medium without the addition of sulfatide, and after further culturing for 3 days, the culture supernatant was collected.
  • the culture supernatant is first centrifuged at 2,000 x g for 15 minutes at 4°C to remove dead cells and cell debris, and then centrifuged at 12,000 x g for 35 minutes at 4°C to remove dead cells. The exposed intracellular organelles were removed. Finally, this supernatant was ultracentrifuged at 110,000 ⁇ g and 4° C. for 70 minutes, and the resulting pellet was designated as EVs.
  • the prepared EVs were confirmed by photographing with an electron microscope and Western blotting using EVs marker antibodies (CD9, CD81).
  • the amount of protein contained in EVs contained in the culture supernatant was quantified by the microBCA method, and the number of particles of EVs contained in the culture supernatant was measured using a nanoparticle analysis system NanoSight (Quantum Design, Japan). Furthermore, the amount of protein contained in EVs contained in the culture supernatant was quantified by the microBCA method. Furthermore, EVs contained in the culture supernatant were detected by Western blotting using EVs marker antibodies (CD9, CD81).
  • ⁇ -actin contained in the cell lysate obtained by lysing the MSCs used for the production of EVs was also detected by Western blot, and the density of the detected band was quantified by Image-J to determine the expression of ⁇ -actin. The results were normalized and compared by quantity ( Figure 1).
  • Example 2 Effects of the presence or absence of sulfate compounds on extracellular vesicles (EVs) secreted from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (2)
  • umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were cultured with different amounts of sulfatide added (0M, 11 ⁇ M, or 22 ⁇ M), and the effect on the secretion amount of extracellular vesicles (EVs) was investigated. Observed. The amount of EVs produced was compared by quantification by protein amount (microBCA method) and Western blotting (CD9 antibody).
  • Example 3 Effects of the presence or absence of sulfate compounds on extracellular vesicles (EVs) secreted from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (3)
  • umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were cultured by adding various sulfate compounds in an amount of 20 ⁇ g/mL, and the effect on the secretion amount of extracellular vesicles (EVs) was observed. did.
  • the amount of EVs was quantified by protein amount determination (microBCA method) and Western blot (CD81 antibody).
  • Example 4 Effects of the presence or absence of sulfate compounds on extracellular vesicles (EVs) secreted from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (4)
  • Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were cultured for 3 days with or without the addition of sulfatide (22 ⁇ M) according to the same method as in Example 1, and the resulting culture supernatant was subjected to ultracentrifugation or Mag Capture ( Extracellular vesicles (EVs) were collected using Exosome Isolation Kit PS (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan).
  • the ultracentrifugation method was performed as follows. The culture supernatant was centrifuged at 2,000 x g for 15 minutes at 4°C to remove dead cells and cell debris, and further centrifuged at 12,000 x g for 35 minutes at 4°C to remove intracellular particles from dead cells. Organs were removed. This supernatant was ultracentrifuged at 110,000 xg for 70 minutes at 4°C to obtain a pellet containing EVs.
  • Mag Capture (trademark) Exosome Isolation Kit PS is an affinity purification method using Tim4 protein that specifically recognizes phosphatidylserine (PS) expressed on the surface of extracellular vesicles, particularly exosomes. Therefore, by purifying extracellular vesicles using Mag Capture (trademark) Exosome Isolation Kit PS, it becomes possible to concentrate extracellular vesicles expressing PS.
  • Mag Capture (trademark) Exosome Isolation Kit PS is an affinity purification method using Tim4 protein that specifically recognizes phosphatidylserine (PS) expressed on the surface of extracellular vesicles, particularly exosomes. Therefore, by purifying extracellular vesicles using Mag Capture (trademark) Exosome Isolation Kit PS, it becomes possible to concentrate extracellular vesicles expressing PS.
  • Western blotting was performed on the obtained EVs using antibodies that recognize CD9 and CD81. Furthermore, ⁇ -actin contained in the cell lysate obtained by lysing the MSCs used for the production of EVs was also detected by Western blotting. The density of the band detected by Western blot was quantified using Image-J, normalized by the expression level of ⁇ -actin, and compared (FIG. 4).
  • Example 5 Effects of the presence or absence of sulfate compounds on extracellular vesicles (EVs) secreted from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (5)
  • umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were cultured with or without the addition of sulfatide (22 ⁇ M), and the culture supernatant was subjected to ultracentrifugation under the same conditions as in Example 4.
  • extracellular vesicles EVs were collected using Mag Capture (trademark) Exosome Isolation Kit PS (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan). The same amount (20 ⁇ l) of purified EVs was loaded, and 80 ⁇ l of a 20-fold dilution of Biotin-Annexin V (Biolegend) was added thereto, followed by reaction at room temperature for 15 minutes.
  • Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) model mice are created by clipping the common carotid artery of 9-day-old Icr mice (immunodeficient mice) for 1 hour, which corresponds to the onset period of human HIE patients. was created by artificially causing it. The success of the model was confirmed by MRI imaging of the brain injury site and rotarod test to determine whether motor function was impaired.
  • HIE hypoxic-ischemic encephalopathy
  • EVs derived from umbilical cord MSCs were administered through the tail vein.
  • EVs suspended in 100 ⁇ l of PBS were administered at 0.1 ⁇ g/g body weight.
  • HIE model mice were created by the same method as in Example 5, and EVs derived from umbilical cord MSCs were intranasally administered.
  • a PBS solution containing Sul (-) EVs) at a concentration of 0.1 ⁇ g/ ⁇ L was intranasally administered in an amount of 1 ⁇ L per 1 g of mouse body weight.
  • Microglia and macrophages are known to recognize and phagocytose PS expressed on the cell surface of apoptotic cells, but it has been reported that microglia are highly concentrated in the mouse olfactory bulb ( For example, EVs administered intranasally are likely to be trapped by these. However, EVs derived from umbilical cord MSCs supplemented with sulfatide (Sul(+) EVs) secrete EVs with high PS content (PS High EVs) and EVs with low PS content or no PS (PS Low EVs). When administered intranasally to model mice, PS High EVs are trapped in microglia, which function as a blocker for microglia, and PS Low EVs are thought to reach the brain injury site (glial scar) and accumulate.
  • Sul(+) EVs sulfatide
  • PS High EVs When administered intranasally to model mice, PS High EVs are trapped in microglia, which function as a blocker for micro
  • sulfatide stimulation not only increases the amount of EVs secreted from umbilical cord MSCs, but also increases the content of PS, CD9, and CD81 on the surface of EVs. It has become clear that bias occurs. It was suggested that EVs with a high content of PS are trapped by microglia, whereas EVs with a low content of PS escape this trap and are able to reach the injury site (Figure 11).
  • Example 8 Comparative verification of therapeutic effects on HIE model mice by administration of extracellular vesicles (EVs) (3)
  • HIE model mice were created by the same method as in Example 5, and EVs obtained from umbilical cord MSCs cultured with or without sulfatide were administered intranasally. After administration of EVs, a rotarod test was performed every two weeks to monitor whether motor ability had recovered. As a result, HIE model mice intranasally administered with umbilical cord MSC-derived EVs (Sul(+)-EVs) supplemented with sulfatide recovered motor function to the same level as normal mice after 6 weeks in the rotarod test. This was shown (Fig. 12).
  • EVs extracellular vesicles
  • EVs extracellular vesicles obtained by culturing umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in a medium with or without sulfatide (Sul+) or without (Sul-) by the same method as in Example 1.
  • PBS extracellular vesicles
  • NSCs Mouse neural stem cells
  • SSCs Mouse neural stem cells
  • PBS or a medium containing 0.1 ⁇ g/well of EVs obtained by culture with sulfatide (Sul+) or EVs obtained by culture without sulfatide (Sul-).
  • Sul+ sulfatide
  • Sul- EVs obtained by culture without sulfatide
  • EVs extracellular vesicles
  • EVs (sul+) obtained by culturing SHSY5Y (neuroblastoma cells) (4 ⁇ 10 5 cells/2 mL) with PBS (-) or 4 ⁇ g of sulfatide in a 6-well plate, or by culturing without sulfatide.
  • the obtained EVs (sul-) were added and cultured for 2 days, and the influence on the expression of PTEN and p38, which are targets of miR-17 and miR-106a, was confirmed by Western blotting.
  • Example 12 Search for EVs molecules related to therapeutic effects (2) Comparative analysis by mass spectrometry was performed on EVs obtained by culture with sulfatide added (Sul+) or EVs obtained by culture without sulfatide (Sul-), and it was found that the Growth Difference Factor - in EVs (Sul+) 15 (GDF-15).
  • an anti-GDF-15 mouse antibody was used as a primary antibody for EVs obtained by culture with sulfatide (Sul+) or EVs obtained by culture without sulfatide (Sul-), and then an anti-GDF-15 mouse antibody was used as a secondary antibody.
  • Western blotting was performed using mouse IgG-HRP. The density of the detected bands was analyzed using Image-J and compared. At the same time, the amount of protein contained in a 10 ⁇ L sample containing EV was also quantified, and the expression amount of GDF-15 per 1 ⁇ g of protein was compared.
  • GDF-15 (immature) was significantly increased in EVs obtained by Sul(+) compared to EVs obtained by Sul(-).
  • GDF-15 is involved in neural differentiation and neogenesis of neural stem cells, and has been reported to have a therapeutic effect on Alzheimer's disease (for example, Dong Hyun Kim et al. STEM CELLS AND DEVELOPMENT Volume 24, Number 20, 2015; Yuelin Zhang et al. Scientific Reports, 5:11235, 2015; Wen-Ping Xiong et al. Brain Research Bulletin 177 (2021) 92- 102). Therefore, since GDF-15 (immature) was significantly increased in EVs obtained by Sul(+), it is possible that the increase in GDF-15 brought about a therapeutic effect on HIE model mice.
  • Example 13 Relationship between the amount of sulfatide added to the medium and the amount of GDF-15 contained in extracellular vesicles (EVs) obtained from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
  • Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were cultured according to the same method as in Example 1, changing the amount of sulfatide added (0 M (PBS), 5.5 ⁇ M, 8.25 ⁇ M, 11 ⁇ M, 16.5 ⁇ M, or 22 ⁇ M). The effect on the secreted amount of extracellular vesicles (EVs) was observed. The expression levels of each protein were compared by quantification by protein amount (microBCA method) and Western blotting (anti-GDF-15 antibody, anti-CD81 antibody, CD9 antibody, anti- ⁇ -actin antibody).
  • EVs extracellular vesicles
  • umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were cultured with or without the addition of sulfatide (0M (PBS) or 16.5 ⁇ M), and extracellular vesicles ( The amount of GDF-15 in EVs) was observed.
  • the expression levels of each protein were compared by quantification by protein amount (microBCA method) and Western blotting (anti-GDF-15 antibody, anti-CD81 antibody, CD9 antibody, anti- ⁇ -actin antibody).
  • Example 15 Effect of different sulfate compounds added on the amount of GDF-15 contained in extracellular vesicles (EVs) from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
  • umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were cultured by changing to an EVs-free medium containing various sulfate compounds (15 ⁇ g/mL), and extracellular vesicles (EVs) were collected after 72 hours.
  • the amount of GDF-15 was observed.
  • the expression levels of each protein were compared by quantification by protein amount (microBCA method) and Western blotting (anti-GDF-15 antibody, anti-CD81 antibody, CD9 antibody, anti- ⁇ -actin antibody).
  • Example 16 Effect of different sulfate compounds added on the amount of GDF-15 contained in extracellular vesicles (EVs) from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
  • umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were cultured by changing to an EVs-free medium containing various sulfate compounds (15 ⁇ g/mL), and extracellular vesicles (EVs) were collected after 72 hours.
