CN105132375A - 一种肝癌干细胞的无血清培养基及其培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种肝癌干细胞的无血清培养基及其培养方法，以DMEM／F12+GlutaMAXTM-1培养基为基础，包括：人重组表皮生长因子、人重组碱性成纤维细胞生长因子-10、胰岛素一号增长因子、无血清补充营养成分、肝素、青霉素+链霉素双抗溶液。本发明带来了以下效果：1.本发明中的无血清培养基添加了三个特殊的生长因子并按相应比例配置；直接无血清培养，使肝癌细胞可以成球且成球率高，并可以连续稳定传代；2.本发明中生长因子可维持一小群细胞处于未分化状态；在肝癌干细胞无血清培养的基础研究及临床应用上将具有广泛的前景；为肝癌干细胞的研究提供了丰富的实验材料。
Description
技术领域
本发明属于生物细胞培养技术领域，具体涉及一种肝癌干细胞的无血清培养基及其培养方法。
背景技术
近年来肿瘤干细胞的理论研究已受到广泛关注，被认为是最主流的原因。Michor等认为干细胞是一类在原来的细胞中具有自我更新、无限增殖，多向分化的一部分极小群的细胞（HwangHI,LeeTH,JangYJ.Cellproliferation-inducingprotein52/Mitofilinisasurfaceantigenonundifferentiatedhumandentalpulpstemcells[J].StemCellsDev,2015）。然而在肿瘤细胞中也存在着肿瘤干细胞（cancerstemcells，CSC），并在成瘤潜能上具有强大的自我更新和无限增殖能力，也在肿瘤的发生、发展、转移及侵袭、复发中也同样起到至关重要的作用。
越来越多的人所认同肿瘤干细胞的存在，干细胞数量存在太少，不易分离，因此后续实验的开展比较困难。如何使其在体外有效的分离、培养，扩增，并以此为研究对象是我们思考的方向。在长期研究中，发现加入FGF和EGF的无血清培养液，使正常成体干细胞的体外扩增，并维持多向分化潜能。目前已经在乳腺癌、结肠癌、恶性神经系统肿瘤等实体瘤中分离培养得到了类似肿瘤干细胞的一群细胞。我们将以此为基础进行了肝癌干细胞的相关培养。
本发明采用直接无血清培养的方法，使得肝癌细胞可以成球并连续稳定传代，其用相关肝癌干细胞标志物的分选发现，从成球的肝癌细胞株中分离出较常规贴壁培养所得到的肝癌干样细胞量明显较多。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种肝癌干细胞的无血清培养基及其制备方法，用于肝癌细胞的培养，且该培养方法获得的肝癌干细胞具有自我更新能力、且富集。
一种肝癌干细胞的无血清培养基，以DMEM／F12+GlutaMAXTM-1培养基为基础，包括：人重组表皮生长因子、人重组碱性成纤维细胞生长因子-10、胰岛素一号增长因子、无血清补充营养成分、肝素、青霉素+链霉素双抗溶液。
优选的，相对于DMEM／F12+GlutaMAXTM-1基础培养基，人重组表皮生长因子的浓度为10-30ng/ml、人重组碱性成纤维细胞生长因子-10的浓度为10-30ng/ml、胰岛素一号增长因子的浓度为10-30ng/ml、无血清补充营养成分的浓度为1-3%、肝素的浓度为40-60mg/ml、青霉素+链霉素双抗溶液的浓度90-110U/ml。
所述的，DMEM／F12+GlutaMAXTM-1基础培养基、人重组表皮生长因子、人重组碱性成纤维细胞生长因子-10、胰岛素一号增长因子、无血清补充营养成分、肝素、青霉素+链霉素双抗溶液均可从市面公司购买得到。
优选的，EGF的最优浓度为20ng/ml、FGF-10的最优浓度为20ng/ml、IGF-1的最优质量浓度为20ng/ml、B27的最优质量浓度为2%、肝素的最优质量浓度为50mg/ml、青霉素+链霉素双抗溶液的最优浓度为100U/ml，浓度均相对于DMEM／F12+GlutaMAXTM-1培养基而言。
本发明还为肝癌干细胞的研究提供了丰富的实验材料。提供一种肝癌干细胞的无血清培养基的培养方法，包括以下几个步骤：
