CN104531621A - 肝癌干细胞的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肝癌干细胞的分离方法，包括如下步骤：1)将肝癌细胞用DMEM高糖培育基进行培养；2)将步骤1得到的肝癌细胞培养液进行消化传代；3)取步骤2中消化传代呈对数生长期的传代细胞，用流式分选荧光抗体CD90和CD24进行标记，然后用流式细胞仪分选，CD90和CD24都标记上的CD90+CD24+肝癌细胞亚群即为分离得到的肝癌干细胞。本发明选取两种标志物进行联合检测，提高了肝癌干细胞的分离和鉴定的成功率。操作简单，可以快速、高效地分离出肝癌干细胞，提供了一种新的分离肝癌干细胞的方法，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞的分离方法，具体涉及一种肝癌干细胞的分离方法。
背景技术
目前认为肿瘤细胞具有异质性(heterogeneous)，其中少量癌干细胞，表现出更强的生长增殖、致瘤性和对抗肿瘤药物的耐受能力，是肿瘤形成和维持以及治疗后复发的源头细胞，找到这些细胞并确定其细胞生物学特点有助于发展新的诊疗方案实现恶性肿瘤的早期诊断和靶向治疗方案，降低其发生率和致死率。
寻找和鉴定特异性的肝癌干细胞(Liver Cancer Stem Cells，LCSCs)表面标志物是证明肝癌存在的首要环节，对于深入了解肝癌的生物学行为并开展新的靶向治疗研究有着重要意义。目前，LCSCs标志物的研究还只局限于从正常肝干/祖细胞的表面标志物去推定，尚缺乏特异性标志物来鉴定和分离LCSCs。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种新的肝癌干细胞的分离方法。
本发明实现其目的的技术方案如下：一种肝癌干细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将肝癌细胞用DMEM高糖培育基进行培养；
2)将步骤1得到的肝癌细胞培养液进行消化传代；
3)取步骤2中消化传代呈对数生长期的传代细胞，用流式分选荧光抗体CD90和CD24进行标记，然后用流式细胞仪分选，CD90和CD24都标记上的CD90+CD24+肝癌细胞亚群即为分离得到的肝癌干细胞。
所述步骤3中对肝癌细胞进行荧光抗体CD90和CD24标记的方法为：取步骤2中消化传代呈对数生长期的传代细胞吸弃培养液后用PBS洗涤，加入0.2-0.3％的胰蛋酶消化至细胞脱落后用PBS洗涤，过40μm细胞尼龙滤网，肝癌细胞数量控制在1～5×107个/mL，将细胞转入流式细胞仪的流式管中，离心弃掉上清液，加入FACS分选缓冲液重悬，混匀后加入FCR Blocking试剂，室温孵育，加入40-60μL PBS缓冲液后加入4-6μL流式分选荧光抗体CD90和CD24，混匀，5℃避光孵育40-50min。
所述步骤1中肝癌细胞的培养方法为将肝癌细胞用含80-100u/mL的青霉素和链霉素的10％胎牛血清的DMEM高糖培育基在37℃、85-95％相对湿度、4-6％CO2的培养箱中培养。
所述步骤2中肝癌细胞的消化传代方法为当细胞覆盖率达80-90％时将步骤1得到的肝癌细胞培养液吸弃培养液后用PBS洗涤，加入0.2-0.3％的胰蛋白酶消化至细胞脱落，终止消化，传代。
所述的肝癌细胞选自肝癌细胞系Huh-7。