  • the amount of GDF-15 was observed.
  • the expression levels of each protein were compared by quantification by protein amount (microBCA method) and Western blotting (anti-GDF-15 antibody, anti-CD81 antibody, CD9 antibody, anti-CD63 antibody, anti- ⁇ -actin antibody).
  • Example 17 Effect of addition of sulfatide on the amount of GDF-15 contained in extracellular vesicles (EVs) from cells that highly express GDF-15
  • K562 cells which are a cell line derived from leukemia patients.
  • K562 cells were cultured with or without the addition of sulfatide (0 M (PBS) or 16.5 ⁇ M), and the expression level of GDF-15 in extracellular vesicles (EVs) was determined. observed.
  • the expression levels of each protein were compared by quantification by protein amount (microBCA method) and Western blotting (anti-GDF-15 antibody, anti-TGF- ⁇ antibody, anti-CD81 antibody, CD9 antibody, anti- ⁇ -actin antibody).
  • Example 18 Effect of addition of sulfatide on the amount of GDF-15 contained in extracellular vesicles (EVs) from cells that highly express GDF-15
  • canine kidney-derived cell lines (MDCK cells, human renal cancer-derived cell lines (KMRC- 20), cultured L1CAM knockout-KMRC-20 cells, human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, and human neuroblastoma cell line (SHSY-5Y), and observed the expression level of GDF-15 in extracellular vesicles (EVs).
  • the expression levels of each protein were compared by quantification by protein amount (microBCA method) and Western blot (anti-GDF-15 antibody).
  • L1CAM knockout-KMRC-20 cells were listed as a candidate receptor for sulfatide. This is a cell line in which L1CAM, which is a molecule derived from the human brain, has been knocked out.
  • Example 19 Effect of addition of sulfatide on the amount of GDF-15 contained in extracellular vesicles (EVs) from cells that highly express GDF-15
  • the experiment was basically conducted in accordance with Example 1. Each cell (human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell, K562 cell, KMRC-20 cell, or SHSY-5Y cell) was cultured until it became 100% confluent. The medium was replaced with a medium containing sulfatide (16.5 ⁇ M), and EVs were collected from the culture supernatant after 3 days. The amount of protein was quantified by the microBCA method, and 0.2 ⁇ g was subjected to Western blotting (anti-GDF-15 antibody).
  • EVs derived from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells contained the most GDF-15 ( Figure 24).

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Abstract

本発明は、膜表面のフォスファチジルセリンが低発現する細胞外小胞を含む細胞外小胞集団の製造方法であって、　（１）硫酸化糖脂質、コレステロール硫酸及び薬学的に許容されるその塩からなる群から１又は複数選択される硫酸化合物を含む培地で間葉系幹細胞を培養する工程、及び　（２）前記工程（１）を実施後の前記培地に含まれる細胞外小胞集団を回収する工程、 を含む、方法を提供する。また、本発明は、膜表面のフォスファチジルセリンが低発現する細胞外小胞を含む細胞外小胞集団を提供する。

Description

細胞外小胞集団の製造方法及び細胞外小胞集団
　本発明は、膜表面のフォスファチジルセリンが低発現する細胞外小胞を含む細胞外小胞集団、及びその製造方法に関する。
　近年、細胞が分泌する細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ＥＶｓ）の１つであるエクソソームに注目が集まっており、特に骨髄や脂肪組織、臍帯組織に存在する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）によって分泌されるエクソソームが、様々な組織の損傷や疾患に対して治療効果を示すことが報告されている（特許文献１～２及び非特許文献１）。
　このような効果を発揮し得るエクソソームを含む細胞外小胞を医薬とするために、細胞から産生される細胞外小胞の分泌を促進させる技術や、細胞外小胞を効率的に回収するための技術が必要となることから、様々な技術が開発中である（例えば、特許文献３～４）。骨髄由来の間葉系幹細胞を硫酸化糖脂質サルファタイドで刺激すると、細胞外小胞の一つであるエクソソームの分泌が促進されることが報告されている（非特許文献２）。
　エクソソームなどのＥＶｓを構成する膜は、それを分泌する細胞膜に由来している。ＥＶｓの膜にはリン脂質の一種であるフォスファチジルセリンが細胞よりも多くの比率で含まれており、それが膜の外側に露出している（非特許文献３）。一方、生細胞の細胞膜では、フリッパーゼと呼ばれる酵素の働きによりフォスファチジルセリンがその内側に配向している。細胞がアポトーシスを起こすと、細胞膜の外側にフォスファチジルセリンが配向するようになり、それをミクログリアやマクロファージが認識して、アポトーシス細胞を貪食する（例えば、非特許文献４、５）。従って、フォスファチジルセリンを膜の外側に露出させているＥＶｓは、治療効果を発揮したい部位に到達する前に、アポトーシス細胞と同様に、フォスファチジルセリンを認識したミクログリアやマクロファージなどに捕捉され、貪食される可能性がある。そのため、ＥＶｓ投与による治療効果が低減している可能性がある。
　現在のところ、フォスファチジルセリンの含有量を低減させたエクソソームなどのＥＶｓや、それを作製する方法については知られていない。
特開２０２０－１７４５７３号公報 特表２０２０－５２２９９６号公報 特開２０２１－１２２２０６号公報 特開２０２１－１２２２０５号公報
Katsuda T. and Ochiya T., Molecular signatures of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicle-mediated tissue repair, Stem Cell Research &Therapy, 6: 212, 2015 山下 竜幸、都留 英美、王　飛霏、馬場 伸育、沈　淵、津田 雅之、前田 長正、本家 孝一、相良 祐輔.　硫酸化糖脂質サルファタイドによる間葉系幹細胞のエクソソーム分泌促進効果.　第16回日本再生医療学会総会，2017年 3月7日～9日，仙台 Trajkovic, K. et al. Ceramide triggers budding of exosome vesicles into multivesicular endosomes. Science 319(5867) : 1244-7(2008). Moseman E. A., et al., T cell engagement of cross-presenting microglia protects the brain from a nasal virus infection, Sci Immunol. 2020 Jun 5;5(48):eabb1817. Herbert R.P., et al., Cytokines and olfactory bulb microglia in response to bacterial challenge in the compromised primary olfactory pathway, J Neuroinflammation. 2012 May 29;9:109. Wang F., Yamashita T. et al., The therapeutic potential of human umbilical cord blood transplantation for neonatal hypoxic-ischemic brain injury and ischemic stroke, Acta Med. Okayama, 66 (6), 429-434, 2012 Wang F., Yamashita T. et al., Syngeneic transplantation of newborn splenocytes in a murine model of neonatal ischemia-reperfusion brain injury, J. Maternal-Fetal & Neonatal Med., 28, 2015
　所望の治療部位に到達し、治療効果を発揮し得る細胞外小胞及びそれを製造する方法を提供することを目的とする。
　本願発明者らは、硫酸化化合物（例えば、硫酸化糖脂質、又はコレステロール硫酸）を用いて間葉系幹細胞を刺激したところ、ＥＶｓの分泌が促進されるのみならず、フォスファチジルセリンをほとんど含まないＥＶｓが産生されることを発見した。また、そのようにして得られたＥＶｓは、硫酸化化合物の非存在下で放出されたＥＶｓと比較して、ＨＩＥモデルマウスに対し有意な治療効果を示し得ることも発見した。これらの新たな知見に基づいて、本願発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
［１］　膜表面のフォスファチジルセリンが低発現する細胞外小胞（低ＰＳ細胞外小胞）を含む細胞外小胞集団の製造方法であって、
　（１）硫酸化糖脂質、コレステロール硫酸及び薬学的に許容されるその塩からなる群から１又は複数選択される硫酸化合物を含む培地で動物細胞を培養する工程、及び
　（２）前記工程（１）を実施後の前記培地に含まれる細胞外小胞集団を回収する工程、
を含む、方法。
［２］　前記硫酸化糖脂質が、サルファタイド及びセミノリピドからなる群から１又は複数選択される、項目１に記載の方法。
［３］　前記動物細胞が、Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ－１５（ＧＤＦ－１５）高発現細胞である、項目１又は２に記載の方法。