步骤A:培养基制备：在无菌超净工作台中将重组表皮生长因子EGF、人重组碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素一号增长因子，无血清补充营养成分B27、肝素、青霉素+链霉素双抗溶液添加至DMEM／F12+GlutaMAXTM-1培养基中，吹打混匀;
步骤B:复苏人肝癌细胞系：将细胞从液氮罐中取出后，水浴箱振荡使其充分均匀受热后快速融化；在超净工作台中，加入含质量浓度为10%FBS的高糖DMEM完全培养基,和冻存管中的DMSO混合，离心弃掉上清;再用含质量浓度为10%FBS高糖DMEM完全培养基重悬细胞，吹打混匀，于透气培养瓶中培养;
步骤C:肝癌细胞用含含质量浓度为10%FBS的DMEM高糖培养基进行常规培养，贴壁长至80%-90%时传代；吸去培养瓶中的培养基，培养瓶中加入PBS清洗后，加入含质量浓度为0.25%胰蛋白酶+为0.01%EDTA消化液，倒置显微镜下观察，见贴壁细胞开始变圆、漂浮脱落即加入按消化酶体积和完全培养基体积1:3的体积的含质量浓度为10%FBS的高糖DMEM的完全培养基终止消化，离心弃上清；PBS洗涤细胞后再离心；
步骤D:加入含添加生长因子的DMEM／F12+GlutaMAXTM-1培养基，吹打混匀，转入新培养瓶培养；
步骤E:当细胞球布满的密度为80%-90%时，吸取全部培养基和细胞离心，弃上清，PBS重悬后离心，加入含质量浓度为0.25%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化液消化，吹打成单细胞，终止消化，离心，加入含生长因子的DMEM／F12+GlutaMAXTM-1培养基传代，重复前述操作进行传代培养。
优选的，所述步骤B和步骤D中，所需的培养环境：温度为37℃、CO2的体积浓度为5%。
优选的，所述步骤E中，DMEM／F12+GlutaMAXTM-1培养基1:2或者1:3传代。
本发明带来了以下效果：1.本发明中的无血清培养基添加了三个特殊的生长因子并按相应比例配置；直接无血清培养，使肝癌细胞可以成球且成球率高，并可以连续稳定传代；2.本发明中生长因子可维持一小群细胞处于未分化状态；在肝癌干细胞无血清培养的基础研究及临床应用上将具有广泛的前景；为肝癌干细胞的研究提供了丰富的实验材料。
附图说明
图1为肝癌细胞系MHCC-97H和MHCC-97L的贴壁培养效果图（显微镜200倍）
图2为肝癌细胞系MHCC-97H和MHCC-97L的无血清培养效果图
A.MHCC-97H无血清培养第3天（显微镜200倍）。
B.MHCC-97H无血清培养第8天（显微镜200倍）。
C.MHCC-97L无血清培养第3天（显微镜200倍）。
D.MHCC-97L无血清培养第8天（显微镜200倍）。
图3为肝癌细胞系MHCC97H贴壁培养和无血清培养细胞流式荧光标记CD90表达量对比图。
A.MHCC97H同型对照组的表达量。
B.MHCC97H无血清培养流式荧光标记CD90+表达量。
C.MHCC97H同型对照组的表达量。
D.MHCC97H贴壁培养流式荧光标记CD90+表达量。
图4为肝癌细胞系MHCC97L贴壁培养和无血清培养细胞流式荧光标记CD90表达量对比图。
A.MHCC97L同型对照组的表达量。
B.MHCC97L无血清培养流式荧光标记CD90+表达量。
C.MHCC97L同型对照组的表达量。
D.MHCC97L贴壁培养流式荧光标记CD90+表达量。
图５为肝癌细胞系MHCC97L贴壁培养和无血清培养细胞细胞周期检测对比图。
Ａ.肝癌细胞系MHCC97H无血清培养细胞细胞周期图。
Ｂ.肝癌细胞系MHCC97H贴壁培养细胞细胞周期图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明：
本发明的适用于肝癌干细胞的培养，其他肿瘤干细胞是否适用应根据实际实施应用，具体描述如下。
本发明中实施例中用到的重要仪器设备：流式细胞仪为BD公司
本发明中实施例中用到的试剂如下：
1.DMEM／F12+GlutaMAXTM-1培养基:Gibco公司，
2.高糖DMEM培养基：Hyclone公司，
3.EGF、FGF-10、IGF-1及B27-supplement：Gibco公司，
4.肝素：BD公司，
5.青霉素+链霉素双抗溶液：Gibco公司，
6.胎牛血清FBS：Gibco公司，
