ES2910115T3 - Células madre mesenquimales preacondicionadas con trombina para el tratamiento de la EIH neonatal - Google Patents

Células madre mesenquimales preacondicionadas con trombina para el tratamiento de la EIH neonatal Download PDF

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Abstract

Composición farmacéutica para la utilización en la prevención o el tratamiento de la encefalopatía isquémica hipóxica (EIH) neonatal, que comprende células madre tratadas con trombina o exosomas derivados de las mismas a modo de un ingrediente activo.

Description

DESCRIPCIÓN
Células madre mesenquimales preacondicionadas con trombina para el tratamiento de la EIH neonatal
Campo técnico
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de la encefalopatía isquémica hipóxica neonatal (EIH), que incluye células madre tratadas con trombina o un exosoma derivado de las mismas a modo de un ingrediente activo.
Antecedentes de la técnica
Se ha informado de que la EIH neonatal supone el 23 % de las causas de todas las muertes neonatales, y en el caso de daños graves, aproximadamente 50 % a 100 % de los pacientes muere, y en 65 % a 75 % de los supervivientes, se mantienen deterioros motores/cognitivos graves, convulsiones, etc. durante toda la vida. La única terapia existente para la EIH es la hipotermia terapéutica, aunque su efecto es insignificante y, de esta manera, aproximadamente el 44 % de los pacientes sometidos a hipotermia terapéutica muere o sufre secuelas neurológicas a largo plazo, y la hipotermia terapéutica no posee ningún efecto de mejora, particularmente en el tipo grave. Por este motivo, debido a la intratabilidad, el desarrollo de métodos terapéuticos eficaces y significativos para la EIH neonatal es una necesidad muy importante y urgente.
Además, debido a que la baja tasa de fertilidad en Corea no se está incrementando a pesar de las diversas políticas de apoyo gubernamental, la reducción de la morbilidad del neonato será el método más eficiente y fiable para incrementar la futura población económica efectiva. Por lo tanto, el desarrollo de agentes terapéuticos altamente eficaces de nueva generación para tratar la EIH neonatal, que explica una parte significativa de las muertes neonatales totales y que causa graves complicaciones durante sus vidas, es una necesidad urgente en países con baja fertilidad.
Por otra parte, las células madre se conocen como células que participan en la regeneración, tratamiento y respuestas inmunitarias de los tejidos, así como por su potencial de diferenciación y, por lo tanto, se han realizado esfuerzos para aislar y cultivar células madre mesenquimales a partir de sangre de cordón umbilical o médula ósea utilizando dichas características para desarrollarlas como un agente terapéutico para diversas enfermedades y síntomas. Sin embargo, dicho método con las células madre mismas presenta las limitaciones y efectos secundarios siguientes.
En primer lugar, básicamente un agente terapéutico celular podría no excluir la posibilidad de tumorigenicidad debido a la transferencia de ADN; en segundo lugar, debido a que las células madre son grandes, pueden producirse obstrucciones vasculares o infarto de miocardio; en tercer lugar, existe el problema del rechazo debido a un antígeno de superficie celular en el trasplante (aloinjerto) con células alogénicas, tal como sangre del cordón, y en cuarto lugar, generalmente resulta difícil de preparar un agente terapéutico celular y adolece de muchas limitaciones de almacenamiento y transporte y elevados costes de producción. De esta manera, debido a las limitaciones inherentes a las células madre, se han desarrollado métodos de mejora de la eficacia de la manipulación génica como métodos para reducir los efectos secundarios y para mejorar los efectos terapéuticos (solicitud no examinada de patente coreana n° 10-2017-0099382, etc.), aunque actualmente no existen alternativas claras.
Los exosomas son vesículas pequeñas estructuradas como membranas (con un diámetro de entre aproximadamente 30 y 100 nm) secretadas por diversas células, que no están directamente separadas de la membrana plasmática, sino que se originan a partir de compartimientos intracelulares específicos denominados cuerpos multivesiculares (CMV), y que son liberadas y secretadas al exterior de las células, tal como se ha observado en la investigación mediante microscopía electrónica. En otras palabras, al fusionar los CMV con la membrana plasmática, las vesículas se liberan al medio extracelular y se denominan exosomas. Aunque no se conoce exactamente qué mecanismos moleculares producen los exosomas, se conocen diversos tipos de células inmunitarias, incluyendo linfocitos B, linfocitos T, células dendríticas, trombocitos y macrófagos, así como eritrocitos, células tumorales y células madre producidas y secretadas por exosomas en estado vivo.