［４］　前記ＧＤＦ－１５高発現細胞が、間葉系細胞、女性生殖系細胞、骨髄由来細胞、内皮系細胞、肝臓系細胞、腎がん由来細胞、又は神経芽腫由来細胞である、項目３に記載の方法。
［５］　前記ＧＤＦ－１５高発現細胞が、間葉系幹細胞である、項目３に記載の方法。
［６］　前記間葉系幹細胞が、骨髄、脂肪組織、臍帯、歯髄、滑膜、胎盤、及び／もしくは卵膜由来の間葉系幹細胞、並びに／又は、多能性幹細胞から分化誘導して得られた間葉系幹細胞である、項目５に記載の方法。
［７］　前記間葉系幹細胞が、臍帯由来の間葉系幹細胞である、項目５に記載の方法。
［８］　前記低ＰＳ細胞外小胞において、フォスファチジルセリンの含量が、前記硫酸化合物の非存在下で培養した前記動物細胞から分泌される細胞外小胞と比較して、０．５倍以下である、項目１～７のいずれか１項に記載の方法。
［９］　前記細胞外小胞集団が、膜表面のフォスファチジルセリンが高発現する細胞外小胞（高ＰＳ細胞外小胞）を含む、項目１～８のいずれか１項に記載の方法。
［１０］　前記細胞外小胞集団が神経系疾患の治療に用いられる、項目１～９のいずれか１項に記載の方法。
［１１］　前記神経系疾患が、虚血性脳症又は外傷性脳損傷である、項目１０に記載の方法。
［１２］　前記細胞外小胞集団が、ｍｉＲ－１７及びｍｉＲ－１０６からなる群から選択されるマイクロＲＮＡを高含有する細胞外小胞を含む、項目１～１１のいずれか１項に記載の方法。
［１３］　前記細胞外小胞集団が、ＧＤＦ－１５を高含有する細胞外小胞を含む、項目１～１２のいずれか１項に記載の方法。
［１４］　項目１～１３のいずれか１項に記載の方法により得られる、膜表面のフォスファチジルセリンが低発現する細胞外小胞（低ＰＳ細胞外小胞）を含む細胞外小胞集団。
［１５］　膜表面のフォスファチジルセリンが低発現する、動物細胞由来の細胞外小胞（低ＰＳ細胞外小胞）を含む細胞外小胞集団。
［１６］　前記細胞外小胞が、Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ－１５（ＧＤＦ－１５）高発現細胞由来である、項目１５に記載の細胞外小胞集団。
［１７］　前記ＧＤＦ－１５高発現細胞が、間葉系幹細胞、女性生殖系細胞、骨髄由来細胞、腎がん由来細胞、又は神経芽腫由来細胞である、項目１６に記載の細胞外小胞集団。
［１８］　前記ＧＤＦ－１５高発現細胞が、間葉系幹細胞である、項目１６に記載の細胞外小胞集団。
［１９］　前記間葉系幹細胞が、骨髄、脂肪組織、臍帯、歯髄、滑膜、胎盤、及び／もしくは卵膜由来の間葉系幹細胞、並びに／又は、多能性幹細胞から分化誘導して得られた間葉系幹細胞である、項目１８に記載の細胞外小胞集団。
［２０］　前記間葉系幹細胞が、臍帯由来の間葉系幹細胞である、項目１８に記載の細胞外小胞集団。
［２１］　前記低ＰＳ細胞外小胞において、フォスファチジルセリンの含量が、硫酸化糖脂質、コレステロール硫酸及び薬学的に許容されるその塩からなる群から１又は複数選択される硫酸化合物の非存在下で培養した前記動物細胞から分泌される細胞外小胞と比較して、０．５倍以下である、項目１５～２０のいずれか１項に記載の細胞外小胞集団。
［２２］　前記細胞外小胞集団が、膜表面のフォスファチジルセリンが高発現する細胞外小胞（高ＰＳ細胞外小胞）を含む、項目１５～２１のいずれか１項に記載の細胞外小胞集団。
［２３］　前記細胞外小胞集団が、神経系疾患の治療に用いられる、項目１５～２２のいずれか１項に記載の細胞外小胞集団。
［２４］　前記神経系疾患が、虚血性脳症又は外傷性脳損傷である、項目２３に記載の細胞外小胞集団。
［２５］　前記細胞外小胞集団が、ｍｉＲ－１７及びｍｉＲ－１０６からなる群から選択されるマイクロＲＮＡを高含有する細胞外小胞を含む、項目１５～２４のいずれか１項に記載の細胞外小胞集団。
［２６］　前記細胞外小胞集団が、ＧＤＦ－１５を高含有する細胞外小胞を含む、項目１５～２５のいずれか１項に記載の細胞外小胞集団。
［２７］　必要とする対象において神経系疾患を治療または予防するための方法であって、
　項目１５～２６のいずれか１項に記載の細胞外小胞集団を前記対象に投与すること、
を含む、方法。
　本発明により、これまで知られているＥＶｓとは異なり、膜表面のフォスファチジルセリンが低発現する細胞外小胞を提供することが可能となった。これにより、ミクログリアやマクロファージなどの貪食細胞に捕捉されることなく、所望の部位に到達し、効果を発揮し得る細胞外小胞が提供可能となった。また、本発明により、これまで治療が困難であった神経系疾患、例えば難治性中枢神経系障害を治癒し得る細胞外小胞集団を提供可能となった。
図１は、サルファタイドの有無による、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞からの細胞外小胞（ＥＶｓ）の分泌量への影響を比較した結果を示す。 図２は、サルファタイドの添加量の違いによる、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞からの細胞外小胞（ＥＶｓ）の分泌量への影響を比較した結果を示す。 図３は、添加する硫酸化合物の違いによる、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞からの細胞外小胞（ＥＶｓ）の分泌量への影響を比較した結果を示す。 図４は、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞をサルファタイドの有無によって培養し、その培養上清を超遠心法又はＭａｇ　Ｃａｐｔｕｒｅ（商標）Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ＰＳを用いて精製して得た細胞外小胞（ＥＶｓ）のマーカータンパク質の発現を比較した結果を示す。 図５は、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞をサルファタイドの有無によって培養し、その培養上清を超遠心法又はＭａｇ　Ｃａｐｔｕｒｅ（商標）Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ＰＳを用いて精製して得た細胞外小胞（ＥＶｓ）の表面のフォスファチジルセリン（ＰＳ）を、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖを用いたＥＬＩＳＡ法によって検出し、比較した結果を示す。 図６は、サルファタイドを添加したヒト臍帯由来間葉系幹細胞から得られた細胞外小胞（ＥＶｓ）を尾静脈投与したＨＩＥモデルマウスの側脳室冠状面の組織切片の蛍光染色像を示す。緑：ＧＦＡＰ（損傷部位（グリア瘢痕）マーカー）、赤：ｐＫＨ２６標識ＥＶｓ。 図７は、サルファタイドを添加したヒト臍帯由来間葉系幹細胞から得られた細胞外小胞（ＥＶｓ）を尾静脈投与したＨＩＥモデルマウスの海馬冠状面の組織切片の蛍光染色像を示す。緑：ＧＦＡＰ（損傷部位（グリア瘢痕）マーカー）、赤：ｐＫＨ２６標識ＥＶｓ。 図８は、サルファタイドを添加したヒト臍帯由来間葉系幹細胞から得られた細胞外小胞（ＥＶｓ）を尾静脈投与した正常マウスの側脳室冠状面の組織切片の蛍光染色像を示す。緑：ＧＦＡＰ（損傷部位（グリア瘢痕）マーカー）、赤：ｐＫＨ２６標識ＥＶｓ。 図９は、サルファタイドを添加したヒト臍帯由来間葉系幹細胞から得られた細胞外小胞（ＥＶｓ）を鼻腔内投与したＨＩＥモデルマウスの側脳室冠状面の組織切片の蛍光染色像を示す。緑：ＧＦＡＰ（損傷部位（グリア瘢痕）マーカー）、赤：ｐＫＨ２６標識ＥＶｓ。 図１０は、サルファタイドを無添加のヒト臍帯由来間葉系幹細胞から得られた細胞外小胞（ＥＶｓ）を鼻腔内投与したＨＩＥモデルマウスの側脳室冠状面の組織切片の蛍光染色像を示す。緑：ＧＦＡＰ（損傷部位（グリア瘢痕）マーカー）、赤：ｐＫＨ２６標識ＥＶｓ。 図１１は、サルファタイドの有無によりヒト臍帯由来間葉系幹細胞から得られる細胞外小胞（ＥＶｓ）の性質の変化を示す概要図である。 図１２は、正常マウス又はＨＩＥモデルマウスに対する細胞外小胞（ＥＶｓ）の運動機能回復効果（ロタロッドテスト）を示す。 図１３は、サルファタイド有り又は無しの培地で培養したヒト臍帯由来間葉系幹細胞から得られた細胞外小胞（ＥＶｓ）のマウス神経幹細胞に対する神経分化促進効果を示す。 図１４は、サルファタイド有り又は無しの培地で培養したヒト臍帯由来間葉系幹細胞から得られた細胞外小胞（ＥＶｓ）に含まれるマイクロＲＮＡを定量した結果を示す。 図１５は、サルファタイド有り又は無しの培地で培養したヒト臍帯由来間葉系幹細胞から得られた細胞外小胞（ＥＶｓ）の添加による、神経芽腫細胞ＳＨＳＹ５ＹのｍｉＲ－１７／１０６ａターゲット分子の発現の影響を示す。 図１６は、サルファタイド有り又は無しの培地で培養したヒト臍帯由来間葉系幹細胞から得られた細胞外小胞（ＥＶｓ）に含まれるＧＤＦ－１５タンパク質を検出した結果を示す。 図１７は、培地中へのサルファタイドの添加量と、それによりヒト臍帯由来間葉系幹細胞から得られる細胞外小胞（ＥＶｓ）に含まれるＧＤＦ－１５の量との関係を示す。 図１８は、培地中へのサルファタイドの添加後の培養時間と、それによりヒト臍帯由来間葉系幹細胞から得られる細胞外小胞（ＥＶｓ）に含まれるＧＤＦ－１５の量との関係を示す。 図１９は、添加する硫酸化合物の違いによる、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞からの細胞外小胞（ＥＶｓ）に含まれるＧＤＦ－１５の量への影響を比較した結果を示す。 図２０は、硫酸化糖脂質セミノリピドによる、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞からの細胞外小胞（ＥＶｓ）に含まれるＧＤＦ－１５の量への影響を比較した結果を示す。 図２１は、ＧＤＦ－１５を高発現する細胞をデータベース（「ＴＨＥ　ＨＵＭＡＮ　ＰＲＯＴＥＩＮ　ＡＴＬＡＳ」）を用いて検索した結果を示す。 図２２は、培地中へのサルファタイドの添加の有無と、それによりＫ５６２細胞から得られる細胞外小胞（ＥＶｓ）に含まれるＧＤＦ－１５の量への影響を調べた結果を示す。 図２３は、培地中へのサルファタイドの添加の有無と、それにより複数の癌細胞から得られる細胞外小胞（ＥＶｓ）に含まれるＧＤＦ－１５の量への影響を調べた結果を示す。 図２４は、各細胞から得られる細胞外小胞（ＥＶｓ）に含まれるＧＤＦ－１５の量を比較した結果を示す。
　以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみに限定されない。なお、本明細書において引用されている先行技術文献は、本明細書においても援用され、その全体が本明細書において取り込まれる。
　一実施態様において、本発明は、膜表面のフォスファチジルセリンが低発現する細胞外小胞（低ＰＳ細胞外小胞）を含む細胞外小胞集団の製造方法を提供するものであって、当該方法は、
　（１）硫酸化糖脂質、コレステロール硫酸及び薬学的に許容されるその塩からなる群から１又は複数選択される硫酸化合物を含む培地で間葉系幹細胞を培養する工程、
　（２）前記工程（１）を実施後の前記培地に含まれる細胞外小胞集団を回収する工程、
を含む。
　本明細書中において、「細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ：ＥＶｓ）」とは、細胞から分泌される脂質二重膜で覆われた粒子であり、例えば、エクソソーム、微小小胞体（Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ：ＭＶ）、アポトーシス小体、等が含まれる。
　また、本明細書において、「細胞外小胞集団」とは、複数の細胞外小胞を含む、細胞外小胞の集団を意味し、個々の細胞外小胞と区別するために用いられる。
　エクソソームは、エンドサイト－シス・パスウエイに由来する約２０～約２００ｎｍの小胞であり、その構成成分としてタンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ノンコーティングＲＮＡ等）等が知られており、細胞間コミュニケーションを司る機能等を有しうる。エクソソームの産生や分泌機序について未解明の点が多いため、厳密には微小小胞体（ＭＶ）と区分することは困難であるが、一般的に知られているエクソソームのマーカー分子、例えば、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１、テトラスパニン（例えば、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９）、ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ、フォスファチジルセリン等によって大まかに識別することが出来る。これらのマーカー分子に対する抗体や結合タンパク質等を用いることによって、エクソソームを同定してもよい。なお、エクソソームの構成成分については、ＥｘｏＣａｒｔａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｏｃａｒｔａ．ｏｒｇ／）にまとめられており、そこに挙げられている構成成分の含有の有無を指標として同定してもよい。