7.透气无菌培养瓶：Corning公司，
8.流式荧光分选抗体及其同型对照CD90：BD公司，
9.0.25%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化液:Gibco公司，
10.细胞周期检测试剂盒:南京凯基生物科技发展有限公司，
11.Buffer:PBS（8.0gNaCl、0.2gKCl、0.2gKH2PO4、1.44gNa2HPO4·12H2O、1000ml去离子水）。
实施例1：肝癌细胞系MHCC-97H干细胞培养
1.培养基制备：在无菌超净工作台中将EGF、FGF-10、IGF-1各2ug，B27为2ml，肝素5g，青霉素+链霉素双抗溶液1ml，添加至96.9ml的DMEM／F12+GlutaMAXTM-1培养基中，吹打混匀。
2.复苏人肝癌细胞系MHCC97H：将细胞从-80℃液氮罐中取出后，立即在37℃水浴箱中轻轻振荡约2分钟后，使其充分均匀受热后快速融化。在超净工作台中，加入5ml含质量浓度为10%FBS的高糖DMEM完全培养基（含青霉素+链霉素双抗溶液）轻轻吹打混匀中和DMSO，1500rpm离心5min，弃掉上清。再用含质量浓度为10%FBS的高糖DMEM完全培养基（含青霉素+链霉素双抗溶液）重悬细胞，吹打混匀，于在37℃、5%CO2培养箱中用一次性75ml透气培养瓶中培养。
3.肝癌细胞系MHCC-97H用含含质量浓度为10%FBS的DMEM高糖培养基进行常规培养，贴壁长至80%-90%时传代。吸去培养瓶中的培养基，培养瓶中加入PBS清洗2-3遍后，加入5mL质量浓度为0.25%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化液，并轻轻顺培养瓶横轴方向晃动，在37℃下消化，以便消化酶能充分接触和消化细胞。1-2min左右后于倒置显微镜下观察，可见贴壁细胞开始变圆、漂浮脱落即加入按消化酶体积和完全培养基体积1:3的体积的含有10%FBS的高糖DMEM的完全培养基终止消化，1500rpm离心3min，弃上清。PBS洗涤细胞1遍，1000rpm离心5min。
4.加入含添加生长因子的DMEM／F12+GlutaMAXTM-1培养基，吹打混匀，按1:2转入新培养瓶培养，培养条件为体积浓度为5%CO2、37℃孵箱。
5.根据细胞的生长状态进行换液，细胞数量增长快，细胞聚集形成明显球状可3天换全液，如细胞数量增长较慢，细胞球不明显，可3天半量换液，7天换全液。一般5-7天均可见明显细胞球形成，当细胞球布满细胞瓶，约占80%-90%密度时，吸取全部培养基和细胞离心，弃上清，PBS重悬后离心，加入质量浓度为0.25%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化液37℃消化3分钟，吹打成单细胞，终止消化，离心，加入含生长因子的DMEM／F12+GlutaMAXTM-1培养基1:2或者1:3传代，重复上诉操作进行传代培养过程，目前已稳定传代50代以上，约半年时间。
6.镜下观察：图2A和图2B分别为经无血清培养方法培养第3天和第8天时的细胞形态照片，可见细胞聚集成球状，细胞球状态稳定。
7.成球率：将同期培养的10瓶肝癌细胞系MHCC-97H细胞贴壁培养后按1:2传代，进行无血清培养总共20瓶细胞，20瓶细胞均可聚集形成明显的细胞球，且细胞球均可长至培养瓶80%-90%密度，球状细胞团稳定，吹打不散，可认为成球率为100%。
8.待肝癌细胞MHCC97H细胞系贴壁细胞和成球细胞分别长至80％密度时的对数生长期细胞，用质量浓度为0.25%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化液消化后离心去上清，加预冷的1×PBS洗1次，轻轻吹打成单个细胞，计数板计数取细胞加入流式专用试管，每种细胞分别设置1管实验组和1管同型对照组，每管同型对照组取1×106个细胞，实验组取1×107个细胞。离心弃上清，每管同型对照组加1×PBS稀释的质量浓度为2%FBS50μL混匀，每管实验组加入1×PBS稀释的质量浓度为2%FBS500μL混匀。实验组加100μL荧光标记CD90抗体，同型对照组加10μL同型对照，混匀。4℃避光孵育60min。然后实验组每管中加质量浓度为2%FBS10mL，同型对照组每管中加质量浓度为2%FBS1mL，混匀，终止反应，流式细胞仪上机检测。结果图3显示无血清培养（图3B）较贴壁培养（图3D）细胞表达CD90荧光标记量明显升高。