本发明的有益效果是：本发明采用荧光抗体CD90(一种分子量为25～37KDa的GPI锚定蛋白)和荧光抗体CD24(一种分子量为42KDa单链唾液酸糖蛋白)联合标记肝癌细胞，两种标记物在肝癌细胞中呈共表达，采用流式细胞仪检测肝癌细胞系中肿瘤干细胞标志物的表达，通过比较分选出CD90+CD24+肝癌细胞，检测CD90+CD24+肝癌细胞的干细胞生物特性，证明CD90和CD24均表达的肝癌细胞即为肝癌干细胞。本发明选取两种标志物进行联合检测，提高了肝癌干细胞的分离和鉴定的成功率。本发明方法操作简单，可以快速、高效地分离出肝癌干细胞，提供了一种新的分离肝癌干细胞的方法，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是肝癌干细胞CD90+CD24+标记在Huh-7肝细胞癌细胞的表达图。
图2是从RNA水平上检测CD90和CD24在CD90+CD24+Huh-7、CD90+CD24-Huh-7、CD90-CD24+Huh-7、CD90-CD24-Huh-7四种表型肝癌细胞亚群中表达的灰度分析图。
具体实施方式
本发明实施例中所用试剂来源如下：
胎牛血清：上海生物工程技术服务有限公司。
DMEM培育基：美国Hyclone公司。
胰蛋白酶、PE-CD90、FITC-CD24：美国Gibco公司。
FACS分选缓冲液：PBS(称取氯化钠8g，氯化钾0.2g,磷酸氢钠3.4785g,磷酸二氢钾0.2g，加水至1升)500mL+0.5M EDTA 2mL+牛血清白蛋白2.5g。
FCR Blocking试剂：上海浩然生物技术有限公司。
bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、EGF(寡肽-1)、LIF(白血病抑制因子)：美国Peprotech公司。
B27(细胞培养添加剂)、RNA提取试剂盒：美国Invitrogen公司。
RNA逆转录试剂盒：美国Promega公司。
Giemsa染液试剂：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
肝癌细胞Huh-7来源：中国科学院上海细胞库。
实施例一、分离肝癌干细胞
分离肝癌干细胞，按照如下步骤操作：
1)将肝癌细胞株系Huh-7用含100u/mL的青霉素和链霉素的10％胎牛血清的DMEM高糖培育基于37℃、90％相对湿度、5％CO2的培养箱中培养。
2)当细胞覆盖率达90％时将步骤1得到的肝癌细胞培养液吸弃培养液后用PBS洗涤，加入0.25％的胰蛋白酶消化至细胞脱落，终止消化，传代。
细胞传代按照如下步骤操作：
当观察到培养瓶中细胞铺满度为90％时(细胞生长处于对数期时)，解冻复活成功后的细胞进行分离培养。
①弃去旧培养液，用PBS液(不含钙，镁离子)洗1-2次。
②向瓶内加入1ml消化液(0.25％Trypsin-0.53mEDTA)，置于37℃孵箱或室温(25℃温度)下进行消化，1-3min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化(将培养瓶翻转过来，以保证细胞没有脱壁)。
③倒出消化液，向瓶内用滴管加入培养液少量(约2ml)，轻轻转动培养瓶，把残留胰蛋白液消化液冲掉，然后再加3ml培养液+15滴小牛血清。
④使用吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。
⑤将准备好的细胞悬液转入离心管中，离心(1000r/min)5min，弃掉上清，在离心管中加入3ml培养液，并反复吹打细胞，制成细胞悬液。
⑥取3个无菌培养瓶，酒精棉球擦拭消毒，并在酒精灯下过火消毒。在培养瓶中各加入1ml细胞悬液、2ml培养液、15滴小牛血清，加好后酒精灯下过火加塞。
⑦细胞培养换液时间应根据细胞生长的状态和实验要求来确定。一般2～3d后应换一次生长液。待细胞铺满器皿底面，即可使用；也可继续传代扩大培养或换成维持液。