　微小小胞体（ＭＶ）は、細胞質膜に由来する約５０～約１０００ｎｍの小胞であり、その構成成分としてタンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ノンコーティングＲＮＡ等）等が知られており、細胞間コミュニケーションを司る機能等を有しうる。微小小胞体のマーカー分子としては、例えば、インテグリン、セレクチン、ＣＤ４０、ＣＤ１５４等が挙げられ、これらのマーカー分子に対する抗体や結合タンパク質等を用いることによって、微小小胞体（ＭＶ）を同定することができる。
　アポトーシス小体は、細胞質膜に由来する約５００～約２０００ｎｍの小胞であり、その構成成分として断片化された核、細胞小器官（オルガネラ）等が知られており、ファゴサイトーシスを誘導する機能等を有しうる。アポトーシス小体のマーカー分子としては、例えば、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ、フォスファチジルセリン等が挙げられ、これらのマーカー分子に対する抗体や結合タンパク質等を用いることによって、アポトーシス小体を同定することができる。
　一実施態様において、本発明に含まれる細胞外小胞は、好ましくはエクソソームを含む。一般に細胞外小胞の種類の区別（エクソソーム、微小小胞体、アポトーシス小体等）は必ずしもすべて学術的に明確にされておらず、さらに特定の種類の細胞外小胞を選択的に単離することは技術的に容易ではないため、いずれの手法を用いて細胞外小胞体を単離したとしても通常はエクソソームを含むこととなる。従って、本発明の実施において、細胞外小胞を単離するための態様や条件は、細胞外小胞の種類を厳密に区別して特定のものを標的とするようなものに限定されることはない。
　本発明者らは、鋭意研究を行うことにより、硫酸化糖脂質、コレステロール硫酸及び薬学的に許容されるその塩からなる群から１又は複数選択される硫酸化合物を含む培地で動物細胞を培養すると、従来の培養方法（例えば、硫酸化糖脂質、コレステロール硫酸及び薬学的に許容されるその塩からなる群から１又は複数選択される硫酸化合物を含まない培地で、動物細胞を培養する方法）と比較して、細胞外小胞の産生が増加することを見出した。また、本発明者らは、本発明により提供される細胞外小胞集団には、従来の細胞外小胞（例えば、硫酸化糖脂質、コレステロール硫酸及び薬学的に許容されるその塩からなる群から１又は複数選択される硫酸化合物を含まない培地で培養される動物細胞から産生される細胞外小胞）と比較して、膜表面のフォスファチジルセリンが低発現する細胞外小胞が含まれていることを明かにした。さらにまた、本発明者らは、本発明により提供される膜表面のフォスファチジルセリンが低発現する細胞外小胞を含む細胞外小胞集団は、神経系疾患の治療に用いられた場合に良好な治療効果を発揮し得ることを見出した。
　一実施態様において、本発明により提供される細胞外小胞集団は、膜表面のフォスファチジルセリンが低発現する細胞外小胞を含むことを特徴としている。
　一実施態様において、本発明において提供される「フォスファチジルセリンが膜表面で低発現する細胞外小胞」（本明細書において「低ＰＳ細胞外小胞」と略され得る。）とは、従来の培養条件下（例えば、硫酸化糖脂質、コレステロール硫酸及び薬学的に許容されるその塩からなる群から１又は複数選択される硫酸化合物の非存在下）の動物細胞から分泌される細胞外小胞と比較して、膜表面におけるフォスファチジルセリンの発現量が低い細胞外小胞をいい、好ましくは０．５倍以下、例えば、０．２５倍以下、０．１倍以下、０．０５倍以下、又は０．０１倍以下のフォスファチジルセリンを発現している細胞外小胞であってもよい。フォスファチジルセリンの発現量は公知の方法を用いて適宜決定すればよく（例えば、ＥＬＩＳＡ法、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法、クロマトグラフィー法など）、特に限定されない。なお、本明細書において、ある物質の「発現量」とは、当該物質の「含有量」と言い換えてもよく、例えば、当該物質の含有量を直接測定するものであってもよく、任意の検出方法により既知の量の当該物質を含む標準サンプルとの比較により、測定対象サンプルにおける当該物質の含有量（又は発現量）を算出するものであってもよい。あるいは、比較対象に対する相対的な量、例えば、従来の培養条件下（例えば、硫酸化糖脂質、コレステロール硫酸及び薬学的に許容されるその塩からなる群から１又は複数選択される硫酸化合物の非存在下）の動物細胞から分泌される細胞外小胞に含まれる対象物質の「発現量」（含有量）との比較により導き出される相対的な発現量（含有量）であってもよい。
　一実施態様において、本発明により提供される細胞外小胞集団は、膜表面のフォスファチジルセリンが高発現する細胞外小胞（高ＰＳ細胞外小胞）を含み得る。また、一実施態様において、本発明により提供される細胞外小胞集団は、膜表面のフォスファチジルセリンが低発現する細胞外小胞と、膜表面のフォスファチジルセリンが高発現する細胞外小胞（高ＰＳ細胞外小胞）とを含み得る。従って、従来の培養条件下（例えば、硫酸化糖脂質、コレステロール硫酸及び薬学的に許容されるその塩からなる群から１又は複数選択される硫酸化合物の非存在下）の動物細胞から分泌される細胞外小胞と比較して、本発明によって提供される細胞外小胞集団は、膜表面のフォスファチジルセリンの含有量の分布が偏在しており、膜表面のフォスファチジルセリンが低含有（又はフォスファチジルセリンを含まない）の細胞外小胞と、膜表面のフォスファチジルセリンが高含有の細胞外小胞とを含み得る。
　「フォスファチジルセリンが膜表面で高発現する細胞外小胞」（本明細書において「高ＰＳ細胞外小胞」と略され得る。）とは、従来の培養条件下（例えば、硫酸化糖脂質、コレステロール硫酸及び薬学的に許容されるその塩からなる群から１又は複数選択される硫酸化合物の非存在下）の動物細胞から分泌される細胞外小胞と比較して、膜表面においけるフォスファチジルセリンの発現量が高い細胞外小胞をいい、好ましくは１．５倍以上、例えば２倍以上、３倍以上、または４倍以上のフォスファチジルセリンを含有している細胞外小胞であってもよい。
　一実施態様において、本発明により提供される細胞外小胞集団には、ｍｉＲ－１７及びｍｉＲ－１０６からなる群から選択されるマイクロＲＮＡを高含有する細胞外小胞が含まれている。また、一実施態様において、本発明により提供される細胞外小胞集団は、神経系疾患の治療に用いられ得る。
　一実施態様において、本発明において適用可能な動物細胞は、例えば、Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ－１５（ＧＤＦ－１５）高発現細胞が好ましい。ＧＤＦ－１５を高発現する細胞は、公知のデータベース、例えば「ＴＨＥ　ＨＵＭＡＮ　ＰＲＯＴＥＩＮ　ＡＴＬＡＳ」（ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／）などを用いて調べることができる。ここでは「ＴＨＥ　ＨＵＭＡＮ　ＰＲＯＴＥＩＮ　ＡＴＬＡＳ」を用いて調べる方法を例示するが、他のデーベース（例えば、米国ＮＩＨが提供するＮａｔｉｏｎａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＮＣＢＩ）など）を用いてそのような細胞を特定してもよい。「ＴＨＥ　ＨＵＭＡＮ　ＰＲＯＴＥＩＮ　ＡＴＬＡＳ」を用いて、ＧＤＦ－１５を高発現する細胞を検索する場合、例えば、「ＧＤＦ－１５高発現細胞」とは、当該データベースに登録されている正規化発現（ｎＴＰＭ）値に基づいて特定してもよく、例えば、ｎＴＰＭが５０以上（例えば、１００以上、又は１５０以上）である組織や当該組織由来の細胞又は細胞株（例えば癌細胞株）を選択して用いてもよい。そのような細胞としては、例えば、女性生殖系細胞（例えば、ＢＥＷＯ細胞など）、骨髄由来細胞（例えば、Ｋ５６２細胞など）、間葉系細胞（例えば、ＨＨＳｔｅＣ細胞など）、内皮系細胞（例えば、ＴＩＭＥ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞など）、肝臓系細胞（例えば、ＨｅｐＧ２など）を用いてもよい（例えば、図２１参照）。また、腎がん由来細胞（例えば、ＫＭＲＣ－２０など）、又は神経芽腫由来細胞（例えば、ＳＨＳＹ－５Ｙなど）であってもよい（例えば、図２３参照）。本発明において適用可能な動物細胞として、特に好ましくは間葉系幹細胞である。
　本明細書において、「間葉系幹細胞」とは、未分化な細胞で、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、ストローマ細胞、及び／又は腱細胞等のさまざまな間葉系の細胞へ分化する能力を持ち、且つ自己複製の能力を持つ細胞をいう。Ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ　（ＩＳＣＴ）において、間葉系幹細胞を既定する以下の３つの最小限の基準；（１）標準的な培養条件でプラスチックに接着して培養できること、（２）免疫学的特徴として、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４又はＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９ａ又はＣＤ１９、ＨＬＡ－ＤＲが陰性であること、（３）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ分化系で骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨芽細胞への分化能を示すこと、を提唱するが、本発明においては、これに限定されない。その他、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１０６及びＳＴＲＯ－１も間葉系幹細胞を示す陽性マーカーとして挙げられる。本発明において、「間葉系幹細胞」は、可能な限り最も広く解釈される。
　間葉系幹細胞は、生体内においては、骨髄、脂肪組織、臍帯、歯髄、滑膜、胎盤、卵膜（例えば、羊膜）等の組織から単離される細胞であり、公知の方法を用いて単離することができる。
　例えば、骨髄由来間葉系幹細胞は、骨髄から採取した骨髄液を、密度勾配遠心法にて血球系細胞を分離し、プラスチック培養皿に播種し、３７℃、５％ＣＯ２環境で培養することで、接着する細胞として単離することが可能である。
　脂肪組織由来間葉系幹細胞（脂肪組織由来幹細胞；Ａｄｉｐｏｓｅ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）は、採取した脂肪組織を細分化（ミンス（ｍｉｎｃｅ））し、コラゲナーゼタイプＩＩによって、３７℃１時間処理をして組織を消化し、培地を加えて遠心分離する。その後、沈殿した細胞を基礎培地で洗浄し、セルストレーナー等のメッシュにてろ過し、プラスチック培養皿に播種して、３７℃、５％ＣＯ２環境で培養することで、接着する細胞として単離することが可能である。
　例えば、臍帯由来間葉系幹細胞は、臍帯組織を採取し、細かく切り刻んだのちシャーレにのせ、１０　％牛血清アルブミンを含む培養液に浸して１０日～２０日培養し、増殖してきた細胞を回収することで、単離することができる。
　その他の組織由来の間葉系幹細胞を単離する方法については、公知の方法を用いればよく、限定されない。また、公知の間葉系幹細胞のマーカーを利用することにより、例えばＦＡＣＳ法や磁気ビーズ法によって、純度を高めてもよい。
　間葉系幹細胞は、多能性幹細胞から分化誘導して得られた間葉系幹細胞であってもよい。本明細書において、多能性幹細胞とは、自己複製能と多分化能を有する細胞であり、体を構成するあらゆる細胞を形成する能力（ｐｌｕｒｉｏｐｏｔｅｎｔ）を備える細胞をいう。自己複製能とは、１つの細胞から自分と同じ未分化な細胞を２つ作る能力のことをいう。本発明で用いられる多能性幹細胞には、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、胚性癌腫細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ：ＥＣ細胞）、栄養芽幹細胞（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＴＳ細胞）、エビブラスト幹細胞（ｅｐｉｂｌａｓｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＥｐｉＳ細胞）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）、多能性生殖細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｇｅｒｍｌｉｎｅ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ｍＧＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）などが含まれる。多能性幹細胞より、公知の方法（例えば、特開２０１２－１２０４８６、Ｆｕｋｕｔａ　Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ａ　ｎｅｕｒａｌ　ｃｒｅｓｔ　ｌｉｎｅａｇｅ　ｕｓｉｎｇ　ｓｍａｌｌ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｗｉｔｈ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｍｅｄｉａ．ＰＬＯＳ　ＯＮＥ，２０１４；９（１２）：ｅ１１２２９１．等）を用いて誘導された間葉系幹細胞を用いてもよい。