Particularmente, es conocido que los exosomas derivados de las células madre contienen un componente nuclear, así como un receptor y una proteína y, por lo tanto, participan en la comunicación intercelular. Además, los exosomas derivados de células madre contienen relativamente menos suero animal que las células madre, y de esta manera, también puede descartarse el riesgo de síntomas causados por la infección por suero animal (zoonosis). Considerando las características de dichos exosomas, la terapia celular con exosomas se espera que se convierta en un nuevo paradigma que supere las limitaciones de la terapia actual de células madre.
Exposición
Problema técnico
Por lo tanto, como resultado de que los inventores han llevado a cabo estudios intensivos para superar las limitaciones de los agentes terapéuticos de células madre actuales y mejorar la eficacia terapéutica para la EIH neonatal, se ha confirmado que las células madre/exosomas tratadas con trombina no sólo mantienen la estabilidad celular de las células madre no expuestas existentes y presentan una eficacia reforzada mediante la secreción de diversos factores de crecimiento, aunque también presentan un mayor efecto protector frente a la muerte de las células nerviosas, en comparación con las células madre no expuestas, y de esta manera se ha completado la presente invención.
De acuerdo con lo anterior, la presente invención se refiere a proporcionar una composición farmacéutica para la utilización en la prevención o tratamiento de la EIH neonatal, que incluye células madre tratadas con trombina o exosomas derivados a partir de las mismas.
Sin embargo, los problemas técnicos que deben resolverse en la presente invención no se encuentran limitados a los problemas anteriormente indicados y el experto ordinario en la materia entenderá de otros problemas que no se describen en la presente memoria, a partir de la descripción siguiente.
Solución técnica
La presente invención proporciona una composición farmacéutica para la utilización en la prevención o tratamiento de la EIH neonatal, que incluye células madre tratadas con trombina o exosomas derivados a partir de las mismas a modo de un ingrediente activo.
En una realización ejemplar de la presente invención, las células madre se seleccionan del grupo que consiste en células madre mesenquimales, células estromales mesenquimales derivadas de tejido humano, células madre mesenquimales derivadas de tejido humano y células madre multipotentes.
En otra realización ejemplar de la presente invención, las células madre mesenquimales se derivan de médula umbilical, sangre del cordón, médula ósea, grasa, músculo, nervios, piel, líquido amniótico o placenta.
En todavía otra realización ejemplar de la presente invención, el tratamiento de la EIH neonatal se caracteriza por la inhibición de la muerte de las células nerviosas.
En todavía otra realización ejemplar de la presente invención, la composición farmacéutica se administra en un ventrículo cerebral o vaso sanguíneo de un sujeto.
En todavía otra realización ejemplar de la presente invención, la composición farmacéutica incluye además un componente complementario seleccionado del grupo que consiste en un medio de cultivo, una citoquina, un factor de crecimiento y un gen.
En todavía otra realización ejemplar de la presente invención, las células madre tratadas con trombina o los exosomas derivados a partir de las mismas presenta una expresión incrementada de un factor de crecimiento, de un factor inmunomodulador, de n factor antioxidante o de un factor de regeneración, en comparación con un grupo no tratado con trombina.
En todavía otra realización ejemplar de la presente invención, el factor de crecimiento es un factor neurotrópico derivado del cerebro (FNDC), un factor de crecimiento fibroblástico (FCF), un factor de crecimiento de hepatocitos (FCH), un factor de crecimiento nervioso (FCN) o un factor de crecimiento endotelial vascular (FCEV).
Además, la presente invención proporciona una preparación farmacéutica para la utilización en la prevención o el tratamiento de la EIH neonatal, que contiene la composición.
En una realización ejemplar de la presente invención, la preparación se encuentra en una forma para inyección, infusión o pulverización.
En otra realización ejemplar de la presente invención, la preparación incluye además un portador farmacéuticamente aceptable.