3)取步骤2中消化传代对数生长期的第8次传代细胞吸弃培养液后用PBS洗涤，加入0.25％的胰蛋酶消化至细胞脱落后用PBS洗涤，过40μm细胞尼龙滤网，肝癌细胞数量控制在5×107个/mL，将细胞转入流式细胞仪的流式管中，离心弃掉上清液，加入FACS分选缓冲液重悬，混匀后加入FCR Blocking试剂，室温孵育，加入40-60μL PBS缓冲液后加入4-6μL流式分选荧光抗体PE-CD90和FITC-CD24，混匀，5℃避光孵育40-50min。然后用流式细胞仪分选得到CD90+CD24+、CD90+CD24-、CD90-CD24+、CD90-CD24-不同表型的4种肝癌细胞亚群，CD90+CD24+肝癌细胞亚群即为分离得到的肝癌干细胞，计算得到CD90+CD24+的肝癌细胞数为8.78％，流式细胞仪检测CD90+CD24+在肝癌细胞中的荧光表达如图1所示。
实施例二、检测4种肝癌细胞亚群成球能力
在超低黏附培养板上将4种肝癌细胞亚群CD90+CD24+、CD90+CD24-、CD90-CD24+、CD90-CD24-分别接种到未加血清的DMEM/F12培养基中(含有20ng/mL的bFGF(碱性成纤维细胞生长因子，由155个氨基酸的阳离子多肽)、20ng/mL的EGF(寡肽-1，由53个氨基组成的活性多肽)、20ng/mL的LIF(白血病抑制因子)、2％的B27(细胞培养添加剂)、100u/mL的青霉素和100u/mL的链霉素)，观察7天、14天、21天和28天细胞的成球数量，将所筛选的细胞进行培养扩增后选取3、5、7、10、13代时收集细胞进行重复验证3次成球能力，采用t统计分析，得出CD90+CD24+肝癌细胞与CD90+CD24-、CD90-CD24+、CD90-CD24-具有显著性差异(P<0.05、P<0.01、P<0.001)。
实施例三、检测4种肝癌细胞亚群克隆成形率
将4种肝癌细胞分别以每孔1000个细胞接种于6孔板中，采用5％的FBS(胎牛血清)和双抗制成低血清的培养液培养，隔2d换液，3周后终止培养，弃上清，PBS清洗2次，用甲醇固定后，加入Giemsa染液试剂1mL/孔，染色30min，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。最后于普通光学显微镜下计数≥50个细胞的集落，并计算克隆形成率(PE，PE＝集落数目/接种细胞数×100％)，CD90+CD24+肝癌细胞的克隆形成率为(53.31±0.85)％，远高于CD90+CD24-、CD90-CD24+、CD90-CD24-，具有显著性差异(P<0.01、P<0.001、P<0.001)。
实施例四、检测4种肝癌细胞亚群成瘤能力
将4种肝癌细胞亚群每种亚群均配制3种细胞浓度：102个/200μL、103个/200μL、104个/200μL，分别接种到BALB/C裸鼠前臂皮下，4周后观察裸鼠的成瘤和生长情况，测量肿瘤长轴，以直径≥0.5cm为种植瘤成功，结果证明4种肝癌细胞亚群均具有不同程序的致瘤性，致瘤性从高到低顺序为CD90+CD24+>CD90+CD24->CD90-CD24+>CD90-CD24-，CD90+CD24+肿瘤具有强致瘤性。
实施例五、从RNA和蛋白质水平上检测CD90和CD24的表达
使用RNA提取试剂盒分别提取实施例一中的4种肝癌细胞亚群CD90+CD24+、CD90+CD24-、CD90-CD24+、CD90-CD24-的总RNA，采用1％的琼脂糖凝胶电泳，测定样品D260/D280比值和浓度用于逆转录定量的计算。以两步法(逆转录合成cDNA和PCR反应)行RT-PCR，首先将抽提的细胞总RNA用RNA逆转录试剂盒逆转录成cDNA，然后进行PCR反应得PCR产物，PCR所用引物序列如下：(CD90和CD24分别扩增)(以GAPDH作为内参基因)
CD90：上游引物：5'-GACTGCCGCCATGAGAATAACACC-3'；
下游引物：5'-CGCGCCCGAGACTTGAA-3'；
CD24：上游引物：5'-ACCTGTTTCCATTCAACAAGAGCAC-3'；