　間葉系幹細胞の分化誘導される能力については、公知の方法によって確認すればよい。例えば、間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化誘導の確認には、インスリン及びデキサメサゾンを加えた培地で培養して、Ｏｉｌ　Ｒｅｄ　Ｏ染色によって確認すればよい。例えば、間葉系幹細胞から骨細胞への分化誘導では、アスコルビン酸、β－グリセロリン酸、デキサメサゾンを培地に添加して培養し、アルカリフォスファターゼ染色で確認すればよい。例えば、間葉系幹細胞から筋分化誘導には、ウマ血清を加えた培地で培養すればよく、筋細胞に特異的な融合細胞が出現することを確認すればよい。その他、間葉系幹細胞からの分化誘導は、公知の方法を用いればよく、特に限定されない。分化誘導の有無の確認も公知の方法を用いればよく、例えば、分化誘導後にのみ発現する遺伝子又はタンパク質を、リアルタイムＰＣＲ法、フローサイトメーター等によって検出すればよい。
　本発明に使用される間葉系幹細胞の由来は限定されないが、入手のしやすさの観点や、神経系疾患に対する治療効果の観点から、骨髄、脂肪組織、又は臍帯由来の間葉系幹細胞であってもよく、臍帯由来の間葉系幹細胞であることが好ましい。
　本発明に用いられる動物細は、例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物などの哺乳類動物、鳥類、爬虫類、両生類、両生類、魚類、昆虫等が挙げられる。本発明をヒトの治療に用いる場合はヒト由来、ブタの治療に用いる場合はブタ由来、サルの治療に用いる場合はサル由来、チンパンジーの治療に用いる場合はチンパンジー由来の間葉系幹細胞を用いる方が好ましい。また、治療を行うのがヒトである場合、患者本人から採取した細胞であってもよく（自家細胞）、他人の細胞から採取した細胞を用いてもよく（他家細胞）、市販の細胞株であってもよい。
　本発明において間葉系幹細胞とは、間葉系幹細胞を含む任意の細胞集団を意味する。当該細胞集団は、少なくとも２０％以上、好ましくは、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９６％、９７％、９８％又は９９％が間葉系幹細胞である。
　本発明の工程（１）において使用される培地は、動物細胞を培養できる培地であれば、特に限定されないが、例えば、基礎培地に、血清を添加する、及び／又は、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、コレステロール、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロール等の１つ以上の血清代替物を添加して作製してもよい。これらの培地には、必要に応じて、さらに脂質、アミノ酸、タンパク質、多糖、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等の物質を添加してもよい。
　動物細胞に用いることができる基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　　１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＭＣＤＢ２０１培地及びこれらの混合培地等が挙げられるが、これに限定されない。
　培地に添加する血清としては、例えば、ヒト血清、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清、仔ウシ血清、ヤギ血清、ウマ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、ラット血清等が挙げられるがこれらに限定されない。血清を用いる場合、基礎培地に対して、５ｖ／ｖ％から１５ｖ／ｖ％、好ましくは、１０ｖ／ｖ％を添加してもよい。
　培地に添加され得る脂肪酸としては、リノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸等が例示されるが、これらに限定されない。培地に添加され得る脂質は、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン等が例示されるが、これらに限定されない。培地に添加され得るアミノ酸は、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシンなどを含むがこれらに限定されない。培地に添加され得るタンパク質は、例えば、エコチン、還元型グルタチオン、フィブロネクチン及びβ２－ミクログロブリン等が例示されるが、これらに限定されない。培地に添加され得る多糖は、グリコサミノグリカンが例示され、グリコサミノグリカンのうち特に、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸等が例示されるが、これらに限定されない。培地に添加され得る増殖因子は、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等が例示されるが、これらに限定されない。
　本発明において得られる細胞外小胞集団を含む組成物は、血清等の異種由来成分を含まない（ゼノフリー）培地を用いて作製するものであってもよい。このような培地は、例えば、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社、Ｌｏｎｚａ社、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、Ｖｅｒｉｔａｓ社、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ社及びＲｏｈｔｏ社などから間葉系幹細胞（間質細胞）用として予め調製された培地として提供されており、入手可能である。
　本願発明では「硫酸化糖脂質、コレステロール硫酸及び薬学的に許容されるその塩からなる群から１又は複数選択される硫酸化合物」が用いられ得る。硫酸化糖脂質としては、例えば、サルファタイド、セミノリピド及び薬学的に許容されるその塩が用いられてもよい。
　本発明に用いられる硫酸化糖脂質又はコレステロール硫酸の薬学的に許容され得る塩は、天然物からの抽出物であっても良いし，公知の方法によって合成した物であっても良い。例えば，具体的には，第１７改正日本薬局方に収載されているものを用いることができる。薬学的に許容され得る塩は、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、例えば酢酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩等の有機酸塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩等の金属塩、例えばトリエチルアミン塩、グアニジン塩、アンモニウム塩、ヒドラジン塩、キニーネ塩、シンコニン塩等の塩基との塩等が挙げられる。
　本発明により提供される細胞外小胞集団は、上述の細胞外小胞集団の他、薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤を含む組成物（例えば医薬組成物）として提供されてもよい。当該組成物は、局所投与（皮膚上、吸入、注腸、点眼、点耳、経鼻、膣内等）、経腸投与（経口、経管、経注等）、非経口投与（経静脈、経動脈、経皮、筋肉注等）に適する剤形として提供されうるが、投与経路はこれらに限られるものではない。本発明により提供される細胞外小胞集団は、膜表面のフォスファチジルセリンが低発現する細胞外小胞を含むので、例えば、経鼻投与される場合、フォスファチジルセリンを標的とするミクログリアが集積する嗅球においてトラップされることなく、所望の部位（例えば、脳の損傷部）に到達可能である。
　本発明により提供される組成物は、その投与経路に適した剤形を選択し製剤化することができる。経口投与に用いる場合、カプセル剤、液剤等、非経口投与の場合、注射剤、輸液製剤等の剤形が設計されうる。また、これらの製剤は医薬用に用いられる種々の補助剤、即ち、担体や他の助剤、例えば、安定化剤、防腐剤、無痛化剤、味剤、矯味剤、香料、乳化剤、充填剤、ｐＨ調整剤等が含まれてもよく、本発明の組成物の効果を損なわない範囲で配合することができる。
　細胞外小胞集団を回収及び／又は精製する方法については、公知の方法を用いればよく、例えば、超遠心分離法、密度勾配分離法、限外濾過法、免疫沈降法、クロマトグラフィー法などの他、各種微小粒子分離キットを用いることによって、回収及び／又は精製してもよい。また、一実施態様において、本発明によって提供される細胞外小胞集団における、膜表面のフォスファチジルセリンが低発現する細胞外小胞（低ＰＳ細胞外小胞）の濃度を高めたい場合は、フォスファチジルセリンを認識して単離する方法、例えば、カルシウムイオン依存的に結合するＴｉｍ４（Ｔ－ｃｅｌｌ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｄｏｍａｉｎ　ａｎｄ　ｍｕｃｉｎ　ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４）を固相化した磁気ビーズを用いる方法（例えば、ＭａｇＣａｐｔｕｒｅ（商標）　Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ＰＳ（富士フィルム和光純薬、日本））を用いたネガティブセレクションを実施することにより、濃縮してもよく、例えば、抗テトラスパニン抗体（例えば、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ８１抗体、又は抗ＣＤ６３抗体）を固相化した磁気ビーズを用いて濃縮してもよく、適宜公知の技術を用いて実施することができる。
　一実施態様において、本発明により提供される細胞外小胞集団には、ｍｉＲ－１７及びｍｉＲ－１０６からなる群から選択されるマイクロＲＮＡを高含有する細胞外小胞が含まれている。なお、「ｍｉＲ－１７」及び「ｍｉＲ－１０６」の核酸配列は、公知のデータベース（例えば、ＮＣＢＩ、ＨＧＮＣ等）を用いることによって特定することが可能である。また、本発明に適用され得る細胞外小胞に含まれる「ｍｉＲ－１７」又は「ｍｉＲ－１０６」は、それらのオーソログ（例えば、ｍｉＲ－１０６ａ及びｍｉＲ－１０６ｂなど）を含む。
　マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）とは、一般的には、２１～２５塩基程度の、タンパク質をコードしない一本鎖のノンコーディングＲＮＡをいい、それは相補的又は一部相補的なメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対して発現抑制を惹起する。１種類のｍｉＲＮＡは、複数の遺伝子の発現制御に関与するといわれている。このｍｉＲＮＡにかかわる遺伝子発現調節機構は、さまざまな生命現象・生命機能・疾患等と関連する。
　本明細書において、「ｍｉＲ－１７及びｍｉＲ－１０６からなる群から選択されるマイクロＲＮＡを高含有する細胞外小胞」とは、例えば、従来の培養条件下（すなわち、硫酸化合物の非存在下）の間葉系幹細胞から分泌される細胞外小胞と比較して、それぞれのマイクロＲＮＡの含有量が高い細胞外小胞をいい、好ましくは１．５倍以上、例えば２倍以上、又は３倍以上含有している細胞外小胞をいう。マイクロＲＮＡの含有量は公知の方法を用いて適宜決定すればよく、特に限定されない。
　一実施態様において、本発明により提供される細胞外小胞集団には、Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＦ）ファミリータンパク質、例えば、ＧＤＦ－１、ＧＤＦ－２、ＧＤＦ－３、ＧＤＦ－５、ＧＤＦ－９、ＧＤＦ－１１、およびＧＤＦ－１５からなる群から選択されるＧＤＦタンパク質、特にＧＤＦ－１５を高含有する細胞外小胞が含まれ得る。