9.待肝癌细胞MHCC97H细胞系贴壁细胞和成球细胞分别长至80％密度时的对数生长期细胞，质量浓度为0.25%胰蛋白酶+质量浓度为0.01%EDTA消化液消化后离心去上清，均使用4℃的1×PBS缓冲液将消化后的细胞再轻轻吹打成单个细胞，1500rpm离心，1×PBS缓冲液清洗1次，计数，后将1～2×106个细胞加入至EP管中，1500rpm离心，1×PBS缓冲液反复清洗3次细胞加入预冷的75%乙醇1mL固定，冰箱4℃过夜，1500rpm离心，15分钟，上清液弃之。500μL的1×PBS缓冲液清洗1次，1000rpm离心，8分钟，上清液弃之。在EP管中加150μLPI+0.5μLRNase+145μL1×PBS缓冲液，冰上操作。边加边振荡混匀，锡箔纸包裹EP管后避光低温孵育30分钟。用流式细胞仪检测细胞周期变化。结果提示通过无血清培养基获得的成球细胞比常规培养的贴壁细胞更多的具有与干细胞有相似的相对静止的状态G0-G1期（80.18±4.39%vs.63.45±3.27%）。而G0-G1期的细胞通常认为处于未分化状态。
实施例2肝癌细胞系MHCC-97L干细胞培养
MHCC-97L为复旦大学医学部惠赠
1.试剂配制：超净工作台中将EGF、FGF-10、IGF-1各2ug，B27为2ml，肝素5g，青霉素+链霉素双抗溶液1ml添加至96.9ml的DMEM／F12+GlutaMAXTM-1培养基中，吹打混匀。
2.复苏人肝癌细胞系MHCC97L：将细胞从-80℃液氮罐中取出后，立即在37℃水浴箱中轻轻振荡约2分钟后，使其充分均匀受热后快速融化。在超净工作台中，加入5ml质量浓度为10%FBS高糖DMEM完全培养基（含青霉素+链霉素双抗溶液）轻轻吹打混匀中和DMSO，1500rpm离心5min，弃掉上清。再用10%质量浓度为FBS高糖的DMEM完全培养基（含青霉素+链霉素双抗溶液）重悬细胞，吹打混匀，于在37℃、体积浓度为5%CO2培养箱中用一次性75ml透气培养瓶中培养。
3.肝癌细胞系MHCC-97L用含质量浓度为10%FBS的DMEM高糖培养基进行常规培养，贴壁长至80%-90%时传代。吸去培养瓶中的培养基，培养瓶中加入PBS清洗2-3遍后，加入5mL质量浓度为0.25%胰蛋白酶+质量浓度为0.01%EDTA消化液，并轻轻顺培养瓶横轴方向晃动，在37℃下消化，以便消化酶能充分接触和消化细胞。1-2min左右后于倒置显微镜下观察，可见贴壁细胞开始变圆、漂浮脱落即加入按消化酶体积和完全培养基体积1:3的体积的含有质量浓度为10%FBS的高糖DMEM的完全培养基终止消化，1500rpm离心3min，弃上清。PBS洗涤细胞1遍，1000rpm离心5min。
4.加入含添加生长因子的DMEM／F12+GlutaMAXTM-1培养基，吹打混匀，按1:2转入新培养瓶培养，培养条件为体积浓度为5%CO2、37℃孵箱。
5.根据细胞的生长状态进行换液，细胞数量增长快，细胞聚集形成明显球状可3天换全液，如细胞数量增长较慢，细胞球不明显，可3天半量换液，7天换全液。5-7天均可见明显细胞球形成，当细胞球布满细胞瓶，占80%-90%密度时，吸取全部培养基和细胞离心，弃上清，PBS重悬后离心，加入质量浓度为0.25%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化液37℃消化3分钟，吹打成单细胞，终止消化，离心，加入含生长因子的DMEM／F12+GlutaMAXTM-1培养基1:2或者1:3传代，重复上述操作进行传代培养过程，目前已稳定传代50代以上，半年时间。
6.镜下观察：图2A和图2B分别为经无血清培养方法培养第3天和第8天时的细胞形态照片，可见细胞聚集成球状，细胞球状态稳定。
7.成球率：将同期培养的10瓶肝癌细胞系MHCC-97H细胞贴壁培养后按1:2传代，进行无血清培养总共20瓶细胞，20瓶细胞均可聚集形成明显的细胞球，且细胞球均可长至培养瓶80%-90%密度，球状细胞团稳定，吹打不散，可认为成球率为100%。