Efectos ventajosos
Según la presente invención, las células madre tratadas con trombina o los exosomas derivados a partir de las mismas presentan una expresión incrementada de un factor de crecimiento, de un factor inmunomodulador, de un factor antioxidante o de un factor de regeneración y de mayor efecto inhibidor de la muerte de las células nerviosas en comparación con un grupo no tratado con trombina, y por lo tanto, presentan un excelente efecto terapéutico de la EIH neonatal con solo una pequeña cantidad. De esta manera, la presente invención puede reducir significativamente los costes de producción de un agente terapéutico.
Debido a que el efecto terapéutico basado en exosomas de la presente invención es una preparación libre de células, existe un riesgo bajo de oncogénesis ya que no hay ADN y no existe el problema del rechazo del trasplante debido a que no hay antígenos de superficie celular. Además, debido a que el agente terapéutico basado en exosomas de la presente invención es más pequeño que las células, no existe el riesgo de bloqueo de microvasos con la administración sistémica, y debido a que el agente terapéutico basado en exosomas de la presente invención es un material separado, y no de células, puede desarrollarse en forma de un producto listo para utilizar, y de esta manera, pueden reducirse los costes de producción.
En consecuencia, según la presente invención, el agente terapéutico basado en exosomas de la presente invención puede resolver problemas del agente terapéutico de células madre convencional y mejorar significativamente la eficacia terapéutica y, de esta manera, puede resultar útil en el tratamiento de la EIH neonatal.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 muestra los resultados del análisis de imágenes de MET, confirmando que la secreción de exosomas resulta activada por el tratamiento de las células madre con trombina.
La FIG. 2 muestra el resultado de la transferencia western, confirmando que CD63 y CD9, que son marcadores de exosomas, se expresan normalmente en los exosomas derivados de células madre tratadas con trombina.
La FIG. 3 muestra los resultados de un inmunoensayo, que confirman que la expresión de factores de crecimiento (FNDC, FCF, FCH, FCN y FCEV) y de una citoquina antiinflamatoria (IL-6) en las células madre y en los exosomas se incrementa debido al tratamiento con trombina.
La FIG. 4 muestra el resultado del ensayo de MTT, que muestra el efecto inhibidor de las células madre tratadas con trombina de la muerte de las células nerviosas en un modelo in vitro de EIH.
La FIG. 5 muestra el resultado del ensayo de MTT, que muestra el efecto inhibidor de exosomas derivados de células madre tratadas con trombina de la muerte de las células nerviosas en un modelo in vitro de EIH.
Las FIGS. 6A y 6B muestran resultados que confirman el efecto terapéutico de la EIH de las células madre tratadas con trombina utilizando un modelo animal.
Modos de la invención
La presente invención proporciona una composición farmacéutica para la utilización en la prevención o el tratamiento de la EIH neonatal, que incluye células madre tratadas con trombina o exosomas derivados a partir de las mismas a modo de un ingrediente activo.
La "célula madre" utilizada en la presente memoria se refiere a células no diferenciadas que presentan autorreplicabilidad y la capacidad de diferenciarse en dos o más tipos diferentes de células. Las células madre de la presente invención pueden ser células madre autólogas o alogénicas, y pueden obtenerse a partir de cualquier tipo de animal, tal como un ser humano o un mamífero no humano, o de un adulto o de un embrión, aunque la presente invención no se encuentra limitada a ellos.
Entre las células madre de la presente invención pueden incluirse células madre embrionarias o células madre adultas, y preferentemente, células madre adultas. Las células madre adultas pueden ser células madre mesenquimales, células estromales mesenquimales derivadas de tejido humano, células madre mesenquimales derivadas de tejido humano, o células madre multipotentes, y preferentemente, células madre mesenquimales, aunque la presente invención no se encuentra limitada a las mismas. Las células madre mesenquimales pueden obtenerse a partir del cordón umbilical, sangre del cordón, médula ósea, grasa, músculo, nervios, piel, líquido amniótico o placenta, aunque la presente invención no se encuentra limitada a ellos.