　ＧＤＦ－１５は、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　β　（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーの一つであり、マクロファージや脂肪細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞などから分泌されていることが知られている。また、近年、ＧＤＦ－１５は、神経分化や神経幹細胞の新生に関わり、アルツハイマーに対する治療効果と関連することが報告されている（例えば、Ｄｏｎｇ　Ｈｙｕｎ　Ｋｉｍ　ｅｔ　ａｌ．　ＳＴＥＭ　ＣＥＬＬＳ　ＡＮＤ　ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ　Ｖｏｌｕｍｅ　２４，　Ｎｕｍｂｅｒ　２０，　２０１５；Ｙｕｅｌｉｎ　Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，　５：１１２３５，　２０１５；　Ｗｅｎ－Ｐｉｎｇ　Ｘｉｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　１７７　（２０２１）　９２－１０２を参照のこと）。ＧＤＦ－１５は、ｍＲＮＡが転写され、タンパク質に翻訳されると約３４ｋＤａのＰｒｏ－ＧＤＦ－１５（未成熟型）となり、Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ、Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ－ｔｙｐｅ（ＰＣＳＫ）ファミリーのＰＣＳＫ－３、ＰＣＳＫ－５又はＰＣＳＫ－６によって切断され、約１３ｋＤａの成熟型ＧＤＦ－１５となることが知られている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２０１８　Ｖｏｌｕｍｅ　３８　Ｉｓｓｕｅ　２１　ｅ００２４９－１８を参照）。本明細書において、「ＧＤＦ－１５」は、Ｐｒｏ－ＧＤＦ－１５（未成熟型）であってもよく、成熟型ＧＤＦ－１５であってもよく、両者を含む意味で用いられ得る。
　ＧＤＦ－１５の核酸配列またはアミノ酸配列は、公知のタベース（例えば、ＮＣＢＩ、ＨＧＮＣ、ＥｘｏＣａｒｔａ等）を用いることによって特定することが可能であり、特に限定されるものではないが、例えば、哺乳動物のＧＤＦ－１５は、ヒトＧＤＦ－１５であれば、ＮＭ＿００４８６４及びＮＰ＿００４８５５、マウスＧＤＦ－１５であれば、ＮＭ＿００１３３０６８７、ＮＰ＿００１３１７６１６、ラットＧＤＦ－１５であればＮＭ＿０１９２１６及びＮＰ＿０６２０８９などのアクセッション番号によって容易に特定可能である。また、例えば、ヒトＧＤＦ－１５であれば、Ｅｎｔｒｅｚ　Ｇｅｎｅ＿９５１８、ＥｘｏＣａｒｔａ＿９５１８、ＵｎｉＰｒｏｔ＿Ｑ９９９８８等のＩＤによっても特定可能である。
　「ＧＤＦ－１５を高含有する細胞外小胞」とは、従来の培養条件下（例えば、硫酸化糖脂質、コレステロール硫酸及び薬学的に許容されるその塩からなる群から１又は複数選択される硫酸化合物の非存在下）の間葉系幹細胞から分泌される細胞外小胞と比較して、ＧＤＦ－１５の発現量が高い細胞外小胞をいい、例えば１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、４倍以上又は５倍以上のＧＤＦ－１５を発現している細胞外小胞であってもよい。ＧＤＦ－１５の発現量は公知の方法を用いて適宜決定すればよく（例えば、ＥＬＩＳＡ法、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法、クロマトグラフィー法など）、特に限定されない。
　一実施態様において、本願発明により提供される細胞外小胞集団は、間葉系幹細胞により治療効果を発揮し得る疾患において適用されてもよく、例えば、変形性膝関節症などの骨軟骨疾患、非代償性肝硬変症などの肝疾患、全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患、急性移植片対宿主病、クローン病などの炎症性腸疾患、心筋梗塞などの虚血性心疾患、閉塞性動脈硬化症、バージャー病又は膠原病による重症虚血肢、ＣＯＶＩＤ－１９などによる重症肺疾患などに適用されてもよく、これに限定されない。
　また、一実施態様において、本願発明により提供される細胞外小胞集団は、神経系疾患の治療において用いられ得てもよい。本明細書において、「神経系疾患」とは、脳や脊髄にある神経細胞のなかで、ある特定の神経細胞群（例えば、認知機能に関係する神経細胞や運動機能に関係する細胞）が損傷を受け、機能障害を生ずる疾患をいう。例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、多系統萎縮症、筋委縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、アレキサンダー病、脳血管障害、外傷性脳損傷、虚血性脳症（例えば、新生児低酸素虚血性脳症（ＨＩＥ））、中枢神経感染症、てんかん、統合失調症、大うつ病を含むが、これらに限定されるものではない。一実施態様において、本願発明により提供される細胞外小胞集団は、好ましくは虚血性脳症又は外傷性脳損傷、より好ましくは、新生児低酸素虚血性脳症（ＨＩＥ）に適用し得る。
　脳性麻痺の主要な原因の一つである新生児低酸素虚血性脳症（ＨＩＥ）は、胎生期や出生後に起こる脳組織損傷に起因して引き起こされ、運動障害や発達障害を主な症状とする難治性疾患であるが、これまで多くの治療研究が行われてきたにもかかわらず、いまだ根治療法はみいだされていない。近年種々の難治性中枢神経系障害に対して、幹細胞を利用した研究を中心に数多くの研究が行われ、多くの治療効果が報告されている。しかしながらＨＩＥに対する明確な治療効果は未だ示されていない。本願発明者らが含まれるグループにおいても、これまでにＨＩＥモデルマウスを作成し、臍帯血幹細胞による治療効果を検証してきた（非特許文献６～７）。しかしながら運動機能にわずかな回復傾向が認められたものの顕著な治療効果を示すには至っていない。本発明者らは、本発明により提供され得る細胞外小胞集団が、外傷性脳損傷、又は虚血性脳症に対し、治療効果を発揮し得ることを初めて明らかにした。従って、一実施態様において、本願発明により提供される細胞外小胞集団は、好ましくは、外傷性脳損傷、又は虚血性脳症（例えば、新生児低酸素虚血性脳症（ＨＩＥ））に適用されるものであってもよい。
　一実施態様において、本発明は、必要とする対象において神経系疾患を治療または予防するための方法であって、
　上記の細胞外小胞集団を前記対象に投与すること、を含む、方法を提供する。
　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
＜実施例１＞
　硫酸化合物の有無による臍帯由来間葉系幹細胞から分泌される細胞外小胞（ＥＶｓ）への影響（１）
　インフォームドコンセントにより同意を得た被験者から臍帯組織を採取し、細かく切り刻んだのちシャーレにのせ、１０％牛血清アルブミンを含む培地（α－ＭＥＭ）に浸して１０日～２０日培養し、増殖してきた細胞を回収した（体外組織培養法）。
　回収した細胞は５×１０３／ｃｍ２で継代し、２継代目の細胞の一部はＭＳＣマーカーを用いたフローサイトメトリーにより間葉系幹細胞（ＭＳＣ）であることを確認し、評価した。３継代目の細胞をコンフルエントになるまで培養し、サルファタイドを添加（２２μＭ）、または無添加培地に置換し、さらに３日間培養した後、培養上清を回収した。
　ＥＶｓの精製は培養上清をまず２，０００×ｇ、１５分間４℃で遠心して死細胞や細胞残さを除去し、さらに１２，０００×ｇ、３５分間４℃で遠心することで死細胞から出た細胞内小器官を除去した。最後にこの上清を１１０，０００×ｇ、７０分間４℃で超遠心し、得られたペレットをＥＶｓとした。調製したＥＶｓは、電子顕微鏡による撮影とＥＶｓマーカー抗体（ＣＤ９、ＣＤ８１）を用いたＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔにより確認した。また、培養上清に含まれるＥＶｓに含まれるタンパク質量をｍｉｃｒｏＢＣＡ法により定量し、ナノ粒子解析システム　ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（Ｑｕａｎｔｕｍ　Ｄｅｓｉｇｎ、日本）を用いて、培養上清に含まれるＥＶｓの粒子数を測定した。また、培養上清に含まれるＥＶｓに含まれるタンパク質量をｍｉｃｒｏＢＣＡ法により定量した。さらに、培養上清に含まれるＥＶｓを、ＥＶｓマーカー抗体（ＣＤ９、ＣＤ８１）を用いてＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔにより検出した。なお、ＥＶｓの産生に用いたＭＳＣを溶解した細胞溶解物に含まれるβアクチンについてもＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔにより検出し、検出されたバンドの濃さ（Ｄｅｎｓｉｔｙ）をＩｍａｇｅ－Ｊにより定量し、βアクチンの発現量によって正規化し、比較した（図１）。
　その結果、サルファタイドを添加した培地で間葉系幹細胞を培養した場合、ＥＶｓの分泌量が促進されることが確認された（図１）。
＜実施例２＞
　硫酸化合物の有無による臍帯由来間葉系幹細胞から分泌される細胞外小胞（ＥＶｓ）への影響（２）
　実施例１と同様の方法に沿って、サルファタイドの添加量（０Ｍ、１１μＭ又は２２μＭ）を変えて臍帯由来間葉系幹細胞を培養し、細胞外小胞（ＥＶｓ）の分泌量に与える影響を観察した。タンパク質量による定量（ｍｉｃｒｏＢＣＡ法）及びＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ（ＣＤ９抗体）により、ＥＶｓの産生量を比較した。
　その結果、サルファタイドの濃度依存的に臍帯由来間葉系幹細胞のＥＶｓの分泌量が促進されることが明らかとなった（図２）。
＜実施例３＞
　硫酸化合物の有無による臍帯由来間葉系幹細胞から分泌される細胞外小胞（ＥＶｓ）への影響（３）
　実施例１と同様の方法に沿って、各種硫酸化合物を２０μｇ／ｍＬとなる量で添加して臍帯由来間葉系幹細胞を培養し、細胞外小胞（ＥＶｓ）の分泌量に与える影響を観察した。タンパク質量による定量（ｍｉｃｒｏＢＣＡ法）及びＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ（ＣＤ８１抗体）により、ＥＶｓの量を定量した。
　その結果、サルファタイドの他、コレステロール硫酸の添加によっても臍帯由来間葉系幹細胞のＥＶｓの分泌量が促進されることが明らかとなった（図３）。
＜実施例４＞
　硫酸化合物の有無による臍帯由来間葉系幹細胞から分泌される細胞外小胞（ＥＶｓ）への影響（４）
　実施例１と同様の方法に沿って、サルファタイドの添加あり（２２μＭ）又は添加無しで臍帯由来間葉系幹細胞を３日間培養し、得られた培養上清について超遠心法、又はＭａｇ　Ｃａｐｔｕｒｅ（商標）Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ＰＳ（富士フィルム和光純薬株式会社、日本）により、細胞外小胞（ＥＶｓ）を回収した。
　具体的には、超遠心法は、以下の方法を実施した。培養上清を２，０００×ｇ、１５分間４℃で遠心して死細胞や細胞残さを除去し、さらに１２，０００×ｇ、３５分間４℃で遠心することで死細胞から出た細胞内小器官を除去した。この上清を１１０，０００×ｇ、７０分間４℃で超遠心し、ＥＶｓが含まれるペレットを得た。
　Ｍａｇ　Ｃａｐｔｕｒｅ（商標）Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ＰＳを用いたＥＶｓの回収方法は、キットに付属の説明書に沿って実施した。なおＭａｇ　Ｃａｐｔｕｒｅ（商標）Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ＰＳは、細胞外小胞、特にエクソソームの表面に発現するフォスファチジルセリン（ＰＳ）を特異的に認識するＴｉｍ４タンパク質を用いたアフィニティー精製法である。従って、Ｍａｇ　Ｃａｐｔｕｒｅ（商標）Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ＰＳを用いて細胞外小胞を精製することにより、ＰＳを発現する細胞外小胞を濃縮することが可能となる。