下游引物：5'-TCTGAGATCGCACCACTGCAC-3'；
GAPDH：上游引物：5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3'；
下游引物：5'-GTCCACCACCCTGTTGCTCTAG-3'。
分别取15μL扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统采集荧光信号，并使用系统软件分析光密度值，以PCR产物/内参GAPDH抗体的光密度值表示其相对表达量，结果如图2所示，CD90+CD24+肝癌细胞的表达水平远远高于CD90+CD24-、CD90-CD24+、CD90-CD24-，具有统计学差异。
应用western印迹法从RNA水平检测4种肝癌细胞相关基因蛋白的表达，提取4种肝癌细胞的蛋白，用BCA法测定样品蛋白浓度，变性后经10％SDS-PAGE转移至PVDF膜，TBST(5％脱脂奶用PBS溶解加Tween-20至0.2％)稀释的5％牛血清白蛋白粉作为封闭液，室温封闭2h，孵育一抗及二抗，TBST洗膜，采用超敏ECL化学发光试剂盒显色，凝胶成像系统扫描后软件进行半定量分析，以蛋白灰度值/内参GAPDH抗体灰度值的比值表示其相对表达量，结果显示，CD90+CD24+肝癌细胞的在蛋白质水平上表达远远高于CD90+CD24-、CD90-CD24+、CD90-CD24-，具有统计学差异。
Claims (8)
1.一种肝癌干细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将肝癌细胞用DMEM高糖培育基进行培养；
2)将步骤1得到的肝癌细胞培养液进行消化传代；
3)取步骤2中消化传代呈对数生长期的传代细胞，用流式分选荧光抗体CD90和CD24进行标记，然后用流式细胞仪分选，CD90和CD24都标记上的CD90+CD24+肝癌细胞亚群即为分离得到的肝癌干细胞。
2.如权利要求1所述的肝癌干细胞的分离方法，其特征在于，所述步骤3中对肝癌细胞进行荧光抗体CD90和CD24标记的方法为：取步骤2中消化传代呈对数生长期的传代细胞吸弃培养液后用PBS洗涤，加入0.2-0.3％的胰蛋酶消化至细胞脱落后用PBS洗涤，过40μm细胞尼龙滤网，肝癌细胞数量控制在1～5×107个/mL，将细胞转入流式细胞仪的流式管中，离心弃掉上清液，加入FACS分选缓冲液重悬，混匀后加入FCR Blocking试剂，室温孵育，加入40-60μL PBS缓冲液后加入4-6μL流式分选荧光抗体CD90和CD24，混匀，5℃避光孵育40-50min。
3.如权利要求1或2所述的肝癌干细胞的分离方法，其特征在于，所述步骤1中肝癌细胞的培养方法为将肝癌细胞用含80-100u/mL的青霉素和链霉素的10％胎牛血清的DMEM高糖培育基在37℃、85-95％相对湿度、4-6％CO2的培养箱中培养。
4.如权利要求1或2所述的肝癌干细胞的分离方法，其特征在于，所述步骤2中肝癌细胞的消化传代方法为当细胞覆盖率达80-90％时将步骤1得到的肝癌细胞培养液吸弃培养液后用PBS洗涤，加入0.2-0.3％的胰蛋白酶消化至细胞脱落，终止消化，传代。
5.如权利要求1所述的肝癌干细胞的分离方法，其特征在于，所述的肝癌细胞选自肝癌细胞系Huh-7。
6.如权利要求2所述的肝癌干细胞的分离方法，其特征在于，所述的肝癌细胞选自肝癌细胞系Huh-7。
7.如权利要求3所述的肝癌干细胞的分离方法，其特征在于，所述的肝癌细胞选自肝癌细胞系Huh-7。
8.如权利要求4所述的肝癌干细胞的分离方法，其特征在于，所述的肝癌细胞选自肝癌细胞系Huh-7。
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