La "sangre del cordón" utilizada en la presente memoria se refiere a sangre obtenida de la vena umbilical que conecta la placenta y el feto. La sangre del cordón, que es un producto secundario que se produce naturalmente durante el parto, resulta mucho más fácil de obtener que el tejido mesenquimal general, que requiere múltiples operaciones, y comparado con el trasplante de médula ósea, y desde que se ha activado la industria del almacenamiento de sangre del cordón y ya se ha establecido la infraestructura, resulta más fácil conseguir donantes. Además, debido a que las células derivadas de sangre del cordón son células que no expresan el antígeno de histocompatibilidad HLA-DR (clase II), que es la causa más importante de rechazo en el trasplante de tejidos u órganos, no puede inducir, o puede minimizar, las respuestas inmunitarias, tales como el rechazo, que convencionalmente se convierte en un problema en el trasplante y, por lo tanto, también puede utilizarse sangre de cordón alogénica, así como sangre de cordón autóloga.
Los "exosomas" utilizados en la presente memoria se refieren a vesículas pequeñas con estructura de membranas (con un diámetro de entre aproximadamente 30 y 100 nm), secretadas de diversas células, y a vesículas liberadas al medio extracelular debido a la fusión de los CMV y la membrana plasmática. Entre los exosomas se incluyen exosomas naturales y exosomas secretados artificialmente.
La "encefalopatía isquémica hipóxica (EIH)" utilizada en la presente memoria se refiere a una condición en las que funciones o estructura cerebral resulta modificada debido a una deficiencia grave de oxígeno en el cerebro, y aunque esta condición puede ser temporal y un paciente puede recuperarse de la misma, en ocasiones es irreversible y se produce un daño permanente.
La "prevención o tratamiento de la EIH" utilizada en la presente memoria incluye síntomas reducidos, aliviados y mejorados de EIH y la reducción de la morbilidad de la EIH.
Las "células madre tratadas con trombina" utilizadas en la presente memoria puede presentar una función/eficacia de las células madre reforzada en comparación con las células madre no tratadas, debido a un incremento de la propiedad paracrina, que es el mecanismo de acción principal de las células madre, sin ningún cambio en la estabilidad celular, tal como la viabilidad celular, la función oxidativa o similares. Además, el tratamiento de trombina no sólo potencia la eficacia terapéutica de los exosomas derivados de las células madre, sino que también incrementa la secreción de exosomas.
En la presente memoria, un factor de crecimiento, un factor inmunomodulador, un factor antioxidante o un factor de regeneración puede incrementarse de modo paracrino, y particularmente, el factor de crecimiento se refiere a un material fisiológicamente activo de tipo proteico que estimula la división, crecimiento o diferenciación celular, y puede incluir FNDC, FCF, FCH, FCN, FCEV e interleuquina-6 (IL-6).
La composición farmacéutica utilizada en la presente invención puede administrarse en el sujeto por diversas vías, aunque sin limitación, por ejemplo por vía oral o parenteral, y preferentemente se administra en un ventrículo cerebral o un vaso sanguíneo.
La composición farmacéutica utilizada en la presente invención puede contener además uno o más componentes complementarios que presentan un efecto terapéutico de la EIH. Por ejemplo, la composición farmacéutica de la presente invención puede incluir además uno o más componentes complementarios seleccionado del grupo que consiste en genes eficaces en el tratamiento de la EIH (p.ej., un gen de citoquina antiinflamatoria, ARNip o un cebador antisentido para una citoquina inflamatoria) o un vector de expresión que incluye los mismos, citoquinas que proporcionan un efecto autocrino o paracrino (p.ej., interleuquina-10), factores de crecimiento (p.ej., factor de crecimiento de queratinocitos) y una combinación de los mismos.
Una dosis preferente de la composición farmacéutica utilizada en la presente invención puede depender de la condición y peso corporal del sujeto, de la gravedad de la enfermedad, del tipo de fármaco, de la vía de administración y de la duración de la misma, y puede ser convenientemente seleccionada por el experto ordinario en la materia. La composición puede administrarse una vez al día o en dosis divididas, aunque la presente invención no se encuentra limitada a las mismas.
Para el tratamiento de la IEH, la composición farmacéutica utilizada en la presente invención puede utilizarse independientemente, o en combinación con cirugía, radioterapia, terapia hormonal, quimioterapia y métodos de utilización de un modulador de una reacción biológica.