　得られたＥＶｓについて、ＣＤ９及びＣＤ８１を認識する抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔを行った。また、ＥＶｓの産生に用いたＭＳＣを溶解した細胞溶解物に含まれるβアクチンについてもＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔにより検出した。Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔで検出されたバンドの濃さ（Ｄｅｎｓｉｔｙ）をＩｍａｇｅ－Ｊにより定量し、βアクチンの発現量によって正規化し、比較した（図４）。
　各種精製法によって得られた細胞外小胞について、ＣＤ９及びＣＤ８１の含有量を調べた結果、サルファタイドを添加して得られた細胞外小胞をＭａｇ　Ｃａｐｔｕｒｅ（商標）Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ＰＳにより精製すると、ＣＤ９及びＣＤ８１陽性の細胞外小胞の回収量が低下することが明らかとなった（図４）。これらの結果より、サルファタイドの添加により、ＰＳ陽性の細胞外小胞の分泌量が減少する、あるいは、ＰＳ陽性の細胞外小胞のＣＤ９及びＣＤ８１の発現が減少することが示唆された。
＜実施例５＞
　硫酸化合物の有無による臍帯由来間葉系幹細胞から分泌される細胞外小胞（ＥＶｓ）への影響（５）
　実施例１と同様の方法に沿って、サルファタイドの添加あり（２２μＭ）又は添加無しで臍帯由来間葉系幹細胞を培養し、培養上清から、実施例４と同様の条件による超遠心法、又はＭａｇ　Ｃａｐｔｕｒｅ（商標）Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ＰＳ（富士フィルム和光純薬株式会社、日本）により、細胞外小胞（ＥＶｓ）を回収した。精製したＥＶｓを同量（２０μｌ）ロードし、これにＢｉｏｔｉｎ－ＡｎｎｅｘｉｎＶ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）の２０倍希釈液８０μｌを添加し、１５分間室温にて反応させた。その後、ＡｎｎｅｘｉｎＶ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（ＡＶＢ）で２回洗浄後、ストレプトアビジン－ＨＲＰの１０００倍希釈液１００μｌを加え、さらに１５分間反応させた。ＡＶＢで２回洗浄後、ＥＶｓを９６ウェルプレートに移した。ＥＬＩＳＡ反応液（３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を加え、３７℃、１５分間反応させた。２規定（２Ｎ）の硫酸で反応を止めた後、Ａ４５０の吸光度を測定した。得られたＡ４５０の吸光度を、ｍｉｃｒｏＢＣＡ法で算出したタンパク量μｇ／２０ｕｌにて除した値（Ａ４５０／ｕｇ　ＥＶｓ）を比較した（図５）。
　ＰＳ定量実験の結果、超遠心法により回収されたＥＶｓ、Ｍａｇ　Ｃａｐｔｕｒｅ（商標）Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔで回収したＥＶｓともに、サルファタイドの添加によりＰＳの量が顕著に増加していた。これらの結果と実施例４の結果より、サルファタイドの添加がＥＶｓ表面のＰＳの発現を増加させるとともに、ＥＶｓ表面のＰＳ、ＣＤ９及びＣＤ８１の含有量に偏りが生じることが明らかとなった（図５）。
＜実施例６＞
　細胞外小胞（ＥＶｓ）投与によるＨＩＥモデルマウスに対する治療効果の比較検証（１）
　新生児低酸素虚血性脳症（ＨＩＥ）モデルマウスは、ヒトのＨＩＥ患者の発症時期に相当する生後９日目のＩｃｒマウス（免疫不全マウス）の総頚動脈を１時間クリッピングすることにより低酸素性虚血を人工的に引き起こし作成した。モデルがうまく作成できているかどうかはＭＲＩによる脳損傷部位の撮影とロタロッドテストによる運動機能の低下によって確認した。
　ヒトでは慢性期に相当するモデル作成から３週間後に、臍帯ＭＳＣ由来のＥＶｓを尾静脈より投与した。１００μｌのＰＢＳに懸濁したＥＶｓを０．１μｇ／体重（ｇ）にて投与した。投与したＥＶｓが損傷部位周辺の細胞にどのような作用で運動機能回復効果をもたらしているのかを確認するために、蛍光ラベルしておいた投与ＥＶｓのモデルマウス脳における存在場所を追跡するとともに、脳に存在するニューロンやグリア細胞がどのような変化を起こしているのかを各マーカー抗体による脳組織免疫染色により検証した。
　その結果、サルファタイドを添加した臍帯ＭＳＣ由来のＥＶｓ（Ｓｕｌ（＋）－ＥＶｓ）は、尾静脈投与後、脳損傷部位に集積することが示された（図６及び７）。一方で、脳損傷の無いマウスでは、グリア瘢痕、ＥＶｓの集積ともに観察されなかった（図８）。
＜実施例７＞
　細胞外小胞（ＥＶｓ）投与によるＨＩＥモデルマウスに対する治療効果の比較検証（２）
　実施例５と同様の方法によりＨＩＥモデルマウスを作成し、臍帯ＭＳＣ由来のＥＶｓを鼻腔内に投与した。サルファタイドを添加して得た臍帯ＭＳＣ由来のＥＶｓ（Ｓｕｌ（＋）ＥＶｓ）を０．１０８μｇ／μＬの濃度で含むＰＢＳ溶液、又は、サルファタイドを添加せずに得た臍帯ＭＳＣ由来のＥＶｓ（Ｓｕｌ（－）ＥＶｓ）を０．１μｇ／μＬの濃度で含むＰＢＳ溶液を、マウス体重１ｇ当たり１μＬの量で鼻腔内投与した。
　その結果、サルファタイドを添加した臍帯ＭＳＣ由来のＥＶｓ（Ｓｕｌ（＋）ＥＶｓ）は、鼻腔内投与によっても脳傷害部位（グリア瘢痕）に集積することが示された（図９）。一方で、サルファタイドを添加せずに得た臍帯ＭＳＣ由来のＥＶｓ（Ｓｕｌ（－）ＥＶｓ）は、モデルマウスの脳傷害部位（グリア瘢痕）に集積されなかった（図１０）。
　ミクログリアやマクロファージは、アポトーシスを起こした細胞などが細胞表面に発現するＰＳを認識して貪食することが知られているが、マウス嗅球にはミクログリアが多く集積していることが報告されており(例えば、非特許文献４，５)、鼻腔内投与したＥＶｓはこれらにトラップされる可能性が高い。しかし、サルファタイドを添加した臍帯ＭＳＣ由来のＥＶｓ（Ｓｕｌ（＋）ＥＶｓ）はＰＳ含量の高いＥＶｓ(ＰＳ Ｈｉｇｈ ＥＶｓ)とＰＳ含量の低いあるいはＰＳを含まないＥＶｓ(ＰＳ Ｌｏｗ ＥＶｓ)を分泌し、これをモデルマウスに鼻腔内投与した場合ＰＳ Ｈｉｇｈ ＥＶｓはミクログリアにトラップされるがこれがミクログリアに対するブロッカーとして機能し、ＰＳ Ｌｏｗ ＥＶｓは脳傷害部位（グリア瘢痕）に到達し、集積すると考えられる。
　上記の実施例１～７の結果を踏まえると、サルファタイド刺激により、臍帯ＭＳＣから分泌されるＥＶｓは、その分泌量が増加するのみならず、ＥＶｓの表面のＰＳ，ＣＤ９及びＣＤ８１の含有量に偏りが生じることが明らかとなった。ＰＳの含有量が多いＥＶｓは、ミクログリアにトラップされるが、ＰＳの含有量が少ないＥＶｓは、これを免れ、傷害部位に達成できるようになることが示唆された（図１１）。
＜実施例８＞
　細胞外小胞（ＥＶｓ）投与によるＨＩＥモデルマウスに対する治療効果の比較検証（３）
　実施例５と同様の方法によりＨＩＥモデルマウスを作成し、サルファタイド添加又は無添加にて培養した臍帯ＭＳＣから得たＥＶｓを鼻腔内に投与した。ＥＶｓ投与後、２週間ごとにロタロッドテストを行い、運動能力が回復するかをモニタリングした。その結果、サルファタイドを添加した臍帯ＭＳＣ由来のＥＶｓ（Ｓｕｌ（＋）－ＥＶｓ）を鼻腔内投与したＨＩＥモデルマウスは、ロタロッドテストにおいて、６週間後には正常マウスと同等まで運動機能が回復することが示された（図１２）。
＜実施例９＞
　硫酸化合物によって臍帯由来間葉系幹細胞から産生された細胞外小胞（ＥＶｓ）のマウス神経幹細胞に対する神経促進効果の検証
　実施例１と同様の方法により、サルファタイドを添加（Ｓｕｌ＋）又は無添加（Ｓｕｌ－）の培地で臍帯由来間葉系幹細胞を培養し、それらから得られる細胞外小胞（ＥＶｓ）を含む組成物（ＰＢＳ）を調製した。
　ＰＢＳ、又はサルファタイド添加培養により得られたＥＶｓ（Ｓｕｌ＋）もしくはサルファタイド無添加培養により得られたＥＶｓ（Ｓｕｌ－）を０．１μｇ／ウェル含む培地を用い、９６ウェルプレートにマウス神経幹細胞（ＮＳＣ）（１×１０４　ｃｅｌｌｓ）を播種し、３日間培養後、顕微鏡観察にて、分化したニューロンの数を測定した。
　その結果、サルファタイド添加培養により得られたＥＶｓ（ｓｕｌ＋）は、マウス神経幹細胞から顕著に神経分化を促進する効果を有することが明らかとなった（図１３）。
＜実施例１０＞
　治療効果に関わるＥＶｓ分子の探索（１）
　サルファタイド添加培養により得られたＥＶｓ（Ｓｕｌ＋）もしくはサルファタイド無添加培養により得られたＥＶｓ（ｓｕｌ－）の成分を比較し、直接治療に関わる作用因子の探索を試みた。
　それぞれのＥＶｓからＲＮＡを抽出し、デジタルＰＣＲ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）により、神経再生や成熟に関わるものとして報告されているｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲ－１７、ｍｉＲ－１０６ａ、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１３３ｂ）の量を定量した。
　その結果、ｍｉＲ－１７及びｍｉＲ－１０６ａが、サルファタイド添加培養により得られたＥＶｓ（ｓｕｌ＋）により多く含まれていることが明らかとなった（図１４）。
＜実施例１１＞
　臍帯由来間葉系幹細胞から産生された細胞外小胞（ＥＶｓ）添加によるｍｉＲ－１７／ｍｉＲ－１０６ａターゲット分子の発現への影響
　６ウェルプレートにＳＨＳＹ５Ｙ（神経芽腫細胞）（４×１０５　ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ）に、ＰＢＳ（－）、又は４μｇのサルファタイド添加培養により得られたＥＶｓ（ｓｕｌ＋）、またはサルファタイド無添加培養により得られたＥＶｓ（ｓｕｌ－）を添加して２日間培養し、ｍｉＲ－１７及びｍｉＲ－１０６ａのターゲットであるＰＴＥＮ及びｐ３８の発現への影響をＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔにより確認した。
　その結果、ＥＶｓ（ｓｕｌ＋）を含む培地で２日間培養したＳＨＳＹ５Ｙ細胞は、ｐ３８の発現が抑制されていることが明らかとなった（図１５）。
＜実施例１２＞
　治療効果に関わるＥＶｓ分子の探索（２）
　サルファタイド添加培養により得られたＥＶｓ（Ｓｕｌ＋）もしくはサルファタイド無添加培養により得られたＥＶｓ（Ｓｕｌ－）について、マススペクトロメトリーによる比較解析を行ったところ、ＥＶｓ（Ｓｕｌ＋）において、Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ－１５（ＧＤＦ－１５）を含有している可能性が示された。
　そこで、サルファタイド添加培養により得られたＥＶｓ（Ｓｕｌ＋）もしくはサルファタイド無添加培養により得られたＥＶｓ（Ｓｕｌ－）に対し、一次抗体として抗ＧＤＦ－１５マウス抗体を用い、次いで二次抗体として抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを用いてウエスタンブロットを実施した。検出されたバンドの濃さ（Ｄｅｎｓｉｔｙ）をＩｍａｇｅ－Ｊにより解析し、比較した。同時に、ＥＶを含む１０μＬのサンプルに含まれるタンパク量についても定量し、タンパク量１μｇ当たりのＧＤＦ－１５の発現量を比較した。
　その結果、Ｓｕｌ（－）により得られるＥＶｓと比較して、Ｓｕｌ（＋）により得られるＥＶｓは、ＧＤＦ－１５（ｉｍｍａｔｕｒｅ）が著しく増加することが明らかとなった。
　ＧＤＦ－１５は、神経分化や神経幹細胞の新生に関わり、アルツハイマーに対する治療効果について報告されている（例えば、Ｄｏｎｇ　Ｈｙｕｎ　Ｋｉｍ　ｅｔ　ａｌ．　ＳＴＥＭ　ＣＥＬＬＳ　ＡＮＤ　ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ　Ｖｏｌｕｍｅ　２４，　Ｎｕｍｂｅｒ　２０，　２０１５；Ｙｕｅｌｉｎ　Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，　５：１１２３５，　２０１５；　Ｗｅｎ－Ｐｉｎｇ　Ｘｉｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　１７７　（２０２１）　９２－１０２）。従って、Ｓｕｌ（＋）により得られるＥＶｓは、ＧＤＦ－１５（ｉｍｍａｔｕｒｅ）が著しく増したことから、ＧＤＦ－１５の増加がＨＩＥモデルマウスに対する治療効果をもたらした可能性もある。
＜実施例１３＞
　培地中へのサルファタイドの添加量と、それによりヒト臍帯由来間葉系幹細胞から得られる細胞外小胞（ＥＶｓ）に含まれるＧＤＦ－１５の量との関係
　実施例１と同様の方法に沿って、サルファタイドの添加量（０Ｍ（ＰＢＳ）、５．５μＭ、８．２５μＭ、１１μＭ、１６．５μＭ又は２２μＭ）を変えて臍帯由来間葉系幹細胞を培養し、細胞外小胞（ＥＶｓ）の分泌量に与える影響を観察した。タンパク質量による定量（ｍｉｃｒｏＢＣＡ法）及びＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ（抗ＧＤＦ－１５抗体、抗ＣＤ８１抗体、ＣＤ９抗体、抗β－アクチン抗体）により、各タンパク質の発現量を比較した。