8.待肝癌细胞MHCC97L细胞系贴壁细胞和成球细胞分别长至80％密度时的对数生长期细胞，用质量浓度为0.25%胰蛋白酶+质量浓度为0.01%EDTA消化液消化后离心去上清，加预冷的1×PBS洗1次，轻轻吹打成单个细胞，计数板计数取细胞加入流式专用试管，每种细胞分别设置1管实验组和1管同型对照组，每管同型对照组取1×106个细胞，实验组取1×107个细胞。离心弃上清，每管同型对照组加1×PBS稀释的质量浓度为2%FBS50μL混匀，每管实验组加入1×PBS稀释的质量浓度为2%FBS500μL混匀。实验组加100μL荧光标记CD90抗体，同型对照组加10μL同型对照，混匀。4℃避光孵育60min。然后实验组每管中加质量浓度为2%FBS10mL，同型对照组每管中加质量浓度为2%FBS1mL，混匀，终止反应，流式细胞仪上机检测。结果图4显示无血清培养（图4B）较贴壁培养（图4D）细胞表达CD90荧光标记量明显升高。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种肝癌干细胞的无血清培养基，其特征在于，以DMEM／F12+GlutaMAXTM-1培养基为基础，包括：人重组表皮生长因子、人重组碱性成纤维细胞生长因子-10、胰岛素一号增长因子、无血清补充营养成分、肝素、青霉素+链霉素双抗溶液。
2.如权利要求1所述的肝癌干细胞的无血清培养基，其特征在于，相对于DMEM／F12+GlutaMAXTM-1基础培养基，人重组表皮生长因子的浓度为10-30ng/ml、人重组碱性成纤维细胞生长因子-10的浓度为10-30ng/ml、胰岛素一号增长因子的浓度为10-30ng/ml、无血清补充营养成分的浓度为1-3%、肝素的浓度为40-60mg/ml、青霉素+链霉素双抗溶液的浓度90-110U/ml。
3.一种如权利要求1肝癌干细胞的无血清培养基的培养方法，其特征在于，包括以下几个步骤：
步骤A:培养基制备：在无菌超净工作台中将重组表皮生长因子、人重组碱性成纤维细胞生长因子-10、胰岛素一号增长因子，无血清补充营养成分、肝素、青霉素+链霉素双抗溶液添加至DMEM／F12+GlutaMAXTM-1培养基中，吹打混匀；
步骤B:复苏人肝癌细胞系：将细胞从液氮罐中取出后，水浴箱振荡使其充分均匀受热后快速融化；
在超净工作台中，加入10%FBS高糖DMEM完全培养基,离心弃掉上清;再用10%FBS高糖DMEM完全培养基重悬细胞，吹打混匀，于透气培养瓶中培养；
步骤C:肝癌细胞用含质量浓度10%FBS的DMEM高糖培养基进行培养，贴壁长至80%-90%时传代；吸去培养瓶中的培养基，培养瓶中加入PBS清洗后，加入0.25%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化液，倒置显微镜下观察，见贴壁细胞开始变圆、漂浮脱落即加入含有10%FBS的高糖DMEM的完全培养基终止消化，离心弃上清；PBS洗涤细胞后再离心；
步骤D:加入含添加生长因子的DMEM／F12+GlutaMAXTM-1培养基，吹打混匀，转入新培养瓶培养；
步骤E:当细胞球布满的密度为80%-90%时，吸取全部培养基和细胞离心，弃上清，PBS重悬后离心，加入0.25%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化液消化，吹打成单细胞，终止消化，离心，加入含生长因子的DMEM／F12+GlutaMAXTM-1培养基传代，重复前述操作进行传代培养。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤B和步骤D中，所需的培养环境：温度为37℃、CO2体积浓度为5%。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤E中，DMEM／F12+GlutaMAXTM-1培养基按1:2或者1:3传代。
6.如权利要1所述的肝癌干细胞无血清培养基在人肝癌细胞系MHCC-97H和MHCC-97L培养中的应用。
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