La composición utilizada en la presente invención puede incluir además un portador adecuado utilizado convencionalmente en la preparación de una composición farmacéutica. Por ejemplo, en el caso de una formulación para inyección, puede incluirse un conservante, un agente de alivio del dolor, un solubilizador o un estabilizante, y en el caso de una preparación para la administración tópica, puede incluirse además una base, un excipiente, un lubricante o un conservante.
La composición utilizada en la presente invención puede prepararse para formularse en forma de una preparación de dosis unitaria, adecuada para la administración en el cuerpo de un sujeto según un método convencional en el campo farmacéutico. Entre las formas adecuadas para el objetivo anteriormente indicado se incluyen una formulación inyectable, tal como una ampolla para inyección, una formulación de infusión contenida en una bolsa de infusión, y una formulación para pulverización, tal como un aerosol como preparaciones para la administración parenteral. La ampolla para inyección puede prepararse mediante la mezcla con una solución para inyección inmediatamente antes de la utilización, y como solución para inyección, puede utilizarse solución salina fisiológica, glucosa o una solución de Ringer. Además, la bolsa de infusión puede realizarse en cloruro de polivinilo o polietileno. En la presente invención, la administración se refiere a proporcionar una composición predeterminada utilizada en la presente invención en un sujeto mediante cualquier método adecuado.
Una dosis preferente de la composición farmacéutica utilizada en la presente invención varía según la condición y peso corporal del sujeto, la gravedad de la enfermedad, el tipo de fármaco, la vía de administración y la duración de la misma, y puede ser convenientemente seleccionada por el experto ordinario en la materia. La administración de la composición puede llevarse a cabo una vez al día o en dosis divididas, aunque la presente invención no se encuentra limitada a la misma.
A continuación, en la presente memoria, para ayudar a comprender la presente invención, se proponen ejemplos ejemplares. Sin embargo, los ejemplos a continuación se proporcionan meramente para entender más fácilmente la presente invención y no para limitarla.
Ejemplos
Ejemplo 1: Inducción de una eficacia mejorada por el tratamiento de células madre con trombina.
1-1. Inducción de la secreción de exosomas con trombina.
Se sembraron células madre mesenquimales (3x105) derivadas de sangre de cordón humano en una placa de cultivo de 60 mm (Orange Scientific, n° de cat. 4450200) y se cultivaron durante 1 semana. Tras confirmar que las células habían proliferado hasta la saturación en la placa de cultivo, se sustituyó el medio de cultivo por un medio de cultivo sin suero (medio MEM alfa)) en el que se habían diluido 50 unidades/ml de trombina (REYON Pharmaceutical Co., Ltd.) y las células se incubaron nuevamente durante 6 horas, obteniendo de esta manera células madre tratadas con trombina.
Después, para confirmar si la secreción de exosomas en las células madre mesenquimales se había activado por el tratamiento de trombina, se confirmó el proceso de secreción de exosomas mediante imágenes de microscopía electrónica por transmisión (MET). Como resultado, tal como se muestra en la FIG. 1, puede observarse que la estimulación con trombina induce la secreción de exosomas.
Además, se dispensó la solución de cultivo en tubos de centrífuga y se sometió a centrifugación a 4°C y a 100.000 rpm durante 30 minutos y se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo para eliminar los residuos celulares. Nuevamente, se ultracentrifugó el sobrenadante a 4°C y a 100.000 rpm durante 2 horas y después se eliminó nuevamente el sobrenadante, obteniendo de esta manera exosomas (concentración final: 15 pg/ml).
En la presente memoria, para confirmar que el producto obtenido eran exosomas, se utilizó la transferencia western para verificar la expresión de marcadores de exosoma conocidos, tales como CD63 y CD9 (System Biosciences, Mountain View, CA, EE.UU.). Como resultado, tal como se muestra en la FIG. 2, los exosomas obtenidos de células madre tratadas con trombina expresaban normalmente CD63 y CD9, confirmando que eran exosomas.
1-2. Eficacia potenciada por trombina de las células madre/exosomas.