　その結果、臍帯由来間葉系幹細胞のＥＶｓにおけるＧＤＦ－１５の発現量はサルファタイド濃度に依存して増加することが明らかとなった（図１７）。
＜実施例１４＞
　培地中へのサルファタイドの添加後の培養時間と、それによりヒト臍帯由来間葉系幹細胞から得られる細胞外小胞（ＥＶｓ）に含まれるＧＤＦ－１５の量との関係
　実施例１と同様の方法に沿って、サルファタイドの添加の有無（０Ｍ（ＰＢＳ）又は１６．５μＭ）の条件で臍帯由来間葉系幹細胞を培養し、経時的に回収した細胞外小胞（ＥＶｓ）におけるＧＤＦ－１５の量を観察した。タンパク質量による定量（ｍｉｃｒｏＢＣＡ法）及びＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ（抗ＧＤＦ－１５抗体、抗ＣＤ８１抗体、ＣＤ９抗体、抗β－アクチン抗体）により、各タンパク質の発現量を比較した。
　その結果、臍帯由来間葉系幹細胞のＥＶｓにおけるＧＤＦ－１５の発現量はサルファタイド添加後の経過時間に依存して増加することが明らかとなった（図１８）。
＜実施例１５＞
　添加する硫酸化合物の違いによる、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞からの細胞外小胞（ＥＶｓ）に含まれるＧＤＦ－１５の量への影響
　実施例１と同様の方法に沿って、各種硫酸化合物（１５μｇ／ｍＬ）を含むＥＶｓフリー培地に交換して臍帯由来間葉系幹細胞を培養し、７２時間後に回収した細胞外小胞（ＥＶｓ）におけるＧＤＦ－１５の量を観察した。タンパク質量による定量（ｍｉｃｒｏＢＣＡ法）及びＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ（抗ＧＤＦ－１５抗体、抗ＣＤ８１抗体、ＣＤ９抗体、抗β－アクチン抗体）により、各タンパク質の発現量を比較した。
　その結果、サルファタイド以外の硫酸化合物を添加しても、臍帯由来間葉系幹細胞のＥＶｓにおけるＧＤＦ－１５の発現量には変化がなかった（図１９）。
＜実施例１６＞
　添加する硫酸化合物の違いによる、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞からの細胞外小胞（ＥＶｓ）に含まれるＧＤＦ－１５の量への影響
　実施例１と同様の方法に沿って、各種硫酸化合物（１５μｇ／ｍＬ）を含むＥＶｓフリー培地に交換して臍帯由来間葉系幹細胞を培養し、７２時間後に回収した細胞外小胞（ＥＶｓ）におけるＧＤＦ－１５の量を観察した。タンパク質量による定量（ｍｉｃｒｏＢＣＡ法）及びＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ（抗ＧＤＦ－１５抗体、抗ＣＤ８１抗体、ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗β－アクチン抗体）により、各タンパク質の発現量を比較した。
　その結果、サルファタイドと同様に、セミノリピドを添加しても、臍帯由来間葉系幹細胞のＥＶｓにおけるＧＤＦ－１５の発現量が増加した（図２０）。しかしながら、一般にＥＶｓの分泌を促進すると知られているスフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）は、ＥＶｓにおけるＧＤＦ－１５の量を増加しなかった（図２０）。
＜実施例１７＞
　サルファタイドの添加によるＧＤＦ－１５を高発現する細胞からの細胞外小胞（ＥＶｓ）に含まれるＧＤＦ－１５の量への影響
　「ＴＨＥ　ＨＵＭＡＮ　ＰＲＯＴＥＩＮ　ＡＴＬＡＳ」（ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／）において、ＧＤＦ－１５を高発現する細胞を調べた（図２１）。
　当該データベースにより特定された細胞のうち、骨髄細胞、特に白血病患者由来の細胞株であるＫ５６２細胞を用いて実験を行った。実施例１と同様の方法に沿って、サルファタイドの添加の有無（０Ｍ（ＰＢＳ）又は１６．５μＭ）の条件でＫ５６２細胞を培養し、細胞外小胞（ＥＶｓ）におけるＧＤＦ－１５の発現量を観察した。タンパク質量による定量（ｍｉｃｒｏＢＣＡ法）及びＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ（抗ＧＤＦ－１５抗体、抗ＴＧＦ－β抗体、抗ＣＤ８１抗体、ＣＤ９抗体、抗β－アクチン抗体）により、各タンパク質の発現量を比較した。
　その結果、Ｋ５６２細胞のＥＶｓにおけるＧＤＦ－１５の発現量はサルファタイドの添加によって増加することが明らかとなった（図２２）。
＜実施例１８＞
　サルファタイドの添加によるＧＤＦ－１５を高発現する細胞からの細胞外小胞（ＥＶｓ）に含まれるＧＤＦ－１５の量への影響
　実施例１と同様の方法に沿って、サルファタイドの添加の有無（０Ｍ（ＰＢＳ）又は１６．５μＭ）の条件で、イヌ腎臓由来細胞株（ＭＤＣＫ細胞、ヒト腎がん由来細胞株（ＫＭＲＣ－２０）、Ｌ１ＣＡＭノックアウト－ＫＭＲＣ－２０細胞、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞、ヒト神経芽腫細胞株（ＳＨＳＹ－５Ｙ）を培養し、細胞外小胞（ＥＶｓ）におけるＧＤＦ－１５の発現量を観察した。タンパク質量による定量（ｍｉｃｒｏＢＣＡ法）及びＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ（抗ＧＤＦ－１５抗体）により、各タンパク質の発現量を比較した。なお、Ｌ１ＣＡＭノックアウト－ＫＭＲＣ－２０細胞は、サルファタイドの受容体候補として挙げられた分子であるＬ１ＣＡＭをノックアウトした細胞株である。
　その結果、ヒト腎がん由来細胞株であるＫＭＲＣ－２０やヒト神経芽腫細胞株であるＳＨＳＹ－５Ｙを用いた場合であっても、サルファタイドの添加によって、ＥＶｓにおけるＧＤＦ－１５の発現量が増加することが明らかとなった（図２３）。また、サルファタイドの受容体候補として挙げられた分子であるＬ１ＣＡＭをノックアウトした細胞株であっても、サルファタイドの添加によってＥＶｓにおけるＧＤＦ－１５の発現量が増加した（図２３）。
＜実施例１９＞
　サルファタイドの添加によるＧＤＦ－１５を高発現する細胞からの細胞外小胞（ＥＶｓ）に含まれるＧＤＦ－１５の量への影響
　基本的には実施例１に沿って実験を行った。各細胞（ヒト臍帯由来間葉系幹細胞、Ｋ５６２細胞、ＫＭＲＣ－２０細胞、又はＳＨＳＹ－５Ｙ細胞）を１００％コンフルエントになるまで培養した。サルファタイド（１６．５μＭ）を含む培地に交換して、３日後の培養上清から、ＥＶｓを回収した。タンパク質量をｍｉｃｒｏＢＣＡ法で定量し、０．２μｇをＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ（抗ＧＤＦ－１５抗体）に供した。
　その結果、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞に由来するＥＶｓに最も多くＧＤＦ－１５が含まれていた（図２４）。

Claims (27)

  1. 　膜表面のフォスファチジルセリンが低発現する細胞外小胞（低ＰＳ細胞外小胞）を含む細胞外小胞集団の製造方法であって、
    　（１）硫酸化糖脂質、コレステロール硫酸及び薬学的に許容されるその塩からなる群から１又は複数選択される硫酸化合物を含む培地で動物細胞を培養する工程、及び
    　（２）前記工程（１）を実施後の前記培地に含まれる細胞外小胞集団を回収する工程、
    を含む、方法。
  2. 　前記硫酸化糖脂質が、サルファタイド及びセミノリピドからなる群から１又は複数選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記動物細胞が、Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ－１５（ＧＤＦ－１５）高発現細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記ＧＤＦ－１５高発現細胞が、間葉系細胞、女性生殖系細胞、骨髄由来細胞、内皮系細胞、肝臓系細胞、腎がん由来細胞、又は神経芽腫由来細胞である、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記ＧＤＦ－１５高発現細胞が、間葉系幹細胞である、請求項３に記載の方法。
  6. 　前記間葉系幹細胞が、骨髄、脂肪組織、臍帯、歯髄、滑膜、胎盤、及び／もしくは卵膜由来の間葉系幹細胞、並びに／又は、多能性幹細胞から分化誘導して得られた間葉系幹細胞である、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記間葉系幹細胞が、臍帯由来の間葉系幹細胞である、請求項５に記載の方法。
  8. 　前記低ＰＳ細胞外小胞において、フォスファチジルセリンの含量が、前記硫酸化合物の非存在下で培養した前記動物細胞から分泌される細胞外小胞と比較して、０．５倍以下である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記細胞外小胞集団が、膜表面のフォスファチジルセリンが高発現する細胞外小胞（高ＰＳ細胞外小胞）を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記細胞外小胞集団が神経系疾患の治療に用いられる、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　前記神経系疾患が、虚血性脳症又は外傷性脳損傷である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記細胞外小胞集団が、ｍｉＲ－１７及びｍｉＲ－１０６からなる群から選択されるマイクロＲＮＡを高含有する細胞外小胞を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　前記細胞外小胞集団が、ＧＤＦ－１５を高含有する細胞外小胞を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法により得られる、膜表面のフォスファチジルセリンが低発現する細胞外小胞（低ＰＳ細胞外小胞）を含む細胞外小胞集団。
  15. 　膜表面のフォスファチジルセリンが低発現する、動物細胞由来の細胞外小胞（低ＰＳ細胞外小胞）を含む細胞外小胞集団。
  16. 　前記細胞外小胞が、Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ－１５（ＧＤＦ－１５）高発現細胞由来である、請求項１５に記載の細胞外小胞集団。
  17. 　前記ＧＤＦ－１５高発現細胞が、間葉系幹細胞、女性生殖系細胞、骨髄由来細胞、腎がん由来細胞、又は神経芽腫由来細胞である、請求項１６に記載の細胞外小胞集団。
  18. 　前記ＧＤＦ－１５高発現細胞が、間葉系幹細胞である、請求項１６に記載の細胞外小胞集団。
  19. 　前記間葉系幹細胞が、骨髄、脂肪組織、臍帯、歯髄、滑膜、胎盤、及び／もしくは卵膜由来の間葉系幹細胞、並びに／又は、多能性幹細胞から分化誘導して得られた間葉系幹細胞である、請求項１８に記載の細胞外小胞集団。
  20. 　前記間葉系幹細胞が、臍帯由来の間葉系幹細胞である、請求項１８に記載の細胞外小胞集団。
  21. 　前記低ＰＳ細胞外小胞において、フォスファチジルセリンの含量が、硫酸化糖脂質、コレステロール硫酸及び薬学的に許容されるその塩からなる群から１又は複数選択される硫酸化合物の非存在下で培養した前記動物細胞から分泌される細胞外小胞と比較して、０．５倍以下である、請求項１５～２０のいずれか１項に記載の細胞外小胞集団。
  22. 　前記細胞外小胞集団が、膜表面のフォスファチジルセリンが高発現する細胞外小胞（高ＰＳ細胞外小胞）を含む、請求項１５～２１のいずれか１項に記載の細胞外小胞集団。
  23. 　前記細胞外小胞集団が、神経系疾患の治療に用いられる、請求項１５～２２のいずれか１項に記載の細胞外小胞集団。
  24. 　前記神経系疾患が、虚血性脳症又は外傷性脳損傷である、請求項２３に記載の細胞外小胞集団。
  25. 　前記細胞外小胞集団が、ｍｉＲ－１７及びｍｉＲ－１０６からなる群から選択されるマイクロＲＮＡを高含有する細胞外小胞を含む、請求項１５～２４のいずれか１項に記載の細胞外小胞集団。
  26. 　前記細胞外小胞集団が、ＧＤＦ－１５を高含有する細胞外小胞を含む、請求項１５～２５のいずれか１項に記載の細胞外小胞集団。
  27. 　必要とする対象において神経系疾患を治療または予防するための方法であって、
    　請求項１５～２６のいずれか１項に記載の細胞外小胞集団を前記対象に投与すること、
    を含む、方法。
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