Se confirmó si las células madre y exosomas obtenidos en el Ejemplo 1-1 se habían incrementado la expresión de un factor de crecimiento o una citoquina antiinflamatoria, tal como IL-6, con el tratamiento de trombina.
Específicamente, se lisaron las membranas celulares con un tampón de lisis a fin de aislar las proteínas a partir de las células/exosomas, y se midieron los niveles de FNDC, FCF, FCH, FCN, FCEV e IL-6 utilizando un kit de inmunoensayo Procarta (Affymetrix, EE.UU.).
Como resultado, tal como se muestra en la FIG. 3, el tratamiento de trombina incrementó la expresión de FNDC, FCF, FCH, FCN, FCEV e IL-6, en comparación con el nivel en células madre no tratadas con trombina o exosomas obtenidos a partir de ellas (control; normal).
Este resultado muestra que la regeneración celular, la regeneración de vasos sanguíneos y la eficacia antiinflamatoria de las células madre o los exosomas derivados a partir de ellas resultan potenciados por el tratamiento de trombina.
Ejemplo 2: construcción de modelo in vitro de EIH neonatal.
T ras 18,5 días de embarazo, se diseccionó el abdomen inferior de una rata SD para extraer el feto y después se extrajo cuidadosamente el cerebro completo. Sólo se separó cuidadosamente el córtex cerebral respecto del tejido cerebral extraído; se separó en células individuales con una pipeta y después se cultivó en una solución de cultivo de células nerviosas. Tras 10 días de cultivo, las células se expusieron a un medio libre de glucosa bajo condiciones de hipoxia al 1% (privación de oxígeno y glucosa (POG)) durante 60 minutos, construyendo de esta manera un modelo in vitro de EIH neonatal.
Ejemplo 3: efecto inhibidor in vitro sobre la muerte de las células nerviosas de las células madre tratadas con trombina.
El modelo in vitro de EIH neonatal construido en el Ejemplo 2 se trató con las células madre tratadas con trombina obtenidas en el Ejemplo 1 y después se evaluó la viabilidad de las células nerviosas mediante ensayo de MTT.
Como resultado, tal como se muestra en la FIG. 4, en comparación con las células nerviosas (CN) normales, en el modelo in vitro de EIH (POG), la muerte de células nerviosas se incrementó significativamente debido a la privación de oxígeno/glucosa, mientras que en el "grupo de EIH neonatal in vitro tratado con células madre pretratadas con trombina (POG+CMM_pre trombina)" en comparación con un grupo de células madre no tratadas con trombina (POG+CMM no expuestas) o un grupo de células madre pretratadas con hipoxia (POG+CMM pre hipoxia), la muerte de las células nerviosas resultó considerablemente inhibida, demostrando que las células madre tratadas con trombina mostraban el efecto protector de las células nerviosas más excelente.
Ejemplo 4: efecto inhibidor in vitro sobre la muerte de las células nerviosas de los exosomas derivados de células madre tratadas con trombina.
El modelo in vitro de EIH neonatal construido en el Ejemplo 2 se trató con exosomas derivados de las células madre tratadas con trombina obtenidas en el Ejemplo 1 y se evaluó la viabilidad de las células nerviosas mediante ensayo de MTT.
Como resultado, tal como se muestra en la FIG. 5, en comparación con las células nerviosas (CN) normales, en el modelo in vitro de EIH (POG), la muerte de las células nerviosas se incrementó significativamente debido a la privación de oxígeno/glucosa, mientras que, en un "grupo de EIH neonatal tratado con exosomas derivados de células madre pretratadas con trombina (POG+VE de CMM_pre trombina)", en comparación con un grupo tratado con exosomas derivados de células madre no tratadas con trombina (POG+VE de CMM no expuestas) o un grupo tratado con exosomas derivados de células madre tratadas por hipoxia (POG+VE de CMM pre hipoxia), se informó de que la muerte de las células nerviosas no resultaba inhibida significativamente.
Por lo tanto, al igual que las células madre tratadas con trombina de la presente invención, también se verificó que los exosomas derivados a partir de las mismas mostraban un excelente efecto protector de las células nerviosas.
Ejemplo 5: verificación de la actividad terapéutica de las células madre tratadas con trombina sobre la EIH (in vivo).
Con el fin de confirmar la actividad terapéutica de las células madre tratadas con trombina sobre la EIH utilizando modelos animales, se llevó un experimento de la manera siguiente.
Actualmente, la hipotermia terapéutica es la única terapia paliativa aplicada clínicamente para el tratamiento de la EIH. Por este motivo, también en el experimento animal, de manera similar al entorno clínico, después de la inducción de EIH y de someter el modelo animal a hipotermia terapéutica, se confirmó que la enfermedad mejoraba al añadir células madre para el tratamiento combinado, y los grupos clasificados para el experimento fueron los siguientes:
(1) CN: control normal
(2) EIH+S: control enfermo (tras la inducción de la enfermedad, tratamiento con solución salina).
(3) EIH+H+GW: tratamiento con células madre no tratadas con trombina tras la inducción de EIH y tratamiento de hipotermia.
(4) EIH+H+GW.tromb.: tratamiento con células madre tratadas con trombina tras la inducción de EIH y tratamiento de hipotermia.
Como resultado, tal como se muestra en la FIGS. 6A y 6B, en comparación con el grupo CN normal, se confirmó que, en todos los grupos de EIH de enfermedad inducida, se incrementaba significativamente la superficie de lesión cerebral. En el grupo que había sido sometido a pretratamiento de hipotermia tras la inducción de EIH y posteriormente tratado con células madre no tratadas con trombina, la superficie lesionada tendía a mejorar, aunque de manera no significativa. Sin embargo, en el grupo tratado con células madre tratadas con trombina, la superficie enferma tendía a mejorar adicionalmente, de manera significativa.
Aplicabilidad industrial
Con las células madre tratadas con trombina o los exosomas derivados de las mismas según la presente invención, incluso en una cantidad pequeña, el efecto de tratamiento contra la EIH neonatal era excelente; podían resolverse los problemas de los agentes terapéuticos convencionales de células madre y podía mejorarse significativamente la eficacia terapéutica de los mismos. Por lo tanto, las células madre tratadas con trombina o con exosomas derivados de las mismas según la presente invención pueden resultar útiles en el tratamiento de la EIH neonatal.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Composición farmacéutica para la utilización en la prevención o el tratamiento de la encefalopatía isquémica hipóxica (EIH) neonatal, que comprende células madre tratadas con trombina o exosomas derivados de las mismas a modo de un ingrediente activo.
2. Composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 1, en la que las células madre se seleccionan del grupo que consiste en células madre mesenquimales, células estromales mesenquimales derivadas de tejido humano, células madre mesenquimales derivadas de tejido humano y células madre multipotentes.
3. Composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 2, en la que las células madre mesenquimales se derivan de médula umbilical, sangre del cordón, médula ósea, grasa, músculo, nervios, piel, líquido amniótico o placenta.
4. Composición farmacéutica para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el tratamiento de la EIH neonatal se caracteriza por la inhibición de la muerte de las células nerviosas.
5. Composición farmacéutica para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se administra en un ventrículo cerebral o vaso sanguíneo.
6. Composición farmacéutica para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además un componente complementario seleccionado del grupo que consiste en un medio de cultivo, una citoquina, un factor de crecimiento y un gen.
7. Composición farmacéutica para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que las células madre tratadas con trombina o los exosomas derivados a partir de las mismas presenta una expresión incrementada de un factor de crecimiento, de un factor inmunomodulador, de un factor antioxidante o de un factor de regeneración, en comparación con un grupo no tratado con trombina.
8. Composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 7, en la que el factor de crecimiento es un factor neurotrópico derivado del cerebro (FNDC), un factor de crecimiento fibroblástico (FCF), un factor de crecimiento de hepatocitos (FCH), un factor de crecimiento nervioso (FCN) o un factor de crecimiento endotelial vascular (FCEV).
9. Preparación farmacéutica para la utilización en la prevención o el tratamiento de encefalopatía isquémica hipóxica neonatal (EIH), que comprende la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Preparación farmacéutica para la utilización según la reivindicación 9, que se encuentra en una forma para inyección, infusión o pulverización.
11. Preparación farmacéutica para la utilización según la reivindicación 9 o 10, que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.
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